សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រ CSS ។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ក្នុងពេលនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្របន្ត យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
ការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវ (LB) គឺជាគំនិតមួយដែលកំពុងទទួលបានប្រជាប្រិយភាពយ៉ាងឆាប់រហ័សនៅក្នុងវិស័យជីវវេជ្ជសាស្ត្រ។គំនិតនេះគឺផ្អែកជាចម្បងលើការរកឃើញបំណែកនៃ DNA ក្រៅកោសិកាដែលកំពុងចរាចរ (ccfDNA) ដែលត្រូវបានបញ្ចេញជាចម្បងជាបំណែកតូចៗបន្ទាប់ពីការស្លាប់កោសិកានៅក្នុងជាលិកាផ្សេងៗ។សមាមាត្រតូចមួយនៃបំណែកទាំងនេះមានប្រភពមកពីជាលិកាបរទេស (បរទេស) ឬសារពាង្គកាយ។នៅក្នុងការងារបច្ចុប្បន្ន យើងបានអនុវត្តគោលគំនិតនេះចំពោះសត្វមូស ដែលជាប្រភេទសត្វឆ្មាដែលគេស្គាល់សម្រាប់សមត្ថភាពច្រោះទឹកសមុទ្រខ្ពស់របស់ពួកគេ។យើងប្រើប្រាស់សមត្ថភាពរបស់ mussels ដើម្បីដើរតួជាតម្រងធម្មជាតិ ដើម្បីចាប់យកបំណែក DNA បរិស្ថានពីប្រភពផ្សេងៗគ្នា ដើម្បីផ្តល់ព័ត៌មានអំពីជីវចម្រុះនៃប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីឆ្នេរសមុទ្រសមុទ្រ។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា mussel hemolymph មានបំណែក DNA ដែលមានទំហំខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងពី 1 ទៅ 5 kb ។ការ​បាញ់​តាម​លំដាប់​លំដោយ​បាន​បង្ហាញ​ថា​បំណែក DNA មួយ​ចំនួន​ធំ​មាន​ដើម​កំណើត​អតិសុខុមប្រាណ​បរទេស។ក្នុងចំណោមពួកគេ យើងបានរកឃើញបំណែក DNA ពីបាក់តេរី archaea និងមេរោគ រួមទាំងមេរោគដែលគេស្គាល់ថាឆ្លងមេរោគជាច្រើនប្រភេទដែលជាទូទៅត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រតាមឆ្នេរសមុទ្រ។សរុបសេចក្តី ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថា គោលគំនិតនៃ LB ដែលបានអនុវត្តចំពោះសត្វស្លែតំណាងឱ្យប្រភពចំណេះដឹងដ៏សម្បូរបែប ប៉ុន្តែមិនទាន់ត្រូវបានរុករកនៅឡើយអំពីភាពចម្រុះនៃអតិសុខុមប្រាណនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីឆ្នេរសមុទ្រសមុទ្រ។
ផលប៉ះពាល់នៃការប្រែប្រួលអាកាសធាតុ (CC) ទៅលើជីវចម្រុះនៃប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រគឺជាតំបន់ដែលរីកចម្រើនយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃការស្រាវជ្រាវ។ការឡើងកំដៅផែនដីមិនត្រឹមតែបណ្តាលឱ្យមានភាពតានតឹងខាងសរីរវិទ្យាសំខាន់ៗប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងជំរុញដល់ដែនកំណត់នៃការវិវត្តនៃស្ថេរភាពកម្ដៅនៃសារពាង្គកាយសមុទ្រ ដែលប៉ះពាល់ដល់ជម្រកនៃប្រភេទសត្វមួយចំនួន ដែលជំរុញឱ្យពួកគេស្វែងរកលក្ខខណ្ឌអំណោយផលបន្ថែមទៀត [1, 2] ។បន្ថែមពីលើការប៉ះពាល់ដល់ជីវចម្រុះនៃមេតាហ្សូន CC រំខានដល់តុល្យភាពដ៏ឆ្ងាញ់នៃអន្តរកម្មអតិសុខុមប្រាណរបស់ម៉ាស៊ីន។dysbacteriosis អតិសុខុមប្រាណនេះបង្កការគំរាមកំហែងយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរដល់ប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រ ដោយសារវាធ្វើឱ្យសារពាង្គកាយសមុទ្រកាន់តែងាយនឹងបង្ករោគ [3, 4] ។វាត្រូវបានគេជឿថា SS ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការស្លាប់ដ៏ធំ ដែលជាបញ្ហាធ្ងន់ធ្ងរសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រពិភពលោក [5, 6]។នេះគឺជាបញ្ហាសំខាន់ដែលផ្តល់ផលប៉ះពាល់សេដ្ឋកិច្ច អេកូឡូស៊ី និងអាហារូបត្ថម្ភនៃប្រភេទសត្វសមុទ្រជាច្រើន។នេះជាការពិតជាពិសេសចំពោះសត្វប្រចៀវដែលរស់នៅក្នុងតំបន់ប៉ូល ដែលឥទ្ធិពលនៃ CK កាន់តែមានភ្លាមៗ និងធ្ងន់ធ្ងរ [6, 7] ។តាមពិតទៅ សត្វពាហនៈដូចជា Mytilus spp.ត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយដើម្បីតាមដានផលប៉ះពាល់របស់ CC លើប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រ។មិនគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលទេ មួយចំនួនធំនៃ biomarkers ត្រូវបានបង្កើតឡើងដើម្បីតាមដានសុខភាពរបស់ពួកគេ ជាញឹកញាប់ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តពីរជាន់ដែលពាក់ព័ន្ធនឹង biomarkers មុខងារដោយផ្អែកលើសកម្មភាពអង់ស៊ីម ឬមុខងារកោសិកាដូចជាលទ្ធភាពនៃកោសិកា និងសកម្មភាព phagocytic [8] ។វិធីសាស្រ្តទាំងនេះក៏រួមបញ្ចូលផងដែរនូវការវាស់វែងនៃការប្រមូលផ្តុំនៃសូចនាករសម្ពាធជាក់លាក់ដែលកកកុញនៅក្នុងជាលិកាទន់បន្ទាប់ពីការស្រូបយកបរិមាណដ៏ធំនៃទឹកសមុទ្រ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សមត្ថភាពចម្រោះខ្ពស់ និងប្រព័ន្ធឈាមរត់ពាក់កណ្តាលបើកចំហនៃ bivalves ផ្តល់ឱកាសមួយក្នុងការអភិវឌ្ឍន៍ biomarkers hemolymph ថ្មីដោយប្រើគំនិតនៃការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវ (LB) ដែលជាវិធីសាស្ត្ររាតត្បាតដ៏សាមញ្ញ និងតិចតួចបំផុតចំពោះការគ្រប់គ្រងអ្នកជំងឺ។គំរូឈាម [9, 10] ។ទោះបីជាប្រភេទជាច្រើននៃម៉ូលេគុលចរាចរអាចត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង LB របស់មនុស្សក៏ដោយ គំនិតនេះគឺផ្អែកលើការវិភាគលំដាប់ DNA នៃបំណែក DNA ក្រៅកោសិកា (ccfDNA) ដែលកំពុងចរាចរនៅក្នុងប្លាស្មា។ជាការពិត វត្តមានរបស់ DNA ដែលចរាចរនៅក្នុងប្លាស្មារបស់មនុស្សត្រូវបានគេស្គាល់តាំងពីពាក់កណ្តាលសតវត្សទី 20 [11] ប៉ុន្តែវាមានតែនៅក្នុងប៉ុន្មានឆ្នាំថ្មីៗនេះទេដែលការមកដល់នៃវិធីសាស្រ្តលំដាប់លំដោយកម្រិតខ្ពស់បាននាំឱ្យមានការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យដោយផ្អែកលើ ccfDNA ។វត្តមាននៃបំណែក DNA ដែលកំពុងចរាចរទាំងនេះគឺដោយសារតែផ្នែកមួយនៃការចេញផ្សាយ DNA ហ្សែនអកម្ម (នុយក្លេអ៊ែរនិងមីតូខនឌ្រីល) បន្ទាប់ពីការស្លាប់កោសិកា។ ចំពោះបុគ្គលដែលមានសុខភាពល្អ កំហាប់នៃ ccfDNA ជាធម្មតាមានកម្រិតទាប (<10 ng/mL) ប៉ុន្តែអាចកើនឡើងពី 5 ទៅ 10 ដងចំពោះអ្នកជំងឺដែលទទួលរងពីជំងឺផ្សេងៗ ឬទទួលរងនូវភាពតានតឹង ដែលបណ្តាលឱ្យខូចខាតជាលិកា។ ចំពោះបុគ្គលដែលមានសុខភាពល្អ កំហាប់នៃ ccfDNA ជាធម្មតាមានកម្រិតទាប (<10 ng/mL) ប៉ុន្តែអាចកើនឡើងពី 5 ទៅ 10 ដងចំពោះអ្នកជំងឺដែលទទួលរងពីជំងឺផ្សេងៗ ឬទទួលរងនូវភាពតានតឹង ដែលបណ្តាលឱ្យខូចខាតជាលិកា។ У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 рсльрт у гией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ចំពោះមនុស្សដែលមានសុខភាពល្អ កំហាប់ cccDNA ជាធម្មតាមានកម្រិតទាប (<10 ng/mL) ប៉ុន្តែវាអាចកើនឡើងពី 5 ទៅ 10 ដងចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានរោគសាស្ត្រផ្សេងៗ ឬស្ថិតក្រោមភាពតានតឹងដែលនាំទៅដល់ការបំផ្លាញជាលិកា។在健康个体中，ccfDNA的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患倅但在患有各种理或承受压力的患倅但。导致组织损伤។在健康个体中，ccfdna的浓度较低（（<10 ng/ml）但在各种病理或承受压力 1或承受压力 0 承受压力倍，从而组织。。