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혈액뇌장벽과 혈액뇌장벽은 바이오 치료제가 중추신경계에서 표적에 도달하는 것을 막아 신경계 질환의 효과적인 치료를 방해한다.생체 내에서 새로운 뇌 수송체를 발견하기 위해 우리는 T7 파지 펩타이드 라이브러리를 도입하고 쥐의 캐뉼라 의식 대형 풀 모델을 사용하여 연속적으로 혈액 및 뇌척수액(CSF)을 수집했습니다.특정 파지 클론은 4회 선택 후 CSF에서 고도로 농축되었습니다.개별 후보 펩타이드의 테스트는 CSF에서 1000배 이상의 농축을 나타냈습니다.뇌로의 펩티드-매개 전달의 생체활성은 확인된 새로운 수송 펩티드에 연결된 BACE1 펩티드 억제제를 사용하여 뇌척수액에서 아밀로이드-베타 수준의 40% 감소에 의해 확인되었다.이러한 결과는 생체내 파지 선택 방법에 의해 확인된 펩티드가 치료 효과와 함께 거대분자를 뇌로 전신 전달하기 위한 유용한 비히클일 수 있음을 시사한다.
중추신경계(CNS) 표적 치료 연구는 뇌에 활성 약물 전달을 유도하는 메커니즘을 발견하는 데 더 적은 노력을 기울이면서 CNS 표적 특성을 나타내는 최적화된 약물 및 제제를 식별하는 데 주로 중점을 두었습니다.이것은 약물 전달, 특히 큰 분자가 현대 신경과학 약물 개발의 필수적인 부분이기 때문에 이제 변화하기 시작했습니다.중추신경계의 환경은 뇌혈관장벽(BBB)과 혈액뇌장벽(BCBB)1으로 구성된 뇌혈관장벽에 의해 잘 보호되어 있어 뇌에 약물을 전달하는 것이 어렵다1,2.거의 모든 대형 분자 약물과 98% 이상의 소분자 약물이 뇌에서 제거되는 것으로 추정됩니다3.그렇기 때문에 치료 약물을 CNS 4,5로 효율적이고 구체적으로 전달하는 새로운 뇌 수송 시스템을 식별하는 것이 매우 중요합니다.그러나 BBB와 BCSFB는 광범위한 맥관 구조를 통해 뇌의 모든 구조에 침투하고 들어가기 때문에 약물 전달을 위한 훌륭한 기회를 제공합니다.따라서, 뇌에 대한 비침습적 전달 방법을 사용하려는 현재의 노력은 주로 내인성 BBB6 수용체를 사용하는 수용체-매개 수송(PMT)의 메커니즘을 기반으로 합니다.트랜스페린 수용체 경로7,8를 사용한 최근의 주요 발전에도 불구하고 향상된 특성을 가진 새로운 전달 시스템의 추가 개발이 필요합니다.이를 위해 우리의 목표는 원칙적으로 CNS에 거대분자를 전달하거나 새로운 수용체 경로를 여는 데 사용될 수 있기 때문에 CSF 수송을 매개할 수 있는 펩티드를 확인하는 것이었습니다.특히, 뇌혈관 시스템의 특정 수용체 ​​및 수송체(BBB 및 BSCFB)는 바이오 치료제의 능동적이고 특정한 전달을 위한 잠재적인 표적이 될 수 있습니다.뇌척수액(CSF)은 맥락총(CS)의 분비물이며 지주막하 공간과 심실 공간을 통해 뇌의 간질액과 직접 접촉합니다4.최근 지주막하 뇌척수액이 뇌의 간질로 과도하게 확산되는 것으로 나타났습니다9.우리는 이 지주막하 유입관을 사용하거나 BBB를 통해 직접 실질 공간에 접근하기를 희망합니다.이를 달성하기 위해 우리는 이 두 가지 경로 중 하나에 의해 수송되는 펩티드를 이상적으로 식별하는 강력한 생체 내 파지 선택 전략을 구현했습니다.
우리는 이제 가장 높은 라이브러리 다양성으로 초기 선택 라운드를 모니터링하기 위해 높은 처리량 시퀀싱(HTS)과 결합된 CSF 샘플링을 사용하여 순차적인 생체 내 파지 디스플레이 스크리닝 방법을 설명합니다.혈액 오염을 피하기 위해 영구적으로 이식된 큰 수조(CM) 캐뉼라가 있는 의식이 있는 쥐에서 스크리닝을 수행했습니다.중요한 것은 이 접근법이 뇌혈관 장벽을 가로질러 수송 활동을 하는 뇌 표적화 및 펩타이드를 모두 선택한다는 것입니다.우리는 작은 크기(~60nm)10 때문에 T7 파지를 사용했으며 내피 및/또는 상피-수질 장벽의 세포간 교차를 허용하는 소포의 수송에 적합하다고 제안했습니다.4 라운드의 패닝 후, 파지 개체군은 강력한 생체내 CSF 농축 및 대뇌 미세혈관 결합을 나타내는 단리되었다.중요한 것은 선호되고 화학적으로 합성된 최상의 후보 펩타이드가 단백질 화물을 뇌척수액으로 운반할 수 있음을 입증함으로써 우리의 연구 결과를 확인할 수 있었습니다.첫째, CNS의 약력학적 효과는 BACE1 펩타이드의 억제제와 선도적인 수송 펩타이드를 결합하여 확립되었습니다.생체 내 기능 스크리닝 전략이 새로운 뇌 수송 펩타이드를 효과적인 단백질 화물 운반체로 식별할 수 있다는 것을 입증하는 것 외에도, 우리는 유사한 기능 선택 접근법이 새로운 뇌 수송 경로를 식별하는 데 중요해질 것으로 기대합니다.
PFU(plaque-forming units)를 기반으로 파지 패키징 단계 후 약 109개의 다양성을 가진 무작위 12-mer 선형 T7 파지 펩티드 ​​라이브러리가 설계 및 생성되었습니다(재료 및 방법 참조).생체 내 패닝 전에 이 라이브러리를 신중하게 분석했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.수정된 프라이머를 사용한 파지 라이브러리 샘플의 PCR 증폭은 HTS에 직접 적용할 수 있는 앰플리콘을 생성했습니다(보충 그림 1a).a) HTS11 시퀀싱 오류, b) 프라이머(NNK) 1-12의 품질에 대한 영향 및 c) 대기 라이브러리에 야생형(wt) 파지(골격 삽입물)의 존재로 인해 확인된 서열 정보만 추출하기 위해 서열 필터링 절차가 구현되었습니다(보충 그림 1b).이러한 필터 단계는 모든 HTS 시퀀싱 라이브러리에 적용됩니다.표준 라이브러리의 경우 총 233,868개의 판독값을 얻었으며 그 중 39%가 필터 기준을 통과했으며 후속 라운드를 위한 라이브러리 분석 및 선택에 사용되었습니다(보충 그림 1c–e).판독 값은 주로 36개의 뉴클레오티드에서 피크를 갖는 3개의 염기쌍 길이의 배수였으며(보충 그림 1c), 라이브러리 디자인(NNK) 1-12를 확인했습니다.특히, 라이브러리 구성원의 약 11%는 12차원 야생형(wt) 백본 PAGISRELVDKL 삽입을 포함했고, 시퀀스의 거의 절반(49%)은 삽입 또는 삭제를 포함했습니다.라이브러리 라이브러리의 HTS는 라이브러리에서 펩타이드의 높은 다양성을 확인했습니다. 81% 이상의 펩타이드 서열이 한 번만 발견되었고 1.5%만이 4카피 이상에서 발생했습니다(보충 그림 2a).레퍼토리의 모든 12개 위치에서 아미노산(aa)의 빈도는 퇴화 NKK 레퍼토리에 의해 생성된 코돈의 수에 대해 예상되는 빈도와 잘 연관되어 있습니다(보충 그림 2b).이 삽입물에 의해 인코딩된 aa 잔기의 관찰된 빈도는 계산된 빈도(r = 0.893)와 잘 연관되어 있습니다(보충 그림 2c).주입을 위한 파지 라이브러리의 준비에는 내독소의 증폭 및 제거 단계가 포함됩니다.이것은 이전에 파지 라이브러리12,13의 다양성을 잠재적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다.따라서 우리는 엔도톡신 제거를 거친 플레이트 증폭 파지 라이브러리를 시퀀싱하고 원래 라이브러리와 비교하여 AA의 빈도를 추정했습니다.원래 풀과 증폭되고 정제된 풀 사이에 강한 상관관계(r = 0.995)가 관찰되었으며(보충 그림 2d), 이는 T7 파지를 사용하여 플레이트에서 증폭된 클론 간의 경쟁이 큰 편향을 일으키지 않았음을 나타냅니다.HTS로도 라이브러리의 다양성(~109)을 완전히 캡처할 수 없기 때문에 이 비교는 각 라이브러리의 트리펩티드 모티프 빈도를 기반으로 합니다.각 위치에서 aa의 빈도 분석은 입력된 레퍼토리의 마지막 세 위치에서 작은 위치 의존 바이어스를 나타냈습니다(보충 그림 2e).결론적으로 우리는 라이브러리의 품질과 다양성이 허용 가능하며 몇 번의 선택 라운드 사이에 파지 라이브러리의 증폭 및 준비로 인해 다양성의 사소한 변화만 관찰되었다고 결론지었습니다.
