Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ನೀವು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲದೊಂದಿಗೆ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಿದ್ದೀರಿ. ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕೆಂದು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ). ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಕ್ಯಾರೋಸೆಲ್ ಅನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ. ಒಂದೇ ಬಾರಿಗೆ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಹಿಂದಿನ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ, ಅಥವಾ ಒಂದೇ ಬಾರಿಗೆ ಮೂರು ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಕೊನೆಯಲ್ಲಿರುವ ಸ್ಲೈಡರ್ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.
ಸ್ವಯಂ-ಜೋಡಿಸುವ ನರ ಅಂಗಕಗಳು ಮಾನವ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಮತ್ತು ರೋಗವನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ಭರವಸೆಯ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ವೇದಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಆರ್ಗನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು ಇನ್ ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಇರುವ ಸಂಪರ್ಕವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ, ಇದು ಪಕ್ವತೆಯನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಇತರ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಏಕೀಕರಣವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ. ನವಜಾತ ಶಿಶುವಿನ ನಗ್ನ ಇಲಿಗಳ ಸೊಮಾಟೊಸೆನ್ಸರಿ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ಗೆ ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಲಾದ ಮಾನವ ಕಾಂಡಕೋಶ-ಪಡೆದ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಆರ್ಗನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು ಸಂವೇದನಾ ಮತ್ತು ಪ್ರೇರಣೆ-ಸಂಬಂಧಿತ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಪ್ರಬುದ್ಧ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ. MRI ಹಲವಾರು ಕಾಂಡಕೋಶ ರೇಖೆಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಸಿ ನಂತರದ ಆರ್ಗನಾಯ್ಡ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಆದರೆ ಏಕ-ಕೋರ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಾರ್ಟಿಕೊಜೆನೆಸಿಸ್‌ನ ಪ್ರಗತಿ ಮತ್ತು ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮದ ಹೊರಹೊಮ್ಮುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ನರಕೋಶಗಳು ಅವುಗಳ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರತಿರೂಪಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ, ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕ ಪೊರೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ತಿಮೋತಿ ಸಿಂಡ್ರೋಮ್ ಹೊಂದಿರುವ ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ನರಕೋಶದ ದೋಷಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಅಂಗಕಗಳು ಥಾಲಮೊಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಟಿಕೊಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುತ್ತವೆ ಎಂದು ಅಂಗರಚನಾಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆ ತೋರಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ನರ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಇನ್ ವಿವೊ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳು ಈ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳು ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸಂವೇದನಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಆರ್ಗನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು ಇಲಿ ಮೆದುಳಿನಾದ್ಯಂತ ಆಕ್ಸಾನ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಆಪ್ಟೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಪ್ರತಿಫಲ-ಹುಡುಕುವ ನಡವಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಹೀಗಾಗಿ, ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಮಾನವ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ನರಕೋಶಗಳು ಪ್ರಬುದ್ಧವಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಆತಿಥೇಯರ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಭಾಗವಹಿಸುತ್ತವೆ. ಈ ವಿಧಾನವು ರೋಗಿಯಿಂದ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಇತರ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್-ಲೆವೆಲ್ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದುತ್ತಿರುವ ಮಾನವ ಮೆದುಳು ಒಂದು ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಸ್ವಯಂ-ಸಂಘಟನಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿದ್ದು, ಇದರಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಪ್ರಸರಣಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತವೆ, ವಲಸೆ ಹೋಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಸಂಪರ್ಕಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಸಂವೇದನಾ ಅನುಭವದ ಮೂಲಕ ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರಿಷ್ಕರಿಸಲ್ಪಡುವ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ನರಕೋಶ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ. ಮಾನವ ಮೆದುಳಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ರೋಗದ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಪ್ರಮುಖ ಸಮಸ್ಯೆಯೆಂದರೆ ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶಕ್ಕೆ ಪ್ರವೇಶದ ಕೊರತೆ. ಮಾನವ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಆರ್ಗನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು (hCO; ಮಾನವ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಗೋಳ ಎಂದೂ ಕರೆಯುತ್ತಾರೆ) ಸೇರಿದಂತೆ ಸ್ವಯಂ-ಸಂಘಟಿಸುವ ಅಂಗಗಳು 2,3,4,5,6 ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹಲವಾರು ಮಿತಿಗಳು ನರಮಂಡಲದ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಣೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಅವುಗಳ ವ್ಯಾಪಕ ಅನ್ವಯವನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸುತ್ತವೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಇರುವ ಕೆಲವು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರ ಮತ್ತು ಸಂವೇದನಾ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಿಂದ hCO ಪಕ್ವತೆಯು ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂಬುದು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ. ಇದಲ್ಲದೆ, hCO ಗಳು ವರ್ತನೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲದ ಕಾರಣ, ತಳೀಯವಾಗಿ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮತ್ತು ವರ್ತನೆಯ ನರಮನೋವೈದ್ಯಕೀಯ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಗಳನ್ನು ಮಾಡೆಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆ ಪ್ರಸ್ತುತ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ.
hCO ಅನ್ನು ಅಖಂಡ ಜೀವಂತ ಮೆದುಳಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡುವುದರಿಂದ ಈ ಮಿತಿಗಳನ್ನು ನಿವಾರಿಸಬಹುದು. ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ದಂಶಕ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಲಾದ ಮಾನವ ನರಕೋಶಗಳು ದಂಶಕ ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಬದುಕಲು, ಯೋಜಿಸಲು ಮತ್ತು ಸಂವಹನ ನಡೆಸಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ7,8,9,10,11,12. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ವಯಸ್ಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಮೇಲೆ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಮತ್ತು ಆಕ್ಸೋನಲ್ ಏಕೀಕರಣವನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸಬಹುದು. ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ಹೈಪಿಎಸ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಪಡೆದ 3D hCO ಅನ್ನು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಇಮ್ಯುನೊಸೆನ್ಸರಿ ಡಿಫಿಷಿಯಂಟ್ ಇಲಿಗಳ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಸೊಮಾಟೊಸೆನ್ಸರಿ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ (S1) ಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಕಸಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ. ಕಸಿ ಮಾಡಲಾದ hCO (t-hCO) ನರಕೋಶಗಳು ಗಣನೀಯ ಪಕ್ವತೆಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ, ಸಂವೇದನಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುವ ಥಾಲಮೊಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಟಿಕಲ್-ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ವೀಕರಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಫಲ-ಕೋರಿಕೆಯ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಇಲಿ ಮೆದುಳಿಗೆ ಆಕ್ಸೋನಲ್ ಪ್ರಕ್ಷೇಪಣಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತವೆ. t-hCO ನ ವಿಸ್ತೃತ ಪಕ್ವತೆಯು ತಿಮೋತಿ ಸಿಂಡ್ರೋಮ್ (TS) ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ನರಕೋಶದ ದೋಷಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದೆ, ಇದು ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಸೂಕ್ಷ್ಮ L-ಟೈಪ್ CaV1.2 ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿನ ರೂಪಾಂತರಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ತೀವ್ರವಾದ ಆನುವಂಶಿಕ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯಾಗಿದೆ (CACNA1C ನಿಂದ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ).
ಮಾನವ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಆಗಿ ಅಖಂಡ 3D hCO ಅನ್ನು ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಅಥೈಮಿಕ್ ಇಲಿಗಳ S1 ಗೆ (ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ 3-7 ದಿನಗಳು) ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1a ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ 1a-c ನ ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ). ಈ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ಥಾಲಮೊಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಟಿಕೊಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಆಕ್ಸೋನಲ್ ಪ್ರಕ್ಷೇಪಗಳು ಇನ್ನೂ ತಮ್ಮ S1 ಆವಿಷ್ಕಾರವನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಿಲ್ಲ (ref. 13). ಹೀಗಾಗಿ, ಈ ವಿಧಾನವು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳ ಮೇಲಿನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವಾಗ t-hCO ಏಕೀಕರಣವನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೀವಂತ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ t-hCO ನ ಸ್ಥಳವನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು, ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 2-3 ತಿಂಗಳ ನಂತರ ನಾವು ಇಲಿಗಳ T2-ತೂಕದ MRI ಮೆದುಳಿನ ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1b ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 1d). t-hCO ಗಳನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು t-hCO ಯ ಪರಿಮಾಣ ಮಾಪನಗಳು ಸ್ಥಿರ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದಂತೆಯೇ ಇದ್ದವು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 1d,e; P > 0.05). t-hCO ಗಳನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು t-hCO ಯ ಪರಿಮಾಣ ಮಾಪನಗಳು ಸ್ಥಿರ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದಂತೆಯೇ ಇದ್ದವು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 1d,e; P > 0.05). t-hCO ಲೆಗ್ಕೊ ನ್ಯಾಬ್ಲ್ಯುಡಲಿಸ್, ಎ ಒಬ್ರೆಮ್ನಿ ಇಝ್ಮೆರೀನಿಯ t-hCO ಬೈಲಿ ಅನಾಲೊಜಿಚ್ನಿ ರಾಸ್ಚಿಟಾನಿಮ್ ಡಿಲೈ ಫ್ರಿಕ್ಸೈನ್ಸ್ данные, 1d, e; 0,05). t-hCO ಗಳನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣದ t-hCO ಅಳತೆಗಳು ಸ್ಥಿರ ವಿಭಾಗಗಳಿಗೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದಂತೆಯೇ ಇದ್ದವು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO ಲೆಗ್ಕೊ ನಾಬ್ಲ್ಯುಡಲ್ಸ್, ಎ ಒಬ್ರೆಮ್ನಿ ಇಜ್ಮೆರೆನಿಯಸ್ ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ ಬೈಲಿ ಅನಾಲೊಜಿಚ್ನಿ ರಾಸ್ಚಿಟಾನಿಮ್ ಡೈಲಾಕ್ಟರ್ಸ್ данные, 1d, e; 0,05). t-hCO ಅನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣದ t-hCO ಅಳತೆಗಳು ಸ್ಥಿರ ವಿಭಾಗಗಳಿಗೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದಂತೆಯೇ ಇದ್ದವು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 1d, e; P > 0.05).ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಸುಮಾರು 2 ತಿಂಗಳ ನಂತರ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ 81% ರಷ್ಟು t-hCO ಅನ್ನು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ (n = 72 ಪ್ರಾಣಿಗಳು; 10 hiPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳಿಂದ hCO; ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ hiPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳು). ಇವುಗಳಲ್ಲಿ, 87% ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿವೆ (ಚಿತ್ರ 1c). ಒಂದೇ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಇಲಿಯಲ್ಲಿ ಬಹು ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಸರಣಿ MRI ಸ್ಕ್ಯಾನ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೂಲಕ, 3 ತಿಂಗಳೊಳಗೆ t-hCO ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿ ಒಂಬತ್ತು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1d ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 1f). ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಪ್ರಾಣಿಗಳು ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 12 ತಿಂಗಳ ನಂತರ ಹೆಚ್ಚಿನ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು (74%) ಹೊಂದಿದ್ದವು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 1g ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2), ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟ ಮೋಟಾರ್ ಅಥವಾ ಮೆಮೊರಿ ದುರ್ಬಲತೆಗಳು, ಗ್ಲಿಯೋಸಿಸ್ ಅಥವಾ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಎನ್ಸೆಫಾಲೋಗ್ರಾಮ್ (EEG) ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ. ಡೇಟಾ ಚಿತ್ರ 1g ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2). 1h–m ಮತ್ತು 3e).
a, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿನ್ಯಾಸದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್. hiPS ಕೋಶಗಳಿಂದ ಪಡೆದ hCO ಅನ್ನು 30-60 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ ನವಜಾತ ನಗ್ನ ಇಲಿಗಳ S1 ಗೆ ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಲಾಯಿತು. b, ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 2 ತಿಂಗಳ ನಂತರ S1 ನಲ್ಲಿ t-hCO ಅನ್ನು ತೋರಿಸುವ T2-ತೂಕದ ಕರೋನಲ್ ಮತ್ತು ಅಡ್ಡ MRI ಚಿತ್ರಗಳು. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 2 ಮಿಮೀ. c, ಪ್ರತಿ hiPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗೆ ತೋರಿಸಲಾದ ಕಸಿ ಯಶಸ್ಸಿನ ದರಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 108, ಬಾರ್‌ಗಳೊಳಗಿನ ಸಂಖ್ಯೆಗಳು hIPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗೆ t-hCO ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ) ಮತ್ತು ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಅಥವಾ ಸಬ್‌ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಸ್ಥಳ (n = 88). d, ಪರಿಧಮನಿಯ ಅಪಧಮನಿಯ MRI ಚಿತ್ರ (ಎಡ; ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 3 ಮಿಮೀ) ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ 3D ವಾಲ್ಯೂಮೆಟ್ರಿಕ್ ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣ (ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 3 ಮಿಮೀ) 3 ತಿಂಗಳುಗಳಲ್ಲಿ t-hCO ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. e, ಇಲಿ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ t-hCO ಮಾದರಿಗಳ ವಿಮರ್ಶೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 1 ಮಿಮೀ. f, ಮೇಲಿನ ಎಡದಿಂದ ಬಲಕ್ಕೆ ತೋರಿಸಲಾದ t-hCO ನ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಇಮ್ಯುನೊಸೈಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ಚಿತ್ರಗಳು (ವಿಭಿನ್ನತೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ): PPP1R17 (4 ತಿಂಗಳು ಹಳೆಯದು), NeuN (8 ತಿಂಗಳು ಹಳೆಯದು), SOX9 ಮತ್ತು GFAP (8 ತಿಂಗಳು ಹಳೆಯದು), PDGFRα; (8 ತಿಂಗಳು ಹಳೆಯದು), MAP2 (8 ತಿಂಗಳು ಹಳೆಯದು) ಮತ್ತು IBA1 (8 ತಿಂಗಳುಗಳು). ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 20 µm. HNA ಯ ಸಹ-ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾನವ ಮೂಲದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. g, snRNA-seq: ಸೀರಾಟ್ ಏಕೀಕರಣದ ನಂತರ ಎಲ್ಲಾ ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ t-hCO ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳ ಏಕೀಕೃತ ಮ್ಯಾನಿಫೋಲ್ಡ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್ (UMAP) ಆಯಾಮ ಕಡಿತ ಚಿತ್ರಣ (n=3 t-hCO ಮಾದರಿಗಳು, n=2 hiPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳು). ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳು, ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್ ರೇಖೆಯ ಕೋಶಗಳು; ಸೈಕ್ ಪ್ರೊಗ್, ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡುವ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳು; ಗ್ಲುನ್ ಡಿಎಲ್, ಆಳವಾದ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ಗ್ಲುನ್ ಡಿಎಲ್/ಎಸ್‌ಪಿ, ಆಳವಾದ ಮತ್ತು ಸಬ್‌ಲ್ಯಾಮೆಲ್ಲರ್ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ಗ್ಲುನ್ ಯುಎಲ್, ಮೇಲಿನ ಪದರದ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳು, ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳು; OPC, ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್ ಮೂಲಜನಕ ಕೋಶಗಳು; RELN, ರೀಲಿನ್ ನರಕೋಶಗಳು. h, hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಟೆಡ್ (ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮಾಡಲಾದ P < 0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ > 2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ) ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ಪದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. h, hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಟೆಡ್ (ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮಾಡಲಾದ P < 0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ > 2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ) ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ಪದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. h, ಅನಾಲಿಸ್ ಒಬೊಗಶೇನಿಯ ಟೆರ್ಮಿನೋವ್ ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ಗೆನೋವ್ ಮೂಲಕ ಪ್ರಸಿದ್ಧವಾದ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಣೆ (ಸ್ಕೊರೆಕ್ಟರಿ, ಪೋಸ್ಟ್ <0, ಇಸ್ಮೆನೆನಿಯಾ > 2, 10% ರಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚು) ಗ್ಲುಟಮಾಟರ್ಗಿಚೆಸ್ಕಿಮಿ ನೈರೋನಾಮಿ hCO. h, hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ (ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮಾಡಿದ P<0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ >2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ) ಹೊಂದಿರುವ ಜೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ಪದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整喕喇> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （ 后 . ಉದಾಹರಣೆಗೆ的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, geny geny genicitelno aktivizirovalisь (ಸ್ಕೊರೆಕ್ಟಿರೊವಾನ್ನಿಯ್ P <0,05, kratnosti izmenneniya> 2, Экспрессироет 10% ಡೇರ್) ಗ್ಲುಟಮಾಟರ್ಗಿಚೆಸ್ಕಿಹ್ ನೆಯ್ರೊನಾಹ್ ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ ಪೋ ಸ್ಕ್ರಾವ್ನೆನಿಯೂಸ್ ಗ್ಲುಟಮಾಟರ್ಗಿಚೆಸ್ಕಿಮಿ ನೆಯ್ರೊನಾಮಿ ಎಚ್‌ಸಿಒ (ಎನ್‌ಜಿಒ) ಟೆರ್ಮಿನಾ ಒಬೊಗಾಶೇನಿಯಾ. h, hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಸರಿಹೊಂದಿಸಿದ P < 0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ > 2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ). ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಪದದ ಒಂಟೊಲಾಜಿಕಲ್ (GO) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು 0.05 ರ aq ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. i, ಉಲ್ಲೇಖ 22 snRNA-seq ವಯಸ್ಕ ಮೋಟಾರ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ನಿಂದ ಲೇಬಲ್ ವರ್ಗಾವಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು t-hCO ನಲ್ಲಿ GluN ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ UMAP ಇಮೇಜಿಂಗ್. CT — ಕಾರ್ಟಿಕೊಥಾಲಾಮಿಕ್ ಕೋಶಗಳು, ET — ಎಕ್ಸ್‌ಟ್ರಾಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕೋಶಗಳು, IT — ಆಂತರಿಕ ಟೆಲೆನ್ಸೆಫಾಲಿಕ್ ಕೋಶಗಳು, NP — ಸಮೀಪದ ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್.