损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 рац уптичаца пет в 5-10 рац упта ологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ការប្រមូលផ្តុំ ccfDNA ជាធម្មតាមានកម្រិតទាប (<10 ng/ml) ចំពោះបុគ្គលដែលមានសុខភាពល្អ ប៉ុន្តែអាចត្រូវបានកើនឡើង 5-10 ដងចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានរោគសាស្ត្រ ឬភាពតានតឹងផ្សេងៗ ដែលបណ្តាលឱ្យខូចខាតជាលិកា។ទំហំនៃបំណែក ccfDNA ប្រែប្រួលយ៉ាងទូលំទូលាយ ប៉ុន្តែជាធម្មតាមានចាប់ពី 150 ទៅ 200 bp ។[12] ។ការវិភាគនៃ ccfDNA ដែលទទួលបានដោយខ្លួនឯង ពោលគឺ ccfDNA ពីកោសិកាម៉ាស៊ីនធម្មតា ឬដែលត្រូវបានបំប្លែង អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើលការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន និងអេពីដេហ្សែនដែលមានវត្តមាននៅក្នុងហ្សែននុយក្លេអ៊ែ និង/ឬ មីតូខនឌ្រីល ដោយហេតុនេះជួយឱ្យគ្រូពេទ្យជ្រើសរើសវិធីព្យាបាលដែលកំណត់គោលដៅម៉ូលេគុលជាក់លាក់ [13] ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ccfDNA អាចទទួលបានពីប្រភពបរទេសដូចជា ccfDNA ពីកោសិកាគភ៌អំឡុងពេលមានផ្ទៃពោះ ឬពីសរីរាង្គប្តូរ [14,15,16,17]។ccfDNA ក៏ជាប្រភពសំខាន់នៃព័ត៌មានសម្រាប់ការរកឃើញវត្តមាននៃអាស៊ីត nucleic នៃភ្នាក់ងារបង្ករោគ (បរទេស) ដែលអនុញ្ញាតឱ្យរកឃើញដោយមិនរាតត្បាតនៃការឆ្លងរីករាលដាលដែលមិនត្រូវបានសម្គាល់ដោយវប្បធម៌ឈាម ជៀសវាងការធ្វើកោសល្យវិច័យរាតត្បាតនៃជាលិកាដែលមានមេរោគ [18] ។ការសិក្សាថ្មីៗនេះពិតជាបានបង្ហាញថាឈាមរបស់មនុស្សមានប្រភពព័ត៌មានដ៏សម្បូរបែបដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណមេរោគ និងបាក់តេរី ហើយប្រហែល 1% នៃ ccfDNA ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងប្លាស្មារបស់មនុស្សមានប្រភពដើមពីបរទេស [19] ។ការសិក្សាទាំងនេះបង្ហាញថា ជីវចម្រុះនៃអតិសុខុមប្រាណដែលកំពុងចរាចររបស់សារពាង្គកាយអាចត្រូវបានគេវាយតម្លៃដោយប្រើការវិភាគ ccfDNA ។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ រហូតមកដល់ពេលថ្មីៗនេះ គំនិតនេះត្រូវបានប្រើតែលើមនុស្សតែប៉ុណ្ណោះ ហើយក្នុងកម្រិតតិចជាងនេះ នៅក្នុងសត្វឆ្អឹងកងផ្សេងទៀត [20, 21] ។
នៅក្នុងក្រដាសបច្ចុប្បន្ន យើងប្រើប្រាស់សក្តានុពល LB ដើម្បីវិភាគ ccfDNA នៃ Aulacomya atra ដែលជាប្រភេទសត្វភាគខាងត្បូងដែលត្រូវបានគេរកឃើញជាទូទៅនៅក្នុងប្រជុំកោះ Kerguelen subantarctic ដែលជាក្រុមកោះនៅលើខ្ពង់រាបដ៏ធំមួយដែលបានបង្កើតឡើងកាលពី 35 លានឆ្នាំមុន។ការ​ផ្ទុះ​ភ្នំភ្លើង។ដោយប្រើប្រព័ន្ធពិសោធន៍នៅក្នុង vitro យើងបានរកឃើញថាបំណែក DNA នៅក្នុងទឹកសមុទ្រត្រូវបានចាប់យកយ៉ាងលឿនដោយ mussels ហើយចូលទៅក្នុងផ្នែក hemolymph ។លំដាប់លំដោយនៃកាំភ្លើងខ្លីបានបង្ហាញថា mussel hemolymph ccfDNA មានបំណែក DNA នៃប្រភពដើមរបស់វាផ្ទាល់ និងមិនមែនដោយខ្លួនឯង រួមទាំងបាក់តេរី symbiotic និងបំណែក DNA ពី biomes ធម្មតានៃប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីឆ្នេរសមុទ្រភ្នំភ្លើងត្រជាក់។Hemolymph ccfDNA ក៏មានផ្ទុកមេរោគដែលបានមកពីមេរោគដែលមានជួរម៉ាស៊ីនផ្សេងៗគ្នា។យើង​ក៏​បាន​រក​ឃើញ​បំណែក DNA ពី​សត្វ​ច្រើន​កោសិកា​ដូច​ជា ត្រី​សាច់ សត្វ​សមុទ្រ សារាយ និង​សត្វល្អិត។សរុបសេចក្តី ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថា គោលគំនិត LB អាចត្រូវបានអនុវត្តដោយជោគជ័យចំពោះសត្វឆ្អឹងខ្នងក្នុងសមុទ្រ ដើម្បីបង្កើតជាទម្រង់ហ្សែនដ៏សម្បូរបែបនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រ។
មនុស្សពេញវ័យ (ប្រវែង 55-70 ម.ម) Mytilus platensis (M. platensis) និង Aulacomya atra (A. atra) ត្រូវបានប្រមូលពីច្រាំងថ្ម intertidal នៃ Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.)។កោះ Kerguelen ក្នុងខែធ្នូ ឆ្នាំ 2018 ។ សត្វខ្លាខៀវពេញវ័យផ្សេងទៀត (Mytilus spp.) ត្រូវបានទទួលពីអ្នកផ្គត់ផ្គង់ពាណិជ្ជកម្ម (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ហើយដាក់ក្នុងធុងខ្យល់ដែលគ្រប់គ្រងសីតុណ្ហភាព (4°C) ដែលមានផ្ទុក 10-20 L នៃ 32‰ brine សិប្បនិម្មិត។(អំបិលសមុទ្រសិប្បនិម្មិត Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA)។សម្រាប់ការពិសោធន៍នីមួយៗ ប្រវែង និងទម្ងន់នៃសំបកនីមួយៗត្រូវបានវាស់។
ពិធីការចូលប្រើបើកចំហដោយឥតគិតថ្លៃសម្រាប់កម្មវិធីនេះមាននៅលើអ៊ីនធឺណិត (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1) ។ដោយសង្ខេប LB hemolymph ត្រូវបានប្រមូលពីសាច់ដុំ abductor ដូចដែលបានពិពណ៌នា [22] ។hemolymph ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយ centrifugation នៅ 1200 × g សម្រាប់រយៈពេល 3 នាទី, supernatant ត្រូវបានបង្កក (-20 ° C) រហូតដល់ការប្រើប្រាស់។សម្រាប់ការញែក និងបន្សុទ្ធ cfDNA សំណាក (1.5-2.0 មីលីលីត្រ) ត្រូវបានរលាយ និងដំណើរការដោយប្រើឧបករណ៍ NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ccfDNA ត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -80 ° C រហូតដល់ការវិភាគបន្ថែម។នៅក្នុងការពិសោធន៍មួយចំនួន ccfDNA ត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នា និងបន្សុតដោយប្រើ QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada)។DNA ដែលបានបន្សុតត្រូវបានកំណត់បរិមាណដោយប្រើតេស្ត PicoGreen ស្តង់ដារ។ការចែកចាយបំណែកនៃ ccfDNA ដាច់ដោយឡែកត្រូវបានវិភាគដោយ capillary electrophoresis ដោយប្រើ Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ដោយប្រើឧបករណ៍ DNA ដែលមានប្រតិកម្មខ្ពស់។ការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ 1 µl នៃគំរូ ccfDNA យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។
សម្រាប់ការបែងចែកបំណែក hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) បានរៀបចំបណ្ណាល័យកាំភ្លើងបាញ់ដោយប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ Illumina DNA Mix នៃកញ្ចប់ Illumina MiSeq PE75 ។អាដាប់ទ័រស្តង់ដារ (BioO) ត្រូវបានប្រើប្រាស់។ឯកសារទិន្នន័យដើមអាចរកបានពីបណ្ណសារអានលំដាប់ NCBI (SRR8924808 និង SRR8924809)។គុណភាពនៃការអានជាមូលដ្ឋានត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើ FastQC [23] ។Trimmomatic [24] ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការកាត់អាដាប់ទ័រ និងការអានដែលមានគុណភាពអន់។ការអានកាំភ្លើងខ្លីជាមួយនឹងចុងផ្គូផ្គងត្រូវបាន FLASH បញ្ចូលទៅក្នុងអានតែមួយវែងជាងជាមួយនឹងការត្រួតគ្នាអប្បបរមា 20 bp ដើម្បីជៀសវាងការមិនស៊ីគ្នា [25] ។ ការអានបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN ដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យ NCBI Taxonomy bivalve (e value < 1e−3 និង 90% homology) ហើយការបិទបាំងនៃលំដាប់ស្មុគស្មាញទាបត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ DUST [26] ។ ការអានបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN ដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យ NCBI Taxonomy bivalve (e value < 1e−3 និង 90% homology) ហើយការបិទបាំងនៃលំដាប់ស្មុគស្មាញទាបត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ DUST [26] ។ Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуслтвор e < 1e-3 និង 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполь 6 ការអានរួមបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN ដោយប្រើ NCBI bivalve taxonomy database (e value < 1e-3 និង 90% homology) ហើយការបិទបាំងលំដាប់ស្មុគស្មាញទាបត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ DUST [26] ។使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读潰甍幡怎 甍 6DUS 使杂度序列的掩蔽។使用双壳类 ncbi 分类（（<1e-3和 90%同源）用用用注释合并读数，幨卽6用注释合并读数，幨卽6甶忽甶卽6甶序列的。。。 掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩莔Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данныхвсвус чение e <1e-3 និង 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с. ការអានរួមបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN ដោយប្រើ NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 និង 90% homology) ហើយការបិទបាំងលំដាប់ស្មុគស្មាញទាបត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ DUST [26] ។ការអានត្រូវបានបែងចែកជាពីរក្រុម៖ ទាក់ទងនឹងលំដាប់ទ្វេ (នៅទីនេះហៅថាការអានដោយខ្លួនឯង) និងមិនទាក់ទង (មិនអានដោយខ្លួនឯង) ។ក្រុមពីរត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយឡែកពីគ្នាដោយប្រើ MEGAHIT ដើម្បីបង្កើត contigs [27] ។ទន្ទឹមនឹងនេះដែរ ការចែកចាយតាមនិទ្ទេសនៃអតិសុខុមប្រាណជនបរទេសត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ដោយប្រើ Kraken2 [28] និងតំណាងក្រាហ្វិកដោយតារាងចំណិត Krona នៅលើ Galaxy [29, 30] ។kmers ល្អបំផុតត្រូវបានកំណត់ថាជា kmers-59 ពីការពិសោធន៍បឋមរបស់យើង។ បន្ទាប់មក ភាពជាប់គាំងដោយខ្លួនឯងត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការតម្រឹមជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ bivalve NCBI តម្លៃ e < 1e−10 និង 60% ភាពដូចគ្នា) សម្រាប់ចំណារពន្យល់ចុងក្រោយ។ បន្ទាប់មក ភាពជាប់គាំងដោយខ្លួនឯងត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការតម្រឹមជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ bivalve NCBI តម្លៃ e < 1e−10 និង 60% ភាពដូចគ្នា) សម្រាប់ចំណារពន្យល់ចុងក្រោយ។ Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данныюх двуствор чата двуствор чата <1e-10 និង гомология 60%) для окончательной аннотации ។ បន្ទាប់មក ភាពជាប់គាំងដោយខ្លួនឯងត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការផ្គូផ្គងជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ NCBI bivalve, តម្លៃ e <1e-10 និង 60% ដូចគ្នា) សម្រាប់ចំណារពន្យល់ចុងក្រោយ។然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别荪和60% 同源性)注释។然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоста вления NB с устворчатых моллюсков, значение e <1e-10 និង гомология 60%) ។ បន្ទាប់មកការជាប់ទាក់ទងគ្នាដោយខ្លួនឯងត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណសម្រាប់ចំណារពន្យល់ចុងក្រោយដោយការផ្គូផ្គងប្រឆាំងនឹង BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ NCBI bivalve, តម្លៃ e <1e-10 និង 60% homology)។ ស្របគ្នា ការភ្ជាប់ក្រុមដែលមិនមែនជាខ្លួនឯងត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ NT NCBI តម្លៃ អ៊ី < 1e−10 និង 60% ភាពដូចគ្នា)។ ស្របគ្នា ការភ្ជាប់ក្រុមដែលមិនមែនជាខ្លួនឯងត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ NT NCBI តម្លៃ អ៊ី < 1e−10 និង 60% ភាពដូចគ្នា)។ Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, зналиони.-1гом ом 6 зналионие%) ស្របគ្នា ការភ្ជាប់ក្រុមបរទេសត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ NT NCBI តម្លៃ អ៊ី <1e-10 និង 60% ភាពដូចគ្នា)។平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群។平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群។ Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (<базачани nt BI 1нены) និង гомология 60%) ។ ស្របគ្នា ការភ្ជាប់ក្រុមដែលមិនមែនជាក្រុមខ្លួនឯងត្រូវបានកត់ចំណាំជាមួយ BLASTN (មូលដ្ឋានទិន្នន័យ NT NCBI តម្លៃ អ៊ី <1e-10 និង 60% ភាពដូចគ្នា)។ BLASTX ក៏ត្រូវបានធ្វើឡើងនៅលើ contigs ដែលមិនមែនជាខ្លួនឯងដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យ nr និង RefSeq ប្រូតេអ៊ីន NCBI (តម្លៃអ៊ី < 1e−10 និង 60% ដូចគ្នា) ។ BLASTX ក៏ត្រូវបានធ្វើឡើងនៅលើ contigs ដែលមិនមែនជាខ្លួនឯងដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យ nr និង RefSeq ប្រូតេអ៊ីន NCBI (តម្លៃអ៊ី < 1e−10 និង 60% ដូចគ្នា) ។ BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значо 1eгего значо 1e гом 1 гячилоние 1 горана 1000 . BLASTX ក៏ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ contigs ដែលមិនមែនជាខ្លួនឯងដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីន nr និង RefSeq NCBI (តម្លៃ e < 1e-10 និង 60% ដូចគ្នា) ។还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 倧源）។还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 倧源）។ BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значиние-1гом 6 BLASTX ក៏ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ contigs ដែលមិនមែនជាខ្លួនឯងដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីន nr និង RefSeq NCBI (តម្លៃអ៊ី <1e-10 និង 60% ដូចគ្នា) ។អាង BLASTN និង BLASTX នៃ contigs មិនដោយខ្លួនឯងតំណាងឱ្យ contigs ចុងក្រោយ (សូមមើលឯកសារបន្ថែម) ។
ថ្នាំ primers ដែលប្រើសម្រាប់ PCR ត្រូវបានរាយក្នុងតារាង S1។Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីកហ្សែនគោលដៅ ccfDNA ។លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មខាងក្រោមត្រូវបានប្រើប្រាស់៖ denaturation នៅ 95°C រយៈពេល 3 នាទី 95°C រយៈពេល 1 នាទី កំណត់សីតុណ្ហភាព annealing 1 នាទី ការពន្លូតនៅ 72°C រយៈពេល 1 នាទី 35 វដ្ត និងចុងក្រោយគឺ 72°C ក្នុងរយៈពេល 10 នាទី។.ផលិតផល PCR ត្រូវបានបំបែកដោយ electrophoresis នៅក្នុង agarose gels (1.5%) ដែលមាន SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) នៅ 95 V.
Mussels (Mytilus spp.) ត្រូវបានធ្វើឱ្យស្រូបចូលទៅក្នុងទឹកសមុទ្រដែលមានអុកស៊ីហ្សែន 500 មីលីលីត្រ (32 PSU) រយៈពេល 24 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C ។Plasmid DNA ដែលមានការបញ្ចូលបញ្ចូលកូដនៃលំដាប់ galectin-7 cDNA របស់មនុស្ស (លេខចូល NCBI L07769) ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងដបនៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 190 μg/μl។Mussels incubed នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នាដោយគ្មានការបន្ថែម DNA គឺជាការគ្រប់គ្រង។ធុង​ត្រួត​ពិនិត្យ​ទី​បី​មាន DNA ដោយ​មិន​មាន​ស្លែ។ដើម្បីតាមដានគុណភាពនៃ DNA នៅក្នុងទឹកសមុទ្រ សំណាកទឹកប្រៃ (20 μl; ពាក្យដដែលៗចំនួនបី) ត្រូវបានយកចេញពីធុងនីមួយៗតាមពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។សម្រាប់​ការ​តាមដាន DNA របស់​ផ្លាស្មីត ស្លែ LB ត្រូវ​បាន​ប្រមូល​ផល​នៅ​ពេល​ដែល​បាន​បង្ហាញ និង​វិភាគ​ដោយ qPCR និង ddPCR ។ដោយសារតែបរិមាណអំបិលខ្ពស់នៃទឹកប្រៃ aliquots ត្រូវបានពនឺក្នុងទឹកគុណភាព PCR (1:10) មុនពេលការធ្វើតេស្ត PCR ទាំងអស់។
ដំណក់ទឹកឌីជីថល PCR (ddPCR) ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើពិធីការ BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada) ។ប្រើទម្រង់សីតុណ្ហភាពដើម្បីកំណត់សីតុណ្ហភាពល្អបំផុត (តារាង S1) ។ដំណក់ទឹកត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើម៉ាស៊ីនភ្លើងទម្លាក់ QX200 (BioRad) ។ddPCR ត្រូវបានអនុវត្តដូចខាងក្រោម: 95 ° C សម្រាប់ 5 នាទី 50 វដ្តនៃ 95 ° C សម្រាប់ 30 s និងសីតុណ្ហភាព annealing សម្រាប់រយៈពេល 1 នាទីនិង 72 ° C សម្រាប់ 30 s, 4 ° C សម្រាប់ 5 នាទីនិង 90 ° C ក្នុងរយៈពេល 5 នាទី។ចំនួនដំណក់ និងប្រតិកម្មវិជ្ជមាន (ចំនួនច្បាប់ចម្លង/µl) ត្រូវបានវាស់ដោយប្រើឧបករណ៍អានទម្លាក់ QX200 (BioRad)។គំរូដែលមានដំណក់ទឹកតិចជាង 10,000 ត្រូវបានច្រានចោល។ការគ្រប់គ្រងលំនាំមិនត្រូវបានអនុវត្តរាល់ពេលដែល ddPCR ត្រូវបានដំណើរការ។
