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미생물 기생충의 진화는 기생충이 개선되도록 하는 자연 선택과 기생충이 유전자를 잃고 유해한 돌연변이를 축적하게 하는 유전적 표류 사이의 반작용을 포함합니다.여기에서 이 반작용이 단일 거대분자 규모에서 어떻게 발생하는지 이해하기 위해 자연에서 가장 작은 게놈 중 하나를 가진 진핵 유기체인 Encephalitozoon cuniculi의 리보솜의 cryo-EM 구조를 설명합니다.E. cuniculi 리보솜에서 rRNA의 극단적인 감소는 이전에 알려지지 않은 융합된 rRNA 링커 및 돌출부가 없는 rRNA의 진화와 같은 전례 없는 구조적 변화를 동반합니다.또한, E. cuniculi 리보솜은 저분자를 분해된 rRNA 단편 및 단백질의 구조적 모방체로 사용하는 능력을 개발함으로써 rRNA 단편 및 단백질의 손실에서 살아남았습니다.전반적으로, 우리는 오랫동안 감소되고, 퇴화되고, 쇠약하게 만드는 돌연변이에 영향을 받는 것으로 생각되는 분자 구조가 극도의 분자 수축에도 불구하고 활성을 유지하는 많은 보상 메커니즘을 가지고 있음을 보여줍니다.
대부분의 미생물 기생충 그룹은 숙주를 이용할 수 있는 고유한 분자 도구를 가지고 있기 때문에 다양한 기생충 그룹에 대해 서로 다른 치료법을 개발해야 하는 경우가 많습니다1,2.그러나 새로운 증거에 따르면 기생충 진화의 일부 측면은 수렴되고 대체로 예측 가능하며 미생물 기생충3,4,5,6,7,8,9에서 광범위한 치료 개입을 위한 잠재적 기반을 나타냅니다.
이전 작업에서는 게놈 감소 또는 게놈 붕괴라고 하는 미생물 기생충의 일반적인 진화 경향을 확인했습니다.현재 연구에 따르면 미생물이 자유로운 생활 방식을 포기하고 세포내 기생충(또는 내공생체)이 되면 미생물의 게놈이 수백만 년에 걸쳐 느리지만 놀라운 변태를 겪게 됩니다9,11.게놈 붕괴로 알려진 과정에서 미생물 기생충은 이전에 중요했던 많은 유전자를 위유전자로 바꾸는 유해한 돌연변이를 축적하여 점진적인 유전자 손실과 돌연변이 붕괴를 초래합니다14,15.이 붕괴는 밀접하게 관련된 자유 생활 종에 비해 가장 오래된 세포 내 유기체에서 유전자의 최대 95%를 파괴할 수 있습니다.따라서 세포내 기생충의 진화는 기생충의 개량으로 이어지는 다윈의 자연 선택과 기생충을 망각 속으로 내던지는 게놈의 붕괴라는 두 가지 상반되는 힘 사이의 줄다리기입니다.기생충이 어떻게 이 줄다리기에서 벗어나 분자 구조의 활동을 유지했는지는 아직 불분명합니다.
게놈 붕괴의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만 주로 빈번한 유전적 부동으로 인해 발생하는 것으로 보입니다.기생충은 작고 무성이며 유전적으로 제한된 집단에 살고 있기 때문에 DNA 복제 중에 때때로 발생하는 해로운 돌연변이를 효과적으로 제거할 수 없습니다.이로 인해 유해한 돌연변이가 돌이킬 수 없이 축적되고 기생충 게놈이 감소합니다.결과적으로 기생충은 세포 내 환경에서 생존하는 데 더 이상 필요하지 않은 유전자를 잃을 뿐만 아니라가장 중요한 유전자를 포함하여 게놈 전체에 이러한 돌연변이가 축적되도록 하는 산발적이고 해로운 돌연변이를 효과적으로 제거하는 것은 기생충 개체군의 무능력입니다.
게놈 감소에 대한 우리의 현재 이해의 대부분은 하우스키핑 기능을 수행하고 잠재적인 약물 표적으로 작용하는 실제 분자의 변화에 ​​대한 관심이 적은 게놈 서열의 비교에만 기반합니다.비교 연구에 따르면 유해한 세포내 미생물 돌연변이의 부담은 단백질과 핵산이 잘못 접히고 응집되는 경향이 있어 샤페론에 더 의존하고 열에 과민하게 만드는 것으로 나타났습니다19,20,21,22,23.또한, 다양한 기생충(종종 25억 년이나 떨어져 있는 독립적인 진화)은 단백질 합성5,6 및 DNA 복구 메커니즘24에서 유사한 품질 관리 센터의 손실을 경험했습니다.그러나 해로운 돌연변이의 증가하는 부담에 대한 분자 적응을 포함하여 세포 거대 분자의 다른 모든 특성에 대한 세포 내 생활 방식의 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
이 연구에서는 세포내 미생물의 단백질과 핵산의 진화를 더 잘 이해하기 위해 세포내 기생충인 Encephalitozoon cuniculi의 리보솜 구조를 결정했습니다.E. cuniculi는 비정상적으로 작은 진핵 게놈을 가지고 있어 게놈 붕괴를 연구하기 위한 모델 유기체로 사용되는 기생성 미포자충 그룹에 속하는 곰팡이 같은 유기체입니다.최근, Microsporidia, Paranosema locustae 및 Vairimorpha necatrix31,32(~3.2Mb 게놈)의 적당히 감소된 게놈에 대해 cryo-EM 리보솜 구조가 결정되었습니다.이러한 구조는 rRNA 증폭의 일부 손실이 인접한 리보솜 단백질 사이의 새로운 접촉의 발달 또는 새로운 msL131,32 리보솜 단백질의 획득에 의해 보상됨을 시사합니다.Encephalitozoon 종(게놈 ~250만 bp)은 가장 가까운 친척 Ordospora와 함께 진핵생물에서 궁극적인 게놈 감소 정도를 보여줍니다. 그들은 2000개 미만의 단백질 코딩 유전자를 가지고 있으며 그들의 리보솜에는 rRNA 확장 조각(세균 리보솜과 진핵 리보솜을 구별하는 rRNA 조각)이 없을 뿐만 아니라 E. cuni에 상동체가 없기 때문에 4개의 리보솜 단백질도 있습니다. culi genome26,27,28.따라서 우리는 E. cuniculi 리보솜이 게놈 붕괴에 대한 분자 적응을 위한 이전에 알려지지 않은 전략을 밝힐 수 있다고 결론지었습니다.
