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다공성 실리카 입자는 넓은 기공을 갖도록 일부 변형된 졸-겔법으로 제조되었다. 이 입자들은 N-페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PMI)와 스티렌을 역사슬 이동-단편화(RAFT) 중합을 통해 유도체화하여 N-페닐말레이미드가 삽입된 폴리아미드를 생성했다. 스티렌(PMP) 고정상. 좁은 구경의 스테인리스 스틸 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)에 슬러리 패킹을 채웠다. PMP 컬럼의 크로마토그래피 성능을 평가하여 5가지 펩타이드(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu 아미노산 엔케팔린)로 구성된 합성 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 가수분해물을 분리했다. 최적의 용출 조건에서 펩타이드 혼합물의 이론적인 플레이트 수는 280,000개/m²에 도달했습니다. 개발된 컬럼과 상용 Ascentis Express RP-Amide 컬럼의 분리 성능을 비교한 결과, PMP 컬럼의 분리 효율이 분리 효율과 분리능 측면에서 상용 컬럼보다 우수함을 확인했습니다.
바이오 제약 산업은 최근 몇 년간 시장 점유율이 크게 증가하면서 세계 시장으로 성장하고 있습니다. 바이오 제약 산업의 폭발적인 성장1,2,3으로 인해 펩타이드 및 단백질 분석에 대한 수요가 크게 증가하고 있습니다. 표적 펩타이드 외에도 펩타이드 합성 과정에서 다양한 불순물이 생성되므로 원하는 순도의 펩타이드를 얻으려면 크로마토그래피 정제가 필요합니다. 체액, 조직 및 세포 내 단백질의 분석 및 특성 분석은 단일 시료에 존재하는 잠재적으로 검출 가능한 종의 수가 많기 때문에 매우 어려운 과제입니다. 질량 분석법은 펩타이드와 단백질의 시퀀싱에 효과적인 도구이지만, 이러한 시료를 질량 분석기에 직접 주입하면 분리가 불충분합니다. 이 문제는 질량 분석기 분석 전에 액체 크로마토그래피(LC)를 수행하여 특정 시간에 질량 분석기에 유입되는 분석물의 양을 줄임으로써 해결할 수 있습니다4,5,6. 또한, 액상 분리 과정에서 분석물질이 좁은 영역에 농축될 수 있어 분석물질을 농축하고 MS 검출 감도를 높일 수 있습니다. 액체 크로마토그래피(LC)는 지난 10년 동안 크게 발전하여 프로테오믹스 분석에 널리 사용되는 방법이 되었습니다7,8,9,10.
역상 액체 크로마토그래피(RP-LC)는 옥타데실-변형 실리카(ODS)를 고정상으로 사용하여 펩타이드 혼합물을 정제하고 분리하는 데 널리 사용됩니다.11,12,13 그러나 복잡한 구조와 양쪽성 때문에14,15 역상 고정상은 펩타이드와 단백질을 만족스럽게 분리할 수 없습니다. 따라서 극성 및 비극성 단편을 포함하는 펩타이드와 단백질을 분석하려면 이러한 분석물질과 상호작용하고 이를 유지할 수 있도록 특별히 설계된 고정상이 필요합니다.16 다중 모드 상호작용을 제공하는 혼합 크로마토그래피는 펩타이드, 단백질 및 기타 복잡한 혼합물을 분리하는 데 RP-LC의 대안이 될 수 있습니다. 여러 가지 혼합형 고정상을 준비하고 이러한 고정상으로 채워진 컬럼을 사용하여 펩타이드와 단백질을 분리했습니다.17,18,19,20,21. 극성기와 비극성기가 존재하기 때문에 혼합 모드 고정상(WAX/RPLC, HILIC/RPLC, 극성 삽입/RPLC)은 펩타이드와 단백질 분리에 적합합니다.22,23,24,25,26,27,28. 공유 결합된 극성기가 있는 극성 삽입 고정상은 분리가 분석물과 고정상 간의 상호작용에 따라 달라지기 때문에 우수한 분리 능력과 극성 및 비극성 분석물에 대한 고유한 선택성을 보여줍니다.다중 모드 상호작용 29,30,31,32. 최근 Zhang 등은 30 폴리아민의 베헤닐 말단 고정상을 얻었고 탄화수소, 항우울제, 플라보노이드, 뉴클레오사이드, 에스트로겐 및 기타 일부 분석물을 성공적으로 분리했습니다.극성 삽입 고정 물질은 극성기와 비극성기를 모두 가지고 있으므로 펩타이드와 단백질을 소수성과 친수성 부분으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 극성 인라인 컬럼(예: 아미드 인라인이 있는 C18 컬럼)은 Ascentis Express RP-Amide 컬럼이라는 상품명으로 판매되지만, 이 컬럼은 아민 33 분석에만 사용되었습니다.
