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새의 번식력은 정자 저장 세관(SST)에 장기간 충분한 정자를 저장할 수 있는 능력에 달려 있습니다.정자가 SST에 들어가 거주하고 떠나는 정확한 메커니즘은 여전히 ​​논란의 여지가 있습니다.샤카시 암탉의 정자는 높은 응집 경향을 보였고, 많은 세포를 포함하는 이동성 사상 다발을 형성했습니다.불투명한 나팔관에서 정자의 운동성과 행동을 관찰하는 것이 어렵기 때문에 정자 응집과 운동성을 연구하기 위해 정자 단면과 유사한 미세 채널 단면을 가진 미세유체 장치를 사용했습니다.이 연구는 정자 다발이 어떻게 형성되고, 어떻게 움직이는지, SST에서 정자 거주를 확장하는 데 가능한 역할에 대해 논의합니다.우리는 정수압(유속 = 33 µm/s)에 의해 미세 유체 채널 내에서 유체 흐름이 생성될 때 정자 속도와 유변학적 거동을 조사했습니다.정자는 흐름에 대항하여 헤엄치는 경향이 있으며(양성 유변학) 정자 다발의 속도는 단일 정자에 비해 상당히 감소합니다.정자 다발은 더 많은 단일 정자가 모집됨에 따라 나선형으로 움직이고 길이와 두께가 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 정자 다발은 유체 흐름 속도 > 33 μm/s로 스윕되는 것을 피하기 위해 미세 유체 채널의 측벽에 접근하고 부착하는 것이 관찰되었습니다. 정자 다발은 유체 흐름 속도 > 33 μm/s로 스윕되는 것을 피하기 위해 미세 유체 채널의 측벽에 접근하고 부착하는 것이 관찰되었습니다. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. 정자 다발은 유체 흐름 속도 >33 μm/s에서 휩쓸리는 것을 방지하기 위해 미세 유체 채널의 측벽에 접근하고 부착하는 것으로 관찰되었습니다.33 μm/s 扫过.33 µm/s 속도. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежат ь сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. 정자 다발은 >33 μm/s의 유체 흐름에 의해 휩쓸려 가는 것을 피하기 위해 미세 유체 채널의 측벽에 접근하고 부착하는 것으로 관찰되었습니다.주사 및 투과 전자 현미경 검사는 정자 다발이 풍부한 고밀도 물질에 의해 지지되고 있음을 밝혔습니다.얻은 데이터는 Sharkazi 닭 정자의 고유한 이동성과 정자가 응집하여 모바일 번들을 형성하는 능력을 보여 SMT에서 정자의 장기 저장에 대한 더 나은 이해에 기여합니다.
인간과 대부분의 동물에서 수정을 이루려면 정자와 난자가 적시에 수정 장소에 도착해야 합니다.따라서 짝짓기는 배란 전이나 배란 시기에 이루어져야 합니다.반면에 개와 같은 일부 포유류와 곤충, 어류, 파충류, 조류와 같은 비포유류 종은 난자가 수정될 준비가 될 때까지 오랜 기간 동안 생식 기관에 정자를 저장합니다(비동기 수정 1 ).새는 2-10주 동안 난자를 수정시킬 수 있는 정자의 생존력을 유지할 수 있습니다2.
이것은 짝짓기와 배란을 동시에 하지 않고 몇 주 동안 한 번의 수정으로 높은 확률의 수정을 제공한다는 점에서 새를 다른 동물과 구별하는 독특한 특징입니다.정자 저장 세뇨관(sperm storage tubule, SST)이라고 하는 주요 정자 저장 기관은 자궁질 접합부에 있는 내부 점막 주름에 있습니다.현재까지 정자가 정자 은행에 들어가고, 거주하고, 나가는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다.선행 연구를 바탕으로 많은 가설이 제시되었지만 어느 것도 확인된 바는 없다.
Forman4는 정자가 SST 상피 세포에 위치한 단백질 채널을 통한 유체 흐름의 방향에 대해 지속적인 진동 운동을 통해 SST 공동에 거주지를 유지한다는 가설을 세웠습니다(유변학).정자를 SST 내강에 유지하는 데 필요한 지속적인 편모 활동으로 인해 ATP가 고갈되고 정자가 체액 흐름에 의해 정자 은행에서 운반되어 정자를 수정하기 위해 상행 나팔관 아래로 새로운 여행을 시작할 때까지 운동성은 결국 감소합니다.계란 (Forman4).이 정자 저장 모델은 SST 상피 세포에 존재하는 아쿠아포린 2, 3 및 9의 면역세포화학에 의한 검출에 의해 뒷받침됩니다.현재까지 닭 정액 유변학 및 SST 저장, 질 정자 선택 및 정자 경쟁에서의 역할에 대한 연구는 부족합니다.닭의 정자는 자연 교배 후 질로 들어가지만 정자의 80% 이상이 교미 직후 질 밖으로 배출된다.이것은 질이 조류의 정자 선택을 위한 주요 장소임을 시사합니다.또한, 질에서 수정된 정자의 1% 미만이 SST로 끝나는 것으로 보고되었습니다2.질 내 병아리의 인공 수정에서 SST에 도달하는 정자 수는 수정 후 24시간이 지나면 증가하는 경향이 있습니다.지금까지 이 과정에서 정자 선택의 메커니즘은 불분명하며 정자 운동성은 SST 정자 섭취에 중요한 역할을 할 수 있습니다.나팔관의 두껍고 불투명한 벽으로 인해 조류의 나팔관에서 정자의 운동성을 직접 모니터링하는 것은 어렵습니다.따라서 정자가 수정 후 SST로 전환하는 방법에 대한 기본 지식이 부족합니다.