일련의 뇌척수액 샘플링은 BBB 및/또는 BCSFB(그림 1a-b)를 통해 정맥 주사(iv)된 T7 파지의 식별을 용이하게 하기 위해 의식이 있는 쥐의 CM에 캐뉼라를 외과적으로 이식하여 수행할 수 있습니다.우리는 생체 내 선택의 처음 세 라운드에서 두 개의 독립적인 선택 암(암 A와 B)을 사용했습니다(그림 1c).우리는 선택의 처음 세 라운드에서 도입된 파지의 총량을 줄임으로써 선택의 엄격함을 점차적으로 높였습니다.패닝의 네 번째 라운드에서는 분기 A와 B의 샘플을 결합하고 3개의 추가 독립 선택을 수행했습니다.이 모델에서 T7 파지 입자의 생체 내 특성을 연구하기 위해 야생형 파지(PAGISRELVDKL 마스터 삽입물)를 쥐의 꼬리 정맥을 통해 주입했습니다.서로 다른 시점에서 뇌척수액과 혈액에서 파지의 회수는 상대적으로 작은 T7 20면체 파지가 혈액 구획에서 빠른 초기 클리어런스 단계를 가짐을 보여주었습니다(보충 그림 3).투여된 역가와 쥐의 혈액량을 기준으로 약 1% wt.투여된 용량의 파지는 정맥 주사 후 10분 후에 혈액에서 검출되었습니다.이러한 초기 급속한 감소 후, 27.7분의 반감기로 더 느린 1차 청소율이 측정되었습니다.중요한 것은 CSF 구획에서 매우 적은 파지 만 검색되어 CSF 구획으로의 야생형 파지 이동에 대한 배경이 낮음을 나타냅니다 (보충 그림 3).평균적으로 혈액 내 T7 파지 역가의 약 1 x 10-3%와 처음 주입된 파지의 4 x 10-8%만이 전체 샘플링 기간(0-250분)에 걸쳐 뇌척수액에서 검출되었습니다.특히, 뇌척수액에서 야생형 파지의 반감기(25.7분)는 혈액에서 관찰된 것과 유사했다.이러한 데이터는 혈액에서 CSF 구획을 분리하는 장벽이 CM-삽입된 쥐에서 온전하여 파지 라이브러리의 생체 내 선택을 통해 혈액에서 CSF 구획으로 쉽게 운반되는 클론을 식별할 수 있음을 보여줍니다.
(a) 대형 풀에서 뇌척수액(CSF)을 재샘플링하는 방법을 설정합니다.(b) 중추신경계(CNS) 장벽의 세포 위치 및 혈액-뇌 장벽(BBB) ​​및 혈액-뇌 장벽을 통과하는 펩티드를 식별하는 데 사용되는 선택 전략을 보여주는 다이어그램.(c) 생체 내 파지 디스플레이 스크리닝 흐름도.선택의 각 라운드에서 파지(화살표 안의 동물 식별자)를 정맥 주사했습니다.두 개의 독립적인 대체 분기(A, B)는 4차 선택까지 별도로 유지됩니다.선택 라운드 3 및 4의 경우 CSF에서 추출한 각 파지 클론을 수동으로 시퀀싱했습니다.(d) T7 펩타이드 라이브러리(2 x 1012 파지/동물)의 정맥 주사 후 2마리의 캐뉼러 쥐에서 선택의 첫 번째 라운드 동안 혈액(빨간색 원)과 뇌척수액(녹색 삼각형)에서 분리된 파지의 동역학.파란색 사각형은 총 혈액량을 고려하여 주입된 파지의 양으로부터 계산된 혈액 내 평균 초기 파지 농도를 나타냅니다.검은색 사각형은 혈중 파지 농도에서 외삽한 y선의 교차점을 나타냅니다.(e,f) 펩티드에서 발견되는 가능한 모든 중복 트리펩티드 모티프의 상대 빈도 및 분포를 제시합니다.1000개의 판독값에서 발견된 모티프의 수가 표시됩니다.크게(p < 0.001) 풍부한 모티프는 빨간색 점으로 표시됩니다.(e) 주입된 라이브러리의 트리펩티드 모티프의 상대 빈도를 동물 #1.1 및 #1.2의 혈액 유래 파지와 비교하는 상관 산점도.(f) 혈액 및 뇌척수액에서 분리된 동물 파지 트리펩타이드 모티프 #1.1 및 #1.2의 상대 빈도를 비교하는 상관관계 산점도.(g, h) 혈액이 풍부한 파지(g) 대 주사된 라이브러리 및 CSF가 풍부한 파지(h) 대 혈액의 서열 ID 표현은 두 동물 모두에서 생체 내 선택 라운드 후.한 글자 코드의 크기는 아미노산이 해당 위치에서 얼마나 자주 발생하는지 나타냅니다.녹색 = 극성, 보라색 = 중성, 파란색 = 염기성, 빨간색 = 산성, 검은색 = 소수성 아미노산.그림 1a, b는 Eduard Urich가 설계하고 제작했습니다.
우리는 파지 펩타이드 라이브러리를 두 개의 CM 기기 쥐(클레이드 A와 B)에 주입하고 뇌척수액과 혈액에서 파지를 분리했습니다(그림 1d).라이브러리의 초기 빠른 클리어런스는 야생형 파지에 비해 덜 뚜렷했습니다.두 동물 모두에서 주입된 라이브러리의 평균 반감기는 야생형 파지와 유사하게 혈액에서 24.8분, CSF에서 38.5분이었습니다.각 동물의 혈액 및 뇌척수액 파지 샘플을 HTS에 적용하고 확인된 모든 펩티드를 짧은 트리펩티드 모티프의 존재에 대해 분석했습니다.트리펩티드 모티프는 구조 형성 및 펩티드-단백질 상호작용에 대한 최소한의 기초를 제공하기 때문에 선택되었습니다.우리는 주입된 파지 라이브러리와 두 동물의 혈액에서 추출된 클론 사이의 모티프 분포에서 좋은 상관관계를 발견했습니다(그림 1e).데이터는 라이브러리의 구성이 혈액 구획에서 약간만 풍부함을 나타냅니다.Weblogo16 소프트웨어의 적응을 사용하여 각 위치에서 아미노산 빈도 및 컨센서스 서열을 추가로 분석했습니다.흥미롭게도 우리는 혈중 글리신 잔류물에서 강력한 농축을 발견했습니다(그림 1g).혈액을 CSF에서 선별한 클론과 비교했을 때 모티프의 강한 선택과 약간의 선택 해제가 관찰되었으며(그림 1f), 특정 아미노산이 12-구성원에서 미리 결정된 위치에 우선적으로 존재했습니다(그림 1h).특히, 개별 동물은 뇌척수액에서 크게 달랐지만 혈액 글리신 농축은 두 동물에서 관찰되었습니다 (보충 그림 4a-j).동물 #1.1 및 #1.2의 뇌척수액에서 서열 데이터를 엄격하게 필터링한 후 총 964개 및 420개의 고유한 12-mer 펩티드를 얻었다(보충 그림 1d-e).분리된 파지 클론을 증폭시키고 2차 생체내 선택을 수행하였다.2차 선택에서 추출한 파지는 각 동물에서 HTS를 수행하였고, 확인된 모든 펩티드는 트리펩티드 모티프의 발생을 분석하기 위한 모티프 인식 프로그램의 입력으로 사용되었습니다(그림 2a, b, ef).CSF에서 회수된 파지의 첫 번째 주기와 비교하여, 분기 A와 B에서 CSF의 많은 모티프가 추가로 선택 및 선택 취소되는 것을 관찰했습니다(그림 2).일관된 시퀀스의 다른 패턴을 나타내는지 확인하기 위해 네트워크 식별 알고리즘이 적용되었습니다.대체 클레이드 A(그림 2c, d)와 클레이드 B(그림 2g, h)에서 CSF에 의해 복구된 12차원 시퀀스 간에 명확한 유사성이 관찰되었습니다.각 분기의 풀링된 분석은 12-mer 펩타이드에 대한 서로 다른 선택 프로파일(보충 그림 5c, d)과 첫 번째 라운드와 비교하여 두 번째 선택 라운드 후 풀링된 클론에 대한 시간 경과에 따른 CSF/혈액 역가 비율의 증가를 나타냈습니다. 선택(보충 그림 5e).).
