Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕೆಂದು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ). ಈ ಮಧ್ಯೆ, ನಿರಂತರ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ರೆಂಡರ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
AFEX ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್‌ನಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಹೊಸ ರೋಗನಿರೋಧಕ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ವಿಧಾನಗಳು. ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್ ಪಳೆಯುಳಿಕೆ ಇಂಧನಗಳಿಗೆ ಸುಸ್ಥಿರ ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಹಾರ, ಆಹಾರ, ಇಂಧನಗಳು ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳಂತಹ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳಲ್ಲಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಅರಾಬಿನೋಸ್‌ನಂತಹ ಸರಳ ಸಕ್ಕರೆಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು ವೆಚ್ಚ-ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯೇ ಈ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶವಾಗಿದೆ. ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್ ತುಂಬಾ ಹಠಮಾರಿಯಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಅಪೇಕ್ಷಿತ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಅದನ್ನು ಥರ್ಮೋಕೆಮಿಕಲ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಗೆ (ಉದಾ, ಅಮೋನಿಯಾ ಫೈಬರ್ ಎಕ್ಸ್‌ಫೋಲಿಯೇಶನ್ (AFEX), ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಆಮ್ಲಗಳು (DA), ಅಯಾನಿಕ್ ದ್ರವಗಳು (IL)) ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಗೆ (ಉದಾ, ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಹುದುಗುವಿಕೆ) ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಪಡಿಸಬೇಕು. . ಆದಾಗ್ಯೂ, ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಿದಾಗ, ರೂಪುಗೊಂಡ ಕರಗುವ ಸಕ್ಕರೆಗಳಲ್ಲಿ ಕೇವಲ 75-85% ಮಾತ್ರ ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ಉಳಿದ 15-25% ಕರಗಬಲ್ಲ, ಕರಗದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿವೆ, ಇವು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳಿಗೆ ಯಾವಾಗಲೂ ಲಭ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ. ಈ ಹಿಂದೆ, ನಾವು ಕಾರ್ಬನ್ ಮತ್ತು ಡಯಾಟೊಮೇಸಿಯಸ್ ಭೂಮಿಯ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮತ್ತು ಗಾತ್ರ ಹೊರಗಿಡುವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿಯ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕರಗುವ ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಕಿಣ್ವ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಸಹ ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ಕಡಿಮೆ DP ಮತ್ತು ತಟಸ್ಥ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ ಪಾಲಿಮರೀಕರಣ (DP) ಮೀಥೈಲೇಟೆಡ್ ಯುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಲು ಹೆಚ್ಚು ಕಷ್ಟಕರವೆಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿ ಗ್ಲೈಕನ್‌ಗಳಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮಾನೋಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು (mAbs) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ಲೈಕನ್ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್, ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್-ನೆರವಿನ ಲೇಸರ್ ನಿರ್ಜಲೀಕರಣ ಅಯಾನೀಕರಣ, ಹಾರಾಟದ ಸಮಯದ ಮಾಸ್-ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ಸೇರಿದಂತೆ ಹಲವಾರು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ವಿಧಾನಗಳ ಬಳಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. MALDI-TOF-MS) ಋಣಾತ್ಮಕ ಅಯಾನುಗಳ ದ್ವಿತೀಯಕ ಕೊಳೆಯುವಿಕೆಯ ನಂತರ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಿಂದ ಪಡೆದ ರಚನೆ-ತಿಳಿವಳಿಕೆ ನೀಡುವ ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಶಿಖರಗಳನ್ನು, ಅನಿಲ ವರ್ಣತಂತುಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (GC-MS) ಅನ್ನು ವ್ಯುತ್ಪನ್ನದೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತು ಇಲ್ಲದೆ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಣ್ಣ ಗಾತ್ರದ ಕಾರಣ (DP 4–20), ಈ ಅಣುಗಳನ್ನು mAb ಬಂಧಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಬಳಸುವುದು ಕಷ್ಟ. ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ನಿವಾರಿಸಲು, ನಾವು ಹೊಸ ಬಯೋಟಿನ್ ಸಂಯೋಗ-ಆಧಾರಿತ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ನಿಶ್ಚಲೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದು ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಡಿಮೆ DP ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿತು, ನಂತರ ಇದನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬಂಧನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ mAb ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಈ ಹೊಸ ವಿಧಾನವು ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಮುಂದುವರಿದ ಹೈ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ಅಸ್ಸೇಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ ಬಯೋಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿರೂಪಿಸಲು ಬಳಸಬಹುದು.
ಕೃಷಿ, ಅರಣ್ಯ, ಹುಲ್ಲು ಮತ್ತು ಮರದ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಜೀವರಾಶಿ, ಆಹಾರ, ಆಹಾರ, ಇಂಧನ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಜೈವಿಕ ಆಧಾರಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಫೀಡ್‌ಸ್ಟಾಕ್ ಆಗಿದೆ. ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳಲ್ಲಿರುವ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಹೆಮಿಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್‌ನಂತಹವು) ರಾಸಾಯನಿಕ ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ರೂಪಾಂತರದ ಮೂಲಕ (ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಹುದುಗುವಿಕೆ) ಮೋನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಡಿಪೋಲಿಮರೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಲ್ಲಿ ಅಮೋನಿಯಾ ಫೈಬರ್ ವಿಸ್ತರಣೆ (AFEX), ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಆಮ್ಲ (DA), ಅಯಾನಿಕ್ ದ್ರವ (IL) ಮತ್ತು ಉಗಿ ಸ್ಫೋಟ (SE) ಸೇರಿವೆ, ಇವು ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳನ್ನು ತೆರೆಯುವ ಮೂಲಕ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳು ಮತ್ತು ಶಾಖದ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ3,4. ವಸ್ತುವಿನ ಮೊಂಡುತನ, 5. ವಾಣಿಜ್ಯ ಸಕ್ರಿಯ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಕಿಣ್ವಗಳು (CAZymes) ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ-ಆಧಾರಿತ ಇಂಧನಗಳು ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್ ಯೀಸ್ಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಹುದುಗುವಿಕೆ ಬಳಸಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ಲೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ 6 .
ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳಲ್ಲಿನ CAZymes, ಸಂಕೀರ್ಣ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್-ಸಕ್ಕರೆ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕಲ್ ಆಗಿ ಸೀಳಿ ಮಾನೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಕಿಣ್ವಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣದಿಂದ ಕೂಡಿದೆ. 2,7. ನಾವು ಮೊದಲೇ ವರದಿ ಮಾಡಿದಂತೆ, ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಲಿಗ್ನಿನ್‌ನ ಆರೊಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಜಾಲವು ಅವುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಅವಿಭಾಜ್ಯವಾಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಅಪೂರ್ಣ ಸಕ್ಕರೆ ಪರಿವರ್ತನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಜೀವರಾಶಿಯ ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗದ 15-25% ಲೈಂಗಿಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುತ್ತದೆ. ವಿವಿಧ ಜೀವರಾಶಿ ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸಾ ವಿಧಾನಗಳೊಂದಿಗೆ ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿದೆ. ಈ ಅಡಚಣೆಗೆ ಕೆಲವು ಕಾರಣಗಳು ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವ ಪ್ರತಿಬಂಧ ಅಥವಾ ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ ಸಕ್ಕರೆ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಮುರಿಯಲು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಅಗತ್ಯ ಅಗತ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟಗಳು. ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಸಕ್ಕರೆ ಬಂಧಗಳಂತಹ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಸಂಯೋಜನೆ ಮತ್ತು ರಚನಾತ್ಮಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು, ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಕ್ಕರೆ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪೆಟ್ರೋಲಿಯಂ-ಪಡೆದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳೊಂದಿಗೆ ವೆಚ್ಚ-ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕವಾಗಿಸುತ್ತದೆ.
ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಸವಾಲಿನ ಕೆಲಸವಾಗಿದ್ದು, ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (LC)11,12, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (NMR)13, ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ (CE)14,15,16 ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS)17. ,ಹದಿನೆಂಟು. ಲೇಸರ್ ಡಿಸಾರ್ಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ (MALDI-TOF-MS) ಬಳಸಿ ಅಯಾನೀಕರಣದೊಂದಿಗೆ ಹಾರಾಟದ ಸಮಯದ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯಂತಹ MS ವಿಧಾನಗಳು ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಬಹುಮುಖ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಸೋಡಿಯಂ ಅಯಾನ್ ಸಂಯೋಜಕಗಳ ಘರ್ಷಣೆ-ಪ್ರೇರಿತ ವಿಘಟನೆ (CID) ಟಂಡೆಮ್ MS ಅನ್ನು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಲಗತ್ತು ಸ್ಥಾನಗಳು, ಅನೋಮೆರಿಕ್ ಸಂರಚನೆಗಳು, ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಮತ್ತು ಕವಲೊಡೆಯುವ ಸ್ಥಾನಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಫಿಂಗರ್‌ಪ್ರಿಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ 20, 21 .
ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಬಂಧಗಳ ಆಳವಾದ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗೆ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ22. ಈ ವಿಧಾನವು ಸಂಕೀರ್ಣ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಸಂಪರ್ಕಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳಾಗಿ ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲಾದ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು (mAbs) ಬಳಸುತ್ತದೆ. ವಿವಿಧ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿವಿಧ ರೇಖೀಯ ಮತ್ತು ಶಾಖೆಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ವಿರುದ್ಧ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ 250 mAbs ಪ್ರಪಂಚದಾದ್ಯಂತ ಲಭ್ಯವಿದೆ24. ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ರಚನೆ, ಸಂಯೋಜನೆ ಮತ್ತು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಹಲವಾರು mAbs ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರ, ಅಂಗ, ವಯಸ್ಸು, ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಹಂತ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪರಿಸರವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿವೆ25,26. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಸಸ್ಯ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಣಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿನ ಕೋಶಕ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಮತ್ತು ಉಪಕೋಶೀಯ ಗುರುತುಗಳು, ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹಂತಗಳು ಅಥವಾ ಪರಿಸರ ಪ್ರಚೋದಕಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಸಾಗಣೆಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಪಾತ್ರಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ಸೈಲಾನ್‌ಗಳ ಕೆಲವು ವಿಭಿನ್ನ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಪೆಕ್ಟಿನ್ (P), ಕ್ಸೈಲಾನ್ (X), ಮನ್ನನ್ (M), ಕ್ಸೈಲೋಗ್ಲುಕಾನ್‌ಗಳು (XylG), ಮಿಶ್ರ ಬಂಧದ ಗ್ಲುಕಾನ್‌ಗಳು (MLG), ಅರಾಬಿನೋಕ್ಸಿಲಾನ್ (ArbX), ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಮನ್ನನ್ (GalG), ಗ್ಲುಕುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ-ಅರಾಬಿನೋಕ್ಸಿಲಾನ್ (GArbX) ಮತ್ತು ಅರಾಬಿನೋ-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟಾನ್ (ArbG)29 ಸೇರಿವೆ.
ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರಯತ್ನಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಿಡುಗಡೆ, ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಮೆರಿಕ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ ಬದಲಾವಣೆಗಳು, ವಿವಿಧ ಕಡಿಮೆ DP ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ಲೋಡ್ (HSL) ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ಸ್ವರೂಪದ ಮೇಲೆ ಕೆಲವೇ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಗಮನಹರಿಸಿವೆ. ವಿತರಣೆಗಳು 30,31,32. ಏತನ್ಮಧ್ಯೆ, ಗ್ಲೈಕನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗ್ಲೈಕನ್ ರಚನೆಯ ಸಮಗ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಉಪಯುಕ್ತ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದ್ದರೂ, ಪ್ರತಿಕಾಯ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಕಡಿಮೆ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡುವುದು ಕಷ್ಟ. 5-10 kDa ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕವಿರುವ ಸಣ್ಣ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು 33, 34 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕಾಯ ಸೇರ್ಪಡೆಯ ಮೊದಲು ತೊಳೆಯಲ್ಪಡುತ್ತವೆ.
ಇಲ್ಲಿ, ಮೊದಲ ಬಾರಿಗೆ, ನಾವು ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ELISA ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ, ಕರಗುವ ವಕ್ರೀಕಾರಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಒಂದು-ಹಂತದ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತೇವೆ. ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ನಮ್ಮ ವಿಧಾನವನ್ನು MALDI-TOF-MS ಮತ್ತು GC-MS ಆಧಾರಿತ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಸಕ್ಕರೆ ಸಂಯೋಜನೆಗಳ ಟ್ರೈಮಿಥೈಲ್‌ಸಿಲಿಲ್ (TMS) ವ್ಯುತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪೂರಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಪರ್ಕಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ನವೀನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೂಪುಟ್ ವಿಧಾನವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಅನ್ವಯಿಕೆಯನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು35.