당사의 cryo-EM 구조는 특성화할 가장 작은 진핵 세포질 리보솜을 나타내며 궁극적인 게놈 감소 정도가 세포에 필수적인 분자 기계의 구조, 조립 및 진화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공합니다.우리는 E. cuniculi 리보솜이 널리 보존된 RNA 폴딩 및 리보솜 조립의 많은 원칙을 위반하고 이전에 알려지지 않은 새로운 리보솜 단백질을 발견했음을 발견했습니다.예상외로 우리는 미포자충 리보솜이 작은 분자에 결합하는 능력을 진화시켰음을 보여주고 rRNA와 단백질의 절단이 궁극적으로 리보솜에 유용한 특성을 부여할 수 있는 진화적 혁신을 유발한다는 가설을 세웁니다.
세포내 유기체에서 단백질과 핵산의 진화에 대한 이해를 높이기 위해 감염된 포유류 세포의 배양물에서 E. cuniculi 포자를 분리하여 리보솜을 정제하고 이러한 리보솜의 구조를 결정하기로 결정했습니다.미포자충은 영양배지에서 배양할 수 없기 때문에 기생성 미포자충을 대량으로 얻기 어렵다.대신 숙주 세포 내에서만 자라고 번식합니다.따라서 리보솜 정제를 위한 E. cuniculi 바이오매스를 얻기 위해 포유류 신장 세포주 RK13에 E. cuniculi 포자를 감염시키고 이 감염된 세포를 몇 주 동안 배양하여 E. cuniculi가 성장하고 증식할 수 있도록 했습니다.약 0.5제곱미터의 감염된 세포 단층을 사용하여 약 300mg의 미포자충 포자를 정제하고 리보솜을 분리하는 데 사용할 수 있었습니다.그런 다음 유리 구슬로 정제된 포자를 파괴하고 용해물의 단계적 폴리에틸렌 글리콜 분류를 사용하여 조 리보솜을 분리했습니다.이를 통해 구조 분석을 위한 약 300µg의 원시 E. cuniculi 리보솜을 얻을 수 있었습니다.
그런 다음 결과 리보솜 샘플을 사용하여 cryo-EM 이미지를 수집하고 큰 리보솜 소단위, 작은 소단위 머리 및 작은 소단위에 해당하는 마스크를 사용하여 이러한 이미지를 처리했습니다.이 과정에서 우리는 약 108,000개의 리보솜 입자의 이미지를 수집하고 2.7Å의 해상도로 cryo-EM 이미지를 계산했습니다(보충 그림 1-3).그런 다음 cryoEM 이미지를 사용하여 E. cuniculi 리보솜과 관련된 rRNA, 리보솜 단백질 및 최대 절전 모드 인자 Mdf1을 모델링했습니다(그림 1a, b).
최대 절전 모드 인자 Mdf1 (pdb id 7QEP)과 복잡한 E. cuniculi 리보솜의 구조.b E. cuniculi ribosome과 관련된 최대 절전 모드 인자 Mdf1의지도.c Microsporidian 종에서 회수된 rRNA를 알려진 리보솜 구조와 비교하는 이차 구조 맵.패널은 디코딩 사이트(DC), 사르시니신 루프(SRL) 및 펩티딜 트랜스퍼라제 센터(PTC)를 포함하여 증폭된 rRNA 단편(ES) 및 리보솜 활성 사이트의 위치를 ​​보여줍니다.d E. cuniculi ribosome의 peptidyl transferase 중심에 해당하는 전자 밀도는 이 촉매 부위가 H. sapiens를 포함한 E. cuniculi 기생충과 그 숙주에서 동일한 구조를 가지고 있음을 시사합니다.e, f 해독 중심(e)의 해당 전자 밀도와 해독 중심(f)의 도식적 구조는 E. cuniculi가 다른 많은 진핵생물에서 A1491(대장균 번호 매기기) 대신 잔기 U1491을 가지고 있음을 나타냅니다.이러한 변화는 E. cuniculi가 이 활성 부위를 표적으로 하는 항생제에 민감할 수 있음을 시사합니다.
이전에 확립된 V. necatrix 및 P. locustae 리보솜의 구조(두 구조 모두 동일한 미포자충과 Nosematidae를 나타내며 서로 매우 유사함)와 달리 E. cuniculi 리보솜은 수많은 rRNA 및 단백질 단편화 과정을 거칩니다.추가 변성(보조 그림 4-6).rRNA에서 가장 눈에 띄는 변화는 증폭된 25S rRNA 조각 ES12L의 완전한 손실과 h39, h41 및 H18 나선의 부분적 변성이었습니다(그림 1c, 보충 그림 4).리보솜 단백질 중에서 가장 눈에 띄는 변화는 eS30 단백질의 완전한 손실과 eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 및 eS7 단백질의 단축을 포함했습니다(보충 그림 4, 5).
따라서 Encephalotozoon/Ordospora 종의 게놈의 극단적인 감소는 리보솜 구조에 반영됩니다. E. cuniculi 리보솜은 구조적 특성화 대상인 진핵 세포질 리보솜에서 단백질 함량의 가장 극적인 손실을 경험하며 진핵생물뿐만 아니라 생명의 세 가지 영역에서도 널리 보존되는 rRNA 및 단백질 단편조차 가지고 있지 않습니다.E. cuniculi ribosome의 구조는 이러한 변화에 대한 첫 번째 분자 모델을 제공하고 비교 유전체학 및 세포 내 생체 분자 구조에 대한 연구에서 간과된 진화적 사건을 보여줍니다(보충 그림 7).아래에서 우리는 진화적 기원과 리보솜 기능에 대한 잠재적 영향과 함께 이러한 각 사건을 설명합니다.