생체 내 기능성 파지 디스플레이 선택의 2회 연속 라운드에 의한 뇌척수액의 모티프 및 펩티드 농축.
각 동물의 첫 번째 라운드에서 회수한 모든 뇌척수액 파지(동물 #1.1 및 #1.2)를 풀링하고, 증폭하고, HT 시퀀싱하고 함께 재주입했습니다(2 x 1010 파지/동물) 2 SM 캐뉼라 쥐(#1.1 → #).2.1 및 2.2, 1.2 → 2.3 및 2.4).(a,b,e,f) 첫 번째 및 두 번째 선택 라운드에서 모든 CSF 유래 파지의 트리펩티드 모티프의 상대 빈도를 비교하는 상관 산점도.두 배향의 펩티드에서 발견되는 모든 가능한 중첩 트리펩티드를 나타내는 모티프의 상대 빈도 및 분포.1000개의 판독값에서 발견된 모티프의 수가 표시됩니다.비교 라이브러리 중 하나에서 크게(p < 0.001) 선택되거나 제외된 모티프는 빨간색 점으로 강조 표시됩니다.(c, d, g, h) 생체내 선택의 라운드 2 및 1에 기초한 모든 CSF-풍부 12개 아미노산 길이 서열의 서열 로고 표시.한 글자 코드의 크기는 아미노산이 해당 위치에서 얼마나 자주 발생하는지 나타냅니다.로고를 나타내기 위해 두 선택 라운드 사이에 개별 동물에서 추출한 CSF 시퀀스의 빈도를 비교하고 두 번째 라운드에서 풍부한 시퀀스를 표시합니다. (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 및 (h) #1.2–#2.4.(c, d) 동물 번호에서 주어진 위치에서 가장 풍부한 아미노산.2.1과 아니오.2.2 또는 (g, h) 동물 no.2.3과 아니오.2.4는 색상으로 표시됩니다.녹색 = 극성, 보라색 = 중성, 파란색 = 염기성, 빨간색 = 산성, 검은색 = 소수성 아미노산.
세 번째 선택 라운드 후, 우리는 두 동물에서 분리된 332개의 CSF 재구성 파지 클론에서 124개의 고유한 펩타이드 서열(#3.1 및 #3.2)을 확인했습니다(보충 그림 6a).시퀀스 LGSVS(18.7%)의 상대적 비율이 가장 높았고, 야생형 삽입물 PAGISRELVDKL(8.2%), MRWFFSHASQGR(3%), DVAKVS(3%), TWLFSLG(2.2%), SARGSWREIVSLS(2.2%)가 그 뒤를 이었습니다.마지막 네 번째 라운드에서는 3마리의 개별 동물에서 독립적으로 선택된 2개의 가지를 모았습니다(그림 1c).CSF에서 회수한 925개의 시퀀싱된 파지 클론 중 네 번째 라운드에서 우리는 64개의 고유한 펩타이드 서열을 발견했습니다(보충 그림 6b). 그 중 야생형 파지의 상대적 비율은 0.8%로 떨어졌습니다.네 번째 라운드에서 가장 흔한 CSF 클론은 LYVLHSRGLWGFKLAAALE(18%), LGSVS(17%), GFVRFRLSNTR(14%), KVAWRVFSLFWK(7%), SVHGV(5%), GRPQKINGARVC(3.6%) 및 RLSSVDSDLSGC(3, 2%)였습니다.%)).선택된 펩타이드의 길이 범위는 NNK 라이브러리 설계를 위해 퇴화 코돈을 사용할 때 라이브러리 프라이머의 뉴클레오티드 삽입/결실 또는 조기 정지 코돈 때문입니다.조기 정지 코돈은 더 짧은 펩타이드를 생성하며 유리한 aa 모티프를 포함하기 때문에 선택됩니다.더 긴 펩티드는 합성 라이브러리의 프라이머에서 삽입/결실로 인해 발생할 수 있습니다.이렇게 하면 설계된 정지 코돈이 프레임 외부에 배치되고 새로운 정지 코돈이 다운스트림에 나타날 때까지 읽습니다.일반적으로 입력 데이터와 샘플 출력 데이터를 비교하여 네 가지 선택 라운드 모두에 대한 농축 계수를 계산했습니다.첫 번째 스크리닝을 위해 야생형 파지 역가를 비특이적 배경 참조로 사용했습니다.흥미롭게도 음성 파지 선택은 첫 번째 CSF 주기에서 매우 강력했지만 혈액에서는 그렇지 않았습니다(그림 3a). 이는 펩타이드 라이브러리의 대부분의 구성원이 CSF 구획으로 수동 확산될 가능성이 낮거나 상대 파지가 박테리오파지보다 혈류에서 더 효율적으로 유지되거나 제거되는 경향이 있기 때문일 수 있습니다.그러나 패닝의 두 번째 라운드에서 CSF에서 파지의 강력한 선택이 두 클래드 모두에서 관찰되었으며 이는 이전 라운드가 CSF 섭취를 촉진하는 펩타이드를 표시하는 파지가 풍부했음을 시사합니다(그림 3a).다시 말하지만, 상당한 혈액 농축이 없습니다.또한 세 번째와 네 번째 라운드에서 파지 클론은 CSF가 상당히 풍부했습니다.마지막 두 라운드의 선택 사이에서 각각의 고유한 펩타이드 서열의 상대 빈도를 비교하여, 우리는 서열이 네 번째 선택 라운드에서 훨씬 더 풍부하다는 것을 발견했습니다(그림 3b).두 펩티드 배향을 사용하여 총 64개의 고유한 펩티드 서열로부터 총 931개의 트리펩티드 모티프를 추출하였다.네 번째 라운드에서 가장 풍부한 모티프는 주입된 라이브러리(컷오프: 10% 농축)와 비교하여 모든 라운드에서 농축 프로파일에 대해 더 면밀히 조사되었습니다(보충 그림 6c).선택의 일반적인 패턴은 연구된 동기의 대부분이 두 선택 분기의 모든 이전 라운드에서 강화되었음을 보여주었습니다.그러나 일부 모티프(예: SGL, VSG, LGS GSV)는 주로 대체 클레이드 A에서 나온 반면 다른 모티프(예: FGW, RTN, WGF, NTR)는 대체 클레이드 B에서 풍부했습니다.
CSF가 풍부한 파지 디스플레이 펩티드 및 스트렙타비딘 페이로드에 접합된 비오티닐화된 리더 펩티드의 CSF 수송 검증.