ನಂತರ ನಾವು t-hCO ನ ಸೈಟೋಆರ್ಕಿಟೆಕ್ಚರ್ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಾರೆ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಇಲಿ ಎಂಡೋಥೀಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಕಲೆಗಳು t-hCO ನೊಂದಿಗೆ ನಾಳೀಯೀಕರಣವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದವು, ಆದರೆ IBA1 ಕಲೆಗಳು ಕಸಿ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಇಲಿ ಮೈಕ್ರೋಗ್ಲಿಯಾ ಇರುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದವು (ಚಿತ್ರ 1f ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 3c,d). ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಟೈನಿಂಗ್ ಮಾನವ ಪರಮಾಣು ಪ್ರತಿಜನಕ (HNA) ಧನಾತ್ಮಕ ಕೋಶಗಳನ್ನು PPP1R17 (ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳು), NeuN (ನರಕೋಶಗಳು), SOX9 ಮತ್ತು GFAP (ಗ್ಲಿಯಲ್-ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳು) ಅಥವಾ PDGFRα (ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳು) ಸಹ-ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವುದನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 1f). ಏಕ ಕೋಶ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನಲ್ಲಿ t-hCO ನ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ಸರಿಸುಮಾರು 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ನಂತರ ನಾವು ಏಕ-ಕೋರ್ RNA ಅನುಕ್ರಮ (snRNA-seq) ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಇಲಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳ ಬೃಹತ್ ಶೋಧನೆ ಮತ್ತು ತೆಗೆಯುವಿಕೆ 21,500 ಉತ್ತಮ-ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮಾನವ ಮಾನೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ನಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ನೀಡಿತು (ಚಿತ್ರ 1g ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 4a,b). ವಿಶಿಷ್ಟ ಕೋಶ-ಮಾದರಿಯ ಗುರುತುಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಗಳು ಆಳವಾದ ಮತ್ತು ಮೇಲ್ಮೈ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, ಪರಿಚಲನೆಗೊಳ್ಳುವ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳು, ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್ ವಂಶಾವಳಿ ಸೇರಿದಂತೆ ಪ್ರಮುಖ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಕೋಶ ವರ್ಗಗಳ ಸಮೂಹಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿವೆ (ಚಿತ್ರ 1g, ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 4c, ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 3). SATB2 ಮತ್ತು CTIP2 ಗಾಗಿ ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಟೈನಿಂಗ್ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಉಪವಿಭಾಗಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, t-hCO ಸ್ಪಷ್ಟ ಅಂಗರಚನಾ ಶ್ರೇಣೀಕರಣವನ್ನು ತೋರಿಸಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 3a). ಹಂತ-ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ snRNA-seq hCO ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿ ಮತ್ತು GABAergic ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಸೇರಿದಂತೆ ಕೆಲವು ವಿನಾಯಿತಿಗಳೊಂದಿಗೆ ವಿಶಾಲವಾಗಿ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಕೋಶ ವರ್ಗಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿತು, ಇದು ಪಾರ್ಶ್ವ ಪೂರ್ವಗಾಮಿ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಅನುಕೂಲಕರ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಬಹುದು15 (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 4f - i ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 4). ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್, ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣ ಮತ್ತು ವೋಲ್ಟೇಜ್-ಗೇಟೆಡ್ ಚಾನಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಂತಹ ನರಕೋಶದ ಪಕ್ವತೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳ ಸೆಟ್‌ಗಳ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಸೇರಿದಂತೆ t-hCO ಮತ್ತು hCO ನಡುವಿನ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 5). ಕೋಷ್ಟಕ 6). ಅಂತೆಯೇ, ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ವೇಗವರ್ಧಿತ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಪಕ್ವತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದವು.
t-hCO ನಲ್ಲಿನ ಈ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು hCO ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಮತ್ತು t-hCO ಇನ್ ವಿವೊ ನಡುವಿನ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿವೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸಲು, ನಾವು 7-8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ನಂತರ ತೀವ್ರ ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಹಂತ-ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಬಯೋಸೈಟಿನ್ ತುಂಬಿದ hCO ಮತ್ತು hCO ಅನ್ನು ಪುನರ್ನಿರ್ಮಿಸಿದೆವು. hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು (ಚಿತ್ರ 2a). t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ದೊಡ್ಡದಾಗಿದ್ದವು, ಸೋಮಾ ವ್ಯಾಸಕ್ಕಿಂತ 1.5 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು, ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು ಡೆಂಡ್ರೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ hCO ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಒಟ್ಟು ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಉದ್ದದಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟಾರೆ ಆರು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು (ಚಿತ್ರ 2b). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗಿಂತ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಸ್ಪೈನ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿರುವುದನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2c). ಇದು t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಉದ್ದೀಕರಣ ಮತ್ತು ಕವಲೊಡೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ನಿರಂತರ ಕೋಶ ಪ್ರಸರಣದೊಂದಿಗೆ, ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ t-hCO ನ ತೀವ್ರ ಬೆಳವಣಿಗೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 1d ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಚಿತ್ರ 1f). ಇದು ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು. ಪೊರೆಯ ಧಾರಣಶಕ್ತಿ ಎಂಟು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿತ್ತು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 8d), ವಿಶ್ರಾಂತಿ-ಸ್ಥಿತಿಯ ಪೊರೆಯ ವಿಭವವು ಹೆಚ್ಚು ಹೈಪರ್‌ಪೋಲರೈಸ್ ಆಗಿತ್ತು (ಸರಿಸುಮಾರು 20 mV), ಮತ್ತು ಕರೆಂಟ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗಿಂತ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗರಿಷ್ಠ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ದರವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು. ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ (ಚಿತ್ರ 2d), e), ಇದು t-hCO ನ ದೊಡ್ಡ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಪ್ರಚೋದಕ ಪೋಸ್ಟ್‌ನ್ಯಾಪ್ಟಿಕ್ ಕರೆಂಟ್ ಈವೆಂಟ್‌ಗಳ (EPSC) ಆವರ್ತನವು t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ 2f), t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಸ್ಪೈನ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಉತ್ಸಾಹದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಲೈಂಗಿಕ ಸಿನಾಪ್ಸ್. ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 6a-c) ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ನಾವು hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಅಪಕ್ವ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.
a, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ನಂತರ ಬಯೋಸೈಟಿನ್ ತುಂಬಿದ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನರಕೋಶಗಳ 3D ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣ. b, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 8 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n = 6 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ಮತ್ತು ***P < 0.0001). b, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 8 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n = 6 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ಮತ್ತು ***P < 0.0001). б, ಕೋಲಿಚೆಸ್ಟ್ವೆನ್ನಯಾ ಒಶೆಂಕಾ ಮಾರ್ಫೊಲೊಜಿಕ್ಸ್ ಪ್ರಿಸ್ನಾಕೋವ್ (n = 8 ನೇಯ್ರೋನೋವ್ hCO, n = 6 ನೇಯ್ರೋನೋವ್ t-hCO; ** P = 0 *70 = 80, * 0,0 <0,0001). b, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n=8 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n=6 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; **P=0.0084, *P=0.0179, ಮತ್ತು ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0084,*P = 0.0179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0084,*P = 0.0179 б, ಕೋಲಿಚೆಸ್ಟ್ವೆನ್ನಯಾ ಒಶೆಂಕಾ ಮಾರ್ಫೊಲೊಜಿಕ್ಸ್ ಪ್ರಿಸ್ನಾಕೋವ್ (n = 8 ನೇಯ್ರೋನೋವ್ hCO, n = 6 ನೇಯ್ರೋನೋವ್ t-hCO; ** P = 0 *70 = 80, * 0,0 <0,0001). b, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n=8 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n=6 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; **P=0.0084, *P=0.0179, ಮತ್ತು ***P<0.0001).c, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ನಂತರ hCO ಮತ್ತು t-hCO ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಶಾಖೆಗಳ 3D ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣ. ಕೆಂಪು ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಕಲ್ಪಿತ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಸ್ಪೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಸ್ಪೈನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 8 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 6 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; **P = 0.0092). d, ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ವಿಭವದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 16 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ***P < 0.0001). d, ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ವಿಭವದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 16 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ***P < 0.0001). d, ಕೋಲಿಚೆಸ್ಟ್ವೆನ್ನಯ ಒಸೆಂಕಾ ಮೆಂಬ್ರಾನ್ನೊಗೊ ಪೊಟೆನ್ಷಿಯಾಲಾ ಪೊಕೊಯಾ (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, 0 *** P10). d, ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ವಿಭವದ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n = 16 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, ಕೋಲಿಚೆಸ್ಟ್ವೆನ್ನಯ ಒಸೆಂಕಾ ಮೆಂಬ್ರಾನ್ನೊಗೊ ಪೊಟೆನ್ಷಿಯಾಲಾ ಪೊಕೊಯಾ (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, 0 *** P10). d, ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ವಿಭವದ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n = 16 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001). e, ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಕರೆಂಟ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನಲ್ಲಿ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಕ್ರಿಯಾಶೀಲ ವಿಭವ ಫೈರಿಂಗ್, ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಫೈರಿಂಗ್ ದರದ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 16 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ***P < 0.0001). e, ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಕರೆಂಟ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನಲ್ಲಿ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಕ್ರಿಯಾಶೀಲ ವಿಭವ ಫೈರಿಂಗ್, ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಫೈರಿಂಗ್ ದರದ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 16 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ***P < 0.0001). ಇ, ಎಚ್‌ಸಿಒ ಮತ್ತು ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ, ವೈಜ್‌ವಾನ್ನೊ ವೆಲಿಚೆನಿಯೆಮ್ ಟೋಕಾ, ಮತ್ತು ಕೊಲಿಚೆಸ್ ಮ್ಯಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಸ್ಕೊರೊಸ್ಟ್ ವೊಜ್ಬುಡ್ಡೆನಿಯಾ (n = 25 NEIRONOв hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ಗರಿಷ್ಠ ಫೈರಿಂಗ್ ದರದ ಪ್ರವಾಹ ಹೆಚ್ಚಳ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನಲ್ಲಿ ಕ್ರಿಯಾಶೀಲ ವಿಭವ ಮರು-ಫೈರಿಂಗ್ (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 16 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; *** P < 0.0001). e, 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的最大放电率的神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 皖 =2 量神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 ಇ, ಪೋವ್ಟೋರಿಯಸ್ ವೋಸ್ಬುಡ್ಡೆನಿ ಪೊಟೆನ್ಷಿಯಾಲಾ ಡೈಸ್ಟ್ವಿಯಾ ಹೆಚ್‌ಸಿಒ ಮತ್ತು ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ, ವೈಜ್ವಾನ್ನೋ ಯೂವೆಲಿಚೆನಿಮ್ ಪೋಡಾಕ್, ಟೆಕ್ನಾಲಜಿ ಒಸೆಂಕಾ ಮ್ಯಾಕ್ಸಿಮಾಲ್ನೋಯ್ ಸ್ಕೊರೊಸ್ಟಿ ವೊಜ್ಬುಡ್ಡೆನಿಯ (n = 25 NEIRONOV hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ಹೆಚ್ಚಿದ ವಿದ್ಯುತ್ ಪೂರೈಕೆ ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಗುಂಡಿನ ದರದ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ hCO ಮತ್ತು t-hCO ಕ್ರಿಯಾಶೀಲ ವಿಭವಗಳ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಗುಂಡಿನ ದಾಳಿ (n = 25 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n = 16 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; *** P < 0.0001). f, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳು (sEPSC ಗಳು), ಮತ್ತು ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಘಟನೆಗಳ ಆವರ್ತನದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನರಕೋಶಗಳು, n = 17 t-hCO ನರಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001). f, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳು (sEPSC ಗಳು), ಮತ್ತು ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಘಟನೆಗಳ ಆವರ್ತನದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 17 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ***P < 0.0001). f, ನೈರೋನಾಹ್ ಹೆಚ್‌ಸಿಒ ಮತ್ತು ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ ಚೆರೆಸ್ 8 ಮೆಷಿಯಾಸೆವ್ ಡಿಫರೆನ್ಸ್ ಮತ್ತು ಕೊಲಿಚೆಸ್ಟ್‌ವೆನ್‌ಸಿಯಲ್ಲಿ ಸ್ಪೋನ್ಟಾನ್ ಇಪಿಎಸ್‌ಸಿ (ಎಸ್‌ಇಪಿಎಸ್‌ಸಿ) синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಈವೆಂಟ್ ದರಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದ 8 ತಿಂಗಳಿನಲ್ಲಿ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳು (sEPSC ಗಳು) (n=25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n=17 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, ನೈರೋನಾಹ್ ಹೆಚ್‌ಸಿಒ ಮತ್ತು ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ ಚೆರೆಸ್ 8 ಮೆಷಿಯಾಸೆವ್ ಡಿಫರೆನ್ಸ್ ಮತ್ತು ಕೊಲಿಚೆಸ್ಟ್‌ವೆನ್‌ಸಿಯಲ್ಲಿ ಸ್ಪೋನ್ಟಾನ್ ಇಪಿಎಸ್‌ಸಿ (ಎಸ್‌ಇಪಿಎಸ್‌ಸಿ) синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಈವೆಂಟ್ ದರಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದ 8 ತಿಂಗಳಿನಲ್ಲಿ hCO ಮತ್ತು t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳು (sEPSC ಗಳು) (n = 25 hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 17 t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; *** P<0.0001).bf ಗಾಗಿ, 1208-2 ಸಾಲಿನಲ್ಲಿರುವ hCO ಮತ್ತು t-hCO ಗಳನ್ನು ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾದ ಅದೇ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಬ್ಯಾಚ್‌ನಿಂದ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ. g, hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಟೆಡ್ (ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾದ P < 0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ > 2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ) ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಸೆಟ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಏಕಪಕ್ಷೀಯ ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ) ಇನ್ ವಿವೋ ಮೌಸ್ ಅಧ್ಯಯನದಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಆರಂಭಿಕ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (ERG) ಮತ್ತು ತಡ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (LRG) ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಸೆಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು16 ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಂದ ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ LRG ಗಳು17. g, hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಟೆಡ್ (ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾದ P < 0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ > 2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ) ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಸೆಟ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಏಕಪಕ್ಷೀಯ ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ) ಇನ್ ವಿವೋ ಮೌಸ್ ಅಧ್ಯಯನದಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಆರಂಭಿಕ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (ERG) ಮತ್ತು ತಡ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (LRG) ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಸೆಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು16 ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಂದ ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ LRG ಗಳು17. g, ಅನಾಲಿಸ್ ಒಬೊಗಸ್ಸೆನಿಯ ನಬೊರಾ ಗೆನೊವ್ (ಒಡ್ನೊಸ್ಟೊರೊನಿ ಟೊಚ್ನಿ ಕ್ರಿಟೇರಿ ಫಿಷೆರಾ) ಜೆನೊವ್ ಸೊ ಸ್ನಾಚಿಟೆಲ್ನೊಯ್ ಟೆಕ್ (ಸ್ಕೋರ್‌ರೆಕ್ಟಿರೋವಾನ್ ಪಿ <0,05, ಕ್ರಾಟ್‌ನೋಸ್ಟ್ ಇಸ್ಮೆನಿಯಸ್ > 2, ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಸ್ ಪೋ ಮೆನಿಶಿಯ ಮೇರಿ 10% ಡೇರ್‌) t-hCO по сравнению с ಗ್ಲುಟಮಾಥೆರ್ಗಿಕಿಮಿ ನೆಯ್ರೊನಾಮಿ ಹೆಚ್‌ಸಿಒ ನಾಬೋರ್ ಗೇನೋವ್ ಕ್ಯಾಕ್ ರಾನೆಗೊ (ಇಆರ್‌ಜಿ), ಟ್ಯಾಕ್ ಮತ್ತು ಪೋಜ್ಡ್ನೆಗೊ (ಎಲ್‌ಆರ್‌ಜಿ) ಗ್ಯಾನೋವ್, ಸಾವಿಷ್ಟ್ಗಳು vivo16 ನಲ್ಲಿನ ಮಿಶಾಹ್‌ನಲ್ಲಿನ ಇಸ್ಲೇಡೋವಾನಿಯಲ್ಲಿನ ಐಡೆಂಟಿಫಿಷಿಯನ್ಸ್, ಮತ್ತು ಸ್ಪೈಫಿಶಿಕ್ಸ್ ಚೆಲೋವೆಕಾ ಎಲ್‌ಆರ್‌ಜಿ ಅಥವಾ ವೈರೊನೊ7ವಿನಲ್ಲಿ. g, t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ (ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮಾಡಿದ P<0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ >2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ) ಹೊಂದಿರುವ ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಸೆಟ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಒನ್-ಟೈಲ್ಡ್ ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ) hCO ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಆರಂಭಿಕ (ERG) ಮತ್ತು ತಡವಾದ (LRG) ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಜೀನ್‌ಗಳ ಸೆಟ್‌ಗಳು ಇನ್ ವಿವೋ ಮೈಸ್16 ಮತ್ತು ವಿಟ್ರೊ17 ರಲ್ಲಿ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಂದ ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ LRG ಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG) 和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人rGG g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上 谷氨酸2小鼠 研究 ನೀವು神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, ಗ್ಲುಟಮಾಟರ್ಗಿಚೆಸ್ ನೈರೊನಿ t-hCO ಬ್ಯ್ಲಿ ಝನಾಚಿಟೆಲ್ನೊ ಆಕ್ಟಿವಿಝಿರೋವನ್ಯ್ ಪೋ ಸ್ರ್ಯಾವ್ನೆನಿಸ್ ಸ್ ಗ್ಲುಟಮಾಥೆರ್ಗಿಮ್ಸ್ (скорректированный P<0,05, ಕ್ರಾಟ್ನೊಸ್ಟ್ ಇಸ್ಮೆನೆನಿಯಾ> 2, ಇಲ್ಲ ಮೆನೆ 10% ಅನಾಲಿಸ್ ಒಬೊಗಸ್ಸೆನಿಯಾ ನಾಬೊರಾ ಗ್ನೆನೊವೊಟ್ ಟೆಸ್ಟ್ ಫಿಷೆರಾ) ರಾನ್ನೆಗೊ ಒಟ್ವೆಟಾ (ERG) ಮತ್ತು ಪೋಸ್ಡ್ನೆಗೊ ಗೆನಿ, ಆಕ್ಟಿವ್ನೋಸ್ಟಿ ಒಟ್ವೆಟಾ (LRG) ಯಿಂದ ಪ್ರಯೋಜನಗಳು ಮತ್ತು ನಿರೋನಾಹ್ ಇನ್ ವಿಟ್ರೋ17. LRG, ಸ್ಪೆಷಿಫಿಕೇಶನ್ ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ ಚೆಲೋವೆಕಾ. g, t-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಯಿತು (ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮಾಡಿದ P<0.05, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ >2, ಕನಿಷ್ಠ 10% ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (ERG) ಮತ್ತು ತಡವಾದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಜೀನ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಒನ್-ಟೈಲ್ಡ್ ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಚಟುವಟಿಕೆ ಅವಲಂಬಿತ ಜೀನ್‌ಗಳು (LRGs) ಇನ್ ವಿವೋ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ16 ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು.17 ಮಾನವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ LRGs.ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು 0.05. h ನ ಬೋನ್‌ಫೆರೋನಿ-ಸರಿಪಡಿಸಿದ P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, T-hCO ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ LRG ಜೀನ್‌ಗಳ snRNA-seq ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ GluN ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (ಪ್ರತಿ ಜೀನ್‌ನ ಹುಸಿ-ಪ್ಯಾಕೇಜ್ ಮತ್ತು ಸ್ಕೇಲಿಂಗ್) ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. i, t-hCO (ಮೇಲಿನ) ಮತ್ತು hCO (ಕೆಳಗಿನ) ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ SCG2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಟೈನಿಂಗ್. ಬಿಳಿ ಬಾಣಗಳು SCG2+ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 25 µm. ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಎಕ್ಸ್ ವಿವೋ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ t-hCO ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, snRNA-seq hCO ಇನ್ ವಿಟ್ರೊಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ನಲ್ಲಿ ಜೀನ್ ಪ್ರತಿಲಿಪಿಗಳ ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ತಡವಾದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದವು (ಚಿತ್ರ 2g,h), ಇದು ಮೌಸ್ ಮತ್ತು ಮಾನವ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ16,17. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, BDNF18, SCG2, ಮತ್ತು OSTN, ಪ್ರೈಮೇಟ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಚಟುವಟಿಕೆ-ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಜೀನ್, hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2g-i). ಹೀಗಾಗಿ, t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ಪ್ರತಿಲೇಖನ, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳ ಮೂಲಕ hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ವರ್ಧಿತ ಪಕ್ವತೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದವು.
