Nature.com을 방문해 주셔서 감사합니다.사용 중인 브라우저 버전은 CSS 지원이 제한되어 있습니다.최상의 경험을 위해 업데이트된 브라우저를 사용하는 것이 좋습니다(또는 Internet Explorer에서 호환 모드 비활성화).그동안 지속적인 지원을 위해 스타일과 JavaScript 없이 사이트를 렌더링할 것입니다.
액체 생검(LB)은 생의학 분야에서 빠르게 인기를 얻고 있는 개념입니다.이 개념은 주로 다양한 조직에서 세포 사멸 후 작은 조각으로 방출되는 순환하는 세포외 DNA(ccfDNA) 조각의 검출을 기반으로 합니다.이러한 단편 중 작은 비율은 외부(외부) 조직 또는 유기체에서 유래합니다.현재 작업에서 우리는 높은 해수 여과 능력으로 알려진 센티넬 종인 홍합에 이 개념을 적용했습니다.우리는 해양 해안 생태계의 생물 다양성에 대한 정보를 제공하기 위해 다양한 출처에서 환경 DNA 조각을 캡처하는 자연 필터 역할을 하는 홍합의 능력을 사용합니다.우리의 결과는 홍합 체림프가 1에서 5kb까지 크기가 매우 다양한 DNA 조각을 포함하고 있음을 보여줍니다.Shotgun 시퀀싱은 많은 수의 DNA 단편이 외래 미생물 기원임을 보여주었습니다.그중에서 우리는 해안 해양 생태계에서 일반적으로 발견되는 다양한 숙주를 감염시키는 것으로 알려진 바이러스를 포함하여 박테리아, 고세균 및 바이러스의 DNA 조각을 발견했습니다.결론적으로, 우리의 연구는 홍합에 적용된 LB의 개념이 해양 연안 생태계의 미생물 다양성에 대한 풍부하지만 아직 탐구되지 않은 지식 소스를 나타냄을 보여줍니다.
기후 변화(CC)가 해양 생태계의 생물다양성에 미치는 영향은 빠르게 성장하는 연구 분야입니다.지구 온난화는 중요한 생리적 스트레스를 유발할 뿐만 아니라 해양 생물의 열 안정성의 진화적 한계를 밀어내어 많은 종의 서식지에 영향을 미치고 더 유리한 조건을 찾도록 유도합니다[1, 2].후생동물의 생물 다양성에 영향을 미치는 것 외에도 CC는 숙주-미생물 상호 작용의 섬세한 균형을 방해합니다.이 미생물 dysbacteriosis는 해양 생물을 감염성 병원균에 더 취약하게 만들기 때문에 해양 생태계에 심각한 위협이 됩니다[3, 4].SS는 전 세계 해양 생태계 관리에 심각한 문제인 대량 사망에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다[5, 6].이것은 많은 해양 종의 경제적, 생태적, 영양적 영향을 고려할 때 중요한 문제입니다.이것은 특히 CK의 영향이 더 즉각적이고 심각한 극지방에 사는 이매패류에게 해당됩니다[6, 7].사실, Mytilus spp.와 같은 이매패류.CC가 해양 생태계에 미치는 영향을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다.당연하게도 상대적으로 많은 수의 바이오마커가 그들의 건강을 모니터링하기 위해 개발되었으며 종종 효소 활동 또는 세포 생존력 및 식세포 활동과 같은 세포 기능을 기반으로 하는 기능적 바이오마커를 포함하는 2단계 접근 방식을 사용합니다[8].이러한 방법에는 다량의 해수를 흡수한 후 연조직에 축적되는 특정 압력 지표의 농도 측정도 포함됩니다.그러나 이매패류의 높은 여과 능력과 반개방 순환계는 환자 관리에 대한 간단하고 최소 침습적 접근인 액체 생검(LB)의 개념을 사용하여 새로운 혈액 림프 바이오마커를 개발할 수 있는 기회를 제공합니다.혈액 샘플 [9, 10].여러 유형의 순환 분자가 인간 LB에서 발견될 수 있지만, 이 개념은 주로 혈장에서 순환하는 세포외 DNA(ccfDNA) 조각의 DNA 시퀀싱 분석을 기반으로 합니다.사실, 인간 혈장에서 순환하는 DNA의 존재는 20세기 중반부터 알려졌지만[11], ccfDNA를 기반으로 한 임상 진단으로 이어진 고처리량 시퀀싱 방법의 출현은 최근 몇 년 동안이었습니다.이러한 순환 DNA 단편의 존재는 부분적으로 세포 사멸 후 게놈 DNA(핵 및 미토콘드리아)의 수동적 방출에 기인합니다. 건강한 개인의 경우 ccfDNA의 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/mL) 다양한 병리를 앓고 있거나 스트레스를 받는 환자의 경우 5-10배 증가하여 조직 손상을 초래할 수 있습니다. 건강한 개인의 경우 ccfDNA의 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/mL) 다양한 병리를 앓고 있거나 스트레스를 받는 환자의 경우 5-10배 증가하여 조직 손상을 초래할 수 있습니다. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/ml), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной пат ологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. 건강한 사람에서 cccDNA의 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/mL) 다양한 병리를 가진 환자나 조직 손상을 유발하는 스트레스를 받는 환자에서는 5-10배까지 증가할 수 있습니다.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。에서 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可 增加 5-10 倍 , 从而组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными па тологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA 농도는 일반적으로 건강한 개인에서는 낮지만(<10 ng/ml) 다양한 병리 또는 스트레스가 있는 환자에서는 5-10배 증가하여 조직 손상을 초래할 수 있습니다.ccfDNA 조각의 크기는 매우 다양하지만 일반적으로 150~200bp 범위입니다.[12].자가 유래 ccfDNA, 즉 정상 또는 형질전환된 숙주 세포의 ccfDNA 분석은 핵 및/또는 미토콘드리아 게놈에 존재하는 유전적 및 후생적 변화를 감지하는 데 사용될 수 있으므로 임상의가 특정 분자 표적 치료법을 선택하는 데 도움이 됩니다[13] .그러나 ccfDNA는 임신 중 태아 세포나 이식된 장기에서 ccfDNA와 같은 외부 출처에서 얻을 수 있습니다[14,15,16,17].ccfDNA는 또한 감염원(외래)의 핵산 존재를 감지하기 위한 중요한 정보원으로 혈액 배양으로 식별되지 않는 광범위한 감염을 비침습적으로 감지하여 감염된 조직의 침습적 생검을 피할 수 있습니다[18].최근 연구에 따르면 인간의 혈액에는 바이러스 및 박테리아 병원체를 식별하는 데 사용할 수 있는 풍부한 정보가 포함되어 있으며 인간 혈장에서 발견되는 ccfDNA의 약 1%가 외부 기원입니다[19].이러한 연구는 유기체의 순환 미생물 군집의 생물 다양성이 ccfDNA 분석을 사용하여 평가될 수 있음을 보여줍니다.그러나 최근까지 이 개념은 인간에게만 사용되었으며 다른 척추동물에게도 그 정도는 덜 사용되었습니다[20, 21].