ಕಿಣ್ವಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಅನುವಾದದ ನಂತರದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಗ್ಲೈಕೋಸೈಲೇಷನ್, 36 ಅವುಗಳ ಜೈವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸೀರಮ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಗ್ಲೈಕೋಸೈಲೇಷನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಉರಿಯೂತದ ಸಂಧಿವಾತದಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವಹಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಗ್ಲೈಕೋಸೈಲೇಷನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಗುರುತುಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ 37. ಜಠರಗರುಳಿನ ಪ್ರದೇಶ ಮತ್ತು ಯಕೃತ್ತಿನ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಉರಿಯೂತದ ಕಾಯಿಲೆಗಳು, ವೈರಲ್ ಸೋಂಕುಗಳು, ಅಂಡಾಶಯ, ಸ್ತನ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಸ್ಟೇಟ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳು ಸುಲಭವಾಗಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸಾಹಿತ್ಯದಲ್ಲಿ ವರದಿಯಾಗಿದೆ 38,39,40. ಪ್ರತಿಕಾಯ-ಆಧಾರಿತ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ELISA ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಸಂಕೀರ್ಣ MS ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸದೆಯೇ ರೋಗ ರೋಗನಿರ್ಣಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ವಿಶ್ವಾಸವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನವು, ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರವೂ ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಆಗದೆ ಉಳಿದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1). ನಮ್ಮ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟವಾದ ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ, AFEX-ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮಾಡಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟವರ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ (ACSH) ನಿಂದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ನಾವು ಸಕ್ರಿಯ ಇದ್ದಿಲು ಘನ-ಹಂತದ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಆರಂಭಿಕ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ನಂತರ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗಾತ್ರ ಹೊರಗಿಡುವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (SEC) ಮೂಲಕ ಮತ್ತಷ್ಟು ಭಾಗಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ವಿವಿಧ ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ಸಕ್ಕರೆ ಮಾನೋಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಕ್ಕರೆ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ವಿವಿಧ ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಪಡೆದ ಸಕ್ಕರೆ ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕನಿಷ್ಠ 10-15% ಮತ್ತು 18% ವರೆಗಿನ ಸಕ್ಕರೆ ಇಳುವರಿಯಲ್ಲಿ ಕಡಿತಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. US. ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪಡೆದ ACH ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಅದರ ನಂತರದ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ಈ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಗುಣಲಕ್ಷಣಕ್ಕಾಗಿ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ, ನಿರಂತರ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಜಲವಿಚ್ಛೇದನಗೊಳ್ಳದೆ ಉಳಿದಿವೆ. ಇಲ್ಲಿ (A) ಎಂಬುದು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ವಿಧಾನವಾಗಿದ್ದು, ಇದರಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು AFEX-ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮಾಡಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟವರ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್ (ACSH) ನಿಂದ ಸಕ್ರಿಯ ಇಂಗಾಲ ಮತ್ತು ಡಯಾಟೊಮೇಸಿಯಸ್ ಭೂಮಿಯ ಪ್ಯಾಕ್ಡ್ ಹಾಸಿಗೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ; (B) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ವಿಧಾನ. ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗಾತ್ರ ಹೊರಗಿಡುವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (SEC) ಮೂಲಕ ಮತ್ತಷ್ಟು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು; (C) ವಿವಿಧ ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಮಾನೋಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳು (ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಆಮ್ಲ: DA, ಅಯಾನಿಕ್ ದ್ರವ: IL ಮತ್ತು AFEX). ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು: 25% (w/w) ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ಲೋಡಿಂಗ್ (ಸರಿಸುಮಾರು 8% ಗ್ಲುಕನ್ ಲೋಡಿಂಗ್), 96 ಗಂಟೆಗಳ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ, 20 mg/g ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಲೋಡಿಂಗ್ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ಅನುಪಾತ) ಮತ್ತು (D) AFEX ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮಾಡಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟವರ್ (ACS) ನಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಅರಾಬಿನೋಸ್‌ನ ಸಕ್ಕರೆ ಮಾನೋಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳು.
ಘನ ಜೀವರಾಶಿ ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿನ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ಸಮಗ್ರ ರಚನಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಉಪಯುಕ್ತ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ41 ಏಕೆಂದರೆ ಕಡಿಮೆ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕಾಯ ಸೇರ್ಪಡೆಯ ಮೊದಲು ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಂಧ ಮತ್ತು ಗುಣಲಕ್ಷಣಕ್ಕಾಗಿ, ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕರಗುವ, ಅನುವರ್ತನೆಯಿಲ್ಲದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಲೇಪಿಸಲು ಒಂದು-ಹಂತದ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ನಮ್ಮ ಹಿಂದೆ ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ ACSH ಮತ್ತು ಅದರ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕ (ಅಥವಾ ಪಾಲಿಮರೀಕರಣದ ಮಟ್ಟ, DP) ಆಧರಿಸಿದ ಭಾಗವನ್ನು ಬಳಸಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ನ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ತುದಿಗೆ ಬಯೋಟಿನ್-LC-ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಂಧಿಸುವ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಒಂದು-ಹಂತದ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 2). ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ, ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ತುದಿಯಲ್ಲಿರುವ ಹೆಮಿಯಾಸೆಟಲ್ ಗುಂಪು ಬಯೋಟಿನ್-LC-ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್‌ನ ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್ ಗುಂಪಿನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಿ ಹೈಡ್ರಾಜೋನ್ ಬಂಧವನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ. NaCNBH3 ಎಂಬ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ಏಜೆಂಟ್ ಇರುವಲ್ಲಿ, ಹೈಡ್ರಾಜೋನ್ ಬಂಧವು ಸ್ಥಿರವಾದ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಅಂತಿಮ ಉತ್ಪನ್ನಕ್ಕೆ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ. ಸಕ್ಕರೆ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ತುದಿಯ ಮಾರ್ಪಾಡಿನೊಂದಿಗೆ, ಕಡಿಮೆ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಇದನ್ನು ಗ್ಲೈಕನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ mAbs ಬಳಸಿ ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ELISA ಆಧಾರಿತ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್. ಇಲ್ಲಿ (A) ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್ ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಗ್ಲೈಕನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ mAbs ನೊಂದಿಗೆ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು (B) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್‌ಗಾಗಿ ಒಂದು-ಹಂತದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ನಂತರ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್-ಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಫಲಕಗಳನ್ನು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬೆಳಕು ಮತ್ತು ಸಮಯ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಂಧವು ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಲು TMB ತಲಾಧಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕಾಯ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅಡ್ಡ-ಲಿಂಕಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಬಂಧಕ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ELISA ರೀಡರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕಾವುಕೊಡಲಾದ ಫಲಕಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರಯೋಗದ ವಿವರಗಳು ಮತ್ತು ನಿಯತಾಂಕಗಳಿಗಾಗಿ, ಅನುಗುಣವಾದ ವಿಭಾಗ "ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳು" ನೋಡಿ.
ACSH ನಲ್ಲಿ ಇರುವ ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಹಾಗೂ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಕಚ್ಚಾ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನ್ವಯಿಕೆಗಳಿಗೆ ಈ ಹೊಸದಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ವಿಧಾನದ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ. ಚಿತ್ರ 3 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, ಬಯೋಅಸಿಲೇಟೆಡ್ ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ಅಸ್ಸೇ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ACSH ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್-ಬದಲಿ ಕ್ಸೈಲಾನ್‌ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಯುರೋನಿಕ್ (U) ಅಥವಾ ಮೀಥೈಲ್ಯುರೋನಿಕ್ (MeU) ಮತ್ತು ಪೆಕ್ಟಿಕ್ ಅರಾಬಿನೊಗಲ್ಯಾಕ್ಟನ್‌ಗಳಾಗಿವೆ. ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನವು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡದ ಘನವಸ್ತುಗಳ (UHS) ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕುರಿತು ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬಂದಿವೆ.
ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲಾದ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮರುಕ್ಯಾಲ್ಸಿಟ್ರಾಂಟ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳ ಪತ್ತೆ. "ತಟಸ್ಥ" ಭಾಗವು ACN ಭಾಗವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು "ಆಮ್ಲೀಯ" ಭಾಗವು FA ಭಾಗವಾಗಿದೆ. ಹೀಟ್‌ಮ್ಯಾಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಎಪಿಟೋಪ್ ವಿಷಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ನೀಲಿ ಬಣ್ಣಗಳು ಖಾಲಿ ಹಿನ್ನೆಲೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಮಾಪಕದಲ್ಲಿನ ಬಣ್ಣ ಮೌಲ್ಯಗಳು N=2 ಸೂತ್ರೀಕರಣಗಳಿಗೆ ಕಚ್ಚಾ OD ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿವೆ. ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಮುಖ್ಯ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳನ್ನು ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾದ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ ಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಹೆಮಿಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್‌ಗಳಿಂದ ಸೀಳಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಅವುಗಳ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಗೆ ಹೊಸ ಸಹಾಯಕ ಕಿಣ್ವಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಅಗತ್ಯವಾದ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ಪರಿಕರ ಕಿಣ್ವಗಳಿಲ್ಲದೆ, ಈ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ಬಂಧಗಳು ಅವುಗಳ ಮೂಲ ಸಕ್ಕರೆ ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕ ತುಣುಕುಗಳಾಗಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡಿ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಕರಗಿಸಿದರೂ ಸಹ, ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತವೆ.
ಸಿಗ್ನಲ್ ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಬಂಧಕ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನವು, ಡೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ DP ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಿಗಿಂತ (D, E, F, DP) ಹೆಚ್ಚಿನ DP ಸಕ್ಕರೆ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಲ್ಲಿ (A, B, C, DP 20+ ವರೆಗಿನ) ಬಂಧಿಸುವ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1). ತಟಸ್ಥ ತುಣುಕುಗಳಿಗಿಂತ ಆಮ್ಲ ತುಣುಕುಗಳು ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿದೆ. ಈ ವಿದ್ಯಮಾನಗಳು ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿದ ಮಾದರಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ, ಅಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ DP ಮತ್ತು ಆಮ್ಲ ಅಂಶಗಳು ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚು ನಿರೋಧಕವಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ಗ್ಲೈಕನ್ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ಮತ್ತು U ಮತ್ತು MeU ಪರ್ಯಾಯಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸ್ಥಿರತೆಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ. ಕಡಿಮೆ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪತ್ತೆ ದಕ್ಷತೆಯು ಸಮಸ್ಯಾತ್ಮಕವಾಗಬಹುದು ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಎಪಿಟೋಪ್ ಡೈಮೆರಿಕ್ ಅಥವಾ ಟ್ರಿಮೆರಿಕ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಆಗಿದ್ದರೆ. ವಿಭಿನ್ನ ಉದ್ದಗಳ ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಇದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಬಹುದು, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ mAb ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಒಂದು ಎಪಿಟೋಪ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.
ಹೀಗಾಗಿ, ರಚನೆ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಬಳಕೆಯು ಕೆಲವು ರೀತಿಯ ಮರುಕಳಿಸುವ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಬಳಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಪ್ರಕಾರ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಬಂಧನ ಮಾದರಿ ಮತ್ತು ಅದು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಸಂಕೇತದ ಬಲವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ (ಹೆಚ್ಚು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಹೇರಳವಾಗಿ), ಹೊಸ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಪೂರ್ಣ ಗ್ಲೈಕೋಕನ್ವರ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ ಅರೆ-ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸಬಹುದು. ACSH ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ನಾವು ಪ್ರತಿ ಜೀವರಾಶಿ ವಸ್ತುಗಳಿಗೆ ಗ್ಲೈಕನ್ ಬಂಧಗಳ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದು. ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಗಣನೆಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಬೇಕು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಸಂಬಂಧ ತಿಳಿದಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸುವಾಗ ಇದು ಕೆಲವು ತೊಂದರೆಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಇಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಬೇಕು. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಗ್ಲೈಕನ್ ಬಂಧಗಳ ಹೋಲಿಕೆ ಒಂದೇ ಪ್ರತಿಕಾಯಕ್ಕೆ ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವೆ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು. ನಂತರ ಈ ಮೊಂಡುತನದ ಬಂಧಗಳನ್ನು CAZyme ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಬಹುದು, ಇದರಿಂದ ನಾವು ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು, ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಬಂಧ-ಮುರಿಯುವ ಕಿಣ್ವಗಳಿಗೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಜೈವಿಕ ಸಂಸ್ಕರಣಾಗಾರಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲು ಈ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಬಹುದು.
ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ಕಡಿಮೆ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ರೋಗನಿರೋಧಕ ವಿಧಾನಗಳು ಪರ್ಯಾಯ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಹೇಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಅದೇ ಫಲಕದಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 5) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಾಗದಲ್ಲಿ MALDI (ಚಿತ್ರ 4, S1-S8) ಮತ್ತು GC-MS ಆಧಾರಿತ TMS-ಪಡೆದ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಅಣುಗಳ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ವಿತರಣೆಯು ಉದ್ದೇಶಿತ ರಚನೆಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ಹೋಲಿಸಲು MALDI ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಚಿತ್ರ 4 ರಲ್ಲಿ ACN-A ಮತ್ತು ACN-B ತಟಸ್ಥ ಘಟಕಗಳ MC ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ACN-A ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು DP 4–8 (ಚಿತ್ರ 4) ರಿಂದ DP 22 (ಚಿತ್ರ S1) ವರೆಗಿನ ಪೆಂಟೋಸ್ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು, ಇದರ ತೂಕವು MeU-xylan ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ACN-B ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು DP 8-15 ನೊಂದಿಗೆ ಪೆಂಟೋಸ್ ಮತ್ತು ಗ್ಲುಕೋಕ್ಸಿಲಾನ್ ಸರಣಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು. ಚಿತ್ರ S3 ನಂತಹ ಪೂರಕ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಲ್ಲಿ, FA-C ಆಮ್ಲೀಯ ಅಂಶ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ವಿತರಣಾ ನಕ್ಷೆಗಳು 8-15 DP ಯೊಂದಿಗೆ (Me)U ಬದಲಿ ಪೆಂಟೋಸ್ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ, ಇವು ELISA-ಆಧಾರಿತ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಬದಲಿ ಕ್ಸೈಲಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ.
ACS ನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಅನುವರ್ತನಾಶೀಲವಲ್ಲದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ MALDI-MS ವರ್ಣಪಟಲ. ಇಲ್ಲಿ, (A) ಮೀಥೈಲೇಟೆಡ್ ಯುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ACN-A ಕಡಿಮೆ ತೂಕದ ಶ್ರೇಣಿಯ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳು (DP 4-8) ಗ್ಲುಕುರಾಕ್ಸಿಲಾನ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬದಲಿಸಿದವು ಮತ್ತು (B) ACN-B ಕ್ಸೈಲಾನ್ ಮತ್ತು ಮೀಥೈಲೇಟೆಡ್ ಯುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ಲುಕುರಾಕ್ಸಿಲಾನ್ (DP 8-15) ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಿಸಲಾಯಿತು.
ವಕ್ರೀಕಾರಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಗ್ಲೈಕನ್ ಅವಶೇಷದ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಇಲ್ಲಿ (ಎ) ಜಿಸಿ-ಎಂಎಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಡೆದ ವಿವಿಧ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳ ಟಿಎಂಎಸ್ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಯೋಜನೆ. (ಬಿ) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ವಿವಿಧ ಟಿಎಂಎಸ್-ಪಡೆದ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ರಚನೆಗಳು. ಎಸಿಎನ್ - ತಟಸ್ಥ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿ ಮತ್ತು ಎಫ್‌ಎ - ಆಮ್ಲ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಫೆರುಲಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಭಿನ್ನರಾಶಿ.
