Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ನೀವು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲದೊಂದಿಗೆ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಿದ್ದೀರಿ. ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕೆಂದು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ). ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಕ್ಯಾರೋಸೆಲ್ ಅನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ. ಒಂದೇ ಬಾರಿಗೆ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಹಿಂದಿನ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ, ಅಥವಾ ಒಂದೇ ಬಾರಿಗೆ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಕೊನೆಯಲ್ಲಿರುವ ಸ್ಲೈಡರ್ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.
ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯು ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದಲ್ಲಿ ಜೈವಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳು ತಮ್ಮ ಗುರಿಗಳನ್ನು ತಲುಪುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗುತ್ತದೆ. ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಹೊಸ ಮೆದುಳಿನ ಸಾಗಣೆದಾರರನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲು, ನಾವು T7 ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಗ್ರಂಥಾಲಯವನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಇಲಿಗಳ ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಜಾಗೃತ ದೊಡ್ಡ ಪೂಲ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸರಣಿಯಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (CSF) ಅನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು CSF ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ವೈಯಕ್ತಿಕ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪರೀಕ್ಷೆಯು CSF ನಲ್ಲಿ 1000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಮೆದುಳಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ವಿತರಣೆಯ ಜೈವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾದ ಕಾದಂಬರಿ ಸಾಗಣೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-β ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ 40% ಕಡಿತದಿಂದ ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಇನ್ ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಪರಿಣಾಮದೊಂದಿಗೆ ಮೆದುಳಿಗೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್‌ಗಳ ವ್ಯವಸ್ಥಿತ ವಿತರಣೆಗೆ ಉಪಯುಕ್ತ ವಾಹನಗಳಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದ (CNS) ಉದ್ದೇಶಿತ ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ CNS-ಗುರಿ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಔಷಧಗಳು ಮತ್ತು ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದರ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿದೆ, ಮೆದುಳಿಗೆ ಸಕ್ರಿಯ ಔಷಧ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಯತ್ನವಿದೆ. ಔಷಧ ವಿತರಣೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ಅಣುಗಳು, ಆಧುನಿಕ ನರವಿಜ್ಞಾನ ಔಷಧ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಅವಿಭಾಜ್ಯ ಅಂಗವಾಗಿರುವುದರಿಂದ ಇದು ಈಗ ಬದಲಾಗಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿದೆ. ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದ ಪರಿಸರವು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ (BBB) ​​ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ (BCBB)1 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ತಡೆಗೋಡೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಿಂದ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು ಮೆದುಳಿಗೆ ಔಷಧಿಗಳನ್ನು ತಲುಪಿಸಲು ಸವಾಲಿನ ಸಂಗತಿಯಾಗಿದೆ1,2. ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ದೊಡ್ಡ ಅಣು ಔಷಧಗಳು ಮತ್ತು 98% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸಣ್ಣ ಅಣು ಔಷಧಗಳು ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಹೊರಹಾಕಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಅಂದಾಜಿಸಲಾಗಿದೆ3. ಅದಕ್ಕಾಗಿಯೇ CNS 4,5 ಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಔಷಧಿಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುವ ಹೊಸ ಮೆದುಳಿನ ಸಾರಿಗೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದು ಬಹಳ ಮುಖ್ಯ. ಆದಾಗ್ಯೂ, BBB ಮತ್ತು BCSFB ಔಷಧ ವಿತರಣೆಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಸಹ ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವು ಮೆದುಳಿನ ಎಲ್ಲಾ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಅದರ ವ್ಯಾಪಕ ನಾಳೀಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಮೂಲಕ ಭೇದಿಸಿ ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ. ಹೀಗಾಗಿ, ಮೆದುಳಿಗೆ ತಲುಪಿಸುವ ಆಕ್ರಮಣಶೀಲವಲ್ಲದ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಪ್ರಸ್ತುತ ಪ್ರಯತ್ನಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ BBB6 ಗ್ರಾಹಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ರಾಹಕ-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಸಾರಿಗೆ (PMT) ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿವೆ. ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫ್ರಿನ್ ಗ್ರಾಹಕ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇತ್ತೀಚಿನ ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರಗತಿಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ7,8, ಸುಧಾರಿತ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೊಸ ವಿತರಣಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಈ ಉದ್ದೇಶಕ್ಕಾಗಿ, CSF ಸಾಗಣೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದು ನಮ್ಮ ಗುರಿಯಾಗಿತ್ತು, ಏಕೆಂದರೆ ಅವುಗಳನ್ನು ತಾತ್ವಿಕವಾಗಿ CNS ಗೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್‌ಗಳನ್ನು ತಲುಪಿಸಲು ಅಥವಾ ಹೊಸ ಗ್ರಾಹಕ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ತೆರೆಯಲು ಬಳಸಬಹುದು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ (BBB ಮತ್ತು BSCFB) ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗ್ರಾಹಕಗಳು ಮತ್ತು ಸಾಗಣೆದಾರರು ಜೈವಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಔಷಧಿಗಳ ಸಕ್ರಿಯ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿತರಣೆಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಗುರಿಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು. ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (CSF) ಕೋರಾಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್ (CS) ನ ಸ್ರವಿಸುವ ಉತ್ಪನ್ನವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಬ್ಅರಾಕ್ನಾಯಿಡ್ ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು ಕುಹರದ ಸ್ಥಳದ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿನ ಅಂತರಾಳದ ದ್ರವದೊಂದಿಗೆ ನೇರ ಸಂಪರ್ಕದಲ್ಲಿದೆ4. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಸಬ್ಅರಾಕ್ನಾಯಿಡ್ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವವು ಮೆದುಳಿನ ಅಂತರಾಳಕ್ಕೆ ಅತಿಯಾಗಿ ಹರಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ9. ಈ ಸಬ್ಅರಾಕ್ನಾಯಿಡ್ ಒಳಹರಿವಿನ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಥವಾ ನೇರವಾಗಿ ಬಿಬಿಬಿ ಮೂಲಕ ಪ್ಯಾರೆಂಚೈಮಲ್ ಜಾಗವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸಲು ನಾವು ಆಶಿಸುತ್ತೇವೆ. ಇದನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು, ಈ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಮಾರ್ಗಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದಾದರೂ ಒಂದರಿಂದ ಸಾಗಿಸಲ್ಪಡುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ ಗುರುತಿಸುವ ದೃಢವಾದ ಇನ್ ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆ ತಂತ್ರವನ್ನು ನಾವು ಜಾರಿಗೆ ತಂದಿದ್ದೇವೆ.
ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ರಂಥಾಲಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯೊಂದಿಗೆ ಆರಂಭಿಕ ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲು CSF ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ (HTS) ಜೊತೆಗೆ ಅನುಕ್ರಮ ಇನ್ ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ನಾವು ಈಗ ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ. ರಕ್ತ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಶಾಶ್ವತವಾಗಿ ಅಳವಡಿಸಲಾದ ದೊಡ್ಡ ಸಿಸ್ಟರ್ನಾ (CM) ಕ್ಯಾನುಲಾ ಹೊಂದಿರುವ ಜಾಗೃತ ಇಲಿಗಳ ಮೇಲೆ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಈ ವಿಧಾನವು ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ಸಾರಿಗೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಮೆದುಳು-ಗುರಿ ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಅವುಗಳ ಸಣ್ಣ ಗಾತ್ರ (~60 nm)10 ಕಾರಣ ನಾವು T7 ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಎಂಡೋಥೀಲಿಯಲ್ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಎಪಿಥೇಲಿಯಲ್-ಮೆಡುಲ್ಲಾ ತಡೆಗೋಡೆಯ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ದಾಟುವಿಕೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುವ ಕೋಶಕಗಳ ಸಾಗಣೆಗೆ ಅವು ಸೂಕ್ತವೆಂದು ಸೂಚಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತಿನ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ನಂತರ, ಫೇಜ್ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಪ್ರಬಲವಾದ ಇನ್ ವಿವೋ CSF ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಮೈಕ್ರೋವೆಸೆಲ್ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಆದ್ಯತೆಯ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವಕ್ಕೆ ಸಾಗಿಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ ಎಂದು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಪ್ರಮುಖ ಸಾಗಣೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧಕದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ CNS ನ ಔಷಧೀಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಯಿತು. ಇನ್ ವಿವೋ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳು ನವೀನ ಮೆದುಳಿನ ಸಾಗಣೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸರಕು ವಾಹಕಗಳಾಗಿ ಗುರುತಿಸಬಹುದು ಎಂಬುದನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ನವೀನ ಮೆದುಳಿನ ಸಾಗಣೆ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆ ವಿಧಾನಗಳು ಸಹ ಮುಖ್ಯವಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಪ್ಲೇಕ್-ಫಾರ್ಮಿಂಗ್ ಯೂನಿಟ್‌ಗಳನ್ನು (PFU) ಆಧರಿಸಿ, ಫೇಜ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಹಂತದ ನಂತರ, ಸರಿಸುಮಾರು 109 ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ 12-ಮೆರ್ ಲೀನಿಯರ್ T7 ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಚಿಸಲಾಯಿತು (ಮೆಟೀರಿಯಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ). ಇನ್ ವಿವೋ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೊದಲು ನಾವು ಈ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯ. ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಮಾದರಿಗಳ PCR ವರ್ಧನೆಯು HTS ಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಅನ್ವಯವಾಗುವ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1a). a) HTS11 ಅನುಕ್ರಮ ದೋಷಗಳು, b) ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ (NNK)1-12, ಮತ್ತು c) ಸ್ಟ್ಯಾಂಡ್‌ಬೈ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (wt) ಫೇಜ್ (ಅಸ್ಥಿಪಂಜರ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳು) ಇರುವಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ, ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಅನುಕ್ರಮ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1b). ಈ ಫಿಲ್ಟರ್ ಹಂತಗಳು ಎಲ್ಲಾ HTS ಅನುಕ್ರಮ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತವೆ. ಪ್ರಮಾಣಿತ ಗ್ರಂಥಾಲಯಕ್ಕಾಗಿ, ಒಟ್ಟು 233,868 ಓದುಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು, ಅದರಲ್ಲಿ 39% ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ಹಾದುಹೋಯಿತು ಮತ್ತು ಗ್ರಂಥಾಲಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ ಆಯ್ಕೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1c–e). ಈ ಓದುವಿಕೆಗಳು ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ 3 ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳ ಗುಣಾಕಾರಗಳಾಗಿದ್ದು, 36 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದು, ಗ್ರಂಥಾಲಯ ವಿನ್ಯಾಸ (NNK) 1-12 ಅನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತವೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಸದಸ್ಯರಲ್ಲಿ ಸರಿಸುಮಾರು 11% ರಷ್ಟು ಜನರು 12-ಆಯಾಮದ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (wt) ಬೆನ್ನೆಲುಬು PAGISRELVDKL ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರು ಮತ್ತು ಬಹುತೇಕ ಅರ್ಧದಷ್ಟು ಅನುಕ್ರಮಗಳು (49%) ಅಳವಡಿಕೆಗಳು ಅಥವಾ ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ. ಗ್ರಂಥಾಲಯ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ HTS ಗ್ರಂಥಾಲಯದಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು: 81% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಒಮ್ಮೆ ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಬಂದವು ಮತ್ತು ಕೇವಲ 1.5% ≥4 ಪ್ರತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸಿದವು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2a). ಸಂಗ್ರಹದಲ್ಲಿನ ಎಲ್ಲಾ 12 ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ (aa) ಆವರ್ತನಗಳು ಕ್ಷೀಣಗೊಂಡ NKK ಸಂಗ್ರಹದಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಗೆ ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಆವರ್ತನಗಳೊಂದಿಗೆ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2b). ಈ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳಿಂದ ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ aa ಅವಶೇಷಗಳ ಗಮನಿಸಿದ ಆವರ್ತನವು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಆವರ್ತನದೊಂದಿಗೆ (r = 0.893) (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2c) ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ. ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ತಯಾರಿಕೆಯು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್‌ನ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ತೆಗೆದುಹಾಕುವಿಕೆಯ ಹಂತಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಇದು ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಸಂಭಾವ್ಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಈ ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ 12,13. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾದ ಪ್ಲೇಟ್-ಆಂಪ್ಲಿಫೈಡ್ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು AA ಯ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು ಅದನ್ನು ಮೂಲ ಲೈಬ್ರರಿಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಮೂಲ ಪೂಲ್ ಮತ್ತು ವರ್ಧಿತ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಪೂಲ್ ನಡುವೆ ಬಲವಾದ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು (r = 0.995) ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2d), T7 ಫೇಜ್ ಬಳಸಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿತ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಸ್ಪರ್ಧೆಯು ಪ್ರಮುಖ ಪಕ್ಷಪಾತಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಹೋಲಿಕೆಯು ಪ್ರತಿ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿನ ಟ್ರಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ HTS ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು (~109) ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ. ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ aa ಯ ಆವರ್ತನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನಮೂದಿಸಿದ ರೆಪರ್ಟರಿಯ ಕೊನೆಯ ಮೂರು ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಸ್ಥಾನ-ಅವಲಂಬಿತ ಪಕ್ಷಪಾತವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2e). ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಲೈಬ್ರರಿಯ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ವೈವಿಧ್ಯತೆಯು ಸ್ವೀಕಾರಾರ್ಹವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಯ್ಕೆಯ ಹಲವಾರು ಸುತ್ತುಗಳ ನಡುವೆ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ತಯಾರಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೀರ್ಮಾನಿಸಿದ್ದೇವೆ.