(a) 주입된(입력 = I) 파지(PFU) 역가 및 결정된 CSF 파지 역가(출력 = O)를 기준으로 4가지 라운드(R1-R4) 모두에서 계산된 농축 비율.마지막 3회차(R2-R4)에 대한 농축 인자는 이전 회차와 가중치 데이터가 있는 첫 번째 회차(R1)와 비교하여 계산되었습니다.열린 막대는 뇌척수액이고 음영 막대는 혈장입니다.(***p<0.001, Student's t-test 기준).(b) 4차 선택 후 CSF에서 수집된 모든 파지에 대한 상대적인 비율에 따라 순위가 매겨진 가장 풍부한 파지 펩티드 ​​목록.6개의 가장 일반적인 파지 클론은 선택의 라운드 3과 4(삽입) 사이에 색상, 번호 및 농축 요소로 강조 표시됩니다.(c,d) 라운드 4의 6개의 가장 농축된 파지 클론, 빈 파지 및 부모 파지 펩티드 ​​라이브러리를 CSF 샘플링 모델에서 개별적으로 분석했습니다.CSF 및 혈액 샘플을 표시된 시점에서 수집했습니다.(c) 동일한 양의 6개의 후보 파지 클론(2 x 1010 파지/동물), 빈 파지(#1779)(2 x 1010 파지/동물) 및 스톡 파지 펩티드 ​​라이브러리(2 x 1012 파지/동물)를 꼬리 정맥을 통해 개별적으로 캐뉼러 삽입된 동물에 3CM 이상 주입한다.시간 경과에 따른 각 주입된 파지 클론 및 파지 펩티드 ​​라이브러리의 CSF 약동학이 표시됩니다.(d)는 샘플링 시간 동안 회수된 모든 파지/mL에 대한 평균 CSF/혈액 비율을 보여줍니다.(e) 4개의 합성 리더 펩타이드 및 1개의 스크램블된 대조군을 N-말단(테트라머 디스플레이)을 통해 비오틴과 스트렙타비딘에 연결한 후 주사(꼬리 정맥 iv, 10mg 스트렙타비딘/kg)했습니다.최소 3마리의 삽관된 쥐(N = 3).).표시된 시점에서 CSF 샘플을 수집하고 CSF 항-스트렙타비딘 ELISA로 스트렙타비딘 농도를 측정했습니다(nd = 검출되지 않음).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA 테스트 기준).(f) 가장 농축된 파지 펩티드 ​​클론 #2002(보라색)의 아미노산 서열과 4차 선택에서 다른 선별된 파지 펩티드 ​​클론의 비교.동일하고 유사한 아미노산 조각은 색상으로 구분됩니다.
네 번째 라운드의 모든 농축 파지(그림 3b) 중에서 CSF 샘플링 모델에서 추가 개별 분석을 위해 6개의 후보 클론이 선택되었습니다.동일한 양의 6개의 후보 파지, 빈 파지(삽입물 없음) 및 프로파지 펩타이드 라이브러리를 3개의 캐뉼러 CM 동물에 주입하고 약동학을 CSF(그림 3c) 및 혈액(보충 그림 7) 분석에서 결정했습니다.시험된 모든 파지 클론은 빈 대조군 파지(#1779)보다 10-1000배 더 높은 수준에서 CSF 구획을 표적으로 하였다.예를 들어, 클론 #2020 및 #2077은 대조군 파지보다 CSF 역가가 약 1000배 더 높았습니다.선택된 각 펩타이드의 약동학 프로파일은 다르지만 모두 높은 CSF 귀환 능력을 가지고 있습니다.클론 #1903 및 #2011의 경우 시간이 지남에 따라 지속적인 감소를 관찰한 반면 클론 #2077, #2002 및 #2009의 경우 처음 10분 동안의 증가는 활성 전송을 나타낼 수 있지만 확인이 필요합니다.클론 #2020, #2002 및 #2077은 높은 수준에서 안정화되었으며, 클론 #2009의 CSF 농도는 초기 증가 이후 서서히 감소했습니다.그런 다음 각 CSF 후보의 상대 빈도를 혈액 농도와 비교했습니다(그림 3d).모든 샘플링 시간에서 각 CSF 후보의 평균 역가와 혈액 역가의 상관관계는 6명의 후보 중 3개가 혈액 CSF가 상당히 풍부함을 보여주었습니다.흥미롭게도 클론 #2077은 더 높은 혈액 안정성을 보여주었습니다(보충 그림 7).펩타이드 자체가 파지 입자 이외의 화물을 CSF 구획으로 능동적으로 수송할 수 있는지 확인하기 위해 펩타이드가 파지 입자에 부착되는 N-말단에서 비오틴으로 유도체화된 4개의 리더 펩타이드를 합성했습니다.비오티닐화 펩티드(2002, 2009, 2020 및 2077번)를 스트렙타비딘(SA)과 결합시켜 파지 기하학을 다소 모방하는 다량체 형태를 얻었다.이 형식은 또한 화물 수송 단백질 펩티드로서 혈액 및 뇌척수액에서 SA 노출을 측정할 수 있게 했습니다.중요한 것은 합성 펩타이드가 이 SA 결합 형식으로 투여될 때 파지 데이터가 종종 재생산될 수 있다는 것입니다(그림 3e).스크램블된 펩티드는 초기 노출이 적고 48시간 이내에 감지할 수 없는 수준으로 CSF 제거가 더 빠릅니다.이러한 펩티드 파지 클론의 CSF 공간으로의 전달 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 생체 내 정맥 주사 1시간 후 파지 입자를 직접 검출하기 위해 면역조직화학(IHC)을 사용하여 개별 파지 펩티드 ​​적중의 위치를 ​​분석했습니다.특히, 클론 #2002, #2077 및 #2009는 뇌 모세혈관에서 강한 염색으로 검출될 수 있는 반면 대조군 파지(#1779) 및 클론 #2020은 검출되지 않았습니다(보충 그림 8).이것은 이러한 펩타이드가 BBB를 가로지름으로써 정확하게 뇌에 미치는 영향에 기여한다는 것을 시사합니다.BSCFB 경로도 포함될 수 있으므로 이 가설을 테스트하려면 더 자세한 분석이 필요합니다.가장 풍부한 클론(#2002)의 아미노산 서열을 다른 선택된 펩티드와 비교할 때, 그들 중 일부는 유사한 수송 메커니즘을 나타낼 수 있는 유사한 아미노산 확장을 가짐이 주목되었다(도 3f).
고유한 혈장 프로필과 시간 경과에 따른 CSF의 현저한 증가로 인해 파지 디스플레이 클론 #2077은 더 긴 48시간 동안 추가로 탐색되었으며 지속적인 SA 수준과 관련하여 관찰된 CSF의 급격한 증가를 재현할 수 있었습니다(그림 4a).다른 확인된 파지 클론과 관련하여, #2077은 뇌 모세혈관에 대해 강하게 염색되었으며 더 높은 해상도에서 보았을 때 모세관 마커 렉틴과 상당한 동시 국소화를 보였고 실질 공간에서 일부 염색이 가능했습니다(그림 4b).CNS에서 펩타이드 매개 약리학적 효과를 얻을 수 있는지 알아보기 위해 i) #2077 transit peptide와 ii) BACE1 inhibitor 펩타이드의 biotinylated 버전을 SA와 두 가지 다른 비율로 혼합하는 실험을 수행했습니다.하나의 조합에는 BACE1 펩티드 억제제만 사용했고, 다른 조합에는 BACE1 펩티드 억제제와 #2077 펩티드를 1:3 비율로 사용했습니다.두 샘플을 모두 정맥내 투여하고 베타-아밀로이드 펩타이드 40(Abeta40)의 혈액 및 뇌척수액 수준을 시간 경과에 따라 측정했습니다.Abeta40은 뇌 실질에서 BACE1 억제를 반영하기 때문에 CSF에서 측정되었습니다.예상대로, 두 복합체 모두 Abeta40의 혈중 농도를 유의하게 감소시켰습니다(그림 4c, d).단, 펩타이드 no.2077 및 SA에 결합된 BACE1 펩타이드의 억제제는 뇌척수액에서 Abeta40의 상당한 감소를 일으켰습니다(그림 4c).데이터는 펩타이드 번호를 보여줍니다.2077은 60 kDa SA 단백질을 CNS로 수송할 수 있으며 BACE1 펩타이드의 SA 결합 억제제로 약리학적 효과도 유도합니다.
