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통제되지 않은 출혈은 주요 사망 원인 중 하나입니다.빠른 지혈을 달성하면 전투, 교통 사고 및 사망 감소 작전 중에 응급 처치로 피험자의 생존을 보장합니다.연속상으로서 단순 지혈막 형성 조성물(HFFC)로부터 유도된 나노다공성 섬유 강화 복합 스캐폴드(NFRCS)는 지혈을 유발하고 향상시킬 수 있다.NFRCS의 개발은 잠자리의 날개 디자인을 기반으로 합니다.잠자리 날개 구조는 가로날개와 세로날개로 구성되며, 날개막은 미세구조의 일체성을 유지하기 위해 서로 연결되어 있다.HFFC는 나노미터 두께의 필름으로 섬유 표면을 균일하게 코팅하고 무작위로 분포된 면 두께(Ct)(분산상)를 연결하여 나노다공성 구조를 형성합니다.연속상과 분산상의 조합은 시중에서 판매되는 제품에 비해 제품 비용을 10배까지 절감합니다.수정된 NFRCS(탐폰 또는 손목 밴드)는 다양한 생의학 응용 분야에 사용될 수 있습니다.생체 내 연구는 개발된 Cp NFRCS가 적용 부위에서 응고 과정을 유발하고 강화한다는 결론을 내렸습니다.NFRCS는 나노다공성 구조로 인해 미세 환경을 조절하고 세포 수준에서 작용하여 절제 상처 모델에서 상처 치유를 향상시킬 수 있습니다.
전투, 수술 중 및 응급 상황에서 제어되지 않은 출혈은 부상자의 생명에 심각한 위협이 될 수 있습니다1.이러한 상태는 말초 혈관 저항의 전반적인 증가로 이어져 출혈성 쇼크를 유발합니다.수술 중 및 수술 후 출혈을 제어하기 위한 적절한 조치는 잠재적으로 생명을 위협하는 것으로 간주됩니다2,3.큰 혈관이 손상되면 막대한 실혈로 이어져 전투 시 사망률이 50% 이하, 수술 시 31%에 이릅니다1.다량의 혈액 손실은 체적 감소로 이어져 심박출량을 감소시킵니다.전체 말초혈관 저항의 증가와 미세순환의 진행성 장애는 생명 유지 기관의 저산소증을 유발합니다.효과적인 개입 없이 상태가 지속되면 출혈성 쇼크가 발생할 수 있습니다1,4,5.다른 합병증으로는 저체온증 및 대사성 산증의 진행, 응고 과정을 방해하는 응고 장애가 있습니다.심한 출혈성 쇼크는 높은 사망 위험과 관련이 있습니다6,7,8.III 등급(진행성) 쇼크에서 수혈은 수술 중 및 수술 후 이환율과 사망률 동안 환자의 생존에 필수적입니다.위의 생명을 위협하는 모든 상황을 극복하기 위해 수용성 지혈 고분자의 조합을 사용하여 최소 고분자 농도(0.5%)를 활용하는 나노다공성 섬유 강화 복합 스캐폴드(NFRCS)를 개발했습니다.
섬유 보강재를 사용하면 비용 효율적인 제품을 개발할 수 있습니다.무작위로 배열된 섬유는 날개의 수평 및 수직 줄무늬에 의해 균형을 이루는 잠자리 날개 구조와 유사합니다.날개의 가로 및 세로 정맥은 날개 막과 연결됩니다(그림 1).NFRCS는 더 나은 물리적 및 기계적 강도를 가진 발판 시스템으로 강화된 Ct로 구성됩니다(그림 1).경제성과 장인 정신으로 인해 외과 의사는 수술 및 드레싱 중에 면사 게이지(Ct)를 사용하는 것을 선호합니다. 따라서 > 90%의 결정 셀룰로오스(지혈 활동 향상에 기여)를 포함하여 여러 이점을 고려하여 Ct는 NFRCS9,10의 골격 시스템으로 사용되었습니다. 따라서 > 90%의 결정 셀룰로오스(지혈 활동 향상에 기여)를 포함하여 여러 이점을 고려하여 Ct는 NFRCS9,10의 골격 시스템으로 사용되었습니다. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышени и гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. 따라서 >90% 결정 셀룰로오스(지혈 활성 증가와 관련됨)를 포함하여 많은 이점을 제공하는 Ct는 NFRCS 골격계로 사용되었습니다9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로오스(지혈 활성 향상에 도움)를 포함하여 많은 이점이 있는 경우 Ct는 NFRCS9,10의 스캐폴드로 사용되었습니다.Ct는 표면적으로 코팅되었고(나노 두께의 필름 형성이 관찰됨) 지혈 필름 형성 조성물(HFFC)과 상호 연결되었습니다.HFFC는 무작위로 배치된 Ct를 함께 고정하는 matrigel과 같은 역할을 합니다.개발된 설계는 분산상(강화 섬유) 내에서 응력을 전달합니다.최소 폴리머 농도를 사용하여 우수한 기계적 강도를 가진 나노다공성 구조를 얻는 것은 어렵습니다.또한 다양한 생의학 응용 프로그램에 대해 다양한 금형을 사용자 정의하는 것이 쉽지 않습니다.
그림은 잠자리 날개 구조(A)를 기반으로 한 NFRCS 설계 다이어그램을 보여줍니다.이 이미지는 잠자리의 날개 구조(날개의 교차 및 세로 정맥이 서로 연결됨)의 비교 유추와 Cp NFRCS의 단면 현미경 사진(B)을 보여줍니다.NFRCS의 개략도.