ಮಾನವ ಮೆದುಳಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯೊಂದಿಗೆ t-hCO ಪಕ್ವತೆಯ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಭ್ರೂಣ ಮತ್ತು ವಯಸ್ಕ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ 19,20 ಮತ್ತು ವಯಸ್ಕ 21,22 ರ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೋಮಿಕ್ ಹೋಲಿಕೆಗಳನ್ನು ಹಾಗೂ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ 23 ರ ಬಗ್ಗೆ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಡೇಟಾವನ್ನು (ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾ, ಚಿತ್ರ 5) ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ಹಿಂದಿನ ಕೆಲಸ 24 ರೊಂದಿಗೆ, 7-8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ಜಾಗತಿಕ hCO ಮತ್ತು t-hCO ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೋಮ್ ಪಕ್ವತೆಯ ಸ್ಥಿತಿಯು ಇನ್ ವಿವೋ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಸಮಯಕ್ಕೆ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತಡವಾದ ಭ್ರೂಣದ ಜೀವನಕ್ಕೆ ಸಮನಾಗಿರುತ್ತದೆ (ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಚಿತ್ರ 5a). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ವಯಸ್ಸಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವ hCO ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೋಮ್ ಪರಿಪಕ್ವತೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಜೊತೆಗೆ ಸಿನಾಪ್ಟೊಜೆನೆಸಿಸ್, ಆಸ್ಟ್ರೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಮೈಲಿನೇಷನ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೋಮ್ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾ, ಚಿತ್ರ 5b-d). ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ, ವಯಸ್ಕ L2/3, L5 ಮತ್ತು L6 ನರಕೋಶದ ಉಪವಿಭಾಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಸಮೂಹಗಳೊಂದಿಗೆ t-hCO ನಲ್ಲಿ ತೆಳುವಾದ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಉಪವಿಭಾಗದ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1i). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಭ್ರೂಣದ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಅತಿಕ್ರಮಣವು ಗರ್ಭಧಾರಣೆಯ ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಸೀಮಿತವಾಗಿತ್ತು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 5e-j). t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ಮಾನವ ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ನಿಯೋಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಹೋಲುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ನಾವು ಮಾನವ ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನ ತೀಕ್ಷ್ಣವಾದ ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಮಾನವ L2/3 ಪಿರಮಿಡಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅಂಗರಚನಾ ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 7a). L2/3 ಪಿರಮಿಡಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು t-hCO ಪಿರಮಿಡಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಂತೆಯೇ ಇದ್ದವು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 7e). ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ಪ್ರಕಾರ, ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಮಾನವ ಮಾದರಿಗಳಿಂದ L2/3 ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು hCO ಗಿಂತ t-hCO ಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಹೋಲುತ್ತವೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ L2/3 ಜೀವಕೋಶಗಳು ಉದ್ದವಾಗಿದ್ದವು, ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಶಾಖೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಬೆನ್ನುಮೂಳೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು (ಚಿತ್ರ 3g ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 7b-). G).
a, ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು TS hiPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ hCO ಅನ್ನು ನವಜಾತ ಶಿಶುವಿನ ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡುವುದು. b, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ನಂತರ ಬಯೋಸಿಟಿನ್ ತುಂಬಿದ t-hCO ನರಕೋಶಗಳ 3D ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣ. c, ಸರಾಸರಿ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಉದ್ದದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (n = 19 ನಿಯಂತ್ರಣ ನರಕೋಶಗಳು, n = 21 TS ನರಕೋಶಗಳು; **P = 0.0041). d, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು TS t-hCO ನಿಂದ 3D-ಪುನರ್ನಿರ್ಮಿಸಿದ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಶಾಖೆಗಳು, ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಬೆನ್ನುಮೂಳೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 16 ನಿಯಂತ್ರಣ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 21 TS ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, ***P < 0.0001). d, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು TS t-hCO ನಿಂದ 3D-ಪುನರ್ನಿರ್ಮಿಸಿದ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಶಾಖೆಗಳು, ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಬೆನ್ನುಮೂಳೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n = 16 ನಿಯಂತ್ರಣ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 21 TS ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, ***P < 0.0001). d, 3D-ರೆಕಾನ್‌ಸ್ಟ್ರಕ್‌ಸಿಯಾ ಡೆಂಡ್ರಿಟ್ ವೆಟ್‌ವೆಯ್ ಐಝ್ ಕಾಂಟ್ರೋಲಿಯಾ ಮತ್ತು ಟಿಎಸ್ ಟಿ-ಎಚ್‌ಸಿಒ ಚೆರೆಸ್ 8 ಮೆಸಿಯಾಸೆವ್ ಡಿಫರೆನ್ಸ್‌ಸೈರೋವ್ಕಿ ಓಶೆಂಕಾ ಪ್ಲೋಟ್ನೋಸ್ಟಿ ಡೆಂಡ್ರಿಟ್ನ್ ಶಿಪೋವ್ (n = 16 CONTROLINYH NEIRONOV, n = 21 TS NEIRONov, *** P <0,0001). d, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಬೆನ್ನುಮೂಳೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು t-hCO TS ನಿಂದ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಶಾಖೆಗಳ 3D ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣ (n=16 ನಿಯಂತ್ರಣ ನರಕೋಶಗಳು, n=21 TS ನರಕೋಶಗಳು, ***P<0.0001). d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n =个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密化 = 16 量神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）. d, 3D-ರೆಕಾನ್‌ಸ್ಟ್ರಕ್‌ಸಿಯಾ ಡೆಂಡ್ರಿಟ್‌ನಿಹ್ ವೆಟ್ವೆ ಕಂಟ್ರೋಲ್ ಮತ್ತು TS t-hCO ಚೆರೆಸ್ 8 ಮೆಸ್ಯಾಸೆವ್ ಡಿಫರೆನ್ಸ್‌ಕ್ಯಾನಿಕ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ಲೋಟ್ನೋಸ್ಟಿ ಡೆಂಡ್ರಿಟ್ನ್ ಶಿಪೋವ್ (n = 16 CONTROLINYH NEIRONOV, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಬೆನ್ನುಮೂಳೆಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಶಾಖೆಗಳು ಮತ್ತು TS t-hCO ನ 3D ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣ (n=16 ನಿಯಂತ್ರಣ ನರಕೋಶಗಳು, n=21 TS ನರಕೋಶಗಳು, ***P<0.0001).ಕೆಂಪು ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಸಂಭಾವ್ಯ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಸ್ಪೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. e, ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳು ಮತ್ತು 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ನಂತರ TS t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು. f, ಸಂಚಿತ ಆವರ್ತನ ಪ್ಲಾಟ್ ಮತ್ತು ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಘಟನೆಗಳ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ವೈಶಾಲ್ಯದ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (n=32 ನಿಯಂತ್ರಣ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n=26 TS ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು; **P=0.0076 ಮತ್ತು P=0.8102). g, hCO ಮತ್ತು t-hCO ನಲ್ಲಿ TS ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಸ್ಕೋಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಗಳು ಹೋಲಿಕೆಗಾಗಿ ಮಾನವ L2/3 ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಪಿರಮಿಡಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ (n = 24 ನಿಯಂತ್ರಣ t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 21 TS t-hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು, n = 8 ನಿಯಂತ್ರಣ hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು n = 7 TS hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು). ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮಾನವ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ನರಕೋಶಗಳ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳನ್ನು ಉನ್ನತ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸುವ t-hCO ನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು, ರೋಗದ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು t-hCO ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದೇ ಎಂದು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು. CaV1.2 ಅನ್ನು ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಜೀನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಕಾರ್ಯದ ಲಾಭದ ರೂಪಾಂತರಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ತೀವ್ರವಾದ ನರ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯಾದ TS ಮೇಲೆ ನಾವು ಗಮನಹರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಜೀನ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ ಪರ್ಯಾಯ (p.G406R) ಮತ್ತು ಮೂರು ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮೂರು TS ರೋಗಿಗಳಿಂದ ನಾವು hCO ಅನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3a). ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ TS ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವು ಬದಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3b ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 8a,b), ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಡೆಂಡ್ರೈಟ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳ ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಉದ್ದದಲ್ಲಿ ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಾರೆ ಇಳಿಕೆ (ಚಿತ್ರ 3c ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 8c). ನಿಯಂತ್ರಣ ನರಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ TS ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪೈನ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳ ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಇದು ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3d–f ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 8g). ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ t-hCO TS ನಲ್ಲಿ ಅಸಹಜ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಕವಲೊಡೆಯುವಿಕೆಯ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಆದರೆ ವಿಟ್ರೊ TS hCO ನಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3g). ಇದು TS ನಲ್ಲಿ ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ ಡೆಂಡ್ರೈಟಿಕ್ ಕುಗ್ಗುವಿಕೆಯ ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ವರದಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಈ ಕಸಿ ವೇದಿಕೆಯು ವಿವೋದಲ್ಲಿ ರೋಗ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ನಂತರ ನಾವು t-hCO ಕೋಶಗಳನ್ನು ಇಲಿ S1 ಗೆ ಎಷ್ಟರ ಮಟ್ಟಿಗೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಕೇಳಿದೆವು. ದಂಶಕಗಳಲ್ಲಿನ S1 ಐಪ್ಸಿಲ್ಯಾಟರಲ್ ವೆಂಟ್ರಲ್ ಬೇಸಲ್ ಮತ್ತು ಪೋಸ್ಟೀರಿಯರ್ ಥಾಲಾಮಿಕ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳಿಂದ, ಹಾಗೆಯೇ ಐಪ್ಸಿಲ್ಯಾಟರಲ್ ಮೋಟಾರ್ ಮತ್ತು ಸೆಕೆಂಡರಿ ಸೊಮಾಟೊಸೆನ್ಸರಿ ಕಾರ್ಟಿಸಸ್ ಮತ್ತು ಕಾಂಟ್ರಾಲ್ಯಾಟರಲ್ S1 ನಿಂದ ಬಲವಾದ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4a). ಆವಿಷ್ಕಾರ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಲು, ನಾವು hCO ಅನ್ನು ರೇಬೀಸ್ ವೈರಸ್-dG-GFP/AAV-G ಯಿಂದ ಸೋಂಕಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು 3 ದಿನಗಳ ನಂತರ S1 ಇಲಿಗೆ hCO ಅನ್ನು ಕಸಿ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 7-14 ದಿನಗಳ ನಂತರ ಐಪ್ಸಿಲ್ಯಾಟರಲ್ S1 ಮತ್ತು ವೆಂಟ್ರಲ್ ಬೇಸಲ್ ಗ್ಯಾಂಗ್ಲಿಯಾದ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಾವು ದಟ್ಟವಾದ GFP ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4b, c). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಥಾಲಾಮಿಕ್ ಮಾರ್ಕರ್ ನೆಟ್ರಿನ್ G1 ನ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಕಲೆಗಳು t-hCO ನಲ್ಲಿ ಥಾಲಾಮಿಕ್ ಅಂತ್ಯಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದವು (ಚಿತ್ರ 4d, e). ಈ ಅಫೆರೆಂಟ್ ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಳು t-hCO ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಬಹುದೇ ಎಂದು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಥಾಲಾಮೊಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಪದರದ ತೀಕ್ಷ್ಣವಾದ ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಂದ ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಶ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಇಲಿ S1 ನ ವಿದ್ಯುತ್ ಪ್ರಚೋದನೆ, ಆಂತರಿಕ ಕ್ಯಾಪ್ಸುಲ್, ಬಿಳಿ ದ್ರವ್ಯ, t-hCO ಬಳಿಯ ನಾರುಗಳು ಅಥವಾ AMPA ಗ್ರಾಹಕ ವಿರೋಧಿ NBQX ಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡ t-hCO ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ t-hCO ಪ್ರೇರಿತ ಶಾರ್ಟ್-ಲೇಟೆನ್ಸಿ EPSC ಗಳಲ್ಲಿ ಆಪ್ಸಿನ್-ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಥಾಲಾಮಿಕ್ ಅಂತ್ಯಗಳ ಆಪ್ಟೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ. (ಚಿತ್ರ 4f, g ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 9a-g). ಈ ದತ್ತಾಂಶಗಳು t-hCO ಇಲಿ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಅಂಗರಚನಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಇಲಿ ಹೋಸ್ಟ್ ಅಂಗಾಂಶದಿಂದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ.
a, ರೇಬೀಸ್ ಟ್ರ್ಯಾಕಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. b, t-hCO ಮತ್ತು ಇಲಿ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ (ಮೇಲಿನ ಫಲಕ) ನಡುವಿನ GFP ಮತ್ತು ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ STEM121 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಇಲಿ ಇಪ್ಸಿಲ್ಯಾಟರಲ್ ವೆಂಟ್ರಲ್ ಬೇಸಲ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ (VB) (ಕೆಳಗಿನ ಎಡ) ಮತ್ತು ಐಪ್ಸಿಲ್ಯಾಟರಲ್ S1 (ಕೆಳಗಿನ ಬಲ) ನಲ್ಲಿ GFP ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸಹ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 50 µm. ಕೆಂಪು ಚೌಕಗಳು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ತೆಗೆದ ಮೆದುಳಿನ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. c, GFP (n = 4 ಇಲಿಗಳು) ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. d, e - t-hCO ನಲ್ಲಿ ನೆಟ್ರಿನ್ G1+ ಥಾಲಾಮಿಕ್ ಟರ್ಮಿನಲ್‌ಗಳು. d t-hCO ಮತ್ತು VB ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಕರೋನಲ್ ವಿಭಾಗವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 2 ಮಿಮೀ. e t-hCO (ಎಡ) ಮತ್ತು VB (ಬಲ) ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನೆಟ್ರಿನ್ G1 ಮತ್ತು STEM121 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 50 µm. ಕಿತ್ತಳೆ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು t-hCO ಗಡಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. f, g, S1 ಇಲಿ (f) ಅಥವಾ ಆಂತರಿಕ ಕ್ಯಾಪ್ಸುಲ್ (g) ನಲ್ಲಿ ವಿದ್ಯುತ್ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ t-hCO ನರಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸ್ತುತ ಕುರುಹುಗಳು, (ನೇರಳೆ) ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆ (ಕಪ್ಪು) NBQX (ಎಡ). NBQX (n = 6 S1 ನರಕೋಶಗಳು, *P = 0.0119; ಮತ್ತು n = 6 ಆಂತರಿಕ ಕ್ಯಾಪ್ಸುಲ್ ನರಕೋಶಗಳು, **P = 0.0022) (ಮಧ್ಯ). ಇಲಿ S1 (f) ಅಥವಾ ಆಂತರಿಕ ಕ್ಯಾಪ್ಸುಲ್ (g) (ಬಲ) ದ ವಿದ್ಯುತ್ ಪ್ರಚೋದನೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ EPSC ಅನ್ನು ತೋರಿಸುವ t-hCO ನರಕೋಶಗಳ ಶೇಕಡಾವಾರು. aCSF, ಕೃತಕ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ. h, 2P ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ (ಎಡ). t-hCO (ಮಧ್ಯ) ದಲ್ಲಿ GCaMP6 ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 µm. GCaMP6 ಗಳ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಸಮಯ ನಷ್ಟ (ಬಲ). i, ಸ್ವಾಭಾವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿದೀಪಕದ Z-ಸ್ಕೋರ್. j, ಮೀಸೆ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ವಿವರಣೆ. k, ಒಂದು ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ z-ಸ್ಕೋರ್ ಮಾಡಿದ 2P ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಪಥಗಳು, ಉದಾಹರಣೆ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸಮಯ ಶೂನ್ಯದಲ್ಲಿ (ಡ್ಯಾಶ್ಡ್ ಲೈನ್) ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. l, ಸಮಯ ಶೂನ್ಯದಲ್ಲಿ (ಡ್ಯಾಶ್ಡ್ ಲೈನ್) (ಕೆಂಪು) ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳ ಜನಸಂಖ್ಯೆ-ಸರಾಸರಿ z-ಸ್ಕೋರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು ಅಥವಾ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ರಚಿಸಲಾದ ಸಮಯಸ್ಟ್ಯಾಂಪ್‌ಗಳು (ಬೂದು). m. ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಗುರುತು ಮಾಡುವ ಪ್ರಯೋಗದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. n, ನೀಲಿ ಲೇಸರ್ ಪ್ರಚೋದನೆ ಅಥವಾ ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ t-hCO ಕೋಶದ ಉದಾಹರಣೆಯಿಂದ ಕಚ್ಚಾ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು. ಕೆಂಪು ಬಾಣಗಳು ಬೆಳಕಿನಿಂದ (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಅಥವಾ ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದಿಂದ (ಕೆಳಗೆ) ಉಂಟಾಗುವ ಮೊದಲ ಸ್ಪೈಕ್‌ಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಬೂದು ಛಾಯೆಯು ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದ ಅವಧಿಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. o, ಪೀಕ್ ಲೈಟ್ ತರಂಗರೂಪಗಳು ಮತ್ತು ಮೀಸೆ ವಿಚಲನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು. p, ಒಂದೇ ಪ್ರಯತ್ನದ ಸ್ಪೈಕ್‌ಗಳು, ಉದಾಹರಣೆಯ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೀಸೆಗಳ ವಿಚಲನದೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. 0 ಮೀಸೆ ವಿಚಲನವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಡ್ಯಾಶ್ಡ್ ಲೈನ್). q, ಎಲ್ಲಾ ಫೋಟೊಸೆನ್ಸಿಟಿವ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಜನಸಂಖ್ಯೆ-ಸರಾಸರಿ z-ಸ್ಕೋರ್ ಫೈರಿಂಗ್ ದರ, ಸಮಯ ಶೂನ್ಯದಲ್ಲಿ (ಡ್ಯಾಶ್ಡ್ ಲೈನ್) (ಕೆಂಪು) ಅಥವಾ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ರಚಿಸಲಾದ ಸಮಯಸ್ಟ್ಯಾಂಪ್‌ಗಳು (ಬೂದು) ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. r, ಮೀಸೆ ವಿಚಲನದಿಂದ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾದ ದ್ಯುತಿಸಂವೇದಕ ಘಟಕಗಳ ಅನುಪಾತ (n = 3 ಇಲಿಗಳು) (ಎಡ). ಗರಿಷ್ಠ z-ಸ್ಕೋರ್ ಲೇಟೆನ್ಸಿ (n = 3 ಇಲಿಗಳು; n = 5 (ತಿಳಿ ಹಸಿರು), n = 4 (ಕಡು ಹಸಿರು), ಮತ್ತು n = 4 (ಸಯಾನ್) ಮೀಸೆ ವಿಚಲನ ಮಾಡ್ಯುಲೇಷನ್ ಘಟಕಗಳು ಪ್ರತಿ ಇಲಿಗೆ) (ಬಲ). ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನ ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ನಂತರ ನಾವು t-hCO ಅನ್ನು ಇನ್ ವಿವೋ ಸಂವೇದನಾ ಪ್ರಚೋದಕಗಳಿಂದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ಕೇಳಿದೆವು. ನಾವು ಆನುವಂಶಿಕವಾಗಿ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಸೂಚಕಗಳಾದ GCaMP6 ಅನ್ನು S1 ಇಲಿಗಳಿಗೆ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ hCO ಅನ್ನು ಕಸಿ ಮಾಡಿದೆವು. 150 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ನಾವು ಫೈಬರ್ ಫೋಟೊಮೆಟ್ರಿ ಅಥವಾ ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4h ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾ, ಚಿತ್ರ 10a). t-hCO ಕೋಶಗಳು ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸ್ ಮಾಡಿದ ಲಯಬದ್ಧ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4i, ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾ, ಚಿತ್ರ 10b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ವೀಡಿಯೊ 1). ಗರಿಷ್ಠ t-hCO ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು, ನಾವು ಅರಿವಳಿಕೆ ಕಸಿ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ (ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾ, ಚಿತ್ರ 10c-f). ನಾವು MRI ಚಿತ್ರಗಳಿಂದ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ; ಹೀಗಾಗಿ, ಈ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಘಟಕಗಳು ಸಂಭಾವ್ಯ ಮಾನವ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯಾಲಜಿ ಮಾತ್ರ ಮೂಲದ ಜಾತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಅನುಮತಿಸುವುದಿಲ್ಲ. ನಾವು ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸ್ ಮಾಡಿದ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಸ್ಫೋಟಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾ, ಚಿತ್ರ 10d). ಸ್ಫೋಟಗಳು ಸುಮಾರು 460 ms ಕಾಲ ನಡೆದವು ಮತ್ತು ಸುಮಾರು 2 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಮೌನ ಅವಧಿಗಳಿಂದ ಬೇರ್ಪಟ್ಟವು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 10d, e). ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಘಟಕಗಳು ಪ್ರತಿ ಸ್ಫೋಟಕ್ಕೆ ಸರಾಸರಿ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳನ್ನು ಹಾರಿಸಿದವು, ಇದು ಪ್ರತಿ ಸ್ಫೋಟಕ್ಕೆ ನೋಂದಾಯಿತ ಘಟಕಗಳ ಸರಿಸುಮಾರು 73% ಆಗಿದೆ. ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಘಟಕಗಳ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದ್ದವು, ಮತ್ತು ಈ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳು ಅದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ದಾಖಲಾದ ಲಸಿಕೆ ಹಾಕದ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಘಟಕಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದವು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 10f). ಗುರುತಿಸಲಾದ ಮಾನವ-ಪಡೆದ ನರಕೋಶಗಳ ಸ್ಪೈಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ನಿರೂಪಿಸಲು, ನಾವು hCO ನೊಂದಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಅರಿವಳಿಕೆ ಇಲಿಗಳ ಮೇಲೆ ಬೆಳಕು-ಟ್ಯಾಗಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಬೆಳಕು-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಕ್ಯಾಟಯಾನ್ ಚಾನಲ್ ರೋಡಾಪ್ಸಿನ್ 2 (hChR2) ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರ ಮೂಲಕ t-hCO ನರಕೋಶಗಳು ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಚೋದಕಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಅಲ್ಪ-ಲೇಟೆನ್ಸಿ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ (10 ms ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ) (ಚಿತ್ರ 4m–o). t-hCO ನರಕೋಶಗಳು ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿದಂತೆಯೇ ಆವರ್ತನಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಸ್ಫೋಟಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದವು, ಜೊತೆಗೆ ಬೆಳಕಿನ ಗುರುತು ಇಲ್ಲದಿದ್ದಾಗ t-hCO ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾದ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳು (ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 10c-g). ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾದ hCO ನ ಅನುಗುಣವಾದ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ಸಂವೇದನಾ ಪ್ರಚೋದಕಗಳಿಂದ t-hCO ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು, ನಾವು ಇಲಿ ಮೀಸೆಗಳನ್ನು t-hCO ನಿಂದ ದೂರಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4j,m ಮತ್ತು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 10h,k). ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳ ಪ್ರಕಾರ 8,10, t-hCO ಕೋಶಗಳ ಉಪವಿಭಾಗವು ಮೀಸೆ ವಿಚಲನಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಡೇಟಾವನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸಮಯದ ಅಂಚೆಚೀಟಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದಾಗ ಇದನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 4k-q ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿತ ದತ್ತಾಂಶ, ಚಿತ್ರ 10h-q). ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಆಪ್ಟೋ-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಏಕ ಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 54% ವಿಸ್ಕರ್ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ದರವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಸುಮಾರು 650 ms (ಚಿತ್ರ 4r) ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತಲುಪಿತು. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ದತ್ತಾಂಶಗಳು t-hCO ಸೂಕ್ತವಾದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪರಿಸರ ಪ್ರಚೋದಕಗಳಿಂದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ನಂತರ ನಾವು t-hCO ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದೆವು. t-hCO ನರಕೋಶಗಳ ಆಕ್ಸಾನ್‌ಗಳು ಇಲಿಯ ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳಿಗೆ ಪ್ರಕ್ಷೇಪಿಸುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ಮೊದಲು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದೆವು. EYFP (hChR2-EYFP) ಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾದ hChR2 ಅನ್ನು ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಲೆಂಟಿವೈರಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಾವು hCO ಗೆ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸಿದೆವು. 110 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಶ್ರವಣೇಂದ್ರಿಯ, ಮೋಟಾರ್ ಮತ್ತು ಸೊಮಾಟೊಸೆನ್ಸರಿ ಕಾರ್ಟಿಸಸ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಐಪ್ಸಿಲ್ಯಾಟರಲ್ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಹಾಗೂ ಸ್ಟ್ರೈಟಮ್, ಹಿಪೊಕ್ಯಾಂಪಸ್ ಮತ್ತು ಥಾಲಮಸ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಸಬ್‌ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ನಾವು EYFP ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 5a). ಈ ಎಫೆರೆಂಟ್ ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಳು ಇಲಿ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಬಹುದೇ ಎಂದು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು, ನಾವು ತೀಕ್ಷ್ಣವಾದ ಮೆದುಳಿನ ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಇಲಿ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ hChR2-EYFP ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ t-hCO ಕೋಶಗಳನ್ನು ದೃಗ್ವೈಜ್ಞಾನಿಕವಾಗಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ. NBQX ನಿಂದ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾದ ಇಲಿ ಪಿರಮಿಡಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಶಾರ್ಟ್-ಲೇಟೆನ್ಸಿ EPSC ಗಳೊಂದಿಗೆ t-hCO ಆಕ್ಸಾನ್‌ಗಳ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ (ಚಿತ್ರ 5b-g). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಈ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಟೆಟ್ರೋಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ (TTX) ನಿರ್ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು 4-ಅಮಿನೊಪಿರಿಡಿನ್ (4-AP) ನಿಂದ ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು, ಇದು ಮೊನೊಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಸಂಪರ್ಕಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 5e).