ಚಿತ್ರ S9 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಾಗದ LC-MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಮತ್ತೊಂದು ಕುತೂಹಲಕಾರಿ ತೀರ್ಮಾನವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ (ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್ ಪೂರಕ ವಸ್ತುವಿನಲ್ಲಿ ಕಾಣಬಹುದು). ACN-B ಭಾಗದ ಬಂಧನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೆಕ್ಸೋಸ್ ಮತ್ತು -OAc ಗುಂಪುಗಳ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಪದೇ ಪದೇ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ಮತ್ತು MALDI-TOF ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ವಿಘಟನೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುವುದಲ್ಲದೆ, ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಹೊಸ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
TMS ಸಕ್ಕರೆ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಾವು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಾಗದ ಸಕ್ಕರೆ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. GC-MS ಬಳಸಿ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಾಗದಲ್ಲಿ ನರ (ಉತ್ಪನ್ನವಲ್ಲದ) ಮತ್ತು ಆಮ್ಲೀಯ ಸಕ್ಕರೆಗಳ (GluA ಮತ್ತು GalA) ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 5). ಗ್ಲುಕುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲವು ಆಮ್ಲೀಯ ಘಟಕಗಳಾದ C ಮತ್ತು D ಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಗ್ಯಾಲಕ್ಟುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲವು ಆಮ್ಲೀಯ ಘಟಕಗಳಾದ A ಮತ್ತು B ಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, ಇವೆರಡೂ ಆಮ್ಲೀಯ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ DP ಘಟಕಗಳಾಗಿವೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ನಮ್ಮ ELISA ಮತ್ತು MALDI ಡೇಟಾವನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುವುದಲ್ಲದೆ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಹ ಸ್ಥಿರವಾಗಿವೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಆಧುನಿಕ ರೋಗನಿರೋಧಕ ವಿಧಾನಗಳು ವಿವಿಧ ಜೈವಿಕ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಮರುಕ್ಯಾಲ್ಸಿಟ್ರಾಂಟ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಂಬುತ್ತೇವೆ.
ELISA-ಆಧಾರಿತ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಹಲವಾರು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಈ ಹೊಸ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನದ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ನಾವು ಮತ್ತಷ್ಟು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು ಬಯಸಿದ್ದೇವೆ. ಎರಡು ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು, ಕ್ಸೈಲೋಹೆಕ್ಸಾಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ (XHE) ಮತ್ತು 23-α-L-ಅರಾಬಿನೋಫ್ಯೂರಾನೋಸಿಲ್-ಕ್ಸೈಲೋಟ್ರಿಯೋಸ್ (A2XX), ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕನ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡು ಹೊಸ mAb ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಖರೀದಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಚಿತ್ರ 6 ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಿಗ್ನಲ್ ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಲಾಗ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ನಡುವಿನ ರೇಖೀಯ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಂಭವನೀಯ ಲ್ಯಾಂಗ್ಮುಯಿರ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. mAbs ನಲ್ಲಿ, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ಮತ್ತು CCRC-M151 XHE ನೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ, ಮತ್ತು CCRC-M108, CCRC-M109, ಮತ್ತು LM11 1 nm ನಿಂದ 100 ನ್ಯಾನೊ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ A2XX ನೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ. ಪ್ರಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸೀಮಿತ ಲಭ್ಯತೆಯಿಂದಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಸೀಮಿತ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಕೆಲವು ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ತಲಾಧಾರದಂತೆಯೇ ಅದೇ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗೆ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಇಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಬೇಕು, ಬಹುಶಃ ಅವು ಸ್ವಲ್ಪ ವಿಭಿನ್ನ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಬಂಧಕ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು. ಹೊಸ mAb ವಿಧಾನವನ್ನು ನೈಜ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಿದಾಗ ನಿಖರವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗುತ್ತವೆ.
ವಿವಿಧ ಗ್ಲೈಕನ್-ಗುರಿ mAbs ಗಳ ಪತ್ತೆ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಎರಡು ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಇಲ್ಲಿ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಲಾಗ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ರೇಖೀಯ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳು (A) XHE ಗಾಗಿ mAb ನೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತು (B) A2XX ಗಾಗಿ mAb ನೊಂದಿಗೆ ಲ್ಯಾಂಗ್ಮುಯಿರ್ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಅನುಗುಣವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ತಲಾಧಾರಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಗ್ಲೈಕನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ ಮಾನೋಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಬಳಕೆ (ಗ್ಲೈಕೋಕೊಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಅಥವಾ ELISA-ಆಧಾರಿತ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್) ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮುಖ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ಆಳವಾದ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಒಂದು ಪ್ರಬಲ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಗ್ಲೈಕನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ದೊಡ್ಡ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ನಿರೂಪಿಸುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ನಿಶ್ಚಲವಾಗುವುದಿಲ್ಲ. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, AFEX-ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮಾಡಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವಕವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಮರುಕ್ಯಾಲ್ಸಿಟ್ರಾಂಟ್ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಸಕ್ಕರೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಸಣ್ಣ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ mAb ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಲು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಉಪಕರಣಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್™ ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಷನ್ ನಂತರ ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಒಂದು ನವೀನ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ನಿಶ್ಚಲೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಿದ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಪ್ರತಿಕಾಯಕ್ಕೆ ಸಾಕಷ್ಟು ಸಂಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ, ಇದು ಮರುಕ್ಯಾಲ್ಸಿಟ್ರಾಂಟ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ತ್ವರಿತ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಈ ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗೆ ಈ ಹೊಸ ವಿಧಾನದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು. ಹೀಗಾಗಿ, ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವ ಇತರ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
ಈ ಬಯೋಟಿನ್-ಆಧಾರಿತ ಗ್ಲೈಕನ್ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನವು ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಮರುಕ್ಯಾಲ್ಸಿಟ್ರಂಟ್ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ಮೊದಲ ವರದಿಯಾಗಿದೆ. ಜೈವಿಕ ಇಂಧನ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಬಂದಾಗ ಜೀವರಾಶಿಯ ಕೆಲವು ಭಾಗಗಳು ಏಕೆ ತುಂಬಾ ಮೊಂಡುತನದಿಂದ ಕೂಡಿರುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಇದು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಈ ವಿಧಾನವು ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿನ ಪ್ರಮುಖ ಅಂತರವನ್ನು ತುಂಬುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಸ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮೀರಿ ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ತಲಾಧಾರಗಳಿಗೆ ಅದರ ಅನ್ವಯವನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತದೆ. ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಬಯೋಟೈನೈಲೇಷನ್‌ಗಾಗಿ ರೊಬೊಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು ಮತ್ತು ELISA ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾದರಿಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೂಪುಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ನಾವು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.
