Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲದೊಂದಿಗೆ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಿರುವಿರಿ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ).ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು JavaScript ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಏರಿಳಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ.ಒಂದು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಹಿಂದಿನ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಅಥವಾ ಒಂದು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ಲೈಡರ್ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.
ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ಜೈವಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳು ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದಲ್ಲಿ ತಮ್ಮ ಗುರಿಗಳನ್ನು ತಲುಪದಂತೆ ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗುತ್ತದೆ.ವಿವೋದಲ್ಲಿ ನವೀನ ಮೆದುಳಿನ ಸಾಗಣೆದಾರರನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು, ನಾವು T7 ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಇಲಿಗಳ ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಪ್ರಜ್ಞೆಯ ದೊಡ್ಡ ಪೂಲ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವವನ್ನು (CSF) ಸರಣಿಯಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತುಗಳ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ CSF ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು.ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪರೀಕ್ಷೆಯು CSF ನಲ್ಲಿ 1000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು.ಮೆದುಳಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ವಿತರಣೆಯ ಜೈವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಗುರುತಿಸಲಾದ ಕಾದಂಬರಿ ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿನ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-β ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿನ 40% ಕಡಿತದಿಂದ ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಪರಿಣಾಮದೊಂದಿಗೆ ಮೆದುಳಿಗೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋ ಅಣುಗಳ ವ್ಯವಸ್ಥಿತ ವಿತರಣೆಗೆ ಉಪಯುಕ್ತ ವಾಹನಗಳಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದ (CNS) ಉದ್ದೇಶಿತ ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಸಿಎನ್‌ಎಸ್-ಉದ್ದೇಶಿತ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ಡ್ ಔಷಧಗಳು ಮತ್ತು ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದರ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿದೆ, ಮೆದುಳಿಗೆ ಸಕ್ರಿಯ ಔಷಧ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಯತ್ನವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಔಷಧಿ ವಿತರಣೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ಅಣುಗಳು, ಆಧುನಿಕ ನರವಿಜ್ಞಾನದ ಔಷಧ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಅವಿಭಾಜ್ಯ ಅಂಗವಾಗಿರುವುದರಿಂದ ಇದು ಈಗ ಬದಲಾಗಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತಿದೆ.ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದ ಪರಿಸರವು ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ತಡೆಗೋಡೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಿಂದ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ (BBB) ​​ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ (BCBB) 1 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಮೆದುಳಿಗೆ ಔಷಧಿಗಳನ್ನು ತಲುಪಿಸಲು ಸವಾಲಾಗಿದೆ.ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ದೊಡ್ಡ ಅಣು ಔಷಧಗಳು ಮತ್ತು 98% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸಣ್ಣ ಅಣು ಔಷಧಗಳು ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಹೊರಹಾಕಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಅಂದಾಜಿಸಲಾಗಿದೆ3.ಅದಕ್ಕಾಗಿಯೇ ಸಿಎನ್ಎಸ್ 4,5 ಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಔಷಧಿಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುವ ಹೊಸ ಮೆದುಳಿನ ಸಾರಿಗೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯ.ಆದಾಗ್ಯೂ, BBB ಮತ್ತು BCSFB ಔಷಧಿ ವಿತರಣೆಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾದ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವುಗಳು ಅದರ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ನಾಳೀಯ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿನ ಎಲ್ಲಾ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಭೇದಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ.ಹೀಗಾಗಿ, ಮೆದುಳಿಗೆ ತಲುಪಿಸುವ ಆಕ್ರಮಣಶೀಲವಲ್ಲದ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಪ್ರಸ್ತುತ ಪ್ರಯತ್ನಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ BBB6 ಗ್ರಾಹಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ರಾಹಕ-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಸಾರಿಗೆ (PMT) ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿವೆ.ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರ್ರಿನ್ ರಿಸೆಪ್ಟರ್ ಪಾಥ್‌ವೇ 7,8 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇತ್ತೀಚಿನ ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರಗತಿಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಸುಧಾರಿತ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೊಸ ವಿತರಣಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, CSF ಸಾಗಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದು ನಮ್ಮ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಅವುಗಳನ್ನು ತಾತ್ವಿಕವಾಗಿ ಸಿಎನ್‌ಎಸ್‌ಗೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್‌ಗಳನ್ನು ತಲುಪಿಸಲು ಅಥವಾ ಹೊಸ ಗ್ರಾಹಕ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ತೆರೆಯಲು ಬಳಸಬಹುದು.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ (BBB ಮತ್ತು BSCFB) ಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗ್ರಾಹಕಗಳು ಮತ್ತು ಸಾಗಣೆದಾರರು ಜೈವಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಔಷಧಗಳ ಸಕ್ರಿಯ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿತರಣೆಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಗುರಿಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (CSF) ಕೊರೊಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್ (CS) ನ ಸ್ರವಿಸುವ ಉತ್ಪನ್ನವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಬ್ಅರಾಕ್ನಾಯಿಡ್ ಸ್ಪೇಸ್ ಮತ್ತು ವೆಂಟ್ರಿಕ್ಯುಲರ್ ಸ್ಪೇಸ್ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿನ ತೆರಪಿನ ದ್ರವದೊಂದಿಗೆ ನೇರ ಸಂಪರ್ಕದಲ್ಲಿದೆ.ಸಬ್ಅರಾಕ್ನಾಯಿಡ್ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವವು ಮಿದುಳಿನ ಇಂಟರ್ಸ್ಟಿಷಿಯಂನಲ್ಲಿ ಅತಿಯಾಗಿ ಹರಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಸಬ್ಅರಾಕ್ನಾಯಿಡ್ ಒಳಹರಿವಿನ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಥವಾ ನೇರವಾಗಿ BBB ಮೂಲಕ ಪ್ಯಾರೆಂಚೈಮಲ್ ಜಾಗವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸಲು ನಾವು ಭಾವಿಸುತ್ತೇವೆ.ಇದನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು, ನಾವು ಈ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಮಾರ್ಗಗಳ ಮೂಲಕ ಸಾಗಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ ಗುರುತಿಸುವ ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆಯ ಕಾರ್ಯತಂತ್ರವನ್ನು ನಾವು ಅಳವಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.
ಹೆಚ್ಚಿನ ಲೈಬ್ರರಿ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯೊಂದಿಗೆ ಆರಂಭಿಕ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತುಗಳನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಈಗ CSF ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ (HTS) ಜೊತೆಗಿನ ಅನುಕ್ರಮ ಇನ್ ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ.ರಕ್ತ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಶಾಶ್ವತವಾಗಿ ಅಳವಡಿಸಲಾದ ದೊಡ್ಡ ಸಿಸ್ಟರ್ನಾ (CM) ಕ್ಯಾನುಲಾದೊಂದಿಗೆ ಜಾಗೃತ ಇಲಿಗಳ ಮೇಲೆ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಈ ವಿಧಾನವು ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ಸಾಗಣೆಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಮೆದುಳು-ಗುರಿ ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ನಾವು T7 ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಸಣ್ಣ ಗಾತ್ರದ (~60 nm) 10 ಕಾರಣದಿಂದ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅವು ಎಂಡೋಥೀಲಿಯಲ್ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಎಪಿಥೇಲಿಯಲ್-ಮೆಡುಲ್ಲಾ ತಡೆಗೋಡೆಯ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸೆಲ್ಯುಲರ್ ಕ್ರಾಸಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಅನುಮತಿಸುವ ಕೋಶಕಗಳ ಸಾಗಣೆಗೆ ಸೂಕ್ತವೆಂದು ಸೂಚಿಸಿದ್ದೇವೆ.ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತುಗಳ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್‌ನ ನಂತರ, ವಿವೋ ಸಿಎಸ್‌ಎಫ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಮೈಕ್ರೊವೆಸೆಲ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಬಲವಾದ ಫೇಜ್ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಆದ್ಯತೆಯ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವಕ್ಕೆ ಸಾಗಿಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು.ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧಕದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಸಾಗಣೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ CNS ನ ಫಾರ್ಮಾಕೊಡೈನಾಮಿಕ್ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಯಿತು.ವಿವೋ ಫಂಕ್ಷನಲ್ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳು ಕಾದಂಬರಿ ಮೆದುಳು ಸಾರಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಾರ್ಗೋ ಕ್ಯಾರಿಯರ್‌ಗಳಾಗಿ ಗುರುತಿಸಬಲ್ಲವು ಎಂಬುದನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ಕಾದಂಬರಿಯ ಮಿದುಳಿನ ಸಾರಿಗೆ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆ ವಿಧಾನಗಳು ಪ್ರಮುಖವಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಪ್ಲೇಕ್-ಫಾರ್ಮಿಂಗ್ ಯೂನಿಟ್‌ಗಳನ್ನು (PFU) ಆಧರಿಸಿ, ಫೇಜ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಹಂತದ ನಂತರ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ 12-mer ಲೀನಿಯರ್ T7 ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಸುಮಾರು 109 ವೈವಿಧ್ಯತೆಯೊಂದಿಗೆ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ಮೆಟೀರಿಯಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ).ವಿವೋ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ನಾವು ಮೊದಲು ಈ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಮಾದರಿಗಳ PCR ವರ್ಧನೆಯು HTS ಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಅನ್ವಯವಾಗುವ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1a).ಎ) HTS11 ಅನುಕ್ರಮ ದೋಷಗಳು, b) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ (NNK) 1-12, ಮತ್ತು c) ಸ್ಟ್ಯಾಂಡ್‌ಬೈ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (wt) ಫೇಜ್ (ಅಸ್ಥಿಪಂಜರ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳು) ಇರುವಿಕೆ, ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಅನುಕ್ರಮ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1).ಈ ಫಿಲ್ಟರ್ ಹಂತಗಳು ಎಲ್ಲಾ HTS ಅನುಕ್ರಮ ಲೈಬ್ರರಿಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತವೆ.ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಾಗಿ, ಒಟ್ಟು 233,868 ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ, ಅದರಲ್ಲಿ 39% ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ಅಂಗೀಕರಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ ಲೈಬ್ರರಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಆಯ್ಕೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1c-e).ರೀಡ್‌ಗಳು ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ 3 ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳ ಉದ್ದದ ಗುಣಕಗಳಾಗಿದ್ದು, 36 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1c) ಒಂದು ಶಿಖರವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದು, ಲೈಬ್ರರಿ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು (NNK) 1-12 ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಸರಿಸುಮಾರು 11% ಲೈಬ್ರರಿ ಸದಸ್ಯರು 12-ಆಯಾಮದ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (wt) ಬೆನ್ನೆಲುಬು PAGISRELVDKL ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರು ಮತ್ತು ಬಹುತೇಕ ಅರ್ಧದಷ್ಟು ಅನುಕ್ರಮಗಳು (49%) ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳು ಅಥವಾ ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ.ಲೈಬ್ರರಿ ಲೈಬ್ರರಿಯ HTS ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ: 81% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಒಮ್ಮೆ ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಬಂದಿವೆ ಮತ್ತು ಕೇವಲ 1.5% ಮಾತ್ರ ≥4 ಪ್ರತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2a).ರೆಪರ್ಟರಿಯಲ್ಲಿನ ಎಲ್ಲಾ 12 ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ (aa) ಆವರ್ತನಗಳು ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ NKK ರೆಪರ್ಟರಿಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಗೆ ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಆವರ್ತನಗಳೊಂದಿಗೆ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2b).ಈ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳಿಂದ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ aa ಅವಶೇಷಗಳ ಆವರ್ತನವು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದ ಆವರ್ತನದೊಂದಿಗೆ (r = 0.893) ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2c).ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ಗಾಗಿ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ತಯಾರಿಕೆಯು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸುವ ಮತ್ತು ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ಹಂತಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.12,13 ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಸಮರ್ಥವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಈ ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾದ ಪ್ಲೇಟ್-ಆಂಪ್ಲಿಫೈಡ್ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ನಾವು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಎಎ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು ಮೂಲ ಲೈಬ್ರರಿಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಮೂಲ ಪೂಲ್ ಮತ್ತು ವರ್ಧಿತ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಪೂಲ್ (ಪೂರಕ Fig. 2d) ನಡುವೆ ಬಲವಾದ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು (r = 0.995) ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, T7 ​​ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಲಾದ ತದ್ರೂಪುಗಳ ನಡುವಿನ ಸ್ಪರ್ಧೆಯು ಪ್ರಮುಖ ಪಕ್ಷಪಾತವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಹೋಲಿಕೆಯು ಪ್ರತಿ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿರುವ ಟ್ರೈಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು (~109) HTS ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ aa ನ ಆವರ್ತನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನಮೂದಿಸಿದ ಸಂಗ್ರಹದ ಕೊನೆಯ ಮೂರು ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಸ್ಥಾನ-ಅವಲಂಬಿತ ಪಕ್ಷಪಾತವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2e).ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಲೈಬ್ರರಿಯ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ವೈವಿಧ್ಯತೆಯು ಸ್ವೀಕಾರಾರ್ಹವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೀರ್ಮಾನಿಸಿದೆವು ಮತ್ತು ಹಲವಾರು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಗಳ ನಡುವೆ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ತಯಾರಿಕೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.