그런 다음 큰 rRNA 절단 외에도 E. cuniculi 리보솜이 활성 사이트 중 하나에서 rRNA 변이를 가지고 있음을 발견했습니다.E. cuniculi 리보솜의 펩티딜 트랜스퍼라제 중심은 다른 진핵 리보솜과 동일한 구조를 갖지만(그림 1d), 해독 중심은 뉴클레오티드 1491의 서열 변이로 인해 다릅니다(E. coli 번호 매기기, 그림 1e, f).진핵 리보솜의 해독 부위는 일반적으로 박테리아 유형 잔기 A1408 및 G1491과 비교하여 잔기 G1408 및 A1491을 포함하기 때문에 이러한 관찰이 중요합니다.이러한 변이는 해독 부위를 표적으로 하는 다른 소분자 및 리보솜 항생제의 아미노글리코사이드 계열에 대한 박테리아 및 진핵 리보솜의 상이한 민감도의 기초가 됩니다.E. cuniculi 리보솜의 해독 부위에서 잔기 A1491이 U1491로 대체되어 잠재적으로 이 활성 부위를 표적으로 하는 작은 분자에 대한 고유한 결합 인터페이스를 생성합니다.동일한 A14901 변이체가 P. locustae 및 V. necatrix와 같은 다른 미포자충에도 존재하여 미포자충 종 사이에 널리 퍼져 있음을 시사합니다(그림 1f).
우리의 E. cuniculi 리보솜 샘플은 대사적으로 비활성 포자로부터 분리되었기 때문에 스트레스 또는 기아 조건에서 이전에 설명한 리보솜 결합에 대해 E. cuniculi의 cryo-EM 지도를 테스트했습니다.동면 인자 31,32,36,37, 38. 우리는 이전에 확립된 동면 리보솜의 구조를 E. cuniculi 리보솜의 cryo-EM 지도와 일치시켰습니다.도킹을 위해 S. cerevisiae 리보솜은 동면 인자 Stm138과 복합체로, locust 리보솜은 Lso232 인자와 복합체로, V. necatrix 리보솜은 Mdf1 및 Mdf231 인자와 복합체로 사용되었습니다.동시에 나머지 요소 Mdf1에 해당하는 cryo-EM 밀도를 찾았습니다.V. necatrix 리보솜에 결합하는 Mdf1과 유사하게, Mdf1은 또한 E. cuniculi 리보솜에 결합하여 리보솜의 E 사이트를 차단하여 기생충 포자가 신체 불활성화 시 대사적으로 비활성화될 때 리보솜을 사용할 수 있도록 도와줍니다(그림 2).).
Mdf1은 기생충 포자가 대사적으로 비활성화될 때 리보솜을 비활성화하는 데 도움이 되는 것으로 보이는 리보솜의 E 사이트를 차단합니다.E. cuniculi 리보솜의 구조에서 우리는 Mdf1이 단백질 합성 동안 리보솜에서 탈아실화된 tRNA의 방출을 촉진하는 리보솜의 일부인 L1 리보솜 줄기와 이전에 알려지지 않은 접촉을 형성한다는 것을 발견했습니다.이러한 접촉은 Mdf1이 탈아세틸화된 tRNA와 동일한 메커니즘을 사용하여 리보솜에서 분리되어 리보솜이 Mdf1을 제거하여 단백질 합성을 재활성화하는 방법에 대한 가능한 설명을 제공한다는 것을 시사합니다.
그러나 우리의 구조는 Mdf1과 L1 리보솜 다리(단백질 합성 중에 리보솜에서 탈아실화된 tRNA를 방출하는 데 도움이 되는 리보솜의 일부) 사이에 알려지지 않은 접촉을 드러냈습니다.특히, Mdf1은 탈아실화된 tRNA 분자의 팔꿈치 분절과 동일한 접점을 사용합니다(그림 2).이전에 알려지지 않은 이 분자 모델링은 Mdf1이 탈아세틸화된 tRNA와 동일한 메커니즘을 사용하여 리보솜에서 해리된다는 것을 보여주었고, 이는 리보솜이 단백질 합성을 재활성화하기 위해 이 동면 인자를 제거하는 방법을 설명합니다.
rRNA 모델을 구성할 때, 우리는 E. cuniculi 리보솜이 비정상적으로 접힌 rRNA 단편을 가지고 있음을 발견했으며, 이를 융합 rRNA라고 합니다(그림 3).생명의 세 영역에 걸쳐 있는 리보솜에서 rRNA는 대부분의 rRNA 염기가 염기쌍을 이루고 서로 접히거나 리보솜 단백질과 상호 작용하는 구조로 접힙니다.그러나 E. cuniculi 리보솜에서 rRNA는 나선의 일부를 펼쳐진 rRNA 영역으로 전환함으로써 이러한 접힘 원리를 위반하는 것으로 보입니다.
S. cerevisiae, V. necatrix 및 E. cuniculi의 H18 25S rRNA 나선 구조.일반적으로 3개의 생명 영역에 걸쳐 있는 리보솜에서 이 링커는 24~34개의 잔기를 포함하는 RNA 나선으로 감깁니다.대조적으로, 미포자충에서, 이 rRNA 링커는 12개의 잔기만을 포함하는 2개의 단일 가닥 우리딘이 풍부한 링커로 점차 감소합니다.이러한 잔류물의 대부분은 용매에 노출됩니다.그림은 기생성 미포자충이 rRNA 염기가 일반적으로 다른 염기와 결합되거나 rRNA-단백질 상호작용에 관여하는 rRNA 접힘의 일반 원칙을 위반하는 것으로 보인다는 것을 보여줍니다.미포자충에서 일부 rRNA 단편은 바람직하지 않은 접힘을 취하는데, 여기서 이전 rRNA 나선은 거의 직선으로 늘어난 단일 가닥 단편이 됩니다.이러한 특이한 영역의 존재로 인해 미포자충 rRNA는 최소 수의 RNA 염기를 사용하여 먼 rRNA 단편에 결합할 수 있습니다.