본 연구에서는 극성 매립 고정상(N-페닐말레이미드, 매립 폴리스티렌)을 제조하고 펩타이드 분리 및 트립신 HSA 절단을 평가하였다. 고정상을 제조하기 위해 다음 전략을 사용하였다. 다공성 실리카 입자는 제조 계획 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39를 일부 변경하여 이전 논문에 기술된 절차에 따라 제조하였다. 우레아, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), TMOS 및 수성 아세트산의 비율을 조절하여 기공 크기가 큰 실리카 입자를 얻었다. 두 번째로, 새로운 페닐말레이미드-메틸비닐 이소시아네이트 리간드를 합성하고, 이의 유도체화된 실리카 입자를 사용하여 극성 매립 고정상을 제조하였다. 얻어진 고정상을 최적화된 충진 계획에 따라 스테인리스 스틸 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)에 충진하였다. 컬럼의 패킹은 컬럼 내의 균일한 층을 보장하기 위해 기계적 진동의 도움을 받습니다. 패킹된 컬럼은 5가지 펩타이드(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신-엔케팔린 펩타이드)로 구성된 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HSA)의 트립신 가수분해물의 분리를 위해 평가되었습니다. 펩타이드 혼합물과 HSA 트립신 소화물이 좋은 분리능과 효율로 분리되는 것이 관찰되었습니다. PMP 컬럼의 분리 효율을 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교했습니다. 펩타이드와 단백질은 PMP 컬럼에서 좋은 분리능과 높은 분리 효율을 보였으며 PMP 컬럼의 분리 효율이 Ascentis Express RP-Amide 컬럼보다 높은 것이 관찰되었습니다.
PEG(폴리에틸렌 글리콜), 요소, 아세트산, 트리메톡시오르토실리케이트(TMOS), 트리메틸클로로실란(TMCS), 트립신, 인간 혈청 알부민(HSA), 염화암모늄, 요소, 헥사메틸메타크릴로일디실라잔(HMDS), 메타크릴로일클로라이드(MC), 스티렌, 4-하이드록시-TEMPO, 벤조일퍼옥사이드(BPO), HPLC용 아세토니트릴(ACN), 메탄올, 2-프로판올 및 아세톤. Sigma-Aldrich Company(미국 미주리주 세인트루이스)
요소(8 g), 폴리에틸렌 글리콜(8 g), 0.01 N 아세트산 8 ml의 혼합물을 10분간 교반한 후, 빙냉 하에 TMOS 24 ml를 첨가하였다. 반응 혼합물을 스테인리스 스틸 오토클레이브에서 40°C에서 6시간, 이어서 120°C에서 8시간 동안 가열하였다. 물을 따라내고 잔류물을 70°C에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 연질 블록을 매끄럽게 분쇄한 후 550°C 오븐에서 12시간 동안 소성하였다. 입자 크기, 기공 크기 및 표면적의 재현성을 시험하기 위해 세 개의 배치를 제조하고 특성을 분석하였다.
폴리스티렌 사슬의 극성기와 고정상. 제조 과정은 아래와 같습니다.