본 논문에서는 LB 전위를 사용하여 3,500만 년 전에 형성된 넓은 고원 꼭대기에 있는 섬 그룹인 아남극 Kerguelen 섬에서 흔히 발견되는 남부 종인 Aulacomya atra의 ccfDNA를 분석합니다.화산 분출.체외 실험 시스템을 사용하여 우리는 해수에 있는 DNA 조각이 홍합에 의해 빠르게 흡수되어 혈림프 구획으로 들어가는 것을 발견했습니다.Shotgun 시퀀싱은 홍합 체림프 ccfDNA가 공생 박테리아 및 차가운 화산 해양 해안 생태계의 전형적인 생물 군계의 DNA 조각을 포함하여 자체 및 비자기 기원의 DNA 조각을 포함하고 있음을 보여주었습니다.Hemolymph ccfDNA에는 숙주 범위가 다른 바이러스에서 파생된 바이러스 서열도 포함되어 있습니다.우리는 또한 경골어류, 말미잘, 조류 및 곤충과 같은 다세포 동물의 DNA 조각을 발견했습니다.결론적으로, 우리의 연구는 LB 개념이 해양 무척추 동물에 성공적으로 적용되어 해양 생태계에서 풍부한 게놈 레퍼토리를 생성할 수 있음을 보여줍니다.
성충(길이 55-70mm) Mytilus platensis(M. platensis) 및 Aulacomya atra(A. atra)는 Port-au-France(049°21.235 S, 070°13.490 E.)의 조간대 암석 해안에서 채집되었습니다.2018년 12월 Kerguelen Islands. 다른 성체 푸른 홍합(Mytilus spp.)은 상업적 공급업체(PEI Mussel King Inc., 캐나다 프린스 에드워드 아일랜드)에서 구입하여 10–20L의 32‰ 인공 염수가 들어 있는 온도 제어(4°C) 폭기 탱크에 넣었습니다.(인공 바다 소금 Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).각 실험에서 개별 껍질의 길이와 무게를 측정했습니다.
이 프로그램에 대한 무료 공개 액세스 프로토콜은 온라인에서 사용할 수 있습니다(https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).간단히 말해서, LB 혈림프는 [22]에 설명된 대로 외전근에서 수집되었습니다.혈림프를 1200xg에서 3분 동안 원심분리하여 정화하고, 상청액을 사용할 때까지 동결(-20℃)하였다.cfDNA의 분리 및 정제를 위해 샘플(1.5-2.0ml)을 해동하고 NucleoSnap cfDNA 키트(Macherey-Nagel, Bethlehen, PA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 처리했습니다.ccfDNA는 추가 분석까지 -80°C에서 보관되었습니다.일부 실험에서 ccfDNA는 QIAamp DNA Investigator Kit(QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada)를 사용하여 분리 및 정제되었습니다.정제된 DNA는 표준 PicoGreen 분석을 사용하여 정량화되었습니다.분리된 ccfDNA의 단편 분포는 High Sensitivity DNA Kit를 사용하는 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)를 사용하여 모세관 전기영동으로 분석했습니다.제조업체의 지침에 따라 ccfDNA 샘플 1µl를 사용하여 분석을 수행했습니다.
혈림프 ccfDNA 단편의 시퀀싱을 위해 Génome Québec(캐나다 몬트리올, 퀘벡)은 Illumina MiSeq PE75 키트의 Illumina DNA Mix 키트를 사용하여 샷건 라이브러리를 준비했습니다.표준 어댑터(BioO)가 사용되었습니다.원시 데이터 파일은 NCBI Sequence Read Archive(SRR8924808 및 SRR8924809)에서 사용할 수 있습니다.기본 읽기 품질은 FastQC[23]를 사용하여 평가되었습니다.Trimmomatic [24]은 클리핑 어댑터와 낮은 품질의 읽기에 사용되었습니다.끝이 쌍으로 된 Shotgun 읽기는 불일치를 피하기 위해 FLASH가 최소 20bp의 겹치는 더 긴 단일 읽기로 병합되었습니다[25]. 병합된 읽기는 이매패류 NCBI 분류법 데이터베이스(e 값 < 1e-3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석을 달고, 저복잡성 서열의 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다. 병합된 읽기는 이매패류 NCBI 분류법 데이터베이스(e 값 < 1e-3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석을 달고, 저복잡성 서열의 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых molлюсков NCBI(зн ачение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. 풀링된 읽기는 NCBI 이매패류 분류 데이터베이스(e 값 < 1e-3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석을 달고 DUST[26]를 사용하여 낮은 복잡도 시퀀스 마스킹을 수행했습니다.使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数，并用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 먼지 [26] 进行 复杂度 序列 的 。。。。 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых molлюсков NCBI(значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [2 6]. 풀링된 읽기는 NCBI 이매패류 분류학 데이터베이스(e 값 <1e-3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석을 달고 낮은 복잡도 시퀀스 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다.읽기는 이매패류 시퀀스와 관련된(여기서는 자체 읽기라고 함) 및 관련되지 않은(비자기 읽기)의 두 그룹으로 나뉩니다.MEGAHIT를 사용하여 두 그룹을 개별적으로 조합하여 contig를 생성했습니다[27].한편, 외계인 마이크로바이옴 읽기의 분류학적 분포는 Kraken2 [28]를 사용하여 분류되었고 Galaxy [29, 30]의 Krona 파이 차트로 그래픽으로 표시되었습니다.최적의 kmers는 예비 실험에서 kmers-59로 결정되었습니다. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(이매패류 NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)과 정렬하여 자기 콘티그를 식별했습니다. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(이매패류 NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)과 정렬하여 자기 콘티그를 식별했습니다. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых molлюсков NCBI, значение) e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(NCBI 이매패류 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)과 일치시켜 자체 콘티그를 식별했습니다.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% NCBI для для для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для д) вустворчатых molлюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). 그런 다음 BLASTN(NCBI 이매패류 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)과의 일치를 통해 최종 주석을 위해 자체 콘티그를 식별했습니다. 동시에, 비자기 그룹 콘티그에 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)으로 주석을 달았습니다. 동시에, 비자기 그룹 콘티그에 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)으로 주석을 달았습니다. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60% ). 동시에, 외부 그룹 컨티그는 BLASTN(NT NCBI 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)으로 주석을 달았습니다.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e- 10 과 고몰로지야 60%). 동시에, non-self 그룹 콘티그에 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)으로 주석을 달았습니다. BLASTX는 nr 및 RefSeq 단백질 NCBI 데이터베이스(e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)를 사용하여 nonself contig에서 수행되었습니다. BLASTX는 nr 및 RefSeq 단백질 NCBI 데이터베이스(e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)를 사용하여 nonself contig에서 수행되었습니다. BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомологи я 60%). BLASTX는 또한 nr 및 RefSeq NCBI 단백질 데이터베이스(e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)를 사용하여 비자기 contig에서 수행되었습니다.还使用nr 와RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值 < 1e-10 和 60% 同源性).还使用nr 와RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值 < 1e-10 和 60% 同源性). BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомологя 6 0%). BLASTX는 또한 nr 및 RefSeq NCBI 단백질 데이터베이스(e 값 <1e-10 및 60% 상동성)를 사용하여 비자가 콘티그에서 수행되었습니다.non-self-contigs의 BLASTN 및 BLASTX 풀은 최종 contigs를 나타냅니다(보충 파일 참조).