ಪಯೋನೀರ್ 33A14 ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಬೀಜಗಳಿಂದ ಬೆಳೆದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟ್ರಾ (CS) ಅನ್ನು 2010 ರಲ್ಲಿ ಕೊಲೊರಾಡೋದ ರೇಯಲ್ಲಿರುವ ಕ್ರೇಮರ್ ಫಾರ್ಮ್ಸ್‌ನಿಂದ ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಭೂಮಾಲೀಕರ ಅನುಮತಿಯೊಂದಿಗೆ, ಈ ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ಸಂಶೋಧನೆಗೆ ಬಳಸಬಹುದು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಜಿಪ್-ಲಾಕ್ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ 6% ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ತೇವಾಂಶದೊಂದಿಗೆ ಒಣಗಿಸಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಜಿಪ್-ಲಾಕ್ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ 6% ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ತೇವಾಂಶದೊಂದಿಗೆ ಒಣಗಿಸಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಒಬ್ರಝಿ ಹ್ಯಾಂಡ್ಸ್ ಸುಚಿಮಿ ಪ್ರೀ ವ್ಲಾಗ್ನೋಸ್ಟಿ < 6% ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಜಿಪ್ಪರ್ ಮಾಡಿದ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ <6% ಆರ್ದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ಒಬ್ರಝಿ ಹ್ಯಾಂಡ್ ವ್ ಪ್ಯಾಕೆಟಚ್ಸ್ ಸೆಸ್ಟೇಜ್ಕೊಯ್-ಮಾಲ್ನಿಯೆಯ್ ಪ್ರಿ ಕಾಮ್ನಟ್ನೋಯ್ ಟೆಂಪರಟುರೆಸ್ ವ್ಲಾಗ್ನೋಸ್ಟ್ಯೂರ್ < 6%. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಝಿಪ್ಪರ್ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 6% ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಆರ್ದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನವು ಸ್ಥಳೀಯ ಮತ್ತು ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿದೆ. NREL ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಬಳಸಿ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ 31.4% ಗ್ಲುಕನ್, 18.7% ಕ್ಸೈಲಾನ್, 3.3% ಅರಾಬಿನಾನ್, 1.2% ಗ್ಯಾಲಕ್ಟಾನ್, 2.2% ಅಸಿಟೈಲ್, 14.3% ಲಿಗ್ನಿನ್, 1.7% ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು 13. 4% ಬೂದಿ ಇರುವುದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ.
ಸೆಲಿಕ್® CTec2 (138 ಮಿಗ್ರಾಂ ಪ್ರೋಟೀನ್/ಮಿಲಿ, ಲಾಟ್ VCNI 0001) ನೊವೊಜೈಮ್‌ಗಳಿಂದ (ಫ್ರಾಂಕ್ಲಿಂಟನ್, NC, USA) ಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್, β-ಗ್ಲುಕೋಸಿಡೇಸ್ ಮತ್ತು ಸೆಲಿಕ್® HTec2 (157 ಮಿಗ್ರಾಂ ಪ್ರೋಟೀನ್/ಮಿಲಿ, ಲಾಟ್ VHN00001) ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣವಾಗಿದೆ. ಪೆಕ್ಟಿನ್ ಅನ್ನು ಕೆಡಿಸುವ ಕಿಣ್ವಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣವಾದ ಮಲ್ಟಿಫೆಕ್ಟ್ ಪೆಕ್ಟಿನೇಸ್® (72 ಮಿಗ್ರಾಂ ಪ್ರೋಟೀನ್/ಮಿಲಿ) ಅನ್ನು ಡುಪಾಂಟ್ ಇಂಡಸ್ಟ್ರಿಯಲ್ ಬಯೋಸೈನ್ಸಸ್ (ಪಾಲೊ ಆಲ್ಟೊ, CA, USA) ದಾನ ಮಾಡಿದೆ. ಕೆಜೆಲ್ಡಾಲ್ ಸಾರಜನಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಂಶವನ್ನು ಅಂದಾಜು ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ (ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಲ್ಲದ ಸಾರಜನಕದ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ಕಳೆಯುವ ಮೂಲಕ) ಕಿಣ್ವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (AOAC ವಿಧಾನ 2001.11, ಡೈರಿ ಒನ್ ಕೋಆಪರೇಟಿವ್ ಇಂಕ್., ಇಥಾಕಾ, NY, USA). ಡಯಾಟೊಮೇಸಿಯಸ್ ಅರ್ಥ್ 545 ಅನ್ನು EMD ಮಿಲಿಪೋರ್ (ಬಿಲ್ಲೆರಿಕಾ, MA) ನಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಕ್ರಿಯ ಇಂಗಾಲ (ಡಾರ್ಕೊ, 100 ಮೆಶ್ ಗ್ರ್ಯಾನ್ಯೂಲ್‌ಗಳು), ಅವಿಸೆಲ್ (PH-101), ಬೀಚ್ ಕ್ಸೈಲಾನ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಎಲ್ಲಾ ರಾಸಾಯನಿಕಗಳನ್ನು ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್ (ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO) ನಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.
AFEX ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು GLBRC (ಬಯೋಮಾಸ್ ಕನ್ವರ್ಷನ್ ರಿಸರ್ಚ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರಿ, MSU, ಲ್ಯಾನ್ಸಿಂಗ್, MI, USA) ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು 140°C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಬೆಂಚ್‌ಟಾಪ್ ಬ್ಯಾಚ್ ರಿಯಾಕ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಪಾರ್ ಇನ್ಸ್ಟ್ರುಮೆಂಟ್ಸ್ ಕಂಪನಿ) 60% (w/w) ಲೋಡ್ ಆಗುವಾಗ ಜಲರಹಿತ ಅಮೋನಿಯ ಮತ್ತು ಜೀವರಾಶಿಯ 1:1 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ 46 ನಿವಾಸ ಸಮಯ. ಇದು 30 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಂಡಿತು. ರಿಯಾಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು 140°C ಗೆ ತರಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಮೋನಿಯಾವನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಜೀವರಾಶಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮರಳಲು ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು. AFEX ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮಾಡಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೌವರ್ (ACS) ನ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಸಂಸ್ಕರಿಸದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೌವರ್ (UT-CS) ನಂತೆಯೇ ಇತ್ತು.
ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳಾದ ACSH 25% (w/w) (ಸರಿಸುಮಾರು 8% ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್ ಲೋಡಿಂಗ್) ಅನ್ನು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. ACS ನ ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನವನ್ನು Cellic® Ctec2 10 mg ಪ್ರೋಟೀನ್/g ಗ್ಲುಕನ್ (ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ), Htec2 (ನೊವೊಜೈಮ್‌ಗಳು, ಫ್ರಾಂಕ್ಲಿನ್ಟನ್, NC), 5 mg ಪ್ರೋಟೀನ್/g ಗ್ಲುಕನ್, ಮತ್ತು ಮಲ್ಟಿಫೆಕ್ಟ್ ಪೆಕ್ಟಿನೇಸ್ (ಜೆನೆನ್ಕಾರ್ ಇಂಕ್, USA) ಸೇರಿದಂತೆ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ), 5 mg ಪ್ರೋಟೀನ್/g ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್. 3 ಲೀಟರ್, pH 4.8, 50°C ಮತ್ತು 250 rpm ನ ಕೆಲಸದ ಪರಿಮಾಣದೊಂದಿಗೆ 5-ಲೀಟರ್ ಜೈವಿಕ ರಿಯಾಕ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 96 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ, ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ ಅನ್ನು 6000 rpm ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ನಂತರ 14000 rpm ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡದ ಘನವಸ್ತುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ ಅನ್ನು 0.22 ಎಂಎಂ ಫಿಲ್ಟರ್ ಬೀಕರ್ ಮೂಲಕ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಶೋಧನೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ ಅನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಬಾಟಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ, ನಂತರ ಇಂಗಾಲದ ಮೇಲೆ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು.