N-페닐말레이미드(200mg)와 메틸비닐이소시아네이트(100mg)를 무수톨루엔에 녹인 후, 반응플라스크에 2,2'-아조이소부티로니트릴(AIBN) 0.1ml을 첨가하여 페닐말레이미드와 메틸비닐이소시아네이트의 공중합체(PMCP)를 얻었다. 60℃에서 3시간 가열한 후 여과하고, 40℃ 오븐에서 3시간 건조하였다.
건조된 실리카 입자(2g)를 건조 톨루엔(100ml)에 분산시키고, 교반한 후 500ml 둥근 바닥 플라스크에서 10분간 초음파 처리하였다. PMCP(10mg)를 톨루엔에 녹인 후, 첨가 깔때기를 이용하여 반응 플라스크에 적가하였다. 혼합물을 100°C에서 8시간 동안 환류시키고, 여과한 후 아세톤으로 세척하고, 60°C에서 3시간 동안 건조하였다. 이어서, PMCP(100g)와 결합된 실리카 입자를 톨루엔(200ml)에 녹이고, 촉매로서 디부틸틴 디라우레이트 100μl를 첨가한 상태에서 4-하이드록시-TEMPO(2ml)를 첨가하였다. 혼합물을 50°C에서 8시간 동안 교반하고, 여과한 후 50°C에서 3시간 동안 건조하였다.
스티렌(1 ml), 과산화벤조일 BPO(0.5 ml), 그리고 TEMPO-PMCP(1.5 g)에 부착된 실리카 입자를 톨루엔에 분산시키고 질소로 세정하였다. 스티렌의 중합은 100°C에서 12시간 동안 수행하였다. 생성된 생성물을 메탄올로 세척하고 60°C에서 하룻밤 동안 건조하였다. 반응의 전반적인 개요는 그림 1에 도시되어 있다.
샘플은 잔류 압력이 10–3 Torr 미만이 될 때까지 393 K에서 1시간 동안 탈기되었습니다. 상대 압력 P/P0 = 0.99에서 흡착된 N2의 양을 사용하여 전체 기공 부피를 결정했습니다. 순수 및 리간드 결합 실리카 입자의 형태는 주사 전자 현미경(Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan)을 사용하여 조사했습니다. 건조 샘플(순수 실리카 및 리간드 결합 실리카 입자)은 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 막대에 놓았습니다. Q150T 스퍼터링 장치를 사용하여 샘플에 금을 증착하고 5nm 두께의 Au 층을 샘플에 증착했습니다. 이렇게 하면 저전압 공정의 효율이 향상되고 미세한 냉간 분무가 제공됩니다. 원소 분석은 Thermo Electron(Waltham, MA, USA) Flash EA1112 원소 조성 분석기를 사용하여 수행했습니다. Malvern 입자 크기 분석기(Worcestershire, UK) Mastersizer 2000을 사용하여 입자 크기 분포를 얻었습니다. 코팅되지 않은 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자(각각 5mg)를 이소프로판올 5ml에 분산시키고, 10분간 초음파 처리한 후 5분간 교반한 후 Mastersizer 광학 벤치에 올려놓았습니다. 열중량 분석은 30~800°C의 온도 범위에서 분당 5°C의 속도로 수행되었습니다.
유리 섬유 라이닝 협구 스테인리스 스틸 컬럼(ID 100 × 1.8 mm)을 참고문헌 31과 동일한 절차에 따라 슬러리 충전법으로 충진했습니다. 스테인리스 스틸 컬럼(유리 라이닝, ID 100 × 1.8 mm)과 1 µm 프릿이 들어 있는 출구를 슬러리 포장기(Alltech Deerfield, IL, USA)에 연결했습니다. 고정상 150 mg을 메탄올 1.2 ml에 현탁하여 저장 컬럼에 공급하여 고정상의 현탁액을 준비했습니다. 메탄올을 슬러리 용매 및 대조 용매로 사용했습니다. 100 MP에서 10분, 80 MP에서 15분, 60 MP에서 30분의 압력 시퀀스를 적용하여 컬럼을 충진했습니다. 충진 공정에는 두 개의 가스 크로마토그래피 컬럼 진동기(Alltech, Deerfield, IL, USA)를 사용하여 기계적 진동을 통해 균일한 컬럼 충진을 보장했습니다. 슬러리 패커를 닫고 스트링 손상을 방지하기 위해 압력을 천천히 배출하십시오. 컬럼을 슬러리 노즐에서 분리하고, 다른 피팅을 입구에 부착하여 LC 시스템에 연결하여 작동을 테스트했습니다.