BBB ಮತ್ತು/ಅಥವಾ BCSFB (Fig. 1a-b) ಮೂಲಕ ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ (iv) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ T7 ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಅನುಕೂಲವಾಗುವಂತೆ ಪ್ರಜ್ಞೆಯ ಇಲಿಗಳ CM ಗೆ ಕ್ಯಾನುಲಾವನ್ನು ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯಿಂದ ಅಳವಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಸರಣಿ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ನಾವು in vivo ಆಯ್ಕೆಯ (Fig. 1c) ಮೊದಲ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಆಯ್ಕೆಯ ತೋಳುಗಳನ್ನು (ಆರ್ಮ್ಸ್ A ಮತ್ತು B) ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.ಮೊದಲ ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಗಳಲ್ಲಿ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಒಟ್ಟು ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಆಯ್ಕೆಯ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದ್ದೇವೆ.ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, ನಾವು ಎ ಮತ್ತು ಬಿ ಶಾಖೆಗಳಿಂದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮೂರು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಆಯ್ಕೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ T7 ಫೇಜ್ ಕಣಗಳ in vivo ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ (PAGISRELVDKL ಮಾಸ್ಟರ್ ಇನ್ಸರ್ಟ್) ಅನ್ನು ಬಾಲ ಅಭಿಧಮನಿ ಮೂಲಕ ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು.ವಿಭಿನ್ನ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ಫೇಜ್‌ಗಳ ಚೇತರಿಕೆಯು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾದ T7 ಐಕೋಸಾಹೆಡ್ರಲ್ ಫೇಜ್‌ಗಳು ರಕ್ತ ವಿಭಾಗದಿಂದ ತ್ವರಿತ ಆರಂಭಿಕ ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್ ಹಂತವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 3).ನೀಡಲಾದ ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇಲಿಗಳ ರಕ್ತದ ಪರಿಮಾಣದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ನಾವು ಅಂದಾಜು 1% wt ಎಂದು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದ್ದೇವೆ.ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಆಡಳಿತದ ಡೋಸ್ನಿಂದ ಫೇಜ್ ಪತ್ತೆಯಾಗಿದೆ.ಈ ಆರಂಭಿಕ ತ್ವರಿತ ಕುಸಿತದ ನಂತರ, ನಿಧಾನವಾದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು 27.7 ನಿಮಿಷಗಳ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯೊಂದಿಗೆ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, CSF ಕಂಪಾರ್ಟ್‌ಮೆಂಟ್‌ನಿಂದ ಕೆಲವೇ ಕೆಲವು ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಹಿಂಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ, ಇದು CSF ಕಂಪಾರ್ಟ್‌ಮೆಂಟ್‌ಗೆ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ ವಲಸೆಗೆ ಕಡಿಮೆ ಹಿನ್ನೆಲೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 3).ಸರಾಸರಿಯಾಗಿ, ರಕ್ತದಲ್ಲಿನ T7 ಫೇಜ್‌ನ ಸುಮಾರು 1 x 10-3% ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು 4 x 10-8% ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ತುಂಬಿದ ಫೇಜ್‌ಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾದರಿ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ (0-250 ನಿಮಿಷಗಳು) ಪತ್ತೆಯಾಗಿವೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿನ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ನ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯು (25.7 ನಿಮಿಷ) ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವಂತೆಯೇ ಇತ್ತು.ರಕ್ತದಿಂದ CSF ವಿಭಾಗವನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ತಡೆಗೋಡೆ CM-ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಖಂಡವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಈ ಡೇಟಾವು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ vivo ಆಯ್ಕೆಯು ರಕ್ತದಿಂದ CSF ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ಸುಲಭವಾಗಿ ಸಾಗಿಸುವ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.
(a) ದೊಡ್ಡ ಪೂಲ್‌ನಿಂದ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವವನ್ನು (CSF) ಮರು-ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ವಿಧಾನವನ್ನು ಹೊಂದಿಸುವುದು.(ಬಿ) ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದ (ಸಿಎನ್‌ಎಸ್) ತಡೆಗೋಡೆಯ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸ್ಥಳವನ್ನು ತೋರಿಸುವ ರೇಖಾಚಿತ್ರ ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ (ಬಿಬಿಬಿ) ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ದಾಟುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಬಳಸುವ ಆಯ್ಕೆ ತಂತ್ರ.(ಸಿ) ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಫ್ಲೋಚಾರ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ.ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಲ್ಲಿ, ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು (ಬಾಣಗಳೊಳಗಿನ ಪ್ರಾಣಿ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗಳು) ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ.ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪರ್ಯಾಯ ಶಾಖೆಗಳನ್ನು (ಎ, ಬಿ) 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯವರೆಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.3 ಮತ್ತು 4 ರ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ, CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಪ್ರತಿ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್ ಅನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.(ಡಿ) T7 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ (2 x 1012 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ) ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ ಎರಡು ತೂರುನಳಿಕೆಯ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರಕ್ತದಿಂದ (ಕೆಂಪು ವಲಯಗಳು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಿಂದ (ಹಸಿರು ತ್ರಿಕೋನಗಳು) ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಫೇಜ್‌ನ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರ.ನೀಲಿ ಚೌಕಗಳು ರಕ್ತದಲ್ಲಿನ ಫೇಜ್‌ನ ಸರಾಸರಿ ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ, ಒಟ್ಟು ರಕ್ತದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಗಣನೆಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಫೇಜ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕಪ್ಪು ಚೌಕಗಳು ರಕ್ತದ ಫೇಜ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ y ರೇಖೆಯ ಛೇದನದ ಬಿಂದುವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.(ಇ, ಎಫ್) ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭವನೀಯ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಿ.1000 ರೀಡಿಂಗ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ (p <0.001) ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.(ಇ) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ರಕ್ತದಿಂದ ಪಡೆದ ಫೇಜ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲೋಟ್ #1.1 ಮತ್ತು #1.2.(ಎಫ್) ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಫೇಜ್ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್ಸ್ #1.1 ಮತ್ತು #1.2 ರ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲೋಟ್.(g, h) ರಕ್ತದಲ್ಲಿ (g) ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್‌ನ ಅನುಕ್ರಮ ID ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ ಮತ್ತು ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿದ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು ಮತ್ತು CSF (h) ನಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿರುವ ಫೇಜ್ ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು ಸುತ್ತಿನ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ ರಕ್ತ.ಒಂದು ಅಕ್ಷರದ ಕೋಡ್‌ನ ಗಾತ್ರವು ಆ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಹಸಿರು = ಧ್ರುವ, ನೇರಳೆ = ತಟಸ್ಥ, ನೀಲಿ = ಮೂಲ, ಕೆಂಪು = ಆಮ್ಲೀಯ ಮತ್ತು ಕಪ್ಪು = ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು.ಚಿತ್ರ 1a, b ಅನ್ನು ಎಡ್ವರ್ಡ್ ಉರಿಚ್ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದಾರೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ಮಿಸಿದ್ದಾರೆ.