a, ಆಕ್ಸಾನ್ ಟ್ರ್ಯಾಕಿಂಗ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ (ಎಡ). t-hCO EYFP ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (ಬಲ). ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 µm. A1, ಶ್ರವಣೇಂದ್ರಿಯ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್, ACC, ಮುಂಭಾಗದ ಸಿಂಗ್ಯುಲೇಟ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್, d. ಸ್ಟ್ರೈಟಮ್, ಡಾರ್ಸಲ್ ಸ್ಟ್ರೈಟಮ್, HPC, ಹಿಪೊಕ್ಯಾಂಪಸ್; ಡಯಾಫ್ರಾಮ್, ಲ್ಯಾಟರಲ್ ಸೆಪ್ಟಮ್, mPFC, ಮೀಡಿಯಲ್ ಪ್ರಿಫ್ರಂಟಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್, ಪಿರಿ, ಪಿರಿಫಾರ್ಮ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್, v. ಸ್ಟ್ರೈಟಮ್, ವೆಂಟ್ರಲ್ ಸ್ಟ್ರೈಟಮ್, VPM, ಥಾಲಮಸ್‌ನ ವೆಂಟ್ರೊಪೋಸ್ಟೋಮೀಡಿಯಲ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್, VTA, ವೆಂಟ್ರಲ್ ಟೆಗ್ಮೆಂಟಲ್ ಪ್ರದೇಶ. ಕೆಂಪು ಚೌಕಗಳು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ತೆಗೆದ ಮೆದುಳಿನ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. b, ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಪ್ರಯೋಗದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. c, d, ಮಾನವ (c) EYFP+ t-hCO ಅಥವಾ ಇಲಿ (d) EYFP- ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನೀಲಿ ಬೆಳಕು-ಪ್ರೇರಿತ ಫೋಟೊಕರೆಂಟ್ (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಮತ್ತು ವೋಲ್ಟೇಜ್ (ಕೆಳಗೆ) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಉದಾಹರಣೆಗಳು. e, f, TTX ಮತ್ತು 4-AR (ಹಸಿರು), TTX (ಬೂದು) ಅಥವಾ aCSF (ಕಪ್ಪು) (e), (ನೇರಳೆ) ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆ (ಕಪ್ಪು) ) ) NBQX (e) ನೊಂದಿಗೆ t-hCO ಆಕ್ಸಾನ್‌ಗಳ ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ ಇಲಿ ನರಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸ್ತುತ ಕುರುಹುಗಳು. g, ಇಲಿ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಸುಪ್ತತೆ (n = 16 ಕೋಶಗಳು); ಸಮತಲ ಬಾರ್‌ಗಳು ಸರಾಸರಿ ಸುಪ್ತತೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (7.13 ms) (ಎಡ). NBQX (n = 7 ಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001) (ಮಧ್ಯ) ದೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆಯೇ ದಾಖಲಾಗಿರುವ ಬೆಳಕು-ಪ್ರಚೋದಿತ EPSC ಗಳ ವೈಶಾಲ್ಯ. NBQX (n = 7 ಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001) (ಮಧ್ಯ) ದೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆಯೇ ದಾಖಲಾಗಿರುವ ಬೆಳಕು-ಪ್ರಚೋದಿತ EPSC ಗಳ ವೈಶಾಲ್ಯ. ಆಂಪ್ಲಿಟುಡಾ ವೈಜ್ವಾನ್ವಿಕ ಸ್ವೆಟಮ್ EPSC, ಜರೆಗಿಸ್ಟ್ರಿರೋವಾನ್ನಿಕ್ಸ್ ಅಥವಾ ಬೇಸ್ NBQX (n = 7 ಕ್ಲೈಟೊಕ್; ***P <0,0001) (v). NBQX (n = 7 ಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001) (ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ) ನೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆಯೇ ದಾಖಲಾಗಿರುವ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳ ವೈಶಾಲ್ಯ.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中 ಆಂಪ್ಲಿಟುಡಾ ವೈಜ್ವಾನ್ವಿಕ ಸ್ವೆಟಮ್ EPSC, ಜರೆಗಿಸ್ಟ್ರಿರೋವಾನ್ನಿಕ್ಸ್ ಅಥವಾ ಬೇಸ್ NBQX (n = 7 ಕ್ಲೈಟೊಕ್; ***P <0,0001) (v). NBQX (n = 7 ಕೋಶಗಳು; ***P < 0.0001) (ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ) ನೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆಯೇ ದಾಖಲಾಗಿರುವ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರೇರಿತ EPSC ಗಳ ವೈಶಾಲ್ಯ.ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುವ EPSC ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಇಲಿ ಕೋಶಗಳ ಶೇಕಡಾವಾರು (ಬಲ). h, ವರ್ತನೆಯ ಕಾರ್ಯದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. d0, ದಿನ 0. i. ತರಬೇತಿಯ ದಿನ 1 (ಎಡ) ಅಥವಾ ದಿನ 15 (ಬಲ) ದಲ್ಲಿ ಅನುಕರಣೀಯ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆ. ದಿನ 1 (ಎಡ) ಅಥವಾ ದಿನ 15 (ಬಲ ಮಧ್ಯ) (n = 150 ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು, n = 150 ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು; ***P < 0.0001) ರಂದು ನಡೆಸಿದ ಸರಾಸರಿ ಲಿಕ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ. ದಿನ 1 (ಎಡ) ಅಥವಾ ದಿನ 15 (ಬಲ ಮಧ್ಯ) (n = 150 ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು, n = 150 ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು; ***P < 0.0001) ರಂದು ನಡೆಸಿದ ಸರಾಸರಿ ಲಿಕ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ. ಸೆಪ್ಟೆಂಬರ್ 1 (ಸ್ಲೇವಾ) ಅಥವಾ ದಿನಾಂಕ 15 (ಇಂಗ್ಲಿಷ್ ದಿನಾಂಕ 15) (ಎನ್ = 150) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). ದಿನ 1 (ಎಡ) ಅಥವಾ ದಿನ 15 (ಮಧ್ಯ ಬಲ) ದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾದ ಸರಾಸರಿ ಲಿಕ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ (n = 150 ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು, n = 150 ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.001 ಸೆಪ್ಟೆಂಬರ್ 1 (ಸ್ಲೇವಾ) ಅಥವಾ ದಿನಾಂಕ 15 (ಇಂಗ್ಲಿಷ್ ದಿನಾಂಕ 15) (ಎನ್ = 150) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). ದಿನ 1 (ಎಡ) ಅಥವಾ ದಿನ 15 (ಮಧ್ಯ ಬಲ) ದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾದ ಸರಾಸರಿ ಲಿಕ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ (n = 150 ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು, n = 150 ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳು; ***P < 0.0001).ದಿನ 1 (ಮಧ್ಯ ಎಡ) ಅಥವಾ ದಿನ 15 (ಬಲ) ರಂದು ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ ಸಂಚಿತ ಲಿಕ್ಸ್. NS, ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿಲ್ಲ. j,k, ದಿನ 1 ಅಥವಾ 15 ರಂದು hChR2-EYFP (j) ಅಥವಾ ನಿಯಂತ್ರಣ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ (k) ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ t-hCO ನೊಂದಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ವರ್ತನೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು (hChR2-EYFP: n = 9 ಇಲಿಗಳು, ** P = 0.0049; ನಿಯಂತ್ರಣ: n = 9, P = 0.1497). l, ಆದ್ಯತೆಯ ಸ್ಕೋರ್‌ನ ವಿಕಸನ (n = 9 hChR2, n = 9 ನಿಯಂತ್ರಣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, ಆದ್ಯತೆಯ ಸ್ಕೋರ್‌ನ ವಿಕಸನ (n = 9 hChR2, n = 9 ನಿಯಂತ್ರಣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). ಎಲ್. l, ಆದ್ಯತೆಯ ಸ್ಕೋರ್‌ನ ವಿಕಸನ (n = 9 hChR2, n = 9 ನಿಯಂತ್ರಣಗಳು; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 ಎಲ್. l, ಆದ್ಯತೆಯ ಅಂಕಗಳ ವಿಕಸನ (n = 9 hChR2, n = 9 ನಿಯಂತ್ರಣಗಳು; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1 ನಲ್ಲಿ t-hCO ನ ಆಪ್ಟೊಜೆನೆಟಿಕ್ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ FOS ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. FOS ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಚಿತ್ರಗಳು (ಎಡ), ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (ಪ್ರತಿ ಗುಂಪಿಗೆ n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 ಮತ್ತು ***P < 0.001) (ಬಲ) ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. FOS ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಚಿತ್ರಗಳು (ಎಡ), ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣ (ಪ್ರತಿ ಗುಂಪಿಗೆ n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 ಮತ್ತು ***P < 0.001) (ಬಲ) ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. Показаны изображения Кспресии FOS (слева) ಮತ್ತು ಕೊಲಿಚೆಸ್ಟ್ವೆನ್ನೊಗೊ ಒಪ್ರೆಡೆಲೆನಿಯ (n = 3 ನಲ್ಲಿ ಗ್ರಪ್ಪು; * P <0,005, **1 P <0,005, **1 (ಪ್ರವಾಹ). FOS ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (ಎಡ) ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದ (n = 3 ಪ್ರತಿ ಗುಂಪಿಗೆ; *P<0.05, **P<0.01, ಮತ್ತು ***P<0.001) ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಬಲ).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右 Показаны изображения Кспресии FOS (слева) ಮತ್ತು ಕೊಲಿಚೆಸ್ಟ್ವೆನ್ನೊಗೊ ಒಪ್ರೆಡೆಲೆನಿಯ (n = 3 ನಲ್ಲಿ ಗ್ರಪ್ಪು; * P <0,005, **1 P <0,005, **1 (ಪ್ರವಾಹ). FOS ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (ಎಡ) ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣದ (n = 3 ಪ್ರತಿ ಗುಂಪಿಗೆ; *P<0.05, **P<0.01, ಮತ್ತು ***P<0.001) ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಬಲ).ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 µm. ಡೇಟಾವನ್ನು BLA, ಬಾಸೊಲೇಟರಲ್ ಟಾನ್ಸಿಲ್, MDT, ಡಾರ್ಸೋಮೆಡಿಯಲ್ ಥಾಲಾಮಿಕ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್, PAG, ಪೆರಿಯಾಕ್ವೆಡಕ್ಟಲ್ ಗ್ರೇಗಳ ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ದೋಷವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಅಂತಿಮವಾಗಿ, t-hCO ಇಲಿ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ನಾವು ಕೇಳಿದೆವು. ಇದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು hChR2-EYFP-ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ hCO ಅನ್ನು S1 ಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದೆವು, ಮತ್ತು 90 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಬೆಳಕಿನ ವಿತರಣೆಗಾಗಿ ನಾವು t-hCO ಗೆ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಫೈಬರ್‌ಗಳನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿದೆವು. ನಂತರ ನಾವು ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಆಪರೇಂಟ್ ಕಂಡೀಷನಿಂಗ್ ಪ್ಯಾರಡೈಮ್ (ಚಿತ್ರ 5h) ನೊಂದಿಗೆ ತರಬೇತಿ ನೀಡಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ವರ್ತನೆಯ ಪರೀಕ್ಷಾ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ 5 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ನೀಲಿ (473 nm) ಮತ್ತು ಕೆಂಪು (635 nm) ಲೇಸರ್ ಪ್ರಚೋದಕಗಳನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನೆಕ್ಕಿದರೆ ಆದರೆ ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನೆಕ್ಕದಿದ್ದರೆ ಪ್ರಾಣಿಗಳು ನೀರಿನ ಬಹುಮಾನವನ್ನು ಪಡೆದವು. ತರಬೇತಿಯ ಮೊದಲ ದಿನದಂದು, ಪ್ರಾಣಿಗಳು ನೀಲಿ ಅಥವಾ ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರಚೋದಿಸಿದಾಗ ನೆಕ್ಕುವಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ತೋರಿಸಲಿಲ್ಲ. ಆದಾಗ್ಯೂ, 15 ನೇ ದಿನದಂದು, hCO ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ hChR2-EYFP ಯೊಂದಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಪ್ರಾಣಿಗಳು ಕೆಂಪು ಬೆಳಕಿನ ಪ್ರಚೋದನೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ನೀಲಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರಚೋದಿಸಿದಾಗ ಹೆಚ್ಚು ಸಕ್ರಿಯ ನೆಕ್ಕುವಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು. ನಿಯಂತ್ರಣ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ hCO ನೊಂದಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ನೆಕ್ಕುವ ನಡವಳಿಕೆಯಲ್ಲಿನ ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (ಕಲಿಕೆಯ ಯಶಸ್ಸಿನ ಪ್ರಮಾಣ: hChR2 89%, EYFP 0%, ಚಿತ್ರ 5i-1 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ವೀಡಿಯೊ 2). ಈ ಡೇಟಾವು t-hCO ಜೀವಕೋಶಗಳು ಪ್ರತಿಫಲ-ಹುಡುಕುವ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಇಲಿ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ನಡವಳಿಕೆಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವ ಇಲಿ t-hCO ನರ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳು ಭಾಗಿಯಾಗಿರಬಹುದು ಎಂಬುದನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲು, ನಾವು 90 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ತರಬೇತಿ ಪಡೆದ ಪ್ರಾಣಿಗಳು ಮತ್ತು ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಿದ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಆಪ್ಟೊಜೆನೆಟಿಕ್ ಆಗಿ t-hCO ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿಯು ಮಧ್ಯದ ಪ್ರಿಫ್ರಂಟಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್, ಮಧ್ಯದ ಥಾಲಮಸ್ ಮತ್ತು ಪೆರಿಯಾಕ್ವೆಡಕ್ಟಲ್ ಗ್ರೇ ಮ್ಯಾಟರ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಪ್ರೇರಿತ ನಡವಳಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಹಲವಾರು ಮೆದುಳಿನ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಚಟುವಟಿಕೆ-ಅವಲಂಬಿತ FOS ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಇದನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಅಕ್ಕಿ. 5 ಮೀ). ಒಟ್ಟಿಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಡೇಟಾವು t-hCO ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಇಲಿ ನರಕೋಶದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ನರಗಳ ಅಂಗಕಗಳು ಮಾನವ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ರೋಗವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಭರವಸೆಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಇನ್ ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಪರ್ಕಗಳ ಕೊರತೆಯಿಂದಾಗಿ ಅವು ಸೀಮಿತವಾಗಿವೆ. ನಾವು hCO ಅನ್ನು ರೋಗನಿರೋಧಕ ಶಕ್ತಿ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಇಲಿಗಳ S1 ಗೆ ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸುವ ಒಂದು ಹೊಸ ವೇದಿಕೆಯನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. t-hCO ವಿಟ್ರೊ28 ನಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸದ ಪ್ರಬುದ್ಧ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು t-hCO ದಂಶಕ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಅಂಗರಚನಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ. t-hCO ಅನ್ನು ದಂಶಕ ನರ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಜಿಸುವುದರಿಂದ ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ನಡವಳಿಕೆಯ ನಡುವೆ ಸಂಪರ್ಕವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು, t-hCO ನರಕೋಶಗಳು ವರ್ತನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಇಲಿ ನರಕೋಶ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ನಾವು ವಿವರಿಸುವ ವೇದಿಕೆಯು ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ದಂಶಕಗಳ ಮಿದುಳಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡುವ ಹಿಂದಿನ ಸಂಶೋಧನೆಗಿಂತ ಹಲವಾರು ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ನಾವು hCO ಅನ್ನು ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಇಲಿಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಶೀಲ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಅಂಗರಚನಾ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಏಕೀಕರಣವನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಎರಡನೆಯದಾಗಿ, t-hCO MRI ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆಯು ಜೀವಂತ ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಸಿ ಸ್ಥಾನ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು, ಇದು ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಬಹು-ಪ್ರಾಣಿ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲು ಮತ್ತು ಹಲವಾರು hiPS ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ನಾವು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಏಕ ಕೋಶ ಅಮಾನತುಗಳ ಬದಲಿಗೆ ಅಖಂಡ ಆರ್ಗನಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕಸಿ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ ಕಡಿಮೆ ವಿನಾಶಕಾರಿಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಇಲಿ ಮಿದುಳಿನಲ್ಲಿ ಮಾನವ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ನರಕೋಶಗಳ ಏಕೀಕರಣ ಮತ್ತು ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಬಹುದು.