LC 펌프(10AD Shimadzu, 일본), 50 nL 주입 루프(Valco(USA) C14 W.05)가 있는 샘플러, 멤브레인 탈기 장치(Shimadzu DGU-14A) 및 UV-VIS 모세관 창을 사용하여 맞춤형 MLC를 구축했습니다. 검출기 장치(UV-2075)와 에나멜 처리된 마이크로컬럼. 추가 컬럼 팽창의 영향을 최소화하기 위해 매우 좁고 짧은 연결 튜브를 사용하십시오. 컬럼을 채운 후 1/16인치 환원 접합부 출구에 모세관(50 µm id 365)을 설치하고 환원 접합부의 모세관(50 µm)을 설치합니다. 데이터 수집 및 크로마토그램 처리는 Multichro 2000 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. 254 nm에서 피험 분석물의 UV 흡광도를 0.000에서 모니터링했습니다. 크로마토그래피 데이터는 OriginPro8(Northampton, MA)을 사용하여 분석했습니다.
인간 혈청 알부민 동결건조 분말, ≥ 96% (아가로스겔 전기영동) 3mg을 트립신(1.5mg), 4.0M 요소(1ml), 0.2M 중탄산암모늄(1ml)과 혼합하였다. 용액을 10분간 교반한 후 37°C 수조에서 6시간 동안 방치한 후, 0.1% TFA 1ml로 반응 정지시켰다. 용액을 여과하여 4°C 이하에서 보관하였다.
PMP 컬럼에서 펩타이드와 트립신 분해 HSA 혼합물의 분리를 개별적으로 평가했습니다. PMP 컬럼으로 분리한 펩타이드와 HSA 혼합물의 트립신 가수분해를 확인하고 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 결과를 비교했습니다. 이론 단수는 다음 방정식을 사용하여 계산했습니다.
순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 SEM 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 순수 실리카 입자(A, B)의 SEM 이미지는 기존 연구 결과와 비교하여 입자가 길쭉하거나 불규칙한 대칭을 갖는 구형을 보여줍니다. 리간드(C, D)에 결합된 실리카 입자의 표면은 순수 실리카 입자보다 매끄러우며, 이는 실리카 입자 표면을 덮고 있는 폴리스티렌 사슬 때문일 수 있습니다.
순수 실리카 입자(A, B)와 리간드 결합 실리카 입자(C, D)의 주사 전자 현미경 사진입니다.
순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포는 그림 2. 3(A)에 나와 있습니다. 체적 입자 크기 분포 곡선은 화학적 변형 후 실리카 입자 크기가 증가했음을 보여주었습니다(그림 3A). 현재 연구와 이전 연구의 실리카 입자 크기 분포 데이터는 표 1(A)에 비교되어 있습니다. PMP의 체적 입자 크기 d(0.5)는 3.36µm였으며, 이는 이전 연구(폴리스티렌 결합 실리카 입자)34의 ad(0.5) 값 3.05µm에 비해 낮습니다. 반응 혼합물에서 PEG, 우레아, TMOS 및 아세트산의 비율이 변경되어 이 배치의 입자 크기 분포는 이전 연구에 비해 좁았습니다. PMP 상의 입자 크기는 앞서 연구한 폴리스티렌 결합 실리카 입자 상의 입자 크기보다 약간 큽니다. 이는 스티렌을 이용한 실리카 입자의 표면 기능화가 실리카 표면에 폴리스티렌 층(0.97µm)만 증착한 반면, PMP 단계에서는 층 두께가 1.38µm임을 의미합니다.
순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포(A) 및 기공 크기 분포(B).