NFRC는 위의 제한 사항을 해결하기 위해 HFFC를 연속 단계로 사용하여 개발되었습니다.HFFC는 혈전 형성을 촉진하는 지지체 중합체로서 메틸셀룰로오스(MC), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC 50cp) 및 폴리비닐 알코올(PVA)(125kDa)과 키토산(주요 지혈 중합체)을 비롯한 다양한 필름 형성 지혈 중합체로 구성됩니다.형성.폴리비닐피롤리딘 K30(PVP K30)을 첨가하여 NFRCS의 수분 흡수 능력을 향상시켰습니다.폴리에틸렌 글리콜 400(PEG 400)은 결합된 폴리머 블렌드에서 폴리머 가교를 개선하기 위해 첨가되었습니다.3개의 다른 HFFC 지혈 조성물(Cm HFFC, Ch HFFC 및 Cp HFFC), 즉 MC(Cm)가 포함된 키토산, HPMC(Ch)가 포함된 키토산 및 PVA(Cp)가 포함된 키토산이 Ct에 적용되었습니다.다양한 시험관 내 및 생체 내 특성화 연구에서 NFRCS의 지혈 및 상처 치유 활성이 확인되었습니다.NFRCS에서 제공하는 복합 재료는 특정 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 형태의 비계를 사용자 정의하는 데 사용할 수 있습니다.
또한, NFRCS는 하지 및 기타 신체 부위의 전체 부상 부위를 덮기 위해 붕대 또는 롤로 변형될 수 있습니다.특히 전투 사지 부상의 경우 설계된 NFRCS 설계를 반팔 또는 전체 다리로 변경할 수 있습니다(보조 그림 S11).NFRCS는 조직 접착제로 손목 밴드로 만들 수 있으며, 이는 심한 자살 손목 부상으로 인한 출혈을 멈추는 데 사용할 수 있습니다.우리의 주요 목표는 많은 인구(빈곤선 이하)에게 전달될 수 있고 응급 처치 키트에 넣을 수 있는 가능한 적은 폴리머로 NFRCS를 개발하는 것입니다.단순하고 효율적이며 경제적인 디자인의 NFRCS는 지역 사회에 혜택을 주고 전 세계에 영향을 미칠 수 있습니다.
키토산(분자량 80kDa)과 아마란스는 인도 Merck에서 구입했습니다.하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 50Cp, 폴리에틸렌 글리콜 400 및 메틸셀룰로오스는 Loba Chemie Pvt.에서 구입했습니다.LLC, 뭄바이.폴리비닐 알코올(분자량 125kDa)(87-90% 가수분해됨)은 National Chemicals, Gujarat에서 구입했습니다.폴리비닐피롤리딘 K30은 Molychem, Mumbai에서 구입했고, 멸균 면봉은 Tamil Nadu의 Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd.에서 Milli Q water(Direct-Q3 정수 시스템, Merck, India)를 담체로 사용하여 구입했습니다.
NFRCS는 동결건조 방법11,12을 사용하여 개발되었습니다.모든 HFFC 조성물(표 1)은 기계적 교반기를 사용하여 제조되었습니다.기계적 교반기에서 800rpm으로 연속 교반하여 물에 1% 아세트산을 사용하여 키토산의 0.5% 용액을 준비합니다.표 1에 표시된 적재된 폴리머의 정확한 중량을 키토산 용액에 첨가하고 투명한 폴리머 용액이 얻어질 때까지 교반하였다.생성된 혼합물에 PVP K30 및 PEG 400을 표 1에 나타낸 양으로 첨가하고, 투명한 점성 폴리머 용액이 얻어질 때까지 교반을 계속하였다.생성된 폴리머 용액조를 60분 동안 초음파 처리하여 폴리머 혼합물에서 갇힌 기포를 제거했습니다.보충 그림 S1(b)에서 볼 수 있듯이 Ct는 5ml의 HFFC가 보충된 6웰 플레이트(몰드)의 각 웰에 고르게 분포되어 있습니다.
6웰 플레이트를 60분 동안 초음파 처리하여 Ct 네트워크에서 HFFC의 균일한 습윤 및 분포를 달성했습니다.그런 다음 6웰 플레이트를 -20°C에서 8-12시간 동안 동결합니다.동결 플레이트를 48시간 동안 동결건조하여 NFRCS의 다양한 제형을 얻었다.동일한 절차를 사용하여 탐폰이나 원통형 탐폰 또는 다른 용도의 다른 모양과 같은 다른 모양과 구조를 생산합니다.
정확한 무게를 잰 키토산(80kDa)(3%)을 자기 교반기를 사용하여 1% 아세트산에 용해합니다.생성된 키토산 용액에 1% PEG 400을 첨가하고 30분 동안 교반하였다.생성된 용액을 정사각형 또는 직사각형 용기에 붓고 -80°C에서 12시간 동안 동결합니다.동결된 샘플을 48시간 동안 동결건조하여 다공성 Cs13을 얻었다.
개발된 NFRCS는 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)(Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan)을 사용하여 키토산과 다른 폴리머의 화학적 호환성을 확인하는 실험을 거쳤습니다14,15.모든 테스트 샘플의 FTIR 스펙트럼(400 ~ 4000cm-1 스펙트럼 범위의 폭)은 32회 스캔을 수행하여 얻었습니다.