qPCR ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) និងថ្នាំ primers ជាក់លាក់ LGALS7 ។PCRs បរិមាណទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តក្នុង 20 µl ដោយប្រើ QuantitFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ។qPCR ត្រូវបានចាប់ផ្តើមជាមួយនឹងការ incubation 15 នាទីនៅ 95 ° C បន្តដោយ 40 វដ្តនៅ 95 ° C សម្រាប់ 10 វិនាទីនិងនៅ 60 ° C សម្រាប់ 60 វិនាទីជាមួយនឹងការប្រមូលទិន្នន័យមួយ។ខ្សែកោងរលាយត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើរង្វាស់បន្តបន្ទាប់គ្នានៅ 95°C សម្រាប់ 5 s, 65°C សម្រាប់ 60 s និង 97°C នៅចុងបញ្ចប់នៃ qPCR ។qPCR នីមួយៗត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង លើកលែងតែគំរូត្រួតពិនិត្យ។
ដោយសារ mussels ត្រូវបានគេស្គាល់ថាសម្រាប់អត្រាចម្រោះខ្ពស់របស់ពួកគេ យើងបានស៊ើបអង្កេតជាដំបូងថាតើពួកវាអាចត្រង និងរក្សាបំណែក DNA ដែលមាននៅក្នុងទឹកសមុទ្របានដែរឬទេ។យើងក៏ចាប់អារម្មណ៍ផងដែរថាតើបំណែកទាំងនេះកកកុញនៅក្នុងប្រព័ន្ធឡាំហ្វាទិចពាក់កណ្តាលបើកចំហរបស់ពួកគេដែរឬទេ។យើង​បាន​ដោះស្រាយ​បញ្ហា​នេះ​ដោយ​ពិសោធន៍​ដោយ​ការ​តាមដាន​ជោគវាសនា​នៃ​បំណែក DNA ដែល​រលាយ​បាន​បន្ថែម​ទៅ​ក្នុង​ធុង​ផ្សិត​ខៀវ។ដើម្បីជួយសម្រួលដល់ការតាមដានបំណែក DNA យើងបានប្រើ plasmid DNA បរទេស (មិនមែនដោយខ្លួនឯង) ដែលមានហ្សែន galectin-7 របស់មនុស្ស។ddPCR តាមដានបំណែក DNA plasmid នៅក្នុងទឹកសមុទ្រ និង mussels ។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថាប្រសិនបើបរិមាណនៃបំណែក DNA នៅក្នុងទឹកសមុទ្រនៅតែថេរក្នុងរយៈពេល (រហូតដល់ 7 ថ្ងៃ) ក្នុងករណីដែលគ្មាន mussels បន្ទាប់មកនៅក្នុងវត្តមានរបស់ mussels កម្រិតនេះស្ទើរតែបាត់ទាំងស្រុងក្នុងរយៈពេល 8 ម៉ោង (រូបភាព 1a,b)។បំណែកនៃ DNA exogenous ត្រូវបានរកឃើញយ៉ាងងាយស្រួលក្នុងរយៈពេល 15 នាទីនៅក្នុងសារធាតុរាវ intravalvular និង hemolymph (រូបភាព 1c) ។បំណែកទាំងនេះនៅតែអាចត្រូវបានរកឃើញរហូតដល់ 4 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់។សកម្មភាពចម្រោះនេះទាក់ទងនឹងបំណែក DNA គឺអាចប្រៀបធៀបទៅនឹងសកម្មភាពចម្រោះបាក់តេរី និងសារាយ [31]។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា ស្លែអាចត្រង និងប្រមូលផ្តុំ DNA បរទេសនៅក្នុងផ្នែកនៃសារធាតុរាវរបស់ពួកគេ។
ការប្រមូលផ្តុំដែលទាក់ទងនៃ plasmid DNA នៅក្នុងទឹកប្រៃនៅក្នុងវត្តមាន (A) ឬអវត្តមាន (B) នៃ mussels ដែលវាស់វែងដោយ ddPCR ។នៅក្នុង A លទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញជាភាគរយ ជាមួយនឹងស៊ុមនៃប្រអប់តំណាងឱ្យភាគរយទី 75 និងទី 25 ។ខ្សែកោងលោការីតដែលសមស្របត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ក្រហម ហើយផ្ទៃដែលមានស្រមោលពណ៌ប្រផេះតំណាងឱ្យចន្លោះពេលទំនុកចិត្ត 95% ។នៅក្នុង B បន្ទាត់ក្រហមតំណាងឱ្យមធ្យម ហើយបន្ទាត់ពណ៌ខៀវតំណាងឱ្យចន្លោះពេលទំនុកចិត្ត 95% សម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំ។C ការប្រមូលផ្តុំនៃ plasmid DNA នៅក្នុង hemolymph និង valvular fluid នៃ mussels នៅពេលផ្សេងគ្នាបន្ទាប់ពីការបន្ថែម plasmid DNA ។លទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញជាច្បាប់ចម្លងដាច់ខាតដែលបានរកឃើញ/ml (±SE)។
បន្ទាប់មក យើងបានស៊ើបអង្កេតប្រភពដើមនៃ ccfDNA នៅក្នុង mussels ដែលប្រមូលបានពី mussel beds នៅលើកោះ Kerguelen ដែលជាក្រុមដាច់ស្រយាលនៃកោះដែលមានឥទ្ធិពល anthropogenic មានកម្រិត។ចំពោះគោលបំណងនេះ cccDNA ពី mussel hemolymphs ត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នា និងបន្សុតដោយវិធីសាស្រ្តដែលប្រើជាទូទៅដើម្បីបន្សុទ្ធ cccDNA របស់មនុស្ស [32, 33] ។យើងបានរកឃើញថាកំហាប់ hemolymph ccfDNA ជាមធ្យមនៅក្នុង mussels គឺស្ថិតនៅក្នុងមីក្រូក្រាមទាបក្នុងមួយមីលីលីត្រ ជួរ hemolymph (សូមមើលតារាង S2 ពត៌មានបន្ថែម)។ជួរនៃការប្រមូលផ្តុំនេះគឺធំជាងចំពោះមនុស្សដែលមានសុខភាពល្អ (ណាណូក្រាមទាបក្នុងមួយមីលីលីត្រ) ប៉ុន្តែក្នុងករណីកម្រ ចំពោះអ្នកជំងឺមហារីក កម្រិតនៃ ccfDNA អាចឈានដល់មីក្រូក្រាមជាច្រើនក្នុងមួយមីលីលីត្រ [34, 35] ។ការវិភាគនៃការចែកចាយទំហំរបស់ hemolymph ccfDNA បានបង្ហាញថាបំណែកទាំងនេះមានទំហំខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងចាប់ពី 1000 bp ដល់ 1000 bp ។រហូតដល់ 5000 bp (រូបភាព 2) ។លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេទទួលបានដោយប្រើឧបករណ៍ស៊ើបអង្កេត QIAamp ដែលមានមូលដ្ឋានលើស៊ីលីកា ដែលជាវិធីសាស្ត្រដែលប្រើជាទូទៅក្នុងវិទ្យាសាស្ត្រកោសល្យវិច្ច័យ ដើម្បីញែក និងបន្សុទ្ធ DNA ហ្សែនយ៉ាងឆាប់រហ័សចេញពីគំរូ DNA ដែលមានកំហាប់ទាប រួមទាំង ccfDNA [36] ។
តំណាង ccfDNA electrophoregram នៃ mussel hemolymph ។ស្រង់ចេញជាមួយ NucleoSnap Plasma Kit (កំពូល) និង QIAamp DNA Investigator Kit ។B វីយូឡុងគ្រោងបង្ហាញពីការចែកចាយកំហាប់ hemolymph ccfDNA (±SE) នៅក្នុង mussels ។បន្ទាត់ខ្មៅ និងក្រហមតំណាងឱ្យមធ្យមភាគ និងត្រីមាសទីមួយ និងទីបី រៀងគ្នា។
ប្រហែល 1% នៃ ccfDNA នៅក្នុងមនុស្ស និងសត្វព្រូនមានប្រភពបរទេស [21, 37] ។ដោយសារប្រព័ន្ធឈាមរត់ពាក់កណ្តាលបើកចំហនៃ bivalves ទឹកសមុទ្រដែលសំបូរទៅដោយអតិសុខុមប្រាណ និងការចែកចាយទំហំរបស់ mussel ccfDNA យើងបានសន្មត់ថា mussel hemolymph ccfDNA អាចផ្ទុកនូវបណ្តុំ DNA microbial ដ៏សម្បូរបែប និងចម្រុះ។ដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មនេះ យើងបានធ្វើតាមគំរូ hemolymph ccfDNA ពីសំណាក Aulacomya atra ដែលប្រមូលបានពីកោះ Kerguelen ដែលផ្តល់លទ្ធផលជាង 10 លានអាន ដែល 97.6% បានឆ្លងកាត់ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព។បន្ទាប់មកការអានត្រូវបានចាត់ថ្នាក់តាមប្រភពខ្លួនឯង និងមិនមែនខ្លួនឯង ដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យ BLASTN និង NCBI bivalve (រូបភាព S1, ពត៌មានបន្ថែម)។
នៅក្នុងមនុស្ស ទាំង DNA និង mitochondrial DNA អាចត្រូវបានបញ្ចេញទៅក្នុងចរន្តឈាម [38] ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅក្នុងការសិក្សាបច្ចុប្បន្ន មិនអាចពិពណ៌នាលម្អិតអំពី DNA ហ្សែនរបស់សត្វមូសបានទេ ដោយហេតុថាហ្សែន A. atra មិនត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ ឬពិពណ៌នា។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ យើងអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណបំណែក ccfDNA មួយចំនួននៃប្រភពដើមរបស់យើង ដោយប្រើបណ្ណាល័យ bivalve (រូបភាព S2, ពត៌មានបន្ថែម)។យើងក៏បានបញ្ជាក់ពីវត្តមាននៃបំណែក DNA នៃប្រភពដើមផ្ទាល់របស់យើងដោយការពង្រីក PCR ដោយផ្ទាល់នៃហ្សែន A. atra ទាំងនោះដែលត្រូវបានបន្តបន្ទាប់គ្នា (រូបភាព 3) ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ដោយសារហ្សែន mitochondrial នៃ A. atra មាននៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យសាធារណៈ មនុស្សម្នាក់អាចរកឃើញភស្តុតាងសម្រាប់វត្តមាននៃបំណែក mitochondrial ccfDNA នៅក្នុង hemolymph នៃ A. atra ។វត្តមាននៃបំណែក mitochondrial DNA ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការពង្រីក PCR (រូបភាពទី 3) ។
ហ្សែន mitochondrial ជាច្រើនមានវត្តមាននៅក្នុង hemolymph នៃ A. atra (ចំណុចក្រហម – លេខភាគហ៊ុន៖ SRX5705969) និង M. platensis (ចំណុចពណ៌ខៀវ – លេខភាគហ៊ុន៖ SRX5705968) ពង្រីកដោយ PCR ។រូបភាពដែលបានកែសម្រួលពី Breton et al ។ , 2011 B Amplification of hemolymph supernatant ពី A. atra រក្សាទុកនៅលើក្រដាស FTA ។ប្រើកណ្តាប់ដៃ 3 មីលីម៉ែត្រ ដើម្បីបន្ថែមដោយផ្ទាល់ទៅបំពង់ PCR ដែលមានលាយ PCR ។