이 연구에서 사용된 실리카 입자의 기공 크기, 기공 부피 및 표면적은 표 1(B)에 나와 있습니다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 PSD 프로파일은 그림 3(B)에 나와 있습니다. 결과는 이전 연구34와 유사했습니다. 순수 및 리간드 결합 실리카 입자의 기공 크기는 각각 310Å와 241Å로, 화학적 변형 후 기공 크기가 표 1(B)에 나와 있는 것처럼 69Å 감소했음을 나타내며 이동 곡선은 그림에 나와 있습니다. 현재 연구에서 실리카 입자의 비표면적은 116m2/g로 이전 연구(124m2/g)와 유사합니다. 표 1(B)에서 볼 수 있듯이 화학적 변형 후 실리카 입자의 표면적(m2/g)도 116m2/g에서 105m2/g로 감소했습니다.
고정상의 원소 분석 결과는 표 2에 제시되어 있습니다. 현재 고정상의 탄소 함량은 6.35%로, 이전 연구(폴리스티렌과 결합된 실리카 입자, 각각 7.93%35 및 10.21%)보다 낮습니다. 42. SP 제조에 스티렌 외에도 페닐말레이미드 메틸 비닐 이소시아네이트(PCMP) 및 4-하이드록시-TEMPO와 같은 일부 극성 리간드가 사용되었기 때문에 현재 고정상의 탄소 함량은 아래와 같습니다. 현재 고정상의 질소 중량 백분율은 이전 연구의 0.1735 및 0.85%에 비해 2.21%입니다. 42 이는 페닐말레이미드로 인해 현재 고정상의 질소 중량 백분율이 높다는 것을 의미합니다. 마찬가지로, 생성물 (4) 및 (5)는 각각 2.7% 및 2.9%의 탄소 함량을 갖는 반면, 최종 생성물 (6)은 표 2에 나타낸 바와 같이 6.35%의 탄소 함량을 갖는다. 열중량 분석(TGA)은 PMP의 고정상에서 중량 감소를 테스트하는 데 사용되었으며, TGA 곡선은 그림 4에 나와 있다. TGA 곡선은 8.6%의 중량 감소를 보여주는데, 이는 리간드에 C뿐만 아니라 N, O 및 H도 포함되어 있기 때문에 탄소 함량(6.35%)과 잘 일치한다.
리간드 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트는 극성 페닐말레이미드 및 비닐이소시아네이트기를 가지고 있어 실리카 입자 표면을 개질하는 데 선택되었습니다. 비닐이소시아네이트기는 리빙 라디칼 중합을 통해 스티렌과 추가로 반응할 수 있습니다. 두 번째 이유는 페닐말레이미드 부분이 정상 pH에서 가상 전하를 갖지 않기 때문에 분석물과 적당한 상호작용을 하고 분석물과 고정상 사이에 강한 정전기적 상호작용이 없는 기를 삽입하는 것입니다. 고정상의 극성은 스티렌의 최적 함량과 자유 라디칼 중합 반응 시간에 의해 제어될 수 있습니다. 반응의 마지막 단계(자유 라디칼 중합)는 고정상의 극성을 변화시키므로 매우 중요합니다. 이러한 고정상의 탄소 함량을 확인하기 위해 원소 분석을 수행했습니다. 스티렌의 양과 반응 시간을 증가시키면 고정상의 탄소 함량이 증가하고, 그 반대의 경우도 마찬가지인 것으로 관찰되었습니다. 스티렌 농도에 따라 제조된 SP는 탄소 함량이 다릅니다. 마찬가지로, 이 고정상들을 스테인리스 스틸 컬럼에 놓고 크로마토그래피 특성(선택성, 분리능, N 값 등)을 확인했습니다. 이러한 실험을 바탕으로, 극성을 조절하고 분석물질의 양호한 머무름을 보장하는 PMP 고정상 제조를 위한 최적의 조성을 선택했습니다.
