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인간 장 형태발생은 3차원 상피 미세구조와 공간적 구성의 융모-융모 특징을 확립합니다. 이 독특한 구조는 기저 융모의 줄기세포 니치를 외인성 미생물 항원과 그 대사산물로부터 보호함으로써 장 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 또한, 장 융모와 분비 점액은 기능적으로 분화된 상피 세포에게 장 점막 표면에 보호 장벽을 제공합니다. 따라서 3차원 상피 구조 재현은 시험관 내 장 모델 구축에 매우 중요합니다. 특히, 유기 모방 장 칩은 향상된 생리적 기능과 생체역학을 통해 장 상피의 자발적인 3차원 형태발생을 유도할 수 있습니다. 본 연구에서는 미세유체 칩과 Transwell 임베디드 하이브리드 칩에서 장의 장 형태발생을 강력하게 유도하는 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 또한, Caco-2 또는 장 오가노이드 상피 세포의 소자 제작 및 배양 방법을 상세히 기술합니다. 기존 환경뿐만 아니라 미세유체 플랫폼에서도 3D 형태형성을 유도하고 다양한 영상 방식을 사용하여 확립된 3D 상피를 특성화합니다. 이 프로토콜은 5일 동안 기저외측 유체 흐름을 제어하여 기능적 장 미세구조를 재생합니다. 저희의 시험관 내 형태형성 방법은 생리학적으로 관련된 전단 응력과 기계적 운동을 사용하며 복잡한 세포 공학이나 조작이 필요하지 않아 기존의 다른 기술보다 성능이 우수할 수 있습니다. 저희는 제안된 프로토콜이 생의학 연구 커뮤니티에 광범위한 영향을 미쳐 생의학, 임상 및 제약 분야에 적용하기 위해 시험관 내에서 3D 장 상피층을 재생하는 방법을 제공할 수 있을 것으로 예상합니다.
실험에 따르면 칩상 장1,2,3,4,5 또는 이중층 미세유체 장치6,7에서 배양된 장 상피 Caco-2 세포는 기저 메커니즘을 명확히 이해하지 못한 채 시험관 내에서 자발적으로 3차원 형태형성을 겪을 수 있습니다. 최근 연구에서 우리는 배양 장치에서 기저측면으로 분비되는 형태형성 길항제를 제거하는 것이 시험관 내에서 3차원 상피 형태형성을 유도하는 데 필요하고 충분하다는 것을 발견했으며, 이는 Caco-2와 환자 유래 장 기관체를 통해 입증되었습니다. 상피 세포가 검증되었습니다.이 연구에서 우리는 특히 장내 칩과 "하이브리드 칩"이라고 불리는 Transwell 인서트를 포함하는 변형된 미세유체 장치에서 강력한 Wnt 길항제인 Dickkopf-1(DKK-1)의 세포 생성 및 농도 분포에 초점을 맞췄습니다.우리는 칩상 장에 외인성 Wnt 길항제(예: DKK-1, Wnt 억제자 1, 분비된 frizzled 관련 단백질 1 또는 Soggy-1)를 추가하면 형태 발생이 억제되거나 사전 구조화된 3D 상피층이 파괴되어 배양 중 길항적 스트레스가 시험관 내 장 형태 발생에 책임이 있음을 시사합니다.따라서 상피 계면에서 강력한 형태 발생을 달성하기 위한 실용적인 접근 방식은 활성 세척(예: 장내 칩 또는 하이브리드 온 칩 플랫폼)을 통해 기저외측 구획에서 Wnt 길항제 수준을 제거하거나 최소한으로 유지하는 것입니다. 확산.기저측 매체(예: 웰의 대형 기저측 저장소로의 Transwell 삽입물에서).
이 프로토콜에서는 장 상피 세포를 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 다공성 막(단계 6A, 7A, 8, 9) 또는 Transwell 삽입물의 폴리에스터 막(단계 6B, 7B, 8, 9)에서 배양하고 시험관 내에서 3D 형태 발생을 유도하기 위해 장상피 마이크로 장치와 Transwell 삽입형 하이브리드 칩(단계 1-5)을 제작하는 자세한 방법을 제공합니다(단계 10). 또한 여러 이미징 방식을 적용하여 조직 특이적 조직 발생 및 계통 의존적 세포 분화를 나타내는 세포 및 분자적 특징을 식별했습니다(단계 11-24). Caco-2 또는 장 기관체와 같은 인간 장 상피 세포를 두 가지 배양 형식으로 사용하여 형태 발생을 유도합니다. 다공성 막의 표면 개질, 2D 단층 생성, 장 생화학 및 생체 역학의 재생산을 포함한 기술적 세부 사항 미세환경.시험관 내.2D 상피 단층에서 3D 형태발생을 유도하기 위해, 배양액의 기저외측 구획으로 배지를 흘려보내어 두 배양 형태 모두에서 형태발생제 길항제를 제거했습니다.마지막으로, 형태발생제 의존성 상피 성장, 종단적 숙주-미생물군 공동 배양, 병원체 감염, 염증성 손상, 상피 장벽 기능 장애 및 프로바이오틱스 기반 치료법을 모델링하는 데 사용할 수 있는 재생 가능한 3D 상피층의 유용성에 대한 표현을 제공합니다.예.영향.
우리 프로토콜은 기초 연구(예: 장 점막 생물학, 줄기 세포 생물학, 발생 생물학)와 응용 연구(예: 임상 전 약물 테스트, 질병 모델링, 조직 공학, 위장병학)에 종사하는 다양한 과학자에게 유용할 수 있습니다. 우리 프로토콜은 시험관 내에서 장 상피의 3D 형태 발생을 유도하는 재현성과 견고성을 갖추고 있기 때문에 장 발달, 재생 또는 항상성 동안 세포 신호 전달의 역학을 연구하는 대상에게 기술 전략을 전파할 수 있을 것으로 예상합니다. 또한 우리 프로토콜은 노로바이러스 8, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2), 클로스트리디움 디피실리, 살모넬라 티피무리움 9 또는 비브리오 콜레라와 같은 다양한 감염원에 의한 감염을 조사하는 데 유용합니다. 질병 병리학 및 병인학의 대상자도 유용합니다.온칩 장 미세생리학 시스템을 사용하면 세로 공동 배양 10과 이후 위장관(GI)관 11에서 숙주 방어, 면역 반응 및 병원체 관련 손상 복구에 대한 평가가 가능합니다.누출성 장 증후군, 셀리악병, 크론병, 궤양성 대장염, 낭염 또는 과민성 대장 증후군과 관련된 기타 GI 장애는 환자의 3D 장 상피층을 사용하여 3D 장 상피층을 준비할 때 시뮬레이션할 수 있습니다.이러한 질병에는 융모 위축, 융모 단축, 점막 손상 또는 손상된 상피 장벽이 포함됩니다.생검 또는 줄기 세포 유래 장 기관체 12,13.질병 환경의 더 높은 복잡성을 더 잘 모델링하기 위해 독자는 3D 장 기관을 포함하는 모델에 환자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 질병 관련 세포 유형을 추가하는 것을 고려할 수 있습니다. 융모-함몰 미세구조. 조직 특이적 면역 세포, 5.