모든 제제에 대한 혈액 흡수율(BAR)은 Chen et al.약간의 수정이 있는 16.모든 조성의 전개된 NFRK를 진공 오븐에서 105°C로 밤새 건조하여 잔류 용매를 제거했습니다.30mg NFRCS(초기 샘플 중량 – W0) 및 30mg Ct(양성 대조군)를 3.8% 시트르산나트륨의 프리믹스가 들어 있는 별도의 접시에 넣었습니다.미리 결정된 시간 간격, 즉 5, 10, 20, 30, 40 및 60초에서 NFRCS를 제거하고 시료를 Ct에 30초 동안 두어 표면에 흡수되지 않은 혈액을 제거했습니다.NFRCS 16에 의해 흡수된 혈액의 최종 무게는 각 시점에서 고려되었습니다(W1).다음 공식을 사용하여 BAR 백분율을 계산합니다.
혈액 응고 시간(BCT)은 Wang et al.17 .전혈(3.8% 구연산 나트륨과 사전 혼합된 쥐 혈액)이 NFRCS 존재 하에서 응고되는 데 필요한 시간을 테스트 샘플의 BCT로 계산했습니다.다양한 NFRCS 성분(30mg)을 10ml 스크류 캡 바이알에 넣고 37°C에서 배양했습니다.바이알에 혈액(0.5ml)을 넣고 0.2M CaCl2 0.3ml를 넣어 혈액 응고를 활성화시켰다.마지막으로 단단한 응고가 형성될 때까지 15초마다(최대 180°) 바이알을 뒤집습니다.샘플의 BCT는 플립 vails17,18의 수로 추정됩니다.BCT를 기반으로 NFRCS Cm, Ch 및 Cp의 두 가지 최적 구성이 추가 특성화 연구를 위해 선택되었습니다.
Ch NFRCS 및 Cp NFRCS 구성의 BCT는 Li et al.19 .15 x 15mm Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs(양성 대조군)를 별도의 페트리 접시(37°C)에 넣습니다.3.8% 시트르산나트륨을 함유한 혈액을 0.2M CaCl2와 10:1 부피비로 혼합하여 혈액 응고 과정을 시작했습니다.0.2M CaCl2 쥐 혈액 혼합물 20μl를 시료 표면에 바르고 빈 페트리 접시에 넣었습니다.대조군은 Ct가 없는 빈 페트리 접시에 혈액을 부었습니다.0, 3, 5분의 고정된 간격으로 응고를 방해하지 않고 접시가 들어 있는 샘플에 10ml의 탈이온수(DI)를 추가하여 응고를 중지합니다.응고되지 않은 적혈구(적혈구)는 탈이온수의 존재 하에서 용혈되어 헤모글로빈을 방출합니다.상이한 시점에서의 헤모글로빈(HA(t))은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 540 nm(λmax 헤모글로빈)에서 측정되었습니다.10ml의 탈이온수에서 0분 동안 20μl의 혈액에서 헤모글로빈(AH(0))의 절대 흡수를 참조 표준으로 사용했습니다.응고된 혈액의 상대 헤모글로빈 섭취량(RHA)은 동일한 배치의 혈액을 사용하여 HA(t)/HA(0) 비율로부터 계산되었습니다.
텍스처 분석기(Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA)를 사용하여 손상된 조직에 대한 NFRK의 접착 특성을 측정했습니다.바닥이 뚫린 원통형 접시를 (지방층이 없는) 돼지 껍질 안쪽에 대고 누르십시오.샘플(Ch NFRCS 및 Cp NFRCS)을 캐뉼라를 통해 원통형 몰드에 적용하여 돼지 피부에 접착력을 생성했습니다.실온(RT)(25℃)에서 3분 인큐베이션 후, NFRCS 접착 강도는 0.5mm/초의 일정한 속도로 기록되었다.
수술용 실란트의 주요 특징은 출혈을 줄이면서 혈액 응고를 증가시키는 것입니다.NFRCS의 무손실 응고는 이전에 발표된 방법을 약간 수정하여 평가했습니다 19 .원심분리기 튜브의 한쪽 면에 8 × 5mm2 구멍이 있는 미세원심분리기 튜브(2ml)(내경 10mm)를 만듭니다(열린 상처를 나타냄).NFRCS는 개구부를 막는 데 사용되고 테이프는 외부 가장자리를 밀봉하는 데 사용됩니다.3.8% 구연산 나트륨 프리믹스를 포함하는 미세 원심 분리기 튜브에 0.2 M CaCl2 20 μl를 추가합니다.10분 후 접시에서 미세원심분리기 튜브를 제거하고 NFRK에서 혈액이 유출되어 접시의 질량 증가를 측정했습니다(n = 3).실혈 Ch NFRCS 및 Cp NFRCS를 Cs와 비교하였다.
NFRCS의 습식 무결성은 Mishra 및 Chaudhary21이 설명한 방법을 약간 수정하여 결정했습니다.NFRCS를 50ml 물이 있는 100ml 삼각 플라스크에 넣고 상단을 형성하지 않고 60s 동안 소용돌이치게 합니다.수집에 기반한 물리적 무결성에 대한 샘플의 육안 검사 및 우선 순위 지정.
Ct에 대한 HFFC의 결합 강도는 이전에 발표된 방법을 약간 수정하여 연구했습니다.milliQ 물(Ct)이 있는 상태에서 NFRK를 음향파(외부 자극)에 노출시켜 표면 코팅 무결성을 평가했습니다.개발된 NFRCS Ch NFRCS 및 Cp NFRCS를 물이 채워진 비이커에 넣고 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 30분 동안 초음파 처리했습니다.건조 후 NFRCS의 초기 중량과 최종 중량 간의 백분율 차이를 사용하여 재료 손실률(HFFC)을 계산했습니다.시험관 내 BCT는 표면 재료의 결합 강도 또는 손실을 추가로 지원했습니다.Ct에 결합하는 HFFC의 효율은 Ct22 표면에 혈액 응고 및 탄성 코팅을 제공합니다.