PMP 컬럼은 또한 이동상의 용량을 사용하여 5가지 펩타이드 혼합물(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신-엔케팔린)의 분석을 위해 평가되었습니다. 60/40(v/v) ACN/물(0.1% TFA)을 80 µl/min의 유속으로 사용했습니다. 최적의 용출 조건(200,000개 플레이트/m)에서 컬럼(100 × 1.8mm)당 이론 플레이트 수(N)는 20,000 ± 100입니다. 3개의 PMP 컬럼에 대한 N 값은 표 3에 나와 있고 크로마토그램은 그림 5A에 나와 있습니다. PMP 컬럼에서 높은 유속(700 µl/min)으로 빠르게 분석한 결과, 1분 이내에 5개의 펩타이드가 용출되었고, 컬럼당(직경 100 x 1.8 mm) 13,500 ± 330의 우수한 N 값이 얻어졌으며, 이는 135,000개 플레이트/m에 해당합니다(그림 5B). 동일한 크기(내경 100 x 1.8 mm)의 컬럼 3개에 PMP 고정상의 3가지 다른 배치를 채워 재현성을 테스트했습니다. 최적의 용출 조건, 이론 플레이트 수 N 및 머무름 시간을 사용하여 각 컬럼에서 동일한 테스트 혼합물을 분리하여 각 컬럼의 분석물을 기록했습니다. PMP 컬럼의 재현성 데이터는 표 4에 나와 있습니다. PMP 컬럼의 재현성은 표 3에 나와 있는 매우 낮은 %RSD 값과 좋은 상관관계를 보였습니다.
PMP 컬럼(B)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(A)에서 펩타이드 혼합물을 분리, 이동상은 60/40 ACN/H2O(TFA 0.1%), PMP 컬럼 크기(100 x 1.8 mm id), 분석 화합물의 용출 순서: 1(Gly-Tyr), 2(Gly-Leu-Tyr), 3(Gly-Gly-Tyr-Arg), 4(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) 및 5(류신산 엔케팔린).
PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)을 사용하여 HPLC를 이용한 인간 혈청 알부민의 트립신 가수분해물의 분리를 평가하였다. 그림 6의 크로마토그램은 시료가 매우 우수한 분리능으로 잘 분리되었음을 보여준다. HSA 용액은 100 μl/분의 유속, 70/30 아세토니트릴/물 이동상, 그리고 0.1% TFA를 사용하여 분석하였다. HSA의 절단은 크로마토그램(그림 6)에 나타난 바와 같이 17개의 피크로 나뉘었으며, 이는 17개의 펩타이드에 해당한다. HSA 가수분해물에서 각 피크의 분리 효율을 계산하여 표 5에 나타내었다.
HSA 트립신 가수분해물은 PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm), 유속(100 μl/분), 이동상 60/40 아세토니트릴/물, 0.1% TFA를 사용하여 분리되었습니다.
여기서 L은 컬럼 길이, η는 이동상의 점도, ΔP는 컬럼의 역압, u는 이동상의 선속도입니다. PMP 컬럼의 투과율은 2.5×10-14m2, 유속은 25µl/min, 60/40 v/v가 사용되었습니다. ACN/물. PMP 컬럼(ID 100×1.8mm)의 투과율은 이전 참고문헌 34 연구와 유사했습니다. 표면 다공성 입자로 채워진 컬럼의 투과율은 1.7×10 .6µm, 5µm 입자의 경우 2.5×10-14m2입니다. 따라서 PMP 상의 투과율은 크기가 5µm인 코어-쉘 입자의 투과율과 유사합니다.
여기서 Wx는 클로로포름으로 채워진 컬럼의 질량, Wy는 메탄올로 채워진 컬럼의 질량, ρ는 용매의 밀도입니다. 메탄올(ρ = 0.7866)과 클로로포름(ρ = 1.484)의 밀도입니다. 실리카-C18 입자 컬럼(100 × 1.8 mm ID)34과 이전에 연구한 C18-우레아31 컬럼의 총 기공률은 각각 0.63과 0.55였습니다. 이는 우레아 리간드의 존재가 고정상의 투과성을 감소시킨다는 것을 의미합니다. 반면, PMP 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)의 총 기공률은 0.60입니다. PMP 컬럼은 C18 결합 실리카 입자로 채워진 컬럼보다 투과성이 낮습니다. C18 유형 고정상에서 C18 리간드는 선형 사슬 형태로 실리카 입자에 부착되어 있는 반면, 폴리스티렌 유형 고정상에서 입자 주위에 비교적 두꺼운 폴리머가 형성되기 때문입니다. 층 A. 일반적인 실험에서 컬럼 다공성은 다음과 같이 계산됩니다.