3차원 상피 미세구조는 절편 과정 없이 고정 및 시각화할 수 있으므로, 공간 전사체학 및 고해상도 또는 초고해상도 이미징을 연구하는 연구자들은 상피 니치(niche)에서 유전자와 단백질의 시공간적 동역학을 매핑하는 연구에 관심을 가질 수 있습니다. 기술에 관심이 있습니다. 미생물 또는 면역 자극에 대한 반응. 또한, 장내 항상성을 조정하는 종단적 숙주-미생물군집 교차결합(longitudinal host-microbiome crosstalk) 10, 14 은 특히 장내 칩(gut-on-a-chip)에서 다양한 미생물 종, 미생물 군집 또는 분변 미생물총을 공동 배양함으로써 3차원 장 점막층에서 확립될 수 있습니다. 플랫폼에서.이 접근 방식은 실험실에서 이전에 배양되지 않은 장내 미생물을 배양하려는 점막 면역학, 위장병학, 인간 미생물 군집, 배양체학 및 임상 미생물학을 연구하는 대상에게 특히 매력적입니다.우리의 시험관 내 형태 형성 프로토콜이 기저외측 구획을 지속적으로 보충하는 24, 96 또는 384 웰 플레이트의 멀티웰 인서트와 같은 확장 가능한 배양 형식에 적용될 수 있다면 이 프로토콜은 제약, 생물 의학 또는 식품 산업을 위한 고처리량 스크리닝 또는 검증 플랫폼을 개발하는 사람들에게도 보급될 수 있습니다.원리 증명으로서, 우리는 최근 24웰 플레이트 형식으로 확장 가능한 다중 고처리량 형태 형성 시스템의 실현 가능성을 입증했습니다.또한 여러 개의 칩상 장기 제품이 상용화되었습니다.16,17,18.따라서 우리의 시험관 내 형태 형성 방법의 검증은 가속화될 수 있으며 잠재적으로 많은 연구 실험실, 산업 또는 정부 및 규제 기관에서 세포 약물이나 생물학적 치료제를 시험하기 위해 전사체 수준에서 시험관 내 장 형태 발생을 재프로그래밍합니다. 약물 후보의 흡수와 수송은 3D 장 대체물이나 맞춤형 또는 상용 칩상 장기 모델을 사용하여 평가하여 장 형태 발생 과정의 재현성을 평가했습니다.
인간 관련 실험 모델의 수는 제한되어 있으며, 이는 주로 시험관 내에서 3차원 형태발생을 유도하는 구현 가능한 프로토콜이 부족하기 때문입니다. 실제로, 장 형태발생에 대한 현재 지식의 대부분은 동물 연구(예: 제브라피쉬20, 마우스21 또는 닭22)에 기반합니다. 그러나 이러한 모델은 노동력과 비용이 많이 들고 윤리적으로 문제가 될 수 있으며, 가장 중요한 것은 인간의 발달 과정을 정확하게 결정하지 못한다는 것입니다. 이러한 모델은 또한 다중 확장 가능한 방식으로 테스트할 수 있는 능력이 매우 제한적입니다. 따라서 시험관 내에서 3차원 조직 구조를 재생하기 위한 우리의 프로토콜은 생체 내 동물 모델뿐만 아니라 다른 기존의 정적 2차원 세포 배양 모델보다 성능이 뛰어납니다. 앞서 설명한 바와 같이 3차원 상피 구조를 활용함으로써 다양한 점막 또는 면역 자극에 반응하여 융모막 축에서 분화된 세포의 공간적 위치를 조사할 수 있었습니다. 3차원 상피층은 미생물 세포가 어떻게 숙주 요인(예: 내부 점액층 대 외부 점액층, IgA 분비 및 항균 펩타이드)에 반응하여 공간적 틈새와 생태적 진화를 형성하기 위해 경쟁합니다. 나아가 3D 상피 형태학을 통해 장내 미생물 군집이 어떻게 군집을 구성하고 기저 융기부에서 세포 조직과 줄기 세포 틈새를 형성하는 미생물 대사산물(예: 단쇄 지방산)을 상승적으로 생성하는지 이해할 수 있습니다. 이러한 특징은 3D 상피층이 시험관 내에서 확립될 때에만 입증될 수 있습니다.
3D 장 상피 구조를 생성하는 방법 외에도 여러 가지 시험관 내 방법이 있습니다. 장 오가노이드 배양은 특정 형태발생 인자(morphogen) 조건 하에서 장 줄기세포를 배양하는 최첨단 조직 공학 기술입니다.23,24,25 그러나 3D 오가노이드 모델을 수송 분석이나 숙주-미생물군 공동 배양에 사용하는 것은 종종 어려운데, 장 내강이 오가노이드 내에 둘러싸여 있어 미생물 세포나 외인성 항원과 같은 내강 구성 요소의 도입이 제한되기 때문입니다. 오가노이드 내강에 대한 접근성은 마이크로인젝터를 사용하여 개선할 수 있지만,26,27 이 방법은 침습적이고 노동 집약적이며 전문적인 지식이 필요합니다. 더욱이, 정적인 조건에서 하이드로젤 지지체에 고정된 기존 오가노이드 배양은 생체 내 생체 역학을 정확하게 반영하지 못합니다.