ನಾವು ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಎರಡು CM ಉಪಕರಣ ಇಲಿಗಳಿಗೆ (ಕ್ಲೇಡ್‌ಗಳು A ಮತ್ತು B) ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಫೇಜ್ (ಚಿತ್ರ 1d).ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಆರಂಭಿಕ ಕ್ಷಿಪ್ರ ತೆರವು ಕಡಿಮೆ ಉಚ್ಚರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಸರಾಸರಿ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯು ರಕ್ತದಲ್ಲಿ 24.8 ನಿಮಿಷಗಳು, ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಹೋಲುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CSF ನಲ್ಲಿ 38.5 ನಿಮಿಷಗಳು.ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಯಿಂದ ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಫೇಜ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು HTS ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಣ್ಣ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಗಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಟ್ರಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವು ರಚನೆಯ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಆಧಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ14,15.ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ರಕ್ತದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ತದ್ರೂಪುಗಳ ನಡುವಿನ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ವಿತರಣೆಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಉತ್ತಮ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1e).ರಕ್ತ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಸ್ವಲ್ಪಮಟ್ಟಿಗೆ ಮಾತ್ರ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಡೇಟಾ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.Weblogo16 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನ ಅಳವಡಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಅಮಿನೊ ಆಸಿಡ್ ಆವರ್ತನಗಳು ಮತ್ತು ಒಮ್ಮತದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ನಾವು ರಕ್ತದ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 1g) ಬಲವಾದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.CSF ನಿಂದ ಆಯ್ಕೆಯಾದ ತದ್ರೂಪುಗಳೊಂದಿಗೆ ರಕ್ತವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ಬಲವಾದ ಆಯ್ಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಮಾದರಿಗಳ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು (Fig. 1f), ಮತ್ತು 12-ಸದಸ್ಯರಲ್ಲಿ (Fig. 1h) ಪೂರ್ವನಿರ್ಧರಿತ ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿ ಇರುತ್ತವೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿವೆ, ಆದರೆ ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ರಕ್ತದ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ. 4a-j).ಪ್ರಾಣಿಗಳ #1.1 ಮತ್ತು #1.2 ರ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮ ಡೇಟಾದ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ನಂತರ, ಒಟ್ಟು 964 ಮತ್ತು 420 ಅನನ್ಯ 12-ಮೆರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1d-e).ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಯ ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಯಲ್ಲಿ HTS ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಭವವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಮೋಟಿಫ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂಗೆ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು (Fig. 2a, b, ef).CSF ನಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಫೇಜ್‌ನ ಮೊದಲ ಚಕ್ರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, A ಮತ್ತು B ಶಾಖೆಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 2) CSF ನಲ್ಲಿನ ಅನೇಕ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ಆಯ್ಕೆ ಮತ್ತು ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಅವು ಸ್ಥಿರವಾದ ಅನುಕ್ರಮದ ವಿವಿಧ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಗುರುತಿನ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪರ್ಯಾಯ ಕ್ಲಾಡ್ A (Fig. 2c, d) ಮತ್ತು ಕ್ಲಾಡ್ B (Fig. 2g, h) ನಲ್ಲಿ CSF ನಿಂದ ಮರುಪಡೆಯಲಾದ 12-ಆಯಾಮದ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಶಾಖೆಯಲ್ಲಿನ ಪೂಲ್ ಮಾಡಲಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು 12-mer ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ ಆಯ್ಕೆ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಪೂರಕ Fig. 5c,d) ಮತ್ತು ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ ಪೂಲ್ ಮಾಡಿದ ತದ್ರೂಪುಗಳಿಗಾಗಿ CSF/ಬ್ಲಡ್ ಟೈಟರ್ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 5e).)
ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿನ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವು ವಿವೋ ಫಂಕ್ಷನಲ್ ಫೇಜ್ ಡಿಸ್‌ಪ್ಲೇ ಆಯ್ಕೆಯಲ್ಲಿ ಸತತ ಎರಡು ಸುತ್ತುಗಳ ಮೂಲಕ.
ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಯ ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನಿಂದ (ಪ್ರಾಣಿಗಳು #1.1 ಮತ್ತು #1.2) ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಎಲ್ಲಾ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ಫ್ಲೂಯಿಡ್ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಲಾಯಿತು, ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು, HT-ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಮರು ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ (2 x 1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳು) 2 SM ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳು (#1.1 → #).2.1 ಮತ್ತು 2.2, 1.2 → 2.3 ಮತ್ತು 2.4).(a,b,e,f) ಮೊದಲ ಮತ್ತು ಎರಡನೆಯ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲಾ CSF-ಪಡೆದ ಫೇಜ್‌ಗಳ ಟ್ರಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲೋಟ್‌ಗಳು.ಎರಡೂ ದೃಷ್ಟಿಕೋನಗಳಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭವನೀಯ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ವಿತರಣೆ.1000 ರೀಡಿಂಗ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಹೋಲಿಸಿದ ಲೈಬ್ರರಿಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ (p <0.001) ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಅಥವಾ ಹೊರಗಿಡಲಾದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಂದ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.(c, d, g, h) ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಯಲ್ಲಿ 2 ಮತ್ತು 1 ರ ಸುತ್ತುಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಎಲ್ಲಾ CSF-ಸಮೃದ್ಧ 12 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ದೀರ್ಘ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಅನುಕ್ರಮ ಲೋಗೋ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ.ಒಂದು ಅಕ್ಷರದ ಕೋಡ್‌ನ ಗಾತ್ರವು ಆ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಲೋಗೋವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲು, ಎರಡು ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳ ನಡುವೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ CSF ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಹೋಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ: (c) #1.1-#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ಮತ್ತು (h) #1.2–#2.4.(ಸಿ, ಡಿ) ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ನಂ.2.1 ಮತ್ತು ಸಂ.2.2 ಅಥವಾ (g, h) ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಂ.2.3 ಮತ್ತು ಸಂ.2.4 ಅನ್ನು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಹಸಿರು = ಧ್ರುವ, ನೇರಳೆ = ತಟಸ್ಥ, ನೀಲಿ = ಮೂಲ, ಕೆಂಪು = ಆಮ್ಲೀಯ ಮತ್ತು ಕಪ್ಪು = ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು.
ಮೂರನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ, ನಾವು ಎರಡು ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ 332 CSF-ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿತ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಿಂದ 124 ವಿಶಿಷ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು (#3.1 ಮತ್ತು #3.2) ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 6a).LGSVS (18.7%) ಅನುಕ್ರಮವು ಅತ್ಯಧಿಕ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ನಂತರ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳು PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ಮತ್ತು SARGSWREIVSLS (2.2%).ಅಂತಿಮ ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, ನಾವು ಮೂರು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ (Fig. 1c) ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಶಾಖೆಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.CSF ನಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ 925 ಅನುಕ್ರಮ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳಲ್ಲಿ, ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ನಾವು 64 ವಿಶಿಷ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 6b) ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣವು 0.8% ಕ್ಕೆ ಇಳಿದಿದೆ.ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ CSF ತದ್ರೂಪುಗಳೆಂದರೆ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ಮತ್ತು RRPQKINGARVC (3.6%).%)).ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಉದ್ದದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅಳವಡಿಕೆಗಳು/ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳು ಅಥವಾ NNK ಲೈಬ್ರರಿ ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಗೊಳ್ಳುವ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ ಲೈಬ್ರರಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಕಾಲಿಕ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಅಕಾಲಿಕ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳು ಅನುಕೂಲಕರವಾದ aa ಮೋಟಿಫ್ ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದರಿಂದ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಉದ್ದವಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಕೆ/ಅಳಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಉಂಟಾಗಬಹುದು.ಇದು ವಿನ್ಯಾಸದ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್ ಅನ್ನು ಫ್ರೇಮ್‌ನ ಹೊರಗೆ ಇರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೊಸ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್ ಕೆಳಗೆ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವವರೆಗೆ ಅದನ್ನು ಓದುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಮಾದರಿ ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಎಲ್ಲಾ ನಾಲ್ಕು ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದ್ದೇವೆ.ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, ನಾವು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಮೊದಲ CSF ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಋಣಾತ್ಮಕ ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆಯು ತುಂಬಾ ಪ್ರಬಲವಾಗಿತ್ತು, ಆದರೆ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (Fig. 3a), ಇದು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸದಸ್ಯರ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ಪ್ರಸರಣದ ಕಡಿಮೆ ಸಂಭವನೀಯತೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ CSF ವಿಭಾಗ ಅಥವಾ ಸಂಬಂಧಿತ ಫೇಜ್‌ಗಳು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯೊಫೇಜ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ರಕ್ತಪ್ರವಾಹದಿಂದ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಅಥವಾ ತೆಗೆದುಹಾಕಲ್ಪಡುತ್ತವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ, CSF ನಲ್ಲಿನ ಫೇಜ್‌ಗಳ ಬಲವಾದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಎರಡೂ ಕ್ಲಾಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ಹಿಂದಿನ ಸುತ್ತು CSF ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಫೇಜ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 3a).ಮತ್ತೊಮ್ಮೆ, ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ರಕ್ತ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವಿಲ್ಲದೆ.ಮೂರನೇ ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ, ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳು CSF ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು.ಆಯ್ಕೆಯ ಕೊನೆಯ ಎರಡು ಸುತ್ತುಗಳ ನಡುವಿನ ಪ್ರತಿ ಅನನ್ಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದ ತುಲನಾತ್ಮಕ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಲ್ಲಿ (Fig. 3b) ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಇನ್ನೂ ಹೆಚ್ಚು ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.ಎರಡೂ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ದೃಷ್ಟಿಕೋನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎಲ್ಲಾ 64 ವಿಶಿಷ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಂದ ಒಟ್ಟು 931 ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗಿದೆ.ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಗ್ರಂಥಾಲಯಕ್ಕೆ (ಕಟ್-ಆಫ್: 10% ಪುಷ್ಟೀಕರಣ) (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 6c) ಹೋಲಿಸಿದರೆ ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಎಲ್ಲಾ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ತಮ್ಮ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ನಿಕಟವಾಗಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆಯ್ಕೆಯ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮಾದರಿಗಳು ಅಧ್ಯಯನದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಉದ್ದೇಶಗಳು ಎರಡೂ ಆಯ್ಕೆ ಶಾಖೆಗಳ ಹಿಂದಿನ ಎಲ್ಲಾ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕೆಲವು ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು (ಉದಾ. SGL, VSG, LGS GSV) ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ ಪರ್ಯಾಯ ಕ್ಲಾಡ್ A ನಿಂದ, ಇತರವುಗಳು (ಉದಾ FGW, RTN, WGF, NTR) ಪರ್ಯಾಯ ಕ್ಲಾಡ್ B ಯಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿವೆ.
CSF-ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್-ಡಿಸ್ಪ್ಲೇಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಪೇಲೋಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾಗಿರುವ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಲೀಡರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ CSF ಸಾಗಣೆಯ ಮೌಲ್ಯೀಕರಣ.
(a) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ (ಇನ್‌ಪುಟ್ = I) ಫೇಜ್ (PFU) ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ CSF ಫೇಜ್ ಟೈಟರ್‌ಗಳ (ಔಟ್‌ಪುಟ್ = O) ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಎಲ್ಲಾ ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ (R1-R4) ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅನುಪಾತಗಳು.ಕಳೆದ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳ (R2-R4) ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಹಿಂದಿನ ಸುತ್ತಿನ ಹೋಲಿಕೆ ಮತ್ತು ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ (R1) ತೂಕದ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ತೆರೆದ ಬಾರ್‌ಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ, ಮಬ್ಬಾದ ಬಾರ್‌ಗಳು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ.(***p<0.001, ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ).(b) ಅತ್ಯಂತ ಹೇರಳವಾಗಿರುವ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪಟ್ಟಿ, 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ CSF ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಫೇಜ್‌ಗಳಿಗೆ ಅವುಗಳ ಸಂಬಂಧಿತ ಅನುಪಾತದ ಪ್ರಕಾರ ಶ್ರೇಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆರು ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಸಂಖ್ಯೆಗಳು ಮತ್ತು ಆಯ್ಕೆಯ 3 ಮತ್ತು 4 ರ ನಡುವಿನ ಅವುಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಅಂಶಗಳು (ಇನ್ಸೆಟ್ಗಳು).(c,d) 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನಿಂದ ಆರು ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು, ಖಾಲಿ ಫೇಜ್ ಮತ್ತು ಪೇರೆಂಟಲ್ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು CSF ಮಾದರಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸೂಚಿಸಿದ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ..ಪ್ರತಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್ ಮತ್ತು ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ CSF ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ಸ್ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.(ಡಿ) ಮಾದರಿಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲಾ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಎಂಎಲ್‌ಗಳಿಗೆ ಸರಾಸರಿ CSF/ರಕ್ತದ ಅನುಪಾತವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.(ಇ) ನಾಲ್ಕು ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಲೀಡರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಒಂದು ಸ್ಕ್ರಾಂಬಲ್ಡ್ ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಅನ್ನು ಬಯೋಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ಗೆ ಅವುಗಳ ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಸ್ (ಟೆಟ್ರಾಮರ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ) ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಮೂಲಕ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ (ಟೈಲ್ ಸಿರೆ iv, 10 mg ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್/ಕೆಜಿ).ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಇಂಟ್ಯೂಬೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳು (N = 3).)CSF ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸಿದ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು CSF ಆಂಟಿ-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ELISA (nd = ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ) ಮೂಲಕ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ಪರೀಕ್ಷೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ).(ಎಫ್) 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಇತರ ಆಯ್ದ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಕ್ಲೋನ್ #2002 (ನೇರಳೆ) ನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅನುಕ್ರಮದ ಹೋಲಿಕೆ.ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಮತ್ತು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ತುಣುಕುಗಳು ಬಣ್ಣ-ಕೋಡೆಡ್ ಆಗಿರುತ್ತವೆ.
ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ (Fig. 3b) ಎಲ್ಲಾ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, CSF ಮಾದರಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಮತ್ತಷ್ಟು ವೈಯಕ್ತಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಆರು ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಸಮಾನ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರು ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಫೇಜ್, ಖಾಲಿ ಫೇಜ್ (ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಇಲ್ಲ) ಮತ್ತು ಪ್ರೊಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ಮೂರು ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ CM ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು CSF (Fig. 3c) ಮತ್ತು ರಕ್ತ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 7) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಎಲ್ಲಾ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳು ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್ (#1779) ಗಿಂತ 10-1000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ CSF ವಿಭಾಗವನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡಿವೆ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, #2020 ಮತ್ತು #2077 ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಫೇಜ್‌ಗಿಂತ ಸುಮಾರು 1000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ CSF ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು.ಪ್ರತಿ ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಅವೆಲ್ಲವೂ ಹೆಚ್ಚಿನ CSF ಹೋಮಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.ತದ್ರೂಪುಗಳು #1903 ಮತ್ತು #2011 ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ ತದ್ರೂಪುಗಳು #2077, #2002 ಮತ್ತು #2009 ಮೊದಲ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಳವು ಸಕ್ರಿಯ ಸಾರಿಗೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸಬಹುದು ಆದರೆ ಪರಿಶೀಲಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ.ಕ್ಲೋನ್ #2020, #2002, ಮತ್ತು #2077 ಉನ್ನತ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರಗೊಂಡಿತು, ಆದರೆ ಕ್ಲೋನ್ #2009 ರ CSF ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಆರಂಭಿಕ ಹೆಚ್ಚಳದ ನಂತರ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಯಿತು.ನಂತರ ನಾವು ಪ್ರತಿ CSF ಅಭ್ಯರ್ಥಿಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಅದರ ರಕ್ತದ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ (Fig. 3d).ಪ್ರತಿ CSF ಅಭ್ಯರ್ಥಿಯ ಸರಾಸರಿ ಟೈಟರ್‌ನ ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ರಕ್ತದ ಟೈಟರ್‌ನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವು ಆರು ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೂವರು ರಕ್ತ CSF ನಲ್ಲಿ ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಕ್ಲೋನ್ #2077 ಹೆಚ್ಚಿನ ರಕ್ತದ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7).ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಫೇಜ್ ಕಣಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ CSF ಕಂಪಾರ್ಟ್‌ಮೆಂಟ್‌ಗೆ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ಸಾಗಿಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಲು, ನಾವು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಫೇಜ್ ಕಣಕ್ಕೆ ಲಗತ್ತಿಸುವ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಯೋಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನಗೊಂಡ ನಾಲ್ಕು ಲೀಡರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು (ಸಂ. 2002, 2009, 2020 ಮತ್ತು 2077) ಫೇಜ್ ಜ್ಯಾಮಿತಿಯನ್ನು ಸ್ವಲ್ಪಮಟ್ಟಿಗೆ ಅನುಕರಿಸುವ ಮಲ್ಟಿಮೆರಿಕ್ ರೂಪಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ (SA) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಸ್ವರೂಪವು ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿನ SA ಮಾನ್ಯತೆಯನ್ನು ಕಾರ್ಗೋ-ರವಾನೆ ಮಾಡುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಅಳೆಯಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು.ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಈ SA-ಸಂಯೋಜಿತ ಸ್ವರೂಪದಲ್ಲಿ (Fig. 3e) ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದಾಗ ಫೇಜ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು.ಸ್ಕ್ರಾಂಬಲ್ಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಆರಂಭಿಕ ಮಾನ್ಯತೆ ಮತ್ತು 48 ಗಂಟೆಗಳ ಒಳಗೆ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ ಮಟ್ಟಗಳೊಂದಿಗೆ ವೇಗವಾಗಿ CSF ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು.CSF ಜಾಗಕ್ಕೆ ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳ ವಿತರಣಾ ಮಾರ್ಗಗಳ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ 1 ಗಂಟೆಯ ನಂತರ ಫೇಜ್ ಕಣಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ (IHC) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಹಿಟ್‌ಗಳ ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ನಾವು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ತದ್ರೂಪುಗಳು #2002, #2077, ಮತ್ತು #2009 ಅನ್ನು ಮೆದುಳಿನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಕಲೆಗಳಿಂದ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು, ಆದರೆ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್ (#1779) ಮತ್ತು ಕ್ಲೋನ್ #2020 ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8).ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು BBB ಅನ್ನು ದಾಟುವ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿನ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಊಹೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿವರವಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ BSCFB ಮಾರ್ಗವು ಸಹ ಒಳಗೊಂಡಿರಬಹುದು.ಇತರ ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಕ್ಲೋನ್‌ನ (#2002) ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ವಿಸ್ತರಣೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಸಾರಿಗೆ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 3f).
ಅದರ ವಿಶಿಷ್ಟ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಮತ್ತು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ CSF ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳದಿಂದಾಗಿ, ಫೇಜ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ ಕ್ಲೋನ್ #2077 ಅನ್ನು 48-ಗಂಟೆಗಳ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರಿಶೋಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಿರಂತರ SA ಮಟ್ಟಗಳ (Fig. 4a) ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ CSF ನಲ್ಲಿನ ತ್ವರಿತ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು.ಇತರ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, #2077 ಮಿದುಳಿನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳಿಗೆ ಬಲವಾಗಿ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ನೋಡಿದಾಗ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಮಾರ್ಕರ್ ಲೆಕ್ಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಕೋಲೊಕಲೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯಶಃ ಪ್ಯಾರೆಂಚೈಮಲ್ ಜಾಗದಲ್ಲಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಕಲೆಗಳು (ಚಿತ್ರ 4b).ಸಿಎನ್‌ಎಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ ಔಷಧೀಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಬಹುದೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, i) #2077 ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು ii) BACE1 ಇನ್‌ಹಿಬಿಟರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಟೆಡ್ ಆವೃತ್ತಿಗಳನ್ನು ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಅನುಪಾತಗಳಲ್ಲಿ SA ಯೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಿದ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ನಾವು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ.ಒಂದು ಸಂಯೋಜನೆಗಾಗಿ ನಾವು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದಕ್ಕೆ ನಾವು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕದ 1:3 ಅನುಪಾತವನ್ನು #2077 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.ಎರಡೂ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬೀಟಾ-ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ 40 (Abeta40) ನ ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮೆದುಳಿನ ಪ್ಯಾರೆಂಚೈಮಾದಲ್ಲಿ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುವ ಕಾರಣ ಅಬೆಟಾ40 ಅನ್ನು CSF ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, ಎರಡೂ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು Abeta40 (Fig. 4c, d) ನ ರಕ್ತದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ನಂ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳು ಮಾತ್ರ.2077 ಮತ್ತು SA ಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾಗಿರುವ BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ Abeta40 ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು (Fig. 4c).ಡೇಟಾವು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ನಂ.2077 60 kDa SA ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು CNS ಗೆ ಸಾಗಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ SA- ಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಔಷಧೀಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಸಹ ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ.
(a) T7 ಫೇಜ್‌ನ ಕ್ಲೋನಲ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ (2 × 10 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳು) CSF ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 (RLSSVDSDLSGC) ನ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು CM-ಇನ್ಟ್ಯೂಬೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್ (#1779).(b) ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ಮತ್ತು ನಾಳಗಳ (ಲೆಕ್ಟಿನ್) ಪ್ರತಿರೂಪವನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಫೇಜ್-ಇಂಜೆಕ್ಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (2 × 10 10 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ) ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋವೆಸೆಲ್‌ಗಳ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಕ್ ಚಿತ್ರ.ಈ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು 3 ಇಲಿಗಳಿಗೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಮೊದಲು 1 ಗಂಟೆ ಕಾಲ ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡಲು ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು.T7 ಫೇಜ್ ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್ ವಿರುದ್ಧ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ FITC-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಮೆದುಳುಗಳನ್ನು ವಿಭಾಗಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸ್ಥಿರೀಕರಣಕ್ಕೆ ಹತ್ತು ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು, DyLight594-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಲೆಕ್ಟಿನ್ ಅನ್ನು ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು.ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರೀಸ್ ಮತ್ತು ಪೆರಿವಾಸ್ಕುಲರ್ ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಲುಮೆನ್‌ನಲ್ಲಿ ಮೈಕ್ರೊವೆಸೆಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಫೇಜ್‌ಗಳ (ಹಸಿರು) ಲುಮಿನಲ್ ಸೈಡ್‌ನ ಲೆಕ್ಟಿನ್ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ (ಕೆಂಪು) ತೋರಿಸುವ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಚಿತ್ರಗಳು.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 10 µm ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ.(c, d) ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಏಕಾಂಗಿಯಾಗಿ ಅಥವಾ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಕನಿಷ್ಟ ಮೂರು ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ CM ಇಲಿಗಳ (10 mg ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್/ಕೆಜಿ) ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.Aβ40 ನಲ್ಲಿ BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಕಡಿತವನ್ನು Aβ1-40 ELISA ರಕ್ತದಲ್ಲಿ (ಕೆಂಪು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (ಕಿತ್ತಳೆ) ಸೂಚಿಸಿದ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಉತ್ತಮ ಸ್ಪಷ್ಟತೆಗಾಗಿ, 100% ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಗ್ರಾಫ್ನಲ್ಲಿ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯನ್ನು ಎಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.(ಸಿ) 3:1 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ಮತ್ತು BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಸಂಯೋಜಿತ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಿದ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ (ಕೆಂಪು ತ್ರಿಕೋನಗಳು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ (ಕಿತ್ತಳೆ ತ್ರಿಕೋನಗಳು) Aβ40 ನಲ್ಲಿ ಶೇಕಡಾವಾರು ಕಡಿತ.(ಡಿ) ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಶೇಕಡಾವಾರು ಕಡಿತ Aβ40 (ಕೆಂಪು ವಲಯಗಳು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (ಕಿತ್ತಳೆ ವೃತ್ತಗಳು) ಇಲಿಗಳ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಜೊತೆಗೆ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ Aβ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 420 pg/ml ಆಗಿತ್ತು (ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ವಿಚಲನ = 101 pg/ml).