그림 7A, B는 동일한 용출 조건, 60/40 ACN/H2O 및 0.1% TFA 20 µl/min~800 µl/min에서 PMP 컬럼(id 100 x 1.8 mm)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(id 100 x 1.8 mm)에 대한 Van Deemter 플롯을 보여줍니다. 두 컬럼 모두 최적 유속(80 µl/min)에서 최소 HETP 값은 PMP 컬럼의 경우 2.6 µm, Ascentis Express RP-Amide 컬럼의 경우 3.9 µm였습니다. HETP 값은 PMP 컬럼(id 100 x 1.8 mm)의 분리 효율이 시판 중인 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(id 100 x 1.8 mm)보다 훨씬 높음을 보여줍니다. 그림 7(A)의 반 딤터 그래프는 유량 증가에 따른 N 값 감소가 이전 연구와 비교하여 유의미하게 크지 않음을 보여줍니다. Ascentis Express RP-Amide 컬럼에 비해 PMP 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)의 분리 효율이 높은 것은 향상된 입자 모양과 크기, 그리고 본 연구에서 사용된 정교한 컬럼 충진 절차에 기인합니다34.
(A) 0.1% TFA가 포함된 60/40 ACN/H2O에서 PMP 컬럼(id 100 x 1.8 mm)에서 얻은 Van Deemter 플롯(HETP 대 이동상 선속도). (B) 0.1% TFA가 포함된 60/40 ACN/H2O에서 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(id 100 x 1.8 mm)에서 얻은 Van Deemter 플롯(HETP 대 이동상 선속도).
고성능 액체 크로마토그래피에서 합성 펩타이드와 인간 혈청 알부민(HSA)의 트립신 가수분해물 혼합물의 분리를 위해 삽입된 폴리스티렌의 극성 고정상을 제조하고 평가하였다. 펩타이드 혼합물에 대한 PMP 컬럼의 크로마토그래피 성능은 분리 효율과 분해능 측면에서 우수하다. PMP 컬럼의 분리 효율 향상은 실리카 입자 크기 및 기공 크기, 고정상 합성 제어, 그리고 복잡한 컬럼 충진재 등 여러 가지 이유에서 비롯된다. 높은 분리 효율 외에도, 이 고정상의 또 다른 장점은 높은 유속에서도 컬럼 배압이 낮다는 것이다. PMP 컬럼은 재현성이 뛰어나 펩타이드 혼합물 및 다양한 단백질의 트립신 분해 분석에 사용할 수 있다. 본 연구에서는 이 컬럼을 액체 크로마토그래피에서 천연물, 약용 식물 추출물, 버섯에서 생리활성 화합물을 분리하는 데 사용할 계획이다. 향후 단백질 및 단일클론 항체 분리에도 PMP 컬럼을 활용할 계획이다.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템 연구 1부: 컬럼 특성화를 위한 프로토콜 개발. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템 연구 1부: 컬럼 특성화를 위한 프로토콜 개발.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., 및 Petersson, P. 역상 크로마토그래피를 이용한 펩타이드 분리 시스템 연구, 1부: 컬럼 특성 분석을 위한 프로토콜 개발. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템 연구 1부: 컬럼 특성에 대한 프로토콜 개발. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템 연구 1부: 컬럼 특성에 대한 프로토콜 개발.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., 및 Petersson, P. 역상 크로마토그래피를 이용한 펩타이드 분리 시스템 연구, 1부: 컬럼 특성 분석을 위한 프로토콜 개발.J.color谱법。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
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