여러 연구 그룹에서 사용하는 다른 접근법은 미리 구조화된 3D 하이드로젤 스캐폴드를 활용하여 젤 표면에서 분리된 인간 장 세포를 배양하여 장 상피 구조를 모방하는 것입니다. 3D 프린팅, 미세 밀링 또는 리소그래피로 제작된 몰드를 사용하여 하이드로젤 스캐폴드를 제작합니다. 이 방법은 생리학적으로 관련성 있는 형태발생 인자 구배를 사용하여 시험관 내에서 분리된 상피 세포의 자가 조직적 배열을 보여주며, 스캐폴드에 기질 세포를 포함시켜 높은 종횡비의 상피 구조와 기질-상피 간극을 형성합니다. 그러나 미리 구조화된 스캐폴드의 특성상 자발적인 형태발생 과정 자체를 보여주지 못할 수 있습니다. 또한 이러한 모델은 장 세포가 형태발생을 겪고 생리적 기능을 얻는 데 필요한 유체 전단 응력이 부족하여 역동적인 내강 또는 간질 흐름을 제공하지 않습니다. 또 다른 최근 연구에서는 미세유체 플랫폼에서 하이드로젤 스캐폴드를 사용하고 레이저 에칭 기술을 사용하여 장 상피 구조를 패턴화했습니다. 장 오가노이드는 에칭 패턴을 따라 장 세관 구조를 형성하며, 장내 유체 흐름은 미세유체 모듈을 사용하여 재현할 수 있습니다. 그러나 이 모델은 자발적인 형태발생 과정을 나타내지 않으며, 장 기계생물학적 움직임을 포함하지도 않습니다. 같은 연구진의 3D 프린팅 기술을 사용하여 자발적인 형태발생 과정을 가진 소형 장 튜브를 제작할 수 있었습니다. 튜브 내에 다양한 장 부분을 복잡하게 제작했음에도 불구하고, 이 모델은 장내 유체 흐름과 기계적 변형이 없습니다. 또한, 특히 바이오 프린팅 과정이 완료된 후에는 모델 작동이 제한되어 실험 조건이나 세포 간 상호작용이 교란될 수 있습니다. 대신, 제안된 프로토콜은 자발적인 장 형태발생, 생리학적으로 관련된 전단 응력, 장 운동성을 모방하는 생체역학, 독립적인 정단 및 기저외측 구획의 접근성, 그리고 모듈성을 갖춘 복잡한 생물학적 미세환경의 재현을 제공합니다. 따라서, 우리의 시험관 내 3D 형태발생 프로토콜은 기존 방법의 어려움을 극복하는 보완적인 접근법을 제공할 수 있습니다.
우리의 프로토콜은 배양된 상피 세포만 있고 중간엽 세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 다른 유형의 주변 세포가 없는 3D 상피 형태 형성에 전적으로 초점을 맞춥니다.이전에 설명한 바와 같이, 우리 프로토콜의 핵심은 도입된 배지의 기저외측에서 분비되는 형태 형성 억제제를 제거하여 상피 형태 형성을 유도하는 것입니다.우리의 칩상 장 및 칩상 하이브리드의 강력한 모듈성 덕분에 물결 모양의 3D 상피층을 재현할 수 있지만 상피-중간엽 상호 작용33,34, 세포외 기질(ECM) 침착35 및 우리 모델에서 기저 움푹 들어간 곳에서 줄기 세포 틈새를 전달하는 움푹 들어간 곳-융모 기능과 같은 추가적인 생물학적 복잡성은 추가로 고려되어야 합니다.중간엽의 기질 세포(예: 섬유아세포)는 ECM 단백질 생성 및 장 형태 형성 조절에 중요한 역할을 합니다. vivo35,37,38. 모델에 중간엽 세포를 추가하면 형태발생 과정과 세포 부착 효율이 향상되었습니다. 내피층(즉, 모세혈관이나 림프관)은 장 미세환경에서 분자 수송39과 면역 세포 모집40을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 조직 모델 간에 연결될 수 있는 혈관 구성 요소는 다기관 상호작용을 보여주기 위해 조직 모델을 설계할 때 필수적입니다. 따라서 기관 수준의 해상도로 더욱 정확한 생리적 특징을 모델링하기 위해 내피 세포를 포함해야 할 수도 있습니다. 환자 유래 면역 세포는 장 질환을 모방하는 맥락에서 선천 면역 반응, 항원 제시, 선천 적응 면역 교차 신호, 조직 특이 면역을 나타내는 데에도 필수적입니다.
하이브리드 칩은 장치 설정이 더 간단하고 Transwell 인서트를 사용하면 장 상피의 확장 가능한 배양이 가능하기 때문에 칩 위의 장보다 사용하기가 더 간단합니다. 그러나 폴리에스터 멤브레인이 있는 상용 Transwell 인서트는 탄성이 없어 연동 운동과 같은 움직임을 시뮬레이션할 수 없습니다. 나아가 하이브리드 칩에 배치된 Transwell 인서트의 정단 구획은 정단 측에 전단 응력이 가해지지 않고 고정된 상태를 유지합니다. 분명히 정단 구획의 정적 특성으로 인해 하이브리드 칩에서 장기간 박테리아 공동 배양이 거의 불가능합니다. 하이브리드 칩을 사용하면 Transwell 인서트에서 3D 형태 발생을 견고하게 유도할 수 있지만 생리학적으로 관련된 생체 역학과 정단 유체 흐름이 부족하여 잠재적 응용 분야에서 하이브리드 칩 플랫폼의 실현 가능성이 제한될 수 있습니다.
칩상 장 및 칩상 하이브리드 배양에서 인간 융모-융모 축의 실물 크기 재구성은 아직 완전히 확립되지 않았습니다. 형태발생은 상피 단층에서 시작하므로 3D 미세 구조가 반드시 생체 내 융모와 형태적으로 유사하지는 않습니다. 미세공학적으로 제작된 3D 상피에서 기저 융모 영역 근처에서 증식하는 세포 집단을 특성화했지만 융모와 융모 영역을 명확하게 구분하지 못했습니다. 칩의 위쪽 채널이 더 높아져 미세공학적으로 제작된 상피의 높이가 증가했지만 최대 높이는 여전히 ~300–400µm로 제한됩니다. 소장과 대장에서 인간 장 융모의 실제 깊이는 각각 ~135µm와 ~400µm이고 소장 융모의 높이는 ~600µm입니다41.