BBB ಮತ್ತು/ಅಥವಾ BCSFB (ಚಿತ್ರ 1a-b) ಮೂಲಕ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಮೂಲಕ T7 ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಅನುಕೂಲವಾಗುವಂತೆ ಪ್ರಜ್ಞಾಪೂರ್ವಕ ಇಲಿಗಳ CM ಗೆ ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಮೂಲಕ ಕ್ಯಾನುಲಾವನ್ನು ಅಳವಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಸರಣಿ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 1a-b). ಇನ್ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಯ ಮೊದಲ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 1c) ನಾವು ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಆಯ್ಕೆ ತೋಳುಗಳನ್ನು (ತೋಳುಗಳು A ಮತ್ತು B) ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಆಯ್ಕೆಯ ಮೊದಲ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಫೇಜ್‌ನ ಒಟ್ಟು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಆಯ್ಕೆಯ ಬಿಗಿತವನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, ನಾವು ಶಾಖೆಗಳು A ಮತ್ತು B ಯಿಂದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮೂರು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಆಯ್ಕೆಗಳನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ T7 ಫೇಜ್ ಕಣಗಳ ಇನ್ ವಿವೋ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ (PAGISRELVDKL ಮಾಸ್ಟರ್ ಇನ್ಸರ್ಟ್) ಅನ್ನು ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳದ ಮೂಲಕ ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ಫೇಜ್‌ಗಳ ಮರುಪಡೆಯುವಿಕೆ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸಣ್ಣ T7 ಐಕೋಸಾಹೆಡ್ರಲ್ ಫೇಜ್‌ಗಳು ರಕ್ತ ವಿಭಾಗದಿಂದ ತ್ವರಿತ ಆರಂಭಿಕ ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್ ಹಂತವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3). ಇಲಿಗಳಿಗೆ ನೀಡಿದ ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ರಕ್ತದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ, ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ನೀಡಲಾದ ಡೋಸ್‌ನಿಂದ ಸುಮಾರು 1% wt. ಫೇಜ್ ಪತ್ತೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಆರಂಭಿಕ ಕ್ಷಿಪ್ರ ಕುಸಿತದ ನಂತರ, 27.7 ನಿಮಿಷಗಳ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯೊಂದಿಗೆ ನಿಧಾನವಾದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, CSF ವಿಭಾಗದಿಂದ ಕೆಲವೇ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹಿಂಪಡೆಯಲಾಯಿತು, ಇದು CSF ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ ವಲಸೆಗೆ ಕಡಿಮೆ ಹಿನ್ನೆಲೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3). ಸರಾಸರಿಯಾಗಿ, ರಕ್ತದಲ್ಲಿ T7 ಫೇಜ್‌ನ ಸುಮಾರು 1 x 10-3% ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ಇನ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಿದ ಫೇಜ್‌ಗಳ 4 x 10-8% ಮಾತ್ರ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾದರಿ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ (0-250 ನಿಮಿಷ) ಪತ್ತೆಯಾಗಿವೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ನ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿ (25.7 ನಿಮಿಷ) ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿದಂತೆಯೇ ಇತ್ತು. ಈ ದತ್ತಾಂಶಗಳು ಸಿಎಮ್-ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಿಎಸ್ಎಫ್ ವಿಭಾಗವನ್ನು ರಕ್ತದಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ತಡೆಗೋಡೆ ಹಾಗೇ ಇದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ರಕ್ತದಿಂದ ಸಿಎಸ್ಎಫ್ ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ಸುಲಭವಾಗಿ ಸಾಗಿಸಲ್ಪಡುವ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ಇನ್ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.
(ಎ) ದೊಡ್ಡ ಪೂಲ್‌ನಿಂದ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (CSF) ಅನ್ನು ಮರು-ಮಾದರಿ ಮಾಡುವ ವಿಧಾನವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸುವುದು. (ಬಿ) ಕೇಂದ್ರ ನರಮಂಡಲದ (CNS) ತಡೆಗೋಡೆಯ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ (BBB) ​​ಮತ್ತು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯನ್ನು ದಾಟುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಬಳಸುವ ಆಯ್ಕೆ ತಂತ್ರವನ್ನು ತೋರಿಸುವ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. (ಸಿ) ಇನ್ ವಿವೋ ಫೇಜ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಫ್ಲೋಚಾರ್ಟ್. ಆಯ್ಕೆಯ ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು (ಬಾಣಗಳೊಳಗಿನ ಪ್ರಾಣಿ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗಳು) ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ. 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯವರೆಗೆ ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪರ್ಯಾಯ ಶಾಖೆಗಳನ್ನು (A, B) ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಇಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆಯ್ಕೆಯ 3 ಮತ್ತು 4 ನೇ ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ, CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಪ್ರತಿ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್ ಅನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (ಡಿ) T7 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ (2 x 1012 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ) ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ ಎರಡು ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರಕ್ತದಿಂದ (ಕೆಂಪು ವಲಯಗಳು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಿಂದ (ಹಸಿರು ತ್ರಿಕೋನಗಳು) ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಫೇಜ್‌ನ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರ. ನೀಲಿ ಚೌಕಗಳು ರಕ್ತದಲ್ಲಿನ ಫೇಜ್‌ನ ಸರಾಸರಿ ಆರಂಭಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ, ಒಟ್ಟು ರಕ್ತದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಗಣನೆಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡು, ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಫೇಜ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕಪ್ಪು ಚೌಕಗಳು ರಕ್ತದ ಫೇಜ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ y ರೇಖೆಯ ಛೇದನದ ಬಿಂದುವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. (e,f) ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಿ. 1000 ವಾಚನಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ (p < 0.001) ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. (e) ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿದ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ #1.1 ಮತ್ತು #1.2 ರಿಂದ ರಕ್ತ-ಪಡೆದ ಫೇಜ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲಾಟ್. (f) ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಪ್ರಾಣಿ ಫೇಜ್ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು #1.1 ಮತ್ತು #1.2 ರ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲಾಟ್. (g, h) ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು ಸುತ್ತಿನ ಇನ್ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್ (g) ವಿರುದ್ಧ ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿದ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು ಮತ್ತು CSF (h) ನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್ ವಿರುದ್ಧ ರಕ್ತದ ಅನುಕ್ರಮ ID ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ. ಒಂದು ಅಕ್ಷರದ ಕೋಡ್‌ನ ಗಾತ್ರವು ಆ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಆ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಹಸಿರು = ಧ್ರುವ, ನೇರಳೆ = ತಟಸ್ಥ, ನೀಲಿ = ಮೂಲ, ಕೆಂಪು = ಆಮ್ಲೀಯ ಮತ್ತು ಕಪ್ಪು = ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು. ಚಿತ್ರ 1a, b ಅನ್ನು ಎಡ್ವರ್ಡ್ ಉರಿಚ್ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದಾರೆ ಮತ್ತು ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ್ದಾರೆ.
ನಾವು ಎರಡು CM ಉಪಕರಣ ಇಲಿಗಳಿಗೆ (ಕ್ಲೇಡ್‌ಗಳು A ಮತ್ತು B) ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಚುಚ್ಚಿದೆವು (ಚಿತ್ರ 1d). ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಆರಂಭಿಕ ಕ್ಷಿಪ್ರ ತೆರವು ಕಡಿಮೆ ಉಚ್ಚರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿತು. ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಲಾದ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಸರಾಸರಿ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ನಂತೆಯೇ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ 24.8 ನಿಮಿಷಗಳು ಮತ್ತು CSF ನಲ್ಲಿ 38.5 ನಿಮಿಷಗಳು. ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಯಿಂದ ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಫೇಜ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು HTS ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಣ್ಣ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್ ಉಪಸ್ಥಿತಿಗಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಏಕೆಂದರೆ ಅವು ರಚನೆ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಹನಗಳಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಆಧಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ 14,15. ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಲಾದ ಫೇಜ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ರಕ್ತದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ವಿತರಣೆಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಉತ್ತಮ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1e). ಲೈಬ್ರರಿಯ ಸಂಯೋಜನೆಯು ರಕ್ತದ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾತ್ರ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಡೇಟಾ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. Weblogo16 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಅಮೈನೊ ಆಮ್ಲ ಆವರ್ತನಗಳು ಮತ್ತು ಒಮ್ಮತದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ರಕ್ತದ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1g). CSF ನಿಂದ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾದ ತದ್ರೂಪುಗಳೊಂದಿಗೆ ರಕ್ತವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ಬಲವಾದ ಆಯ್ಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಉದ್ದೇಶಗಳ ಆಯ್ಕೆ ರದ್ದತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 1f), ಮತ್ತು 12-ಸದಸ್ಯರಲ್ಲಿ ಪೂರ್ವನಿರ್ಧರಿತ ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿ ಇರುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 1h). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿವೆ, ಆದರೆ ಎರಡೂ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ರಕ್ತದ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4a-j). #1.1 ಮತ್ತು #1.2 ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮ ದತ್ತಾಂಶದ ಕಠಿಣ ಶೋಧನೆಯ ನಂತರ, ಒಟ್ಟು 964 ಮತ್ತು 420 ಅನನ್ಯ 12-ಮರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1d-e). ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಇನ್ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಯಲ್ಲಿ HTS ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಭವವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಮೋಟಿಫ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 2a, b, ef). CSF ನಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಫೇಜ್‌ನ ಮೊದಲ ಚಕ್ರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, A ಮತ್ತು B ಶಾಖೆಗಳಲ್ಲಿ CSF ನಲ್ಲಿ ಅನೇಕ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ಆಯ್ಕೆ ಮತ್ತು ಆಯ್ಕೆ ರದ್ದತಿಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2). ಅವು ಸ್ಥಿರವಾದ ಅನುಕ್ರಮದ ವಿಭಿನ್ನ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಗುರುತಿನ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪರ್ಯಾಯ ಕ್ಲೇಡ್ A (ಚಿತ್ರ 2c, d) ಮತ್ತು ಕ್ಲೇಡ್ B (ಚಿತ್ರ 2g, h) ನಲ್ಲಿ CSF ನಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ 12-ಆಯಾಮದ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಪಷ್ಟ ಹೋಲಿಕೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಶಾಖೆಯಲ್ಲಿನ ಪೂಲ್ ಮಾಡಿದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು 12-ಮೆರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ವಿಭಿನ್ನ ಆಯ್ಕೆ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 5c, d) ಮತ್ತು ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ ಪೂಲ್ ಮಾಡಿದ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ CSF/ರಕ್ತ ಟೈಟರ್ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು.