ដោយទទួលបានមាតិកាអតិសុខុមប្រាណដ៏ច្រើននៅក្នុងទឹកសមុទ្រ ដំបូងឡើយ យើងបានផ្តោតលើការកំណត់លក្ខណៈនៃលំដាប់ DNA អតិសុខុមប្រាណនៅក្នុង hemolymph ។ដើម្បីធ្វើដូចនេះយើងប្រើយុទ្ធសាស្រ្តពីរផ្សេងគ្នា។យុទ្ធសាស្ត្រដំបូងបានប្រើ Kraken2 ដែលជាកម្មវិធីចាត់ថ្នាក់តាមលំដាប់ដែលមានមូលដ្ឋានលើក្បួនដោះស្រាយដែលអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណលំដាប់អតិសុខុមប្រាណជាមួយនឹងភាពត្រឹមត្រូវដែលអាចប្រៀបធៀបទៅនឹង BLAST និងឧបករណ៍ផ្សេងទៀត [28] ។ការអានច្រើនជាង 6719 ត្រូវបានកំណត់ថាមានប្រភពដើមបាក់តេរី ខណៈដែល 124 និង 64 គឺមកពី archaea និង viruses រៀងគ្នា (រូបភាព 4) ។បំណែក DNA បាក់តេរីដែលមានច្រើនបំផុតគឺ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) និង Bacteroidetes (17%) (រូបភាព 4a) ។ការចែកចាយនេះគឺស្របជាមួយនឹងការសិក្សាពីមុននៃ microbiome mussel ខៀវសមុទ្រ [39, 40] ។Gammaproteobacteria គឺជាក្រុមចម្បងនៃ Proteobacteria (44%) រួមទាំង Vibrionales ជាច្រើន (រូបភាព 4b) ។វិធីសាស្រ្ត ddPCR បានបញ្ជាក់ពីវត្តមាននៃបំណែក Vibrio DNA នៅក្នុង ccfDNA នៃ A. atra hemolymph (រូបភាព 4c) [41] ។ដើម្បីទទួលបានព័ត៌មានបន្ថែមអំពីប្រភពដើមបាក់តេរីនៃ ccfDNA វិធីសាស្រ្តបន្ថែមមួយត្រូវបានគេយក (រូបភាព S2 ពត៌មានបន្ថែម)។ ក្នុងករណីនេះ ការអានដែលត្រួតលើគ្នាត្រូវបានផ្គុំជាគូចុងអាន ហើយត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ថាជារបស់ខ្លួនឯង (bivalves) ឬមិនមែនខ្លួនឯងដោយប្រើ BLASTN និងតម្លៃ e នៃ 1e−3 និងការកាត់ផ្តាច់ជាមួយនឹងភាពដូចគ្នា > 90% ។ ក្នុងករណីនេះ ការអានដែលត្រួតលើគ្នាត្រូវបានផ្គុំជាគូចុងអាន ហើយត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ថាជារបស់ខ្លួនឯង (bivalves) ឬមិនមែនខ្លួនឯងដោយប្រើ BLASTN និងតម្លៃ e នៃ 1e−3 និងការកាត់ផ្តាច់ជាមួយនឹងភាពដូចគ្នា > 90% ។ В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицирова рчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гиомолол 9% ក្នុងករណីនេះ ការអានត្រួតលើគ្នាត្រូវបានប្រមូលជាការអានដែលបញ្ចប់ជាគូ ហើយត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ថាជាប្រភពដើម (bivalve) ឬមិនមែនដើមដោយប្រើ BLASTN និងតម្លៃ e នៃ 1e-3 និងកាត់ផ្តាច់ជាមួយនឹងភាពដូចគ្នា > 90% ។在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和>90% 渐戼同自身（双壳类）或非自身来源។在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用的使用使用 blastn和 - 1 9 %源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицироввстка е моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гим> 9 % ក្នុងករណីនេះ ការអានត្រួតលើគ្នាត្រូវបានប្រមូលជាការអានដែលបញ្ចប់ជាគូ និងចាត់ថ្នាក់ថាជាការអានផ្ទាល់ខ្លួន (bivalves) ឬមិនមែនដើមដោយប្រើ e BLASTN និងតម្លៃ 1e-3 និងកម្រិតដូចគ្នា > 90% ។ដោយសារហ្សែន A. atra មិនទាន់ត្រូវបានដាក់តាមលំដាប់លំដោយ យើងបានប្រើយុទ្ធសាស្រ្តដំឡើង de novo នៃ MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler។សរុបចំនួន 147,188 contigs ត្រូវបានកំណត់ថាជាអ្នកអាស្រ័យ (bivalves) នៃប្រភពដើម។បន្ទាប់មក contigs ទាំងនេះត្រូវបានផ្ទុះជាមួយនឹង e-values ​​នៃ 1e-10 ដោយប្រើ BLASTN និង BLASTX ។យុទ្ធសាស្រ្តនេះបានអនុញ្ញាតឱ្យយើងកំណត់អត្តសញ្ញាណបំណែកដែលមិនមែនជា bivalve 482 ដែលមានវត្តមាននៅក្នុង A. atra ccfDNA ។ច្រើនជាងពាក់កណ្តាល (57%) នៃបំណែក DNA ទាំងនេះត្រូវបានទទួលពីបាក់តេរី ជាចម្បងពី symbionts gill រួមទាំង sulfotrophic symbionts និងពី gill symbionts Solemya velum (រូបភាព 5) ។
ភាពសម្បូរបែបដែលទាក់ទងនៅកម្រិតប្រភេទ។B ភាពចម្រុះនៃអតិសុខុមប្រាណនៃ phyla សំខាន់ពីរ (Firmicutes និង Proteobacteria) ។ការពង្រីកតំណាងនៃ ddPCR C Vibrio spp ។A. បំណែកនៃហ្សែន 16S rRNA (ពណ៌ខៀវ) ក្នុងចំនួនបី atra hemolymphs ។
សរុបចំនួន 482 មេរោគដែលប្រមូលបានត្រូវបានវិភាគ។កម្រងព័ត៌មានទូទៅនៃការបែងចែកតាមនិទ្ទេសនៃចំណារពន្យល់អំពីទំនាក់ទំនងមេតាណម (ប្រូកាយ៉ូត និង យូកាយ៉ូត) ។B ការចែកចាយលម្អិតនៃបំណែក DNA បាក់តេរីដែលកំណត់ដោយ BLASTN និង BLASTX ។
ការវិភាគ Kraken2 ក៏បានបង្ហាញផងដែរថា mussel ccfDNA មានបំណែក DNA បុរាណ រួមទាំងបំណែក DNA នៃ Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) និង Thaurmarcheota (11%) (រូបភាព 6a)។វត្តមាននៃបំណែក DNA ដែលបានមកពី Euryarchaeota និង Crenarchaeota ដែលត្រូវបានរកឃើញពីមុននៅក្នុងសហគមន៍អតិសុខុមប្រាណនៃ mussels កាលីហ្វ័រញ៉ា មិនគួរមានការភ្ញាក់ផ្អើលទេ [42] ។ទោះបីជា Euryarchaeota ជារឿយៗត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងលក្ខខណ្ឌធ្ងន់ធ្ងរក៏ដោយ ឥឡូវនេះវាត្រូវបានគេទទួលស្គាល់ថាទាំង Euryarchaeota និង Crenarcheota ស្ថិតក្នុងចំណោម prokaryotes ទូទៅបំផុតនៅក្នុងបរិយាកាសគ្រីស្តាល់សមុទ្រ [43, 44] ។វត្តមានរបស់អតិសុខុមប្រាណ methanogenic នៅក្នុង mussels មិនមែនជារឿងគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលនោះទេ ដោយសាររបាយការណ៍ថ្មីៗនៃការលេចធ្លាយមេតានយ៉ាងទូលំទូលាយពីការលេចធ្លាយខាងក្រោមនៅលើខ្ពង់រាប Kerguelen [45] និងការផលិតមេតានអតិសុខុមប្រាណដែលអាចកើតមាននៅឆ្នេរសមុទ្រនៃកោះ Kerguelen [46] ។
បន្ទាប់មកការយកចិត្តទុកដាក់របស់យើងបានប្តូរទៅការអានពីមេរោគ DNA ។ដើម្បីទទួលបានចំណេះដឹងល្អបំផុតរបស់យើង នេះគឺជាការសិក្សាក្រៅគោលដៅដំបូងនៃខ្លឹមសារមេរោគនៃ mussels ។ដូចដែលបានរំពឹងទុក យើងបានរកឃើញបំណែក DNA នៃ bacteriophages (Caudovirales) (រូបភាព 6b) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ DNA មេរោគទូទៅបំផុតបានមកពី phylum នៃ nucleocytoviruses ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា cytoplasmic nuclear DNA virus (NCLDV) ដែលមានហ្សែនធំបំផុតនៃមេរោគណាមួយ។នៅក្នុង phylum នេះ លំដាប់ DNA ភាគច្រើនជារបស់គ្រួសារ Mimimidoviridae (58%) និង Poxviridae (21%) ដែលម្ចាស់ធម្មជាតិរបស់វារួមមាន សត្វឆ្អឹងខ្នង និង arthropods ខណៈដែលសមាមាត្រតូចមួយនៃ DNA ទាំងនេះជាកម្មសិទ្ធិរបស់សារាយមេរោគដែលគេស្គាល់។ឆ្លងសារាយ eukaryotic សមុទ្រ។លំដាប់ក៏ទទួលបានពីមេរោគ Pandora ដែលជាមេរោគយក្សដែលមានទំហំហ្សែនធំបំផុតនៃប្រភេទមេរោគដែលគេស្គាល់។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ជួរនៃម៉ាស៊ីនដែលគេដឹងថាត្រូវបានឆ្លងមេរោគ ដូចដែលបានកំណត់ដោយលំដាប់លំដោយនៃ hemolymph ccfDNA គឺមានទំហំធំគួរសម (រូបភាព S3 ពត៌មានបន្ថែម)។វារួមបញ្ចូលមេរោគដែលឆ្លងសត្វល្អិតដូចជា Baculoviridae និង Iridoviridae ក៏ដូចជាមេរោគដែលឆ្លងអាមីបា សារាយ និងសត្វឆ្អឹងខ្នង។យើងក៏បានរកឃើញលំដាប់ដែលត្រូវគ្នានឹងហ្សែន Pithovirus sibericum ផងដែរ។Pitoviruses (ត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា "មេរោគខ្មោចឆៅ") ត្រូវបានញែកដាច់ពីគេជាលើកដំបូងពី permafrost ដែលមានអាយុ 30,000 ឆ្នាំនៅស៊ីបេរី [47] ។ដូច្នេះ លទ្ធផលរបស់យើងគឺស្របជាមួយនឹងរបាយការណ៍មុនដែលបង្ហាញថាមិនមែនប្រភេទមេរោគទំនើបទាំងអស់នោះត្រូវបានផុតពូជទេ [48] ហើយថាមេរោគទាំងនេះអាចមានវត្តមាននៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូសមុទ្រ subarctic ដាច់ស្រយាល។
ទីបំផុត យើងបានធ្វើតេស្តដើម្បីមើលថាតើយើងអាចរកឃើញបំណែក DNA ពីសត្វពហុកោសិកាផ្សេងទៀតដែរឬទេ។ទំនាក់ទំនងបរទេសសរុបចំនួន 482 ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយ BLASTN និង BLASTX ជាមួយនឹងបណ្ណាល័យ nt, nr និង RefSeq (ហ្សែន និងប្រូតេអ៊ីន)។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា ក្នុងចំនោមបំណែកបរទេសនៃ ccfDNA នៃសត្វពហុកោសិកា DNA នៃឆ្អឹងឆ្អឹង គ្របដណ្ដប់ (រូបភាពទី 5) ។បំណែក DNA ពីសត្វល្អិត និងប្រភេទសត្វផ្សេងទៀតក៏ត្រូវបានរកឃើញផងដែរ។ផ្នែកធំដែលទាក់ទងនៃបំណែក DNA មិនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទេ ប្រហែលជាដោយសារតែការបង្ហាញតិចតួចនៃប្រភេទសត្វសមុទ្រមួយចំនួនធំនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យហ្សែនបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទសត្វនៅលើដី [49] ។