영상화 관점에서 볼 때, 3D 마이크로구조의 현장 초고해상도 영상화는 칩 위의 장으로 제한될 수 있는데, 이는 대물렌즈에서 상피층까지의 필요한 작업 거리가 수 밀리미터 수준이기 때문이다. 이 문제를 극복하기 위해 먼 거리의 대물렌즈가 필요할 수 있다. 또한, PDMS의 높은 탄성으로 인해 영상화 표본 준비를 위한 얇은 절편을 만드는 것이 까다롭다. 또한, 칩 위의 장을 층층이 미세 제작하는 데는 각 층 사이에 영구적인 접착이 필요하기 때문에 상피층의 표면 구조를 조사하기 위해 상층을 열거나 제거하는 것이 매우 어렵다. 예를 들어, 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하는 것이다.
PDMS의 소수성은 소수성 소분자를 다루는 미세유체 기반 연구에서 제한 요인이 되어 왔는데, 이는 PDMS가 이러한 소수성 분자를 비특이적으로 흡착할 수 있기 때문이다. PDMS에 대한 대안은 다른 고분자 재료와 함께 고려될 수 있다. 또는 PDMS의 표면 개질(예: 친유성 재료 42 또는 폴리에틸렌 글리콜) 43 을 고려하면 소수성 분자의 흡착을 최소화할 수 있다.
마지막으로, 우리의 방법은 고처리량 스크리닝이나 "모든 사람에게 맞는 단일" 사용자 친화적 실험 플랫폼을 제공하는 측면에서 잘 특성화되지 않았습니다.현재 프로토콜은 마이크로 디바이스당 주사기 펌프가 필요하므로 CO2 인큐베이터에서 공간을 차지하고 대규모 실험을 방해합니다.이러한 제한은 혁신적인 배양 형식(예: 기저측면 배지의 지속적인 보충 및 제거를 허용하는 24웰, 96웰 또는 384웰 다공성 인서트)의 확장성을 통해 크게 개선될 수 있습니다.
영어: 시험관 내에서 인간 장 상피의 3D 형태발생을 유도하기 위해, 우리는 두 개의 평행한 미세채널과 그 사이의 탄성 다공성 막을 포함하는 미세유체 칩 장 장치를 사용하여 루멘-모세관 인터페이스를 만들었습니다. 또한 Transwell 삽입물에서 성장한 극성 상피층 아래에서 연속적인 기저측면 흐름을 제공하는 단일 채널 미세유체 장치(하이브리드 칩)의 사용을 보여줍니다. 두 플랫폼 모두에서, 기저측면 구획에서 형태발생제 길항제를 제거하기 위해 흐름의 방향 조작을 적용하여 다양한 인간 장 상피 세포의 형태발생을 입증할 수 있습니다. 전체 실험 절차(그림 1)는 5개 부분으로 구성됩니다. (i) 장 칩 또는 Transwell 삽입형 하이브리드 칩의 미세 제작(단계 1-5; 상자 1), (ii) 장 상피 세포(Caco-2 세포) 또는 인간 장 기관체의 준비; (박스 2-5), (iii) 장 칩 또는 하이브리드 칩에서의 장 상피 세포 배양(단계 6-9), (iv) 시험관 내에서 3D 형태형성 유도(단계 10) 및 (v) ) 3D 상피 미세구조를 특성화하기 위한(단계 11-24). 마지막으로, 적절한 대조군(아래에서 더 자세히 논의)을 설계하여 상피 형태형성을 공간적, 시간적, 조건적 또는 절차적 대조군과 비교하여 시험관 내 형태형성의 효과를 검증했습니다.
우리는 두 가지 다른 배양 플랫폼을 사용했습니다: 직선 채널 또는 비선형 나선형 채널이 있는 칩상의 장 또는 미세유체 장치에 Transwell(TW) 인서트를 포함하는 하이브리드 칩, 상자 1에 설명된 대로 제작, 단계 1-5."장치 제작"은 단일 칩 또는 하이브리드 칩을 만드는 주요 단계를 보여줍니다."인간 장 상피 세포 배양"은 이 프로토콜에서 사용되는 세포 공급원(Caco-2 또는 인간 장 오르가노이드)과 배양 절차를 설명합니다."시험관 내 형태발생"은 Caco-2 또는 오르가노이드 유래 상피 세포가 장 칩 또는 하이브리드 칩의 Transwell 인서트에서 배양되고 3D 형태발생이 유도되고 특성화된 상피 구조가 형성되는 전체 단계를 보여줍니다.프로그램 단계 번호 또는 상자 번호는 각 화살표 아래에 표시됩니다.이 응용 프로그램은 확립된 장 상피 층이 세포 분화 특성화, 장 생리학 연구, 확립과 같은 데 사용될 수 있는 방법의 예를 제공합니다. 숙주-미생물 생태계 및 질병 모델링. "세포 분화"의 면역형광 이미지는 장 칩에서 생성된 3D Caco-2 상피층에서 발현되는 핵, F-액틴 및 MUC2를 보여줍니다. MUC2 신호 전달은 점막 표면에서 분비되는 점액과 술잔 세포에 존재합니다. 장 생리학의 형광 이미지는 형광 밀 배아 응집소를 사용하여 시알산 및 N-아세틸글루코사민 잔류물을 염색하여 생성된 점액을 보여줍니다. "숙주-미생물 공동 배양"의 두 개의 겹치는 이미지는 칩에서 장의 대표적인 숙주-미생물 공동 배양을 보여줍니다. 왼쪽 패널은 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 대장균과 미세공학적으로 제작된 3D Caco-2 상피 세포의 공동 배양을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 3D Caco-2 상피 세포와 공동 배양한 GFP 대장균의 국소화를 보여 주고, 그 후 면역형광 염색을 합니다. F-액틴(빨간색)과 핵(파란색). 질병 모델링은 장 염증 칩에서 박테리아 항원(예: 리포폴리사카라이드, LPS)과 면역 세포(예: PBMC, 녹색)를 생리적으로 자극하여 건강한 장과 누수된 장을 보여줍니다. Caco-2 세포를 배양하여 3차원 상피층을 형성했습니다. 스케일 바, 50 µm. 아랫줄 이미지: 참고문헌의 허가를 받아 각색한 "세포 분화". 2. Oxford University Press; 참고문헌의 허가를 받아 재편집. 5. NAS; 참고문헌의 허가를 받아 각색한 "숙주-미생물 공동 배양". 3. NAS; 참고문헌의 허가를 받아 각색한 "질병 모델링". 5. NAS.