ಇನ್ ವಿವೋ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಫೇಜ್ ಪ್ರದರ್ಶನ ಆಯ್ಕೆಯ ಎರಡು ಸತತ ಸುತ್ತುಗಳ ಮೂಲಕ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ.
ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಪ್ರಾಣಿಯ ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನಿಂದ (ಪ್ರಾಣಿಗಳು #1.1 ಮತ್ತು #1.2) ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಎಲ್ಲಾ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಿ, ವರ್ಧಿಸಿ, HT-ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಮರು ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (2 x 1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ) 2 SM ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳು (#1.1 → #). 2.1 ಮತ್ತು 2.2, 1.2 → 2.3 ಮತ್ತು 2.4). (a,b,e,f) ಮೊದಲ ಮತ್ತು ಎರಡನೇ ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲಾ CSF-ಪಡೆದ ಫೇಜ್‌ಗಳ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧದ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳು. ಎರಡೂ ದೃಷ್ಟಿಕೋನಗಳಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ವಿತರಣೆ. 1000 ವಾಚನಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಹೋಲಿಸಿದ ಲೈಬ್ರರಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದರಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ (p < 0.001) ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಅಥವಾ ಹೊರಗಿಡಲಾದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಂದ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. (c, d, g, h) ಇನ್ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತುಗಳು 2 ಮತ್ತು 1 ರ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಎಲ್ಲಾ CSF-ಸಮೃದ್ಧ 12 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ದೀರ್ಘ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಅನುಕ್ರಮ ಲೋಗೋ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ. ಒಂದು-ಅಕ್ಷರದ ಕೋಡ್‌ನ ಗಾತ್ರವು ಆ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಆ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಲೋಗೋವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲು, ಎರಡು ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳ ನಡುವೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ CSF ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಹೋಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ಮತ್ತು (h) #1.2–#2.4. ಪ್ರಾಣಿ ಸಂಖ್ಯೆ 2.3 ಮತ್ತು ಸಂಖ್ಯೆ 2.4 ರಲ್ಲಿ (c, d) ಪ್ರಾಣಿ ಸಂಖ್ಯೆ 2.1 ಮತ್ತು ಸಂಖ್ಯೆ 2.2 ಅಥವಾ (g, h) ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಹಸಿರು = ಧ್ರುವ, ನೇರಳೆ = ತಟಸ್ಥ, ನೀಲಿ = ಮೂಲ, ಕೆಂಪು = ಆಮ್ಲೀಯ ಮತ್ತು ಕಪ್ಪು = ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು.
ಮೂರನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಂತರ, ಎರಡು ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ 332 CSF-ಪುನರ್ರಚಿಸಲಾದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಿಂದ 124 ಅನನ್ಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು (#3.1 ಮತ್ತು #3.2) ನಾವು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6a). LGSVS (18.7%) ಅನುಕ್ರಮವು ಅತ್ಯಧಿಕ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು, ನಂತರ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳಾದ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) ಮತ್ತು SARGSWREIVSLS (2.2%). ಅಂತಿಮ ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, ನಾವು ಮೂರು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಎರಡು ಶಾಖೆಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1c). CSF ನಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ 925 ಅನುಕ್ರಮ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ನಾವು 64 ಅನನ್ಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6b), ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅನುಪಾತವು 0.8% ಕ್ಕೆ ಇಳಿದಿದೆ. ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ CSF ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ಮತ್ತು RLSSVDSDLSGC (3, 2%). ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಉದ್ದದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು NNK ಲೈಬ್ರರಿ ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕಾಗಿ ಡಿಜೆನರೇಟ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ ಲೈಬ್ರರಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಅಳವಡಿಕೆಗಳು/ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳು ಅಥವಾ ಅಕಾಲಿಕ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳಿಂದಾಗಿ. ಅಕಾಲಿಕ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅವು ಅನುಕೂಲಕರವಾದ aa ಮೋಟಿಫ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಿಂಥೆಟಿಕ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಕೆಗಳು/ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳಿಂದ ಉದ್ದವಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಉಂಟಾಗಬಹುದು. ಇದು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್ ಅನ್ನು ಫ್ರೇಮ್‌ನ ಹೊರಗೆ ಇರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೊಸ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್ ಕೆಳಮುಖವಾಗಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವವರೆಗೆ ಅದನ್ನು ಓದುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಮಾದರಿ ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಎಲ್ಲಾ ನಾಲ್ಕು ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದ್ದೇವೆ. ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, ನಾವು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್ ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಮೊದಲ CSF ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆಯು ತುಂಬಾ ಪ್ರಬಲವಾಗಿತ್ತು, ಆದರೆ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3a), ಇದು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸದಸ್ಯರನ್ನು CSF ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ಪ್ರಸರಣದ ಕಡಿಮೆ ಸಂಭವನೀಯತೆಯಿಂದಾಗಿ ಅಥವಾ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯೊಫೇಜ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ರಕ್ತಪ್ರವಾಹದಿಂದ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ಅಥವಾ ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯಿಂದಾಗಿರಬಹುದು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ, CSF ನಲ್ಲಿ ಫೇಜ್‌ಗಳ ಬಲವಾದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಎರಡೂ ಕ್ಲೇಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ಹಿಂದಿನ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ CSF ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಫೇಜ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3a). ಮತ್ತೆ, ಗಮನಾರ್ಹ ರಕ್ತ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವಿಲ್ಲದೆ. ಮೂರನೇ ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ, ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು CSF ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಕೊನೆಯ ಎರಡು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ನಡುವಿನ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ವಿಶಿಷ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಇನ್ನಷ್ಟು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3b). ಎರಡೂ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ದೃಷ್ಟಿಕೋನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎಲ್ಲಾ 64 ವಿಶಿಷ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಂದ ಒಟ್ಟು 931 ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿದ ಲೈಬ್ರರಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಎಲ್ಲಾ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು (ಕಟ್-ಆಫ್: 10% ಪುಷ್ಟೀಕರಣ) (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6c). ಆಯ್ಕೆಯ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮಾದರಿಗಳು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಉದ್ದೇಶಗಳು ಎರಡೂ ಆಯ್ಕೆ ಶಾಖೆಗಳ ಹಿಂದಿನ ಎಲ್ಲಾ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕೆಲವು ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು (ಉದಾ. SGL, VSG, LGS GSV) ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ ಪರ್ಯಾಯ ಕ್ಲೇಡ್ A ನಿಂದ ಬಂದವು, ಆದರೆ ಇತರವುಗಳು (ಉದಾ. FGW, RTN, WGF, NTR) ಪರ್ಯಾಯ ಕ್ಲೇಡ್ B ನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಪೇಲೋಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾದ CSF-ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್-ಪ್ರದರ್ಶಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಲೀಡರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ CSF ಸಾಗಣೆಯ ಮೌಲ್ಯೀಕರಣ.
(ಎ) ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿದ (ಇನ್‌ಪುಟ್ = I) ಫೇಜ್ (PFU) ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ CSF ಫೇಜ್ ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು (ಔಟ್‌ಪುಟ್ = O) ಆಧರಿಸಿ ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ (R1-R4) ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅನುಪಾತಗಳು. ಕೊನೆಯ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳಿಗೆ (R2-R4) ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಹಿಂದಿನ ಸುತ್ತಿನ ಮತ್ತು ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ (R1) ತೂಕದ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ತೆರೆದ ಬಾರ್‌ಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ, ಮಬ್ಬಾದ ಬಾರ್‌ಗಳು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ. (***p<0.001, ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿ). (ಬಿ) ಆಯ್ಕೆಯ 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನ ನಂತರ CSF ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಫೇಜ್‌ಗಳಿಗೆ ಅವುಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅನುಪಾತದ ಪ್ರಕಾರ ಶ್ರೇಣೀಕರಿಸಲಾದ ಅತ್ಯಂತ ಹೇರಳವಾಗಿರುವ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪಟ್ಟಿ. ಆರು ಸಾಮಾನ್ಯ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಸಂಖ್ಯೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಯ್ಕೆಯ 3 ಮತ್ತು 4 ನೇ ಸುತ್ತುಗಳ ನಡುವೆ ಅವುಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅಂಶಗಳು (ಇನ್‌ಸೆಟ್‌ಗಳು). (ಸಿ,ಡಿ) 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನಿಂದ ಆರು ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು, ಖಾಲಿ ಫೇಜ್ ಮತ್ತು ಪೋಷಕರ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು CSF ಮಾದರಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. (c) 6 ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ಸಮಾನ ಪ್ರಮಾಣಗಳು (2 x 1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳು), ಖಾಲಿ ಫೇಜ್‌ಗಳು (#1779) (2 x 1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳು) ಮತ್ತು ಸ್ಟಾಕ್ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು (2 x 1012 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಗಳು) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದನ್ನು ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಪ್ರಾಣಿಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳದ ಮೂಲಕ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್ ಮತ್ತು ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ CSF ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. (d) ಮಾದರಿ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲಾ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡ ಫೇಜ್‌ಗಳು/mL ಗೆ ಸರಾಸರಿ CSF/ರಕ್ತ ಅನುಪಾತವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. (e) ನಾಲ್ಕು ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಲೀಡರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಒಂದು ಸ್ಕ್ರಾಂಬಲ್ಡ್ ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಅನ್ನು ಬಯೋಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ಗೆ ಅವುಗಳ N-ಟರ್ಮಿನಸ್ (ಟೆಟ್ರಾಮರ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ) ಮೂಲಕ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ, ನಂತರ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ (ಟೈಲ್ ಸಿರೆ iv, 10 mg ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್/ಕೆಜಿ). ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಇಂಟ್ಯೂಬೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳು (N = 3). ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ CSF ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು CSF ಆಂಟಿ-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ELISA (nd = ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ) ಮೂಲಕ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ಪರೀಕ್ಷೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ). (f) ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಕ್ಲೋನ್ #2002 (ನೇರಳೆ) ನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಅನುಕ್ರಮದ ಹೋಲಿಕೆ 4 ನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಇತರ ಆಯ್ದ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ. ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಮತ್ತು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಬಣ್ಣ-ಕೋಡೆಡ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 3 ಬಿ) ಎಲ್ಲಾ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫೇಜ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ಆರು ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು CSF ಮಾದರಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಮತ್ತಷ್ಟು ವೈಯಕ್ತಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಆರು ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಫೇಜ್, ಖಾಲಿ ಫೇಜ್ (ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಇಲ್ಲ) ಮತ್ತು ಪ್ರೊಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ಸಮಾನ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಮೂರು ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ CM ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು CSF (ಚಿತ್ರ 3 ಸಿ) ಮತ್ತು ರಕ್ತ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳು ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್ (#1779) ಗಿಂತ 10-1000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ CSF ವಿಭಾಗವನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡವು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, #2020 ಮತ್ತು #2077 ತದ್ರೂಪುಗಳು ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್‌ಗಿಂತ ಸುಮಾರು 1000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ CSF ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು. ಪ್ರತಿ ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಅವೆಲ್ಲವೂ ಹೆಚ್ಚಿನ CSF ಹೋಮಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ. #1903 ಮತ್ತು #2011 ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಿಗೆ ನಾವು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ #2077, #2002 ಮತ್ತು #2009 ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಿಗೆ ಮೊದಲ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಳವು ಸಕ್ರಿಯ ಸಾಗಣೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸಬಹುದು ಆದರೆ ಪರಿಶೀಲಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ. ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು #2020, #2002, ಮತ್ತು #2077 ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರಗೊಂಡವು, ಆದರೆ ಕ್ಲೋನ್ #2009 ರ CSF ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಆರಂಭಿಕ ಹೆಚ್ಚಳದ ನಂತರ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಯಿತು. ನಂತರ ನಾವು ಪ್ರತಿ CSF ಅಭ್ಯರ್ಥಿಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಅದರ ರಕ್ತದ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3d). ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ CSF ಅಭ್ಯರ್ಥಿಯ ಸರಾಸರಿ ಟೈಟರ್ ಮತ್ತು ಅದರ ರಕ್ತದ ಟೈಟರ್‌ನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವು ಆರು ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೂವರು ರಕ್ತದ CSF ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಸಮೃದ್ಧರಾಗಿದ್ದಾರೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಕ್ಲೋನ್ #2077 ಹೆಚ್ಚಿನ ರಕ್ತದ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7). ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಫೇಜ್ ಕಣಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಇತರ ಸರಕುಗಳನ್ನು CSF ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ಸಾಗಿಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಲು, ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಫೇಜ್ ಕಣಕ್ಕೆ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಯೋಟಿನ್‌ನಿಂದ ಪಡೆದ ನಾಲ್ಕು ಲೀಡರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು (ಸಂಖ್ಯೆ 2002, 2009, 2020 ಮತ್ತು 2077) ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ (SA) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ ಫೇಜ್ ಜ್ಯಾಮಿತಿಯನ್ನು ಸ್ವಲ್ಪಮಟ್ಟಿಗೆ ಅನುಕರಿಸುವ ಮಲ್ಟಿಮೆರಿಕ್ ರೂಪಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. ಈ ಸ್ವರೂಪವು ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ SA ಮಾನ್ಯತೆಯನ್ನು ಸರಕು-ಸಾಗಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಅಳೆಯಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು. ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಈ SA-ಸಂಯೋಜಿತ ಸ್ವರೂಪದಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನೀಡಿದಾಗ ಫೇಜ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 3e). ಸ್ಕ್ರಾಂಬಲ್ಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು 48 ಗಂಟೆಗಳ ಒಳಗೆ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ ಮಟ್ಟಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಡಿಮೆ ಆರಂಭಿಕ ಮಾನ್ಯತೆ ಮತ್ತು ವೇಗವಾದ CSF ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು. CSF ಜಾಗಕ್ಕೆ ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ವಿತರಣಾ ಮಾರ್ಗಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ನಾವು ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ (IHC) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಫೇಜ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಹಿಟ್‌ಗಳ ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಇನ್ವಿನೋಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ 1 ಗಂಟೆಯ ನಂತರ ಫೇಜ್ ಕಣಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುತ್ತದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು #2002, #2077, ಮತ್ತು #2009 ಅನ್ನು ಮೆದುಳಿನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಕಲೆ ಹಾಕುವ ಮೂಲಕ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಬಹುದು, ಆದರೆ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್ (#1779) ಮತ್ತು ಕ್ಲೋನ್ #2020 ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8). ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು BBB ಅನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ದಾಟುವ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿನ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. BSCFB ಮಾರ್ಗವು ಸಹ ಒಳಗೊಂಡಿರಬಹುದು ಎಂಬ ಕಾರಣಕ್ಕೆ ಈ ಊಹೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿವರವಾದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಹೆಚ್ಚು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಕ್ಲೋನ್‌ನ (#2002) ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಇತರ ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ವಿಸ್ತರಣೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಸಾರಿಗೆ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3f).
ಅದರ ವಿಶಿಷ್ಟ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಮತ್ತು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ CSF ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳದಿಂದಾಗಿ, ಫೇಜ್ ಡಿಸ್ಪ್ಲೇ ಕ್ಲೋನ್ #2077 ಅನ್ನು 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಹೆಚ್ಚು ಕಾಲ ಅನ್ವೇಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಿರಂತರ SA ಮಟ್ಟಗಳೊಂದಿಗೆ (ಚಿತ್ರ 4a) ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಗಮನಿಸಿದ CSF ನಲ್ಲಿ ತ್ವರಿತ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು. ಇತರ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, #2077 ಮೆದುಳಿನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳಿಗೆ ಬಲವಾಗಿ ಕಲೆ ಹಾಕಿತು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ನೋಡಿದಾಗ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಮಾರ್ಕರ್ ಲೆಕ್ಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ತೋರಿಸಿತು ಮತ್ತು ಬಹುಶಃ ಪ್ಯಾರೆಂಚೈಮಲ್ ಜಾಗದಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಕಲೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 4b). CNS ನಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಔಷಧೀಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಬಹುದೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಒಂದು ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ i) #2077 ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು ii) BACE1 ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆವೃತ್ತಿಗಳನ್ನು SA ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಅನುಪಾತಗಳಲ್ಲಿ ಬೆರೆಸಲಾಗಿದೆ. ಒಂದು ಸಂಯೋಜನೆಗಾಗಿ ನಾವು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದಕ್ಕೆ ನಾವು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ನ 1:3 ಅನುಪಾತವನ್ನು #2077 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಎರಡೂ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬೀಟಾ-ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ 40 (ಅಬೆಟಾ40) ನ ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಅಬೆಟಾ40 ಅನ್ನು CSF ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಮೆದುಳಿನ ಪ್ಯಾರೆಂಚೈಮಾದಲ್ಲಿ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ. ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, ಎರಡೂ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಅಬೆಟಾ40 ರ ರಕ್ತದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು (ಚಿತ್ರ 4c, d). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಂಖ್ಯೆ 2077 ರ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಮತ್ತು SA ಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾದ BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳು ಮಾತ್ರ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಅಬೆಟಾ40 ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 4c). ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಂಖ್ಯೆ 2077 60 kDa SA ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು CNS ಗೆ ಸಾಗಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ SA-ಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಔಷಧೀಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಡೇಟಾ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
(ಎ) ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು CM-ಇಂಟ್ಯುಬೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ CSF ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 (RLSSVDSDLSGC) ಮತ್ತು ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್ (#1779) ನ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ T7 ಫೇಜ್‌ನ ಕ್ಲೋನಲ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ (2 × 10 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ). (ಬಿ) ಫೇಜ್-ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಲಾದ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (2 × 10 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ) ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋವೆಸೆಲ್‌ಗಳ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಕ್ ಚಿತ್ರ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ಮತ್ತು ನಾಳಗಳ (ಲೆಕ್ಟಿನ್) ಪ್ರತಿ-ಬಣ್ಣವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು 3 ಇಲಿಗಳಿಗೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಮಾಡುವ ಮೊದಲು 1 ಗಂಟೆ ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡಲು ಬಿಡಲಾಯಿತು. ಮೆದುಳುಗಳನ್ನು T7 ಫೇಜ್ ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್ ವಿರುದ್ಧ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ FITC-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ವಿಭಾಗಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬಣ್ಣ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸ್ಥಿರೀಕರಣಕ್ಕೆ ಹತ್ತು ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು, DyLight594-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಲೆಕ್ಟಿನ್ ಅನ್ನು ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ನೀಡಲಾಯಿತು. ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳು ಮತ್ತು ಪೆರಿವಾಸ್ಕುಲರ್ ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಲುಮೆನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮನಾಳಗಳು ಮತ್ತು ಫೇಜ್‌ಗಳ (ಹಸಿರು) ಲುಮಿನಲ್ ಬದಿಯ ಲೆಕ್ಟಿನ್ ಕಲೆ (ಕೆಂಪು) ತೋರಿಸುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಚಿತ್ರಗಳು. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 10 µm ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ. (c, d) ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಏಕಾಂಗಿಯಾಗಿ ಅಥವಾ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ CM ಇಲಿಗಳ (10 mg ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್/ಕೆಜಿ) ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. Aβ40 ನಲ್ಲಿ BACE1 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಕಡಿತವನ್ನು ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ರಕ್ತ (ಕೆಂಪು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (ಕಿತ್ತಳೆ) ದಲ್ಲಿ Aβ1-40 ELISA ಮೂಲಕ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಉತ್ತಮ ಸ್ಪಷ್ಟತೆಗಾಗಿ, ಗ್ರಾಫ್‌ನಲ್ಲಿ 100% ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯನ್ನು ಎಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. (ಸಿ) 3:1 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸಿಟ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ಮತ್ತು BACE1 ಇನ್ಹಿಬಿಟರಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾದ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ (ಕೆಂಪು ತ್ರಿಕೋನಗಳು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ (ಕಿತ್ತಳೆ ತ್ರಿಕೋನಗಳು) Aβ40 ನಲ್ಲಿನ ಶೇಕಡಾವಾರು ಕಡಿತ. (ಡಿ) BACE1 ಇನ್ಹಿಬಿಟರಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ ಮಾತ್ರ ಸಂಯೋಜಿತವಾದ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಇಲಿಗಳ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ Aβ40 (ಕೆಂಪು ವೃತ್ತಗಳು) ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ (ಕಿತ್ತಳೆ ವೃತ್ತಗಳು) ಶೇಕಡಾವಾರು ಕಡಿತ. ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ Aβ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 420 pg/ml ಆಗಿತ್ತು (ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನ = 101 pg/ml).