(a) CSF 펩타이드 #2077(RLSSVDSDLSGC)의 장기 약동학적 프로파일을 나타내는 T7 파지의 클론 주사(2 × 10 파지/동물) 및 적어도 3마리의 CM-삽관된 쥐에서 주사되지 않은 대조군 파지(#1779).(b) 펩티드 #2077 및 혈관(렉틴)의 역염색을 보여주는 파지 주입된 래트(2 × 10 10 파지/동물)의 대표적인 피질 미세혈관의 공초점 현미경 이미지.이들 파지 클론을 3마리의 래트에 투여하고 관류 전에 1시간 동안 순환시켰다.뇌를 절단하고 T7 파지 캡시드에 대한 다클론 FITC 표지 항체로 염색했습니다.관류 및 후속 고정 10분 전에 DyLight594 표지된 렉틴을 정맥 주사했습니다.모세혈관 및 혈관주위 뇌 조직의 내강에서 미세혈관 및 파지(녹색)의 내강측의 렉틴 염색(빨간색)을 보여주는 형광 이미지.눈금 막대는 10μm에 해당합니다.(c, d) 비오티닐화 BACE1 억제 펩티드 단독 또는 비오티닐화 수송 펩티드 #2077과의 조합을 스트렙타비딘에 커플링한 후 캐뉼라를 삽입한 CM 래트 최소 3마리(10 mg 스트렙타비딘/kg)를 정맥 주사했습니다.Aβ40의 BACE1 펩티드 억제제 매개 감소는 표시된 시점에서 혈액(적색) 및 뇌척수액(주황색)에서 Aβ1-40 ELISA에 의해 측정되었습니다.명확성을 높이기 위해 100% 배율로 그래프에 점선이 그려집니다.(c) 전이 펩티드 #2077 및 BACE1 억제 펩티드에 3:1 비율로 접합된 스트렙타비딘으로 처리된 쥐의 혈액(적색 삼각형) 및 뇌척수액(주황색 삼각형)에서 Aβ40의 백분율 감소.(d) BACE1 억제 펩티드에만 결합된 스트렙타비딘으로 처리된 쥐의 혈액 Aβ40(빨간색 원) 및 뇌척수액(주황색 원)의 백분율 감소.대조군의 Aβ 농도는 420pg/ml(표준 편차 = 101pg/ml)였습니다.
파지 디스플레이는 생물 의학 연구의 여러 분야에 성공적으로 적용되었습니다.이 방법은 생체 내 혈관 다양성 연구 및 대뇌 혈관20,21,22,23,24,25,26을 대상으로 하는 연구에 사용되었습니다.본 연구에서는 이 선택 방법을 대뇌 혈관을 표적으로 하는 펩타이드의 직접적인 식별뿐만 아니라 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능동 수송 특성을 가진 후보 물질의 발견으로 확장했습니다.우리는 이제 CM 삽관된 쥐에서 생체 내 선택 절차의 개발을 설명하고 CSF 귀환 속성을 가진 펩티드를 식별할 수 있는 가능성을 보여줍니다.12-mer 무작위 펩타이드 라이브러리를 표시하는 T7 파지를 사용하여 우리는 T7 파지가 혈뇌 장벽에 적응할 수 있을 만큼 충분히 작아서(직경 약 60nm) 10 혈액-뇌 장벽 또는 맥락총을 직접 가로지른다는 것을 입증할 수 있었습니다.우리는 cannulated CM 쥐에서 채취한 CSF가 잘 통제된 생체 내 기능 스크리닝 방법이며 추출된 파지가 맥관 구조에 결합할 뿐만 아니라 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 운반체 역할을 한다는 것을 관찰했습니다.또한 혈액을 동시에 수집하고 CSF 및 혈액 유래 파지에 HTS를 적용함으로써 CSF의 선택이 혈액 농축 또는 선택 라운드 사이의 확장 적합성에 영향을 받지 않는다는 것을 확인했습니다.그러나 CSF 구획에 도달할 수 있는 파지가 생존하고 뇌에서 스스로를 풍부하게 할 만큼 충분히 오랫동안 혈류에서 순환해야 하기 때문에 혈액 구획은 선택 절차의 일부입니다.원시 HTS 데이터에서 신뢰할 수 있는 시퀀스 정보를 추출하기 위해 분석 워크플로우에서 플랫폼별 시퀀싱 오류에 맞게 조정된 필터를 구현했습니다.스크리닝 방법에 동역학 매개변수를 통합하여 혈액에서 야생형 T7 파지(t½ ~ 28분)의 빠른 약동학을 확인하고 분당 뇌척수액에서 반감기(t½ ~ 26분)를 결정했습니다.혈액 및 CSF에서 유사한 약동학 프로파일에도 불구하고 파지의 혈중 농도의 0.001%만이 CSF에서 검출될 수 있었으며 이는 혈뇌 장벽을 가로지르는 야생형 T7 파지의 배경 이동성이 낮다는 것을 나타냅니다.이 작업은 CNS 구획에 도달할 수 있는 클론이 거의 없기 때문에 특히 순환에서 빠르게 제거되는 파지 시스템의 경우 생체 내 패닝 전략을 사용할 때 선택의 첫 번째 라운드의 중요성을 강조합니다.따라서 첫 번째 라운드에서 이 매우 엄격한 CSF 모델에서 결국 제한된 수의 클론만 수집되었기 때문에 라이브러리 다양성의 감소가 매우 컸습니다.이 생체 내 패닝 전략에는 CSF 구획의 활성 축적, 혈액 구획의 클론 생존, 처음 10분 이내에 혈액에서 T7 파지 클론의 신속한 제거와 같은 여러 선택 단계가 포함되었습니다(그림 1d 및 보충 그림 4M).).따라서, 첫 번째 라운드 후, 동일한 초기 풀이 개별 동물에 사용되었지만 CSF에서 다른 파지 클론이 확인되었습니다.이는 라이브러리 구성원이 많은 소스 라이브러리에 대해 여러 엄격한 선택 단계를 수행하면 다양성이 크게 감소함을 시사합니다.따라서 무작위 이벤트는 초기 선택 프로세스의 필수적인 부분이 되어 결과에 큰 영향을 미칩니다.원래 라이브러리에 있는 많은 클론이 매우 유사한 CSF 강화 경향을 가졌을 가능성이 있습니다.그러나 동일한 실험 조건에서도 초기 풀의 각 특정 클론 수가 적기 때문에 선택 결과가 다를 수 있습니다.