이 진화적 전환의 가장 놀라운 예는 H18 25S rRNA 나선에서 관찰할 수 있습니다(그림 3).대장균에서 인간에 이르는 종에서 이 rRNA 나선의 염기는 24-32개의 뉴클레오티드를 포함하며 약간 불규칙한 나선을 형성합니다.이전에 확인된 V. necatrix 및 P. locustae31,32의 리보솜 구조에서 H18 나선의 염기는 부분적으로 풀리지만 뉴클레오티드 염기쌍은 보존됩니다.그러나 E. cuniculi에서 이 rRNA 조각은 가장 짧은 링커 228UUUGU232 및 301UUUUUUUUU307이 됩니다.일반적인 rRNA 조각과 달리 이러한 우리딘이 풍부한 링커는 리보솜 단백질과 광범위하게 접촉하거나 꼬이지 않습니다.대신, 그들은 rRNA 가닥이 거의 직선으로 확장되는 용매 개방 및 완전히 펼쳐진 구조를 채택합니다.이 늘어난 형태는 E. cuniculi가 H16과 H18 rRNA 나선 사이의 33Å 간격을 채우기 위해 12개의 RNA 염기만을 사용하는 반면, 다른 종은 간격을 채우기 위해 적어도 두 배의 rRNA 염기를 필요로 하는 방법을 설명합니다.
따라서 우리는 에너지적으로 바람직하지 않은 폴딩을 통해 기생성 미포자충이 생명의 세 가지 영역에서 종 전체에 걸쳐 광범위하게 보존된 rRNA 세그먼트까지도 수축시키는 전략을 개발했음을 입증할 수 있습니다.분명히, rRNA 나선을 짧은 폴리-U 링커로 변형시키는 돌연변이를 축적함으로써, E. cuniculi는 원위 rRNA 단편의 결찰을 위해 가능한 한 적은 뉴클레오티드를 포함하는 특이한 rRNA 단편을 형성할 수 있습니다.이것은 미포자충이 구조적 및 기능적 무결성을 잃지 않고 기본 분자 구조를 극적으로 감소시킨 방법을 설명하는 데 도움이 됩니다.
E. cuniculi rRNA의 또 다른 특이한 특징은 비후가 없는 rRNA의 출현입니다(그림 4).벌지는 RNA 나선에 숨어 있는 대신에 RNA 나선 밖으로 비틀어지는 염기쌍이 없는 뉴클레오티드입니다.대부분의 rRNA 돌출부는 분자 접착제 역할을 하여 인접한 리보솜 단백질이나 다른 rRNA 조각을 결합하는 데 도움을 줍니다.돌출부 중 일부는 경첩 역할을 하여 rRNA 나선이 생산적인 단백질 합성을 위해 최적으로 구부러지고 접힐 수 있도록 합니다 41 .
a rRNA 돌출부(S. cerevisiae 번호 매기기)는 E. cuniculi 리보솜 구조에는 없지만 대부분의 다른 진핵생물에는 존재합니다 b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens 및 E. cuniculi 내부 리보솜.기생충에는 고대의 고도로 보존된 rRNA 돌출부가 많이 없습니다.이러한 농축은 리보솜 구조를 안정화시킵니다.따라서 미포자충에 그들의 부재는 미포자충 기생충에서 rRNA 접힘의 감소된 안정성을 나타냅니다.P 스템(박테리아의 L7/L12 스템)과의 비교는 rRNA 범프의 손실이 때때로 손실된 범프 옆에 새로운 범프의 출현과 일치한다는 것을 보여줍니다.23S/28S rRNA의 H42 나선은 생명의 세 가지 영역에서 보호되기 때문에 적어도 35억 년 된 것으로 추정되는 고대 돌출부(Saccharomyces cerevisiae의 U1206)를 가지고 있습니다.미포자충에서는 이 팽창이 제거됩니다.그러나 사라진 돌출부 옆에 새로운 돌출부가 나타났다(E. cuniculi의 A1306).
놀랍게도 우리는 E. cuniculi 리보솜이 다른 진핵생물에서 보존된 30개 이상의 돌출부를 포함하여 다른 종에서 발견되는 대부분의 rRNA 돌출부가 결여되어 있음을 발견했습니다(그림 4a).이 손실은 리보솜 소단위와 인접한 rRNA 나선 사이의 많은 접촉을 제거하고 때로는 리보솜 내에 큰 빈 공간을 만들어 E. cuniculi 리보솜을 보다 전통적인 리보솜에 비해 더 다공성으로 만듭니다(그림 4b).특히, 우리는 이전 구조 분석31,32에서 간과했던 이전에 확인된 V. necatrix 및 P. locustae 리보솜 구조에서도 이러한 팽창의 대부분이 손실되었음을 발견했습니다.
때때로 rRNA 팽창의 소실은 소실된 팽창 옆에 새로운 팽창이 발생하는 것을 동반합니다.예를 들어, 리보솜 P-줄기에는 E. coli에서 인간까지 살아남은 U1208 돌출부(Saccharomyces cerevisiae에서)가 포함되어 있으므로 35억 년 된 것으로 추정됩니다.단백질 합성 동안 이 팽창은 P 줄기가 열린 형태와 닫힌 형태 사이를 이동하도록 도와서 리보솜이 번역 인자를 모집하고 활성 부위로 전달할 수 있도록 합니다.E. cuniculi 리보솜에서는 이러한 두꺼워짐이 없습니다.그러나 3개의 염기 쌍에만 위치한 새로운 비후화(G883)는 P 줄기의 최적 유연성 복원에 기여할 수 있습니다(그림 4c).
돌출부가 없는 rRNA에 대한 우리의 데이터는 rRNA 최소화가 리보솜 표면의 rRNA 요소의 손실에 국한되지 않고 리보솜 핵을 포함하여 자유 생활 세포에서 설명되지 않은 기생충 특정 분자 결함을 생성할 수도 있음을 시사합니다.살아있는 종들이 관찰된다.