유변학은 최근 포유류 생식기에서 정자 수송을 제어하는 ​​중요한 요소로 인식되고 있습니다.역류로 이동하는 운동성 정자의 능력에 기초하여 Zaferani 등은 고정된 정액 샘플에서 운동성 정자를 수동적으로 분리하기 위해 corra 미세유체 시스템을 사용했습니다.이러한 유형의 정액 분류는 의료 불임 치료 및 임상 연구에 필수적이며 시간과 노동 집약적이고 정자 형태와 구조적 무결성을 손상시킬 수 있는 전통적인 방법보다 선호됩니다.그러나 현재까지 닭의 생식기 분비물이 정자 운동성에 미치는 영향에 대한 연구는 수행되지 않았다.
SST에 저장된 정자를 유지하는 메커니즘에 관계없이 많은 연구자들은 닭 9, 10, 메추라기 2 및 칠면조 11의 SST에서 상주 정자가 정면으로 응집하여 응집된 정자 다발을 형성하는 것을 관찰했습니다.저자는 이러한 응집과 SST에서 정자의 장기 저장 사이에 연관성이 있다고 제안합니다.
Tingari와 Lake12는 닭의 정자 수용 샘에 있는 정자 사이의 강한 연관성을 보고했으며 조류 정자가 포유류 정자와 같은 방식으로 응집하는지 여부에 대해 의문을 제기했습니다.그들은 수정관에서 정자 사이의 깊은 연결이 작은 공간에 많은 수의 정자가 존재함으로써 야기되는 스트레스 때문일 수 있다고 믿습니다.
매달려 있는 신선한 유리 슬라이드에서 정자의 행동을 평가할 때, 특히 정액 방울의 가장자리에서 일시적인 응집 징후를 볼 수 있습니다.그러나 응집은 종종 지속적인 움직임과 관련된 회전 작용에 의해 방해를 받았으며, 이는 이 현상의 일시적인 특성을 설명합니다.연구자들은 또한 정액에 희석제를 첨가했을 때 길쭉한 "실 같은" 세포 응집체가 나타나는 것을 발견했습니다.
정자를 모방하려는 초기 시도는 매달린 방울에서 얇은 와이어를 제거하여 정액 방울에서 튀어 나온 길쭉한 정자와 같은 소포를 만들었습니다.정자는 소포 내에서 즉시 병렬 방식으로 정렬되었지만 3D 제한으로 인해 전체 단위가 빠르게 사라졌습니다.따라서 정자 응집을 연구하기 위해서는 달성하기 어려운 고립된 정자 저장 세관에서 직접 정자의 운동성과 거동을 관찰하는 것이 필요하다.따라서 정자 운동성과 응집 행동에 대한 연구를 지원하기 위해 정자를 모방하는 기구를 개발하는 것이 필요합니다.Brillard et al13은 성인 병아리의 정자 저장 세관의 평균 길이가 400–600 µm이지만 일부 SST는 2000 µm까지 길 수 있다고 보고했습니다.Mero와 Ogasawara14는 정자 저장 세뇨관을 확장된 것과 비확대된 정자 저장 세관으로 나누었는데, 둘 다 길이(~500 μm)와 목 너비(~38 μm)가 동일하지만 세관의 평균 내강 직경은 56.6과 56.6 μm였습니다.., 각각 11.2 μm.본 연구에서는 채널 크기가 200 µm × 20 µm(W × H)인 미세유체 장치를 사용했으며, 그 단면적은 증폭된 SST의 단면에 다소 가깝습니다.또한, 우리는 SST 상피 세포에 의해 생성된 유체가 정자를 역류(유변학적) 방향으로 내강에 유지한다는 Foreman의 가설과 일치하는 흐르는 유체에서 정자 운동성과 응집 거동을 조사했습니다.
이 연구의 목적은 나팔관에서 정자 운동성을 관찰하는 문제를 극복하고 역동적인 환경에서 정자의 유변학과 행동을 연구하는 어려움을 피하는 것입니다.닭의 생식기에서 정자의 운동성을 시뮬레이션하기 위해 정수압을 생성하는 미세 유체 장치가 사용되었습니다.
희석된 정자 샘플 한 방울(1:40)을 마이크로채널 장치에 넣었을 때 두 가지 유형의 정자 운동성(분리된 정자와 결합된 정자)을 확인할 수 있었습니다.또한, 정자는 흐름을 거슬러 헤엄치는 경향이 있었습니다(긍정적인 유변학; 비디오 1, 2). 정자 다발은 고독한 정자보다 속도가 낮았지만(p<0.001) 양성 가변성을 나타내는 정자의 비율을 증가시켰습니다(p<0.001; 표 2). 정자 다발은 고독한 정자보다 속도가 낮았지만(p<0.001) 양성 가변성을 나타내는 정자의 비율을 증가시켰습니다(p<0.001; 표 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; 표 2). 정자 다발은 단일 정자보다 느린 속도를 가졌지 만 (p <0.001) 양성 rheotaxis를 나타내는 정자의 비율을 증가 시켰습니다 (p <0.001; 표 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度(p<0.001), 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比(p<0.001; 表2).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p<0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。 ））））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент спермат озоидов с положительной реологией (p < 0,001; 표 2). 정자 다발의 속도는 단일 정자보다 낮았지만(p < 0.001) 양성 유변학을 가진 정자의 비율을 증가시켰습니다(p < 0.001; 표 2).단일 정자 및 다발에 대한 양성 유변학은 각각 약 53% 및 85%로 추정됩니다.