ಫೇಜ್ ಪ್ರದರ್ಶನವನ್ನು ಜೈವಿಕ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಹಲವಾರು ಕ್ಷೇತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಇನ್ ವಿವೋ ನಾಳೀಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ [18,19] ಹಾಗೂ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ನಾಳಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ [20,21,22,23,24,25,26] ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ನಾಳಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ನೇರ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗೆ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯನ್ನು ದಾಟಲು ಸಕ್ರಿಯ ಸಾರಿಗೆ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳ ಆವಿಷ್ಕಾರಕ್ಕೂ ನಾವು ಈ ಆಯ್ಕೆ ವಿಧಾನದ ಅನ್ವಯವನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಿದ್ದೇವೆ. CM ಇಂಟ್ಯೂಬೇಟೆಡ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಇನ್ ವಿವೋ ಆಯ್ಕೆ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಾವು ಈಗ ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು CSF ಹೋಮಿಂಗ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಅದರ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ. 12-ಮೆರ್ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಗ್ರಂಥಾಲಯವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ T7 ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, T7 ಫೇಜ್ ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವಷ್ಟು (ಸುಮಾರು 60 nm ವ್ಯಾಸ) [10] ಎಂದು ನಾವು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ ಅಥವಾ ಕೋರಾಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್ ಅನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ದಾಟಬಹುದು. ಕ್ಯಾನ್ಯುಲೇಟೆಡ್ CM ಇಲಿಗಳಿಂದ CSF ಕೊಯ್ಲು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಇನ್ ವಿವೋ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಫೇಜ್ ನಾಳೀಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವುದಲ್ಲದೆ ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ಸಾಗಣೆದಾರನಾಗಿಯೂ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ರಕ್ತವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ಪಡೆದ ಫೇಜ್‌ಗಳಿಗೆ HTS ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ, ನಮ್ಮ CSF ಆಯ್ಕೆಯು ರಕ್ತ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಅಥವಾ ಆಯ್ಕೆಯ ಸುತ್ತುಗಳ ನಡುವಿನ ವಿಸ್ತರಣೆಗೆ ಫಿಟ್‌ನೆಸ್‌ನಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, CSF ವಿಭಾಗವನ್ನು ತಲುಪುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ಫೇಜ್‌ಗಳು ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ತಮ್ಮನ್ನು ತಾವು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಸಮಯದವರೆಗೆ ರಕ್ತಪ್ರವಾಹದಲ್ಲಿ ಬದುಕುಳಿಯಬೇಕು ಮತ್ತು ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡಬೇಕು. ಕಚ್ಚಾ HTS ಡೇಟಾದಿಂದ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಅನುಕ್ರಮ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲು, ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ಕಾರ್ಯಪ್ರವಾಹದಲ್ಲಿ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮ ದೋಷಗಳಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ಕಾರ್ಯಗತಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ ಚಲನ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ, ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ T7 ಫೇಜ್‌ಗಳ (t½ ~ 28 ನಿಮಿಷ) ಕ್ಷಿಪ್ರ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ನಾವು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ24, 27, 28 ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ (t½ ~ 26 ನಿಮಿಷ) ಪ್ರತಿ ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಅವುಗಳ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ). ರಕ್ತ ಮತ್ತು CSF ನಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, CSF ನಲ್ಲಿ ಫೇಜ್‌ನ ರಕ್ತದ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಕೇವಲ 0.001% ಮಾತ್ರ ಪತ್ತೆಯಾಗಿದೆ, ಇದು ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ T7 ಫೇಜ್‌ನ ಕಡಿಮೆ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಚಲನಶೀಲತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಕೆಲಸವು ಇನ್ ವಿವೋ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಕೆಲವು ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು CNS ವಿಭಾಗವನ್ನು ತಲುಪಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವುದರಿಂದ, ರಕ್ತಪರಿಚಲನೆಯಿಂದ ವೇಗವಾಗಿ ತೆರವುಗೊಳಿಸಲ್ಪಡುವ ಫೇಜ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಿಗೆ. ಹೀಗಾಗಿ, ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, ಗ್ರಂಥಾಲಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯಲ್ಲಿನ ಕಡಿತವು ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗಿತ್ತು, ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಅತ್ಯಂತ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ CSF ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಸೀಮಿತ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಇನ್ ವಿವೋ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ತಂತ್ರವು CSF ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯ ಶೇಖರಣೆ, ರಕ್ತದ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ಕ್ಲೋನ್ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಮೊದಲ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ರಕ್ತದಿಂದ T7 ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕುವಂತಹ ಹಲವಾರು ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ 1d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4M). ಹೀಗಾಗಿ, ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ನಂತರ, CSF ನಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು, ಆದಾಗ್ಯೂ ಅದೇ ಆರಂಭಿಕ ಪೂಲ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಗ್ರಂಥಾಲಯ ಸದಸ್ಯರನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮೂಲ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳಿಗೆ ಬಹು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಿನ ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಗಳು ವೈವಿಧ್ಯತೆಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಘಟನೆಗಳು ಆರಂಭಿಕ ಆಯ್ಕೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಅವಿಭಾಜ್ಯ ಅಂಗವಾಗುತ್ತವೆ, ಫಲಿತಾಂಶದ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತವೆ. ಮೂಲ ಗ್ರಂಥಾಲಯದಲ್ಲಿನ ಅನೇಕ ತದ್ರೂಪುಗಳು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ CSF ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಅದೇ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ, ಆರಂಭಿಕ ಪೂಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತದ್ರೂಪಿನ ಸಣ್ಣ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಆಯ್ಕೆ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು.
CSF ನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಉದ್ದೇಶಗಳು ರಕ್ತದಲ್ಲಿರುವ ಲಕ್ಷಣಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿವೆ. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಸಿನ್-ಭರಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಕಡೆಗೆ ಮೊದಲ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ. (ಚಿತ್ರ 1g, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4e, 4f). ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಫೇಜ್ ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ರಕ್ತಪರಿಚಲನೆಯಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಕಡಿಮೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಗ್ಲೈಸಿನ್-ಭರಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿಲ್ಲ, ಇದು ಕ್ಯುರೇಟೆಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಗಳ ಮೂಲಕ ಸಾಗಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ: ಒಂದು ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಗೊಳ್ಳಲು ಅನುಮತಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಾಲ್ಕನೇ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಪಡೆದ CSF-ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಖಾಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫೇಜ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾದ ತದ್ರೂಪುಗಳು CSF ನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಒಂದು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಹಿಟ್ (#2077) ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವಿವರವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಇತರ ಹಿಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಇದು ದೀರ್ಘವಾದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3d ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7), ಮತ್ತು ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಶೇಷವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ ಅಲ್ಬುಮಿನ್ 29 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅವುಗಳ ಫಾರ್ಮಾಕೊಕಿನೆಟಿಕ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇದು ಪ್ರಸ್ತುತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 ಗೆ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಕೆಲವು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು CSF ಪುಷ್ಟೀಕರಣದಲ್ಲಿ ವೇಲೆನ್ಸ್-ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ (ಡೇಟಾ ತೋರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ), ಇದು T7 ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್‌ನ ಪ್ರದರ್ಶಿತ ಮೇಲ್ಮೈ ಜ್ಯಾಮಿತಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿರಬಹುದು. ನಾವು ಬಳಸಿದ T7 ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ಪ್ರತಿ ಫೇಜ್ ಕಣಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ 5-15 ಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ. ಇಲಿಗಳ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ಗೆ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಿದ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಲೀಡ್ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ IHC ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8). ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು (ಸಂಖ್ಯೆ 2002, ಸಂಖ್ಯೆ 2009 ಮತ್ತು ಸಂಖ್ಯೆ 2077) BBB ಯೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಡೇಟಾ ತೋರಿಸಿದೆ. ಈ BBB ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು CSF ನ ಸಂಗ್ರಹಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆಯೇ ಅಥವಾ ಈ ತದ್ರೂಪುಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ BCSFB ಗೆ ಚಲಿಸುತ್ತದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ. ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಆಯ್ದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿದಾಗ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸರಕುಗೆ ಬಂಧಿಸಿದಾಗ ಅವುಗಳ CSF ಸಾಗಣೆ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ. N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು SA ಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದು ರಕ್ತ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಆಯಾ ಫೇಜ್ ತದ್ರೂಪುಗಳೊಂದಿಗೆ ಪಡೆದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3e). ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸೀಸದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ #2077 SA ಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾದ BACE1 ನ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕದ ಮೆದುಳಿನ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದು CSF ನಲ್ಲಿ Abeta40 ಮಟ್ಟವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ CNS ನಲ್ಲಿ ಉಚ್ಚಾರಣಾ ಔಷಧೀಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4). ಎಲ್ಲಾ ಹಿಟ್‌ಗಳ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮ ಹೋಮೋಲಜಿ ಹುಡುಕಾಟವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೂಲಕ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಹೋಮೋಲಾಗ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ. T7 ಲೈಬ್ರರಿಯ ಗಾತ್ರವು ಸರಿಸುಮಾರು 109 ಆಗಿದ್ದರೆ, 12-ಮೆರ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕ ಲೈಬ್ರರಿ ಗಾತ್ರವು 4 x 1015 ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು 12-ಮೆರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯ ಜಾಗದ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಭಾಗವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಅಂದರೆ ಈ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಹಿಟ್‌ಗಳ ಪಕ್ಕದ ಅನುಕ್ರಮ ಸ್ಥಳವನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಹೆಚ್ಚು ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ ಮಾಡಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು. ಕಾಲ್ಪನಿಕವಾಗಿ, ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಯಾವುದೇ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಹೋಮೋಲೋಗ್‌ಗಳು ನಮಗೆ ಸಿಗದಿರಲು ಒಂದು ಕಾರಣವೆಂದರೆ ಮೆದುಳಿಗೆ ಕೆಲವು ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಪ್ರವೇಶವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ವಿಕಾಸದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆಯ್ಕೆ ರದ್ದತಿ ಆಗಿರಬಹುದು.