Gut-on-chip과 하이브리드 칩은 모두 소프트 리소그래피1,44를 통해 실리콘 몰드에서 탈형되고 SU-8로 패터닝된 PDMS 복제품을 사용하여 제작되었습니다.각 칩의 마이크로채널 설계는 전단 응력 및 유체역학적 압력1,4,12과 같은 유체역학을 고려하여 결정됩니다.두 개의 병치된 평행 직선 마이크로채널로 구성된 원래의 Gut-on-a-chip 설계(확장 데이터 그림 1a)는 곡선 마이크로채널 한 쌍을 포함하는 복잡한 Gut-on-a-chip(확장 데이터 그림 1b)으로 발전하여 유체 체류 시간 증가, 비선형 흐름 패턴 및 배양된 세포의 다축 변형을 유도합니다(그림 2a–f) 12.더 복잡한 장 생체역학을 재현해야 할 때 복잡한 Gut-on-a-chip을 선택할 수 있습니다.우리는 복잡한 Gut-Chip도 유사한 정도의 유사한 시간 프레임에서 3D 형태발생을 강력하게 유도한다는 것을 보여주었습니다. 배양된 세포 유형에 관계없이 원래 Gut-Chip과 비교하여 상피 성장을 촉진합니다.따라서 3D 형태형성을 유도하기 위해 선형 및 복잡한 온칩 장 설계는 상호 교환 가능합니다.SU-8 패턴이 있는 실리콘 몰드에서 경화된 PDMS 복제품은 탈형 후 음성 특징을 보였습니다(그림 2a).칩에 장을 제작하기 위해 준비된 상부 PDMS 층을 다공성 PDMS 필름에 순차적으로 접합한 다음 코로나 처리기를 사용하여 비가역적 접합을 통해 하부 PDMS 층과 정렬했습니다(그림 2b-f).하이브리드 칩을 제작하기 위해 경화된 PDMS 복제품을 유리 슬라이드에 접합하여 Transwell 인서트를 수용할 수 있는 단일 채널 미세유체 장치를 만들었습니다(그림 2h 및 확장 데이터 그림 2).접합 공정은 PDMS 복제품과 유리 표면을 산소 플라즈마 또는 코로나 처리로 처리하여 수행됩니다.실리콘 튜브에 부착된 미세 제작 장치를 살균한 후, 장치 설정을 통해 장의 3D 형태형성을 수행할 준비가 되었습니다. 상피(그림 2g).
a, SU-8 패턴 실리콘 몰드에서 PDMS 부품을 준비하는 개략도. 경화되지 않은 PDMS 용액을 실리콘 몰드(왼쪽)에 붓고 60°C에서 경화(중간)한 후 몰드에서 꺼냈습니다(오른쪽). 꺼낸 PDMS는 조각으로 자르고 추가 사용을 위해 세척했습니다.b, PDMS 상층을 준비하는 데 사용된 실리콘 몰드의 사진.c, PDMS 다공성 멤브레인을 제작하는 데 사용된 실리콘 몰드의 사진.d, 상하 PDMS 구성 요소와 조립된 온칩 장 장치의 일련의 사진.e, 상하 멤브레인 및 하 PDMS 구성 요소의 정렬 개략도.각 층은 플라즈마 또는 코로나 처리로 비가역적으로 결합되었습니다.f, 중첩된 나선형 마이크로채널과 진공 챔버가 있는 제작된 칩상 장 장치의 개략도.g, 미세유체 세포 배양을 위한 칩상 장 장치의 설정.실리콘 튜브와 주사기로 조립된 제작된 칩상 장 장치는 커버슬립. 칩 장치를 150mm 페트리 접시 뚜껑 위에 올려놓고 처리했습니다. 바인더를 사용하여 실리콘 튜브를 닫았습니다.h, 하이브리드 칩 제작 및 하이브리드 칩을 이용한 3D 형태형성의 시각적 스냅샷. 장 상피 세포의 2D 단층을 배양하기 위해 별도로 준비한 트랜스웰 인서트를 하이브리드 칩에 삽입하여 장 3D 형태형성을 유도했습니다. 트랜스웰 인서트에 형성된 세포층 아래의 미세채널을 통해 배지를 관류했습니다. 스케일 바, 1cm.h 참고문헌에서 허가를 받아 재인쇄했습니다. 4. Elsevier.
이 프로토콜에서는 Caco-2 세포주와 장 오르가노이드를 상피 공급원으로 사용했습니다(그림 3a). 두 유형의 세포 모두 독립적으로 배양(상자 2 및 상자 5)하여 칩상 장 또는 Transwell 삽입물의 ECM 코팅 마이크로채널에 접종했습니다. 세포가 합류하면(플라스크에서 95% 이상 피복) T-플라스크에서 일상적으로 배양한 Caco-2 세포(10~50번째 통과)를 수확하여 트립신 처리액으로 분리된 세포 현탁액을 준비했습니다(상자 2). 장 생검 또는 수술적 절제에서 얻은 인간 장 오르가노이드는 구조적 미세 환경을 지원하기 위해 24-웰 플레이트의 Matrigel 스캐폴드 돔에서 배양했습니다. 상자 3에 설명된 대로 준비한 필수 형태 발생 인자(예: Wnt, R-spondin 및 Noggin)와 성장 인자를 함유한 배지를 오르가노이드가 성장할 때까지 이틀에 한 번씩 보충했습니다. 직경 약 500µm. 완전히 성장한 오르가노이드를 수확하여 단일 세포로 분리한 후 칩의 장이나 Transwell 삽입물에 접종합니다(박스 5). 이전에 보고한 바와 같이 질병 유형12,13(예: 궤양성 대장염, 크론병, 대장직장암 또는 정상 기증자), 병변 부위(예: 병변 대 비병변 부위) 및 위장관 위치(예: 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장 또는 직장)에 따라 차별화할 수 있습니다. 박스 5에서는 소장 오르가노이드보다 일반적으로 더 높은 농도의 형태 생성 인자가 필요한 결장 오르가노이드(콜로이드)를 배양하기 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다.