개발된 NFRCS의 균질성은 NFRCS의 무작위로 선택된 일반 위치에서 채취한 샘플(30mg)의 BCT에 의해 결정되었습니다.이전에 언급한 BCT 절차에 따라 NFRCS 준수 여부를 확인합니다.5개의 모든 샘플 사이의 근접성은 균일한 표면 커버리지와 Ct 메쉬의 HFFC 증착을 보장합니다.
공칭 혈액 접촉 면적(NBCA)은 이전에 일부 수정하여 보고된 대로 결정되었습니다.Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs의 두 표면 사이에 혈액 20 μl를 고정하여 혈액을 응고합니다.1시간 후 스텐트의 두 부분을 분리하고 혈전 면적을 수동으로 측정했습니다.3회 반복의 평균값은 NBCA NFRCS19로 간주되었습니다.
DVS(Dynamic Vapor Sorption) 분석을 사용하여 NFRCS가 외부 환경 또는 응고 시작을 담당하는 손상 부위에서 물을 흡수하는 효과를 평가했습니다.DVS는 질량 분해능이 ±0.1µg인 초고감도 저울을 사용하여 중량 측정 방식으로 샘플의 증기 흡수 및 손실을 평가하거나 기록합니다.부분 증기압(상대 습도)은 포화 및 건조 캐리어 가스를 혼합하여 샘플 주변의 전자 질량 흐름 컨트롤러에 의해 생성됩니다. 유럽 ​​약전 가이드라인에 따라 샘플의 수분 흡수 비율에 따라 샘플을 4가지 범주(0-0.012% w/w- 비흡습성, 0.2-2% w/w 약간 흡습성, 2-15% 중간 흡습성 및 > 15% 매우 흡습성)로 분류했습니다. 유럽 ​​약전 가이드라인에 따라 샘플의 수분 흡수 비율을 기준으로 샘플을 4가지 범주(0-0.012% w/w- 비흡습성, 0.2-2% w/w 약간 흡습성, 2-15% 중간 흡습성 및 > 15% 매우 흡습성)로 분류했습니다.유럽 ​​약전의 권장 사항에 따라 샘플의 수분 흡수 비율에 따라 샘플을 4가지 범주(0–0.012% w/w – 비흡습성, 0.2–2% w/w 약간 흡습성, 2–15%)로 나누었습니다.% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % 보통 흡습성 및 > 15% 매우 흡습성)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4类（0-0.012% w/w- 非吸湿性，0.2-2% w/w 轻微吸湿性，2-15 %适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w- 吸湿性 、 、 、 、 0.2-2% W/ w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。유럽 ​​약전의 권장 사항에 따라 샘플은 샘플에 흡수된 수분의 백분율에 따라 4개의 등급으로 나뉩니다(0-0.012 중량% – 비흡습성, 0.2-2 중량% 약간 흡습성, 2-15 중량%).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % 보통 흡습성, > 15% 매우 흡습성) 23.NFCS X NFCS 및 TsN NFCS의 흡습 효율은 분석기 DVS TA TGA Q5000 SA에서 결정되었습니다.이 과정에서 실행 시간, 상대 습도(RH) 및 25°C24에서 실시간 샘플 중량을 얻었습니다.수분 함량은 다음 방정식을 사용하여 정확한 NFRCS 질량 분석으로 계산됩니다.
MC는 NFRCS 습도입니다.m1 – NSAID의 건조 중량.m2는 주어진 RH에서의 실시간 NFRCS 질량입니다.
총 표면적은 25°C에서 10시간 동안(< 7 × 10–3 Torr) 샘플을 비운 후 액체 질소를 사용한 질소 흡착 실험을 사용하여 추정되었습니다. 총 표면적은 25°C에서 10시간 동안(< 7 × 10–3 Torr) 샘플을 비운 후 액체 질소를 사용한 질소 흡착 실험을 사용하여 추정되었습니다. Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образц ов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). 전체 표면적은 샘플을 25°C에서 10시간(< ​​7 × 10–3 Torr) 동안 비운 후 액체 질소를 사용한 질소 흡착 실험을 사용하여 추정되었습니다.25°C에서 10 小时(< 7 × 10-3 Torr)에서 사용할 수 있는 공기를 사용합니다.현재 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения 온도는 25°C(< 7 × 10-3 торр)입니다. 총 표면적은 샘플을 25°C(< 7 x 10-3 torr)에서 10시간 동안 비운 후 액체 질소를 사용한 질소 흡착 실험을 사용하여 추정되었습니다.총 표면적, 기공 부피 및 NFRCS 기공 크기는 RS 232 소프트웨어를 사용하여 오스트리아 NOVA 1000e의 Quantachrome으로 결정되었습니다.
전혈에서 5% RBC(희석제로 식염수)를 준비합니다.그런 다음 HFFC의 분취량(0.25ml)을 96웰 플레이트 및 5% RBC 질량(0.1ml)으로 옮깁니다.혼합물을 37°C에서 40분 동안 배양합니다.적혈구와 혈청의 혼합물을 양성 대조군으로, 식염수와 적혈구의 혼합물을 음성 대조군으로 간주하였다.혈구응집은 Stajitzky 척도에 따라 결정되었습니다.제안된 척도는 다음과 같습니다. + + + + 조밀한 입상 응집체;+ + + 가장자리가 구부러진 매끄러운 바닥 패드;+ + 가장자리가 찢어진 매끄러운 바닥 패드;+ 부드러운 패드 가장자리 주변의 좁은 빨간색 고리;– (음수) 하단 웰의 중앙에 있는 개별 빨간색 버튼 12.
NFRCS의 혈액적합성은 국제표준화기구(ISO)의 방법(ISO10993-4, 1999)26,27에 따라 연구되었다.Singh et al.에 의해 기술된 중량 측정 방법.NFRCS의 존재 또는 표면에서 혈전 형성을 평가하기 위해 약간의 수정이 이루어졌습니다.500mg의 Cs, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS를 PBS(phosphate buffered saline)에서 24시간 동안 37°C에서 배양했습니다.24시간 후, PBS를 제거하고 NFRCS를 3.8% 시트르산나트륨을 포함하는 2ml의 혈액으로 처리하였다.NFRCS 표면에 배양된 샘플에 0.1M CaCl2 0.04ml를 추가합니다.45분 후, 응고를 멈추기 위해 5ml의 증류수를 첨가하였다.NFRK 표면의 응고된 혈액을 36-38% 포름알데히드 용액으로 처리하였다.포름알데히드로 고정된 혈전을 건조시키고 무게를 쟀다.혈액과 샘플이 없는 유리(음성 대조군)와 혈액이 있는 유리(양성 대조군)의 무게를 계산하여 혈전증의 백분율을 추정했습니다.
초기 확인으로 샘플을 광학 현미경으로 시각화하여 HFFC 표면 코팅, Ct 상호 연결 및 Ct 네트워크가 기공을 형성하는 능력을 이해했습니다.NFRCS의 Ch 및 Cp의 얇은 부분을 메스 블레이드로 다듬었습니다.결과 섹션을 유리 슬라이드 위에 놓고 커버 슬립으로 덮고 가장자리를 접착제로 고정했습니다.준비된 슬라이드를 광학현미경으로 관찰하고 다양한 배율로 사진을 촬영하였다.
Ct 네트워크의 폴리머 증착은 Rice et al.29에 의해 기술된 방법에 기초한 형광 현미경을 사용하여 가시화되었습니다. 제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었고, NFRCS(Ch & Cp)는 전술한 방법에 따라 제조되었다. 제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었고, NFRCS(Ch & Cp)는 전술한 방법에 따라 제조되었다.제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었고 NFRCS(Ch 및 Cp)는 전술한 방법에 따라 얻어졌다.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料(苋菜)混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS(Ch & Cp)。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料(苋菜)混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS(Ch & Cp)。제형에 사용된 HFFC 조성물은 앞서 언급한 바와 같이 형광 염료(아마란스)와 혼합되었고 NFRCS(Ch 및 Cp)를 받았다.얻어진 샘플에서 NFRK의 얇은 절편을 잘라 유리 슬라이드 위에 놓고 커버 슬립으로 덮었습니다.녹색 필터(310-380 nm)를 사용하여 형광 현미경으로 준비된 슬라이드를 관찰합니다.Ct 네트워크에서 Ct 관계 및 과도한 폴리머 침착을 이해하기 위해 이미지를 4배 확대하여 촬영했습니다.
NFRCS Ch 및 Cp의 표면 토포그래피는 태핑 모드: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan에서 매우 날카로운 TESP 캔틸레버가 있는 AFM(Atomic Force Microscope)을 사용하여 결정되었습니다.표면 조도는 소프트웨어(Scanning Probe Image Processor)를 사용하여 평균 제곱근(RMS)으로 측정했습니다.표면 균일성을 확인하기 위해 다양한 NFRCS 위치를 3D 이미지로 렌더링했습니다.주어진 영역에 대한 점수의 표준 편차는 표면 거칠기로 정의됩니다.RMS 방정식은 NFRCS31의 표면 거칠기를 정량화하는 데 사용되었습니다.
Ch NFRCS 및 Cp NFRCS의 표면 형태를 이해하기 위해 FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo를 사용하여 FESEM 기반 연구를 수행했으며, 이는 Cm NFRCS보다 더 나은 BCT를 나타냈습니다.FESEM 연구는 Zhao et al.약간의 수정이 있는 32.NFRCS 20~30mg Ch NFRCS 및 Cp NFRCS는 쥐 혈액과 사전 혼합된 3.8% 시트르산나트륨 20μl와 사전 혼합되었습니다.0.2 M CaCl2 20 μl를 혈액 처리된 샘플에 첨가하여 응고를 시작하고 샘플을 실온에서 10분 동안 배양했습니다.또한 식염수로 헹구어 NFRCS 표면에서 과도한 적혈구를 제거했습니다.
후속 샘플을 0.1% 글루타르알데히드로 처리한 다음 열풍 오븐에서 37°C로 건조하여 수분을 제거했습니다.건조된 샘플을 코팅하고 분석하였다32.분석 중에 얻은 다른 이미지는 개별 면 섬유 표면의 응고 형성, Ct 사이의 중합체 침착, 적혈구 형태(모양), 응고 무결성 및 NFRCS 존재 하의 적혈구 형태였습니다.처리되지 않은 NFRCS 영역과 혈액과 함께 배양된 Ch 및 Cp 처리된 NFRCS 영역은 원소 이온(나트륨, 칼륨, 질소, 칼슘, 마그네슘, 아연, 구리 및 셀레늄)에 대해 스캔되었습니다33.처리된 시료와 처리되지 않은 시료 사이의 원소 이온 백분율을 비교하여 응고 형성 및 응고 균질성 동안 원소 이온 축적을 이해합니다.