사정 직후 샤카시 닭의 정자는 수십 개의 개체로 구성된 선형 다발을 형성하는 것으로 관찰되었습니다.이러한 다발은 시간이 지남에 따라 길이와 두께가 증가하고 소실되기 전에 몇 시간 동안 체외에서 남아 있을 수 있습니다(비디오 3).이 필라멘트 다발은 부고환 끝에 형성되는 바늘 두더지 정자 모양입니다.Sharkashi 암탉 정액은 수집 후 1분 이내에 응집되어 망상 다발을 형성하는 경향이 높은 것으로 밝혀졌습니다.이 광선은 동적이며 근처의 벽이나 고정된 물체에 달라붙을 수 있습니다.정자 다발은 정자 세포의 속도를 감소시키지만 거시적으로는 정자 세포의 선형성을 증가시키는 것이 분명합니다.다발의 길이는 다발에 수집된 정자의 수에 따라 다릅니다.묶음의 두 부분이 분리되었습니다: 응집된 정자의 자유 머리를 포함하는 초기 부분과 정자의 꼬리 및 전체 원위 말단을 포함하는 말단 부분.고속 카메라(950fps)를 사용하여 번들의 초기 부분에서 응집된 정자의 자유 머리가 관찰되었으며, 진동 운동으로 인해 번들의 이동을 담당하고 나머지 정자는 나선형 운동으로 번들로 드래그합니다(비디오 4).그러나 긴 다발에서는 일부 자유로운 정자 머리가 몸체에 부착되고 다발의 말단 부분이 날개 역할을 하여 다발을 추진하는 것이 관찰되었습니다.
유체의 흐름이 느린 동안 정자 다발은 서로 평행하게 움직이지만 유속이 증가함에 따라 전류 흐름에 의해 씻겨 나가지 않도록 정지된 모든 것에 겹치기 시작하고 달라붙습니다.다발은 소수의 정자 세포가 서로 접근할 때 형성되며 동시에 움직이기 시작하고 서로를 감싸고 끈적한 물질에 달라붙습니다.그림 1과 2는 정자가 서로 접근하여 꼬리가 서로를 감싸면서 접합부를 형성하는 방법을 보여줍니다.
연구원들은 정자 유변학을 연구하기 위해 마이크로 채널에서 유체 흐름을 생성하기 위해 정수압을 적용했습니다.크기가 200 µm × 20 µm(W × H)이고 길이가 3.6 µm인 마이크로채널을 사용하였다.끝에 장착된 주사기가 있는 용기 사이에 마이크로채널을 사용합니다.채널을 더 잘 보이게 하기 위해 식용 색소를 사용했습니다.
상호 연결 케이블과 액세서리를 벽에 묶습니다.비디오는 위상차 현미경으로 촬영되었습니다.각 이미지와 함께 위상차 현미경 및 매핑 이미지가 표시됩니다.(A) 두 흐름 사이의 연결은 나선형 운동(빨간색 화살표)으로 인해 흐름에 저항합니다.(B) 튜브 번들과 채널 벽(빨간색 화살표) 사이의 연결은 동시에 두 개의 다른 번들(노란색 화살표)에 연결됩니다.(C) 미세 유체 채널의 정자 다발은 서로 연결되기 시작하여(빨간색 화살표) 정자 다발의 메쉬를 형성합니다.(D) 정자 다발의 네트워크 형성.
희석된 정자 한 방울을 미세유체 장치에 넣고 흐름을 만들면 정자빔이 흐름의 반대 방향으로 움직이는 것을 관찰할 수 있었다.번들은 마이크로 채널의 벽에 꼭 맞고 다발의 초기 부분에 있는 프리 헤드는 마이크로 채널에 꼭 맞습니다(비디오 5).그들은 또한 흐름에 의해 휩쓸려가는 것을 저항하기 위해 파편과 같은 경로에 있는 고정 입자에 달라붙습니다.시간이 지남에 따라 이러한 다발은 다른 단일 정자와 더 짧은 다발을 가두는 긴 필라멘트가 됩니다(비디오 6).흐름이 느려지기 시작하면 정자의 긴 줄이 정자 줄의 네트워크를 형성하기 시작합니다(비디오 7; 그림 2).
높은 유속(V > 33 µm/s)에서 스레드의 나선형 움직임은 흐름의 표류력에 더 잘 저항하는 번들을 형성하는 많은 개별 정자를 잡으려는 시도로 증가합니다. 높은 유속(V > 33 µm/s)에서 스레드의 나선형 움직임은 흐름의 표류력에 더 잘 저항하는 번들을 형성하는 많은 개별 정자를 잡으려는 시도로 증가합니다. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множест во отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. 높은 유속(V > 33µm/s)에서 가닥의 나선형 움직임은 흐름의 표류력에 더 잘 저항할 수 있는 묶음을 형성하는 많은 개별 정자를 잡으려고 시도함에 따라 증가합니다.높은 속도(V > 33 µm/s)에서 , ,높은 流速(v> 33 µm/s) 에서 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多形成 束 单 个 精子 , 从而 更 地 抵抗 的 漂移力. 。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа 사진. 높은 유속(V > 33 µm/s)에서 필라멘트의 나선형 움직임은 흐름의 표류력에 더 잘 저항하기 위해 다발을 형성하는 많은 개별 정자를 포획하려는 시도에서 증가합니다.그들은 또한 측벽에 마이크로 채널을 부착하려고 시도했습니다.
정자 다발은 광학 현미경(LM)을 사용하여 정자 머리와 컬링 꼬리의 클러스터로 확인되었습니다.다양한 응집체를 가진 정자다발도 뒤틀린 머리와 편모의 응집체, 여러 개의 융합된 정자 꼬리, 꼬리에 붙어 있는 정자 머리, 여러 개의 융합된 핵으로서 구부러진 핵을 가진 정자 머리 등으로 확인되었다.투과 전자 현미경(TEM).주사 전자 현미경(SEM)은 정자 다발이 정자 머리의 피복된 집합체이고 정자 집합체는 감긴 꼬리의 부착된 네트워크를 보여주었다는 것을 보여주었습니다.
정자의 형태와 초미세구조, 정자 다발의 형성은 광학현미경(하프섹션), 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 연구하였고, 정자도말은 아크리딘 오렌지로 염색하고 표면형광현미경을 이용하여 조사하였다.
아크리딘 오렌지를 사용한 정자 도말 염색(그림 3B)은 정자 머리가 서로 붙어 있고 분비 물질로 덮여 있어 큰 다발이 형성되었음을 보여주었습니다(그림 3D).정자 다발은 부착된 꼬리 네트워크가 있는 정자 집합체로 구성되었습니다(그림 4A-C).정자 다발은 함께 붙어 있는 많은 정자의 꼬리로 구성됩니다(그림 4D).비밀 (그림 4E, F)은 정자 다발의 머리를 덮었습니다.
정자 다발의 형성 위상차 현미경과 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 검사를 통해 정자 머리가 서로 달라붙어 있음을 확인했습니다.(A) 초기 정자 다발 형성은 정자(흰색 원)와 3개의 정자(노란색 원)로 시작되며 나선형은 꼬리에서 시작하여 머리에서 끝납니다.(B) 부착된 정자 머리(화살표)를 보여주는 아크리딘 오렌지로 염색된 정자 도말 현미경 사진.분비물이 머리를 덮습니다.배율 × 1000. (C) 미세 유체 채널(950fps에서 고속 카메라 사용)에서 흐름에 의해 운반되는 큰 빔의 개발.(D) 큰 다발(화살표)을 보여주는 아크리딘 오렌지로 염색된 정자 도말 현미경 사진.배율: ×200.
아크리딘 오렌지로 염색된 정자 빔 및 정자 도말의 주사 전자 현미경 사진.(A, B, D, E)는 정자의 디지털 컬러 스캐닝 전자 현미경 사진이고, C와 F는 꼬리 웹을 감싸고 있는 여러 정자의 부착을 보여주는 아크리딘 오렌지로 염색된 정자 도말의 현미경 사진입니다.(AC) 정자 집합체는 부착된 꼬리(화살표)의 네트워크로 표시됩니다.(D)꼬리를 감싸고 있는 여러 개의 정자(접착 물질, 분홍색 윤곽선, 화살표 포함)의 접착.(E 및 F)접착제(포인터)로 덮인 정자 머리 집합체(포인터).정자는 몇 개의 와류형 구조(F)로 다발을 형성했습니다.(C) ×400 및 (F) ×200 배율.
투과전자현미경을 사용하여 우리는 정자 다발이 꼬리(그림 6A, C), 꼬리에 머리가 붙어 있거나(그림 6B) 꼬리에 머리가 붙어 있음(그림 6D)을 발견했습니다.번들의 정자 머리는 구부러져 있으며 섹션 2 핵 영역에 표시됩니다(그림 6D).절개 다발에서 정자는 두 개의 핵 영역과 여러 개의 편모 영역이 있는 뒤틀린 머리를 가졌습니다(그림 5A).
정자 다발의 연결 꼬리와 정자 머리를 연결하는 응집 물질을 보여주는 디지털 컬러 전자 현미경 사진.(A) 다수의 정자의 부착된 꼬리.세로(화살표) 및 가로(화살표) 투영에서 꼬리가 어떻게 보이는지 확인하십시오.(B) 정자의 머리(화살표)는 꼬리(화살표)에 연결됩니다.(C) 여러 개의 정자 꼬리(화살표)가 붙어 있습니다.(D) 응집 물질(AS, 파란색)은 4개의 정자 머리(보라색)를 연결합니다.
스캐닝 전자 현미경은 분비물 또는 막으로 덮인 정자 다발에서 정자 머리를 검출하는 데 사용되었으며(그림 6B), 정자 다발이 세포외 물질에 의해 고정되었음을 나타냅니다.응집된 물질은 정자 머리에 집중되었고(해파리 머리 모양 조립체; 그림 5B) 말단으로 확장되어 아크리딘 오렌지로 염색되었을 때 형광 현미경 하에서 밝은 노란색 외관을 나타냈습니다(그림 6C).이 물질은 주사 현미경으로 명확하게 볼 수 있으며 바인더로 간주됩니다.반박형 섹션(그림 5C)과 아크리딘 오렌지로 염색된 정자 도말 검사는 빽빽하게 채워진 머리와 말려진 꼬리를 포함하는 정자 다발을 보여주었습니다(그림 5D).
다양한 방법을 사용하여 정자 머리와 접힌 꼬리의 집합체를 보여주는 다양한 현미경 사진.(A) 두 부분으로 된 핵(파란색)과 여러 개의 편모 부분(녹색)이 있는 감긴 정자 머리를 보여주는 정자 다발의 단면 디지털 컬러 투과 전자 현미경 사진.(B) 덮여 있는 것처럼 보이는 해파리 모양의 정자 머리(화살표) 무리를 보여주는 디지털 컬러 주사 전자 현미경 사진.(C) 응집된 정자 머리(화살표)와 말린 꼬리(화살표)를 보여주는 반박형 섹션.(D) 아크리딘 오렌지로 염색된 정자 도말 현미경 사진은 정자 머리(화살표)와 구부러진 부착 꼬리(화살표)의 집합체를 보여줍니다.끈적끈적한 물질(S)이 정자의 머리를 덮고 있음에 유의하십시오.(D) × 1000 배율.
투과전자현미경(Fig. 7A)을 이용하여 정자 머리가 뒤틀리고 핵이 나선형인 것을 확인하였고, 정자도말을 아크리딘 오렌지로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다(Fig. 7B).
(A) 디지털 컬러 투과 전자 현미경 사진 및 (B) 코일 머리와 정자 머리 및 꼬리(화살표)의 부착을 보여주는 Acridine 오렌지 염색 정자 도말.(B) × 1000 배율.
흥미로운 발견은 Sharkazi의 정자가 모여서 움직이는 사상 다발을 형성한다는 것입니다.이러한 번들의 특성을 통해 SST에서 정자의 흡수 및 저장에서 가능한 역할을 이해할 수 있습니다.
짝짓기 후 정자는 질로 들어가 강렬한 선택 과정을 거쳐 SST15,16에 들어가는 정자 수가 제한됩니다.현재까지 정자가 SST에 들어가고 나가는 메커니즘은 명확하지 않습니다.가금류에서 정자는 종에 따라 2~10주 동안 SST에 저장됩니다6.SST에 보관하는 동안 정액의 상태에 대한 논란이 남아 있습니다.그들은 움직이고 있습니까, 아니면 쉬고 있습니까?다시 말해, 정자 세포는 어떻게 그렇게 오랫동안 SST에서 자신의 위치를 ​​유지합니까?
Forman4는 SST 체류 및 배출이 정자 운동성 측면에서 설명될 수 있다고 제안했습니다.저자는 정자가 SST 상피에 의해 생성된 유체 흐름에 대항하여 수영하여 위치를 유지하고 정자가 에너지 부족으로 인해 정자가 뒤로 이동하기 시작하는 지점 아래로 속도가 떨어지면 SST에서 배출된다는 가설을 세웁니다.Zaniboni5는 SST 상피 세포의 정점 부분에 있는 아쿠아포린 2, 3 및 9의 존재를 확인했으며 이는 Foreman의 정자 저장 모델을 간접적으로 지원할 수 있습니다.현재 연구에서 우리는 Sharkashi의 정자 중 거의 절반이 흐르는 유체에서 양성 유변학을 보이고, 응집된 정자 다발이 양성 유변학을 나타내는 정자 수를 증가시킨다는 것을 발견했습니다.정자 세포가 조류의 나팔관을 통해 수정 부위로 이동하는 방법은 완전히 이해되지 않았습니다.포유류에서 난포액은 정자를 화학유인합니다.그러나 화학 유인 물질은 정자가 장거리에 접근하도록 지시하는 것으로 여겨집니다7.따라서 다른 메커니즘이 정자 수송을 담당합니다.짝짓기 후 방출되는 나팔관액에 대해 방향을 잡고 흐르는 정자의 능력은 생쥐에서 정자를 표적으로 삼는 주요 요인으로 보고되었습니다.Parker 17은 정자가 새와 파충류의 섬모체 흐름에 대항하여 헤엄쳐 난관을 가로지른다고 제안했습니다.조류에서 실험적으로 입증되지는 않았지만, Adolphi18는 커버슬립과 슬라이드 사이에 여과지 조각으로 얇은 액체 층을 만들 때 조류 정자가 긍정적인 결과를 가져온다는 사실을 처음으로 발견했습니다.유변학.Hino와 Yanagimachi[19]는 마우스 난소-난관-자궁 복합체를 관류 고리에 배치하고 나팔관의 유체 흐름을 시각화하기 위해 지협에 1 μl의 잉크를 주입했습니다.그들은 모든 잉크 볼이 나팔관의 팽대부를 향해 꾸준히 움직이는 나팔관에서 수축과 이완의 매우 활발한 움직임을 발견했습니다.저자는 정자의 융기 및 수정을 위해 하부 나팔관에서 상부 나팔관으로의 난관액 흐름의 중요성을 강조합니다.Brillard20은 닭과 칠면조에서 정자가 저장되는 질 입구에서 저장되는 자궁-질 접합부로 능동적인 이동을 통해 정자가 이동한다고 보고했습니다.그러나 정자는 수동 변위에 의해 운반되기 때문에 자궁질 접합부와 누두부 사이에는 이러한 움직임이 필요하지 않습니다.이러한 이전 권장 사항과 현재 연구에서 얻은 결과를 알면 정자가 상류로 이동하는 능력(유변학)이 선택 프로세스의 기반이 되는 속성 중 하나라고 가정할 수 있습니다.이것은 질을 통한 정자의 통과와 저장을 위한 CCT로의 진입을 결정합니다.Forman4가 제안한 것처럼 이것은 정자가 일정 기간 동안 SST와 그 서식지에 들어갔다가 속도가 느려지기 시작할 때 나가는 과정을 용이하게 할 수도 있습니다.
한편, Matsuzaki와 Sasanami21은 조류의 정자는 암수 생식관에서 휴면 상태에서 운동성으로 운동성 변화를 겪는다고 제안하였다.정자의 긴 저장 시간과 SST를 떠난 후 회춘을 설명하기 위해 SST에서 정주 정자 운동성의 억제가 제안되었습니다.저산소 상태에서 Matsuzaki et al.1은 SST에서 젖산염의 높은 생산 및 방출을 보고했으며, 이는 상주하는 정자 운동성을 억제할 수 있습니다.이 경우 정자 유변학의 중요성은 저장이 아니라 정자의 선택과 흡수에 반영됩니다.
정자 응집 패턴은 가금류에서 정자 보유의 일반적인 패턴이기 때문에 SST에서 정자의 긴 저장 기간에 대한 그럴듯한 설명으로 간주됩니다2,22,23.Bakstet al.2는 메추라기 CCM에서 대부분의 정자가 서로 부착하여 다발성 응집체를 형성하고 단일 정자가 드물게 발견되는 것을 관찰했습니다.한편 Wen et al.24는 닭의 SST 내강에서 더 많은 정자가 흩어져 있고 더 적은 정자 다발을 관찰했습니다.이러한 관찰에 기초하여, 정자 응집 성향은 새와 같은 사정액에서 정자 사이에 다르다고 가정할 수 있습니다.또한 Van Krey et al.9는 응집된 정자의 무작위 해리가 정자가 나팔관의 내강으로 점진적으로 침투하는 원인이 된다고 제안했습니다.이 가설에 따르면 응집 능력이 낮은 정자는 SST에서 먼저 추방되어야 합니다.이러한 맥락에서 정자 응집 능력은 더러운 새의 정자 경쟁 결과에 영향을 미치는 요인일 수 있습니다.또한 응집된 정자가 해리되는 시간이 길수록 생식력이 더 오래 유지됩니다.
여러 연구2,22,24에서 정자 응집과 번들로의 응집이 관찰되었지만 SST 내에서의 운동학적 관찰의 복잡성으로 인해 자세히 설명되지 않았습니다.체외에서 정자 응집을 연구하기 위한 여러 시도가 있었습니다.매달려 있는 씨앗 방울에서 얇은 와이어를 제거했을 때 광범위하지만 일시적인 응집이 관찰되었습니다.이것은 길쭉한 거품이 방울에서 튀어 나와 정액을 모방한다는 사실로 이어집니다.3D 제한과 짧은 점적 건조 시간으로 인해 전체 블록이 빠르게 파손되었습니다9.현재 연구에서는 Sharkashi 닭과 미세유체 칩을 사용하여 이러한 뭉치가 어떻게 형성되고 어떻게 움직이는지 설명할 수 있었습니다.정자 다발은 정액 수집 직후에 형성되었으며 나선형으로 움직이는 것으로 밝혀졌으며 흐름에 존재할 때 양성 유변학을 나타냅니다.또한 육안으로 볼 때 정자 다발은 고립된 정자에 비해 운동성의 선형성을 증가시키는 것으로 관찰되었습니다.이것은 정자 응집이 SST 침투 이전에 발생할 수 있으며 정자 생산이 이전에 제안된 것처럼 스트레스로 인해 작은 영역에 제한되지 않음을 시사합니다(Tingari 및 Lake12).다발이 형성되는 동안 정자는 접합부를 형성할 때까지 동시에 헤엄친 다음 꼬리가 서로를 감싸고 정자의 머리는 자유롭게 유지되지만 정자의 꼬리와 말단 부분은 끈적한 물질과 함께 달라붙습니다.따라서 인대의 자유로운 머리는 인대의 나머지 부분을 끌면서 움직임을 담당합니다.정자 다발의 주사전자현미경은 부착된 정자 머리가 많은 끈적끈적한 물질로 덮여 있음을 보여, 정자 머리가 저장 부위(SST)에 도달한 후 발생했을 수 있는 휴지 다발에 부착되어 있음을 시사합니다.
정자도말표본을 아크리딘오렌지로 염색하면 정자세포 주변의 세포외접착물질을 형광현미경으로 볼 수 있다.이 물질은 정자 다발이 주변 표면이나 입자에 달라붙어 주변 흐름과 함께 표류하지 않도록 합니다.따라서, 우리의 관찰은 모바일 번들의 형태로 정자 유착의 역할을 보여줍니다.조류에 대항하여 헤엄치고 근처 표면에 달라붙는 그들의 능력은 정자가 SST에 더 오래 머무를 수 있게 합니다.
Rothschild25는 혈구계측 카메라를 사용하여 현탁액 한 방울에 있는 소 정액의 부유 분포를 연구하고 현미경의 수직 및 수평 광축이 있는 카메라를 통해 현미경 사진을 촬영했습니다.결과는 정자가 챔버 표면에 끌리는 것으로 나타났습니다.저자는 정자와 표면 사이에 유체역학적 상호작용이 있을 수 있다고 제안합니다.이를 고려하면 Sharkashi 병아리 정액이 끈적끈적한 다발을 형성하는 능력과 함께 정액이 SST 벽에 달라붙어 장기간 저장될 가능성이 높아질 수 있습니다.
Bccetti와 Afzeliu26는 정자 glycocalyx가 배우자 인식과 응집에 ​​필요하다고 보고했습니다.Forman10은 조류 정액을 뉴라미니다아제로 처리하여 당단백질-당지질 코팅에서 α-글리코시드 결합의 가수분해가 정자 운동성에 영향을 미치지 않고 생식력을 감소시키는 것을 관찰했습니다.저자는 글리코칼릭스에 대한 뉴라미니다제의 효과가 자궁-질 접합부에서 정자 격리를 손상시켜 생식력을 감소시킨다고 제안합니다.그들의 관찰은 뉴라미니다제 치료가 정자와 난자 인식을 감소시킬 수 있는 가능성을 무시할 수 없습니다.Forman과 Engel10은 암탉이 뉴라미니다제로 처리된 정액으로 질내 수정되었을 때 생식력이 감소되었음을 발견했습니다.그러나 뉴라미니다제 처리된 정자를 사용한 IVF는 대조군 닭과 비교하여 생식력에 영향을 미치지 않았습니다.저자들은 정자막 주변의 당단백질-당지질 코팅의 변화가 자궁-질 접합부에서 정자의 격리를 손상시켜 정자의 수정 능력을 감소시켰으며, 이는 자궁-질 접합부의 속도로 인해 정자 손실을 증가시켰지만 정자와 난자 인식에는 영향을 미치지 않았다고 결론지었습니다.
칠면조에서 Bakst와 Bauchan11은 SST의 내강에서 작은 소포와 막 조각을 발견했고 이 과립 중 일부가 정자 막과 융합된 것을 관찰했습니다.저자는 이러한 관계가 SST에서 정자의 장기 저장에 기여할 수 있다고 제안합니다.그러나 연구원들은 CCT 상피 세포에서 분비되는지, 남성 생식 기관에서 생성 및 분비되는지, 정자 자체에서 생성되는지 여부에 따라 이러한 입자의 출처를 지정하지 않았습니다.또한 이러한 입자는 응집을 담당합니다.Grützner 등27은 부고환 상피 세포가 단일 기공 정낭 형성에 필요한 특정 단백질을 생산하고 분비한다고 보고했습니다.저자들은 또한 이러한 번들의 분산이 부고환 단백질의 상호작용에 의존한다고 보고합니다.Nixon et al28은 부속기가 산성 시스테인이 풍부한 오스테오넥틴이라는 단백질을 분비한다는 것을 발견했습니다.SPARC는 짧은 부리 가시두더지와 오리너구리의 정자 다발 형성에 관여합니다.이러한 빔의 산란은 이 단백질의 손실과 관련이 있습니다.
이번 연구에서는 전자현미경을 이용한 초미세구조 분석에서 정자가 다량의 치밀한 물질에 부착된 것으로 나타났다.이러한 물질은 부착된 머리 사이와 주변에 응축되는 응집의 원인이 되는 것으로 생각되지만 꼬리 영역에서는 농도가 더 낮습니다.정액과 함께 남성의 생식계(부고환 또는 수정관)에서 분비되는 것으로 추정하는 이유는 사정하는 동안 정액이 림프와 정액에서 분리되는 것을 자주 관찰하기 때문입니다.조류 정자는 부고환과 수정관을 통과할 때 단백질에 결합하고 혈장 보조정리 관련 당단백질을 획득하는 능력을 지원하는 성숙 관련 변화를 겪는 것으로 보고되었습니다.SST에서 상주하는 정자 막에 대한 이러한 단백질의 지속성은 이러한 단백질이 정자 막 안정성 획득에 영향을 미치고 30 생식력을 결정할 수 있음을 시사합니다 31 .Ahammad et al32은 남성 생식계의 다양한 부분(고환에서 말단 정관까지)에서 얻은 정자가 저장 온도에 관계없이 액체 저장 조건에서 생존력이 점진적으로 증가하고 닭의 생존력도 인공 수정 후 나팔관에서 증가한다고 보고했습니다.
Sharkashi 닭 정자 다발은 바늘 두더지, 오리너구리, 나무 쥐, 사슴 쥐 및 기니피그와 같은 다른 종과 다른 특성과 기능을 가지고 있습니다.샤카시 닭에서는 정자 다발의 형성으로 단일 정자에 비해 유영 속도가 감소했습니다.그러나 이러한 다발은 유변학적으로 양성인 정자의 비율을 증가시켰고 정자가 역동적인 환경에서 스스로를 안정화시키는 능력을 증가시켰습니다.따라서 우리의 결과는 SST의 정자 응집이 장기 정자 저장과 관련되어 있다는 이전 제안을 확인합니다.우리는 또한 다발을 형성하는 정자의 성향이 정자 경쟁의 결과를 바꿀 수 있는 SST에서 정자 손실 속도를 제어할 수 있다는 가설을 세웁니다.이 가정에 따르면, 응집 능력이 낮은 정자는 먼저 SST를 방출하고, 응집 능력이 높은 정자는 대부분의 자손을 생산합니다.단일 구멍 정자 다발의 형성은 유익하고 부모-자식 비율에 영향을 주지만 다른 메커니즘을 사용합니다.가시두더지와 오리너구리에서는 정자가 서로 평행하게 배열되어 빔의 전진 속도를 높입니다.가시두더지 다발은 단일 정자보다 약 3배 빠르게 움직입니다.바늘두더지에서 그러한 정자 다발의 형성은 암컷이 난잡하고 일반적으로 여러 수컷과 교미하기 때문에 우세를 유지하기 위한 진화적 적응이라고 여겨집니다.따라서 서로 다른 사정액의 정자는 난자의 수정을 위해 치열하게 경쟁합니다.
샤카시 닭의 응집된 정자는 위상차 현미경을 사용하여 쉽게 시각화할 수 있으며, 이는 체외에서 정자의 행동을 쉽게 연구할 수 있기 때문에 유리한 것으로 간주됩니다.정자 다발 형성이 샤카시 닭에서 번식을 촉진하는 메커니즘은 일부 정자가 난자에 도달하여 다른 관련된 개체가 난자에 도달하고 손상시키는 것을 돕는 나무 쥐와 같은 협동 정자 행동을 나타내는 일부 태반 포유류에서 볼 수 있는 것과도 다릅니다.자신을 증명하기 위해.이타적인 행동.자가 수정 34. 정자에서 협동 행동의 또 다른 예는 사슴 생쥐에서 발견되었으며, 여기서 정자는 유전적으로 가장 관련이 있는 정자를 식별하고 결합할 수 있었고, 관련 없는 정자에 비해 속도를 높이기 위해 협동 그룹을 형성할 수 있었습니다35.
이 연구에서 얻은 결과는 SWS에서 정자의 장기 저장에 대한 Foman의 이론과 모순되지 않습니다.연구진은 정자세포가 SST를 감싸고 있는 상피세포의 흐름 속에서 장기간 계속 움직이다가 일정 시간이 지나면 정자세포의 에너지 저장고가 고갈돼 속도가 느려져 저분자량 물질을 배출할 수 있게 된다고 보고했다.SST의 내강에서 나오는 액체의 흐름과 함께 정자의 에너지 나팔관의 공동.현재 연구에서 우리는 단일 정자의 절반이 흐르는 액체에 대항하여 헤엄칠 수 있는 능력을 보였고 다발에서의 부착력이 긍정적인 유변학을 나타내는 능력을 증가시켰다는 것을 관찰했습니다.또한, 우리의 데이터는 Matsuzaki et al.의 데이터와 일치합니다.1 SST에서 증가된 젖산 분비가 상주 정자 운동성을 억제할 수 있다고 보고했습니다.그러나, 우리의 결과는 정자 운동성 인대의 형성과 SST에서 그들의 행동을 밝히기 위한 시도에서 마이크로 채널 내의 동적 환경이 존재하는 그들의 유변학적 행동을 설명합니다.향후 연구는 응집제의 화학적 조성과 기원을 결정하는 데 초점을 맞출 수 있으며, 이는 의심할 여지 없이 연구원들이 액체 정액을 저장하고 수정 기간을 늘리는 새로운 방법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.
15명의 30주령 남성 샤카시(동형접합 우성; Na Na)가 이 연구에서 정자 기증자로 선정되었습니다.새들은 이집트 아시트 주 아시트 대학교 농업 학부의 연구 가금류 농장에서 사육되었습니다.새들은 개별 우리(30 x 40 x 40 cm)에 수용되었고, 조명 프로그램(16시간의 빛과 8시간의 어둠)을 받았고, 160g의 조단백질, 2800kcal의 대사 에너지, 35g의 칼슘이 포함된 사료를 먹였습니다.식단 1kg당 가용 인 5g.