PCR에 사용되는 프라이머는 표 S1에 나열되어 있습니다.Taq DNA 중합효소(Bio Basic Canada, Markham, ON)를 사용하여 ccfDNA 표적 유전자를 증폭했습니다.반응 조건은 95°C에서 3분, 95°C에서 1분, 설정 어닐링 온도 1분, 신장 72°C에서 1분, 35 사이클, 마지막으로 10분 이내에 72°C에서 사용되었습니다..PCR 산물은 SYBRTM Safe DNA Gel Stain(Invitrogen, Burlington, ON, Canada)이 함유된 아가로스 겔(1.5%)에서 95V에서 전기영동으로 분리했습니다.
홍합(Mytilus spp.)은 4°C에서 24시간 동안 500ml의 산소화 해수(32 PSU)에 적응되었습니다.인간 갈렉틴-7 cDNA 서열(NCBI 등록 번호 L07769)을 암호화하는 삽입물을 포함하는 플라스미드 DNA를 190㎍/㎕의 최종 농도로 바이알에 첨가하였다.DNA 첨가 없이 동일한 조건에서 배양된 홍합이 대조군이었다.세 번째 대조군 탱크에는 홍합이 없는 DNA가 포함되어 있었습니다.해수 내 DNA의 품질을 모니터링하기 위해 지정된 시간에 각 수조에서 해수 샘플(20 μl, 3회 반복)을 채취했습니다.플라스미드 DNA 추적성을 위해 LB 홍합을 지정된 시간에 수확하고 qPCR 및 ddPCR로 분석했습니다.바닷물의 염분 함량이 높기 때문에 모든 PCR 분석 전에 분취액을 PCR 품질의 물(1:10)로 희석했습니다.
디지털 액적 PCR(ddPCR)은 BioRad QX200 프로토콜(Mississauga, Ontario, Canada)을 사용하여 수행되었습니다.온도 프로필을 사용하여 최적의 온도를 결정합니다(표 S1).QX200 드롭 생성기(BioRad)를 사용하여 드롭을 생성했습니다.ddPCR은 다음과 같이 수행되었습니다: 95°C에서 5분, 95°C에서 30초 및 주어진 어닐링 온도에서 1분 및 72°C에서 30초, 4°C에서 5분 및 90°C에서 5분 이내의 50주기.QX200 드롭 리더(BioRad)를 사용하여 드롭 수 및 양성 반응(카피 수/μl)을 측정했습니다.10,000개 미만의 물방울이 있는 샘플은 거부되었습니다.ddPCR을 실행할 때마다 패턴 제어를 수행하지 않았습니다.
qPCR은 Rotor-Gene® 3000(Corbett Research, Sydney, Australia) 및 LGALS7 특정 프라이머를 사용하여 수행되었습니다.모든 정량적 PCR은 QuantiFast SYBR Green PCR Kit(QIAGEN)를 사용하여 20µl에서 수행되었습니다.qPCR은 95°C에서 15분간 인큐베이션한 후 95°C에서 10초 동안, 60°C에서 60초 동안 40주기를 거쳐 한 번의 데이터 수집으로 시작되었습니다.용융 곡선은 95°C에서 5초, 65°C에서 60초, 97°C에서 qPCR 종료 시 연속 측정을 사용하여 생성되었습니다.각 qPCR은 대조군 샘플을 제외하고 3회 수행되었습니다.
홍합은 높은 여과율로 알려져 있기 때문에 먼저 홍합이 바닷물에 존재하는 DNA 조각을 여과하고 유지할 수 있는지 조사했습니다.우리는 또한 이러한 단편이 반개방 림프계에 축적되는지 여부에 관심이 있었습니다.우리는 푸른 홍합 탱크에 추가된 용해성 DNA 조각의 운명을 추적하여 이 문제를 실험적으로 해결했습니다.DNA 단편의 추적을 용이하게 하기 위해 우리는 인간 갈렉틴-7 유전자를 포함하는 외래(자신이 아님) 플라스미드 DNA를 사용했습니다.ddPCR은 해수 및 홍합에서 플라스미드 DNA 조각을 추적합니다.우리의 결과는 홍합이 없을 때 해수에서 DNA 조각의 양이 시간이 지남에 따라(최대 7일) 비교적 일정하게 유지된다면 홍합이 있을 때 이 수준은 8시간 이내에 거의 완전히 사라진다는 것을 보여줍니다(그림 1a,b).외인성 DNA 조각은 판막내액과 혈림프에서 15분 이내에 쉽게 검출되었습니다(그림 1c).이러한 파편은 노출 후 최대 4시간 동안 여전히 감지될 수 있습니다.DNA 단편에 대한 이러한 여과 활성은 박테리아 및 조류의 여과 활성과 유사합니다[31].이러한 결과는 홍합이 유체 구획에서 외부 DNA를 걸러내고 축적할 수 있음을 시사합니다.
ddPCR로 측정한 홍합의 존재(A) 또는 부재(B)에서 해수 내 플라스미드 DNA의 상대 농도.A에서 결과는 백분율로 표시되며 상자 테두리는 75번째 및 25번째 백분위수를 나타냅니다.피팅된 로그 곡선은 빨간색으로 표시되고 회색 음영 영역은 95% 신뢰 구간을 나타냅니다.B에서 빨간색 선은 평균을 나타내고 파란색 선은 농도에 대한 95% 신뢰 구간을 나타냅니다.C 플라스미드 DNA를 첨가한 후 서로 다른 시간에 홍합의 혈림프 및 판막액에서 플라스미드 DNA의 축적.결과는 검출된 절대 복제수/mL(±SE)로 표시됩니다.
다음으로 우리는 인위적 영향이 제한적인 외딴 섬 그룹인 Kerguelen 섬의 홍합 침대에서 채취한 홍합에서 ccfDNA의 기원을 조사했습니다.이를 위해 홍합 혈림프에서 cccDNA를 분리하고 인간 cccDNA를 정제하는 데 일반적으로 사용되는 방법으로 정제했습니다[32, 33].우리는 홍합의 평균 혈림프 ccfDNA 농도가 혈림프 범위 ml당 낮은 마이크로그램이라는 것을 발견했습니다(표 S2, 보충 정보 참조).이 농도 범위는 건강한 사람(밀리리터당 낮은 나노그램)보다 훨씬 크지만, 드물게 암 환자의 경우 ccfDNA 수준이 밀리리터당 수 마이크로그램에 도달할 수 있습니다[34, 35].hemolymph ccfDNA의 크기 분포를 분석한 결과, 이러한 단편의 크기는 1000 bp에서 1000 bp까지 매우 다양합니다.최대 5000bp(그림 2).ccfDNA를 포함한 저농도 DNA 샘플에서 게놈 DNA를 신속하게 분리하고 정제하기 위해 법의학에서 일반적으로 사용되는 방법인 실리카 기반 QIAamp Investigator Kit를 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다[36].
홍합 혈림프의 대표적인 ccfDNA 전기영동도.NucleoSnap Plasma Kit(상단) 및 QIAamp DNA Investigator Kit로 추출.B 홍합에서 혈림프 ccfDNA 농도(±SE)의 분포를 보여주는 Violin 플롯.검은색과 빨간색 선은 각각 중앙값과 1사분위수와 3사분위수를 나타냅니다.
인간과 영장류에 있는 ccfDNA의 약 1%는 외부 소스를 가지고 있습니다[21, 37].이매패류의 반개방 순환계, 미생물이 풍부한 해수, 홍합 ccfDNA의 크기 분포를 고려할 때 홍합 체림프 ccfDNA에 풍부하고 다양한 미생물 DNA 풀이 포함될 수 있다는 가설을 세웠습니다.이 가설을 테스트하기 위해 Kerguelen Islands에서 수집한 Aulacomya atra 샘플의 hemolymph ccfDNA를 시퀀싱하여 1,000만 개 이상의 판독 결과를 얻었으며 그 중 97.6%가 품질 관리를 통과했습니다.그런 다음 BLASTN 및 NCBI 이매패류 데이터베이스를 사용하여 자체 및 비자기 소스에 따라 판독값을 분류했습니다(그림 S1, 보충 정보).
인간의 경우 핵 및 미토콘드리아 DNA 모두 혈류로 방출될 수 있습니다[38].그러나 본 연구에서는 A. atra 게놈이 시퀀싱되거나 기술되지 않았기 때문에 홍합의 핵 게놈 DNA를 자세히 기술하는 것은 불가능했다.그러나 우리는 이매패류 라이브러리를 사용하여 우리 자신의 기원에 대한 많은 ccfDNA 단편을 식별할 수 있었습니다(그림 S2, 보충 정보).우리는 또한 시퀀싱된 A. atra 유전자의 직접 PCR 증폭에 의해 우리 자신의 기원의 DNA 단편의 존재를 확인했습니다(그림 3).마찬가지로, A. atra의 미토콘드리아 게놈이 공개 데이터베이스에서 이용 가능하다는 점을 감안할 때 A. atra의 혈림프에서 미토콘드리아 ccfDNA 단편의 존재에 대한 증거를 찾을 수 있습니다.미토콘드리아 DNA 절편의 존재는 PCR 증폭으로 확인하였다(도 3).
다양한 미토콘드리아 유전자가 PCR로 증폭된 A. atra(빨간색 점 – 재고 번호: SRX5705969) 및 M. platensis(파란색 점 – 재고 번호: SRX5705968)의 혈림프에 존재했습니다.Breton et al., 2011에서 채택한 그림 B FTA 용지에 저장된 A. atra의 혈림프 상청액 증폭.3mm 펀치를 사용하여 PCR 믹스가 들어 있는 PCR 튜브에 직접 추가합니다.