ಈ ವೇದಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಗತಿಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರವೂ, ತಾತ್ಕಾಲಿಕ, ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಮತ್ತು ಅಡ್ಡ-ಜಾತಿ ನಿರ್ಬಂಧಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿಷ್ಠೆಯೊಂದಿಗೆ ಮಾನವ ನರ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಒಪ್ಪಿಕೊಳ್ಳುತ್ತೇವೆ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, t-hCO ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಲಯಬದ್ಧ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೋಲುವ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆಯೇ ಅಥವಾ t-hCO ನಲ್ಲಿ ಇರುವ ನಿಗ್ರಹಿಸುವ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಿಂದಾಗಿಯೇ ಎಂಬುದು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ. ಅದೇ ರೀತಿ, t-hCO ನಲ್ಲಿ ಲ್ಯಾಮಿನೇಶನ್ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯು ಸರಪಳಿ ಸಂಪರ್ಕದ ಮೇಲೆ ಎಷ್ಟರ ಮಟ್ಟಿಗೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ. ಭವಿಷ್ಯದ ಕೆಲಸವು ಮಾನವ ಮೈಕ್ರೋಗ್ಲಿಯಾ, ಮಾನವ ಎಂಡೋಥೀಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಅಸೆಂಬ್ಲಿ 6 ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಬಳಸಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ GABAergic ಇಂಟರ್ನ್‌ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಅನುಪಾತಗಳಂತಹ ಇತರ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವುದರ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುತ್ತದೆ, ಜೊತೆಗೆ ಬದಲಾದ t-hCO ನಲ್ಲಿ ನರ ಏಕೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಹೇಗೆ ಸಂಭವಿಸಬಹುದು ಎಂಬುದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ರೋಗಿಗಳಿಂದ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಲೇಖನ, ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಮತ್ತು ವರ್ತನೆಯ ಮಟ್ಟಗಳು.
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಇನ್ ವಿವೋ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ ಇನ್ ವಿಟ್ರೋ ಮಾನವ ಮೆದುಳಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ರೋಗ ಸಂಶೋಧನೆಗೆ ಪೂರಕವಾಗಬಲ್ಲ ಪ್ರಬಲ ಸಂಪನ್ಮೂಲವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ ನಮಗೆ ತಪ್ಪಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗದ ರೋಗಿಯಿಂದ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಕಾದಂಬರಿ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್-ಲೆವೆಲ್ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲು ಮತ್ತು ಹೊಸ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ನಾವು HiPS ಕೋಶಗಳಿಂದ hCO2.5 ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಫೀಡರ್ ಪದರಗಳಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಿದ hiPS ಕೋಶಗಳಿಂದ hCO ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲು, ಡಿಸ್ಪೇಸ್ (0.35 mg/mL) ಬಳಸಿ ಕಲ್ಚರ್ ಡಿಶ್‌ಗಳಿಂದ hiPS ಕೋಶಗಳ ಅಖಂಡ ವಸಾಹತುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು hiPS ಕೋಶ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಭಕ್ಷ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅಲ್ಟ್ರಾ-ಲೋ ಅಟ್ಯಾಚ್‌ಮೆಂಟ್ ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಕಲ್ಚರ್‌ಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. (ಕಾರ್ನಿಂಗ್) ಎರಡು SMAD ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಡಾರ್ಸೊಮಾರ್ಫಿನ್ (5 μM; P5499, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಮತ್ತು SB-431542 (10 μM; 1614, ಟೋಕ್ರಿಸ್) ಮತ್ತು ROCK ಪ್ರತಿರೋಧಕ Y-27632 (10 μM; S1049, ಸೆಲ್ಲೆಕ್‌ಕೆಮ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ. ಮೊದಲ 5 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ, hiPS ಕೋಶ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಪ್ರತಿದಿನ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡಾರ್ಸೊಮಾರ್ಫಿನ್ ಮತ್ತು SB-431542 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಆರನೇ ದಿನ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ನರ ಗೋಳಗಳನ್ನು ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-ಎ (10888, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ವಿಟಮಿನ್ ಎ ಇಲ್ಲದೆ ಬಿ-27 ಪೂರಕ (12587, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಹೊಂದಿರುವ ನರ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 24 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಂಶ (EGF; 20 ng ml−1; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಮತ್ತು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಂಶ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. 25 ನೇ ದಿನದಿಂದ 42 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಪಡೆದ ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಅಂಶ (BDNF; 20 ng ml−1, ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಮತ್ತು ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿನ್ 3 (NT3; 20 ng ml−1; ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ದಿನವೂ ಮಧ್ಯಮ ಬದಲಾವಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ. ಆರನೇ ದಿನ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ನರ ಗೋಳಗಳನ್ನು ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-ಎ (10888, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ವಿಟಮಿನ್ ಎ ಇಲ್ಲದೆ ಬಿ-27 ಪೂರಕ (12587, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಹೊಂದಿರುವ ನರ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 24 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಂಶ (EGF; 20 ng ml−1; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಮತ್ತು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಂಶ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. 25 ನೇ ದಿನದಿಂದ 42 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಪಡೆದ ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಅಂಶ (BDNF; 20 ng ml−1, ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಮತ್ತು ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿನ್ 3 (NT3; 20 ng ml−1; ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ದಿನವೂ ಮಧ್ಯಮ ಬದಲಾವಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ.ಅಮಾನತುಗೊಂಡ ಆರನೇ ದಿನದಂದು, ನರಗಳ ಗೋಳಾಕಾರದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-ಎ (10888, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ವಿಟಮಿನ್ ಎ ಇಲ್ಲದೆ ಬಿ-27 ಪೂರಕ (12587, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ನರ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮಿಷನ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಮತ್ತು ಡೋಪೋಲ್ನೆನಿ ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟೋರಮ್ ರೋಸ್ಟಾ (EGF; 20 ng/ml; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಮತ್ತು ಫೆಬ್ರವರಿ 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) 24-ಗಂಟೆಯವರೆಗೆ. ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಮತ್ತು ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಗ್ರೋತ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ (EGF; 20 ng/ml; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಮತ್ತು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಗ್ರೋತ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ 24 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ.25 ರಿಂದ 42 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ, ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಪಡೆದ ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಅಂಶ (BDNF; 20 ng ml-1, ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಮತ್ತು ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿನ್ 3 (NT3; 20 ng ml-1, ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಅನ್ನು ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು, ಪ್ರತಿ ದಿನವೂ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-A（10888，ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್补充剂（12587,ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್）、ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್（1:100,ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳು）并辅以表皮生长因子（EGF ml-1；R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml -1在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-ಎ （10888 ， ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್ 紉的 b-27 补充剂 （12587 , ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್） ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ （1: 100 , ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನೋಜಿಸ್ 100 , ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್ 表皮 生长 因子 （（20 ng ml-1 ； r & d ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng R&D ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳು 直至第24天. 6-ಇಂದು ದಿನ ಸುಸ್ಪೆನ್ಸಿಯ ನೈರೋಸ್ಫರ್ಸ್ ಬೈಲಿ ಪೆರೆವೆಡೆನ್ ದ ಡೋಬಾವ್ಕು, ಸೋಡರ್‌ಝಾಶುಯು ನೈರೊಬಾಸಲ್-ಎ (10888, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನೋಲಾಜೀಸ್), В-27 без витамина А (12587, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಪೆನಿಷಿಲಿನ್- ನೈಟ್ರಲಿಸೋವಾನ್ ಸ್ಟ್ರಪ್‌ಲಾಗ್ಸ್ (ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಡೋಬಾವ್ಲೆನಿಯಮ್ ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ನೊಗೊ ಫ್ಯಾಕ್ಟೋರಾ ರೋಸ್ಟಾ (EGF; 20 ng ml-1; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಮತ್ತು ಫ್ಯಾಕ್ಟೋರಾ ರೋಸ್ಟಾ ಫೀಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟೋವ್ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; 6 ನೇ ದಿನದಂದು, ನ್ಯೂರೋಸ್ಪಿಯರ್ ಅಮಾನತುಗಳನ್ನು ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-ಎ (10888, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ವಿಟಮಿನ್ ಎ ಇಲ್ಲದ ಬಿ-27 ಪೂರಕ (12587, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್), ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್-ನ್ಯೂಟ್ರಲೈಸ್ಡ್ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (1:100, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಹೊಂದಿರುವ ಪೂರಕಕ್ಕೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಇವುಗಳನ್ನು ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಗ್ರೋತ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ (EGF; 20 ng ml-1; R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಮತ್ತು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಗ್ರೋತ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು; ಆರ್&ಡಿ ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) 24-2018 ರಂದು. (ಆರ್&ಡಿ ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) 24 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ.25 ರಿಂದ 42 ನೇ ದಿನದವರೆಗೆ, ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಪಡೆದ ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಅಂಶ (BDNF; 20 ng ml-1, ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಮತ್ತು ನ್ಯೂರೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಅಂಶ 3 (NT3; 20 ng ml-1, ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಅನ್ನು ಪ್ರತಿ ದಿನವೂ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮಧ್ಯಮ ಬದಲಾವಣೆ ಒಮ್ಮೆ.43 ನೇ ದಿನದಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ, hCO ಅನ್ನು ಪೂರಕವಲ್ಲದ ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-A ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (NM; 1088022, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಪ್ರತಿ 4–6 ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಮಧ್ಯಮ ಬದಲಾವಣೆಯೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು. ಫೀಡರ್‌ರಹಿತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಿದ hiPS ಕೋಶಗಳಿಂದ hCO ಅನ್ನು ಪಡೆಯಲು, hiPS ಕೋಶಗಳನ್ನು 37°C ನಲ್ಲಿ 7 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಅಕ್ಯುಟೇಸ್ (AT-104, ಇನ್ನೋವೇಟ್ ಸೆಲ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ಏಕ ಕೋಶಗಳಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ROCK ಪ್ರತಿರೋಧಕ Y-27632 (10 μM; S1049, ಸೆಲ್ಲೆಕ್‌ಕೆಮ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ ಎಸೆನ್ಷಿಯಲ್ 8 ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 3 × 106 ಏಕ ಕೋಶಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ AggreWell 800 ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (34815, STEMCELL ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಲೇಪಿಸಲಾಯಿತು. 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಬಾವಿಗಳಲ್ಲಿನ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಡಾರ್ಸೊಮಾರ್ಫಿನ್ (2.5 μM; P5499, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಮತ್ತು SB-431542 (10 μM; 1614) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ ಎಸೆನ್ಷಿಯಲ್ 6 ಮಾಧ್ಯಮ (A1516401, ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ಮೇಲಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಳಕ್ಕೆ ಪೈಪ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. , ಟೋಕ್ರಿಡಾ). 2 ರಿಂದ 6 ನೇ ದಿನಗಳಿಂದ, ಎಸೆನ್ಷಿಯಲ್ 6 ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಪ್ರತಿದಿನ ಡಾರ್ಸೊಮಾರ್ಫಿನ್ ಮತ್ತು ಪೂರಕ SB-431542 ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಆರನೇ ದಿನದಿಂದ, ನರಗೋಳದ ಅಮಾನತುಗಳನ್ನು ನರಗೋಳ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು.
ಸ್ಟ್ಯಾನ್‌ಫೋರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ ಪ್ರಾಣಿ ಆರೈಕೆ ಆಡಳಿತ ಸಮಿತಿ (APLAC) ಅನುಮೋದಿಸಿದ ಪ್ರಾಣಿ ಆರೈಕೆ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಗರ್ಭಿಣಿ ಯುಥೈಮಿಕ್ RNU (rnu/+) ಇಲಿಗಳನ್ನು ಖರೀದಿಸಲಾಯಿತು ಅಥವಾ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. ಆಹಾರ ಮತ್ತು ನೀರಿನ ಉಚಿತ ಬಳಕೆಯೊಂದಿಗೆ 12-ಗಂಟೆಗಳ ಬೆಳಕು-ಕತ್ತಲೆಯ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮೂರರಿಂದ ಏಳು ದಿನಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಬೆತ್ತಲೆ (FOXN1–/–) ಇಲಿ ಮರಿಗಳನ್ನು ಕೊಲ್ಲುವ ಮೊದಲು ಅಪಕ್ವವಾದ ಮೀಸೆಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು. ನಾಯಿಮರಿಗಳನ್ನು (ಗಂಡು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು) 2-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಟೀರಿಯೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಚೌಕಟ್ಟಿನ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. ಡ್ಯೂರಾ ಮೇಟರ್‌ನ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಾಗ S1 ಗಿಂತ ಸರಿಸುಮಾರು 2-3 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ತಲೆಬುರುಡೆಯ ಟ್ರೆಪನೇಷನ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಡ್ಯೂರಾವನ್ನು ಚುಚ್ಚಲು ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿಯ ಹೊರಗೆ 30-G ಸೂಜಿಯನ್ನು (ಸರಿಸುಮಾರು 0.3 ಮಿಮೀ) ಬಳಸಿ. ನಂತರ HCO ಅನ್ನು ತೆಳುವಾದ 3×3 ಸೆಂ.ಮೀ ಪ್ಯಾರಾಫಿಲ್ಮ್‌ಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಿ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ. 23 G, 45° ಸೂಜಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಹ್ಯಾಮಿಲ್ಟನ್ ಸಿರಿಂಜ್ ಬಳಸಿ, ಸೂಜಿಯ ಅತ್ಯಂತ ದೂರದ ತುದಿಗೆ hCO ಅನ್ನು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಎಳೆಯಿರಿ. ನಂತರ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ಸಾಧನಕ್ಕೆ ಸಂಪರ್ಕಗೊಂಡಿರುವ ಸಿರಿಂಜ್ ಪಂಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿರಿಂಜ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿ. ನಂತರ ಸೂಜಿಯ ತುದಿಯನ್ನು ಡ್ಯೂರಾದಲ್ಲಿ (z = 0 mm) ಹಿಂದೆ ಮಾಡಿದ 0.3 mm ಅಗಲದ ಪಂಕ್ಚರ್ ರಂಧ್ರದ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಸೂಜಿ ಡ್ಯೂರಾ ಮೇಟರ್ A ನಡುವೆ ಇರುವವರೆಗೆ ಸಿರಿಂಜ್ ಅನ್ನು 1–2 mm (z = ಸರಿಸುಮಾರು –1.5 mm) ಕಿರಿದಾಗಿಸಿ. ದಟ್ಟವಾದ ಸೀಲ್ ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ನಂತರ ಸಿರಿಂಜ್ ಅನ್ನು ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮೇಲ್ಮೈಯ ಮಧ್ಯಭಾಗಕ್ಕೆ z = -0.5 mm ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ ಮತ್ತು hCO ಅನ್ನು ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 1-2 µl ದರದಲ್ಲಿ ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಿ. hCO ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ಸೂಜಿಯನ್ನು ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 0.2-0.5 mm ದರದಲ್ಲಿ ಹಿಂತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ, ಚರ್ಮವನ್ನು ಹೊಲಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಾಯಿಮರಿಯನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಸಂಪೂರ್ಣ ಚೇತರಿಕೆಯಾಗುವವರೆಗೆ ಬೆಚ್ಚಗಿನ ತಾಪನ ಪ್ಯಾಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೆಲವು ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ದ್ವಿಪಕ್ಷೀಯವಾಗಿ ಕಸಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸ್ಟ್ಯಾನ್‌ಫೋರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ APLAC-ಅನುಮೋದಿತ ಪ್ರಾಣಿ ಆರೈಕೆ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 60 ದಿನಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ದಿನಗಳ ನಂತರ ಇಲಿಗಳನ್ನು 5% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಅರಿವಳಿಕೆಯಿಂದ ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಚಿತ್ರಣದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 1-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ದೃಶ್ಯೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ, ಇಂಟರ್ನ್ಯಾಷನಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಕಂಪನಿ (IECO) ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಡ್ರೈವ್‌ನೊಂದಿಗೆ 7 ಟೆಸ್ಲಾ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ರಕ್ಷಿತ ಸಮತಲ ಬೋರ್‌ಹೋಲ್ ಸ್ಕ್ಯಾನರ್ ಬ್ರೂಕರ್ (ಬ್ರೂಕರ್ ಕಾರ್ಪ್.), 120 ಮಿಮೀ (600 mT/m, 1000 T/m/s) ಆಂತರಿಕ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರಕ್ಷಿತ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನ್ನು AVANCE ಬಳಸಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. III, ಎಂಟು-ಚಾನೆಲ್ ಮಲ್ಟಿ-ಕಾಯಿಲ್ RF ಮತ್ತು ಮಲ್ಟಿ-ಕೋರ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಗಳು, ಮತ್ತು ಅದರ ಜೊತೆಗಿನ ಪ್ಯಾರಾವಿಷನ್ 6.0.1 ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್. 86 ಮಿಮೀ ಆಂತರಿಕ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ಡಿಕೌಪಲ್ ಮಾಡಿದ ವಾಲ್ಯೂಮೆಟ್ರಿಕ್ RF ಕಾಯಿಲ್ ಮತ್ತು ಸ್ವೀಕರಿಸಲು ಮಾತ್ರ ನಾಲ್ಕು-ಚಾನೆಲ್ ಕ್ರಯೋ-ಕೂಲ್ಡ್ RF ಕಾಯಿಲ್ ಬಳಸಿ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 16 ಸ್ಲೈಸ್ ಕ್ಯಾಪ್ಚರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಅಕ್ಷೀಯ 2D ಟರ್ಬೊ-ಅಪರೂಪ (ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಸಮಯ = 2500 ms, ಪ್ರತಿಧ್ವನಿ ಸಮಯ = 33 ms, 2 ಸರಾಸರಿಗಳು), ಸ್ಲೈಸ್ ದಪ್ಪ 0.6–0.8 mm, 256 × 256 ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. 2 ಸೆಂ.ಮೀ ಆಂತರಿಕ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಕ್ವಾಡ್ರೇಚರ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸಿವರ್ ವಾಲ್ಯೂಮೆಟ್ರಿಕ್ RF ಕಾಯಿಲ್ ಬಳಸಿ ಸಿಗ್ನಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ವೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (ರಾಪಿಡ್ MR ಇಂಟರ್ನ್ಯಾಷನಲ್, LLC). ಅಂತಿಮವಾಗಿ, 3D ರೆಂಡರಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಅಂತರ್ನಿರ್ಮಿತ ಇಮಾರಿಸ್ (ಬಿಟ್‌ಪ್ಲೇನ್) ಮೇಲ್ಮೈ ಅಂದಾಜು ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಗೋಳಾರ್ಧದಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ T2-ತೂಕದ MRI ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ಪ್ರದೇಶಗಳು ರೂಪುಗೊಂಡವು ಎಂದು ಯಶಸ್ವಿ ಕಸಿ ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ ಗೋಳಾರ್ಧದಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ T2-ತೂಕದ MRI ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸದ ಕಸಿ ಎಂದು ಕಸಿ ನಿರಾಕರಣೆಯನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಬ್‌ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ t-hCO ಅನ್ನು ನಂತರದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಹೊರಗಿಡಲಾಗಿದೆ.
ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ hCO ನಲ್ಲಿ GCaMP6 ಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲು, hiPS ಕೋಶಗಳನ್ನು pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ನಿಂದ ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ರತಿಜೀವಕಗಳ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು EDTA ಯೊಂದಿಗೆ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪಾಲಿಬ್ರೀನ್ (5 μg/ml) ಮತ್ತು 15 μl ವೈರಸ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 300,000 ಕೋಶಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 1 ಮಿಲಿ ಎಸೆನ್ಷಿಯಲ್ 8 ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 60 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸಸ್ಪೆನ್ಷನ್‌ನಲ್ಲಿ ಇಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 50,000 ಕೋಶಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬೀಜಗಳನ್ನು ಹಾಕಲಾಯಿತು. ಸಂಗಮದ ನಂತರ, ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 5-10 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಅಥವಾ ಸ್ಥಿರ ವಸಾಹತುಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವವರೆಗೆ 5-10 μg ml-1 ಪುರೋಮೈಸಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. ತೀವ್ರವಾದ hCO ಸೋಂಕನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ 5 ಕೆಲವು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, 30-45 ದಿನ hCO ಅನ್ನು 100 µl ನರ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 1.5 ಮಿಲಿ ಎಪ್ಪೆಂಡಾರ್ಫ್ ಮೈಕ್ರೋಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸರಿಸುಮಾರು 90 µl ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ, 3-6 µl ಹೈ ಟೈಟರ್ ಲೆಂಟಿವೈರಸ್ (0.5 x 108 ರಿಂದ 1.2 x 109 ವರೆಗೆ) ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು hCO ಅನ್ನು 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ ಪ್ರತಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ 90–100 µl ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳನ್ನು ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್‌ಗೆ ಹಿಂತಿರುಗಿಸಿ. ಮರುದಿನ, ಕಡಿಮೆ ಲಗತ್ತು ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ hCO ಅನ್ನು ತಾಜಾ ನರ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ. 7 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ದೃಶ್ಯೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿನ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನಕ್ಕಾಗಿ hCO ಅನ್ನು 24-ಬಾವಿ ಗಾಜಿನ ಕೆಳಭಾಗದ ಫಲಕಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ಮತ್ತು pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ಅನ್ನು ವೆಕ್ಟರ್‌ಬಿಲ್ಡರ್ ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. ಲೆಂಟಿವೈರಸ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಹೋಸ್ಟ್ ಜೀನೋಮ್‌ಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಸೋಂಕಿತ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳಲ್ಲಿ ವರದಿಗಾರ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ರೇಬೀಸ್ ಫಾಲೋ-ಅಪ್‌ಗಾಗಿ, 30-45 ನೇ ದಿನದಂದು hCO ಅನ್ನು ರೇಬೀಸ್-ΔG-eGFP ಮತ್ತು AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ #67528, ಆಡ್‌ಜೀನ್) ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಸೋಂಕಿತಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, 3 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಚೆನ್ನಾಗಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು S1 ನಲ್ಲಿ ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಕಸಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 7-14 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು.