정식 리보솜 단백질과 rRNA를 모델링한 후, 우리는 기존의 리보솜 구성 요소가 cryo-EM 이미지의 세 부분을 설명할 수 없다는 것을 발견했습니다.이 조각 중 두 개는 크기가 작은 분자입니다(그림 5, 보충 그림 8).첫 번째 세그먼트는 E. cuniculi에서 단축된 eL18의 C-말단이 일반적으로 차지하는 위치에서 리보솜 단백질 uL15와 eL18 사이에 끼어 있습니다.이 분자의 정체를 확인할 수는 없지만 이 밀도 섬의 크기와 모양은 스페르미딘 분자의 존재로 잘 설명됩니다.리보솜에 대한 결합은 uL15 단백질(Asp51 및 Arg56)의 미세포자충 특이 돌연변이에 의해 안정화되며, 이는 uL15가 작은 분자를 리보솜 구조로 감싸도록 허용하기 때문에 이 작은 분자에 대한 리보솜의 친화성을 증가시키는 것으로 보입니다.보충 그림 2).8, 추가 데이터 1, 2).
E. cuniculi 리보솜에 결합된 리보스 외부의 뉴클레오티드의 존재를 보여주는 Cryo-EM 이미징.E. cuniculi 리보솜에서 이 뉴클레오티드는 대부분의 다른 진핵 리보솜에서 25S rRNA A3186 뉴클레오티드(Saccharomyces cerevisiae 넘버링)와 같은 위치를 차지합니다.b E. cuniculi의 리보솜 구조에서 이 뉴클레오티드는 리보솜 단백질 uL9와 eL20 사이에 위치하여 두 단백질 간의 접촉을 안정화시킵니다.cd eL20 microsporidia 종 간의 서열 보존 분석.미포자충 종의 계통수(c)와 eL20 단백질의 다중 서열 정렬(d)은 뉴클레오타이드 결합 잔기 F170 및 K172가 ES39L rRNA 확장을 유지하는 초기 분지 미포자충을 제외하고 S. lophii를 제외하고 대부분의 전형적인 미포자충에서 보존됨을 보여줍니다.e 이 그림은 뉴클레오티드 결합 잔기 F170 및 K172가 고도로 감소된 미포자충 게놈의 eL20에만 존재하고 다른 진핵생물에는 존재하지 않음을 보여줍니다.전반적으로, 이러한 데이터는 미포자충 리보솜이 AMP 분자에 결합하여 리보솜 구조에서 단백질-단백질 상호 작용을 안정화하는 데 사용하는 것으로 보이는 뉴클레오티드 결합 부위를 개발했음을 시사합니다.미포자충에서 이 결합 부위의 높은 보존성과 다른 진핵생물에서의 부재는 이 부위가 미포자충에 대한 선택적인 생존 이점을 제공할 수 있음을 시사합니다.따라서 미포자충 리보솜의 뉴클레오타이드 결합 포켓은 이전에 설명한 rRNA 분해의 퇴화 특징이나 최종 형태가 아니라 미포자충 리보솜이 작은 분자를 분자 빌딩 블록으로 사용하여 직접 결합할 수 있도록 하는 유용한 진화적 혁신으로 보입니다.리보솜의 빌딩 블록.이 발견으로 미포자충 리보솜은 단일 뉴클레오티드를 구조 구성 요소로 사용하는 것으로 알려진 유일한 리보솜이 되었습니다.f 뉴클레오티드 결합에서 파생된 가상의 진화 경로.
두 번째 저분자량 밀도는 리보솜 단백질 uL9과 eL30 사이의 경계면에 위치합니다(그림 5a).이 인터페이스는 이전에 rRNA A3186(ES39L rRNA 확장의 일부)의 25S 뉴클레오티드에 대한 결합 부위로서 Saccharomyces cerevisiae 리보솜의 구조에서 설명되었습니다.퇴화 P. locustae ES39L 리보솜에서 이 인터페이스는 알려지지 않은 단일 뉴클레오티드 31에 결합하는 것으로 나타났으며, 이 뉴클레오티드는 rRNA의 길이가 ~130-230 염기인 감소된 최종 형태의 rRNA인 것으로 추정됩니다.ES39L은 단일 뉴클레오티드 32.43으로 환원됩니다.당사의 cryo-EM 이미지는 밀도가 뉴클레오티드로 설명될 수 있다는 생각을 뒷받침합니다.그러나 우리 구조의 더 높은 분해능은 이 뉴클레오티드가 extraribosomal 분자, 아마도 AMP라는 것을 보여주었습니다(그림 5a, b).
그런 다음 뉴클레오타이드 결합 부위가 E. cuniculi 리보솜에 나타나는지 또는 이전에 존재했는지 물었습니다.뉴클레오타이드 결합은 주로 eL30 리보솜 단백질의 Phe170 및 Lys172 잔기에 의해 매개되기 때문에, 우리는 4396개의 대표적인 진핵생물에서 이들 잔기의 보존을 평가했습니다.위의 uL15의 경우에서와 같이, 우리는 Phe170 및 Lys172 잔기가 전형적인 미포자충에서만 고도로 보존되고 ES39L rRNA 단편이 환원되지 않는 비정형 미포자충 미토스포리디움 및 Amphiamblys를 포함하는 다른 진핵생물에는 존재하지 않음을 발견했습니다44, 45, 46 (도 5c).-이자형).
종합하면, 이러한 데이터는 E. cuniculi 및 아마도 다른 정식 미포자충이 rRNA 및 단백질 수준의 감소를 보상하기 위해 리보솜 구조에서 많은 수의 작은 대사 산물을 효율적으로 포획하는 능력을 발전시켰다는 생각을 뒷받침합니다.그렇게 함으로써 그들은 리보솜 외부의 뉴클레오타이드에 결합하는 독특한 능력을 개발하여 기생 분자 구조가 풍부한 작은 대사 산물을 포획하고 분해된 RNA 및 단백질 조각의 구조적 모방으로 사용함으로써 보상한다는 것을 보여주었습니다..
큰 리보솜 소단위에서 발견되는 cryo-EM 지도의 시뮬레이션되지 않은 세 번째 부분입니다.우리 지도의 상대적으로 높은 해상도(2.6 Å)는 이 밀도가 큰 측쇄 잔기의 고유한 조합을 가진 단백질에 속한다는 것을 시사하며, 이는 우리가 이 밀도를 우리가 식별한 이전에 알려지지 않은 리보솜 단백질로 식별할 수 있게 했습니다. 그것은 msL2(Microsporidia-specific protein L2)로 명명되었습니다(방법, 그림 6).우리의 상동성 검색은 msL2가 Encephaliter 및 Orosporidium 속의 Microsporidia clade에서 보존되지만 다른 Microsporidia를 포함한 다른 종에는 없음을 보여주었습니다.리보솜 구조에서 msL2는 확장된 ES31L rRNA의 손실로 인해 형성된 틈을 차지합니다.이 공백에서 msL2는 rRNA 폴딩을 안정화하고 ES31L의 손실을 보상할 수 있습니다(그림 6).
E. cuniculi 리보솜에서 발견되는 Microsporidia 특정 리보솜 단백질 msL2의 전자 밀도 및 모델.b Saccharomyces cerevisiae의 80S 리보솜을 포함한 대부분의 진핵 리보솜은 대부분의 Microsporidian 종에서 ES19L rRNA 증폭이 손실되었습니다.V. necatrix microsporidia 리보솜의 이전에 확립된 구조는 이러한 기생충에서 ES19L의 손실이 새로운 msL1 리보솜 단백질의 진화에 의해 보상됨을 시사합니다.이 연구에서 우리는 E. cuniculi 리보솜이 ES19L 손실에 대한 명백한 보상으로 추가 리보솜 RNA 모방 단백질을 개발했음을 발견했습니다.그러나 msL2(현재 가상 ECU06_1135 단백질로 주석이 있음)와 msL1은 서로 다른 구조적 및 진화적 기원을 가지고 있습니다.c 진화적으로 관련이 없는 msL1 및 msL2 리보솜 단백질의 생성에 대한 이러한 발견은 리보솜이 rRNA에 해로운 돌연변이를 축적하는 경우 밀접하게 관련된 종의 작은 하위 집합에서도 전례 없는 수준의 구성 다양성을 달성할 수 있음을 시사합니다.이 발견은 매우 감소된 rRNA와 종에 걸친 단백질 구성의 비정상적인 가변성으로 알려진 미토콘드리아 리보솜의 기원과 진화를 명확히 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
그런 다음 msL2 단백질을 이전에 설명한 msL1 단백질, V. necatrix 리보솜에서 발견되는 유일한 미포자충 특이 리보솜 단백질과 비교했습니다.msL1과 msL2가 진화적으로 관련되어 있는지 테스트하고 싶었습니다.우리의 분석에 따르면 msL1과 msL2는 리보솜 구조에서 동일한 공동을 차지하지만 서로 다른 1차 및 3차 구조를 가지며 이는 독립적인 진화 기원을 나타냅니다(그림 6).따라서, msL2의 발견은 소형 진핵 생물 종의 그룹이 rRNA 단편의 손실을 보상하기 위해 구조적으로 구별되는 리보솜 단백질을 독립적으로 진화시킬 수 있다는 증거를 제공합니다.이 발견은 대부분의 세포질 진핵 리보솜이 81개의 리보솜 단백질의 동일한 패밀리를 포함하는 불변 단백질을 포함한다는 점에서 주목할 만합니다.확장된 rRNA 세그먼트의 손실에 대한 반응으로 미포자충의 다양한 클레이드에서 msL1 및 msL2의 출현은 기생충의 분자 구조의 저하로 인해 기생충이 보상 돌연변이를 추구하게 되어 결국 다른 기생충 개체군에서 획득할 수 있음을 시사합니다.구조.
마지막으로 모델이 완성되었을 때 우리는 E. cuniculi 리보솜의 구성을 게놈 서열에서 예측된 구성과 비교했습니다.eL14, eL38, eL41 및 eS30을 포함한 여러 리보솜 단백질은 이전에 E. cuniculi 게놈에서 상동체가 명백히 없기 때문에 E. cuniculi 게놈에서 누락된 것으로 생각되었습니다.많은 리보솜 단백질의 손실은 대부분의 다른 고도로 감소된 세포내 기생충 및 내공생체에서도 예측됩니다.예를 들어, 대부분의 자유 생활 박테리아는 54개의 리보솜 단백질로 구성된 동일한 패밀리를 포함하지만 이러한 단백질 패밀리 중 11개만이 호스트 제한 박테리아의 각 분석된 게놈에서 검출 가능한 상동체를 가지고 있습니다.이 개념을 뒷받침하기 위해 eL38 및 eL4131,32 단백질이 부족한 V. necatrix 및 P. locustae microsporidia에서 리보솜 단백질의 손실이 실험적으로 관찰되었습니다.
그러나 우리의 구조는 eL38, eL41 및 eS30만이 실제로 E. cuniculi 리보솜에서 손실되었음을 보여줍니다.eL14 단백질은 보존되었고 우리의 구조는 이 단백질이 상동성 검색에서 찾을 수 없는 이유를 보여주었습니다(그림 7).E. cuniculi 리보솜에서 eL14 결합 부위의 대부분은 rRNA로 증폭된 ES39L의 분해로 인해 손실됩니다.ES39L이 없는 경우 eL14는 대부분의 2차 구조를 잃었고 eL14 서열의 18%만이 E. cuniculi와 S. cerevisiae에서 동일했습니다.15억년 간격으로 진화한 유기체인 Saccharomyces cerevisiae와 Homo sapiens도 eL14에서 동일한 잔기의 51% 이상을 공유하기 때문에 이러한 빈약한 서열 보존은 주목할 만합니다.이 비정상적인 보존 손실은 E. cuniculi eL14가 현재 eL1427 리보솜 단백질이 아닌 추정 M970_061160 단백질로 주석이 달린 이유를 설명합니다.