해수에 풍부한 미생물 함량을 감안할 때, 우리는 초기에 혈림프에서 미생물 DNA 서열의 특성화에 초점을 맞췄습니다.이를 위해 두 가지 다른 전략을 사용합니다.첫 번째 전략은 BLAST 및 기타 도구에 필적하는 정확도로 미생물 서열을 식별할 수 있는 알고리즘 기반 서열 분류 프로그램인 Kraken2를 사용했습니다[28].6719개 이상의 판독값이 박테리아 기원인 것으로 확인되었으며, 124개와 64개는 각각 고세균과 바이러스에서 유래했습니다(그림 4).가장 풍부한 박테리아 DNA 조각은 Firmicutes(46%), Proteobacteria(27%) 및 Bacteroidetes(17%)였습니다(그림 4a).이 분포는 마린 블루 홍합 마이크로바이옴에 대한 이전 연구와 일치합니다[39, 40].감마프로테오박테리아는 많은 비브리오날레스를 포함하여 프로테오박테리아의 주요 클래스(44%)였습니다(그림 4b).ddPCR 방법은 A. atra hemolymph의 ccfDNA에서 Vibrio DNA 조각의 존재를 확인했습니다(그림 4c)[41].ccfDNA의 박테리아 기원에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 추가 접근 방식을 취했습니다(그림 S2, 보충 정보). 이 경우 중첩된 읽기는 쌍방향 읽기로 조립되었으며 BLASTN 및 1e-3의 e 값과 >90% 상동성을 가진 컷오프를 사용하여 자기(이매패류) 또는 비자기 기원으로 분류되었습니다. 이 경우 중첩된 읽기는 쌍방향 읽기로 조립되었으며 BLASTN 및 1e-3의 e 값과 >90% 상동성을 가진 컷오프를 사용하여 자기(이매패류) 또는 비자기 기원으로 분류되었습니다. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (д вустворчатые molлюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. 이 경우 중복 읽기는 쌍방향 읽기로 수집되었으며 BLASTN 및 e 값이 1e-3이고 >90% 상동성을 가진 컷오프를 사용하여 네이티브(이매패류) 또는 원본이 아닌 것으로 분류되었습니다.에서 这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非신체 활동.에서 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 (双 壳)类） 非自身。。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двуств орчатые molлюски) 또는 несобственные по пороисхождению с использованием значений e BLASTN 및 1e-3 и порога гомологии> 90%. 이 경우, 중복 읽기는 쌍방향 읽기로 수집되었고 e BLASTN 및 1e-3 값과 상동성 임계값 >90%를 사용하여 자체(이매패류) 또는 원본이 아닌 것으로 분류되었습니다.A. atra 게놈은 아직 시퀀싱되지 않았기 때문에 MEGAHIT NGS(Next Generation Sequencing) 어셈블러의 de novo 어셈블리 전략을 사용했습니다.총 147,188개의 콘티그가 종속(이매패류) 기원으로 확인되었습니다.이 contig는 BLASTN 및 BLASTX를 사용하여 1e-10의 e-값으로 폭발했습니다.이 전략을 통해 우리는 A. atra ccfDNA에 존재하는 482개의 비이매패류 단편을 식별할 수 있었습니다.이 DNA 조각의 절반 이상(57%)은 주로 아가미 공생체(황영양성 공생체 포함)와 아가미 공생체(Solemya velum)에서 얻은 박테리아에서 얻었습니다(그림 5).
유형 수준의 상대적 풍부도.B 2개의 주요 문(Firmicutes 및 Proteobacteria)의 미생물 다양성.ddPCR C Vibrio spp.의 대표적인 증폭A. 3개의 atra hemolymphs에서 16S rRNA 유전자(파란색)의 조각.
총 482개의 수집된 컨티그를 분석했습니다.metagenomic contig 주석(원핵생물 및 진핵생물)의 분류학적 분포에 대한 일반 프로필.B BLASTN 및 BLASTX에 의해 식별된 박테리아 DNA 단편의 상세한 분포.
Kraken2 분석은 또한 홍합 ccfDNA에 Euryarchaeota(65%), Crenarchaeota(24%) 및 Thaurmarcheota(11%)의 DNA 단편을 포함하여 고세균 DNA 단편이 포함되어 있음을 보여주었습니다(그림 6a).이전에 캘리포니아 홍합의 미생물 군집에서 발견된 Euryarchaeota 및 Crenarchaeota에서 파생된 DNA 단편의 존재는 놀라운 일이 아닙니다[42].Euryarchaeota는 종종 극한 조건과 관련이 있지만 Euryarchaeota와 Crenarcheota 모두 해양 극저온 환경에서 가장 흔한 원핵 생물 중 하나라는 것이 현재 인식되고 있습니다 [43, 44].케르겔렌 고원[45]의 바닥 누출로 인한 광범위한 메탄 누출에 대한 최근 보고와 케르겔렌 제도 해안에서 관찰된 가능한 미생물 메탄 생성[46]을 고려할 때 홍합에 메탄생성 미생물의 존재는 놀라운 일이 아닙니다.
그런 다음 우리의 관심은 DNA 바이러스의 판독값으로 옮겨갔습니다.우리가 아는 한, 이것은 홍합의 바이러스 함량에 대한 최초의 비표적 연구입니다.예상대로 우리는 박테리오파지(Caudovirales)의 DNA 단편을 발견했습니다(그림 6b).그러나 가장 일반적인 바이러스 DNA는 모든 바이러스의 가장 큰 게놈을 가진 핵 세포질 대형 DNA 바이러스(NCLDV)로도 알려진 뉴클레오사이토바이러스 문에서 유래합니다.이 문 내에서 대부분의 DNA 염기서열은 Mimimidoviridae(58%)와 Poxviridae(21%)과에 속하며 이들의 자연 숙주에는 척추동물과 절지동물이 포함되며 이러한 DNA 염기서열의 작은 부분은 알려진 바이러스학적 조류에 속합니다.해양 진핵 조류를 감염시킵니다.서열은 또한 알려진 바이러스 속의 가장 큰 게놈 크기를 가진 거대 바이러스인 판도라 바이러스로부터 얻어졌다.흥미롭게도 hemolymph ccfDNA 시퀀싱에 의해 결정된 바이러스에 감염된 것으로 알려진 호스트의 범위는 상대적으로 컸습니다(그림 S3, 보충 정보).여기에는 Baculoviridae 및 Iridoviridae와 같은 곤충을 감염시키는 바이러스와 아메바, 조류 및 척추 동물을 감염시키는 바이러스가 포함됩니다.우리는 또한 Pithovirus sibericum 게놈과 일치하는 서열을 발견했습니다.Pitovirus("좀비 바이러스"라고도 함)는 시베리아의 30,000년 된 영구 동토층에서 처음으로 분리되었습니다[47].따라서 우리의 결과는 이러한 바이러스의 모든 현생 종이 멸종된 것은 아니며 [48] 이러한 바이러스가 원격 아북극 해양 생태계에 존재할 수 있다는 이전 보고서와 일치합니다.
마지막으로 다른 다세포 동물의 DNA 조각을 찾을 수 있는지 테스트했습니다.nt, nr 및 RefSeq 라이브러리(게놈 및 단백질)를 사용하여 BLASTN 및 BLASTX에 의해 총 482개의 외부 컨티그가 식별되었습니다.우리의 결과는 다세포 동물의 ccfDNA의 외부 조각 중에서 뼈 뼈의 DNA가 우세하다는 것을 보여줍니다(그림 5).곤충과 다른 종의 DNA 조각도 발견되었습니다.DNA 단편의 상대적으로 많은 부분이 확인되지 않았는데, 아마도 육상 종에 비해 게놈 데이터베이스에서 많은 수의 해양 종의 과소 표현 때문일 것입니다[49].