NREL ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಸಾರ-ಆಧಾರಿತ ಜೀವರಾಶಿ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ: ಸಂಯೋಜನೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮಾದರಿಗಳ ತಯಾರಿಕೆ (NREL/TP-510-42620) ಮತ್ತು ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ ರಚನಾತ್ಮಕ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಲಿಗ್ನಿನ್‌ನ ನಿರ್ಣಯ (NREL/TP-510 – 42618)47.
ಆಟೋಕ್ಲೇವ್-ಆಧಾರಿತ ಆಮ್ಲ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 2 ಮಿಲಿ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ ಸ್ಟ್ರೀಮ್‌ನ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 10 ಮಿಲಿ ಸ್ಕ್ರೂ ಕ್ಯಾಪ್ ಕಲ್ಚರ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು 72% ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದ 69.7 µl ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಿ 121 °C ನಲ್ಲಿ ಬೆಂಚ್‌ಟಾಪ್‌ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ತಂಪಾಗಿಸಿ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯ ದ್ರವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (HPLC) ಸೀಸೆಗೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆಮ್ಲ-ಹೈಡ್ರೊಲೈಜ್ ಮಾಡದ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಒಟ್ಟು ಸಕ್ಕರೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯಿಂದ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜ್ ಮಾಡದ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಕಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಬಯೋ-ರಾಡ್ ಅಮಿನೆಕ್ಸ್ HPX-87H ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಆಟೋಸ್ಯಾಂಪ್ಲರ್, ಕಾಲಮ್ ಹೀಟರ್, ಐಸೋಕ್ರಟಿಕ್ ಪಂಪ್ ಮತ್ತು ವಕ್ರೀಭವನ ಸೂಚ್ಯಂಕ ಪತ್ತೆಕಾರಕವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಶಿಮಾಡ್ಜು HPLC ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಆಮ್ಲ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಬಯೋಮಾಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಅರಾಬಿನೋಸ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 50°C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 0.6 ಮಿಲಿ/ನಿಮಿಷ 5 mM H2SO4 ನೀರಿನ ಹರಿವಿನೊಂದಿಗೆ ಹೊರತೆಗೆದರು.
ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೇಟ್ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಮಾನೋಮರ್ ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಅಂಶಕ್ಕಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ ಪಡೆದ ಮಾನೋಮೆರಿಕ್ ಸಕ್ಕರೆಗಳನ್ನು ಬಯೋ-ರಾಡ್ (ಹರ್ಕ್ಯುಲಸ್, CA) ಅಮಿನೆಕ್ಸ್ HPX-87P ಕಾಲಮ್ ಮತ್ತು ಬೂದಿ ಗಾರ್ಡ್ ಕಾಲಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಜ್ಜುಗೊಳಿಸಿದ HPLC ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿತು. ಕಾಲಮ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 80°C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು, ನೀರನ್ನು 0.6 ಮಿಲಿ/ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದೊಂದಿಗೆ ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಉಲ್ಲೇಖಗಳಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ 121°C ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಮೂಲಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. 41, 48, 49.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು 27, 43, 50, 51 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕಚ್ಚಾ, AFEX ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಜಲವಿಚ್ಛೇದಿತವಲ್ಲದ ಜೀವರಾಶಿ ಅವಶೇಷಗಳ ಮೇಲೆ (ಸರಣಿ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಸಾರಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಸೇರಿದಂತೆ) ಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ವಸ್ತುವಿನ ಆಲ್ಕೋಹಾಲ್-ಕರಗದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಜೀವರಾಶಿ ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಮೋನಿಯಂ ಆಕ್ಸಲೇಟ್ (50 mM), ಸೋಡಿಯಂ ಕಾರ್ಬೋನೇಟ್ (50 mM ಮತ್ತು 0.5% w/v), CON. (1M ಮತ್ತು 4M, ಎರಡೂ 1% w/v ಸೋಡಿಯಂ ಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ) ಮತ್ತು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಆಮ್ಲ ಕ್ಲೋರೈಟ್‌ನಂತಹ ಹೆಚ್ಚು ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ ಕಾರಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಸರಣಿ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ52,53. ನಂತರ ಸಾರಗಳನ್ನು ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲಾದ mAb50 ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಫಲಕದ ವಿರುದ್ಧ ELISA ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು mAb ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಯಾಗಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡು mAb ಗಳನ್ನು ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದ ಸ್ಟಾಕ್‌ಗಳಿಂದ (CCRC, JIM ಮತ್ತು MAC ಸರಣಿ) ಖರೀದಿಸಲಾಯಿತು.
ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಒಂದು ಹಂತದ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಷನ್. ಬಯೋಟಿನ್-LC-ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಗವನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಬಯೋಟಿನ್-LC-ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್ (4.6 mg/12 μmol) ಅನ್ನು ಡೈಮೀಥೈಲ್ ಸಲ್ಫಾಕ್ಸೈಡ್ (DMSO, 70 μl) ನಲ್ಲಿ 65° C ನಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷ ತೀವ್ರವಾಗಿ ಬೆರೆಸಿ ಬಿಸಿ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು. ಗ್ಲೇಶಿಯಲ್ ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು (30 µl) ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸೋಡಿಯಂ ಸೈನೊಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್ (6.4 mg/100 µmol) ಮೇಲೆ ಸುರಿಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸುಮಾರು 1 ನಿಮಿಷ 65° C ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ, ಒಣಗಿದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ (1-100 nmol) ಗೆ 5 ರಿಂದ 8 μl ವರೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಲೇಬಲ್‌ನ 10 ಪಟ್ಟು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೋಲಾರ್ ಹೆಚ್ಚುವರಿಯನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು 65°C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿತವಿಲ್ಲದೆ ಸೋಡಿಯಂ ಸೈನೊಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 65°C ನಲ್ಲಿ 2.5 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲಾಯಿತು.
ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ELISA ಲೇಪನ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯುವುದು. ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ತಟ್ಟೆಯ ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 25 μl ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (0.1 M ಟ್ರಿಸ್ ಬಫರ್ ದ್ರಾವಣದ (TBS) 5 ಮಿಲಿಯಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಪ್ರತಿ ಸಾಂದ್ರೀಕೃತ ಮಾದರಿಯ 100 μl) ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ನಿಯಂತ್ರಣ ಬಾವಿಗಳನ್ನು 0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 10 μg/ml ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 50 μl ಬಯೋಟಿನ್‌ನಿಂದ ಲೇಪಿಸಲಾಯಿತು. ಖಾಲಿ ಅಳತೆಗಳಿಗಾಗಿ ಅಯಾನೀಕರಿಸಿದ ನೀರನ್ನು ಲೇಪನವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಟ್ಯಾಬ್ಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಗ್ರೆನಿಯರ್ ಫ್ಲಾಟ್ 3A ಗಾಗಿ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಸಂಖ್ಯೆ 11 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಕೆನೆ ತೆಗೆದ ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ.
ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸೇರ್ಪಡೆ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯುವಿಕೆ. ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 40 µl ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ. ನಂತರ ಗ್ರೆನಿಯರ್ ಫ್ಲಾಟ್ 3A ಗಾಗಿ ವಾಶ್ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ #11 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 0.1M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯಿರಿ. ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 50 µl ಇಲಿ/ಇಲಿ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು (0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ 1:5000 ರಷ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ) ಸೇರಿಸಿ. ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ. ನಂತರ ಗ್ರೆನಿಯರ್ ಫ್ಲಾಟ್ 5A ಪ್ಲೇಟ್ ವಾಶ್ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ #12 ಬಳಸಿ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ 5 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ತಲಾಧಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು. 3,3′,5,5′-ಟೆಟ್ರಾಮೀಥೈಲ್‌ಬೆನ್ಜಿಡಿನ್ (TMB) ನ 50 µl ಅನ್ನು ಬೇಸ್ ತಲಾಧಾರಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಿ (15 ಮಿಲಿ ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿಗೆ 2 ಹನಿ ಬಫರ್, 3 ಹನಿ TMB, 2 ಹನಿ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ). TMB ತಲಾಧಾರವನ್ನು ತಯಾರಿಸಿ. ಮತ್ತು ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು ಸುಳಿಯನ್ನು ಹಾಕಿ). ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಬೇಕು. ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ.
ಹಂತವನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಟ್ಯಾಬ್ಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಓದಿ. ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 50 µl 1 N ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ELISA ರೀಡರ್ ಬಳಸಿ 450 ರಿಂದ 655 nm ವರೆಗಿನ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಿ.
ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಕಗಳ 1 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಮಿಲಿ ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು ಅಯಾನೀಕರಿಸಿದ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ತಯಾರಿಸಿ: ಅರಾಬಿನೋಸ್, ರಾಮ್ನೋಸ್, ಫ್ಯೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್, ಗ್ಯಾಲಕ್ಟುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (ಗ್ಯಾಲ್ಎ), ಗ್ಲುಕುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (ಗ್ಲ್ಕಎ), ಮನ್ನೋಸ್, ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್, ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್, ಎನ್-ಅಸಿಟೈಲ್ಮನ್ನೋಸಮೈನ್ (ಮ್ಯಾನ್ಎನ್ಎಸಿ), ಎನ್-ಅಸಿಟೈಲ್ಗ್ಲುಕೋಸಮೈನ್. (ಗ್ಲ್ಕಎನ್ಎಸಿ), ಎನ್-ಅಸಿಟೈಲ್ಗ್ಲುಕೋಸಮೈನ್ (ಗ್ಯಾಲ್ಎನ್ಎಸಿ), ಇನೋಸಿಟಾಲ್ (ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡ). ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ 1 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಮಿಲಿ ಸಕ್ಕರೆ ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಎರಡು ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ನೀರನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವವರೆಗೆ (ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸುಮಾರು 12-18 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ) ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಿ -80°C ನಲ್ಲಿ ಲೈಯೋಫಿಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ ಸಮತೋಲನದಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ರೂ ಕ್ಯಾಪ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಿಗೆ 100–500 µg ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಸೇರಿಸಿದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ದಾಖಲಿಸಿ. ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ದ್ರಾವಕದಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಿ ದ್ರವದ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸುವುದು ಉತ್ತಮ. ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡವಾಗಿ 1 mg/ml ಇನೋಸಿಟಾಲ್‌ನ 20 µl ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಮಾದರಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡದ ಪ್ರಮಾಣವು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡದ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಸಮನಾಗಿರಬೇಕು.
ಸ್ಕ್ರೂ ಕ್ಯಾಪ್ ಸೀಸೆಗೆ 8 ಮಿಲಿ ಅನ್‌ಹೈಡ್ರಸ್ ಮೆಥನಾಲ್ ಸೇರಿಸಿ. ನಂತರ 3 N. ಮೆಥನಾಲಿಕ್ HCl ದ್ರಾವಣದ 4 ಮಿಲಿಯನ್ನು ಮುಚ್ಚಿ ಅಲ್ಲಾಡಿಸಿ. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ನೀರನ್ನು ಬಳಸುವುದಿಲ್ಲ.
ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ TMS ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಿಗೆ 500 µl 1 M HCl ಮೆಥನಾಲ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ (168 ಗಂಟೆಗಳು) 80° C ನಲ್ಲಿ ಉಷ್ಣ ಬ್ಲಾಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಒಣಗಿಸುವ ಮ್ಯಾನಿಫೋಲ್ಡ್ ಬಳಸಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಮೆಥನಾಲಿಸಿಸ್ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಒಣಗಿಸಿ. 200 µl MeOH ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮತ್ತೆ ಒಣಗಿಸಿ. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿಗೆ 200 µl ಮೆಥನಾಲ್, 100 µl ಪಿರಿಡಿನ್ ಮತ್ತು 100 µl ಅಸಿಟಿಕ್ ಅನ್ಹೈಡ್ರೈಡ್ ಸೇರಿಸಿ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಮತ್ತು ಒಣಗಿಸಿ. 200 µl ಮೆಥನಾಲ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮತ್ತೆ ಒಣಗಿಸಿ.
200 µl ಟ್ರೈ-ಸಿಲ್ ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮುಚ್ಚಿದ ಟ್ಯೂಬ್ ಅನ್ನು ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ. 80°C ಗೆ, ನಂತರ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ತಣ್ಣಗಾಗಿಸಿ. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸುಮಾರು 50 µl ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಒಣಗಿಸಲು ಒಣಗಿಸುವ ಮ್ಯಾನಿಫೋಲ್ಡ್ ಬಳಸಿ. ಮಾದರಿಗಳು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಒಣಗಲು ನಾವು ಅನುಮತಿಸಲಿಲ್ಲ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯ.
2 ಮಿಲಿ ಹೆಕ್ಸೇನ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ವೋರ್ಟೆಕ್ಸಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ. 5-3/4 ಇಂಚು ವ್ಯಾಸದ ಪೈಪೆಟ್‌ನ ಮೇಲೆ ಗಾಜಿನ ಉಣ್ಣೆಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪಾಶ್ಚರ್ ಪೈಪೆಟ್‌ಗಳ (5-8 ಮಿಮೀ) ತುದಿಗಳನ್ನು ಗಾಜಿನ ಉಣ್ಣೆಯ ತುಂಡಿನಿಂದ ತುಂಬಿಸಿ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 3000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಯಾವುದೇ ಕರಗದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿಯನ್ನು 100-150 µl ಗೆ ಒಣಗಿಸಿ. ಸರಿಸುಮಾರು 1 μl ಪರಿಮಾಣವನ್ನು GC-MS ಗೆ 80 °C ಆರಂಭಿಕ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು 2.0 ನಿಮಿಷಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು (ಕೋಷ್ಟಕ 2).