ಇಮ್ಯುನೊಸೈಟೊಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿಗಾಗಿ, ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕಾರ್ಡಿಯಲ್ ಆಗಿ ಪಿಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ 4% ಪ್ಯಾರಾಫಾರ್ಮಲ್ಡಿಹೈಡ್ (ಪಿಬಿಎಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಪಿಎಫ್‌ಎ; ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಸೈನ್ಸಸ್). ಮಿದುಳುಗಳನ್ನು 4% ಪಿಎಫ್‌ಎಯಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಥವಾ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಪಿಬಿಎಸ್‌ನಲ್ಲಿ 30% ಸುಕ್ರೋಸ್‌ನಲ್ಲಿ 48-72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕ್ರಯೋಪ್ರಿಸರ್ವ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 1:1, 30% ಸುಕ್ರೋಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಂಬೆಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು: ಒಸಿಟಿ (ಟಿಶ್ಯೂ-ಟೆಕ್ ಒಸಿಟಿ ಕಾಂಪೌಂಡ್ 4583, ಸಕುರಾ ಫಿನೆಟೆಕ್) ಮತ್ತು ಕ್ರಯೋಸ್ಟಾಟ್ (ಲೈಕಾ) ಬಳಸಿ 30 µm ನಲ್ಲಿ ಕರೋನಲ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ದಪ್ಪ ವಿಭಾಗಗಳ ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿಗಾಗಿ, ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಪಿಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಮೆದುಳನ್ನು ವಿಭಜಿತಗೊಳಿಸಿ 300–400 µm ನಲ್ಲಿ ಕರೋನಲ್ ಆಗಿ ವಿಭಾಗಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4% ಪಿಎಫ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಕ್ರಯೋಸೆಕ್ಷನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ದಪ್ಪ ಭಾಗಗಳನ್ನು PBS ನಿಂದ ತೊಳೆದು, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಯಿತು (10% ಸಾಮಾನ್ಯ ಡಾಂಕಿ ಸೀರಮ್ (NDS) ಮತ್ತು 0.3% ಟ್ರೈಟಾನ್ X-100 ಅನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು) ಮತ್ತು 4°C ನಲ್ಲಿ ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಯಿತು. – ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಷನ್ ಕ್ರಯೋಸೆಕ್ಷನ್‌ಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ದಪ್ಪ ಭಾಗಗಳನ್ನು 5 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಬಳಸಿದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು: ನ್ಯೂಎನ್ ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:500; ab104224, abcam) CTIP2 ವಿರೋಧಿ (ರಾಟ್, 1:300; ab18465, abcam), ಜಿಎಫ್‌ಎಪಿ ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:1,000; Z0334, ಡಕೋ), ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ವಿರೋಧಿ (ಕೋಳಿ, 1:1,000; GTX13970, ಜೀನ್‌ಟೆಕ್ಸ್), ಎಚ್‌ಎನ್‌ಎ ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:200; ab191181, abcam), ನ್ಯೂಎನ್ ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:500; ABN78, ಮಿಲಿಪೋರ್), ಪಿಡಿಜಿಎಫ್‌ಆರ್‌ಎ ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:200; sc-338, ಸಾಂಟಾ ಕ್ರೂಜ್), ಪಿಪಿಪಿ1ಆರ್17 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:200; HPA047819, ಅಟ್ಲಾಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು), ಆರ್‌ಇಸಿಎ-1 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:100; 20357-1-AP, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಟೆಕ್), SOX9 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:500; AF3075, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ನೆಟ್ರಿನ್ G1a (ಮೇಕೆ, 1:100; AF1166, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), STEM121 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:200; Y40410, ಟಕಾರ ಬಯೋ), SATB2 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್) ಮತ್ತು IBA1 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:100; ab5076, abcam). ಬಳಸಿದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು: ಆಂಟಿ-ನ್ಯೂಎನ್ (ಮೌಸ್, 1:500; ab104224, abcam) ಆಂಟಿ-CTIP2 (ರಾಟ್, 1:300; ab18465, abcam), ಆಂಟಿ-GFAP (ಮೊಲ, 1:1,000; Z0334, ಡಕೋ), ಆಂಟಿ-GFP (ಕೋಳಿ, 1:1,000; GTX13970, ಜೀನ್‌ಟೆಕ್ಸ್), ಆಂಟಿ-HNA (ಮೌಸ್, 1:200; ab191181, abcam), ಆಂಟಿ-ನ್ಯೂಎನ್ (ಮೊಲ, 1:500; ABN78, ಮಿಲಿಪೋರ್), ಆಂಟಿ-PDGFRA (ಮೊಲ, 1:200; sc-338, ಸಾಂಟಾ ಕ್ರೂಜ್), ಆಂಟಿ-PPP1R17 (ಮೊಲ, 1:200; HPA047819, ಅಟ್ಲಾಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು), ಆಂಟಿ-RECA-1 (ಮೌಸ್, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:100; 20357-1-AP, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಟೆಕ್), SOX9 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:500; AF3075, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ನೆಟ್ರಿನ್ G1a (ಮೇಕೆ, 1:100; AF1166, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), STEM121 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:200; Y40410, ಟಕಾರ ಬಯೋ), SATB2 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್) ಮತ್ತು IBA1 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:100; ab5076, abcam). ಆ್ಯಂಟಿ-ನ್ಯೂನ್ (ಮೈಷಿನ್, 1:500; ab104224, abcam), ANTI,0CT10; ab18465, abcam), ಆಂಟಿ-GFAP (ಕ್ರೋಲಿಚ್, 1:1000; Z0334, Dako), ಆಂಟಿ- -GFP (ಕುರಿಸಾ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ANTI:20, ab191181, abcam), ಆಂಟಿ-ನ್ಯೂನ್ (ಕ್ರೋಲಿಕ್, 1:500; ಎಬಿಎನ್78, ಮಿಲಿಪೋರ್), ಆಂಟಿ-ಪಿಡಿಜಿಎಫ್‌ಆರ್‌ಎ (ಕ್ರೋಲಿಕ್, 1:200; ಎಸ್‌ಸಿ-338, ಸ್ಯಾಂಟಾ-ಕ್ರೂಸ್), ಆಂಟಿ-ಪಿಪಿಪಿ1ಆರ್17; HPA047819, ಅಟ್ಲಾಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು), ಆಂಟಿ-RECA-1 (ಮಿಶ್, 1:50; ab9774, abcam), ಆಂಟಿ-SCG2 (ಕ್ರೋಲಿಕ್ , 1:100; 20357-1-AP, ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಟೆಕ್), 10,09 AF3075, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), NETRIN G1a (ಕೋಝಿ, 1:100; AF1166, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ಆಂಟಿ-STEM121 (ಮಿಷಿನ್, 1:200; Y40410, ಟಕಾರಾ ಬಯೋ), ಆಂಟಿ-SATB2 (ಮಿ, 1:50; ab51502, abcam), AD65ти-7 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್) ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-IBA1 (ಕೋಸಾ, 1:100; AB5076, ABKAM). ಬಳಸಿದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು: ಆಂಟಿ-ನ್ಯೂಎನ್ (ಮೌಸ್, 1:500; ab104224, abcam), ಆಂಟಿ-CTIP2 (ರಾಟ್, 1:300; ab18465, abcam), ಆಂಟಿ-GFAP (ಮೊಲ, 1:1000; Z0334, ಡಕೋ), ಆಂಟಿ-GFP (ಕೋಳಿ, 1:1000; GTX13970, ಜೀನ್‌ಟೆಕ್ಸ್), ಆಂಟಿ-HNA (ಮೌಸ್, 1:200; ab191181, abcam), ಆಂಟಿ-ನ್ಯೂಎನ್ (ಮೊಲ, 1:500; ABN78, ಮಿಲಿಪೋರ್), ಆಂಟಿ-PDGFRA (ಮೊಲ, 1:200; sc-338, ಸಾಂಟಾ ಕ್ರೂಜ್), ಆಂಟಿ-PPP1R17 (ಮೊಲ, 1:200; HPA047819, ಅಟ್ಲಾಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು), ಆಂಟಿ-RECA-1 (ಮೌಸ್, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:100; 20357-1-AP, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಟೆಕ್), SOX9 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:500; AF3075, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ನೆಟ್ರಿನ್ G1a (ಮೇಕೆ, 1:100; AF1166, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), STEM121 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:200; Y40410, ಟಕಾರ ಬಯೋ), SATB2 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್) ಮತ್ತು IBA1 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是： 抗NeuN 00;ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GF P（鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex），抗HNA（小鼠, 1:200;ab1911 81, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, ಮಿಲಿಪೋರ್, 抗PDGFRA） 1:200；sc-338, ಸಾಂಟಾ ಕ್ರೂಜ್, 抗PPP1R17（兔, 1:200;HPA047819, ಅಟ್ಲಾಸ್抗体）, 抗RECA-1 1:100;20357-1-AP,Proteintech），抗SOX9 ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳು), 抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是： 抗NeuN :300;ab18465,abcam），抗GFAP -GFP (鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex），抗HNA（小鼠,1:200；ab 191181, abcam），抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, ಮಿಲಿಪೋರ್％弔,抗1: 200；sc-338, ಸಾಂಟಾ ಕ್ರೂಜ್）, 抗PPP1R17 100;20357-1-AP, ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಟೆಕ್），抗SOX9Y40410, ಟಕಾರ ಬಯೋ), SATB2 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್) ಮತ್ತು IBA1 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:100; ab5076, abcam).ಬಳಸಿದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು: ಆಂಟಿ-ನ್ಯೂಎನ್ (ಮೌಸ್, 1:500; ab104224, abcam), ಆಂಟಿ-CTIP2 (ರಾಟ್, 1:300; ab18465, abcam), ಆಂಟಿ-GFAP (ಮೊಲ, 1:1000; Z0334, ಡಾಕೊ) . , GFP ವಿರೋಧಿ (ಕೋಳಿ, 1:1000; GTX13970, ಜೀನ್‌ಟೆಕ್ಸ್), HNA ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:200; ab191181, abcam), NeuN ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:500; ABN78, ಮಿಲಿಪೋರ್), PDGFRA ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:200; sc-338, ಸಾಂಟಾ ಕ್ರೂಜ್), PPP1R17 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:200; HPA047819, ಅಟ್ಲಾಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ), RECA-1 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ), 1:100;20357-1-AP, ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಟೆಕ್), ಆಂಟಿ-SOX9 (ಕೋಸಾ, 1:500; AF3075, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ನೆಟ್ರಿನ್ G1a (ಕೋಸಾ, 1:100; AF1166, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ANTI, 120;STEM121; Y40410, Takara Bio), ಆಂಟಿ-SATB2 (ಮಿಶ್, 1:50; ab51502, abcam), ಆಂಟಿ-GAD65/67 (ಕ್ರೋಲಿಕ್, 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್) ಮತ್ತು 1:10-IBA10 AB5076, ಅಬ್ಕಾಮ್). 20357-1-AP, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಟೆಕ್), SOX9 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:500; AF3075, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), ನೆಟ್ರಿನ್ G1a (ಮೇಕೆ, 1:100; AF1166, R&D ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್), STEM121 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:200; Y40410, ಟಕಾರ ಬಯೋ), SATB2 ವಿರೋಧಿ (ಮೌಸ್, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 ವಿರೋಧಿ (ಮೊಲ, 1:400; ABN904, ಮಿಲಿಪೋರ್), ಮತ್ತು IBA1 ವಿರೋಧಿ (ಮೇಕೆ, 1:100; ab5076, abkam).ನಂತರ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು PBS ನಿಂದ ತೊಳೆದು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ (ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ವಿಭಾಗಗಳು) ಅಥವಾ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C (ದಪ್ಪ ವಿಭಾಗಗಳು) ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ತಡೆಯುವ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ 1:1000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಅಲೆಕ್ಸಾ ಫ್ಲೋರ್ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. PBS ನಿಂದ ತೊಳೆಯುವ ನಂತರ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು ಹೋಚ್ಸ್ಟ್ 33258 (ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಅಕ್ವಾಮೌಂಟ್ (ಪಾಲಿಸೈನ್ಸಸ್) ಬಳಸಿ ಕವರ್‌ಸ್ಲಿಪ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಚಿತ್ರದ ಮೇಲೆ ಕೀಯೆನ್ಸ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ (BZ-X ವಿಶ್ಲೇಷಕ) ಅಥವಾ ಲೈಕಾ TCS SP8 ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ (Las-X) ನಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ (ಫಿಜಿ) ಬಳಸಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು. t-hCO ಮತ್ತು ಇಲಿ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಮಾನವ ನರಕೋಶಗಳ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು, 387.5 μm ಅಗಲದ ಆಯತಾಕಾರದ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು t-hCO ನ ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ, ಇಲಿ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನ ಅಂಚಿನಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಹತ್ತಿರ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು. ಅಂಗಾಂಶ ಪಾರದರ್ಶಕತೆ, HNA+ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳು ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಅಂಗಾಂಶ ಆಟೋಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕಸಿ ಅಂಚುಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ, NeuN+ ಮತ್ತು HNA+ ಕೋಶಗಳ ಒಟ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಅದೇ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿರುವ NeuN+ ಕೋಶಗಳ ಒಟ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆಯಿಂದ ಭಾಗಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇಮೇಜ್ ಪ್ಲೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಎಣಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, Hoechst+ ಆಗಿರುವ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ದೋಷವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಕನಿಷ್ಠ 1 ಮಿಮೀ ಬೇರ್ಪಟ್ಟ ಎರಡು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸರಾಸರಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಮಾದರಿ ಸಂಗ್ರಹಕ್ಕೆ ಒಂದು ವಾರ ಮೊದಲು, hCO ಕಸಿ ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು (ಸರಿಸುಮಾರು 8 ತಿಂಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸ) ಕತ್ತಲೆಯ ಕೋಣೆಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ, ಸಂವೇದನಾ ಪ್ರಚೋದನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಮೀಸೆಗಳನ್ನು ಟ್ರಿಮ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, ಕೆಲವು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, t-hCO ಮತ್ತು hCO ಅನ್ನು ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್-ಮೆಕ್ಯಾನಿಕಲ್ ಸೆಲ್ ಲೈಸಿಸ್ ಮತ್ತು 2 ಮಿಲಿ ಗ್ಲಾಸ್ ಟಿಶ್ಯೂ ಗ್ರೈಂಡರ್ (D8938, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್/ಕಿಂಬಲ್) ಬಳಸಿ ನಾಶಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಕಚ್ಚಾ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು 40 µm ಫಿಲ್ಟರ್ ಬಳಸಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸುಕ್ರೋಸ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೊದಲು 4 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 320 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಹಂತದ ನಂತರ (4 °C ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 320 ಗ್ರಾಂ), ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 0.04% BSA/PBS ನಲ್ಲಿ 0.2 ಯೂನಿಟ್‌ಗಳ µl-1 RNase ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ (40 u µl-1, AM2682, ಆಂಬಿಯನ್) ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 40 µm ಫ್ಲೋ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಬೇರ್ಪಟ್ಟ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು 0.02% BSA ಹೊಂದಿರುವ PBS ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕ್ರೋಮಿಯಂ ಸಿಂಗಲ್ ಸೆಲ್ 3′ ಚಿಪ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಪ್ರತಿ ಲೇನ್‌ಗೆ 8,000 ಕೋಶಗಳ ಚೇತರಿಕೆ ಎಂದು ಅಂದಾಜಿಸಲಾಗಿದೆ). snRNA-seq ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ಕ್ರೋಮಿಯಂ ಸಿಂಗಲ್ ಸೆಲ್ 3′ GEM, ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. snRNA-seq ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ಕ್ರೋಮಿಯಂ ಸಿಂಗಲ್ ಸೆಲ್ 3′ GEM, ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium ಏಕ ಕೋಶ 3′ GEM, ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್). snRNA-seq ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ಕ್ರೋಮಿಯಂ ಸಿಂಗಲ್ ಸೆಲ್ 3′ GEM, ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್) ಬಳಸಿ ತಯಾರಿಸಲಾಗಿದೆ. snRNA-seq 文库是使用Chromium ಏಕಕೋಶ 3′ GEM、ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium ಏಕಕೋಶ 3′ GEM、ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием ಕ್ರೋಮಿಯಂ ಸಿಂಗಲ್ ಸೆಲ್ 3′ GEM, ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್). snRNA-seq ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಕ್ರೋಮಿಯಂ ಸಿಂಗಲ್ ಸೆಲ್ 3′ GEM, ಲೈಬ್ರರಿ & ಜೆಲ್ ಬೀಡ್ ಕಿಟ್ v3 (10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್) ಬಳಸಿ ತಯಾರಿಸಲಾಗಿದೆ.ನೋವಾಸೆಕ್ ಎಸ್ 4 (ಇಲ್ಯುಮಿನಾ) ನಲ್ಲಿ ಅಡ್ಮೆರಾ ಹೆಲ್ತ್ ವಿವಿಧ ಮಾದರಿಗಳಿಂದ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿತು.