a, 장 칩에서 장 형태형성 유도를 위한 워크플로. Caco-2 인간 장 상피세포와 장 오가노이드를 사용하여 이 프로토콜에서 3D 형태형성을 입증합니다. 분리된 상피세포는 준비된 장-온-칩 장치(칩 제조)에 접종했습니다. 0일(D0)에 세포가 PDMS 다공성 막에 접종(seeded)되고 부착(attached)되면 정단(apical, AP) 흐름이 시작되어 처음 2일 동안 유지됩니다(흐름, AP, D0-D2). 완전한 2D 단층이 형성되면 기저외측(basolateral, BL) 흐름도 순환적 신축 운동(stretch, flow, AP 및 BL)과 함께 시작됩니다. 장의 3D 형태형성은 미세유체 배양 5일 후 자발적으로 발생했습니다(형태형성, D5). 위상차 이미지는 각 실험 단계 또는 시점에서 Caco-2 세포의 대표적인 형태를 보여줍니다(막대 그래프, 100µm). 4개의 모식도는 다음을 보여줍니다. 장 형태발생의 해당 연쇄 과정(오른쪽 상단). 모식도의 점선 화살표는 유체 흐름 방향을 나타냅니다.b, 확립된 3D Caco-2 상피의 표면 지형을 보여주는 SEM 이미지(왼쪽).확대된 영역(흰색 점선 상자)을 강조하는 삽입 그림은 3D Caco-2 층(오른쪽)에서 재생된 미세융모를 보여줍니다.c, 확립된 Caco-2 3D, 클라우딘(ZO-1, 빨간색) 및 F-액틴(녹색)과 핵(파란색)으로 표시된 연속 브러시 테두리 막의 수평 정면도.장 칩의 상피 세포에 대한 면역 형광 공초점 시각화.중앙 모식도를 가리키는 화살표는 각 공초점 보기의 초점 평면 위치를 나타냅니다.d, 위상차 현미경으로 3, 7, 9, 11 및 13일에 얻은 칩에서 배양된 오르가노이드의 형태학적 변화의 시간 경과.삽입 그림(오른쪽 상단)은 제공된 고배율을 보여줍니다. 영어: image.e, 7일째에 찍은 슬라이스에서 장에 확립된 유기체 3D 상피의 DIC 현미경 사진.f, 상피층에서 각각 3일 동안 장 칩에서 자란 줄기 세포(LGR5; 자홍색), 잔세포(MUC2; 녹색), F-액틴(회색) 및 핵(청록색)의 마커를 보여주는 중첩 면역 형광 이미지(왼쪽)와 13일(가운데) 유기체.또한 MUC2 신호 없이 LGR5 신호 전달을 강조한 확장 데이터 그림 3을 참조하세요.세포막을 CellMask 염료(오른쪽)로 염색하여 칩에서 장에 확립된 3D 유기체 상피의 상피 미세 구조(오른쪽)를 보여주는 형광 이미지(오른쪽).달리 명시되지 않는 한 스케일 바는 50μm입니다.b 참고 문헌에서 허가를 받아 재인쇄.2. Oxford University Press;c 참고 문헌에서 허가를 받아 수정.2. Oxford University Press; e와 f는 참조 허가를 받아 수정되었습니다.12 크리에이티브 커먼즈 라이선스 CC BY 4.0에 따라.
칩 위의 장에서 성공적인 ECM 코팅을 위해서는 PDMS 다공성 멤브레인의 소수성 표면을 변형하는 것이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 PDMS 멤브레인의 소수성을 변형하기 위해 두 가지 방법을 적용합니다. Caco-2 세포를 배양하기 위해 UV/오존 처리만으로 표면을 활성화하는 것만으로도 PDMS 표면의 소수성을 감소시키고 ECM을 코팅하여 Caco-2 세포를 PDMS 멤브레인에 부착하기에 충분했습니다. 그러나 유기 상피의 미세유체 배양에는 폴리에틸렌이민(PEI)과 글루타르알데히드를 PDMS 마이크로채널에 순차적으로 적용하여 ECM 단백질을 효율적으로 증착하기 위한 화학 기반 표면 기능화가 필요합니다. 표면 변형 후, ECM 단백질을 증착하여 기능화된 PDMS 표면을 덮은 다음 분리된 유기 상피에 도입했습니다. 세포가 부착된 후, 미세유체 세포 배양은 세포가 완전한 단층을 형성할 때까지 상부 마이크로채널로 배지만 관류하는 것으로 시작하며, 하부 마이크로채널은 정적 조건을 유지합니다. 표면 활성화 및 ECM 코팅을 위한 이 최적화된 방법을 통해 부착이 가능합니다. PDMS 표면에 3D 형태발생을 유도하기 위한 유기체 상피의 연구.
Transwell 배양은 세포 접종 전에 ECM 코팅이 필요하지만, Transwell 배양은 다공성 인서트의 표면을 활성화하기 위한 복잡한 전처리 단계가 필요하지 않습니다.Transwell 인서트에서 Caco-2 세포를 배양하는 경우, 다공성 인서트에 ECM을 코팅하면 분리된 Caco-2 세포의 부착(<1시간)과 밀착 접합 장벽 형성(<1-2일)이 가속화됩니다.Transwell 인서트에서 오르가노이드를 배양하려면 분리된 오르가노이드를 ECM 코팅 인서트에 접종하고, 막 표면에 부착(<3시간)한 후, 오르가노이드가 장벽 무결성을 갖춘 완전한 단층을 형성할 때까지 유지합니다.Transwell 배양은 하이브리드 칩을 사용하지 않고 24웰 플레이트에서 수행됩니다.
시험관 내 3D 형태발생은 확립된 상피층의 기저외측 면에 유체 흐름을 적용하여 시작할 수 있습니다.칩 위의 장에서 상피 형태발생은 배지가 상부 및 하부 마이크로채널에 관류되었을 때 시작되었습니다(그림 3a).이전에 설명한 대로, 방향성 분비 형태발생 억제제를 지속적으로 제거하기 위해 하부(기저외측) 구획에 유체 흐름을 도입하는 것이 중요합니다.다공성 막에 결합된 세포에 충분한 영양소와 혈청을 제공하고 내강 전단 응력을 생성하기 위해 일반적으로 칩 위의 장에 이중 흐름을 적용합니다.하이브리드 칩에서 상피 단층을 포함하는 Transwell 인서트를 하이브리드 칩에 삽입했습니다.그런 다음 배지를 마이크로채널을 통해 다공성 Transwell 인서트의 기저외측 면 아래에 적용했습니다.장 형태발생은 두 배양 플랫폼 모두에서 기저외측 흐름이 시작된 후 3~5일 후에 발생했습니다.
미세공학적으로 제작된 3D 상피층의 형태적 특징은 위상차 현미경, 차등 간섭 대조(DIC) 현미경, SEM 또는 면역 형광 공초점 현미경(그림 3 및 4)을 포함한 다양한 영상화 방식을 적용하여 분석할 수 있습니다. 위상차 또는 DIC 영상화는 배양 중 언제든지 쉽게 수행하여 3D 상피층의 모양과 돌출을 모니터링할 수 있습니다. PDMS와 폴리에스터 필름의 광학적 투명성 덕분에 Gut-on-a-chip과 하이브리드 칩 플랫폼 모두 장치를 절단하거나 분해할 필요 없이 실시간 현장 영상을 제공할 수 있습니다. 면역 형광 영상화(그림 1, 3c, f 및 4b, c)를 수행할 때 일반적으로 세포는 4%(중량/부피) 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 다음 Triton X-100과 2%(중량/부피) 소 혈청 알부민(BSA)으로 고정합니다. 세포 유형에 따라 다른 고정제, 투과제 및 차단제를 사용할 수 있습니다.혈통 의존적 세포 또는 영역 마커를 표적으로 하는 1차 항체는 칩에 원위치에 고정된 세포를 강조하는 데 사용되고, 이어서 핵(예: 4′,6-다이아미디노-2-페닐렌) 인돌, DAPI) 또는 F-액틴(예: 형광 표지된 팔로이딘)을 표적으로 하는 대조 염색과 함께 2차 항체가 사용됩니다.점액 생성(그림 1, "세포 분화" 및 "장 생리학"), 미생물 세포의 무작위 식민지화(그림 1, "숙주-미생물 공동 배양"), 면역 세포의 모집(그림 1, '질병 모델링') 또는 3D 상피 형태의 윤곽(그림 3c, f 및 4b, c)을 감지하기 위해 형광 기반 라이브 이미징도 원위치에서 수행할 수 있습니다.참고 문헌에 설명된 대로 칩의 장을 수정하여 상부 층과 하부 마이크로채널 층을 분리하는 경우.그림에 표시된 대로. 2, 3D 상피 형태와 정단 융모의 미세융모는 SEM으로 시각화할 수 있습니다(그림 3b). 분화 마커의 발현은 정량적 PCR5 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행하여 평가할 수 있습니다. 이 경우, 장 칩이나 하이브리드 칩에서 자란 3D 상피 세포 층을 트립신 처리로 수확한 다음 분자 또는 유전 분석에 사용합니다.
a, 하이브리드 칩에서 장 형태형성 유도를 위한 워크플로. 본 프로토콜에서는 Caco-2와 장 오가노이드를 사용하여 하이브리드 칩 플랫폼에서 3D 형태형성을 입증합니다. 분리된 상피 세포를 준비된 Transwell 인서트에 분주했습니다(TW 준비; 아래 그림 참조). 세포를 분주(seed)하고 Transwell 인서트의 폴리에스터 막에 부착한 후, 모든 세포를 정적 조건(TW 배양)에서 배양했습니다. 7일 후, 2D 단층의 상피 세포를 포함하는 단일 Transwell 인서트를 하이브리드 칩에 통합하여 기저외측 유동(Flow, BL)을 유도했고, 이는 궁극적으로 3D 상피층(형태형성)을 생성했습니다. 각 실험 단계 또는 시점에서 정상 공여자(C103 세포주) 상행 결장에서 유래한 인간 장기 상피 세포의 형태학적 특징을 보여주는 위상차 현미경 사진입니다. 상단 층의 모식도는 각 단계의 실험 구성을 보여줍니다. b, 하이브리드 칩(왼쪽 모식도) 다양한 Z 위치(위, 중간, 아래; 오른쪽 모식도 및 해당 점선 참조)에서 촬영한 하향식 공초점 현미경 관찰을 통해 오가노이드 상피 세포의 3D 형태발생을 유도할 수 있습니다. 명확한 형태학적 특징을 보였습니다. F-액틴(청록색), 핵(회색).c, 정적 트랜스웰(TW; 흰색 점선 상자 안의 삽입 그림)에서 배양한 오가노이드 유래 상피 세포의 형광 공초점 현미경 사진(3D 각도 보기)과 하이브리드 칩(가장 큰 전체 샷)을 각각 2D와 3D 형태를 비교한 것입니다. 한 쌍의 2D 수직 횡단면(오른쪽 상단 모서리 삽입 그림; "XZ")도 2D 및 3D 특징을 보여줍니다. 축척 막대, 100µm.c 참고문헌에서 허가를 받아 재인쇄.4. Elsevier.
대조군은 동일한 세포(Caco-2 또는 장 기관상피세포)를 기존의 정적 배양 조건에서 2차원 단층으로 배양하여 준비할 수 있습니다. 특히, 미세채널의 제한된 용량(예: 원래 장 칩 설계의 상단 채널에서 ~4 µL)으로 인해 영양소 고갈이 발생할 수 있습니다. 따라서 기저측 혈류를 적용하기 전과 후의 상피 형태도 비교할 수 있습니다.
소프트 리소그래피 공정은 클린룸에서 수행되어야 합니다. 칩의 각 층(상부 및 하부 층과 멤브레인)과 하이브리드 칩의 경우, 마이크로채널의 높이가 다르기 때문에 서로 다른 포토마스크를 사용하여 별도의 실리콘 웨이퍼에 제작했습니다. 칩의 상부 및 하부 마이크로채널의 목표 높이는 각각 500µm와 200µm입니다. 하이브리드 칩의 채널 목표 높이는 200µm입니다.