CSF에 풍부한 모티프는 혈액의 모티프와 다릅니다.흥미롭게도 우리는 개별 동물의 혈액에서 글리신이 풍부한 펩타이드로의 첫 번째 변화에 주목했습니다.(그림 1g, 보충 그림 4e, 4f).글리신 펩타이드를 포함하는 파지는 더 안정적일 수 있으며 순환에서 제거될 가능성이 적습니다.그러나 이러한 글리신이 풍부한 펩타이드는 뇌척수액 샘플에서 검출되지 않았으며 큐레이팅된 라이브러리가 두 가지 다른 선택 단계를 거쳤음을 시사합니다.네 번째 선택 라운드에서 생성된 CSF가 풍부한 클론은 광범위하게 테스트되었습니다.거의 모든 개별적으로 테스트된 클론은 블랭크 대조군 파지에 비해 CSF가 풍부한 것으로 확인되었습니다.하나의 펩타이드 적중(#2077)이 더 자세히 조사되었습니다.그것은 다른 히트에 비해 더 긴 혈장 반감기를 나타냈고(도 3d 및 보충도 7), 흥미롭게도 이 펩타이드는 C-말단에 시스테인 잔기를 함유하고 있다.최근 펩타이드에 시스테인을 첨가하면 알부민에 결합하여 약동학적 특성을 향상시킬 수 있다는 것이 밝혀졌습니다29.이것은 현재 펩타이드 #2077에 대해 알려지지 않았으며 추가 연구가 필요합니다.일부 펩타이드는 T7 캡시드의 표시된 표면 기하학과 관련이 있을 수 있는 CSF 농축(데이터는 표시되지 않음)에서 원자가 의존성을 나타냈습니다.우리가 사용한 T7 시스템은 파지 입자당 각 펩티드의 5-15개 복제본을 보여주었습니다.IHC는 쥐의 대뇌 피질에 정맥 주사한 후보 납 파지 클론에서 수행되었습니다(보충 그림 8).데이터는 적어도 3개의 클론(No. 2002, No. 2009 및 No. 2077)이 BBB와 상호작용했음을 보여주었다.이 BBB 상호작용으로 인해 CSF가 축적되는지 또는 이러한 클론이 BCSFB로 직접 이동하는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다.중요한 것은 선택된 펩타이드가 합성되고 단백질 화물에 결합될 때 CSF 수송 능력을 유지한다는 것을 보여줍니다.N-말단 biotinylated 펩타이드의 SA에 대한 결합은 기본적으로 혈액과 뇌척수액에서 각각의 파지 클론으로 얻은 결과를 반복합니다(그림 3e).마지막으로, 우리는 납 펩티드 #2077이 SA에 접합된 BACE1의 비오티닐화된 펩티드 억제제의 뇌 활동을 촉진할 수 있고, CSF에서 Abeta40 수준을 상당히 감소시킴으로써 CNS에서 현저한 약력학적 효과를 일으킬 수 있음을 보여줍니다(그림 4).우리는 모든 적중의 펩타이드 서열 상동성 검색을 수행하여 데이터베이스에서 어떤 상동체도 식별할 수 없었습니다.T7 라이브러리의 크기는 약 109인 반면 12-mer에 대한 이론적 라이브러리 크기는 4 x 1015라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 우리는 12-mer 펩타이드 라이브러리의 다양성 공간의 작은 부분만 선택했습니다. 이는 식별된 히트의 인접 시퀀스 공간을 평가하여 보다 최적화된 펩타이드를 식별할 수 있음을 의미할 수 있습니다.가설적으로, 우리가 이러한 펩타이드의 자연적 동족체를 발견하지 못한 이유 중 하나는 특정 펩타이드 모티프가 뇌로 제어되지 않고 들어가는 것을 방지하기 위해 진화 중에 선택 해제되었을 수 있습니다.
종합하면, 우리의 결과는 생체 내 뇌혈관 장벽의 수송 시스템을 더 자세히 식별하고 특성화하기 위한 향후 작업의 기초를 제공합니다.이 방법의 기본 설정은 대뇌 혈관 결합 특성을 가진 클론을 식별할 뿐만 아니라 성공적인 클론이 CNS 구획으로 생체 내 생물학적 장벽을 가로지르는 본질적인 활동을 갖는 중요한 단계를 포함하는 기능적 선택 전략을 기반으로 합니다.이러한 펩티드의 수송 메커니즘과 뇌 영역에 특이적인 미세혈관에 결합하는 선호도를 밝히는 것입니다.이것은 BBB와 수용체의 수송을 위한 새로운 경로의 발견으로 이어질 수 있습니다.우리는 식별된 펩티드가 뇌혈관 수용체 또는 BBB 또는 BCSFB를 통해 수송된 순환 리간드에 직접 결합할 수 있을 것으로 기대합니다.이 작업에서 발견된 CSF 수송 활성을 가진 펩타이드 벡터는 추가로 조사될 것입니다.우리는 현재 BBB 및/또는 BCSFB를 교차하는 능력에 대해 이러한 펩티드의 뇌 특이성을 조사하고 있습니다.이 새로운 펩타이드는 새로운 수용체 또는 경로의 잠재적인 발견과 생물학적 제제와 같은 거대 분자를 뇌로 전달하기 위한 새로운 고효율 플랫폼 개발을 위한 매우 귀중한 도구가 될 것입니다.
이전에 설명한 방법의 수정을 사용하여 큰 수조(CM)를 Cannulate합니다.마취된 Wistar 쥐(200-350g)를 정위 장치에 장착하고 면도하고 무균 상태로 준비된 두피에 정중 절개를 하여 두개골을 노출시켰습니다.상부 새시 영역에 두 개의 구멍을 뚫고 구멍에 고정 나사를 조입니다.스테인레스 스틸 캐뉼라를 CM으로 정위적으로 안내하기 위해 측면 후두부 능선에 추가 구멍을 뚫었습니다.캐뉼라 주변에 치과용 시멘트를 바르고 나사로 고정합니다.광경화 및 시멘트 경화 후, 피부 상처를 4/0 supramid suture로 봉합하였다.캐뉼라의 적절한 배치는 뇌척수액(CSF)의 자발적인 누출에 의해 확인됩니다.정위 장치에서 쥐를 제거하고 적절한 수술 후 관리 및 통증 관리를 받고 뇌척수액에서 혈액 징후가 관찰될 때까지 적어도 1주일 동안 회복되도록 합니다.Wistar 쥐(Crl:WI/Han)는 Charles River(프랑스)에서 구입했습니다.모든 쥐는 특정 병원균이 없는 조건에서 보관되었습니다.모든 동물 실험은 스위스 바젤시의 수의과의 승인을 받았으며 동물 허가 번호 2474(쥐의 뇌척수액 및 뇌에서 치료 후보의 수준을 측정하여 활성 뇌 수송 평가)에 따라 수행되었습니다.
CM 캐뉼라를 손에 쥐고 의식이 있는 쥐를 부드럽게 유지하십시오.캐뉼라에서 Datura를 제거하고 자발적으로 흐르는 뇌척수액 10 μl를 수집합니다.캐뉼라의 개방성이 궁극적으로 손상되었기 때문에 혈액 오염이나 변색의 증거가 없는 깨끗한 뇌척수액 샘플만 이 연구에 포함되었습니다.동시에 꼬리 끝의 작은 절개에서 헤파린(Sigma-Aldrich)이 있는 튜브로 약 10-20μl의 혈액을 채취했습니다.T7 파지의 정맥 주사 후 다양한 시점에서 CSF 및 혈액을 수집하였다.카테터의 죽은 부피에 해당하는 각 CSF 샘플을 수집하기 전에 약 5-10 μl의 유체를 폐기했습니다.
라이브러리는 T7Select 시스템 설명서(Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)에 설명된 대로 T7Select 10-3b 벡터를 사용하여 생성되었습니다.간략하게, 임의의 12-mer DNA 삽입물을 다음 형식으로 합성했습니다.
NNK 코돈은 삽입물에서 이중 정지 코돈 및 아미노산 과발현을 피하기 위해 사용되었습니다.N은 각 뉴클레오티드의 수동 혼합 등몰비이고, K는 아데닌과 시토신 뉴클레오티드의 수동 혼합 등몰비입니다.단일 가닥 영역은 37°C에서 3시간 동안 Klenow 완충액(New England Biolabs)에서 dNTP(Novagen) 및 Klenow 효소(New England Biolabs)와 추가 배양하여 이중 가닥 DNA로 전환되었습니다.반응 후 이중가닥 DNA를 EtOH 침전으로 회수하였다.생성된 DNA를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII(둘 다 Roche 제품)로 절단하였다.절단 및 정제된(QIAquick, Qiagen) 삽입체(T4 리가아제, New England Biolabs)는 10B 캡시드 유전자의 아미노산 348 다음에 미리 절단된 T7 벡터에 인프레임으로 결찰되었습니다.라이게이션 반응은 인 비트로 패키징 전에 18시간 동안 16℃에서 인큐베이션되었다.T7Select 10-3b 클로닝 키트(Novagen)와 함께 제공된 지침에 따라 체외 파지 패키징을 수행하고 패키징 용액을 Escherichia coli(BLT5615, Novagen)를 사용하여 용해로 1회 증폭했습니다.용해물을 원심분리하고 적정하고 -80℃에서 글리세롤 스톡 용액으로 냉동시켰다.