ಪ್ರತಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಬಾರ್‌ಕೋಡ್‌ಗೆ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು 10x ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್ ಸೆಲ್‌ರೇಂಜರ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಆವೃತ್ತಿ 6.1.2) ಬಳಸಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ರೀಡ್‌ಗಳನ್ನು mkref ಆಜ್ಞೆಯೊಂದಿಗೆ ರಚಿಸಲಾದ ಮಾನವ (GRCh38, ಎನ್ಸೆಂಬಲ್, ಆವೃತ್ತಿ 98) ಮತ್ತು ಇಲಿ (Rnor_6.0, ಎನ್ಸೆಂಬಲ್, ಆವೃತ್ತಿ 100) ಉಲ್ಲೇಖ ಜೀನೋಮ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು –include-introns=TRUE ಆಜ್ಞೆಯೊಂದಿಗೆ ಎಣಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಇಂಟ್ರಾನ್ ಪ್ರದೇಶಗಳಿಗೆ ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಲಾದ ರೀಡಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. t-hCO ಮಾದರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ಎಲ್ಲಾ ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಲಾದ ರೀಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ 95% ಮಾನವ ಜೀನೋಮ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗಬೇಕೆಂಬ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಅವಶ್ಯಕತೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಮಾನವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ನಂತರದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳನ್ನು R ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಆವೃತ್ತಿ 4.1.2) ಸೀರಾಟ್ (ಆವೃತ್ತಿ 4.1.1)32 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೆಲ್‌ರೇಂಜರ್‌ನಿಂದ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ ಬಾರ್‌ಕೋಡ್ ಅರೇ ಔಟ್‌ಪುಟ್‌ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ನಂತರದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆಯೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಯಿತು. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, 1000 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ವಿಶಿಷ್ಟ ಜೀನ್‌ಗಳು ಕಂಡುಬಂದಿರುವ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ 20% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಇರುವ ಕಡಿಮೆ-ಗುಣಮಟ್ಟದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ತರುವಾಯ, sctransform(vst.flavor=”v2″) ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕ್ರಮಬದ್ಧಗೊಳಿಸಿದ ಋಣಾತ್ಮಕ ದ್ವಿಪದ ಹಿಂಜರಿತದ ಮೂಲಕ ಕಚ್ಚಾ ಜೀನ್ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 3000 ಹೆಚ್ಚಿನ ವೇರಿಯಬಲ್ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ಗುರುತಿಸಿತು. 30 ರ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಆಯಾಮವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಿನ್ಸಿಪಲ್ ಕಾಂಪೊನೆಂಟ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್ (PCA) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೇಲಿನ ವೇರಿಯಬಲ್ ಜೀನ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಆಯಾಮ ಕಡಿತವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು (ಮಂಡಿಯ ಸ್ಥಳಗಳ ದೃಶ್ಯ ತಪಾಸಣೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಮಂದ = 30 ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಸಮಗ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು). ನಂತರ ನಾವು ಅಸಹಜವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಜೀನ್ ಎಣಿಕೆ (10 ನೇ ಶೇಕಡಾಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಸರಾಸರಿ), ಅಸಹಜವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೀನ್ ಎಣಿಕೆ (95 ನೇ ಶೇಕಡಾಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಧ್ಯಮ) ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಗೀಕರಿಸಲು ಹಲವಾರು ಸುತ್ತಿನ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ (ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ = 1) ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಕಡಿಮೆ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಸಂಭಾವ್ಯ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಮತ್ತು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು. ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಡಬಲ್ಟ್‌ಫೈಂಡರ್33 ಪ್ಯಾಕೇಜ್ ಬಳಸಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಶಂಕಿತ ಅವಳಿಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣ (95 ನೇ ಶೇಕಡಾಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಡಬಲ್ಟ್‌ಫೈಂಡರ್ ಸ್ಕೋರ್). t-hCO ಮಾದರಿಗಳು (n=3) ಮತ್ತು hCO ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (n=3) ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೇಲಿನ ನಿಯತಾಂಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಇಂಟಿಗ್ರೇಟೆಡ್ ಡೇಟಾ ಕಾರ್ಯ. ನಂತರ ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಸಂಯೋಜಿತ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ನ ಮತ್ತೊಂದು ಸುತ್ತಿನ ಗುಣಾತ್ಮಕ ಫಿಲ್ಟರಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಕಡಿಮೆ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಕರ್ನಲ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿದ ನಂತರ, ಸಂಯೋಜಿತ ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಅನ್ನು ಗುಂಪು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ = 0.5) ಮತ್ತು UMAP34 ದೃಶ್ಯೀಕರಣ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ ಎಂಬೆಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗೆ ಮಾರ್ಕರ್ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಡೇಟಾದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ನಿಯತಾಂಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಫೈಂಡ್‌ಮಾರ್ಕರ್ಸ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಭ್ರೂಣ ಮತ್ತು ವಯಸ್ಕ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಉಲ್ಲೇಖ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಕರ್ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ 19,20,21,35 ಮತ್ತು ಟಿಪ್ಪಣಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಪ್ರಮುಖ ಕೋಶ ವರ್ಗಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗೀಕರಿಸುತ್ತೇವೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, MKI67 ಮತ್ತು TOP2A ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಪರಿಚಲನೆ ಮಾಡುವ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೈಟೋಟಿಕ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿ, ಲೇಟ್ ಮೆಟಾಫೇಸ್ ಫೆಟಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ಮಲ್ಟಿಪೊಟೆಂಟ್ ಗ್ಲಿಯಲ್ ಪ್ರೊಜೆನಿಟರ್ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅತಿಕ್ರಮಣ ಮತ್ತು EGFR ಮತ್ತು OLIG1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಪ್ರೊಜೆನಿಟರ್ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ. ಲೇಟ್ ರೇಡಿಯಲ್ ಗ್ಲಿಯಾದಿಂದ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳ ಪಕ್ವತೆಯವರೆಗೆ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಹಲವಾರು ಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಳ್ಳಲು ನಾವು ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್ ಎಂಬ ಪದವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ. ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳು SLC1A3 ಮತ್ತು AQP4 ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಭ್ರೂಣದ ರೇಡಿಯಲ್ ಗ್ಲಿಯಾ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ವಯಸ್ಕ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳ ಉಪವಿಭಾಗಗಳೊಂದಿಗೆ ನಕ್ಷೆ ಮಾಡುವುದನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. OPCಗಳು PDGFRA ಮತ್ತು SOX10 ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದರೆ, ಆಲಿಗೋಡೆಂಡ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳು ಮೈಲೀನೇಷನ್ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು (MOG ಮತ್ತು MYRF) ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ. ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ನರಕೋಶದ ಪ್ರತಿಲಿಪಿಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ (SYT1 ಮತ್ತು SNAP25), GABAergic ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿ (GAD2) ಮತ್ತು NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, ಅಥವಾ SATB2 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. GluN ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಮೇಲ್ಭಾಗದ (SATB2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು BCL11B ನಷ್ಟ) ಮತ್ತು ಆಳವಾದ (BCL11B ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ) ಉಪವರ್ಗಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆಳವಾದ GluN ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ ಜೊತೆಗೆ ST18 ಮತ್ತು SORCS1 ನಂತಹ ತಿಳಿದಿರುವ SP18 ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ಯೂಟೇಟಿವ್ ಸಬ್‌ಪ್ಲೇಟ್ (SP) ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ. ಕೋರಾಯ್ಡ್ ಪ್ಲೆಕ್ಸಸ್ ತರಹದ ಕೋಶಗಳನ್ನು TTR ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಮೆನಿಂಜಿಯಲ್ ತರಹದ ಕೋಶಗಳು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್-ಸಂಬಂಧಿತ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖ ದತ್ತಾಂಶ ಸೆಟ್‌ನ ಪಿಯಲ್/ನಾಳೀಯ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡುತ್ತವೆ.
ಲಿಬ್ರಾ ಆರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಆವೃತ್ತಿ 1.0.0) ಬಳಸಿ ಅಳವಡಿಸಲಾದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಲಾದ ಹೊಸದಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾದ ಸೂಡೊ-ಬ್ಯಾಚ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು t-hCO ಮತ್ತು hCO ಉಪವರ್ಗಗಳ ನಡುವಿನ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಭೇದಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕೋಶ ವರ್ಗಕ್ಕೆ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಜೀನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಗುಂಪುಗಳಿಗೆ edgeR ಲಾಗ್-ಸಂಭವನೀಯತೆ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳನ್ನು (ಆವೃತ್ತಿ 3.36.0, ಪ್ಯಾಕೇಜ್ R) ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಹೀಟ್‌ಮ್ಯಾಪ್ ದೃಶ್ಯೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಮಿಲಿಯನ್‌ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ (CPM) ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು edgeR (cpm() ಕಾರ್ಯ) ಬಳಸಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ (ಸರಾಸರಿ = 0 ಸಾಧಿಸಲು, ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನ = 1). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ನಿಯಂತ್ರಿತ t-hCO ಗ್ಲುನ್ ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್ ಆಂಟಾಲಜಿ (GO) ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು (ಬೆಂಜಮಿನಿ-ಹಾಚ್‌ಬರ್ಗ್ ಕನಿಷ್ಠ 10% t-hCO ಗ್ಲುನ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ 0.05 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕನಿಷ್ಠ 2 ಬಾರಿ ಬದಲಾವಣೆಯಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳ). ಟಾಪ್‌ಜೀನ್ ಸೂಟ್ (https://toppgene.cchmc.org/) ಬಳಸಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ37. ನಾವು ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ToppFun ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು GO- ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಿದ ಹೈಪರ್‌ಜಿಯೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಬೆಂಜಮಿನಿ-ಹಾಚ್‌ಬರ್ಗ್-ಸರಿಪಡಿಸಿದ P-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಏಕ-ಕೋಶ RNA-seq ಅಥವಾ ವಯಸ್ಕ snRNA-seq19,20,21,22 ರ ಉಲ್ಲೇಖ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಂದ ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಲಾದ ಕೋಶ ಸಮೂಹಗಳೊಂದಿಗೆ ನಮ್ಮ snRNA-seq ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು, ನಾವು ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಏಕೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಅತಿಕ್ರಮಣಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಲು ಮತ್ತು ಹೋಲಿಸಲು ನಾವು Seurat ನಲ್ಲಿ SCTransform (v2) ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಣ ಕಾರ್ಯಪ್ರವಾಹವನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (ಮೇಲಿನಂತೆಯೇ ಅದೇ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ). ಕಂಪ್ಯೂಟೇಶನಲ್ ದಕ್ಷತೆಗಾಗಿ ವೈಯಕ್ತಿಕ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ 500 ಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ಮೂಲ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗೆ ಕೋರ್‌ಗಳವರೆಗೆ ಉಪವಿಭಾಗ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಇದೇ ರೀತಿಯ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಅತಿಕ್ರಮಣವನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ನ ಲೇಬಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅತಿಕ್ರಮಿಸಿದ ಪ್ರತಿ ಪೂಲ್ ಮಾಡಿದ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿನ ಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳ ಅನುಪಾತ ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ. GluN ಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವರ್ಗೀಕರಿಸಲು, ನಮ್ಮ GluN ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಉಲ್ಲೇಖ ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಲೇಬಲ್‌ಗಳನ್ನು ನಿಯೋಜಿಸಲು ನಾವು Seurat ನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರ್‌ಡೇಟಾ ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ ಅನ್ನು GluN ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.
t-hCO ಮತ್ತು hCO ಮಾದರಿಗಳ ಜಾಗತಿಕ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಪಕ್ವತೆಯ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು, ನಾವು ನಮ್ಮ ಸೂಡೊ-ಬಲ್ಕ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು BrainSpan/psychENCODE23 ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಮಾನವ ಮೆದುಳಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ವ್ಯಾಪಿಸಿರುವ ದೊಡ್ಡ RNA ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಗರ್ಭಧಾರಣೆಯ 10 ವಾರಗಳ ನಂತರ ಮತ್ತು ನಂತರ, 5567 ಜೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (ನಮ್ಮ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ) ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮಾದರಿಗಳಿಂದ ಸಂಯೋಜಿತ ಮಾದರಿ-ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ನಾವು PCA ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇವುಗಳನ್ನು ಹಿಂದೆ ಬ್ರೈನ್‌ಸ್ಪ್ಯಾನ್ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯವೆಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿತ್ತು (ಘನ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಯಸ್ಸಿನಿಂದ ವಿವರಿಸಲಾದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ 50% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ) 38. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ನಕಾರಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಅಪವರ್ತನೀಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನರ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಸಹಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ಪಡೆದುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ನಕಾರಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಅಪವರ್ತನೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಮಾದರಿ ತೂಕವನ್ನು ಚಿತ್ರ 5b ನಲ್ಲಿ ಝು ಮತ್ತು ಇತರರು ವಿವರಿಸಿದ ಐದು ಸಹಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಯೊಂದಕ್ಕೂ ವಿಸ್ತರಿತ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ರೂಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮತ್ತೊಮ್ಮೆ, ಚಟುವಟಿಕೆ ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟವಾದ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 3 Hrvatin et al.16 ರಿಂದ ದೃಶ್ಯ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ ಮೌಸ್ ದೃಶ್ಯ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ snRNA-seq ಸಂಗ್ರಹದಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಗ್ಲುಟಾಮೇಟರ್ಜಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ERG ಮತ್ತು LRG ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು. ಮಾನವ-ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ LRG ಗಳನ್ನು KCl-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಮಾನವ ಭ್ರೂಣದ ಮೆದುಳಿನ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ 6 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾನವರಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಯಿತು ಆದರೆ ದಂಶಕಗಳಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 4). ಈ ಜೀನ್ ಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೀನ್ ಸೆಟ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಏಕಮುಖ ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರವಾದ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನಿಂದ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಿ, ಮಿದುಳುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಶೀತ (ಸರಿಸುಮಾರು 4°C) ಆಮ್ಲಜನಕಯುಕ್ತ (95% O2 ಮತ್ತು 5% CO2) ಸುಕ್ರೋಸ್ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಇರಿಸಿ: 234 mM ಸುಕ್ರೋಸ್, 11 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ಮತ್ತು 0.5 mM CaCl2 (ಸುಮಾರು 310 mOsm). t-hCO ಹೊಂದಿರುವ ಇಲಿ ಮೆದುಳಿನ ಕರೋನಲ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು (300–400 µm) ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಲೈಕಾ VT1200 ವೈಬ್ರಟೋಮ್ ಬಳಸಿ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು39. ನಂತರ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 10 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ಮತ್ತು 126 mM NaCl (298 mOsm) ನಿಂದ ತಯಾರಿಸಿದ aCSF ಹೊಂದಿರುವ ನಿರಂತರ ಕೊಠಡಿ ತಾಪಮಾನದ ಆಮ್ಲಜನಕೀಕರಣದೊಂದಿಗೆ ವಿಭಾಗೀಕರಣ ಕೊಠಡಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಕನಿಷ್ಠ 45 ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಮುಳುಗಿದ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಯಿತು, ಅಲ್ಲಿ ಅವುಗಳನ್ನು ನಿರಂತರವಾಗಿ aCSF (95% O2 ಮತ್ತು 5% CO2 ವೈಲ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ. t-hCO ನರಕೋಶಗಳನ್ನು 127 mM ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಗ್ಲುಕೋನೇಟ್, 8 mM NaCl, 4 mM ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ATP, 0.3 mM ಸೋಡಿಯಂ GTP, 10 mM HEPES, ಮತ್ತು 0.6 mM EGTA, pH 7.2 ಹೊಂದಿರುವ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ತುಂಬಿದ ಬೊರೊಸಿಲಿಕೇಟ್ ಗಾಜಿನ ಪೈಪೆಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಆಂತರಿಕ ದ್ರಾವಣವನ್ನು KOH (290 mOsm) ನೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಬಯೋಸೈಟಿನ್ (0.2%) ಅನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.
ಮಲ್ಟಿಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ 700B ಆಂಪ್ಲಿಫಯರ್ (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಮತ್ತು ಡಿಜಿಡೇಟಾ 1550B ಡಿಜಿಟೈಸರ್ (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಬಳಸಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ, ಕಡಿಮೆ-ಪಾಸ್ ಅನ್ನು 2 kHz ನಲ್ಲಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, 20 kHz ನಲ್ಲಿ ಡಿಜಿಟೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕ್ಲಾಂಪ್‌ಫಿಟ್ (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು), ಮೂಲ (ಆರಿಜಿನ್‌ಪ್ರೊ) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. 2021b, ಒರಿಜಿನ್‌ಲ್ಯಾಬ್). ಮತ್ತು ಕಸ್ಟಮ್ MATLAB ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು (ಮ್ಯಾಥ್‌ವರ್ಕ್ಸ್) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. JPCalc ಬಳಸಿ ಜಂಕ್ಷನ್ ಸಂಭಾವ್ಯತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಮೂದುಗಳನ್ನು -14 mV ನ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಮೌಲ್ಯಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆ IV -250 ರಿಂದ 750 pA ವರೆಗಿನ 10-25 pA ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತುತ ಹಂತಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, hCO ನರಕೋಶಗಳ ಪ್ಯಾಚ್-ಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಥಾಲಮೋಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಥಾಲಮಸ್, ಬಿಳಿ ದ್ರವ್ಯ ಮತ್ತು S1 ಅಫೆರೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ವಿದ್ಯುತ್ ಮೂಲಕ ಉತ್ತೇಜಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಮೆದುಳನ್ನು 10° ಕೋನದಲ್ಲಿ ಓರೆಯಾಗಿರುವ 3D ಮುದ್ರಣ ಮೇಜಿನ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೆದುಳಿನ ಮುಂಭಾಗವನ್ನು 35° ಕೋನದಲ್ಲಿ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಮೆದುಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಿದ ಮೇಲ್ಮೈಗೆ ಅಂಟಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿಭಾಗಿಸಲಾಯಿತು, ಥಾಲಮೋಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಚಾಚಿಕೊಂಡಿರುವ ಆಕ್ಸಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಬೈಪೋಲಾರ್ ಟಂಗ್‌ಸ್ಟನ್ ವಿದ್ಯುದ್ವಾರಗಳನ್ನು (0.5 MΩ) ಎರಡನೇ ಮೈಕ್ರೋಮ್ಯಾನಿಪ್ಯುಲೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ನಾಲ್ಕು ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು (ಒಳಗಿನ ಕ್ಯಾಪ್ಸುಲ್, ಬಿಳಿ ದ್ರವ್ಯ, S1 ಮತ್ತು hCO) ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಕಾರ್ಯತಂತ್ರವಾಗಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. 0.03–0.1 Hz ನಲ್ಲಿ 300 µA ಹಂತ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿ.
hChR2-ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ hCO ನರಕೋಶಗಳನ್ನು 480 nm ನಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು LED (ಪ್ರಿಜ್ಮ್ಯಾಟಿಕ್ಸ್) ನಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಬೆಳಕಿನ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯಗಳನ್ನು ×40 ಉದ್ದೇಶ (0.9 NA; ಒಲಿಂಪಸ್) ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಬಳಿ hChR2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲು ಅನ್ವಯಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರಕಾಶಿತ ಕ್ಷೇತ್ರದ ವ್ಯಾಸವು ಸರಿಸುಮಾರು 0.5 ಮಿಮೀ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು ಶಕ್ತಿ 10-20 mW ಆಗಿದೆ. ಪಲ್ಸ್ ಅಗಲವನ್ನು 10 ms ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ವರ್ತನೆಯ ಕಲಿಕೆಯ ಪ್ರಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನೀಡಲಾದ ಪಲ್ಸ್‌ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ. 1 ರಿಂದ 20 Hz ವರೆಗಿನ ವಿವಿಧ ಪ್ರಚೋದನಾ ಆವರ್ತನಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು, ಆದರೆ ಸರಣಿಯ ಮೊದಲ ಪಲ್ಸ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಅಥವಾ ಸುಗಮಗೊಳಿಸುವ ಮಾರ್ಗಗಳ ಮೇಲಿನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ರೈಲುಗಳ ನಡುವಿನ ಮಧ್ಯಂತರಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳಿಗಿಂತ ಉದ್ದವಾಗಿರುತ್ತವೆ. hChR2 ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಮೊನೊಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಆಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, EPSC ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಕಣ್ಮರೆಯಾಗುವವರೆಗೆ ನಾವು ಸ್ನಾನಕ್ಕೆ TTX (1 μM) ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ನಂತರ 4-ಅಮಿನೊಪಿರಿಡಿನ್ (4-AP; 100 μM) ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿ, LED ಫೈರಿಂಗ್ ಮತ್ತು EPSC ಉತ್ಪಾದನೆಯ ನಡುವೆ ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚು ವಿಳಂಬದೊಂದಿಗೆ, ಕೆಲವು ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹಿಂತಿರುಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು AMPA ಗ್ರಾಹಕಗಳಿಂದ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು NBQX (10 μM) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ತೀಕ್ಷ್ಣವಾದ hCO ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, hCO ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 4% ಅಗರೋಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಹುದುಗಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ಮತ್ತು 10 mM d-(+) -ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಲೈಕಾ VT1200 ವೈಬ್ರೇಟರ್ ಬಳಸಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 200–300 µm ನಲ್ಲಿ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ASF ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ, ನೇರ ಸ್ಲೈಸ್‌ಸ್ಕೋಪ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (ಸೈಂಟಿಫಿಕಾ) ಅಡಿಯಲ್ಲಿ hCO ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಶಗಳ ಪ್ಯಾಚ್-ಕ್ಯಾಂಪ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು aCSF (95% O2 ಮತ್ತು 5% CO2) ನೊಂದಿಗೆ ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕೋಶ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲಾಯಿತು. 127 mM ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಗ್ಲುಕೋನೇಟ್, 8 mM NaCl, 4 mM ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ATP, 0.3 mM ಸೋಡಿಯಂ GTP, 10 mM HEPES, ಮತ್ತು 0.6 mM EGTA, ಆಂತರಿಕ pH 7, 2 ಹೊಂದಿರುವ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ತುಂಬಿದ ಬೊರೊಸಿಲಿಕೇಟ್ ಗಾಜಿನ ಪೈಪೆಟ್ ಬಳಸಿ hCO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲಾಯಿತು, ಇದನ್ನು KOH (ಆಸ್ಮೋಲಾರಿಟಿ 290) ನೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಚೇತರಿಕೆಯ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ, ಆಂತರಿಕ ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ 0.2% ಬಯೋಸೈಟಿನ್ ಸೇರಿಸಿ.