Ct 표면 상의 Cp HFFC 표면 코팅의 두께는 FESEM을 사용하여 측정하였다.Cp NFRCS의 단면을 프레임워크에서 절단하고 스퍼터링 코팅했습니다.생성된 스퍼터 코팅 샘플을 FESEM으로 관찰하고 표면 코팅의 두께를 측정하였다(34, 35, 36).
X-ray micro-CT는 고해상도 3D 비파괴 영상을 제공하며 NFRK의 내부 구조 배열을 연구할 수 있습니다.Micro-CT는 샘플을 통과하는 X-선 빔을 사용하여 샘플에서 X-선의 로컬 선형 감쇠 계수를 기록하여 형태학적 정보를 얻는 데 도움이 됩니다.Cp NFRCS 및 혈액 처리된 Cp NFRCS에서 Ct의 내부 위치는 NFRCS37,38,39의 존재 하에서 흡수 효율 및 혈액 응고를 이해하기 위해 micro-CT로 조사되었습니다.혈액 처리 및 미처리 Cp NFRCS 샘플의 3D 구조는 micro-CT(V|tome|x S240, Phoenix, Germany)를 사용하여 재구성되었습니다.VG STUDIO-MAX 소프트웨어 버전 2.2를 사용하여 NFRCS용 3D 이미지를 개발하기 위해 여러 각도(이상적으로는 360° 범위)에서 여러 X선 이미지를 촬영했습니다.수집된 프로젝션 데이터는 해당하는 간단한 3D ScanIP Academic 소프트웨어를 사용하여 3D 체적 이미지로 재구성되었습니다.
또한 응고의 분포를 이해하기 위해 사전 혼합된 구연산 혈액 20µl와 0.2M CaCl2 20µl를 NFRCS에 추가하여 혈액 응고를 시작했습니다.준비된 샘플은 경화되도록 남겨둡니다.NFRK 표면을 0.5% 글루타르알데히드로 처리하고 30~40°C의 열풍 오븐에서 30분 동안 건조시켰다.NFRCS에 형성된 혈전을 스캔하고 재구성하여 혈전의 3D 이미지를 시각화했습니다.
이전에 설명한 방법을 약간 수정하여 사용하여 Cp NFRCS(Ch NFRCS와 가장 비교됨)에서 항균 분석을 수행했습니다.Cp NFRCS 및 Cp HFFC의 항균 활성은 인큐베이터의 페트리 접시에서 한천에서 자라는 세 가지 다른 테스트 미생물[S.aureus(그람 양성 박테리아), E.coli(그람 음성 박테리아) 및 백색 칸디다(C.albicans)]를 사용하여 결정되었습니다.105-106 CFU ml-1의 농도로 희석된 세균 배양 현탁액 50 ml를 한천 배지에 균일하게 접종합니다.배지를 페트리 접시에 붓고 굳히십시오.한천 플레이트 표면에 웰을 만들어 HFFC를 채웠습니다(HFFC용 웰 3개, 음성 대조군용 웰 1개).3개의 웰에 200 μl HFFC를 추가하고 4번째 웰에 200 μl pH 7.4 PBS를 추가합니다.페트리 접시의 다른 쪽에서 응고된 한천에 12mm Cp NFRCS 디스크를 놓고 PBS(pH 7.4)로 적십니다.Ciprofloxacin, ampicillin 및 fluconazole 정제는 Staphylococcus aureus, Escherichia coli 및 Candida albicans에 대한 참조 표준으로 간주됩니다.억제 영역을 수동으로 측정하고 억제 영역의 디지털 이미지를 찍습니다.
기관의 윤리적 승인을 받은 후, 이 연구는 인도 남부 카르나타카의 마니팔에 있는 카스투르바 교육 연구 의과 대학에서 수행되었습니다.시험관 내 TEG 실험 프로토콜은 Karnataka Manipal에 있는 Kasturba Medical College의 기관 윤리 위원회에서 검토 및 승인되었습니다(IEC: 674/2020).피험자는 병원 혈액 은행의 자원 헌혈자(18~55세)로부터 모집되었습니다.또한 혈액 샘플 수집을 위해 자원 봉사자로부터 정보에 입각 한 동의서를 얻었습니다.천연 TEG(N-TEG)는 구연산나트륨과 미리 혼합된 전혈에 대한 Cp HFFC 제제의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다.N-TEG는 결과(일상적인 응고 검사)에서 임상적으로 상당한 지연 가능성으로 인해 임상의에게 문제를 일으키는 현장 소생술에서의 역할로 널리 알려져 있습니다.N-TEG 분석은 전혈을 사용하여 수행되었습니다.모든 참가자로부터 사전 동의 및 자세한 병력을 얻었습니다.이 연구에는 임신/산후 또는 간 질환과 같은 지혈 또는 혈전 합병증이 있는 참가자는 포함되지 않았습니다.응고 캐스케이드에 영향을 미치는 약물을 복용하는 피험자도 연구에서 제외되었습니다.기본 실험실 테스트(헤모글로빈, 프로트롬빈 시간, 활성화된 트롬보플라스틴 및 혈소판 수)는 표준 절차에 따라 모든 참가자에게 수행되었습니다.N-TEG는 혈전 점탄성, 초기 혈전 구조, 입자 상호 작용, 혈전 강화 및 혈전 용해를 결정합니다.N-TEG 분석은 여러 세포 요소 및 혈장의 집합적 효과에 대한 그래픽 및 수치 데이터를 제공합니다.N-TEG 분석은 두 가지 다른 부피의 Cp HFFC(10µl 및 50µl)에서 수행되었습니다.그 결과, 구연산을 함유한 전혈 1ml를 Cp HFFC 10μl에 첨가하였다.1ml(Cp HFFC + 구연산 혈액), 340µl 혼합 혈액을 TEG 접시를 포함하는 20µl 0.2M CaCl2에 추가합니다.그 후, TEG 접시를 TEG® 5000, US에 적재하여 Cp HFFC41 존재 하에 혈액 샘플의 R, K, 알파 각도, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30%를 측정했습니다.