ಬಯೋಮೆಡಿಕಲ್ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಹಲವಾರು ಕ್ಷೇತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಫೇಜ್ ಪ್ರದರ್ಶನವನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ17.ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ವಿವೋ ನಾಳೀಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯ ಅಧ್ಯಯನಗಳು 18,19 ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ನಾಳಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಅಧ್ಯಯನಗಳು 20,21,22,23,24,25,26 ರಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಈ ಆಯ್ಕೆ ವಿಧಾನದ ಅನ್ವಯವನ್ನು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ನಾಳಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ನೇರ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗೆ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ದಾಟಲು ಸಕ್ರಿಯ ಸಾರಿಗೆ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳ ಆವಿಷ್ಕಾರಕ್ಕೂ ವಿಸ್ತರಿಸಿದ್ದೇವೆ.CM ಇಂಟ್ಯೂಬೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ in vivo ಆಯ್ಕೆ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಾವು ಈಗ ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು CSF ಹೋಮಿಂಗ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ.12-mer ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ T7 ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, T7 ಫೇಜ್ ಸಾಕಷ್ಟು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ (ಅಂದಾಜು 60 nm ವ್ಯಾಸ) 10 ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ನೇರವಾಗಿ ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ಅಥವಾ ಕೋರಾಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್ ಅನ್ನು ದಾಟುತ್ತದೆ.ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ CM ಇಲಿಗಳಿಂದ CSF ಕೊಯ್ಲು ವಿವೋ ಫಂಕ್ಷನಲ್ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಫೇಜ್ ನಾಳಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿತವಾಗಿರದೆ ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಗೆ ಸಾಗಣೆಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಇದಲ್ಲದೆ, ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ರಕ್ತವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ಪಡೆದ ಫೇಜ್‌ಗಳಿಗೆ HTS ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ, CSF ನ ನಮ್ಮ ಆಯ್ಕೆಯು ರಕ್ತದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅಥವಾ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತಿನ ನಡುವಿನ ವಿಸ್ತರಣೆಗಾಗಿ ಫಿಟ್‌ನೆಸ್‌ನಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ರಕ್ತ ವಿಭಾಗವು ಆಯ್ಕೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಭಾಗವಾಗಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ CSF ವಿಭಾಗವನ್ನು ತಲುಪುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ಫೇಜ್‌ಗಳು ಮಿದುಳಿನಲ್ಲಿ ತಮ್ಮನ್ನು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಸಮಯ ರಕ್ತಪ್ರವಾಹದಲ್ಲಿ ಬದುಕಬೇಕು ಮತ್ತು ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡಬೇಕು.ಕಚ್ಚಾ HTS ಡೇಟಾದಿಂದ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲು, ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋನಲ್ಲಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮ ದೋಷಗಳಿಗೆ ಅಳವಡಿಸಲಾದ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ಅಳವಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ, ನಾವು ರಕ್ತ24, 27, 28 ರಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ T7 ಫೇಜ್‌ಗಳ (t½ ~ 28 ನಿಮಿಷ) ಕ್ಷಿಪ್ರ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ (t½ ~ 26 ನಿಮಿಷ) ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಅವುಗಳ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ರಕ್ತ ಮತ್ತು CSF ನಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, CSF ನಲ್ಲಿ ಫೇಜ್‌ನ ರಕ್ತದ ಸಾಂದ್ರತೆಯ 0.001% ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು, ಇದು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ T7 ಫೇಜ್‌ನ ಕಡಿಮೆ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಚಲನಶೀಲತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಕೆಲಸವು vivo ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸುವಾಗ ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಫೇಜ್ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗಳಿಗೆ ಚಲಾವಣೆಯಿಂದ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ತೆರವುಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಕೆಲವು ತದ್ರೂಪುಗಳು CNS ವಿಭಾಗವನ್ನು ತಲುಪಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯ ಕಡಿತವು ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಅತ್ಯಂತ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ CSF ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಸೀಮಿತ ಸಂಖ್ಯೆಯ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.ಇದು vivo ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ತಂತ್ರವು CSF ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯ ಶೇಖರಣೆ, ರಕ್ತ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ಕ್ಲೋನ್ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಮೊದಲ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ T7 ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ರಕ್ತದಿಂದ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕುವಂತಹ ಹಲವಾರು ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (Fig. 1d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4M).)ಆದ್ದರಿಂದ, ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ನಂತರ, CSF ನಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು, ಆದಾಗ್ಯೂ ಅದೇ ಆರಂಭಿಕ ಪೂಲ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಲೈಬ್ರರಿ ಸದಸ್ಯರನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮೂಲ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳಿಗೆ ಬಹು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಗಳು ವೈವಿಧ್ಯತೆಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಕಡಿತವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಘಟನೆಗಳು ಆರಂಭಿಕ ಆಯ್ಕೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಅವಿಭಾಜ್ಯ ಅಂಗವಾಗಿ ಪರಿಣಮಿಸುತ್ತದೆ, ಫಲಿತಾಂಶದ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ.ಮೂಲ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿನ ಅನೇಕ ತದ್ರೂಪುಗಳು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ CSF ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಅದೇ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಹ, ಆರಂಭಿಕ ಪೂಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕ್ಲೋನ್‌ನ ಸಣ್ಣ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು.
CSF ನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಲಕ್ಷಣಗಳು ರಕ್ತದಲ್ಲಿರುವವುಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಸಿನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಕಡೆಗೆ ಮೊದಲ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.(ಚಿತ್ರ 1g, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು 4e, 4f).ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಫೇಜ್ ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ಚಲಾವಣೆಯಿಂದ ಹೊರಬರುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಕಡಿಮೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಗ್ಲೈಸಿನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ, ಕ್ಯುರೇಟೆಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಗಳ ಮೂಲಕ ಸಾಗಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ: ಒಂದು ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಗೊಳ್ಳಲು ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು.ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ CSF-ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ತದ್ರೂಪುಗಳು CSF ನಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿವೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಒಂದು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಹಿಟ್ (#2077) ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವಿವರವಾಗಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇದು ಇತರ ಹಿಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ದೀರ್ಘ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7), ಮತ್ತು ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಶೇಷವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಅನ್ನು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಅಲ್ಬುಮಿನ್ 29 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅವುಗಳ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇದು ಪ್ರಸ್ತುತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ಗೆ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಕೆಲವು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು CSF ಪುಷ್ಟೀಕರಣದಲ್ಲಿ ವೇಲೆನ್ಸಿ-ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಡೇಟಾವನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ), ಇದು T7 ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್‌ನ ಪ್ರದರ್ಶಿತ ಮೇಲ್ಮೈ ರೇಖಾಗಣಿತಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿರಬಹುದು.ನಾವು ಬಳಸಿದ T7 ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ಪ್ರತಿ ಫೇಜ್ ಕಣಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ 5-15 ಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಇಲಿಗಳ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ಗೆ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾದ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಲೀಡ್ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ IHC ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 8).ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ತದ್ರೂಪುಗಳು (ಸಂ. 2002, ಸಂ. 2009 ಮತ್ತು ಸಂ. 2077) BBB ಯೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಡೇಟಾ ತೋರಿಸಿದೆ.ಈ BBB ಸಂವಾದವು CSF ನ ಶೇಖರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆಯೇ ಅಥವಾ BCSFB ಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಈ ತದ್ರೂಪುಗಳ ಚಲನೆಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಉಳಿದಿದೆ.ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಪ್ರೊಟೀನ್ ಕಾರ್ಗೋಗೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿದಾಗ ಮತ್ತು ಬಂಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟಾಗ ಅವುಗಳ CSF ಸಾರಿಗೆ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು SA ಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದು ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ (Fig. 3e) ಆಯಾ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪಡೆದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸುತ್ತದೆ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸೀಸದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 SA ಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾಗಿರುವ BACE1 ನ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕದ ಮೆದುಳಿನ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ, CSF ನಲ್ಲಿ Abeta40 ಮಟ್ಟವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ CNS ನಲ್ಲಿ ಉಚ್ಚಾರಣಾ ಫಾರ್ಮಾಕೊಡೈನಾಮಿಕ್ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ (Fig. 4).ಎಲ್ಲಾ ಹಿಟ್‌ಗಳ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಹೋಮಾಲಜಿ ಹುಡುಕಾಟವನ್ನು ನಡೆಸುವ ಮೂಲಕ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಹೋಮೋಲಾಗ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ.T7 ಲೈಬ್ರರಿಯ ಗಾತ್ರವು ಸರಿಸುಮಾರು 109 ಆಗಿದ್ದು, 12-ಮರ್ಸ್‌ನ ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಗಾತ್ರವು 4 x 1015 ಆಗಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು 12-ಮರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯ ಜಾಗದ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಭಾಗವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ.ಕಾಲ್ಪನಿಕವಾಗಿ, ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಯಾವುದೇ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಹೋಮೊಲಾಗ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಹಿಡಿಯದಿರುವ ಕಾರಣವೆಂದರೆ ಮೆದುಳಿನೊಳಗೆ ಕೆಲವು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಪ್ರವೇಶವನ್ನು ತಡೆಯಲು ವಿಕಾಸದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಡಿಸೆಲೆಕ್ಷನ್ ಆಗಿರಬಹುದು.
ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ವಿವೋದಲ್ಲಿನ ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ತಡೆಗೋಡೆಯ ಸಾರಿಗೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿರೂಪಿಸಲು ಭವಿಷ್ಯದ ಕೆಲಸಕ್ಕೆ ಆಧಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ.ಈ ವಿಧಾನದ ಮೂಲಭೂತ ಸೆಟಪ್ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಯ ತಂತ್ರವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ ಅದು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ನಾಳೀಯ ಬಂಧಿಸುವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಯಶಸ್ವಿ ತದ್ರೂಪುಗಳು CNS ವಿಭಾಗದೊಳಗೆ ಜೈವಿಕ ಅಡೆತಡೆಗಳನ್ನು ದಾಟಲು ಸ್ವಾಭಾವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಹಂತವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಸಾಗಣೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಮತ್ತು ಮೆದುಳಿನ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮೈಕ್ರೊವಾಸ್ಕುಲೇಚರ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಲು ಅವುಗಳ ಆದ್ಯತೆಯನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸುವುದು.ಇದು BBB ಮತ್ತು ಗ್ರಾಹಕಗಳ ಸಾಗಣೆಗೆ ಹೊಸ ಮಾರ್ಗಗಳ ಆವಿಷ್ಕಾರಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ಗ್ರಾಹಕಗಳಿಗೆ ಅಥವಾ BBB ಅಥವಾ BCSFB ಮೂಲಕ ರವಾನೆಯಾಗುವ ಲಿಗಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ.ಈ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾದ CSF ಸಾರಿಗೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.BBB ಮತ್ತು/ಅಥವಾ BCSFB ಅನ್ನು ದಾಟುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಕ್ಕಾಗಿ ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಮೆದುಳಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನಾವು ಪ್ರಸ್ತುತ ತನಿಖೆ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಹೊಸ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಹೊಸ ಗ್ರಾಹಕಗಳು ಅಥವಾ ಮಾರ್ಗಗಳ ಸಂಭಾವ್ಯ ಆವಿಷ್ಕಾರಕ್ಕಾಗಿ ಮತ್ತು ಮೆದುಳಿಗೆ ಬಯೋಲಾಜಿಕ್ಸ್‌ನಂತಹ ಸ್ಥೂಲ ಅಣುಗಳ ವಿತರಣೆಗಾಗಿ ಹೊಸ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವೇದಿಕೆಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ಅತ್ಯಂತ ಅಮೂಲ್ಯವಾದ ಸಾಧನಗಳಾಗಿವೆ.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನದ ಮಾರ್ಪಾಡು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೊಡ್ಡ ಸಿಸ್ಟರ್ನಾ (CM) ಅನ್ನು ಕ್ಯಾನುಲೇಟ್ ಮಾಡಿ.ಅರಿವಳಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾದ ವಿಸ್ಟಾರ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು (200-350 ಗ್ರಾಂ) ಸ್ಟೀರಿಯೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಉಪಕರಣದ ಮೇಲೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ತಲೆಬುರುಡೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲು ಕ್ಷೌರ ಮತ್ತು ಅಸೆಪ್ಟಿಕಲ್ ತಯಾರಿಸಿದ ನೆತ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ಮಧ್ಯದ ಛೇದನವನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಮೇಲಿನ ಕವಚದ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಎರಡು ರಂಧ್ರಗಳನ್ನು ಕೊರೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ರಂಧ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಫಿಕ್ಸಿಂಗ್ ಸ್ಕ್ರೂಗಳನ್ನು ಜೋಡಿಸಿ.ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ತೂರುನಳಿಗೆ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟಾಕ್ಟಿಕ್ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನಕ್ಕಾಗಿ ಲ್ಯಾಟರಲ್ ಆಕ್ಸಿಪಿಟಲ್ ಕ್ರೆಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ರಂಧ್ರವನ್ನು ಕೊರೆಯಲಾಗಿದೆ.ತೂರುನಳಿಗೆ ಸುತ್ತಲೂ ದಂತ ಸಿಮೆಂಟ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿ ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ರೂಗಳಿಂದ ಸುರಕ್ಷಿತಗೊಳಿಸಿ.ಫೋಟೋ-ಕ್ಯೂರಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಸಿಮೆಂಟ್ ಗಟ್ಟಿಯಾಗಿಸುವಿಕೆಯ ನಂತರ, ಚರ್ಮದ ಗಾಯವನ್ನು 4/0 ಸುಪ್ರಮಿಡ್ ಹೊಲಿಗೆಯಿಂದ ಮುಚ್ಚಲಾಯಿತು.ತೂರುನಳಿಗೆ ಸರಿಯಾದ ನಿಯೋಜನೆಯು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ (CSF) ಸ್ವಾಭಾವಿಕ ಸೋರಿಕೆಯಿಂದ ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.ಸ್ಟಿರಿಯೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಉಪಕರಣದಿಂದ ಇಲಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರದ ಆರೈಕೆ ಮತ್ತು ನೋವು ನಿರ್ವಹಣೆಯನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಳ್ಳಿ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ರಕ್ತದ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಕಂಡುಬರುವವರೆಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ವಾರದವರೆಗೆ ಅದನ್ನು ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಅನುಮತಿಸಿ.ವಿಸ್ಟಾರ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು (Crl:WI/Han) ಚಾರ್ಲ್ಸ್ ನದಿಯಿಂದ (ಫ್ರಾನ್ಸ್) ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಇಲಿಗಳನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರೋಗಕಾರಕ-ಮುಕ್ತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವಿಟ್ಜರ್ಲೆಂಡ್‌ನ ಬಾಸೆಲ್ ನಗರದ ಪಶುವೈದ್ಯಕೀಯ ಕಚೇರಿ ಅನುಮೋದಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಅನಿಮಲ್ ಲೈಸೆನ್ಸ್ ಸಂಖ್ಯೆ 2474 (ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಮತ್ತು ಇಲಿಗಳ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಸಕ್ರಿಯ ಮಿದುಳಿನ ಸಾರಿಗೆಯ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ) ಅನುಸಾರವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಕೈಯಲ್ಲಿ ಸಿಎಂ ಕ್ಯಾನುಲಾದೊಂದಿಗೆ ಇಲಿಯನ್ನು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಜಾಗೃತಗೊಳಿಸಿ.ಕ್ಯಾನುಲಾದಿಂದ ಡಾಟುರಾವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 10 µl ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತವಾಗಿ ಹರಿಯುವ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.ತೂರುನಳಿಗೆಯ ಹಕ್ಕುಸ್ವಾಮ್ಯವು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ರಾಜಿ ಮಾಡಿಕೊಂಡ ಕಾರಣ, ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ರಕ್ತದ ಮಾಲಿನ್ಯ ಅಥವಾ ಬಣ್ಣಕ್ಕೆ ಯಾವುದೇ ಪುರಾವೆಗಳಿಲ್ಲದ ಸ್ಪಷ್ಟ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ, ಸರಿಸುಮಾರು 10-20 μl ರಕ್ತವನ್ನು ಹೆಪಾರಿನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ನೊಂದಿಗೆ ಟ್ಯೂಬ್ಗಳಾಗಿ ಬಾಲದ ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಛೇದನದಿಂದ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ.T7 ಫೇಜ್ನ ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತವನ್ನು ವಿವಿಧ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ CSF ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೊದಲು ಸರಿಸುಮಾರು 5-10 μl ದ್ರವವನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಕ್ಯಾತಿಟರ್ನ ಸತ್ತ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ.
T7Select ಸಿಸ್ಟಂ ಕೈಪಿಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ T7Select 10-3b ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ 12-mer DNA ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸ್ವರೂಪದಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ:
NNK ಕೋಡಾನ್ ಅನ್ನು ಡಬಲ್ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಮಿನೊ ಆಸಿಡ್ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.N ಎಂಬುದು ಪ್ರತಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ನ ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಿತ ಈಕ್ವಿಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು K ಎಂಬುದು ಅಡೆನೈನ್ ಮತ್ತು ಸೈಟೋಸಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳ ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಿತ ಈಕ್ವಿಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತವಾಗಿದೆ.37 ° C ನಲ್ಲಿ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕ್ಲೆನೊ ಬಫರ್ (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ನಲ್ಲಿ dNTP (ನೊವಾಜೆನ್) ಮತ್ತು ಕ್ಲೆನೊ ಕಿಣ್ವ (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತಷ್ಟು ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಏಕ ಎಳೆ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, EtOH ಮಳೆಯಿಂದ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಮರುಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ DNA ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಕಿಣ್ವಗಳಾದ EcoRI ಮತ್ತು HindIII (ಎರಡೂ ರೋಚೆಯಿಂದ) ಜೀರ್ಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಸೀಳಿದ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ (QIAquick, Qiagen) ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು (T4 ಲಿಗೇಸ್, ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ನಂತರ 10B ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್ ಜೀನ್‌ನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ 348 ರ ನಂತರ ಪೂರ್ವ-ವಿಚ್ಛೇದಿತ T7 ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ ಫ್ರೇಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು.ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್‌ಗೆ ಮೊದಲು 18 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಬಂಧನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು 16 ° C. ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.T7Select 10-3b ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಕಿಟ್ (ನೊವಾಜೆನ್) ನೊಂದಿಗೆ ಒದಗಿಸಲಾದ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಫೇಜ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಎಸ್ಚೆರಿಚಿಯಾ ಕೋಲಿ (BLT5615, ನೊವಾಜೆನ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೈಸಿಸ್‌ಗೆ ಒಮ್ಮೆ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ.ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನ ಸ್ಟಾಕ್ ಪರಿಹಾರವಾಗಿ -80 ° C. ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ, ಟೈಟ್ರೇಟ್ ಮತ್ತು ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಸ್ವಾಮ್ಯದ 454/ರೋಚೆ-ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾರು ಅಥವಾ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಿದ ಫೇಜ್ ವೇರಿಯಬಲ್ ಪ್ರದೇಶಗಳ ನೇರ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆ.ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್ ವೇರಿಯಬಲ್ ಪ್ರದೇಶ (NNK) 12 (ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ), GS FLX ಟೈಟಾನಿಯಂ ಅಡಾಪ್ಟರ್ A, ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕು-ಬೇಸ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಕೀ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ (TCAG) (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗರ್ 1a):
ಹಿಮ್ಮುಖ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೈಮರ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲು ಜೋಡಿಸಲಾದ ಬಯೋಟಿನ್ ಮತ್ತು ಎಮಲ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕ್ಲೋನಲ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ GS FLX ಟೈಟಾನಿಯಂ ಅಡಾಪ್ಟರ್ B ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ:
ನಂತರ 454 GS-FLX ಟೈಟಾನಿಯಂ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳನ್ನು 454/ರೋಚೆ ಪೈರೋಸೆನ್ಸಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕಾಗಿ (ಅಪ್ಲೈಡ್ ಬಯೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ ಹಿಟಾಚಿ 3730 xl DNA ವಿಶ್ಲೇಷಕ), T7 ಫೇಜ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್‌ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ:
ರೋಚೆ ಫಾಸ್ಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಕಿಟ್ (ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ಲೇಕ್‌ಗಳಿಂದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ (95 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷ) ಮತ್ತು 35 ಬೂಸ್ಟ್ ಸೈಕಲ್‌ಗಳನ್ನು (95 °C ನಲ್ಲಿ 50 ಸೆ, 50 °C ನಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷ, ಮತ್ತು 72 °C ನಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷ) ಮಾಡಿ.