ಮಲ್ಟಿಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ 700B ಆಂಪ್ಲಿಫಯರ್ (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಮತ್ತು ಡಿಜಿಡೇಟಾ 1550B ಡಿಜಿಟೈಸರ್ (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕ್ಲಾಂಪೆಕ್ಸ್ (ಕ್ಲಾಂಪೆಕ್ಸ್ 11.1, ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಂಡಿತು, ಕಡಿಮೆ-ಪಾಸ್ ಅನ್ನು 2 kHz ನಲ್ಲಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿ, 20 kHz ನಲ್ಲಿ ಡಿಜಿಟೈಸ್ ಮಾಡಿ, ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಮತ್ತು ಕಸ್ಟಮ್ MATLAB ಕಾರ್ಯಗಳಿಗಾಗಿ ಕ್ಲಾಂಪ್‌ಫಿಟ್ (ಆವೃತ್ತಿ 10.6) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ (MATLAB 2019b, ಮ್ಯಾಥ್‌ವರ್ಕ್ಸ್). ಜಂಕ್ಷನ್ ವಿಭವವನ್ನು JPCalc ಬಳಸಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಮೂದುಗಳನ್ನು -14 mV ನ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಜಂಕ್ಷನ್ ವಿಭವಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಯಿತು. ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆ IV -50 ರಿಂದ 250 pA ವರೆಗಿನ 5-10 pA ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತುತ ಹಂತಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.
ಸೆಟೆದುಕೊಂಡ ನರಕೋಶಗಳ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣಕ್ಕಾಗಿ, 0.2% ಬಯೋಸೈಟಿನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಅನ್ನು ಆಂತರಿಕ ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಹ್ಯಾಕಿಂಗ್ ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕನಿಷ್ಠ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರೈಮ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ ನೋಂದಾಯಿತ ಪೊರೆಯು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮುಚ್ಚುವವರೆಗೆ ಪೈಪೆಟ್ ಅನ್ನು ನಿಧಾನವಾಗಿ 1-2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಎಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ವಿಭಾಗದ ಶರೀರಶಾಸ್ತ್ರದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4° C ನಲ್ಲಿ 4% PFA ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು, PBS X3 ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಸಂಯೋಜಿತ ಡೈಲೈಟ್ 549 ಅಥವಾ ಡೈಲೈಟ್ 405 (ವೆಕ್ಟರ್ ಲ್ಯಾಬ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ 1:1000 ನೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಬಯೋಸೈಟಿನ್ (2%; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ತುಂಬಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಪ್ಯಾಚ್ ಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಅಕ್ವಾಮೌಂಟ್ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮರುದಿನ ಲೈಕಾ TCS SP8 ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಖ್ಯಾತ್ಮಕ ದ್ಯುತಿರಂಧ್ರ ×40 1.3, ವರ್ಧನೆ ×0.9–1.0, xy ನೊಂದಿಗೆ ತೈಲ ಇಮ್ಮರ್ಶನ್ ಉದ್ದೇಶವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿ ದರವು ಪ್ರತಿ ಮೈಕ್ರಾನ್‌ಗೆ ಸರಿಸುಮಾರು 7 ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳು. 1 µm ಮಧ್ಯಂತರದಲ್ಲಿ Z-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್‌ಗಳನ್ನು ಸರಣಿಯಾಗಿ ಪಡೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ನರಕೋಶದ ಸಂಪೂರ್ಣ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಮರವನ್ನು ಒಳಗೊಳ್ಳಲು z-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಮೊಸಾಯಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಲೈಕಾ-ಆಧಾರಿತ ಸ್ವಯಂ-ಹೊಲಿಗೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ನ್ಯೂಟ್ಯೂಬ್ 40 ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಬಳಸಿ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಅರೆ-ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಟ್ರ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು SWC ಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸಿಂಪಲ್‌ನ್ಯೂರೈಟ್‌ಟ್ರೇಸರ್ 41 ಫಿಜಿ ಪ್ಲಗಿನ್‌ಗೆ ಅಪ್‌ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಇಮೇಜ್‌ಜೆ, ಆವೃತ್ತಿ 2.1.0; NIH).
ಸ್ಟ್ಯಾನ್‌ಫೋರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ ಸಾಂಸ್ಥಿಕ ಪರಿಶೀಲನಾ ಮಂಡಳಿಯು ಅನುಮೋದಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ ಮಾಹಿತಿಯುಕ್ತ ಒಪ್ಪಿಗೆಯೊಂದಿಗೆ ಮಾನವ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ವಕ್ರೀಭವನದ ಅಪಸ್ಮಾರಕ್ಕೆ ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಭಾಗವಾಗಿ ಮುಂಭಾಗದ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ (ಮಧ್ಯದ ಮುಂಭಾಗದ ಗೈರಸ್) ಅನ್ನು ಛೇದಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮಾನವ ಪ್ರಸವಾನಂತರದ ಅಂಗಾಂಶದ ಎರಡು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (3 ಮತ್ತು 18 ವರ್ಷ ವಯಸ್ಸಿನವರು) ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಛೇದನದ ನಂತರ, ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್ NMDG-aCSF ನಲ್ಲಿ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಿ ಇವುಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 2 mM ಥಿಯೋರಿಯಾ, 5 mM ಸೋಡಿಯಂ ಆಸ್ಕೋರ್ಬೇಟ್, 3 mM ಸೋಡಿಯಂ ಪೈರುವೇಟ್, 0.5 mM CaCl2 4H2O ಮತ್ತು 10 mM MgSO4 7H2O. ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ಹೈಡ್ರೋಕ್ಲೋರಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ pH 7.3-7.4 ಗೆ ಟೈಟ್ರೇಟ್ ಮಾಡಿ. ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು 30 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಕ್ಕೆ ತಲುಪಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕರೋನಲ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು.
ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸ್ಟ್ಯಾನ್‌ಫೋರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ APLAC-ಅನುಮೋದಿತ ಪ್ರಾಣಿ ಆರೈಕೆ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 140 ದಿನಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಕಾಲದ ಇಲಿಗಳನ್ನು 5% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಅರಿವಳಿಕೆಯಿಂದ ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 1-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ಫ್ರೇಮ್ (Kopf) ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಿರಂತರ ಬಿಡುಗಡೆ ಬುಪ್ರೆನಾರ್ಫಿನ್ (SR) ಅನ್ನು ಸಬ್ಕ್ಯುಟೇನಿಯಸ್ ಆಗಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ತಲೆಬುರುಡೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಸ್ವಚ್ಛಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 3-5 ಮೂಳೆ ಸ್ಕ್ರೂಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. t-hCO ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಲು, ನಾವು MRI ಚಿತ್ರಗಳಿಂದ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಆಸಕ್ತಿಯ ಸ್ಥಳದಲ್ಲಿ ಬರ್ ಹೋಲ್ ಅನ್ನು ಕೊರೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫೈಬರ್‌ಗಳನ್ನು (400 µm ವ್ಯಾಸ, NA 0.48, ಡೋರಿಕ್) hCO ಮೇಲ್ಮೈಯಿಂದ 100 µm ಕೆಳಗೆ ಇಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು UV-ಗುಣಪಡಿಸಬಹುದಾದ ದಂತ ಸಿಮೆಂಟ್ (Relyx) ನೊಂದಿಗೆ ತಲೆಬುರುಡೆಗೆ ಸುರಕ್ಷಿತಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.
ಫೈಬರ್ ಫೋಟೊಮೆಟ್ರಿಕ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು42. ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲು, ಇಲಿಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧವಾದ ಪಂಜರದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫೈಬರ್ ಆಪ್ಟಿಕ್ ಫೋಟೊಮೆಟ್ರಿಕ್ ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ ಸಂಪರ್ಕಗೊಂಡಿರುವ 400 µm ವ್ಯಾಸದ ಫೈಬರ್ ಆಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ಯಾಚ್ ಕೇಬಲ್ (ಡೋರಿಕ್) ಅನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾದ ಫೈಬರ್ ಆಪ್ಟಿಕ್ ಕೇಬಲ್‌ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಯಿತು. ಮೋಟಾರ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಪ್ರಾಣಿಗಳು ಪಂಜರವನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು ಮುಕ್ತವಾಗಿದ್ದವು. ಪ್ರಚೋದಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲು, ಇಲಿಗಳನ್ನು (ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 140 ದಿನಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು) ಇಂಡಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ 5% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಮತ್ತು ನಿರ್ವಹಣೆಗಾಗಿ 1-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಣಿಯನ್ನು ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಫ್ರೇಮ್‌ನಲ್ಲಿ (Kopf) ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು t-hCO ನ ಎದುರು ಬದಿಯಲ್ಲಿರುವ ವಿಸ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು ಸುಮಾರು 2 ಸೆಂ.ಮೀ.ಗೆ ಟ್ರಿಮ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪೀಜೋಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ (PI) ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಗೊಂಡಿರುವ ಜಾಲರಿಯ ಮೂಲಕ ಹಾದುಹೋಗುತ್ತದೆ. 400 µm ಫೈಬರ್ ಆಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ಯಾಚ್ ಕೇಬಲ್ (ಡೋರಿಕ್) ಅನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾದ ಫೈಬರ್‌ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗಿದೆ. t-hCO ನ ಎದುರು ಭಾಗದಲ್ಲಿರುವ ವಿಸ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು ನಂತರ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ಪೀಜೋಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಡ್ರೈವ್ ಮೂಲಕ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ 50 ಬಾರಿ (20 Hz ನಲ್ಲಿ 2 mm, ಪ್ರತಿ ಪ್ರಸ್ತುತಿಗೆ 2 s) ತಿರುಗಿಸಲಾಯಿತು. ಕಸ್ಟಮ್ MATLAB ಕೋಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವಿಚಲನ ಸಮಯವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು Arduino MATLAB ಬೆಂಬಲ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಟ್ರಾನ್ಸಿಸ್ಟರ್-ಟ್ರಾನ್ಸಿಸ್ಟರ್ ಲಾಜಿಕ್ (TTL) ಪಲ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಈವೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ಗೆ ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
(ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 140 ದಿನಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು) ಇಲಿಗಳಿಗೆ 5% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 1-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ಫ್ರೇಮ್ (ಕೋಪ್ಫ್) ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬುಪ್ರೆನಾರ್ಫಿನ್ ಎಸ್‌ಆರ್ ಮತ್ತು ಡೆಕ್ಸಾಮೆಥಾಸೊನ್ ಅನ್ನು ಸಬ್ಕ್ಯುಟೇನಿಯಸ್ ಆಗಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ತಲೆಬುರುಡೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಸ್ವಚ್ಛಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 3-5 ಮೂಳೆ ಸ್ಕ್ರೂಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. t-hCO ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಲು, ನಾವು MRI ಚಿತ್ರಗಳಿಂದ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಕಸಿ ಮಾಡಿದ hCO ಮೇಲೆ ನೇರವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ವೇಗದ ಡ್ರಿಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿ (ಸರಿಸುಮಾರು 1 ಸೆಂ.ಮೀ ವ್ಯಾಸ) ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಮೂಳೆ ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ತೆಳ್ಳಗಿದ್ದರೆ, ಆದರೆ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮೂಳೆಯ ಮೂಲಕ ಕೊರೆಯುವ ಮೊದಲು, ಆಧಾರವಾಗಿರುವ t-hCO ಅನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲು ಉಳಿದ ಅಖಂಡ ಪೆಲ್ವಿಕ್ ಡಿಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಫೋರ್ಸ್‌ಪ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ. ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿಯನ್ನು ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಲವಣಯುಕ್ತದಿಂದ ತುಂಬಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಕವರ್‌ಸ್ಲಿಪ್ ಮತ್ತು ವಿಶೇಷ ಹೆಡ್ ಪಿನ್ ಅನ್ನು UV-ಕ್ಯೂರ್ಡ್ ಡೆಂಟಲ್ ಸಿಮೆಂಟ್ (ರೆಲಿಕ್ಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ತಲೆಬುರುಡೆಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು.
ನಿಕಾನ್ LWD (×16, 0.8 NA) ಉದ್ದೇಶದೊಂದಿಗೆ ಬ್ರೂಕರ್ ಮಲ್ಟಿಫೋಟಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಬಳಸಿ ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. GCaMP6 ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಅನ್ನು 920 nm ನಲ್ಲಿ 1.4x ಸಿಂಗಲ್ z-ಪ್ಲೇನ್ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು 8x ಸರಾಸರಿ 7.5 fps ನೊಂದಿಗೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಇಲಿಗಳನ್ನು 5% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಅರಿವಳಿಕೆಯಿಂದ ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 1-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು. ಇಲಿಗಳನ್ನು ಕಸ್ಟಮ್ ಮಾಡಿದ ಹೆಡ್ ಫಿಕ್ಚರ್‌ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಲೆನ್ಸ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮೋಟಾರ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ 3 ನಿಮಿಷಗಳ ಹಿನ್ನೆಲೆ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. 20 ನಿಮಿಷಗಳ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ, 50 ಪಫ್‌ಗಳನ್ನು (ಪ್ರತಿ ಪ್ರಸ್ತುತಿ 100 ms ಉದ್ದ) ಪಿಕೋಸ್ಪ್ರೈಸರ್ ಬಳಸಿ t-hCO ಎದುರಿನ ವಿಸ್ಕರ್ ಪ್ಯಾಡ್‌ಗೆ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ತಲುಪಿಸಲಾಯಿತು. ಕಸ್ಟಮ್ MATLAB ಕೋಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬರ್ಸ್ಟ್ ಸಮಯವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು Arduino MATLAB ಬೆಂಬಲ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. TTL ಪಲ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (PrairieView 5.5) ನೊಂದಿಗೆ ಈವೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸ್ ಮಾಡಿ. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಫಿಜಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲಾದ MoCo ಪ್ರೋಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಅಫೈನ್ ತಿದ್ದುಪಡಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು xy ಚಲನೆಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. CNMF-E43 ಬಳಸಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಕುರುಹುಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯುವುದು. ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೂ ಪ್ರತಿದೀಪಕತೆಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು, dF/F ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ z-ಸ್ಕೋರ್‌ಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು.
(ಕಸಿ ಮಾಡಿದ 140 ದಿನಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು) ಇಲಿಗಳಿಗೆ 5% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 1-3% ಐಸೊಫ್ಲುರೇನ್ ಅನ್ನು ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ಫ್ರೇಮ್ (Kopf) ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬುಪ್ರೆನಾರ್ಫಿನ್ SR ಮತ್ತು ಡೆಕ್ಸಾಮೆಥಾಸೊನ್ ಅನ್ನು ಸಬ್ಕ್ಯುಟೇನಿಯಸ್ ಆಗಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. t-hCO ನ ಎದುರು ಭಾಗದಲ್ಲಿರುವ ಮೀಸೆಗಳನ್ನು ಸುಮಾರು 2 ಸೆಂ.ಮೀ.ಗೆ ಕತ್ತರಿಸಿ ಪೀಜೋಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್‌ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾದ ಜಾಲರಿಯ ಮೂಲಕ ಥ್ರೆಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ತಲೆಬುರುಡೆಯನ್ನು ತೆರೆದು ಸ್ವಚ್ಛಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಗ್ರೌಂಡ್ ಸ್ಕ್ರೂ ಅನ್ನು ತಲೆಬುರುಡೆಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. t-hCO ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಲು, ನಾವು MRI ಚಿತ್ರಗಳಿಂದ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಸಿಕ್ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ. t-hCO ಗಿಂತ ಸ್ವಲ್ಪ ಮೇಲಿರುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ವೇಗದ ಡ್ರಿಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿ (ಸುಮಾರು 1 ಸೆಂ.ಮೀ ವ್ಯಾಸ) ಮಾಡಿ. ಮೂಳೆ ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ತೆಳ್ಳಗಾದ ನಂತರ, ಆದರೆ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮೂಳೆಯ ಮೂಲಕ ಕೊರೆಯುವ ಮೊದಲು, ಆಧಾರವಾಗಿರುವ t-hCO ಅನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲು ಉಳಿದ ಅಖಂಡ ಪೆಲ್ವಿಕ್ ಡಿಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಫೋರ್ಸ್‌ಪ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. 32-ಚಾನೆಲ್ ಅಥವಾ 64-ಚಾನೆಲ್ ಹೈ-ಡೆನ್ಸಿಟಿ ಸಿಲಿಕಾನ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು (ಕೇಂಬ್ರಿಡ್ಜ್ ನ್ಯೂರೋಟೆಕ್) ಗ್ರೌಂಡ್ ಟು ಗ್ರೌಂಡ್ ಸ್ಕ್ರೂಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಮತ್ತು RHD ಆಂಪ್ಲಿಫೈಯರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (ಇಂಟಾನ್) ಪೂರ್ವ-ವರ್ಧಿಸಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಕೋಶಗಳನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿ ಮೂಲಕ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರಿ ಸ್ಥಳಕ್ಕೆ ಇಳಿಸಲು ಮ್ಯಾನಿಪ್ಯುಲೇಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಇದು ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಸಲೈನ್‌ನಿಂದ ತುಂಬಿರುತ್ತದೆ. ಓಪನ್ ಎಫಿಸ್ ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 30 kHz ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ಡೇಟಾ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 10 ಕ್ಕೂ ಹೆಚ್ಚು ಚಾನಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರುವ ಲಯಬದ್ಧ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದಾಗ ಮಾತ್ರ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಮುಂದುವರೆಯಿತು, ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಡ್‌ಗಳು ನಾಟಿಯಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ). ಮೋಟಾರ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ 10-ನಿಮಿಷಗಳ ಹಿನ್ನೆಲೆ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. ನಂತರ t-hCO ನ ಎದುರು ಬದಿಯಲ್ಲಿರುವ ವಿಸ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ಪೀಜೋಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಡ್ರೈವ್ ಮೂಲಕ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ 50 ಬಾರಿ (20 Hz ನಲ್ಲಿ 2 ಮಿಮೀ, ಪ್ರತಿ ಪ್ರಸ್ತುತಿಗೆ 2 ಸೆಕೆಂಡುಗಳು) ತಿರುಗಿಸಲಾಯಿತು. Arduino ಗಾಗಿ MATLAB ಬೆಂಬಲ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (MATLAB 2019b) ಬಳಸಿ, ಕಸ್ಟಮ್ MATLAB ಕೋಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವಿಚಲನ ಸಮಯವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಿ. ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಈವೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸ್ ಮಾಡಲು TTL ಪಲ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.
ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಮಾರ್ಕಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, 473 nm ಲೇಸರ್ (Omicron) ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಗೊಂಡಿರುವ 200 µm ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಪ್ಯಾಚ್ ಬಳ್ಳಿಯನ್ನು (ಡೋರಿಕ್) ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿಯ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಲಾದ 200 µm ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಫೈಬರ್‌ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇದಕ್ಕೂ ಮೊದಲು, ಜಂಪರ್ ಪವರ್ ಅನ್ನು 20 mW ಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ. ಕ್ರೇನಿಯೊಟಮಿ ಮೂಲಕ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರಿ ಸ್ಥಳಕ್ಕೆ ಇಳಿಸಲು ಮ್ಯಾನಿಪ್ಯುಲೇಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಇದು ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಸಲೈನ್‌ನಿಂದ ತುಂಬಿರುತ್ತದೆ. ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ನ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, 473 nm (ಆವರ್ತನ 2 Hz, ಪಲ್ಸ್ ಅವಧಿ 10 ms) ಬೆಳಕಿನ ಹತ್ತು ಪಲ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರಸೂಸಲಾಯಿತು. 70% ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಬೆಳಕಿನ 10 ms ಒಳಗೆ ಸ್ಪೈಕ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಕೋಶಗಳು ಫೋಟೋಸೆನ್ಸಿಟಿವ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ.