일부 LC 문제 해결 항목은 시간이 지남에 따라 기기 기술이 개선되더라도 LC 관행에 문제가 있기 때문에 결코 시대에 뒤떨어지지 않습니다. LC 시스템에서 문제가 발생하여 결국 불량한 피크 모양으로 끝날 수 있는 많은 방법이 있습니다. 피크 모양과 관련된 문제가 발생할 때 이러한 결과에 대한 가능한 원인의 짧은 목록은 문제 해결 경험을 단순화하는 데 도움이 됩니다.
이 "LC 문제 해결" 칼럼을 작성하고 매월 주제에 대해 생각하는 것은 재미있습니다. 일부 주제는 유행을 타지 않기 때문입니다. 크로마토그래피 연구 분야에서 특정 주제나 아이디어는 더 새롭고 더 나은 아이디어로 대체되면서 구식이 되어버렸습니다. 1983년(1) 일부 주제가 여전히 관련이 있기 때문에 첫 번째 문제 해결 기사가 이 저널(당시 LC 저널)에 게재된 이후 문제 해결 분야에서 말입니다. 지난 몇 년 동안 저는 액체 크로마토그래피(LC)에 영향을 미치는 현대적 추세에 대한 여러 LC 문제 해결 섹션에 집중했습니다. (예를 들어, 압력이 유지에 미치는 영향에 대한 이해의 상대적 비교 [2] New Advances) LC 결과에 대한 해석 및 최신 LC 기기로 문제를 해결하는 방법. 이번 달 기사에서는 2021년 12월에 시작된 시리즈(3)를 계속 진행합니다. 이 시리즈는 LC 문제 해결의 "생존" 주제 중 일부에 초점을 맞추었습니다. 문제 해결사에게 유용한 요소는 우리가 사용하는 시스템의 연식에 관계없이 필수적입니다. 이 시리즈의 핵심 주제는 LCGC와 매우 관련이 있습니다. 의 유명한 "LC 문제 해결 가이드" 월 차트(4)가 여러 실험실에 걸려 있습니다. 이 시리즈의 세 번째 부분에서는 피크 모양 또는 피크 특성과 ​​관련된 문제에 초점을 맞추었습니다.놀랍게도 월 차트에는 좋지 않은 피크 모양의 44가지 잠재적 원인이 나열되어 있습니다!이러한 모든 문제를 하나의 기사에서 자세히 고려할 수 없으므로 이 주제에 대한 첫 번째 회에서는 가장 자주 보는 몇 가지 문제에 초점을 맞추겠습니다.젊은 사용자와 노인 LC 사용자가 이 중요한 주제에 대한 몇 가지 유용한 팁과 알림을 찾을 수 있기를 바랍니다.
점점 더 문제 해결 질문에 "무엇이든 가능합니다"라고 대답하는 제 자신을 발견했습니다. 해석하기 어려운 관찰을 고려할 때 이 응답이 쉬워 보일 수 있지만 저는 종종 적절하다고 생각합니다. 좋지 않은 피크 모양의 많은 가능한 원인을 고려할 때 문제가 무엇인지 고려할 때 열린 마음을 유지하고 가장 일반적인 가능성에 초점을 맞춰 문제 해결 노력을 시작하기 위한 잠재적 원인의 우선 순위를 지정할 수 있는 것이 중요합니다. 이 점이 매우 중요합니다. 가능합니다.
모든 문제 해결 작업의 핵심 단계는(그러나 제가 생각하기에 과소평가된 것입니다) 해결해야 할 문제가 있다는 것을 인식하는 것입니다. 문제가 있다는 것을 인식한다는 것은 종종 도구에 발생하는 일이 이론, 경험적 지식 및 경험에 의해 형성되는 우리의 기대와 다르다는 것을 인식하는 것을 의미합니다(5). 여기에서 언급된 "피크 모양"은 실제로 피크의 모양(대칭, 비대칭, 매끄럽고, 푹신하고, 앞 가장자리, 테일링 등)뿐만 아니라 폭을 의미합니다. 실제 피크 모양에 대한 예상은 간단합니다.이론(6)은 대부분의 경우 크로마토그래피 피크가 그림 1a와 같이 대칭이고 가우시안 분포의 모양과 일치해야 한다는 교과서의 예상을 잘 뒷받침합니다. 피크 너비에서 기대하는 것은 더 복잡한 문제이며 이 주제는 향후 기사에서 논의할 것입니다. 이러한 모양 유형으로 이어질 수 있는 상황의 몇 가지 구체적인 예를 논의하는 데 시간을 할애하십시오.
피크가 용출될 것으로 예상되는 크로마토그램에서 피크가 전혀 관찰되지 않는 경우도 있습니다. 위의 월 차트는 피크가 없는 경우(검출기가 잡음보다 더 잘 볼 수 있도록 충분한 검출기 응답을 만들어야 하는 농도의 대상 분석 물질이 샘플에 실제로 포함되어 있다고 가정) 일반적으로 일부 기기 문제 또는 잘못된 이동상 조건(전혀 관찰된 경우)과 관련이 있음을 나타냅니다.피크, 일반적으로 너무 "약함"). 이 범주의 잠재적인 문제 및 솔루션의 짧은 목록은 표 I에서 찾을 수 있습니다.
위에서 언급한 바와 같이, 주의를 기울이고 수정하려고 시도하기 전에 어느 정도의 피크 확장이 허용되어야 하는지에 대한 질문은 향후 기사에서 논의할 복잡한 주제입니다. 제 경험에 따르면 상당한 피크 확장은 종종 피크 모양의 상당한 변화를 수반하며 피크 테일링은 사전 피크 또는 분할보다 더 일반적입니다. 그러나 명목상 대칭 피크도 확장되며 이는 몇 가지 다른 이유로 인해 발생할 수 있습니다.
이러한 각 문제는 문제 해결 LC의 이전 문제에서 자세히 논의되었으며 이러한 항목에 관심이 있는 독자는 이전 문서에서 이러한 문제의 근본 원인 및 잠재적 솔루션에 대한 정보를 참조할 수 있습니다.자세한 내용은.
Peak tailing, peak fronting 및 splitting은 모두 화학적 또는 물리적 현상에 의해 발생할 수 있으며, 이러한 문제에 대한 잠재적 솔루션 목록은 화학적 또는 물리적 문제를 처리하는지 여부에 따라 크게 다릅니다. 종종 크로마토그램의 여러 피크를 비교하여 어떤 것이 원인인지에 대한 중요한 단서를 찾을 수 있습니다.
피크 꼬리끌림의 화학적 원인은 너무 복잡해서 여기에서 간단히 논의할 수 없습니다. 관심 있는 독자는 "LC 문제 해결"의 최근 호를 참조하여 보다 심도 있는 논의를 하십시오(10). 그러나 시도하기 쉬운 것은 주입된 분석 물질의 질량을 줄이고 피크 모양이 개선되는지 확인하는 것입니다. 그렇다면 문제가 "질량 과부하"라는 좋은 단서입니다. 더 큰 질량을 주입해도 얻을 수 있습니다.
또한 피크 테일링에는 많은 잠재적인 물리적 이유가 있습니다. 가능성에 대한 자세한 논의에 관심이 있는 독자는 "LC 문제 해결"(11)의 또 다른 최근 호를 참조하십시오. 피크 테일링의 보다 일반적인 물리적 원인 중 하나는 인젝터와 검출기 사이의 한 지점에서 불량한 연결입니다(12). 극단적인 예가 그림 1d에 나와 있으며, 몇 주 전에 제 실험실에서 얻었습니다. 이 경우, 우리는 이전에 사용하지 않았던 새로운 주입 밸브로 시스템을 구축하고, 몇 가지 초기 문제 해결 실험 후 주입 밸브 고정자의 포트 깊이가 예전보다 훨씬 깊어 포트 하단에 큰 데드 볼륨이 발생한다는 것을 깨달았습니다. 이 문제는 주입 루프를 다른 튜브로 교체하여 쉽게 해결되며 페룰을 적절한 위치로 조정하여 포트 하단의 데드 볼륨을 제거할 수 있습니다.
그림 1e에 표시된 것과 같은 피크 프런트는 물리적 또는 화학적 문제로 인해 발생할 수도 있습니다. 리딩 엣지의 일반적인 물리적 원인은 컬럼의 입자 베드가 잘 채워지지 않았거나 시간이 지남에 따라 입자가 재구성되었기 때문입니다. 이 물리적 현상으로 인해 발생하는 피크 테일링과 마찬가지로 이를 해결하는 가장 좋은 방법은 컬럼을 교체하고 계속 진행하는 것입니다. 고정상에 의해 유지되는 현상(따라서 머무름 계수)은 컬럼 내 분석 물질의 농도와 선형적으로 관련됩니다. 크로마토그래피에서 이는 컬럼에 주입되는 분석 물질의 질량이 증가함에 따라 피크가 더 커지지만 더 넓어지지는 않음을 의미합니다. 이 관계는 머무름 동작이 비선형이고 더 많은 질량이 주입됨에 따라 피크가 더 커질 뿐만 아니라 더 넓어질 때 깨집니다. 또한 비선형 모양이 크로마토그래피 피크의 모양을 결정하여 리딩 또는 트레일링 에지가 발생합니다. 피크 테일링(10)을 유발하는 비선형 머무름으로 인한 피크 리딩은 주입된 분석 물질의 질량을 줄임으로써 진단할 수도 있습니다. 피크 모양이 개선되면 리딩 엣지를 유발하는 주입 품질을 초과하지 않도록 방법을 수정하거나 크로마토그래피 조건을 변경하여 이러한 동작을 최소화해야 합니다.
때때로 우리는 그림 1f와 같이 "분할" 피크로 보이는 것을 관찰합니다. 이 문제를 해결하는 첫 번째 단계는 피크 모양이 부분적인 동시 용리(즉, 두 개의 뚜렷하지만 밀접하게 용리되는 화합물의 존재)로 인한 것인지 확인하는 것입니다. 실제로 두 개의 서로 다른 분석 물질이 서로 가깝게 용출되는 경우 분리능을 개선하는 문제(예: 선택성, 머무름 또는 플레이트 수 증가)가 있으며 명백한 "분할" 피크는 물리적 성능과 관련이 있습니다. 종종 이 결정에 대한 가장 중요한 단서는 크로마토그램의 모든 피크가 분할 모양을 나타내는지 또는 한두 개만 나타내는지 여부입니다. 한두 개만 나타나는 경우 공동 용출 문제일 가능성이 높습니다.모든 피크가 분리되면 물리적 문제일 가능성이 높으며 컬럼 자체와 관련이 있을 가능성이 높습니다.
컬럼 자체의 물리적 특성과 관련된 분할 피크는 일반적으로 부분적으로 막힌 입구 또는 출구 프릿 또는 컬럼 내 입자의 재구성으로 인해 이동상이 다른 지역의 컬럼 채널 형성의 특정 영역에서 이동상보다 빠르게 흐르도록 합니다(11).그러나 내 경험상 이것은 일반적으로 장기적인 해결책보다는 단기적인 해결책입니다. 이것은 입자가 컬럼 내에서 재결합하는 경우 현대 컬럼에서 종종 치명적입니다. 이 시점에서 컬럼을 교체하고 계속하는 것이 가장 좋습니다.
그림 1g의 피크는 내 연구실의 최근 인스턴스에서도 일반적으로 신호가 너무 높아서 응답 범위의 상한에 도달했음을 나타냅니다. 광학 흡광도 검출기(이 경우 UV-vis)의 경우 분석물 농도가 매우 높을 때 분석물은 검출기 흐름 셀을 통과하는 대부분의 빛을 흡수하여 검출할 빛이 거의 남지 않습니다. 이러한 조건에서 광검출기의 전기 신호는 미광 및 "암전류"와 같은 다양한 노이즈 소스의 영향을 많이 받습니다. , 신호가 외관상 매우 "퍼지"하고 분석물 농도와 무관하게 만듭니다.이런 일이 발생하면 분석 물질의 주입량을 줄임으로써(주입량 감소, 시료 희석 또는 두 가지 모두) 문제를 쉽게 해결할 수 있습니다.
크로마토그래피 학파에서는 검출기 신호(즉, 크로마토그램의 y축)를 샘플의 분석물 농도 지표로 사용합니다. 따라서 신호가 0 미만인 크로마토그램을 보는 것은 이상하게 보입니다. 간단한 해석은 이것이 물리적으로 불가능한 음의 분석물 농도를 나타낸다는 것입니다. 제 경험상 음의 피크는 광학 흡광도 검출기(예: UV-vis)를 사용할 때 가장 자주 관찰됩니다.
이 경우 음의 피크는 단순히 컬럼에서 용출되는 분자가 피크 직전 및 직후의 이동상 자체보다 빛을 덜 흡수한다는 것을 의미합니다. 예를 들어, 이는 비교적 낮은 검출 파장(<230 nm)과 이러한 파장에서 대부분의 빛을 흡수하는 이동상 첨가제를 사용할 때 발생할 수 있습니다. 이러한 첨가제는 메탄올과 같은 이동상 용매 성분 또는 아세테이트 또는 포름산염과 같은 완충 성분일 수 있습니다. 실제로 음의 피크를 사용하여 검량선을 작성하고 정확한 정량 정보를 얻을 수 있으므로 이를 피할 근본적인 이유가 없습니다. 그 자체로(이 방법은 때때로 "간접 UV 검출"이라고도 함)(13). 그러나 흡광도 검출의 경우 음의 피크를 완전히 피하려면 최상의 솔루션은 다른 검출 파장을 사용하여 분석 물질이 이동상보다 더 많이 흡수하도록 하거나 분석 물질보다 빛을 덜 흡수하도록 이동상의 조성을 변경하는 것입니다.
음의 피크는 굴절률(RI) 검출을 사용할 때 용매 매트릭스와 같이 샘플의 분석물 이외의 구성 요소의 굴절률이 이동상의 굴절률과 다른 경우에도 나타날 수 있습니다. 이는 UV-vis 검출에서도 발생하지만 이 효과는 RI 검출에 비해 감쇠되는 경향이 있습니다. 두 경우 모두 샘플 매트릭스의 조성을 이동상의 조성과 더 가깝게 일치시키면 음의 피크가 최소화될 수 있습니다.
LC 문제 해결의 기본 주제에 대한 3부에서는 관찰된 피크 모양이 예상 또는 정상 피크 모양과 다른 상황에 대해 설명했습니다. 이러한 문제의 효과적인 문제 해결은 예상 피크 모양(기존 방법에 대한 이론 또는 이전 경험을 기반으로 함)에 대한 지식으로 시작되므로 이러한 예상과의 편차는 명백합니다. 피크 모양 문제에는 다양한 잠재적 원인(너무 넓음, 테일링, 리딩 에지 ​​등)이 있습니다. , 그러나 모든 가능성을 포착하지는 않습니다.원인 및 솔루션에 대한 보다 심층적인 목록에 관심이 있는 독자는 LCGC "LC 문제 해결 가이드" 월 차트를 참조할 수 있습니다.
(4) LCGC “LC 문제 해결 가이드” 월 차트. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF 및 Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.