본 논문에서는 LB 개념을 홍합에 적용하여 hemolymph ccfDNA shot sequencing이 해양 해안 생태계의 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다고 주장합니다.특히, 우리는 1) 홍합 혈림프가 상대적으로 큰(~1-5kb) 순환하는 DNA 조각의 상대적으로 높은 농도(마이크로그램 수준)를 포함한다는 것을 발견했습니다.2) 이 DNA 단편은 독립적이면서 동시에 비독립적입니다. 3) 이러한 DNA 단편의 외래 출처 중에서 우리는 박테리아, 고세균 및 바이러스 DNA와 다른 다세포 동물의 DNA를 발견했습니다.4) 이러한 외래 ccfDNA 단편의 체액 림프액 축적은 빠르게 발생하며 홍합의 내부 여과 활동에 기여합니다.결론적으로, 본 연구는 지금까지 주로 생물의학 분야에 적용되어 온 LB 개념이 센티넬 종과 환경 사이의 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있는 풍부하지만 탐구되지 않은 지식 소스를 암호화한다는 것을 보여줍니다.
영장류 외에도 마우스, 개, 고양이, 말을 포함한 포유류에서 ccfDNA 분리가 보고되었습니다[50, 51, 52].그러나 우리가 아는 한, 개방 순환 시스템을 갖춘 해양 종에서 ccfDNA의 검출 및 시퀀싱을 보고한 연구는 처음입니다.홍합의 이러한 해부학적 특징과 여과 능력은 적어도 부분적으로 다른 종과 비교하여 순환하는 DNA 조각의 크기 특성이 다른 이유를 설명할 수 있습니다.인간의 경우 혈액에서 순환하는 대부분의 DNA 조각은 크기가 150~200bp 범위의 작은 조각입니다.최대 피크는 167bp[34, 53]입니다.작지만 중요한 부분의 DNA 단편은 크기가 300~500bp이고 약 5%는 900bp보다 깁니다.[54].이러한 크기 분포의 이유는 혈장 내 ccfDNA의 주요 공급원이 세포 사멸 또는 건강한 개인의 순환 조혈 세포 괴사 또는 암 환자의 종양 세포의 세포사멸(순환 종양 DNA로 알려짐)로 인해 세포 사멸의 결과로 발생하기 때문입니다., ctDNA).우리가 홍합에서 발견한 혈림프 ccfDNA의 크기 분포는 1000~5000 bp 범위였으며 이는 홍합 ccfDNA가 다른 기원을 가지고 있음을 시사합니다.홍합은 반개방형 혈관 시스템을 가지고 있고 고농도의 미생물 게놈 DNA를 포함하는 해양 수생 환경에서 살기 때문에 이것은 논리적인 가설입니다.사실, 외인성 DNA를 사용한 우리의 실험실 실험은 홍합이 바닷물에 DNA 조각을 축적하는 것으로 나타났습니다. 적어도 몇 시간 후에 홍합은 세포 섭취 후 분해되고/되거나 다양한 조직에 방출 및/또는 저장됩니다.세포(원핵 및 진핵)의 희소성을 감안할 때, 판막내 구획의 사용은 자체 공급원뿐만 아니라 외부 공급원으로부터의 ccfDNA의 양을 감소시킬 것입니다.이매패류 선천 면역의 중요성과 많은 수의 순환하는 식세포를 고려하여, 외부 ccfDNA조차도 미생물 및/또는 세포 찌꺼기 섭취 시 외부 DNA를 축적하는 순환 식세포가 풍부하다는 가설을 세웠습니다.종합하면, 우리의 결과는 이매패류 혈림프 ccfDNA가 분자 정보의 고유한 저장소이며 센티넬 종으로서의 지위를 강화한다는 것을 보여줍니다.
우리의 데이터는 박테리아 유래 혈림프 ccfDNA 단편의 시퀀싱 및 분석이 숙주 박테리아 식물군과 주변 해양 생태계에 존재하는 박테리아에 대한 주요 정보를 제공할 수 있음을 나타냅니다.샷 시퀀싱 기술은 부분적으로 참조 라이브러리 편향으로 인해 기존의 16S rRNA 식별 방법을 사용했다면 놓쳤을 공생 박테리아 A. atra 아가미의 서열을 밝혀냈습니다.실제로 Kerguelen의 동일한 홍합 층에서 M. platensis에서 수집한 LB 데이터를 사용하여 아가미 관련 세균 공생체의 구성이 두 홍합 종에서 동일하다는 것을 보여주었습니다(그림 S4, 보충 정보).유전적으로 다른 두 홍합의 이러한 유사성은 Kerguelen의 저온, 유황 및 화산 퇴적물에서 박테리아 군집의 구성을 반영할 수 있습니다[55, 56, 57, 58].Port-au-France 해안과 같은 생물학적 교란이 있는 해안 지역[59]에서 홍합을 수확할 때 더 높은 수준의 황 환원 미생물이 잘 설명되어 있습니다.또 다른 가능성은 공생 홍합 식물군이 수평 전송에 의해 영향을 받을 수 있다는 것입니다[60, 61].해양 환경, 해저 표면 및 홍합의 공생 박테리아 구성 간의 상관 관계를 확인하려면 더 많은 연구가 필요합니다.이러한 연구는 현재 진행 중입니다.
hemolymph ccfDNA의 길이와 농도, 정제 용이성 및 빠른 샷건 시퀀싱을 허용하는 고품질은 홍합 ccfDNA를 사용하여 해양 연안 생태계의 생물 다양성을 평가하는 많은 이점 중 일부입니다.이 접근법은 특정 생태계에서 바이러스 커뮤니티(viromes)를 특성화하는 데 특히 효과적입니다[62, 63].박테리아, 고세균 및 진핵생물과 달리 바이러스 게놈은 16S 서열과 같은 계통발생학적으로 보존된 유전자를 포함하지 않습니다.우리의 결과는 홍합과 같은 지표 종의 액체 생검을 사용하여 일반적으로 해안 해양 생태계에 서식하는 숙주를 감염시키는 것으로 알려진 비교적 많은 수의 ccfDNA 바이러스 조각을 식별할 수 있음을 나타냅니다.여기에는 원생동물, 절지동물, 곤충, 식물 및 박테리아 바이러스(예: 박테리오파지)를 감염시키는 것으로 알려진 바이러스가 포함됩니다.Kerguelen의 동일한 홍합 층에서 수집된 푸른 홍합(M. platensis)의 혈림프 ccfDNA 바이롬을 조사했을 때 유사한 분포가 발견되었습니다(표 S2, 보충 정보).ccfDNA의 샷건 시퀀싱은 실제로 인간 또는 다른 종의 바이롬 연구에서 탄력을 받는 새로운 접근 방식입니다[21, 37, 64].이 접근법은 볼티모어에서 가장 다양하고 광범위한 종류의 바이러스를 나타내는 모든 이중 가닥 DNA 바이러스 중에서 단일 유전자가 보존되지 않기 때문에 이중 가닥 DNA 바이러스 연구에 특히 유용합니다[65].이러한 바이러스의 대부분은 분류되지 않은 상태로 남아 있고 바이러스 세계의 완전히 알려지지 않은 부분의 바이러스를 포함할 수 있지만[66] 홍합 A. atra 및 M. platensis의 바이롬 및 숙주 범위가 두 종 사이에 있음을 발견했습니다.유사하게(그림 S3, 추가 정보 참조).이러한 유사성은 환경에 존재하는 DNA 흡수의 선택성 부족을 반영할 수 있으므로 놀라운 일이 아닙니다.RNA 바이롬을 특성화하기 위해 정제된 RNA를 사용하는 향후 연구가 현재 필요합니다.
우리 연구에서 우리는 네이티브 ccfDNA의 조립 전후에 풀링된 읽기 및 콘티그의 2단계 삭제를 사용하여 매핑되지 않은 읽기의 높은 비율을 초래한 Kowarski와 동료[37]의 작업에서 채택된 매우 엄격한 파이프라인을 사용했습니다.따라서 우리는 이 홍합 종에 대한 참조 게놈이 없기 때문에 이러한 매핑되지 않은 읽기 중 일부가 여전히 자체 기원을 가질 수 있음을 배제할 수 없습니다.우리는 또한 Illumina MiSeq PE75에서 생성된 자체 읽기와 비자가 읽기 사이의 키메라와 읽기 길이에 대해 우려했기 때문에 이 파이프라인을 사용했습니다.대부분의 미지 판독값에 대한 또 다른 이유는 특히 Kerguelen과 같은 외딴 지역에 있는 많은 해양 미생물에 주석이 달려 있지 않기 때문입니다.인간 ccfDNA와 유사한 ccfDNA 조각 길이를 가정하여 Illumina MiSeq PE75를 사용했습니다.향후 연구를 위해 hemolymph ccfDNA가 인간 및/또는 포유류보다 더 긴 읽기를 가지고 있음을 보여주는 결과를 고려할 때 더 긴 ccfDNA 조각에 더 적합한 시퀀싱 플랫폼을 사용하는 것이 좋습니다.이 방법을 사용하면 심층 분석을 위해 더 많은 징후를 훨씬 쉽게 식별할 수 있습니다.현재 사용할 수 없는 완전한 A. atra 핵 게놈 서열을 얻는 것은 ccfDNA를 자체 소스와 비자기 소스에서 구별하는 것을 크게 촉진할 것입니다.우리의 연구는 액체생검의 개념을 홍합에 적용할 수 있는 가능성에 초점을 맞추었다는 점에서 이 개념이 향후 연구에서 사용됨에 따라 홍합의 미생물 다양성 연구를 위한 이 방법의 가능성을 높일 수 있는 새로운 도구와 파이프라인이 개발되기를 기대합니다.해양 생태계.
비침습적 임상 바이오마커로서 ccfDNA의 상승된 인간 혈장 수준은 다양한 질병, 조직 손상 및 스트레스 조건과 관련이 있습니다[67,68,69].이 증가는 조직 손상 후 자체 기원의 DNA 조각 방출과 관련이 있습니다.우리는 홍합이 30°C의 온도에 잠시 노출되는 급성 열 스트레스를 사용하여 이 문제를 해결했습니다.세 가지 독립적인 실험에서 세 가지 유형의 홍합에 대해 이 분석을 수행했습니다.그러나 급성 열 스트레스 후 ccfDNA 수준의 변화는 발견되지 않았습니다(그림 S5, 추가 정보 참조).이 발견은 홍합이 반개방 순환계를 가지고 있고 높은 여과 활동으로 인해 많은 양의 외부 DNA를 축적한다는 사실을 적어도 부분적으로 설명할 수 있습니다.반면 홍합은 많은 무척추동물과 마찬가지로 스트레스로 인한 조직 손상에 더 저항력이 있어 혈림프에서 ccfDNA의 방출을 제한할 수 있습니다[70, 71].