생체 내 연구 프로토콜은 Manipal의 Manipal Institute of Higher Education(IAEC/KMC/69/2020) Kasturba 의과대학 기관 동물 윤리 위원회(IAEC)에서 검토하고 승인했습니다.모든 동물 실험은 동물 실험 통제 감독 위원회(CPCSEA)의 권고에 따라 수행되었습니다.모든 생체 내 NFRCS 연구(2 × 2cm2)는 암컷 Wistar 쥐(체중 200~250g)에서 수행되었습니다.모든 동물은 24-26°C의 온도에 적응되었으며, 동물은 표준 음식과 물을 자유로이 섭취할 수 있었습니다.모든 동물은 무작위로 다른 그룹으로 나뉘었고 각 그룹은 세 마리의 동물로 구성되었습니다.모든 연구는 Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43에 따라 수행되었습니다.연구 전에, 동물을 20-50mg 케타민(체중 1kg당) 및 2-10mg 자일라진(체중 1kg당)의 혼합물을 복강내(ip) 투여하여 마취시켰다.연구 종료 후 샘플의 초기 무게와 최종 무게의 차이를 평가하여 출혈량을 계산하였고, 3번의 시험에서 얻은 평균값을 샘플의 출혈량으로 하였다.
쥐 꼬리 절단 모델은 외상, 전투 또는 교통 사고(부상 모델)에서 출혈을 조절하는 NFRCS의 잠재력을 이해하기 위해 구현되었습니다.메스 블레이드로 꼬리의 50%를 잘라내고 정상적인 출혈을 보장하기 위해 15초 동안 공기 중에 놓습니다.또한 시험 시료를 쥐 꼬리에 압력(Ct, Cs, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS)을 가하여 얹었다.출혈 및 PCT는 테스트 표본에 대해 보고되었다(n = 3)17,45.
전투에서 NFRCS 압력 제어의 효과는 표면 대퇴 동맥 모델에서 조사되었습니다.대퇴 동맥을 노출시키고 24G 투관침으로 천자하고 15초 이내에 출혈을 시킵니다.제어되지 않는 출혈이 관찰된 후, 압력을 가한 상태에서 시험편을 천자 부위에 놓습니다.시험 시료를 도포한 직후 응고 시간을 기록하고 다음 5분 동안 지혈 효율을 관찰하였다.Cs 및 Ct46에 대해서도 동일한 절차를 반복했습니다.
Dowlinget al.47은 수술 중 출혈과 관련하여 지혈 재료의 지혈 가능성을 평가하기 위해 간 손상 모델을 제안했습니다.BCT는 Ct 샘플(음성 대조군), Cs 프레임워크(양성 대조군), Ch NFRCS 샘플 및 Cp NFRCS 샘플에 대해 기록되었습니다.정중개복술을 시행하여 쥐의 간상대정맥을 노출시켰다.그 후 좌엽의 말단부를 가위로 잘라내었다.메스 칼날로 간을 절개하고 몇 초 동안 피를 흘립니다.정확한 무게를 잰 Ch NFRCS 및 Cp NFRCS 테스트 샘플을 양압 없이 손상된 표면에 놓고 BCT를 기록했습니다.그런 다음 대조군(Ct)은 압력을 가한 다음 부상을 깨지 않고 Cs 30 s47을 적용했습니다.
개발된 폴리머 기반 NFRCS의 상처 치유 특성을 평가하기 위해 절제 상처 모델을 사용하여 생체 내 상처 치유 분석을 수행했습니다.절개 상처의 모델은 이전에 발표된 방법에 따라 약간 수정하여 선택하고 수행했습니다.모든 동물은 이전에 설명한대로 마취되었습니다.생검 펀치(12mm)를 사용하여 등 피부에 깊은 원형 절개를 합니다.준비된 상처 부위는 Cs(양성 대조군), Ct(면 패드가 치유를 방해함을 인식함), Ch NFRCS 및 Cp NFRCS(실험군) 및 어떠한 처리도 하지 않은 음성 대조군으로 드레싱하였다.연구의 매일, 상처 부위는 모든 쥐에서 측정되었습니다.디지털 카메라를 사용하여 상처 부위의 사진을 찍고 새 드레싱을 입힙니다.상처 봉합 백분율은 다음 공식으로 측정되었습니다.
연구 12일째 상처 봉합의 백분율을 기준으로 최상의 그룹의 쥐 피부를 절제하고((Cp NFRCS) 및 대조군) H&E 염색 및 Masson's trichrome 염색으로 연구하였다. 연구 12일째 상처 봉합의 백분율을 기준으로 최상의 그룹의 쥐 피부를 절제하고((Cp NFRCS) 및 대조군) H&E 염색 및 Masson's trichrome 염색으로 연구하였다.연구 12일째 상처 봉합률을 기준으로 최상군((Cp NFRCS) 및 대조군) 쥐의 피부를 절제하여 hematoxylin-eosin과 Masson's trichrome으로 염색하여 검사하였다.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色，Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）최상의 그룹((Cp NFRCS) 및 대조군 그룹)의 래트는 연구 12일째 상처 봉합률을 기준으로 헤마톡실린-에오신 염색 및 마손 트리크롬 염색을 위해 절제되었습니다.구현된 염색 절차는 이전에 설명한 방법49,50에 따라 수행되었습니다.간단히 말해서, 10% 포르말린에 고정한 후 일련의 등급이 매겨진 알코올을 사용하여 샘플을 탈수했습니다.절제된 조직의 얇은 부분(두께 5 μm)을 얻기 위해 마이크로톰을 사용하십시오.대조군과 Cp NFRCS의 얇은 연속 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 처리하여 조직병리학적 변화를 연구했습니다.Masson's trichrome 염색은 콜라겐 피브릴의 형성을 검출하는 데 사용되었습니다.얻은 결과는 병리학자에 의해 맹목적으로 연구되었습니다.