នៅក្នុងក្រដាសបច្ចុប្បន្ន យើងអនុវត្តគោលគំនិត LB ទៅនឹងសត្វស្លែ ដោយលើកហេតុផលថា ការបាញ់តាមលំដាប់លំដោយនៃ hemolymph ccfDNA អាចផ្តល់នូវការយល់ដឹងអំពីសមាសភាពនៃប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីឆ្នេរសមុទ្រ។ជាពិសេស យើងបានរកឃើញថា 1) mussel hemolymph មានកំហាប់ខ្ពស់ទាក់ទងគ្នា (កម្រិតមីក្រូក្រាម) នៃបំណែក DNA ដែលកំពុងចរាចរដ៏ធំ (~1-5 kb) ។2) បំណែក DNA ទាំងនេះមានទាំងឯករាជ្យ និងមិនឯករាជ្យ 3) ក្នុងចំណោមប្រភពបរទេសនៃបំណែក DNA ទាំងនេះ យើងបានរកឃើញ DNA បាក់តេរី បុរាណ និងមេរោគ ក៏ដូចជា DNA នៃសត្វពហុកោសិកាផ្សេងទៀតផងដែរ។4) ការប្រមូលផ្តុំនៃបំណែក ccfDNA បរទេសទាំងនេះនៅក្នុង hemolymph កើតឡើងយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងរួមចំណែកដល់សកម្មភាពចម្រោះខាងក្នុងនៃ mussels ។សរុបសេចក្តី ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថា គោលគំនិតនៃ LB ដែលរហូតមកដល់ពេលនេះត្រូវបានអនុវត្តជាចម្បងក្នុងវិស័យជីវឱសថ បំប្លែងប្រភពចំណេះដឹងដ៏សម្បូរបែប ប៉ុន្តែមិនទាន់បានស្វែងយល់ ដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីយល់កាន់តែច្បាស់អំពីអន្តរកម្មរវាងប្រភេទសត្វឆ្មា និងបរិស្ថានរបស់វា។
បន្ថែមពីលើសត្វព្រូន ភាពឯកោ ccfDNA ត្រូវបានរាយការណ៍នៅក្នុងថនិកសត្វ រួមទាំងកណ្តុរ ឆ្កែ ឆ្មា និងសេះ [50, 51, 52]។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ចំពោះចំណេះដឹងរបស់យើង ការសិក្សារបស់យើងគឺជាលើកដំបូងដើម្បីរាយការណ៍ពីការរកឃើញ និងលំដាប់នៃ ccfDNA នៅក្នុងប្រភេទសត្វសមុទ្រជាមួយនឹងប្រព័ន្ធឈាមរត់បើកចំហ។លក្ខណៈកាយវិភាគវិទ្យានេះ និងសមត្ថភាពត្រងរបស់ mussels យ៉ាងហោចណាស់មួយផ្នែកអាចពន្យល់ពីលក្ខណៈទំហំផ្សេងគ្នានៃការចរាចរបំណែក DNA បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទសត្វដទៃទៀត។នៅក្នុងមនុស្ស បំណែក DNA ភាគច្រើនដែលចរាចរក្នុងឈាម គឺជាបំណែកតូចៗដែលមានទំហំចាប់ពី 150 ទៅ 200 bp ។ជាមួយនឹងកំពូលអតិបរមា 167 bp [34, 53] ។ផ្នែកតូចមួយប៉ុន្តែសំខាន់នៃបំណែក DNA មានទំហំចន្លោះពី 300 ទៅ 500 bp ហើយប្រហែល 5% គឺវែងជាង 900 bp ។[៥៤] ។ហេតុផលសម្រាប់ការចែកចាយទំហំនេះគឺថាប្រភពសំខាន់នៃ ccfDNA នៅក្នុងប្លាស្មាកើតឡើងជាលទ្ធផលនៃការស្លាប់កោសិកា ទាំងដោយសារតែការស្លាប់កោសិកា ឬដោយសារតែការ necrosis នៃកោសិកា hematopoietic ចរាចរនៅក្នុងបុគ្គលដែលមានសុខភាពល្អ ឬដោយសារតែការ apoptosis នៃកោសិកាដុំសាច់នៅក្នុងអ្នកជំងឺមហារីក (ត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាដុំសាច់ DNA ចរាចរ) ។, ctDNA) ។ការចែកចាយទំហំ hemolymph ccfDNA ដែលយើងបានរកឃើញនៅក្នុង mussels មានចាប់ពី 1000 ទៅ 5000 bp ដែលបង្ហាញថា mussel ccfDNA មានប្រភពដើមខុសគ្នា។នេះគឺជាសម្មតិកម្មឡូជីខលមួយ ចាប់តាំងពី mussels មានប្រព័ន្ធសរសៃឈាមពាក់កណ្តាលបើកចំហ និងរស់នៅក្នុងបរិយាកាសក្នុងទឹកសមុទ្រដែលមានកំហាប់ខ្ពស់នៃ DNA ហ្សែនរបស់អតិសុខុមប្រាណ។ជាការពិត ការពិសោធន៍មន្ទីរពិសោធន៍របស់យើងដោយប្រើ DNA ខាងក្រៅបានបង្ហាញថា ស្លែបានប្រមូលផ្តុំបំណែក DNA នៅក្នុងទឹកសមុទ្រ យ៉ាងហោចណាស់បន្ទាប់ពីពីរបីម៉ោងពួកវាត្រូវបានបំផ្លាញបន្ទាប់ពីការស្រូបយកកោសិកា និង/ឬបញ្ចេញ និង/ឬរក្សាទុកនៅក្នុងអង្គការផ្សេងៗ។ដោយសារភាពកម្រនៃកោសិកា (ទាំង prokaryotic និង eukaryotic) ការប្រើប្រាស់ intravalvular compartments នឹងកាត់បន្ថយបរិមាណ ccfDNA ពីប្រភពខ្លួនឯង ក៏ដូចជាពីប្រភពបរទេស។ដោយពិចារណាលើសារៈសំខាន់នៃភាពស៊ាំពីកំណើត bivalve និងចំនួនដ៏ច្រើននៃ phagocytes ដែលកំពុងចរាចរ យើងបានសន្មត់បន្ថែមថា សូម្បីតែ ccfDNA បរទេសក៏សំបូរទៅដោយ phagocytes ដែលកំពុងចរាចរដែលប្រមូលផ្តុំ DNA បរទេសនៅពេលទទួលទានមីក្រូសរីរាង្គ និង/ឬកំទេចកំទីកោសិកា។រួមគ្នា លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា bivalve hemolymph ccfDNA គឺជាឃ្លាំងតែមួយគត់នៃព័ត៌មានម៉ូលេគុល និងពង្រឹងស្ថានភាពរបស់ពួកគេជាប្រភេទសត្វឆ្មា។
ទិន្នន័យរបស់យើងបង្ហាញថាការបន្តបន្ទាប់គ្នា និងការវិភាគនៃបំណែក hemolymph ccfDNA ដែលទទួលបានដោយបាក់តេរីអាចផ្តល់ព័ត៌មានសំខាន់ៗអំពីរុក្ខជាតិបាក់តេរី និងបាក់តេរីដែលមានវត្តមាននៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រជុំវិញ។បច្ចេកទេសនៃការបាញ់តាមលំដាប់លំដោយបានបង្ហាញនូវលំដាប់នៃបាក់តេរី commensal A. atra gill ដែលនឹងត្រូវខកខាន ប្រសិនបើវិធីសាស្ត្រកំណត់អត្តសញ្ញាណ 16S rRNA ធម្មតាត្រូវបានប្រើប្រាស់ ដោយសារផ្នែកខ្លះនៃភាពលំអៀងនៃបណ្ណាល័យយោង។ជាការពិត ការប្រើប្រាស់ទិន្នន័យ LB របស់យើងដែលប្រមូលបានពី M. platensis នៅក្នុងស្រទាប់ mussel ដូចគ្នានៅ Kerguelen បានបង្ហាញថា សមាសភាពនៃបាក់តេរីដែលទាក់ទងនឹង gill-associated symbionts គឺដូចគ្នាសម្រាប់ប្រភេទ mussel ទាំងពីរ (រូបភាព S4, ពត៌មានបន្ថែម)។ភាពស្រដៀងគ្នានៃ mussels ពីរដែលមានហ្សែនខុសគ្នានេះអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីសមាសភាពនៃសហគមន៍បាក់តេរីនៅក្នុងស្រទាប់ត្រជាក់ ស្ពាន់ធ័រ និងភ្នំភ្លើងនៃ Kerguelen [55, 56, 57, 58] ។កម្រិតខ្ពស់នៃអតិសុខុមប្រាណកាត់បន្ថយស្ពាន់ធ័រត្រូវបានពិពណ៌នាយ៉ាងល្អនៅពេលប្រមូលផលស្លែពីតំបន់ឆ្នេរដែលមានជីវជាតិ [59] ដូចជាឆ្នេរនៃទីក្រុង Port-au-France ជាដើម។លទ្ធភាព​មួយ​ទៀត​គឺ​ថា ពពួក​ផ្កា​ស្លែ​ដែល​មាន​ប្រយោជន៍​អាច​នឹង​រង​ផល​ប៉ះពាល់​ដោយ​ការ​បញ្ជូន​ផ្តេក [60, 61]។ការស្រាវជ្រាវបន្ថែមគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីកំណត់ទំនាក់ទំនងរវាងបរិស្ថានសមុទ្រ ផ្ទៃបាតសមុទ្រ និងសមាសភាពនៃបាក់តេរី symbiotic នៅក្នុង mussels ។ការសិក្សាទាំងនេះកំពុងបន្ត។
ប្រវែង និងកំហាប់នៃ hemolymph ccfDNA ភាពងាយស្រួលនៃការបន្សុតរបស់វា និងគុណភាពខ្ពស់ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យមានការបាញ់កាំភ្លើងលឿនតាមលំដាប់លំដោយ គឺជាគុណសម្បត្តិមួយចំនួននៃការប្រើប្រាស់ mussel ccfDNA ដើម្បីវាយតម្លៃជីវចម្រុះនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីឆ្នេរសមុទ្រ។វិធីសាស្រ្តនេះមានប្រសិទ្ធភាពជាពិសេសសម្រាប់កំណត់លក្ខណៈសហគមន៍មេរោគ (មេរោគ) នៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូដែលបានផ្តល់ឱ្យ [62, 63] ។មិនដូចបាក់តេរី archaea និង eukaryotes ទេ ហ្សែនមេរោគមិនមានផ្ទុកហ្សែនដែលត្រូវបានរក្សាទុកដោយ phylogenetically ដូចជា 16S sequences។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា ការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវពីប្រភេទសត្វចង្រៃដូចជា ស្លែ អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណមួយចំនួនធំនៃបំណែកមេរោគ ccfDNA ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាឆ្លងដល់ម្ចាស់ផ្ទះដែលជាធម្មតារស់នៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រតាមឆ្នេរសមុទ្រ។នេះរាប់បញ្ចូលទាំងមេរោគដែលគេស្គាល់ថាឆ្លងមេរោគប្រូតូហ្សូអា សត្វកន្ទ្រាក់ សត្វល្អិត រុក្ខជាតិ និងមេរោគបាក់តេរី (ឧទាហរណ៍ បាក់តេរី បាក់តេរី)។ការចែកចាយស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេរកឃើញនៅពេលដែលយើងពិនិត្យមើល hemolymph ccfDNA virome នៃ mussels ពណ៌ខៀវ (M. platensis) ដែលប្រមូលបាននៅក្នុងស្រទាប់ mussel ដូចគ្នានៅ Kerguelen (តារាង S2, ពត៌មានបន្ថែម)។ការបាញ់កាំជ្រួចតាមលំដាប់នៃ ccfDNA គឺពិតជាវិធីសាស្រ្តថ្មីមួយដែលទទួលបានសន្ទុះក្នុងការសិក្សាអំពីមេរោគរបស់មនុស្ស ឬប្រភេទសត្វដទៃទៀត [21, 37, 64] ។វិធីសាស្រ្តនេះមានប្រយោជន៍ជាពិសេសសម្រាប់ការសិក្សាអំពីមេរោគ DNA ពីរខ្សែ ព្រោះថាគ្មានហ្សែនតែមួយត្រូវបានអភិរក្សក្នុងចំណោមមេរោគ DNA ពីរខ្សែទាំងអស់ ដែលតំណាងឱ្យប្រភេទមេរោគចម្រុះ និងទូលំទូលាយបំផុតនៅ Baltimore [65] ។ទោះបីជាភាគច្រើននៃមេរោគទាំងនេះនៅតែមិនត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ និងអាចរួមបញ្ចូលមេរោគពីផ្នែកដែលមិនស្គាល់ទាំងស្រុងនៃពិភពមេរោគ [66] យើងបានរកឃើញថា viromes និងជួរម៉ាស៊ីននៃ mussels A. atra និង M. platensis ស្ថិតនៅរវាងប្រភេទទាំងពីរ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ (សូមមើលរូប S3 ព័ត៌មានបន្ថែម)។ភាពស្រដៀងគ្នានេះមិនគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលទេព្រោះវាអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីការខ្វះខាតនៃការជ្រើសរើសក្នុងការស្រូបយក DNA ដែលមាននៅក្នុងបរិស្ថាន។ការសិក្សានាពេលអនាគតដោយប្រើ RNA បន្សុតគឺចាំបាច់នាពេលបច្ចុប្បន្នដើម្បីកំណត់លក្ខណៈ RNA virome ។
នៅក្នុងការសិក្សារបស់យើង យើងបានប្រើបំពង់បង្ហូរប្រេងដ៏តឹងរ៉ឹងមួយ ដែលប្រែប្រួលពីការងាររបស់ Kowarski និងសហការី [37] ដែលបានប្រើការលុបពីរជំហាននៃការអាន និង contigs មុន និងក្រោយការប្រមូលផ្តុំនៃ ccfDNA ដើម ដែលបណ្តាលឱ្យមានសមាមាត្រខ្ពស់នៃការអានដែលមិនបានគូសផែនទី។ដូច្នេះហើយ យើងមិនអាចច្រានចោលបានទេថា ការអានដែលមិនបានគូសវាសមួយចំនួនអាចនៅតែមានប្រភពដើមផ្ទាល់របស់វា ជាចម្បងដោយសារតែយើងមិនមានហ្សែនយោងសម្រាប់ប្រភេទសត្វស្លែនេះ។យើងក៏បានប្រើបំពង់បង្ហូរប្រេងនេះផងដែរ ដោយសារតែយើងព្រួយបារម្ភអំពី chimeras រវាងការអានដោយខ្លួនឯង និងមិនមែនដោយខ្លួនឯង និងប្រវែងអានដែលបង្កើតឡើងដោយ Illumina MiSeq PE75។ហេតុផលមួយទៀតសម្រាប់ការអានដែលមិនមានគំនូសតាងភាគច្រើនគឺថាអតិសុខុមប្រាណសមុទ្រភាគច្រើន ជាពិសេសនៅតំបន់ដាច់ស្រយាលដូចជា Kerguelen មិនត្រូវបានកត់ត្រាទុកទេ។យើងបានប្រើ Illumina MiSeq PE75 ដោយសន្មតថាប្រវែងបំណែក ccfDNA ស្រដៀងទៅនឹង ccfDNA របស់មនុស្ស។សម្រាប់ការសិក្សានាពេលអនាគត ដោយសារលទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា hemolymph ccfDNA អានបានយូរជាងមនុស្ស និង/ឬថនិកសត្វ យើងសូមណែនាំឱ្យប្រើវេទិកាលំដាប់លំដោយដែលសមស្របជាងសម្រាប់បំណែក ccfDNA យូរជាងនេះ។ការអនុវត្តនេះនឹងធ្វើឱ្យវាកាន់តែងាយស្រួលក្នុងការកំណត់អត្តសញ្ញាណសូចនាករបន្ថែមទៀតសម្រាប់ការវិភាគកាន់តែស៊ីជម្រៅ។ការទទួលបាន​លំដាប់​ហ្សែន A. atra នុយក្លេអ៊ែរ​ពេញលេញ​ដែល​មិន​អាច​ប្រើ​បាន​នាពេល​បច្ចុប្បន្ន​ក៏​នឹង​ជួយ​សម្រួល​យ៉ាងខ្លាំង​ដល់​ការ​រើសអើង​នៃ ccfDNA ពី​ប្រភព​ខ្លួនឯង និង​មិនមែន​ខ្លួនឯង។ដោយសារការស្រាវជ្រាវរបស់យើងបានផ្តោតលើលទ្ធភាពនៃការអនុវត្តគោលគំនិតនៃការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវចំពោះ mussels យើងសង្ឃឹមថានៅពេលដែលគំនិតនេះត្រូវបានប្រើក្នុងការស្រាវជ្រាវនាពេលអនាគត ឧបករណ៍ និងបំពង់បង្ហូរប្រេងថ្មីនឹងត្រូវបានបង្កើតឡើងដើម្បីបង្កើនសក្តានុពលនៃវិធីសាស្រ្តនេះក្នុងការសិក្សាអំពីភាពចម្រុះនៃពពួក mussels ។ប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីសមុទ្រ។
ក្នុងនាមជា biomarker គ្លីនិកដែលមិនមានការរាតត្បាត កម្រិតប្លាស្មារបស់មនុស្សកើនឡើងនៃ ccfDNA ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងជំងឺផ្សេងៗ ការខូចខាតជាលិកា និងលក្ខខណ្ឌស្ត្រេស [67,68,69] ។ការកើនឡើងនេះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការចេញផ្សាយបំណែក DNA នៃប្រភពដើមរបស់វាបន្ទាប់ពីការបំផ្លាញជាលិកា។យើងបានដោះស្រាយបញ្ហានេះដោយប្រើស្ត្រេសកំដៅស្រួចស្រាវ ដែលក្នុងនោះសត្វមឹកត្រូវបានប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លីទៅសីតុណ្ហភាព 30 អង្សាសេ។យើងបានធ្វើការវិភាគនេះលើសត្វស្លែបីប្រភេទផ្សេងគ្នានៅក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យើងមិនបានរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរកម្រិត ccfDNA បន្ទាប់ពីភាពតានតឹងកំដៅស្រួចស្រាវទេ (សូមមើលរូបភាព S5 ព័ត៌មានបន្ថែម)។របកគំហើញនេះអាចពន្យល់បាន យ៉ាងហោចណាស់មួយផ្នែក ការពិតដែលថា mussels មានប្រព័ន្ធឈាមរត់ពាក់កណ្តាលបើកចំហ និងកកកុញ DNA បរទេសយ៉ាងច្រើន ដោយសារតែសកម្មភាពតម្រងខ្ពស់របស់វា។ម៉្យាងវិញទៀត សត្វមូស ដូចជាសត្វឆ្អឹងខ្នងជាច្រើន អាចមានភាពធន់ទ្រាំទៅនឹងការខូចខាតជាលិកាដែលបណ្ដាលមកពីភាពតានតឹង ដោយហេតុនេះអាចកំណត់ការបញ្ចេញ ccfDNA នៅក្នុង hemolymph របស់ពួកគេ [70, 71] ។
រហូតមកដល់បច្ចុប្បន្ន ការវិភាគ DNA នៃជីវចម្រុះនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីក្នុងទឹកបានផ្តោតជាសំខាន់លើការបំប្លែង DNA បរិស្ថាន (eDNA) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វិធីសាស្រ្តនេះជាធម្មតាមានកម្រិតក្នុងការវិភាគជីវចម្រុះនៅពេលដែល primers ត្រូវបានប្រើ។ការប្រើប្រាស់កាំភ្លើងបាញ់តាមលំដាប់លំដោយជៀសផុតពីដែនកំណត់នៃ PCR និងការជ្រើសរើសដោយលំអៀងនៃសំណុំ primer ។ដូច្នេះ ក្នុងន័យមួយ វិធីសាស្រ្តរបស់យើងគឺកាន់តែខិតទៅជិតវិធីសាស្ត្រ eDNA Shotgun sequencing កម្រិតខ្ពស់ដែលបានប្រើថ្មីៗនេះ ដែលអាចបំបែក DNA ដោយផ្ទាល់តាមលំដាប់លំដោយ និងវិភាគស្ទើរតែគ្រប់សារពាង្គកាយទាំងអស់ [72, 73]។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ មានបញ្ហាជាមូលដ្ឋានមួយចំនួនដែលបែងចែក LB ពីវិធីសាស្ត្រ eDNA ស្តង់ដារ។ជាការពិតណាស់ ភាពខុសគ្នាសំខាន់រវាង eDNA និង LB គឺការប្រើប្រាស់ម៉ាស៊ីនតម្រងធម្មជាតិ។ការប្រើប្រាស់ប្រភេទសត្វសមុទ្រ ដូចជាអេប៉ុង និងប៊ីវ៉ាល (Dresseina spp.) ជាតម្រងធម្មជាតិសម្រាប់ការសិក្សា eDNA ត្រូវបានរាយការណ៍ [74, 75] ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយការសិក្សារបស់ Dreissena បានប្រើការធ្វើកោសល្យវិច័យជាលិកាដែល DNA ត្រូវបានស្រង់ចេញ។ការវិភាគនៃ ccfDNA ពី LB មិនតម្រូវឱ្យមានការធ្វើកោសល្យវិច័យជាលិកា ឧបករណ៍ឯកទេស និងជួនកាលមានតម្លៃថ្លៃ និងការដឹកជញ្ជូនទាក់ទងនឹង eDNA ឬការធ្វើកោសល្យវិច័យជាលិកា។ជាការពិត ថ្មីៗនេះ យើងបានរាយការណ៍ថា ccfDNA ពី LB អាចត្រូវបានរក្សាទុក និងវិភាគដោយមានការគាំទ្រ FTA ដោយមិនរក្សាខ្សែសង្វាក់ត្រជាក់ ដែលជាបញ្ហាប្រឈមដ៏សំខាន់សម្រាប់ការស្រាវជ្រាវនៅតំបន់ដាច់ស្រយាល [76]។ការទាញយក ccfDNA ពីការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវក៏មានលក្ខណៈសាមញ្ញផងដែរ ហើយផ្តល់នូវ DNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់សម្រាប់ការរៀបចំគ្រាប់កាំភ្លើង និងការវិភាគ PCR ។នេះគឺជាអត្ថប្រយោជន៍ដ៏អស្ចារ្យមួយដែលបានផ្តល់ឱ្យនូវដែនកំណត់បច្ចេកទេសមួយចំនួនដែលទាក់ទងនឹងការវិភាគ eDNA [77] ។ភាពសាមញ្ញ និងតម្លៃទាបនៃវិធីសាស្ត្រគំរូក៏សមរម្យជាពិសេសសម្រាប់កម្មវិធីត្រួតពិនិត្យរយៈពេលវែង។បន្ថែមពីលើសមត្ថភាពត្រងខ្ពស់របស់ពួកគេ លក្ខណៈពិសេសដ៏ល្បីមួយទៀតនៃ bivalves គឺសមាសធាតុ mucopolysaccharide គីមីនៃទឹករំអិលរបស់ពួកគេ ដែលជំរុញការស្រូបយកមេរោគ [78, 79] ។នេះធ្វើឱ្យ bivalves ក្លាយជាតម្រងធម្មជាតិដ៏ល្អសម្រាប់កំណត់លក្ខណៈជីវចម្រុះ និងផលប៉ះពាល់នៃការប្រែប្រួលអាកាសធាតុនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូទឹកដែលបានផ្តល់ឱ្យ។ទោះបីជាវត្តមាននៃបំណែក DNA ដែលទទួលបានពីម៉ាស៊ីនអាចត្រូវបានគេមើលឃើញថាជាដែនកំណត់នៃវិធីសាស្រ្តបើប្រៀបធៀបទៅនឹង eDNA ក៏ដោយ ការចំណាយដែលទាក់ទងនឹងការមាន ccfDNA ដើមបែបនេះបើប្រៀបធៀបទៅនឹង eDNA គឺអាចយល់បានក្នុងពេលដំណាលគ្នាសម្រាប់ព័ត៌មានដ៏ច្រើនដែលមានសម្រាប់ការសិក្សាសុខភាព។ម៉ាស៊ីនអុហ្វសិត។នេះរាប់បញ្ចូលទាំងវត្តមាននៃលំដាប់មេរោគដែលរួមបញ្ចូលទៅក្នុងហ្សែនរបស់ម៉ាស៊ីនមេ។នេះគឺមានសារៈសំខាន់ជាពិសេសសម្រាប់ mussels ដោយសារតែវត្តមាននៃ leukemic retroviruses ឆ្លងតាមផ្តេកនៅក្នុង bivalves [80, 81] ។អត្ថប្រយោជន៍មួយទៀតនៃ LB លើ eDNA គឺថាវាទាញយកសកម្មភាព phagocytic នៃកោសិកាឈាមចរាចរនៅក្នុង hemolymph ដែលលេបយកអតិសុខុមប្រាណ (និងហ្សែនរបស់វា) ។Phagocytosis គឺជាមុខងារសំខាន់នៃកោសិកាឈាមនៅក្នុង bivalves [82] ។ជាចុងក្រោយ វិធីសាស្រ្តទាញយកអត្ថប្រយោជន៍ពីសមត្ថភាពចម្រោះខ្ពស់នៃ mussels (ជាមធ្យម 1.5 លីត្រក្នុងមួយម៉ោងនៃទឹកសមុទ្រ) និងចរាចររយៈពេលពីរថ្ងៃ ដែលបង្កើនការលាយបញ្ចូលគ្នានៃស្រទាប់ទឹកសមុទ្រផ្សេងៗគ្នា ដែលអនុញ្ញាតឱ្យចាប់យក eDNA តំណពូជ។[៨៣, ៨៤] ។ដូច្នេះ ការវិភាគរបស់ mussel ccfDNA គឺជាមធ្យោបាយដ៏គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍មួយ ដែលផ្តល់ផលប៉ះពាល់ផ្នែកអាហារូបត្ថម្ភ សេដ្ឋកិច្ច និងបរិស្ថាននៃ mussels ។ស្រដៀងគ្នាទៅនឹងការវិភាគនៃ LB ដែលប្រមូលបានពីមនុស្ស វិធីសាស្ត្រនេះក៏បើកនូវលទ្ធភាពនៃការវាស់ស្ទង់ការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន និងអេពីហ្សែននៅក្នុង DNA របស់ម៉ាស៊ីនក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងសារធាតុ exogenous ។ជាឧទាហរណ៍ បច្ចេកវិជ្ជាបន្តបន្ទាប់គ្នាជំនាន់ទី 3 អាចត្រូវបានគិតគូរដើម្បីអនុវត្តការវិភាគមេទីលធំទូលាយនៃហ្សែននៅក្នុង ccfDNA ដើមដោយប្រើ nanopore sequencing ។ដំណើរការនេះគួរតែត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយការពិតដែលថាប្រវែងនៃបំណែកនៃ mussel ccfDNA គឺត្រូវគ្នាតាមឧត្ដមគតិជាមួយនឹងវេទិកាលំដាប់លំដោយដែលបានអានយូរ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យការវិភាគមេទីល DNA ធំទូលាយពីហ្សែនពីដំណើរការបន្តបន្ទាប់គ្នាដោយមិនចាំបាច់មានការផ្លាស់ប្តូរគីមី។ដូច្នេះ វាអាចផ្តល់នូវការយល់ដឹងដ៏មានតម្លៃចំពោះយន្តការមូលដ្ឋានដែលគ្រប់គ្រងការឆ្លើយតបបន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងការប្រែប្រួលអាកាសធាតុ ឬការបំពុល [87] ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការប្រើប្រាស់ LB មិនមែនគ្មានដែនកំណត់នោះទេ។មិនចាំបាច់និយាយទេ នេះតម្រូវឱ្យមានវត្តមានប្រភេទសត្វចង្អុលនៅក្នុងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ី។ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ ការប្រើប្រាស់ LB ដើម្បីវាយតម្លៃជីវចម្រុះនៃប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីដែលបានផ្តល់ឱ្យក៏តម្រូវឱ្យមានបំពង់បង្ហូរជីវព័ត៌មានយ៉ាងម៉ត់ចត់ដែលគិតគូរពីវត្តមាននៃបំណែក DNA ពីប្រភព។បញ្ហាចម្បងមួយទៀតគឺភាពអាចរកបាននៃហ្សែនយោងសម្រាប់ប្រភេទសត្វសមុទ្រ។គេសង្ឃឹមថា គំនិតផ្តួចផ្តើមដូចជា គម្រោងហ្សែនថនិកសត្វសមុទ្រ និងគម្រោង Fish10k [88] ដែលទើបបង្កើតថ្មី នឹងជួយសម្រួលដល់ការវិភាគបែបនេះនាពេលអនាគត។ការអនុវត្តគោលគំនិត LB ទៅនឹងសារពាង្គកាយដែលចិញ្ចឹមតម្រងសមុទ្រក៏ត្រូវគ្នាជាមួយនឹងភាពជឿនលឿនចុងក្រោយបង្អស់នៃបច្ចេកវិជ្ជាលំដាប់លំដោយ ដែលធ្វើឱ្យវាស័ក្តិសមសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍន៍ឧបករណ៍បំប្លែងពហុអូម ដើម្បីផ្តល់ព័ត៌មានសំខាន់ៗអំពីសុខភាពនៃជម្រកសត្វសមុទ្រក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងភាពតានតឹងផ្នែកបរិស្ថាន។
ទិន្នន័យលំដាប់ហ្សែនត្រូវបានដាក់ក្នុងបណ្ណសារអានលំដាប់ NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ក្រោម Bioprojects SRR8924808។
Brierley AS, Kingsford MJ ផលប៉ះពាល់នៃការប្រែប្រួលអាកាសធាតុលើជីវិតសមុទ្រ និងប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ី។ជីវវិទ្យាខូល។ឆ្នាំ ២០០៩;19: P602–P614 ។
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al ។ពិចារណាពីផលប៉ះពាល់រួមនៃការប្រែប្រួលអាកាសធាតុ និងកត្តាតានតឹងក្នុងតំបន់ផ្សេងទៀតលើបរិស្ថានសមុទ្រ។បរិស្ថានវិទ្យាសាស្ត្រទូទៅ។2021; 755: 142564 ។
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al ។)វិទ្យាសាស្ត្រដំបូងនៃខែមីនា។ឆ្នាំ 2020; 7:48 ។
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. ការកាត់បន្ថយការអត់ធ្មត់កំដៅក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃភាពតានតឹងកំដៅដដែលៗពន្យល់ពីការស្លាប់នៅរដូវក្តៅខ្ពស់នៃ mussels ពណ៌ខៀវ។របាយការណ៍វិទ្យាសាស្ត្រឆ្នាំ 2019;៩:១៧៤៩៨។
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al ។ការផ្លាស់ប្តូរថ្មីៗនៅក្នុងប្រេកង់ មូលហេតុ និងទំហំនៃការស្លាប់របស់សត្វ។Proc Natl Acad Sci សហរដ្ឋអាមេរិក។2015; 112:1083-8 ។
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al ។ភ្នាក់ងារបង្ករោគមិនជាក់លាក់ជាច្រើនប្រភេទអាចបណ្តាលឱ្យមានការស្លាប់ដ៏ធំនៃ Pinna nobilis ។ជីវិត។ឆ្នាំ ២០២០; ១០:២៣៨ ។
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM ។ផលប៉ះពាល់ដែលអាចកើតមាននៃការប្រែប្រួលអាកាសធាតុលើជំងឺ Zoonotic តំបន់អាក់ទិក។សុខភាព Int J Circumpolar ។២០០៥;៦៤:៤៦៨–៧៧។
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.ស្លែខៀវ (Mytilus edulis spp.) ជាសារពាង្គកាយសញ្ញាក្នុងការត្រួតពិនិត្យការបំពុលតាមឆ្នេរសមុទ្រ៖ ការពិនិត្យឡើងវិញ។Mar Environ Res 2017;១៣០:៣៣៨-៦៥។
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. ការរួមបញ្ចូលនៃការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវក្នុងការព្យាបាលជំងឺមហារីក។Nat Rev Clean Oncol ។ឆ្នាំ ២០១៧;១៤:៥៣១–៤៨។
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al ។ការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវ៖ អនុញ្ញាតឱ្យ DNA ដុំសាច់ចរាចរ។មហារីក Nat Rev ។ឆ្នាំ ២០១៧; ១៧:២២៣–៣៨។
Mandel P., Metais P. អាស៊ីត Nucleic នៅក្នុងប្លាស្មារបស់មនុស្ស។កំណត់ហេតុកិច្ចប្រជុំរបស់ក្រុមហ៊ុនបុត្រសម្ព័ន្ធ Soc Biol ។១៩៤៨;១៤២:២៤១-៣ ។
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. តួនាទីថ្មីសម្រាប់ DNA គ្មានកោសិកា ជាសញ្ញាសម្គាល់ម៉ូលេគុលសម្រាប់ការព្យាបាលជំងឺមហារីក។បរិមាណនៃការវិភាគជីវម៉ូឡា។ឆ្នាំ 2019; 17:100087 ។
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy ចូលទៅក្នុងគ្លីនិក - បញ្ហានៃការអនុវត្ត និងបញ្ហាប្រឈមនាពេលអនាគត។Nat Rev Clin Oncol ។២០២១;១៨:២៩៧–៣១២។
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW និងអ្នកដទៃ។DNA របស់ទារកមាននៅក្នុងប្លាស្មារបស់ម្តាយ និងសេរ៉ូម។កាំបិត។ឆ្នាំ ១៩៩៧;៣៥០:៤៨៥-៧។
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ការសិក្សាអំពីដំណើរនៃការមានផ្ទៃពោះ និងផលវិបាករបស់វាដោយប្រើចរន្ត RNA ក្រៅកោសិកាក្នុងឈាមរបស់ស្ត្រីអំឡុងពេលមានផ្ទៃពោះ។ពេទ្យកុមារ។ឆ្នាំ ២០២០; ៨:៦០៥២១៩។
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al ។ការធ្វើកោសល្យវិច័យរាវ៖ DNA ដែលគ្មានកោសិការបស់ម្ចាស់ជំនួយត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើលដំបៅ allogeneic នៅក្នុងតម្រងនោម។Nat Rev Nephrol ។២០២១;១៧:៥៩១–៦០៣។
Juan FC, Lo YM ការច្នៃប្រឌិតក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យមុនពេលសម្រាល៖ លំដាប់ហ្សែនប្លាស្មារបស់មាតា។អាណា MDឆ្នាំ ២០១៦; ៦៧:៤១៩-៣២។
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al ។ការរកឃើញធាតុបង្កជំងឺយ៉ាងឆាប់រហ័សជាមួយនឹងលំដាប់មេតាហ្សែនជំនាន់ក្រោយនៃសារធាតុរាវរាងកាយដែលមានមេរោគ។ណាតឱសថ។២០២១; ២៧:១១៥-២៤។