미포자충 리보솜은 ES39L rRNA 확장을 상실하여 eL14 리보솜 단백질 결합 부위를 부분적으로 제거했습니다.ES39L이 없는 경우, eL14 미세포자 단백질은 2차 구조의 손실을 겪으며, 여기서 이전 rRNA 결합 α-나선은 최소 길이 루프로 변성됩니다.b 다중 서열 정렬은 eL14 단백질이 진핵생물 종에서 고도로 보존되어 있지만(효모와 인간 동족체 사이의 서열 동일성 57%), 미포자충에서는 잘 보존되지 않고 분기됨(24% 이하의 잔기가 eL14 동족체와 동일함)을 보여줍니다.S. cerevisiae 또는 H. sapiens에서).이 열악한 서열 보존 및 2차 구조 가변성은 eL14 상동체가 E. cuniculi에서 발견되지 않은 이유와 이 단백질이 E. cuniculi에서 손실된 것으로 생각되는 이유를 설명합니다.대조적으로, E. cuniculi eL14는 이전에 추정 M970_061160 단백질로 주석이 달렸습니다.이 관찰은 미포자충 게놈 다양성이 현재 과대평가되고 있음을 시사합니다. 현재 미포자충에서 손실된 것으로 생각되는 일부 유전자는 실제로 매우 분화된 형태이지만 보존됩니다.대신, 일부는 벌레 특정 단백질(예: 가상 단백질 M970_061160)에 대한 미포자충 유전자를 코딩하는 것으로 생각되며 실제로는 다른 진핵생물에서 발견되는 매우 다양한 단백질을 코딩합니다.
이 발견은 rRNA 변성이 인접한 리보솜 단백질에서 서열 보존의 극적인 손실로 이어질 수 있으며, 이러한 단백질을 상동성 검색에서 감지할 수 없게 만들 수 있음을 시사합니다.따라서 소실된 것으로 생각되는 일부 단백질이 실제로는 크게 변형된 형태로 유지되기 때문에 작은 게놈 유기체에서 분자 분해의 실제 정도를 과대평가할 수 있습니다.
기생충은 극도의 게놈 감소 조건에서 어떻게 분자 기계의 기능을 유지할 수 있습니까?우리의 연구는 가장 작은 진핵 게놈 중 하나를 가진 유기체인 E. cuniculi의 복잡한 분자 구조(리보솜)를 설명함으로써 이 질문에 답합니다.
미생물 기생충의 단백질 및 RNA 분자는 품질 관리 센터가 없기 때문에 자유 생활 종의 상동 분자와 ​​종종 다르고 자유 생활 미생물에서는 크기가 50%로 줄어드는 등 거의 20년 동안 알려져 왔습니다.접힘과 기능을 손상시키는 많은 쇠약한 돌연변이.예를 들어, 많은 세포내 기생충과 내공생체를 포함한 작은 게놈 유기체의 리보솜은 자유 생활 종에 비해 여러 리보솜 단백질과 최대 1/3의 rRNA 뉴클레오티드가 부족할 것으로 예상됩니다 27, 29, 30, 49. 그러나 이러한 분자가 기생충에서 기능하는 방식은 주로 비교 유전체학을 통해 연구되는 미스터리로 남아 있습니다.
우리의 연구는 거대 분자의 구조가 세포 내 기생충 및 기타 숙주 제한 유기체에 대한 전통적인 비교 게놈 연구에서 추출하기 어려운 진화의 많은 측면을 밝힐 수 있음을 보여줍니다 (보충 그림 7).예를 들어, eL14 단백질의 예는 기생 종에서 분자 장치의 실제 분해 정도를 과대 평가할 수 있음을 보여줍니다.뇌염 기생충은 현재 수백 개의 미포자충 특정 유전자를 가지고 있는 것으로 여겨집니다.그러나 우리의 결과는 겉으로 보기에 특정한 유전자 중 일부가 실제로는 다른 진핵생물에서 흔히 볼 수 있는 유전자의 매우 다른 변종이라는 것을 보여줍니다.게다가 msL2 단백질의 예는 우리가 어떻게 새로운 리보솜 단백질을 간과하고 기생 분자 기계의 내용을 과소평가하는지 보여줍니다.작은 분자의 예는 새로운 생물학적 활동을 제공할 수 있는 기생 분자 구조의 가장 독창적인 혁신을 어떻게 간과할 수 있는지 보여줍니다.
종합하면, 이러한 결과는 숙주 제한 유기체의 분자 구조와 자유 생활 유기체의 분자 구조 간의 차이에 대한 이해를 향상시킵니다.우리는 오랫동안 축소되고, 퇴화되고, 다양한 쇠약화 돌연변이의 대상이 된다고 생각되었던 분자 기계가 체계적으로 간과된 비정상적인 구조적 특징을 가지고 있음을 보여줍니다.
다른 한편으로, 우리가 E. cuniculi의 리보솜에서 발견한 부피가 크지 않은 rRNA 조각과 융합된 조각은 게놈 감소가 거의 35억 년 후에 생명의 세 가지 영역에서 보존되는 기본 분자 기계의 일부까지도 변경할 수 있음을 시사합니다.종의 독립적 진화.
E. cuniculi ribosome의 bulge-free 및 fused rRNA fragments는 endosymbiotic 박테리아의 RNA 분자에 대한 이전 연구에 비추어 볼 때 특히 중요합니다.예를 들어, 진딧물 내공생체 Buchnera aphidicola에서 rRNA 및 tRNA 분자는 A+T 구성 편향과 높은 비율의 비표준 염기쌍20,50으로 인해 온도에 민감한 구조를 갖는 것으로 나타났습니다.이러한 RNA의 변화와 단백질 분자의 변화는 이제 내공생체가 파트너에 과도하게 의존하고 내공생체가 열을 전달하지 못하는 원인이 되는 것으로 생각됩니다 21, 23 .기생성 미포자충 rRNA는 구조적으로 뚜렷한 변화가 있지만, 이러한 변화의 특성은 감소된 열 안정성과 샤페론 단백질에 대한 높은 의존도가 감소된 게놈을 가진 유기체에서 RNA 분자의 일반적인 특징일 수 있음을 시사합니다.