독점적인 454/Roche-amplicon 융합 프라이머를 사용하여 배지 또는 플레이트에서 증폭된 파지 가변 영역의 직접 PCR 증폭.순방향 융합 프라이머에는 가변 영역(NNK) 12(주형별), GS FLX 티타늄 어댑터 A 및 4개 기본 라이브러리 키 시퀀스(TCAG) 옆에 있는 시퀀스가 ​​포함되어 있습니다(보충 그림 1a).
역방향 융합 프라이머는 비오틴을 캡처하기 위해 부착된 비오틴과 에멀젼 PCR 중 클론 증폭에 필요한 GS FLX Titanium Adapter B도 포함합니다.
그런 다음 앰플리콘은 454 GS-FLX Titanium 프로토콜에 따라 454/Roche 파이로시퀀싱을 거쳤습니다.수동 Sanger 시퀀싱(Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA 분석기)의 경우 T7 파지 DNA를 PCR로 증폭하고 다음 프라이머 쌍으로 시퀀싱했습니다.
Roche Fast Start DNA Polymerase Kit를 사용하여 개별 플라크의 삽입물을 PCR 증폭했습니다(제조업체의 지침에 따름).핫 스타트(95°C에서 10분) 및 35개의 부스트 주기(95°C에서 50s, 50°C에서 1분, 72°C에서 1분)를 수행합니다.
라이브러리의 파지, 야생형 파지, CSF 및 혈액에서 구조된 파지 또는 개별 클론을 TB 액체배지(Sigma Aldrich) 또는 500 cm2 디쉬(Thermo Scientific)의 Escherichia coli BL5615에서 37°C에서 4시간 동안 증폭했습니다.플레이트를 Tris-EDTA 완충액(Fluka Analytical)으로 헹구거나 멸균 피펫 팁으로 플라크를 수집하여 플레이트에서 파지를 추출했습니다.파지는 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000) 침전(Promega)의 1회 라운드로 배양 상청액 또는 추출 완충액으로부터 분리되었고 Tris-EDTA 완충액에 재현탁되었습니다.
증폭된 파지는 정맥(IV) 주사(500 μl/동물) 전에 내독소 제거 비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 2-3회 라운드의 내독소 제거에 적용되었습니다.첫 번째 라운드에서는 2×1012개의 파지가 도입되었습니다.두 번째, 2×1010 파지;세 번째 및 네 번째 선택 라운드에서 동물당 2×109 파지.표시된 시점에서 수집된 CSF 및 혈액 샘플의 파지 함량은 제조업체의 지침(T7Select 시스템 매뉴얼)에 따라 플라크 계수에 의해 결정되었습니다.정제된 라이브러리를 꼬리 정맥에 정맥 주사하거나 이전 선택 라운드에서 CSF에서 추출한 파지를 재주입하여 파지 선택을 수행하고, CSF 및 혈액 샘플을 각각 10분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분 및 240분에 수확했습니다.총 4회의 생체내 패닝을 수행하였으며, 여기서 선택된 2개의 가지를 별도로 저장하고 처음 3회의 선택 동안 분석하였다.처음 두 라운드의 선택에서 CSF에서 추출한 모든 파지 삽입물은 454/Roche 파이로시퀀싱을 받았고, 마지막 두 라운드의 선택에서 CSF에서 추출한 모든 클론은 수동으로 시퀀싱했습니다.첫 번째 선택 라운드의 모든 혈액 파지는 또한 454/Roche 파이로시퀀싱을 받았습니다.파지 클론의 주입을 위해, 선별된 파지를 E. coli(BL5615)에서 500 cm2 플레이트 상에서 37℃에서 4시간 동안 증폭시켰다.개별적으로 선택되고 수동으로 시퀀싱된 클론을 TB 배지에서 전파했습니다.파지 추출, 정제 및 엔도톡신 제거(상기 기술된 바와 같음) 후, 300 μl 중 2×1010 파지/동물을 한쪽 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다.
시퀀스 데이터의 전처리 및 정성 필터링.원시 454/Roche 데이터는 공급업체 소프트웨어를 사용하여 바이너리 표준 스트림 맵 형식(sff)에서 Pearson 사람이 읽을 수 있는 형식(fasta)으로 변환되었습니다.뉴클레오타이드 서열의 추가 처리는 하기 기술된 바와 같이 독점 C 프로그램 및 스크립트(미공개 소프트웨어 패키지)를 사용하여 수행하였다.기본 데이터 분석에는 엄격한 다단계 필터링 절차가 포함됩니다.유효한 12mer 삽입 DNA 서열을 포함하지 않는 읽기를 필터링하기 위해 글로벌 Needleman-Wunsch 테스트를 사용하여 읽기를 시작 레이블(GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), 중지 레이블(TAAGCTTGGCGGCCGCACTCGAGTA) 및 배경 삽입(CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)에 순차적으로 정렬했습니다.정렬당 최대 2개의 불일치를 허용하는 정렬31.따라서 시작 및 중지 태그가 없는 읽기와 배경 삽입을 포함하는 읽기, 즉 허용된 불일치 수를 초과하는 정렬이 라이브러리에서 제거되었습니다.나머지 읽기는 시작 표시에서 시작하여 중지 표시 전에 끝나는 N-mer DNA 서열을 원래 읽기 순서에서 잘라내어 추가 처리(이하 "삽입"이라고 함)했습니다.인서트 번역 후, 프라이머의 5' 말단에 있는 첫 번째 정지 코돈 다음 부분이 인서트에서 제거됩니다.또한, 프라이머의 3' 말단에서 불완전한 코돈으로 이어지는 뉴클레오티드도 제거되었습니다.배경 서열만 포함하는 삽입물을 제외하기 위해 아미노산 패턴 "PAG"로 시작하는 번역된 삽입물도 제거했습니다.번역 후 길이가 아미노산 3개 미만인 펩티드를 라이브러리에서 제거했습니다.마지막으로 삽입 풀에서 중복을 제거하고 각 고유 삽입의 빈도를 결정합니다.이 분석 결과에는 뉴클레오타이드 서열(삽입물) 및 해당 (판독) 빈도 목록이 포함되었습니다(보충 그림 1c 및 2).
N-mer DNA 삽입물을 서열 유사성으로 그룹화: 454/Roche 특정 시퀀싱 오류(동종중합체 확장 시퀀싱 문제 등)를 제거하고 덜 중요한 중복을 제거하기 위해 이전에 필터링된 N-mer DNA 서열 삽입물(삽입물)을 유사성별로 정렬합니다.다음과 같이 정의된 반복 알고리즘을 사용하여 삽입(최대 2개의 일치하지 않는 염기 허용): 삽입은 빈도(가장 높은 순서로)에 따라 먼저 정렬되고, 동일한 경우 길이에 따라 보조 정렬(가장 긴 순서로)에 따라 정렬됩니다.따라서 가장 빈번하고 가장 긴 삽입이 첫 번째 "그룹"을 정의합니다.그룹 주파수는 키 주파수로 설정됩니다.그런 다음 정렬된 목록에 남아 있는 각 삽입을 쌍으로 된 Needleman-Wunsch 정렬을 통해 그룹에 추가하려고 했습니다.정렬의 불일치, 삽입 또는 삭제 수가 임계값 2를 초과하지 않는 경우 그룹에 삽입이 추가되고 삽입이 추가된 빈도만큼 전체 그룹 빈도가 증가합니다.그룹에 추가된 삽입물은 사용됨으로 표시되고 추가 처리에서 제외됩니다.이미 존재하는 그룹에 삽입 시퀀스를 추가할 수 없는 경우 삽입 시퀀스를 사용하여 적절한 삽입 빈도로 새 그룹을 만들고 사용됨으로 표시합니다.반복은 각 삽입 순서가 새 그룹을 형성하는 데 사용되었거나 이미 존재하는 그룹에 포함될 수 있을 때 종료됩니다.결국, 뉴클레오티드로 구성된 그룹화된 삽입물은 결국 펩티드 서열(펩티드 라이브러리)로 번역됩니다.이 분석의 결과는 일련의 삽입과 연속 읽기 수를 구성하는 해당 주파수입니다(보조 그림 2).