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ತಡೆಗೋಡೆಯ ಸಾರಿಗೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ವಿವರವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿರೂಪಿಸಲು ಭವಿಷ್ಯದ ಕೆಲಸಕ್ಕೆ ಆಧಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ. ಈ ವಿಧಾನದ ಮೂಲ ಸೆಟಪ್ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆ ತಂತ್ರವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಇದು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ನಾಳೀಯ ಬಂಧಿಸುವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದಲ್ಲದೆ, ಯಶಸ್ವಿ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಜೈವಿಕ ಅಡೆತಡೆಗಳನ್ನು ಸಿಎನ್‌ಎಸ್ ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ದಾಟಲು ಆಂತರಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಹಂತವನ್ನು ಸಹ ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಸಾಗಣೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನ ಮತ್ತು ಮೆದುಳಿನ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮೈಕ್ರೋವಾಸ್ಕ್ಯುಲೇಚರ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಅವುಗಳ ಆದ್ಯತೆಯನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸುವುದು. ಇದು ಬಿಬಿಬಿ ಮತ್ತು ಗ್ರಾಹಕಗಳ ಸಾಗಣೆಗೆ ಹೊಸ ಮಾರ್ಗಗಳ ಆವಿಷ್ಕಾರಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ನೇರವಾಗಿ ಸೆರೆಬ್ರೊವಾಸ್ಕುಲರ್ ಗ್ರಾಹಕಗಳಿಗೆ ಅಥವಾ ಬಿಬಿಬಿ ಅಥವಾ ಬಿಸಿಎಸ್‌ಎಫ್‌ಬಿ ಮೂಲಕ ಸಾಗಿಸಲ್ಪಡುವ ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡುವ ಲಿಗಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ. ಈ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾದ ಸಿಎಸ್‌ಎಫ್ ಸಾರಿಗೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲಾಗುವುದು. ಬಿಬಿಬಿ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಬಿಸಿಎಸ್‌ಎಫ್‌ಬಿಯನ್ನು ದಾಟುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಕ್ಕಾಗಿ ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಮೆದುಳಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನಾವು ಪ್ರಸ್ತುತ ತನಿಖೆ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಹೊಸ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಹೊಸ ಗ್ರಾಹಕಗಳು ಅಥವಾ ಮಾರ್ಗಗಳ ಸಂಭಾವ್ಯ ಆವಿಷ್ಕಾರಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ಮೆದುಳಿಗೆ ಜೈವಿಕ ಪದಾರ್ಥಗಳಂತಹ ಸ್ಥೂಲ ಅಣುಗಳನ್ನು ತಲುಪಿಸಲು ಹೊಸ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವೇದಿಕೆಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ಅತ್ಯಂತ ಅಮೂಲ್ಯವಾದ ಸಾಧನಗಳಾಗಿವೆ.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನದ ಮಾರ್ಪಾಡು ಬಳಸಿ ದೊಡ್ಡ ಸಿಸ್ಟರ್ನಾ (CM) ಅನ್ನು ಕ್ಯಾನುಲೇಟ್ ಮಾಡಿ. ಅರಿವಳಿಕೆ ಪಡೆದ ವಿಸ್ಟಾರ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು (200-350 ಗ್ರಾಂ) ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ಉಪಕರಣದ ಮೇಲೆ ಜೋಡಿಸಿ ಮತ್ತು ತಲೆಬುರುಡೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲು ಕ್ಷೌರ ಮಾಡಿದ ಮತ್ತು ಅಸೆಪ್ಟಿಕಲ್ ಆಗಿ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಿದ ನೆತ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ಮಧ್ಯದ ಛೇದನವನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಮೇಲಿನ ಸ್ಯಾಶ್‌ನ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಎರಡು ರಂಧ್ರಗಳನ್ನು ಕೊರೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ರಂಧ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಫಿಕ್ಸಿಂಗ್ ಸ್ಕ್ರೂಗಳನ್ನು ಜೋಡಿಸಿ. ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಕ್ಯಾನುಲಾದ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನಕ್ಕಾಗಿ ಲ್ಯಾಟರಲ್ ಆಕ್ಸಿಪಿಟಲ್ ಕ್ರೆಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ರಂಧ್ರವನ್ನು ಕೊರೆಯಲಾಯಿತು. ಕ್ಯಾನುಲಾದ ಸುತ್ತಲೂ ದಂತ ಸಿಮೆಂಟ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿ ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ರೂಗಳಿಂದ ಸುರಕ್ಷಿತಗೊಳಿಸಿ. ಫೋಟೋ-ಕ್ಯೂರಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಸಿಮೆಂಟ್ ಗಟ್ಟಿಯಾಗಿಸಿದ ನಂತರ, ಚರ್ಮದ ಗಾಯವನ್ನು 4/0 ಸುಪ್ರಮಿಡ್ ಹೊಲಿಗೆಯಿಂದ ಮುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ (CSF) ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಸೋರಿಕೆಯಿಂದ ಕ್ಯಾನುಲಾದ ಸರಿಯಾದ ಸ್ಥಾನವು ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ. ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ಉಪಕರಣದಿಂದ ಇಲಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರದ ಆರೈಕೆ ಮತ್ತು ನೋವು ನಿರ್ವಹಣೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದಲ್ಲಿ ರಕ್ತದ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಕಂಡುಬರುವವರೆಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ವಾರದವರೆಗೆ ಅದು ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಬಿಡಿ. ವಿಸ್ಟಾರ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು (Crl:WI/Han) ಚಾರ್ಲ್ಸ್ ನದಿಯಿಂದ (ಫ್ರಾನ್ಸ್) ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಇಲಿಗಳನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರೋಗಕಾರಕ-ಮುಕ್ತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗಿತ್ತು. ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವಿಟ್ಜರ್‌ಲ್ಯಾಂಡ್‌ನ ಬಾಸೆಲ್ ನಗರದ ಪಶುವೈದ್ಯಕೀಯ ಕಚೇರಿ ಅನುಮೋದಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಣಿ ಪರವಾನಗಿ ಸಂಖ್ಯೆ 2474 (ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ ಮತ್ತು ಇಲಿಯ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಸಕ್ರಿಯ ಮೆದುಳಿನ ಸಾಗಣೆಯ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ) ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
CM ಕ್ಯಾನುಲಾವನ್ನು ಕೈಯಲ್ಲಿ ಹಿಡಿದುಕೊಂಡು ಇಲಿಯನ್ನು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಜಾಗೃತವಾಗಿಡಿ. ಕ್ಯಾನುಲಾದಿಂದ ಡಾತುರಾವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 10 µl ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತವಾಗಿ ಹರಿಯುವ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. ಕ್ಯಾನುಲಾದ ಪೇಟೆನ್ಸಿ ಅಂತಿಮವಾಗಿ ದುರ್ಬಲಗೊಂಡ ಕಾರಣ, ರಕ್ತದ ಮಾಲಿನ್ಯ ಅಥವಾ ಬಣ್ಣ ಬದಲಾವಣೆಯ ಯಾವುದೇ ಪುರಾವೆಗಳಿಲ್ಲದ ಸ್ಪಷ್ಟ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ, ಬಾಲದ ತುದಿಯಲ್ಲಿರುವ ಸಣ್ಣ ಛೇದನದಿಂದ ಸರಿಸುಮಾರು 10–20 μl ರಕ್ತವನ್ನು ಹೆಪಾರಿನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಹೊಂದಿರುವ ಕೊಳವೆಗಳಿಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ. T7 ಫೇಜ್‌ನ ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ ವಿವಿಧ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ CSF ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೊದಲು ಸರಿಸುಮಾರು 5–10 μl ದ್ರವವನ್ನು ತ್ಯಜಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಕ್ಯಾತಿಟರ್‌ನ ಸತ್ತ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ.
T7Select ಸಿಸ್ಟಮ್ ಕೈಪಿಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ T7Select 10-3b ವೆಕ್ಟರ್ ಬಳಸಿ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ನೊವಾಜೆನ್, ರೋಸೆನ್‌ಬರ್ಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, ಇನ್‌ನೊವೇಶನ್ಸ್ 6, 1-6, 1996). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ 12-ಮರ್ DNA ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸ್ವರೂಪದಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ:
ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಡಬಲ್ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅತಿಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು NNK ಕೋಡಾನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. N ಎಂಬುದು ಪ್ರತಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ನ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಮಿಶ್ರ ಸಮಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು K ಎಂಬುದು ಅಡೆನಿನ್ ಮತ್ತು ಸೈಟೋಸಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಮಿಶ್ರ ಸಮಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತವಾಗಿದೆ. 37°C ನಲ್ಲಿ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕ್ಲೆನೋ ಬಫರ್ (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ನಲ್ಲಿ dNTP (ನೊವಾಜೆನ್) ಮತ್ತು ಕ್ಲೆನೋ ಕಿಣ್ವ (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತಷ್ಟು ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಏಕ ಎಳೆದ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಡಬಲ್ ಎಳೆದ DNA ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ, ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಅನ್ನು EtOH ಅವಕ್ಷೇಪನದಿಂದ ಮರುಪಡೆಯಲಾಯಿತು. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ DNA ಅನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಕಿಣ್ವಗಳಾದ EcoRI ಮತ್ತು HindIII (ಎರಡೂ ರೋಚೆಯಿಂದ) ಜೀರ್ಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು. ಸೀಳಲ್ಪಟ್ಟ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ (QIAquick, Qiagen) ಇನ್ಸರ್ಟ್ (T4 ಲಿಗೇಸ್, ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ಅನ್ನು ನಂತರ 10B ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್ ಜೀನ್‌ನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ 348 ರ ನಂತರ ಪೂರ್ವ-ಸೀಳಲ್ಪಟ್ಟ T7 ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ ಚೌಕಟ್ಟಿನೊಳಗೆ ಬಂಧಿಸಲಾಯಿತು. ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್‌ಗೆ 18 ಗಂಟೆಗಳ ಮೊದಲು 16° C ನಲ್ಲಿ ಬಂಧನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಇನ್‌ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. T7Select 10-3b ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಕಿಟ್ (ನೊವಾಜೆನ್) ನೊಂದಿಗೆ ಒದಗಿಸಲಾದ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಫೇಜ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಎಸ್ಚೆರಿಚಿಯಾ ಕೋಲಿ (BLT5615, ನೊವಾಜೆನ್) ಬಳಸಿ ಲೈಸಿಸ್‌ಗೆ ಒಮ್ಮೆ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು. ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಮಾಡಿ, ಟೈಟ್ರೇಟ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು -80° C ನಲ್ಲಿ ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನ ಸ್ಟಾಕ್ ದ್ರಾವಣವಾಗಿ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಸ್ವಾಮ್ಯದ 454/ರೋಚೆ-ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾರು ಅಥವಾ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಲಾದ ಫೇಜ್ ವೇರಿಯಬಲ್ ಪ್ರದೇಶಗಳ ನೇರ PCR ವರ್ಧನೆ. ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್ ವೇರಿಯಬಲ್ ಪ್ರದೇಶ (NNK) 12 (ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ), GS FLX ಟೈಟಾನಿಯಂ ಅಡಾಪ್ಟರ್ A, ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕು-ಬೇಸ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಕೀ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ (TCAG) ಅನ್ನು ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1a):
ರಿವರ್ಸ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರೈಮರ್, ಮಣಿಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲು ಜೋಡಿಸಲಾದ ಬಯೋಟಿನ್ ಮತ್ತು ಎಮಲ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕ್ಲೋನಲ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಜಿಎಸ್ ಎಫ್‌ಎಲ್‌ಎಕ್ಸ್ ಟೈಟಾನಿಯಂ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಬಿ ಅನ್ನು ಸಹ ಒಳಗೊಂಡಿದೆ:
ನಂತರ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್‌ಗಳನ್ನು 454 GS-FLX ಟೈಟಾನಿಯಂ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ 454/ರೋಚೆ ಪೈರೋಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕಾಗಿ (ಅಪ್ಲೈಡ್ ಬಯೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ ಹಿಟಾಚಿ 3730 xl DNA ವಿಶ್ಲೇಷಕ), T7 ಫೇಜ್ DNA ಯನ್ನು PCR ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸಿ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು:
ರೋಚೆ ಫಾಸ್ಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಕಿಟ್ ಬಳಸಿ (ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ) ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ಲೇಕ್‌ಗಳಿಂದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ (95 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷ) ಮತ್ತು 35 ಬೂಸ್ಟ್ ಸೈಕಲ್‌ಗಳನ್ನು (95 °C ನಲ್ಲಿ 50 ಸೆಕೆಂಡುಗಳು, 50 °C ನಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷ ಮತ್ತು 72 °C ನಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷ) ನಿರ್ವಹಿಸಿ.
ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳಿಂದ ಫೇಜ್, ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಫೇಜ್, CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದಿಂದ ರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಫೇಜ್ ಅಥವಾ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಎಸ್ಚೆರಿಚಿಯಾ ಕೋಲಿ BL5615 ನಲ್ಲಿ TB ಸಾರು (ಸಿಗ್ಮಾ ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ನಲ್ಲಿ ಅಥವಾ 500 cm2 ಭಕ್ಷ್ಯಗಳಲ್ಲಿ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) 37°C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು. ಟ್ರಿಸ್-EDTA ಬಫರ್ (ಫ್ಲುಕಾ ಅನಾಲಿಟಿಕಲ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಪೈಪೆಟ್ ತುದಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಕ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಒಂದು ಸುತ್ತಿನ ಪಾಲಿಥಿಲೀನ್ ಗ್ಲೈಕಾಲ್ (PEG 8000) ಅವಕ್ಷೇಪನ (ಪ್ರೊಮೆಗಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅಥವಾ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಟ್ರಿಸ್-EDTA ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಯಿತು.
ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ (IV) ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ (500 μl/ಪ್ರಾಣಿ) ನೀಡುವ ಮೊದಲು ವರ್ಧಿತ ಫೇಜ್ ಅನ್ನು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವ ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಮಿಲ್ಟೆನಿ ಬಯೋಟೆಕ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು 2-3 ಸುತ್ತುಗಳ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನಲ್ಲಿ, 2×1012 ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು; ಎರಡನೆಯದರಲ್ಲಿ, 2×1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು; ಮೂರನೇ ಮತ್ತು ನಾಲ್ಕನೇ ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಪ್ರಾಣಿಗೆ 2×109 ಫೇಜ್‌ಗಳು. CSF ಮತ್ತು ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ರಕ್ತದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಫೇಜ್ ಅಂಶವನ್ನು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಪ್ಲೇಕ್ ಎಣಿಕೆಯ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (T7Select ಸಿಸ್ಟಮ್ ಕೈಪಿಡಿ). ಫೇಜ್ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳಕ್ಕೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಲೈಬ್ರರಿಗಳ ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ ಹಿಂದಿನ ಆಯ್ಕೆ ಸುತ್ತಿನಿಂದ CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಫೇಜ್‌ನ ಮರು-ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಕೊಯ್ಲುಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ 10 ನಿಮಿಷ, 30 ನಿಮಿಷ, 60 ನಿಮಿಷ, 90 ನಿಮಿಷ, 120 ನಿಮಿಷ, 180 ನಿಮಿಷ ಮತ್ತು 240 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ CSF ಮತ್ತು ರಕ್ತದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಒಟ್ಟು ನಾಲ್ಕು ಸುತ್ತಿನ ಇನ್ ವಿವೋ ಪ್ಯಾನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಇದರಲ್ಲಿ ಆಯ್ಕೆಯ ಮೊದಲ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು ಆಯ್ದ ಶಾಖೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಮೊದಲ ಎರಡು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಫೇಜ್ ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು 454/ರೋಚೆ ಪೈರೋಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಕೊನೆಯ ಎರಡು ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ CSF ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಆಯ್ಕೆಯಿಂದ ಎಲ್ಲಾ ರಕ್ತದ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ 454/ರೋಚೆ ಪೈರೋಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ, ಆಯ್ದ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು E. coli (BL5615) ನಲ್ಲಿ 500 cm2 ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 37°C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಮತ್ತು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿದ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳನ್ನು TB ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಪ್ರಸಾರ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಫೇಜ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ, ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಮತ್ತು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆಯ ನಂತರ (ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ), 300 μl ನಲ್ಲಿರುವ 2×1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿಯನ್ನು ಒಂದು ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳಕ್ಕೆ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು.
ಅನುಕ್ರಮ ದತ್ತಾಂಶದ ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಮತ್ತು ಗುಣಾತ್ಮಕ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್. ರಾ 454/ರೋಚೆ ದತ್ತಾಂಶವನ್ನು ಬೈನರಿ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಮ್ಯಾಪ್ ಫಾರ್ಮ್ಯಾಟ್ (sff) ನಿಂದ ಪಿಯರ್ಸನ್ ಹ್ಯೂಮನ್ ರೀಡಬಲ್ ಫಾರ್ಮ್ಯಾಟ್ (fasta) ಗೆ ಮಾರಾಟಗಾರ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು. ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದ ಮತ್ತಷ್ಟು ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ಕೆಳಗೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಸ್ವಾಮ್ಯದ C ಪ್ರೋಗ್ರಾಂಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡದ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್) ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಥಮಿಕ ದತ್ತಾಂಶದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ ಬಹು-ಹಂತದ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಮಾನ್ಯವಾದ 12mer ಇನ್ಸರ್ಟ್ DNA ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲು, ಜಾಗತಿಕ ನೀಡಲ್‌ಮನ್-ವುನ್ಸ್ಚ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಲೇಬಲ್ (GTGATGTCGGGATCCGAATTC), ಸ್ಟಾಪ್ ಲೇಬಲ್ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCAGTA) ಮತ್ತು ಹಿನ್ನೆಲೆ ಇನ್ಸರ್ಟ್ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ಗೆ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಜೋಡಣೆಗೆ 2 ಅಸಂಗತತೆಗಳನ್ನು ಅನುಮತಿಸುವ ಜೋಡಣೆ31. ಆದ್ದರಿಂದ, ಪ್ರಾರಂಭ ಮತ್ತು ನಿಲುಗಡೆ ಟ್ಯಾಗ್‌ಗಳಿಲ್ಲದ ಓದುಗಳು ಮತ್ತು ಹಿನ್ನೆಲೆ ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರೀಡ್‌ಗಳು, ಅಂದರೆ, ಅನುಮತಿಸಲಾದ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ಮೀರಿದ ಜೋಡಣೆಗಳನ್ನು ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಉಳಿದ ಓದುಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ಪ್ರಾರಂಭದ ಗುರುತು ಮತ್ತು ಸ್ಟಾಪ್ ಗುರುತುಗಿಂತ ಮೊದಲು ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುವ N-mer DNA ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಮೂಲ ಓದು ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು (ಇನ್ನು ಮುಂದೆ ಇದನ್ನು "ಇನ್ಸರ್ಟ್" ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ). ಸೇರಿಸುವಿಕೆಯ ಅನುವಾದದ ನಂತರ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 5′ ತುದಿಯಲ್ಲಿರುವ ಮೊದಲ ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ನ ನಂತರದ ಭಾಗವನ್ನು ಸೇರಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಅಪೂರ್ಣ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಹಿನ್ನೆಲೆ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿರುವ ಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊರಗಿಡಲು, "PAG" ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಅನುವಾದಿತ ಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಸಹ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ. 3 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಅನುವಾದದ ನಂತರದ ಉದ್ದವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ರಂಥಾಲಯದಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸೇರಿಸುವ ಪೂಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಪುನರುಕ್ತಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಅನನ್ಯ ಸೇರಿಸುವಿಕೆಯ ಆವರ್ತನವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ. ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಪಟ್ಟಿ (ಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳು) ಮತ್ತು ಅವುಗಳ (ಓದಿದ) ಆವರ್ತನಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು 1c ಮತ್ತು 2).
ಅನುಕ್ರಮ ಹೋಲಿಕೆಯ ಮೂಲಕ ಗುಂಪು N-mer DNA ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳು: 454/ರೋಚೆ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮ ದೋಷಗಳನ್ನು (ಹೋಮೋಪಾಲಿಮರ್ ವಿಸ್ತರಣೆಗಳ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿನ ಸಮಸ್ಯೆಗಳು) ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು, ಹಿಂದೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾದ N-mer DNA ಅನುಕ್ರಮ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು (ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳು) ಹೋಲಿಕೆಯ ಮೂಲಕ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾದ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಳವಡಿಕೆಗಳನ್ನು (2 ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗದ ಬೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲಾಗಿದೆ): ಅಳವಡಿಕೆಗಳನ್ನು ಮೊದಲು ಅವುಗಳ ಆವರ್ತನದಿಂದ (ಹೆಚ್ಚಿನದರಿಂದ ಕಡಿಮೆ) ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಅವು ಒಂದೇ ಆಗಿದ್ದರೆ, ಅವುಗಳ ದ್ವಿತೀಯಕ ಉದ್ದದ ವಿಂಗಡಣೆಯಿಂದ (ಉದ್ದದಿಂದ ಚಿಕ್ಕದಕ್ಕೆ) ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಹೀಗಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚು ಆಗಾಗ್ಗೆ ಮತ್ತು ಉದ್ದವಾದ ಅಳವಡಿಕೆಗಳು ಮೊದಲ "ಗುಂಪನ್ನು" ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸುತ್ತವೆ. ಗುಂಪು ಆವರ್ತನವನ್ನು ಕೀ ಆವರ್ತನಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಂತರ, ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ ಪಟ್ಟಿಯಲ್ಲಿ ಉಳಿದಿರುವ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಅಳವಡಿಕೆಯನ್ನು ಜೋಡಿಯಾಗಿ ನೀಡಲ್‌ಮನ್-ವುನ್ಸ್ಚ್ ಜೋಡಣೆಯ ಮೂಲಕ ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಲಾಯಿತು. ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗದಿರುವುದು, ಅಳವಡಿಕೆಗಳು ಅಥವಾ ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ 2 ರ ಮಿತಿಯನ್ನು ಮೀರದಿದ್ದರೆ, ಗುಂಪಿಗೆ ಅಳವಡಿಕೆಯನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಾರೆ ಗುಂಪು ಆವರ್ತನವನ್ನು ಅಳವಡಿಕೆಯನ್ನು ಎಷ್ಟು ಬಾರಿ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂಬುದರ ಮೂಲಕ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿದಂತೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಹೊರಗಿಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈಗಾಗಲೇ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿಸುವ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದಿದ್ದರೆ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯ ಆವರ್ತನದೊಂದಿಗೆ ಹೊಸ ಗುಂಪನ್ನು ರಚಿಸಲು ಸೇರಿಸುವ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಳಸಿದಂತೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಅಳವಡಿಕೆಯ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಸ ಗುಂಪನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಬಳಸಿದಾಗ ಅಥವಾ ಈಗಾಗಲೇ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಿದಾಗ ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ನಂತರ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಗುಂಪು ಮಾಡಿದ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಾಗಿ (ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳು) ಅನುವಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಫಲಿತಾಂಶವು ಅಳವಡಿಕೆಗಳ ಸೆಟ್ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಅನುಗುಣವಾದ ಆವರ್ತನಗಳು, ಇದು ಸತತ ಓದುವಿಕೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2).
ಮೋಟಿಫ್ ಜನರೇಷನ್: ಅನನ್ಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿ, ಕೆಳಗೆ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅಮೈನೋ ಆಸಿಡ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (aa) ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ. 3 ಉದ್ದದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಸಂಭಾವ್ಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅದರ ವಿಲೋಮ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು) ಹೊಂದಿರುವ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮೋಟಿಫ್ ಲೈಬ್ರರಿಯೊಂದಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಹೆಚ್ಚು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪುನರುಕ್ತಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ನಂತರ, ಮೋಟಿಫ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರತಿ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗೆ, ಕಂಪ್ಯೂಟೇಶನಲ್ ಪರಿಕರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ಅದರ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಕಂಡುಬರುವ ಮೋಟಿಫ್ ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಮೋಟಿಫ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿನ ಮೋಟಿಫ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿಯೋಜಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ("ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ"). ಮೋಟಿಫ್ ಪೀಳಿಗೆಯ ಫಲಿತಾಂಶವು ಟ್ರೈಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ (ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳು) ಎಲ್ಲಾ ಸಂಭವಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಆಯಾ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಎರಡು ಆಯಾಮದ ಶ್ರೇಣಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದಾಗ, ಗುಂಪು ಮಾಡಿದಾಗ ಮತ್ತು ಅನುವಾದಿಸಿದಾಗ ಅನುಗುಣವಾದ ಮೋಟಿಫ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ರೀಡ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಾಗಿದೆ. ಮೇಲೆ ವಿವರವಾಗಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೆಟ್ರಿಕ್ಸ್.
ಉದ್ದೇಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್‌ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಣ: ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಉದ್ದೇಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ
ಇಲ್ಲಿ ni ಎಂಬುದು ವಿಷಯ i ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಓದುಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ. ಹೀಗಾಗಿ, vi ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಮೋಟಿಫ್ i ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಓದುಗಳ (ಅಥವಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು) ಶೇಕಡಾವಾರು ಆವರ್ತನವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರವಾದ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸದ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳಿಗೆ P- ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಉದ್ದೇಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕೊರೆಲೊಗ್ರಾಮ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ಸ್ಪಿಯರ್‌ಮ್ಯಾನ್‌ನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು R ನೊಂದಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಉದ್ದೇಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.
ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲೂ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು, ವೆಬ್ ಲೋಗೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ಅನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, 12-ಮೆರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲೂ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು 20×12 ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ, ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ವಿಷಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 1000 ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಗುಂಪನ್ನು ಫಾಸ್ಟಾ-ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಸ್ವರೂಪದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವೆಬ್-ಲೋಗೋ 3 ಗೆ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಆಗಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ವಿಷಯದ ಚಿತ್ರಾತ್ಮಕ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಾಗಿ. ಬಹುಆಯಾಮದ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು, R ನಲ್ಲಿ ಆಂತರಿಕವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ಬಯೋಸ್ ಹೀಟ್‌ಮ್ಯಾಪ್, ಇನ್ನೂ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗದ R ಪ್ಯಾಕೇಜ್). ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾದ ಡೆಂಡ್ರೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳನ್ನು ಯೂಕ್ಲಿಡಿಯನ್ ದೂರ ಮೆಟ್ರಿಕ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವಾರ್ಡ್‌ನ ಶ್ರೇಣೀಕೃತ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಮೋಟಿಫ್ ಸ್ಕೋರಿಂಗ್ ಡೇಟಾದ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಅಸಹಜ ಸ್ಕೋರಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರವಾದ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇತರ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳಿಗೆ P-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ t-ಪರೀಕ್ಷೆ ಅಥವಾ ANOVA ಬಳಸಿಕೊಂಡು R ನಲ್ಲಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.
ಆಯ್ದ ಫೇಜ್ ಕ್ಲೋನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇನ್ಸರ್ಟ್‌ಗಳಿಲ್ಲದ ಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳದ ಮೂಲಕ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು (300 μl PBS ನಲ್ಲಿ 2×1010 ಫೇಜ್‌ಗಳು/ಪ್ರಾಣಿ). ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸ್ಥಿರೀಕರಣಕ್ಕೆ ಹತ್ತು ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು, ಅದೇ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ 100 μl ಡೈಲೈಟ್ 594-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಲೆಕ್ಟಿನ್ (ವೆಕ್ಟರ್ ಲ್ಯಾಬೋರೇಟರೀಸ್ ಇಂಕ್., DL-1177) ಅನ್ನು ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಫೇಜ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮಾಡಿದ 60 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ, ಇಲಿಗಳನ್ನು 50 ಮಿಲಿ PBS ನೊಂದಿಗೆ ಹೃದಯದ ಮೂಲಕ ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 50 ಮಿಲಿ 4% PFA/PBS ಅನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು. ಮೆದುಳಿನ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ 4% PFA/PBS ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 30% ಸುಕ್ರೋಸ್‌ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C ನಲ್ಲಿ ನೆನೆಸಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು OCT ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಫ್ಲ್ಯಾಶ್ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಮಾದರಿಗಳ ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 µm ಕ್ರಯೋಸೆಕ್ಷನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 1% BSA ಯೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4 °C ನಲ್ಲಿ T7 ಫೇಜ್ (ನೊವಸ್ NB 600-376A) ವಿರುದ್ಧ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ FITC-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಿ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಲೇಸರ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (ಲೈಕಾ TCS SP5) ನೊಂದಿಗೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು.
ಕನಿಷ್ಠ 98% ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಜೆನ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ USA ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿ, ಬಯೋಟೈನೈಲೇಟೆಡ್ ಮತ್ತು ಲೈಯೋಫಿಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಬಯೋಟಿನ್ ಅನ್ನು N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಟ್ರಿಪಲ್ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಸ್ಪೇಸರ್ ಮೂಲಕ ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎಲ್ಲಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿ.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ S0677) ಅನ್ನು 5 ಪಟ್ಟು ಸಮಾನವಾದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್, ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅಥವಾ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು BACE1 ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಸಂಯೋಜನೆ (3:1 ಅನುಪಾತ) ನೊಂದಿಗೆ 5-10% DMSO/PBS ನಲ್ಲಿ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮೊದಲು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ. ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಸಂಯೋಜಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕುಹರವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಇಲಿಗಳ ಬಾಲ ರಕ್ತನಾಳಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಕ್ಕೆ 10 mg/kg ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ELISA ನಿರ್ಣಯಿಸಿದೆ. ನಂಕ್ ಮ್ಯಾಕ್ಸಿಸಾರ್ಪ್ ಮೈಕ್ರೋಟೈಟರ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಸಿಗ್ಮಾ) ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C ನಲ್ಲಿ 1.5 μg/ml ಮೌಸ್ ಆಂಟಿ-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದಿಂದ (ಥರ್ಮೋ, MA1-20011) ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ (ಬಫರ್ ನಿರ್ಬಂಧಿಸುವುದು: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ಜೆಲಾಟಿನ್, 1% BSA), ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 0.05% ಟ್ವೀನ್-20/PBS (ವಾಶ್ ಬಫರ್) ನೊಂದಿಗೆ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ತೊಳೆಯಿರಿ. ಎರಡನೇ ಬಾರಿಗೆ, CSF ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸುವ ಬಫರ್ (ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ 1:10,000, CSF 1:115) ನೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಬಾವಿಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಪತ್ತೆ ಪ್ರತಿಕಾಯದಿಂದ (1 μg/ml, ಆಂಟಿ-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-HRP, ನೋವಸ್ NB120-7239) ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಮೂರು ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳ ನಂತರ, TMB ತಲಾಧಾರ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ (ರೋಚೆ) 20 ನಿಮಿಷಗಳವರೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು. 1M H2SO4 ನೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಿದ ನಂತರ, 450 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಿರಿ.
ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಪೆಪ್ಟೈಡ್-BACE1 ಪ್ರತಿರೋಧಕ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ (ವಾಕೊ, 294-64701) ಪ್ರಕಾರ Aβ(1-40) ELISA ನಿರ್ಣಯಿಸಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, CSF ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ದ್ರಾವಕದಲ್ಲಿ (1:23) ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು BNT77 ಕ್ಯಾಪ್ಚರ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದಿಂದ ಲೇಪಿತವಾದ 96-ಬಾವಿ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ 4°C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಐದು ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳ ನಂತರ, HRP-ಸಂಯೋಜಿತ BA27 ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 4°C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಐದು ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳು. ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ TMB ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ Aβ(1–40) ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು. ಸ್ಟಾಪ್ ದ್ರಾವಣದೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಿದ ನಂತರ, 450 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಿರಿ. ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು Aβ(1–40) ELISA ಗೆ ಮೊದಲು ಘನ ಹಂತದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ಲಾಸ್ಮಾವನ್ನು 96-ಬಾವಿ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ 0.2% DEA (ಸಿಗ್ಮಾ) ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. SPE ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಓಯಸಿಸ್, 186000679) ನೀರು ಮತ್ತು 100% ಮೆಥನಾಲ್‌ನಿಂದ ಸತತವಾಗಿ ತೊಳೆದ ನಂತರ, ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು SPE ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ದ್ರವವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು (ಮೊದಲು 5% ಮೆಥನಾಲ್‌ನಿಂದ ನಂತರ 30% ಮೆಥನಾಲ್‌ನಿಂದ) ಮತ್ತು 2% NH4OH/90% ಮೆಥನಾಲ್‌ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಸ್ಥಿರ N2 ಪ್ರವಾಹದಲ್ಲಿ 55°C ನಲ್ಲಿ 99 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಎಲ್ಯುಯೇಟ್ ಅನ್ನು ಒಣಗಿಸಿದ ನಂತರ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ದ್ರಾವಕಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ Aβ(1–40) ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು.
ಈ ಲೇಖನವನ್ನು ಹೇಗೆ ಉಲ್ಲೇಖಿಸುವುದು: ಉರಿಚ್, ಇ. ಮತ್ತು ಇತರರು. ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಸಾಗಣೆ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೆದುಳಿಗೆ ಸರಕು ವಿತರಣೆ. ವಿಜ್ಞಾನ. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
ಲಿಖೋಟಾ ಜೆ., ಸ್ಕ್ಜೋರಿಂಜ್ ಟಿ., ಥಾಮ್ಸೆನ್ ಎಲ್‌ಬಿ ಮತ್ತು ಮೂಸ್ ಟಿ. ಗುರಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೆದುಳಿಗೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಔಷಧಗಳ ವಿತರಣೆ. ಜರ್ನಲ್ ಆಫ್ ನ್ಯೂರೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
ಬ್ರಾಸ್‌ನ್ಜೆವಿಕ್, ಐ., ಸ್ಟೈನ್‌ಬುಷ್, ಹೆಚ್‌ಡಬ್ಲ್ಯೂ, ಸ್ಕ್ಮಿಟ್ಜ್, ಸಿ., ಮತ್ತು ಮಾರ್ಟಿನೆಜ್-ಮಾರ್ಟಿನೆಜ್, ಪಿ. ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಔಷಧಗಳ ವಿತರಣೆ. ಪ್ರೊಗ್ ನ್ಯೂರೋಬಯೋಲ್ 87, 212–251, 10.1016/ಜೆ.ಪ್ನ್ಯೂರೋಬಿಯೋ.2008.12.002 (2009).
ಪಾರ್ಡ್ರಿಡ್ಜ್, WM ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆ: ಮೆದುಳಿನ ಔಷಧ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯಲ್ಲಿ ಅಡಚಣೆ. ನ್ಯೂರೋಆರ್ಎಕ್ಸ್ 2, 3–14, 10.1602/ನ್ಯೂರೋರ್ಕ್ಸ್.2.1.3 (2005).
ಜೋಹಾನ್ಸನ್, ಕೆಇ, ಡಂಕನ್, ಜೆಎ, ಸ್ಟೋಪಾ, ಇಜಿ, ಮತ್ತು ಬೈರ್ಡ್, ಎ. ಕೋರಾಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್-ಸಿಎಸ್ಎಫ್ ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ ಮೆದುಳಿಗೆ ಸುಧಾರಿತ ಔಷಧ ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಗುರಿಯಿಡುವ ನಿರೀಕ್ಷೆಗಳು. ಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್ ರಿಸರ್ಚ್ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
ಪಾರ್ಡ್ರಿಡ್ಜ್, WM ಮೆದುಳಿನ ವಿತರಣೆಗಾಗಿ ಆಣ್ವಿಕ ಟ್ರೋಜನ್ ಹಾರ್ಸ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಜೈವಿಕ ಔಷಧಗಳ ಆಧುನೀಕರಣ. ಬಯೋಕಾನ್ಜಗ್ ಕೆಮ್ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
ಪಾರ್ಡ್ರಿಡ್ಜ್, ರಕ್ತ-ಮಿದುಳಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯಾದ್ಯಂತ WM ಗ್ರಾಹಕ-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸಾಗಣೆ. ಎಂಡೋಕ್ರ್ ರೆವ್. 7, 314–330 (1986).
ನೀವೋಹ್ನರ್, ಜೆ. ಮತ್ತು ಇತರರು. ಮೊನೊವೇಲೆಂಟ್ ಆಣ್ವಿಕ ಶಟಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಮೆದುಳಿನ ನುಗ್ಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ. ನ್ಯೂರಾನ್ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ಬಿಯೆನ್-ಲೀ, ಎನ್. ಮತ್ತು ಇತರರು. ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆರಿನ್ ಗ್ರಾಹಕ (TfR) ಸಾಗಣೆಯು TfR ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಅಫಿನಿಟಿ ರೂಪಾಂತರಗಳ ಮೆದುಳಿನ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ. ಜೆ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ ಮೆಡ್ 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).