다른 한편으로, 우리의 구조는 기생충 미포자충이 광범위하게 보존된 rRNA 및 단백질 조각에 저항하는 독특한 능력을 진화시켜 풍부하고 쉽게 사용할 수 있는 작은 대사 산물을 퇴화 rRNA 및 단백질 조각의 구조적 모방으로 사용하는 능력을 개발했음을 보여줍니다.분자 구조 분해..이 의견은 E. cuniculi의 rRNA 및 리보솜에서 단백질 조각의 손실을 보상하는 작은 분자가 uL15 및 eL30 단백질의 미포자충 특이적인 잔기에 결합한다는 사실에 의해 뒷받침됩니다.이것은 작은 분자가 리보솜에 결합하는 것이 양성 선택의 산물일 수 있음을 시사합니다. 여기서 리보솜 단백질의 미포자충 특이 돌연변이는 작은 분자에 대한 리보솜의 친화성을 증가시키는 능력 때문에 선택되어 보다 효율적인 리보솜 유기체로 이어질 수 있습니다.이 발견은 미생물 기생충의 분자 구조에서 현명한 혁신을 보여주고 기생충 분자 구조가 환원적 진화에도 불구하고 어떻게 기능을 유지하는지 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다.
현재 이러한 작은 분자의 식별은 불분명합니다.리보솜 구조에서 이러한 작은 분자의 모양이 미포자충 종 간에 다른 이유는 명확하지 않습니다.특히, V. necatrix의 eL20 및 K172 단백질에 F170 잔기가 존재함에도 불구하고 왜 뉴클레오타이드 결합이 E. cuniculi 및 P. locustae의 리보솜에서 관찰되고 V. necatrix의 리보솜에서는 관찰되지 않는지 명확하지 않다.이 결실은 V. necatrix의 티로신이고 E. cuniculi 및 P. locustae의 트레오닌이 아닌 잔기 43 uL6(뉴클레오티드 결합 포켓에 인접하여 위치)에 의해 야기될 수 있습니다.Tyr43의 부피가 큰 방향족 측쇄는 입체적 중첩으로 인해 뉴클레오티드 결합을 방해할 수 있습니다.대안적으로, 명백한 뉴클레오티드 결실은 V. necatrix 리보솜 조각의 모델링을 방해하는 cryo-EM 이미징의 저해상도 때문일 수 있습니다.
다른 한편으로, 우리의 연구는 게놈 붕괴 과정이 발명의 힘이 될 수 있음을 시사합니다.특히, E. cuniculi 리보솜의 구조는 미포자충 리보솜에서 rRNA 및 단백질 조각의 손실이 리보솜 구조의 변화를 촉진하는 진화 압력을 생성함을 시사합니다.이러한 변형은 리보솜의 활성 부위에서 멀리 떨어져 발생하며 감소된 rRNA에 의해 파괴될 최적의 리보솜 조립을 유지(또는 복원)하는 데 도움이 되는 것으로 보입니다.이것은 미포자충 리보솜의 주요 혁신이 유전자 드리프트를 완충할 필요성으로 진화한 것으로 보인다는 것을 시사합니다.
아마도 이것은 지금까지 다른 유기체에서 관찰된 적이 없는 뉴클레오티드 결합에 의해 가장 잘 설명됩니다.뉴클레오타이드 결합 잔기가 전형적인 미포자충에는 존재하지만 다른 진핵생물에는 존재하지 않는다는 사실은 뉴클레오타이드 결합 부위가 사라지기를 기다리는 유물이거나 rRNA가 개별 뉴클레오타이드의 형태로 복원되는 최종 부위가 아님을 시사합니다.대신 이 사이트는 몇 차례의 긍정적인 선택을 통해 진화할 수 있었던 유용한 기능처럼 보입니다.뉴클레오티드 결합 부위는 자연 선택의 부산물일 수 있습니다. 일단 ES39L이 분해되면 미포자충은 ES39L이 없는 상태에서 최적의 리보솜 생물 발생을 복원하기 위해 보상을 찾아야 합니다.이 뉴클레오타이드는 ES39L에서 A3186 뉴클레오타이드의 분자 접촉을 모방할 수 있기 때문에 뉴클레오타이드 분자는 리보솜의 빌딩 블록이 되며, 리보솜의 결합은 eL30 서열의 돌연변이에 의해 더욱 향상됩니다.
세포내 기생충의 분자적 진화와 관련하여, 우리의 연구는 다윈의 자연 선택과 게놈 붕괴의 유전적 표류가 병렬로 작동하지 않고 진동한다는 것을 보여줍니다.첫째, 유전적 부동은 생체 분자의 중요한 특징을 제거하므로 보상이 절실히 필요합니다.기생충이 다윈의 자연 선택을 통해 이러한 요구를 충족시킬 때만 거대 분자가 가장 인상적이고 혁신적인 특성을 개발할 기회를 갖게 됩니다.중요하게도, E. cuniculi 리보솜의 뉴클레오티드 결합 부위의 진화는 이러한 분자 진화의 손실-이득 패턴이 해로운 돌연변이를 상각할 뿐만 아니라 때때로 기생 거대분자에 완전히 새로운 기능을 부여한다는 것을 시사합니다.
이 아이디어는 엄격한 자연 선택 시스템이 생물의 혁신 능력을 제한한다고 말하는 Sewell Wright의 이동 평형 이론과 일치합니다51,52,53.그러나 유전적 드리프트가 자연선택을 방해한다면, 이러한 드리프트는 그 자체로는 적응적이지 않은(또는 심지어 해로운) 변화를 일으킬 수 있지만 더 높은 적응도 또는 새로운 생물학적 활동을 제공하는 추가 변화로 이어질 수 있습니다.우리의 프레임워크는 생체 분자의 접힘과 기능을 감소시키는 동일한 유형의 돌연변이가 개선의 주요 원인인 것으로 보인다는 것을 설명함으로써 이 아이디어를 뒷받침합니다.윈-윈 진화 모델에 따라 우리의 연구는 전통적으로 퇴행성 과정으로 간주되는 게놈 붕괴가 혁신의 주요 원동력이며 때로는 거대 분자가 새로운 기생 활동을 획득하도록 허용하는 경우도 있음을 보여줍니다.사용할 수 있습니다.