현재까지 수생 생태계의 생물 다양성에 대한 DNA 분석은 주로 eDNA(environmental DNA) 메타바코딩에 초점을 맞추었습니다.그러나 이 방법은 일반적으로 프라이머를 사용할 때 생물다양성 분석에 제한이 있습니다.샷건 시퀀싱을 사용하면 PCR의 한계와 프라이머 세트의 편향된 선택을 피할 수 있습니다.따라서 어떤 의미에서 우리의 방법은 조각난 DNA를 직접 시퀀싱하고 거의 모든 유기체를 분석할 수 있는 최근에 사용되는 high-throughput eDNA Shotgun 시퀀싱 방법에 더 가깝습니다[72, 73].그러나 표준 eDNA 방법과 LB를 구별하는 근본적인 문제가 많이 있습니다.물론 eDNA와 LB의 주요 차이점은 자연 필터 호스트를 사용한다는 것입니다.eDNA 연구를 위한 천연 필터로 해면 및 이매패류(Dresseina spp.)와 같은 해양 종을 사용하는 것이 보고되었습니다[74, 75].그러나 Dreissena의 연구에서는 DNA를 추출한 조직 생검을 사용했습니다.LB의 ccfDNA 분석에는 조직 생검, eDNA 또는 조직 생검과 관련된 특수하고 때로는 고가의 장비 및 물류가 필요하지 않습니다.실제로 우리는 최근 LB의 ccfDNA가 콜드 체인을 유지하지 않고 FTA 지원으로 저장 및 분석될 수 있다고 보고했는데, 이는 외딴 지역 연구의 주요 과제입니다[76].액체 생검에서 ccfDNA 추출도 간단하며 샷건 시퀀싱 및 PCR 분석을 위한 고품질 DNA를 제공합니다.이것은 eDNA 분석과 관련된 일부 기술적 한계를 고려할 때 큰 이점입니다[77].샘플링 방법의 단순성과 저렴한 비용은 장기 모니터링 프로그램에도 특히 적합합니다.높은 여과 능력 외에도, 이매패류의 또 다른 잘 알려진 특징은 바이러스의 흡수를 촉진하는 점액의 화학적 점액다당류 구성입니다[78, 79].이로 인해 이매패류는 주어진 수중 생태계에서 생물다양성과 기후 변화의 영향을 특성화하는 데 이상적인 자연 필터가 됩니다.숙주 유래 DNA 조각의 존재가 eDNA와 비교하여 방법의 한계로 보일 수 있지만, eDNA와 비교하여 이러한 고유 ccfDNA를 갖는 것과 관련된 비용은 건강 연구에 사용할 수 있는 방대한 양의 정보에 대해 동시에 이해할 수 있습니다.오프셋 호스트.여기에는 숙주 숙주의 게놈에 통합된 바이러스 서열의 존재가 포함됩니다.이매패류[80, 81]에서 수평으로 전파되는 백혈병 레트로바이러스의 존재를 고려할 때 이것은 홍합에 특히 중요합니다.eDNA에 비해 LB의 또 다른 장점은 미생물(및 그 게놈)을 삼키는 혈림프에서 순환하는 혈액 세포의 식세포 활동을 이용한다는 것입니다.식균작용은 이매패류에서 혈액 세포의 주요 기능입니다[82].마지막으로, 이 방법은 홍합의 높은 여과 능력(해수 평균 1.5l/h)과 2일 순환을 활용하여 해수의 서로 다른 층의 혼합을 증가시켜 이종 eDNA를 캡처할 수 있습니다.[83, 84].따라서 홍합 ccfDNA 분석은 홍합의 영양적, 경제적, 환경적 영향을 고려할 때 흥미로운 방법입니다.인간에게서 채취한 LB 분석과 유사하게 이 방법은 외인성 물질에 반응하는 숙주 DNA의 유전적 및 후성적 변화를 측정할 가능성도 열어줍니다.예를 들어, 나노포어 시퀀싱을 사용하여 천연 ccfDNA에서 게놈 전체 메틸화 분석을 수행하기 위해 3세대 시퀀싱 기술을 구상할 수 있습니다.이 과정은 홍합 ccfDNA 조각의 길이가 화학적 변형 없이 단일 시퀀싱 실행에서 게놈 차원의 DNA 메틸화 분석을 허용하는 long-read 시퀀싱 플랫폼과 이상적으로 호환된다는 사실에 의해 촉진되어야 합니다.85,86] 이것은 DNA 메틸화 패턴이 환경 스트레스에 대한 반응을 반영하고 여러 세대에 걸쳐 지속된다는 것이 밝혀졌기 때문에 흥미로운 가능성입니다.따라서 기후 변화나 오염 물질에 노출된 후 반응을 지배하는 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다[87].그러나 LB의 사용에 제한이 없는 것은 아닙니다.말할 필요도 없이 이것은 생태계에 지표 종의 존재를 요구합니다.위에서 언급한 바와 같이 주어진 생태계의 생물다양성을 평가하기 위해 LB를 사용하려면 소스의 DNA 단편의 존재를 고려하는 엄격한 생물정보학 파이프라인도 필요합니다.또 다른 주요 문제는 해양 종에 대한 참조 게놈의 가용성입니다.Marine Mammal Genomes Project 및 최근 설립된 Fish10k 프로젝트[88]와 같은 이니셔티브가 향후 이러한 분석을 용이하게 해주기를 바랍니다.LB 개념을 해양 여과 먹이 유기체에 적용하는 것은 시퀀싱 기술의 최신 발전과도 호환되므로 환경 스트레스에 대응하여 해양 서식지의 건강에 대한 중요한 정보를 제공하는 다중 옴 바이오마커 개발에 매우 ​​적합합니다.
게놈 시퀀싱 데이터는 Bioprojects SRR8924808의 NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808에 기탁되었습니다.
Brierley AS, Kingsford MJ 기후 변화가 해양 생물과 생태계에 미치는 영향.콜 생물학.2009년;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, 외.해양 환경에 대한 기후 변화 및 기타 지역 스트레스 요인의 결합된 영향을 고려하십시오.일반 과학 환경.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, 외.).3월 1일의 과학.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. 반복적인 열 스트레스 조건에서 내열성 감소는 푸른 홍합의 높은 여름 사망률을 설명합니다.과학 보고서 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER 등.동물 사망의 빈도, 원인 및 범위의 최근 변화.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, 외.여러 비종 특정 병원체가 Pinna nobilis의 대량 사망을 유발했을 수 있습니다.삶.2020;10:238.
브래들리 M, Coutts SJ, 젠킨스 E, 오하라 TM.기후 변화가 북극 동물원성 질병에 미치는 잠재적 영향.Int J Circumpolar 건강.2005년;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. 외.해안 오염 모니터링에서 신호 유기체로서의 푸른 홍합(Mytilus edulis spp.): 검토.2017년 3월 Environ Res;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. 암 치료에 액체 생검 통합.Nat Rev 클린 온콜.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C 등.액체 생검 성숙: 종양 DNA가 순환하도록 합니다.Nat 레브 암.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. 인간 혈장의 핵산.Soc Biol 자회사 회의록.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. 암 치료용 분자 마커로서 무세포 DNA의 새로운 역할.생체 분석의 정량화.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS 액체 생검이 임상에 도입됨 – 구현 문제 및 향후 과제.Nat Rev Clin Oncol.2021년;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW 등.태아 DNA는 모체 혈장과 혈청에 존재합니다.랜싯.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR 임신 중 여성의 혈액에서 순환하는 세포외 RNA를 사용한 임신 과정 및 합병증 연구.마약.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, 외.액체 생검: 기증자 무세포 DNA는 신장 이식편에서 동종 병변을 감지하는 데 사용됩니다.Nat 레브 네프롤.2021년;17:591–603.
Juan FC, Lo YM 산전 진단의 혁신: 산모 혈장 게놈 시퀀싱.안나 MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D 등.감염된 체액의 차세대 metagenomic 시퀀싱을 통한 신속한 병원체 탐지.Nat 의학.2021;27:115-24.