모티프 생성: 고유한 펩타이드 목록을 기반으로 아래와 같이 가능한 모든 아미노산 패턴(aa)을 포함하는 라이브러리를 생성했습니다.길이 3의 각각의 가능한 패턴을 펩티드에서 추출하고 모든 패턴(트리펩티드)을 포함하는 공통 모티프 라이브러리와 함께 그 역 패턴을 추가했습니다.매우 반복적인 모티프의 라이브러리를 시퀀싱하고 중복성을 제거했습니다.그런 다음 모티프 라이브러리의 각 트리펩타이드에 대해 전산 도구를 사용하여 라이브러리에 존재하는지 확인했습니다.이 경우 발견된 모티프 트리펩타이드를 포함하는 펩타이드의 빈도가 추가되어 모티프 라이브러리의 모티프("모티프 수")에 할당됩니다.모티프 생성의 결과는 트리펩티드(모티프)의 모든 발생과 읽기가 필터링, 그룹화 및 번역될 때 해당 모티프를 초래하는 시퀀싱 읽기의 수인 해당 값을 포함하는 2차원 배열입니다.위에서 자세히 설명한 메트릭.
모티프 수 및 해당 산점도 정규화: 각 샘플에 대한 모티프 수는 다음을 사용하여 정규화되었습니다.
여기서 ni는 주제 i를 포함하는 읽기 수입니다.따라서 vi는 샘플에서 모티프 i를 포함하는 읽기(또는 펩티드)의 백분율 빈도를 나타냅니다.정규화되지 않은 모티프 수에 대한 P-값은 Fisher의 정확 테스트를 사용하여 계산되었습니다.동기 수의 상관도는 R로 정규화된 동기 수를 사용하여 Spearman의 상관관계를 계산했습니다.
펩타이드 라이브러리의 각 위치에 있는 아미노산의 함량을 시각화하기 위해 웹 로고그램 32, 33(http://weblogo.threeplusone.com)을 만들었습니다.먼저, 12-mer 펩타이드의 각 위치에 있는 아미노산의 함량은 20×12 매트릭스에 저장됩니다.그런 다음, 각 위치에서 동일한 상대 아미노산 함량을 포함하는 1000개의 펩타이드 세트가 fasta-sequence 형식으로 생성되고 web-logo 3에 입력으로 제공되어 각 위치에서 상대적 아미노산 함량의 그래픽 표현을 생성합니다.주어진 펩타이드 라이브러리에 대해.다차원 데이터 세트를 시각화하기 위해 R에서 내부적으로 개발된 도구(아직 출시되지 않은 R 패키지인 biosHeatmap)를 사용하여 히트 맵을 생성했습니다.히트 맵에 제시된 덴드로그램은 유클리드 거리 메트릭을 사용하는 Ward의 계층적 클러스터링 방법을 사용하여 계산되었습니다.모티프 채점 데이터의 통계 분석을 위해 피셔의 정확 검정을 사용하여 비정규화 채점에 대한 P 값을 계산했습니다.다른 데이터 세트에 대한 P-값은 Student's t-test 또는 ANOVA를 사용하여 R에서 계산되었습니다.
선택된 파지 클론과 삽입물이 없는 파지는 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사되었습니다(300 μl PBS에서 2 x 1010 파지/동물).관류 및 후속 고정 10분 전에 동일한 동물에 100μl의 DyLight594-표지된 렉틴(Vector Laboratories Inc., DL-1177)을 정맥 주사했습니다.파지 주입 60분 후, 래트를 50ml PBS에 이어서 50ml 4% PFA/PBS로 심장을 통해 관류시켰다.뇌 샘플을 4% PFA/PBS에 밤새 추가로 고정하고 4°C에서 밤새 30% 수크로스에 담갔다.샘플은 OCT 혼합물에서 순간 동결됩니다.냉동 샘플의 면역조직화학적 분석은 실온에서 1% BSA로 차단된 30 μm 저온 절편에서 수행되었으며 T7 파지에 대한 다클론 FITC 표지 항체(Novus NB 600-376A)와 함께 4°C에서 배양되었습니다.하룻밤 품어.마지막으로 절편을 PBS로 3회 세척하고 공초점 레이저 현미경(Leica TCS SP5)으로 검사했습니다.
98%의 최소 순도를 가진 모든 펩타이드는 GenScript USA에 의해 합성되고 비오티닐화되고 동결건조되었습니다.비오틴은 N-말단에서 추가적인 삼중 글리신 스페이서를 통해 결합됩니다.질량 분석법을 사용하여 모든 펩티드를 확인합니다.
스트렙타비딘(Sigma S0677)을 5배 등몰 과량의 비오티닐화 펩티드, 비오티닐화 BACE1 억제 펩티드 또는 비오티닐화 BACE1 억제 펩티드와 BACE1 억제 펩티드의 조합(3:1 비율)과 5-10% DMSO에서 혼합/PBS에서 배양했습니다.주사 전 실온에서 1시간.스트렙타비딘 결합 펩티드를 뇌강이 있는 쥐의 꼬리 정맥 중 하나에 10mg/kg의 용량으로 정맥 주사했습니다.
스트렙타비딘-펩티드 복합체의 농도를 ELISA로 평가하였다.Nunc Maxisorp 마이크로타이터 플레이트(Sigma)를 4°C에서 밤새 1.5μg/ml 마우스 항스트렙타비딘 항체(Thermo, MA1-20011)로 코팅했습니다.블록 (차단 완충액 : 140 nm NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% 젤라틴, 1% BSA) 후 2 시간 동안 플레이트를 0.05% 트윈 -20/PBS (세척 완충액)로 3 초 동안 세척하고 플라즈마 샘플을 wells (Plasma 1 : 10,000)로 첨가 하였다.그런 다음 플레이트를 검출 항체(1 μg/ml, 항-스트렙타비딘-HRP, Novus NB120-7239)와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다.세 번의 세척 단계 후, 최대 20분 동안 TMB 기질 용액(Roche)에서 배양하여 스트렙타비딘을 검출했습니다.1M H2SO4로 발색을 멈춘 후 450 nm에서 흡광도를 측정한다.
스트렙타비딘-펩티드-BACE1 억제제 복합체의 기능은 제조업체의 프로토콜(Wako, 294-64701)에 따라 Aβ(1-40) ELISA에 의해 평가되었습니다.간략하게, CSF 샘플을 표준 희석액(1:23)에 희석하고 BNT77 포획 항체로 코팅된 96-웰 플레이트에서 4°C에서 밤새 배양했습니다.5번의 세척 단계 후, HRP-접합된 BA27 항체를 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 5번의 세척 단계를 거쳤다.Aβ(1–40)는 실온에서 30분 동안 TMB 용액에서 배양하여 검출되었습니다.정지용액으로 발색을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정한다.혈장 샘플은 Aβ(1–40) ELISA 전에 고체상 추출을 거쳤습니다.혈장을 96-웰 플레이트의 0.2% DEA(Sigma)에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.SPE 플레이트(Oasis, 186000679)를 물과 100% 메탄올로 연속적으로 세척한 후 혈장 샘플을 SPE 플레이트에 추가하고 모든 액체를 제거했습니다.샘플을 세척하고(먼저 5% 메탄올, 그 다음 30% 메탄올) 2% NH4OH/90% 메탄올로 용출했습니다.일정한 N2 전류에서 99분 동안 55°C에서 용출액을 건조시킨 후 샘플을 표준 희석액으로 환원시키고 위에서 설명한 대로 Aβ(1–40)를 측정했습니다.
이 기사를 인용하는 방법: Urich, E. et al.생체 내에서 확인된 수송 펩티드를 사용하여 뇌로의 화물 전달.과학.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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