데이터 36, 37에 따르면 복부 마사지를 통해 남성에게서 정액을 채취했습니다.3일 동안 15명의 남성으로부터 총 45개의 정액 샘플을 수집했습니다.정액(n = 15/일)을 이인산칼륨(1.27g), 글루탐산일나트륨 일수화물(0.867g), 과당(0.5d) 무수나트륨을 함유하는 Belsville Poultry Semen Diluent로 1:1(v:v)로 즉시 희석했습니다.아세테이트(0.43g), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(0.195g), 구연산칼륨 일수화물(0.064g), 일인산칼륨(0.065g), 염화마그네슘(0.034g) 및 H2O(100ml), pH = 7, 5, 삼투압 333mOsm/kg38.희석된 정액 샘플은 먼저 광학 현미경으로 검사하여 우수한 정액 품질(수분)을 확인한 다음 수집 후 30분 이내에 사용할 때까지 37°C의 수조에 보관했습니다.
정자의 운동학 및 유변학은 미세 유체 장치 시스템을 사용하여 설명됩니다.정액 샘플을 Beltsville Avian Semen Diluent에서 1:40으로 추가 희석하고 미세유체 장치(아래 참조)에 로드하고 이전에 미세유체 특성화를 위해 개발된 CASA(Computerized Semen Analysis) 시스템을 사용하여 동역학 매개변수를 결정했습니다.액체 매체에서 정자의 이동성에 관한 연구(이집트 아시우트 대학교 공학부 기계공학과).플러그인은 http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39에서 다운로드할 수 있습니다.곡선 속도(VCL, μm/s), 선형 속도(VSL, μm/s) 및 평균 궤적 속도(VAP, μm/s)를 측정했습니다.Tucson ISH1000 카메라에 연결된 거꾸로 된 Optika XDS-3 위상차 현미경(40x 대물렌즈 포함)을 사용하여 정자의 비디오를 3초 동안 30fps로 촬영했습니다.CASA 소프트웨어를 사용하여 샘플당 최소 3개 영역과 500개의 정자 궤적을 연구합니다.녹화된 영상은 수제 CASA를 사용하여 처리되었습니다.CASA 플러그인에서 운동성의 정의는 유속에 비해 정자의 수영 속도를 기반으로 하며, 유체 흐름에서 더 안정적인 것으로 밝혀졌기 때문에 좌우 움직임과 같은 다른 매개변수를 포함하지 않습니다.유변학적 운동은 정자 세포가 유체의 흐름 방향에 반대하는 운동으로 설명됩니다.유변학적 특성을 가진 정자는 운동성 정자 수로 나누었습니다.정지한 정자와 대류운동을 하는 정자는 계수에서 제외하였다.
사용 된 모든 화학 물질은 달리 명시되지 않는 한 Elgomhoria Pharmaceuticals (이집트 카이로)에서 구입했습니다.이 장치는 El-sherry et al.에 의해 설명된 대로 제조되었습니다.40 일부 수정.마이크로 채널을 제작하는 데 사용된 재료에는 유리판(Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 네거티브 레지스트(MicroChem, Newton, CA), 디아세톤 알코올(Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) 및 폴리아세톤이 포함됩니다.-184, 다우 코닝, 미시간 주 미들랜드).마이크로채널은 소프트 리소그래피를 사용하여 제작됩니다.먼저, 원하는 마이크로채널 디자인의 투명 보호 안면 마스크를 고해상도 프린터(Prismatic, Cairo, Egypt 및 Pacific Arts and Design, Markham, ON)에 인쇄했습니다.마스터는 기판으로 유리판을 사용하여 만들어졌습니다.플레이트를 아세톤, 이소프로판올 및 탈이온수로 세척한 다음 스핀 코팅(3000rpm, 1분)에 의해 SU8-25의 20μm 층으로 코팅했습니다.그런 다음 SU-8 층을 부드럽게 건조시키고(65°C, 2분 및 95°C, 10분) 50초 동안 UV 방사선에 노출시켰다.65°C 및 95°C에서 1분 및 4분 동안 노출 후 베이킹하여 노출된 SU-8 층을 가교 결합한 다음 6.5분 동안 디아세톤 알코올에서 현상합니다.SU-8 층을 더욱 굳히기 위해 와플을 200°C에서 15분 동안 열심히 굽습니다.
PDMS는 모노머와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하여 준비한 다음 진공 데시케이터에서 탈기하고 SU-8 본체에 부었습니다.PDMS를 오븐에서 경화(120°C, 30분)한 다음 채널을 잘라 마스터에서 분리하고 구멍을 뚫어 튜브가 마이크로채널의 입구와 출구에 부착될 수 있도록 했습니다.마지막으로 PDMS 마이크로채널은 다른 곳에서 설명한 대로 휴대용 코로나 프로세서(Electro-Technic Products, Chicago, IL)를 사용하여 현미경 슬라이드에 영구적으로 부착되었습니다.이 연구에 사용된 마이크로 채널은 200 µm × 20 µm(W × H)이고 길이는 3.6 cm입니다.
마이크로 채널 내부의 정수압에 의해 유도된 유체 흐름은 입구 저장소의 유체 레벨을 출구 저장소의 높이 차이 Δh39 이상으로 유지함으로써 달성됩니다(그림 1).
여기서 f는 직사각형 채널의 층류에 대한 f = C/Re로 정의되는 마찰 계수이며, 여기서 C는 채널의 종횡비에 따라 달라지는 상수, L은 마이크로 채널의 길이, Vav는 마이크로 채널 내부의 평균 속도, Dh는 채널의 수력학적 직경, g는 중력 가속도입니다.이 방정식을 사용하여 평균 채널 속도는 다음 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다.