3인치 실리콘 웨이퍼를 아세톤이 담긴 접시에 놓습니다. 접시를 30초 동안 부드럽게 돌린 후 웨이퍼를 자연 건조합니다. 웨이퍼를 IPA가 담긴 접시로 옮긴 후 접시를 30초 동안 돌려서 세척합니다.
피라냐 용액(과산화수소와 진한 황산의 혼합물, 1:3(부피/부피))을 선택적으로 사용하여 실리콘 웨이퍼 표면에서 유기 잔류물을 최대한 제거할 수 있습니다.
피라냐 용액은 매우 부식성이 강하고 열을 발생시킵니다.추가적인 안전 예방 조치가 필요합니다.폐기물을 폐기할 경우, 용액을 식힌 후 깨끗하고 건조한 폐기물 용기에 옮깁니다.보조 용기를 사용하고 폐기물 용기에 적절한 라벨을 붙이세요.더 자세한 절차는 시설의 안전 지침을 따르세요.
웨이퍼를 200°C 핫플레이트에 10분간 올려놓고 탈수시킵니다. 탈수 후, 웨이퍼를 공기 중에서 5번 흔들어 식힙니다.
세척한 실리콘 웨이퍼 중앙에 약 10g의 포토레지스트 SU-8 2100을 붓습니다. 핀셋을 사용하여 포토레지스트를 웨이퍼에 고르게 펴 바릅니다. 가끔씩 웨이퍼를 65°C의 핫플레이트에 올려놓으면 포토레지스트가 덜 끈적거리고 펴기 쉽습니다. 웨이퍼를 핫플레이트에 직접 올려놓지 마세요.
SU-8은 스핀 코팅을 실행하여 웨이퍼에 균일하게 분산되었습니다. SU-8의 입력 회전을 5~10초 동안 프로그래밍하여 100rpm/s의 가속도로 500rpm으로 전파되도록 합니다. 200µm 두께 패터닝을 위한 주 스핀을 1,500rpm으로 설정하거나 250µm 두께를 달성합니다(칩의 상부 층의 높이를 500µm로 만듭니다. 아래의 "중요 단계" 참조). 가속도 300rpm/s로 설정하고 1,200rpm에서 30초간 실행합니다.
실리콘 웨이퍼의 SU-8 패턴의 목표 두께에 따라 주요 회전 속도를 조절할 수 있습니다.
칩의 상부 층에 500µm 높이의 SU-8 패턴을 제작하기 위해 이 상자의 스핀 코팅 및 소프트 베이크 단계(7단계 및 8단계)를 순차적으로 반복하여(9단계 참조) 250µm 두께의 SU-8 층을 두 개 생성했습니다. 이 층은 이 상자의 12단계에서 UV 노출을 통해 겹쳐 쌓고 결합하여 500µm 높이의 층을 만들 수 있습니다.
SU-8 코팅된 웨이퍼를 65°C의 열판 위에 조심스럽게 올려놓고 5분간 굽고, 그 후 설정을 95°C로 바꾸어 40분 더 배양합니다.
상부 마이크로채널에서 SU-8 패턴의 높이를 500μm로 만들려면 7단계와 8단계를 반복하여 두께 250μm의 SU-8 층 두 개를 생성합니다.
UV 마스크 정렬기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 램프 테스트를 수행하여 웨이퍼의 노출 시간을 계산합니다.(노출 시간, ms) = (노출량, mJ/cm2)/(램프 전력, mW/cm2).
노출 시간을 결정한 후, 포토마스크를 UV 마스크 정렬기의 마스크 홀더에 놓고, 포토마스크를 SU-8 코팅된 웨이퍼 위에 놓습니다.
UV 분산을 최소화하기 위해 포토마스크의 인쇄면을 실리콘 웨이퍼의 SU-8 코팅면에 직접 놓습니다.
SU-8 코팅된 웨이퍼와 포토마스크를 미리 정해진 노출 시간 동안 260 mJ/cm2의 UV 광선에 수직으로 노출시킵니다(이 상자의 10단계 참조).
UV 노출 후, SU-8 코팅된 실리콘 웨이퍼를 각 핫플레이트에서 65°C에서 5분, 95°C에서 15분 동안 구워서 높이 200µm의 패턴을 제작했습니다. 95°C에서의 후처리 시간을 30분으로 늘려서 높이 500µm의 패턴을 제작했습니다.
현상액을 유리 접시에 붓고 구운 웨이퍼를 접시에 놓습니다. SU-8 현상액의 양은 유리판의 크기에 따라 다를 수 있습니다. 노출되지 않은 SU-8을 완전히 제거할 만큼 충분한 SU-8 현상액을 사용하세요. 예를 들어, 용량이 1L인 직경 150mm 유리 접시를 사용하는 경우 약 300mL의 SU-8 현상액을 사용하세요. 가끔 부드럽게 회전시키면서 25분 동안 금형을 현상하세요.
개발된 곰팡이를 약 10mL의 새로운 현상액으로 헹군 다음, 피펫을 사용하여 용액을 분사하여 IPA를 처리합니다.
웨이퍼를 플라즈마 세정기에 넣고 산소 플라즈마(대기 가스, 목표 압력 1 × 10−5 Torr, 전력 125 W)에 1.5분 동안 노출시킵니다.
웨이퍼를 유리 슬라이드가 들어 있는 진공 데시케이터에 넣습니다. 웨이퍼와 슬라이드는 나란히 놓을 수 있습니다. 진공 데시케이터가 플레이트로 여러 층으로 나뉘어 있는 경우 슬라이드를 아래쪽 챔버에, 웨이퍼를 위쪽 챔버에 넣습니다. 유리 슬라이드에 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸)실란 용액 100 μL를 떨어뜨리고 실란화를 위해 진공을 적용합니다.
냉동된 Caco-2 세포가 담긴 바이알을 37°C 수조에서 해동한 다음, 해동된 세포를 37°C로 예열된 Caco-2 배지 15mL가 들어 있는 T75 플라스크로 옮깁니다.
Caco-2 세포를 약 90%의 밀도로 통과시키려면 먼저 37°C 수조에서 Caco-2 배지, PBS, 0.25% 트립신/1 mM EDTA를 따뜻하게 합니다.
진공흡입법으로 배지를 흡인합니다. 진공흡입을 반복하고 새로운 PBS를 추가하여 따뜻한 PBS 5mL로 세포를 두 번 세척합니다.