ಲೈಬ್ರರಿಗಳಿಂದ ಫೇಜ್, ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್, CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಫೇಜ್ ಅಥವಾ ವೈಯಕ್ತಿಕ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಎಸ್ಚೆರಿಚಿಯಾ ಕೋಲಿ BL5615 ನಲ್ಲಿ TB ಸಾರು (ಸಿಗ್ಮಾ ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಅಥವಾ 500 cm2 ಭಕ್ಷ್ಯಗಳಲ್ಲಿ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) 37 ° C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ.ಟ್ರಿಸ್-ಇಡಿಟಿಎ ಬಫರ್ (ಫ್ಲೂಕಾ ಅನಾಲಿಟಿಕಲ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಪೈಪೆಟ್ ಸುಳಿವುಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಕ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಕಲ್ಚರ್ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಅಥವಾ ಎಕ್ಸ್‌ಟ್ರಾಕ್ಷನ್ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ಒಂದು ಸುತ್ತಿನ ಪಾಲಿಎಥಿಲೀನ್ ಗ್ಲೈಕಾಲ್ (PEG 8000) ಮಳೆ (ಪ್ರೋಮೆಗಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಟ್ರಿಸ್-ಇಡಿಟಿಎ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ (IV) ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ (500 μl/ಪ್ರಾಣಿ) ಮೊದಲು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವ ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಮಿಲ್ಟೆನಿ ಬಯೋಟೆಕ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವರ್ಧಿತ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು 2-3 ಸುತ್ತುಗಳ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, 2×1012 ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು;ಎರಡನೆಯದರಲ್ಲಿ, 2×1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು;ಮೂರನೇ ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕನೇ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಗೆ 2×109 ಫೇಜ್‌ಗಳು.ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಫೇಜ್ ವಿಷಯವನ್ನು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಪ್ಲೇಕ್ ಎಣಿಕೆಯ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (T7Select ಸಿಸ್ಟಮ್ ಕೈಪಿಡಿ).ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಬಾಲ ಅಭಿಧಮನಿಯೊಳಗೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳ ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ ಹಿಂದಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತಿನಿಂದ CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಮರು-ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರದ ಕೊಯ್ಲುಗಳನ್ನು 10 ನಿಮಿಷ, 30 ನಿಮಿಷ, 60 ನಿಮಿಷ, 90 ನಿಮಿಷ, 120 ನಿಮಿಷ, CSF ಮತ್ತು 18040 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ CSF ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಒಟ್ಟು ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತಿನ in vivo ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಇದರಲ್ಲಿ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ ಎರಡು ಶಾಖೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮೊದಲ ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮೊದಲ ಎರಡು ಸುತ್ತುಗಳ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಫೇಜ್ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು 454/Roche ಪೈರೋಸೆನ್ಸಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಕೊನೆಯ ಎರಡು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಎಲ್ಲಾ ರಕ್ತದ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ 454/ರೋಚೆ ಪೈರೋಸೆನ್ಸಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ, ಆಯ್ದ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು E. ಕೊಲಿ (BL5615) ನಲ್ಲಿ 500 cm2 ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಮತ್ತು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿರುವ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಟಿಬಿ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಪ್ರಚಾರ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಫೇಜ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯ ನಂತರ, ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್‌ನ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಮತ್ತು ತೆಗೆದುಹಾಕುವಿಕೆ (ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ), 300 μl ನಲ್ಲಿ 2×1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಒಂದು ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳಕ್ಕೆ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಅನುಕ್ರಮ ಡೇಟಾದ ಪೂರ್ವ ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಮತ್ತು ಗುಣಾತ್ಮಕ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್.ರಾ 454/ರೋಚೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ಬೈನರಿ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಮ್ಯಾಪ್ ಫಾರ್ಮ್ಯಾಟ್‌ನಿಂದ (ಎಸ್‌ಎಫ್‌ಎಫ್) ಮಾರಾಟಗಾರರ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಿಯರ್ಸನ್ ಹ್ಯೂಮನ್ ರೀಡಬಲ್ ಫಾರ್ಮ್ಯಾಟ್‌ಗೆ (ಫಾಸ್ಟಾ) ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ಕೆಳಗೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಸ್ವಾಮ್ಯದ C ಪ್ರೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡದ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್) ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಡೇಟಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ ಬಹು-ಹಂತದ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.ಮಾನ್ಯವಾದ 12mer ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲು, ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಲೇಬಲ್ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ಸ್ಟಾಪ್ ಲೇಬಲ್ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ಮತ್ತು ಜಾಗತಿಕ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಜೋಡಣೆಗೆ 2 ಅಸಂಗತತೆಗಳನ್ನು ಅನುಮತಿಸುವ ಜೋಡಣೆ31.ಆದ್ದರಿಂದ, ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಮತ್ತು ಸ್ಟಾಪ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ಗಳಿಲ್ಲದ ರೀಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಹಿನ್ನೆಲೆ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರೀಡ್‌ಗಳು, ಅಂದರೆ, ಅನುಮತಿಸಲಾದ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ಮೀರಿದ ಜೋಡಣೆಗಳನ್ನು ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಉಳಿದ ರೀಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, N-mer DNA ಅನುಕ್ರಮವು ಪ್ರಾರಂಭದ ಮಾರ್ಕ್‌ನಿಂದ ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಟಾಪ್‌ಮಾರ್ಕ್‌ನ ಮೊದಲು ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮೂಲ ಓದುವ ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ (ಇನ್ನು ಮುಂದೆ "ಇನ್ಸರ್ಟ್" ಎಂದು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ).ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ನ ಅನುವಾದದ ನಂತರ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 5′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್ ನಂತರದ ಭಾಗವನ್ನು ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ನಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಅಪೂರ್ಣ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಹಿನ್ನೆಲೆ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಲು, ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಮಾದರಿ "PAG" ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಅನುವಾದಿತ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಸಹ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.3 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ಅನುವಾದದ ನಂತರದ ಉದ್ದವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ರಂಥಾಲಯದಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಪೂಲ್‌ನಲ್ಲಿನ ಪುನರುಕ್ತಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಅನನ್ಯ ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ನ ಆವರ್ತನವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ.ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳ (ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳು) ಮತ್ತು ಅವುಗಳ (ಓದಲು) ಆವರ್ತನಗಳ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ (ಪೂರಕ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳು 1c ಮತ್ತು 2).
ಅನುಕ್ರಮ ಹೋಲಿಕೆಯ ಮೂಲಕ ಗುಂಪು N-mer DNA ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳು: 454/ರೋಚೆ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮ ದೋಷಗಳನ್ನು ತೊಡೆದುಹಾಕಲು (ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಹೋಮೋಪಾಲಿಮರ್ ವಿಸ್ತರಣೆಗಳ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿನ ಸಮಸ್ಯೆಗಳು) ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮುಖ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು, ಹಿಂದೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾದ N-mer DNA ಅನುಕ್ರಮದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು (ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳು) ಹೋಲಿಕೆಯಿಂದ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕೆಳಗಿನಂತೆ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾದ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು (2 ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗದ ಬೇಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುಮತಿಸಲಾಗಿದೆ): ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಅವುಗಳ ಆವರ್ತನದಿಂದ ಮೊದಲು ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಹೆಚ್ಚಿನದಿಂದ ಕಡಿಮೆ), ಮತ್ತು ಅವು ಒಂದೇ ಆಗಿದ್ದರೆ, ಅವುಗಳ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರಕಾರದ ಉದ್ದದಿಂದ (ಉದ್ದದಿಂದ ಚಿಕ್ಕದಕ್ಕೆ) ).ಹೀಗಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚು ಆಗಾಗ್ಗೆ ಮತ್ತು ದೀರ್ಘವಾದ ಅಳವಡಿಕೆಗಳು ಮೊದಲ "ಗುಂಪು" ಅನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸುತ್ತವೆ.ಗುಂಪಿನ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಕೀ ಆವರ್ತನಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ, ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ ಪಟ್ಟಿಯಲ್ಲಿ ಉಳಿದಿರುವ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಅಳವಡಿಕೆಯನ್ನು ಜೋಡಿಯಾಗಿ ನೀಡಲ್‌ಮ್ಯಾನ್-ವುನ್ಸ್ಚ್ ಜೋಡಣೆಯ ಮೂಲಕ ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಲ್ಲಿನ ಅಸಾಮರಸ್ಯಗಳು, ಅಳವಡಿಕೆಗಳು ಅಥವಾ ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು 2 ರ ಮಿತಿಯನ್ನು ಮೀರದಿದ್ದರೆ, ಒಂದು ಅಳವಡಿಕೆಯನ್ನು ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು ಗುಂಪಿನ ಆವರ್ತನವು ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಸೇರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂಬುದರ ಮೂಲಕ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ.ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಹೊರಗಿಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಈಗಾಗಲೇ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗದಿದ್ದರೆ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಆವರ್ತನದೊಂದಿಗೆ ಹೊಸ ಗುಂಪನ್ನು ರಚಿಸಲು ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಳಸಿದಂತೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಅಳವಡಿಕೆಯ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಸ ಗುಂಪನ್ನು ರಚಿಸಲು ಬಳಸಿದಾಗ ಅಥವಾ ಈಗಾಗಲೇ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಿದಾಗ ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಎಲ್ಲಾ ನಂತರ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಗುಂಪಿನ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಾಗಿ (ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು) ಅನುವಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶವು ಅಳವಡಿಕೆಗಳ ಒಂದು ಗುಂಪಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಅನುಗುಣವಾದ ಆವರ್ತನಗಳು ಸತತ ಓದುವಿಕೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2).
ಮೋಟಿಫ್ ಜನರೇಷನ್: ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿ, ಕೆಳಗೆ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅಮೈನೋ ಆಸಿಡ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (ಎಎ) ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಿಂದ 3 ಉದ್ದದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಸಂಭವನೀಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (ಟ್ರಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು) ಹೊಂದಿರುವ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮೋಟಿಫ್ ಲೈಬ್ರರಿಯೊಂದಿಗೆ ಅದರ ವಿಲೋಮ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಹೆಚ್ಚು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ, ಮೋಟಿಫ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿನ ಪ್ರತಿ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ, ನಾವು ಕಂಪ್ಯೂಟೇಶನಲ್ ಪರಿಕರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ರಂಥಾಲಯದಲ್ಲಿ ಅದರ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಕಂಡುಬರುವ ಮೋಟಿಫ್ ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೋಟಿಫ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿನ ಮೋಟಿಫ್‌ಗೆ ನಿಯೋಜಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ("ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ").ಮೋಟಿಫ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯ ಫಲಿತಾಂಶವು ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ (ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು) ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭವಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಎರಡು ಆಯಾಮದ ಸರಣಿಯಾಗಿದೆ (ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು) ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಅನುಕ್ರಮ ಮೌಲ್ಯಗಳು, ಇವು ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದಾಗ, ಗುಂಪುಗಳಾಗಿ ಮತ್ತು ಅನುವಾದಿಸಿದಾಗ ಅನುಗುಣವಾದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಅನುಕ್ರಮ ಓದುಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ.ಮೇಲೆ ವಿವರವಾಗಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೆಟ್ರಿಕ್ಸ್.
ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಣ: ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ
ಇಲ್ಲಿ ni ಎಂಬುದು ವಿಷಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಓದುಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ i.ಹೀಗಾಗಿ, vi ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಮೋಟಿಫ್ i ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರೀಡ್‌ಗಳ (ಅಥವಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು) ಶೇಕಡಾವಾರು ಆವರ್ತನವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರವಾದ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸದ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳಿಗೆ ಪಿ-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಉದ್ದೇಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕೋರೆಲೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ಸ್ಪಿಯರ್‌ಮ್ಯಾನ್‌ನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು R ನೊಂದಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಉದ್ದೇಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು, ವೆಬ್ ಲೋಗೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ಅನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, 12-ಮರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿರುವ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು 20×12 ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ, ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ವಿಷಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 1000 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಗುಂಪನ್ನು ಫಾಸ್ಟಾ-ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಫಾರ್ಮ್ಯಾಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವೆಬ್-ಲೋಗೋ 3 ಗೆ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ನಂತೆ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ವಿಷಯದ ಚಿತ್ರಾತ್ಮಕ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ.ಕೊಟ್ಟಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಾಗಿ.ಬಹುಆಯಾಮದ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು, R ನಲ್ಲಿ ಆಂತರಿಕವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ (biosHeatmap, ಇನ್ನೂ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗದ R ಪ್ಯಾಕೇಜ್).ಹೀಟ್ ಮ್ಯಾಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾದ ಡೆಂಡ್ರೊಗ್ರಾಮ್‌ಗಳನ್ನು ಯೂಕ್ಲಿಡಿಯನ್ ದೂರದ ಮೆಟ್ರಿಕ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವಾರ್ಡ್‌ನ ಕ್ರಮಾನುಗತ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಮೋಟಿಫ್ ಸ್ಕೋರಿಂಗ್ ಡೇಟಾದ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರವಾದ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಸಹಜವಾದ ಸ್ಕೋರಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇತರ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳಿಗೆ P-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು R ನಲ್ಲಿ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ t-ಪರೀಕ್ಷೆ ಅಥವಾ ANOVA ಬಳಸಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಆಯ್ದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳಿಲ್ಲದ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಬಾಲ ಅಭಿಧಮನಿಯ ಮೂಲಕ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ (300 μl PBS ನಲ್ಲಿ 2×1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳು).ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸ್ಥಿರೀಕರಣಕ್ಕೆ ಹತ್ತು ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು, ಅದೇ ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು 100 μl DyLight594-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಲೆಕ್ಟಿನ್ (ವೆಕ್ಟರ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರೀಸ್ Inc., DL-1177) ನೊಂದಿಗೆ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು.ಫೇಜ್ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ 60 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ, ಇಲಿಗಳನ್ನು 50 ಮಿಲಿ ಪಿಬಿಎಸ್ ನಂತರ 50 ಮಿಲಿ 4% ಪಿಎಫ್‌ಎ/ಪಿಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೃದಯದ ಮೂಲಕ ಸುಡಲಾಯಿತು.ಮೆದುಳಿನ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ 4% PFA/PBS ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4 ° C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 30% ಸುಕ್ರೋಸ್‌ನಲ್ಲಿ ನೆನೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ.OCT ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಫ್ಲ್ಯಾಷ್ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಘನೀಕೃತ ಮಾದರಿಗಳ ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 µm ಕ್ರಯೋಸೆಕ್ಷನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 1% BSA ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4 °C ನಲ್ಲಿ T7 ಫೇಜ್ (Novus NB 600-376A) ವಿರುದ್ಧ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ FITC-ಲೇಬಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕಾವುಕೊಡಿ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆದು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಲೇಸರ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (ಲೈಕಾ TCS SP5) ಮೂಲಕ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು.
98%ನಷ್ಟು ಕನಿಷ್ಠ ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಜೆನ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ USA ನಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಮತ್ತು ಲೈಯೋಫಿಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಟ್ರಿಪಲ್ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಸ್ಪೇಸರ್ ಮೂಲಕ ಬಯೋಟಿನ್ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎಲ್ಲಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿ.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ S0677) ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್, ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ BACE1 ಇನ್ಹಿಬಿಟರಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್, ಅಥವಾ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ನ ಸಂಯೋಜನೆ (3:1 ಅನುಪಾತ) 5-ಪಟ್ಟು ಈಕ್ವಿಮೋಲಾರ್ ಅಧಿಕದೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಗಿದೆ.ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮೊದಲು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ.ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಸಂಯೋಜಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮೆದುಳಿನ ಕುಹರದೊಂದಿಗಿನ ಇಲಿಗಳ ಬಾಲ ಸಿರೆಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಕ್ಕೆ 10 mg/kg ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ELISA ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಿದೆ.Nunc Maxisorp ಮೈಕ್ರೊಟೈಟರ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಸಿಗ್ಮಾ) 1.5 μg/ml ಮೌಸ್ ವಿರೋಧಿ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ (ಥರ್ಮೋ, MA1-20011) ರಾತ್ರಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ (ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ಜೆಲಾಟಿನ್, 1% BSA), ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 0.05% ಟ್ವೀನ್-20/PBS (ವಾಶ್ ಬಫರ್) ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಿರಿ (ವಾಶ್ ಬಫರ್) 3 ಪ್ಲಾಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ma 1:10,000, CSF 1:115).ಪತ್ತೆ ಪ್ರತಿಕಾಯ (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ರಾತ್ರಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.ಮೂರು ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳ ನಂತರ, TMB ತಲಾಧಾರದ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ (ರೋಚೆ) 20 ನಿಮಿಷಗಳವರೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು.1M H2SO4 ನೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಿದ ನಂತರ, ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು 450 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಿರಿ.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಪೆಪ್ಟೈಡ್-BACE1 ಪ್ರತಿರೋಧಕ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಕಾರ್ಯವನ್ನು Aβ(1-40) ELISA ಮೂಲಕ ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ (Wako, 294-64701) ಪ್ರಕಾರ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, CSF ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಡಿಲ್ಯೂಯೆಂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು (1:23) ಮತ್ತು BNT77 ಕ್ಯಾಪ್ಚರ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲೇಪಿತವಾದ 96-ಬಾವಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಐದು ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳ ನಂತರ, HRP-ಸಂಯೋಜಿತ BA27 ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 4 ° C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಐದು ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳು.ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ TMB ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ Aβ(1-40) ಪತ್ತೆಯಾಗಿದೆ.ಸ್ಟಾಪ್ ಪರಿಹಾರದೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಿದ ನಂತರ, ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು 450 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಿರಿ.Aβ(1-40) ELISA ಗಿಂತ ಮೊದಲು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಘನ ಹಂತದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಪ್ಲಾಸ್ಮಾವನ್ನು 96-ಬಾವಿ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ 0.2% DEA (ಸಿಗ್ಮಾ) ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.SPE ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಓಯಸಿಸ್, 186000679) ನೀರು ಮತ್ತು 100% ಮೆಥನಾಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸತತವಾಗಿ ತೊಳೆಯುವ ನಂತರ, ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು SPE ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ದ್ರವವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆದು (ಮೊದಲು 5% ಮೆಥನಾಲ್ ನಂತರ 30% ಮೆಥನಾಲ್) ಮತ್ತು 2% NH4OH/90% ಮೆಥನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು.ಸ್ಥಿರ N2 ಪ್ರವಾಹದಲ್ಲಿ 99 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 55 ° C ನಲ್ಲಿ ಎಲುಯೇಟ್ ಅನ್ನು ಒಣಗಿಸಿದ ನಂತರ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಡೈಲ್ಯೂಯೆಂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ Aβ (1-40) ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಈ ಲೇಖನವನ್ನು ಹೇಗೆ ಉಲ್ಲೇಖಿಸುವುದು: ಉರಿಚ್, ಇ. ಮತ್ತು ಇತರರು.ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೆದುಳಿಗೆ ಸರಕು ವಿತರಣೆ.ವಿಜ್ಞಾನ.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., ಥಾಮ್ಸೆನ್ LB ಮತ್ತು ಮೂಸ್ T. ಉದ್ದೇಶಿತ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೆದುಳಿಗೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಔಷಧಗಳ ವಿತರಣೆ.ಜರ್ನಲ್ ಆಫ್ ನ್ಯೂರೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ಮತ್ತು Martinez-Martinez, P. ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಔಷಧಗಳ ವಿತರಣೆ.ಪ್ರೋಗ್ ನ್ಯೂರೋಬಯೋಲ್ 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
ಪಾರ್ಡ್ರಿಡ್ಜ್, WM ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ: ಮೆದುಳಿನ ಔಷಧ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯಲ್ಲಿ ಅಡಚಣೆ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
ಜೋಹಾನ್ಸನ್, ಕೆಇ, ಡಂಕನ್, ಜೆಎ, ಸ್ಟೋಪಾ, ಇಜಿ, ಮತ್ತು ಬೈರ್ಡ್, ಎ. ಸುಧಾರಿತ ಡ್ರಗ್ ಡೆಲಿವರಿ ಮತ್ತು ಕೊರೊಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್-ಸಿಎಸ್‌ಎಫ್ ಪಾಥ್‌ವೇ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿಗೆ ಗುರಿಯಾಗಲು ಪ್ರಾಸ್ಪೆಕ್ಟ್ಸ್.ಔಷಧೀಯ ಸಂಶೋಧನೆ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
ಪಾರ್ಡ್ರಿಡ್ಜ್, WM ಮೆದುಳಿನ ವಿತರಣೆಗಾಗಿ ಆಣ್ವಿಕ ಟ್ರೋಜನ್ ಹಾರ್ಸ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಬಯೋಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್‌ಗಳ ಆಧುನೀಕರಣ.ಬಯೋಕಾಂಜಗ್ ಕೆಮ್ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
ಪಾರ್ಡ್ರಿಡ್ಜ್, ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ WM ಗ್ರಾಹಕ-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಾಗಣೆ.ಎಂಡೋಕ್ರ್ ರೆವ್. 7, 314–330 (1986).
ನಿವೋಹ್ನರ್, ಜೆ. ಮತ್ತು ಇತರರು.ಮೊನೊವೆಲೆಂಟ್ ಆಣ್ವಿಕ ಶಟಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೆದುಳಿನ ಒಳಹೊಕ್ಕು ಮತ್ತು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.ನ್ಯೂರಾನ್ 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ಬಿಯೆನ್-ಲೀ, ಎನ್. ಮತ್ತು ಇತರರು.ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆರಿನ್ ರಿಸೆಪ್ಟರ್ (ಟಿಎಫ್‌ಆರ್) ಸಾರಿಗೆಯು ಟಿಎಫ್‌ಆರ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಅಫಿನಿಟಿ ರೂಪಾಂತರಗಳ ಮೆದುಳಿನ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).