Cp NFRCS 샘플의 안정성은 실온(25°C ± 2°C/60% RH ± 5%)에서 12개월 동안 연구되었습니다51.Cp NFRCS(표면 변색 및 미생물 성장)를 육안으로 검사하고 재료 및 방법 섹션에 설명된 위의 방법에 따라 내접힘성 및 BCT에 대해 테스트했습니다.
15×15 cm2 크기의 Cp NFRCS를 준비하여 Cp NFRCS의 확장성과 재현성을 조사하였다.또한 다양한 Cp NFRCS 분획에서 30mg 샘플(n = 5)을 잘라내고 연구된 샘플의 BCT를 앞서 방법 섹션에서 설명한 대로 평가했습니다.
우리는 다양한 생물 의학 응용을 위해 Cp NFRCS 조성물을 사용하여 다양한 모양과 구조를 개발하려고 시도했습니다.이러한 모양 또는 구성에는 코피를 위한 원추형 면봉, 치과 시술 및 질 출혈을 위한 원통형 면봉이 포함됩니다.
모든 데이터 세트는 평균 ± 표준 편차로 표현되며 Prism 5.03(GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용한 ANOVA에 이어 Bonferroni의 다중 비교 테스트(*p<0.05)로 분석되었습니다.
인간 연구에서 수행된 모든 절차는 연구소 및 국가 연구 위원회의 기준과 1964년 헬싱키 선언 및 후속 개정 또는 유사한 윤리적 기준에 따랐습니다.모든 참가자는 연구의 특징과 자발적인 성격에 대해 정보를 받았습니다.참여자 데이터는 일단 수집되면 기밀로 유지됩니다.시험관 내 TEG 실험 프로토콜은 Karnataka Manipal에 있는 Kasturba Medical College의 기관 윤리 위원회에서 검토 및 승인되었습니다(IEC: 674/2020).자원 봉사자들은 혈액 샘플 수집에 대한 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
동물 연구에서 수행된 모든 절차는 Manipal의 Manipal Institute of Higher Education(IAEC/KMC/69/2020)의 Kastuba 의과대학에 따라 수행되었습니다.설계된 모든 동물 실험은 동물 실험 통제 및 감독 위원회(CPCSEA)의 지침에 따라 수행되었습니다.모든 저자는 ARRIVE 지침을 따릅니다.
모든 NFRCS의 FTIR 스펙트럼을 분석하고 그림 2A에 표시된 키토산 스펙트럼과 비교했습니다.3437cm-1(OH 및 NH 스트레칭, 중첩), 2945 및 2897cm-1(CH 스트레칭), 1660cm-1(NH 변형), 1589cm-1(N-H 굽힘), 1157cm-1(브리지 스트레칭 O-), 1067cm-1(스트레치 C-O, 2차 수산기), 993에서 키토산의 특징적인 스펙트럼 피크(기록됨) cm-1(스트레치 CO, Bo-OH) 52.53.54.보충 표 S1은 키토산(리포터), 순수 키토산, Cm, Ch 및 Cp에 대한 FTIR NFRCS 흡수 스펙트럼 값을 보여줍니다.모든 NFRCS(Cm, Ch 및 Cp)의 FTIR 스펙트럼은 큰 변화 없이 순수한 키토산과 동일한 특징적인 흡수 밴드를 보여주었습니다(그림 2A).FTIR 결과는 NFRCS를 개발하는 데 사용된 폴리머 간에 화학적 또는 물리적 상호작용이 없음을 확인했으며, 이는 사용된 폴리머가 불활성임을 나타냅니다.
Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs의 시험관 내 특성.(A)는 압축 하에서 키토산과 Cm NFRCS, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS의 조성의 조합된 FTIR 스펙트럼을 나타냅니다.(B) a) NFRCS Cm, Ch, Cp 및 Cg의 전혈 섭취율(n = 3);Ct 샘플은 면봉이 흡수 효율이 더 높기 때문에 더 높은 BAR을 나타냈습니다.b) 혈액 흡수 후 혈액 흡수된 샘플의 그림.테스트 샘플 C의 BCT의 그래픽 표현(Cp NFRCS는 최고의 BCT를 가짐(15초, n = 3)). C, D, E 및 G의 데이터는 평균 ± SD로 표시되었으며 오차 막대는 SD, ***p < 0.0001을 나타냅니다. C, D, E 및 G의 데이터는 평균 ± SD로 표시되었으며 오차 막대는 SD, ***p < 0.0001을 나타냅니다. Dанные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклоне 예, ***p <0,0001. C, D, E 및 G의 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되며 오차 막대는 표준 편차, ***p<0.0001을 나타냅니다. C, D, E 및 G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p < 0.0001. C, D, E 및 G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p < 0.0001. Đанные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, 플랑키 погрешностей представляют стандартное откл 아니오, ***p <0,0001. C, D, E 및 G의 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되며 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. ***p<0.0001.