고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 초고성능 액체 크로마토그래피(HPLC 및 UHPLC) 시스템의 엄격한 요구 사항을 충족하도록 특별히 설계된 혁신적인 신형 인라인 정적 믹서가 개발되었습니다. 두 개 이상의 이동상이 제대로 혼합되지 않으면 신호 대 잡음비가 높아져 감도가 저하될 수 있습니다. 정적 믹서의 최소 내부 부피와 물리적 치수로 두 개 이상의 유체를 균일하게 정적 혼합하는 것은 이상적인 정적 믹서의 최고 기준을 제시합니다. 새로운 정적 믹서는 새로운 3D 프린팅 기술을 사용하여 혼합물의 단위 내부 부피당 기본 사인파를 가장 많이 감소시키는 향상된 유체역학적 정적 혼합을 제공하는 고유한 3D 구조를 만들어 이를 달성합니다. 기존 믹서의 내부 부피의 1/3을 사용하면 기본 사인파가 98% 감소합니다. 이 믹서는 유체가 복잡한 3D 형상을 통과함에 따라 단면적과 경로 길이가 달라지는 상호 연결된 3D 흐름 채널로 구성됩니다. 여러 개의 구불구불한 유동 경로를 따라 혼합하고, 국부적인 난류와 와류를 결합하면 미시적, 중간적, 거시적 규모에서 혼합이 이루어집니다. 이 독특한 믹서는 전산유체역학(CFD) 시뮬레이션을 사용하여 설계되었습니다. 제시된 시험 데이터는 최소 내부 용적으로 탁월한 혼합이 달성됨을 보여줍니다.
30년 이상 액체 크로마토그래피는 제약, 살충제, 환경 보호, 법의학, 화학 분석 등 다양한 산업 분야에서 사용되어 왔습니다. 백만 분의 일(ppm) 이하로 측정할 수 있는 능력은 모든 산업의 기술 발전에 매우 중요합니다. 혼합 효율이 낮으면 신호 대 잡음비가 낮아져 검출 한계와 감도 측면에서 크로마토그래피 업계에 큰 부담이 됩니다. 두 가지 HPLC 용매를 혼합할 때, 일부 용매는 잘 혼합되지 않기 때문에 두 용매를 균질화하기 위해 외부 수단을 사용하여 강제로 혼합해야 하는 경우가 있습니다. 용매가 완전히 혼합되지 않으면 HPLC 크로마토그램의 품질이 저하되어 과도한 베이스라인 노이즈 및/또는 불량한 피크 모양으로 나타날 수 있습니다. 혼합이 불량하면 베이스라인 노이즈가 시간이 지남에 따라 검출기 신호의 사인파(상승 및 하강)로 나타납니다. 또한, 혼합 불량은 피크의 폭이 넓어지고 비대칭성을 유발하여 분석 성능, 피크 모양 및 피크 분해능을 저하시킬 수 있습니다. 업계에서는 인라인 및 티 정적 혼합기가 이러한 한계를 개선하고 사용자가 더 낮은 검출 한계(감도)를 달성할 수 있는 방법임을 인식하고 있습니다. 이상적인 정적 혼합기는 높은 혼합 효율, 낮은 데드 볼륨, 낮은 압력 강하의 이점과 최소 볼륨 및 최대 시스템 처리량을 결합합니다. 또한, 분석이 더욱 복잡해짐에 따라 분석자는 더 극성이 높고 혼합하기 어려운 용매를 일상적으로 사용해야 합니다. 이는 향후 테스트를 위해 더 나은 혼합이 필수적임을 의미하며, 우수한 혼합기 설계 및 성능에 대한 필요성이 더욱 커지고 있습니다.
Mott는 최근 30µl, 60µl, 90µl의 세 가지 내부 용량을 갖춘 특허받은 PerfectPeakTM 인라인 정적 믹서의 새로운 제품군을 개발했습니다. 이 크기는 향상된 혼합과 낮은 분산이 필요한 대부분의 HPLC 테스트에 필요한 용량 범위와 혼합 특성을 포괄합니다. 세 가지 모델 모두 직경이 0.5인치이며 컴팩트한 디자인으로 업계 최고의 성능을 제공합니다. 316L 스테인리스 스틸로 제작되었으며 불활성화를 위해 부동태화 처리되었지만 티타늄 및 기타 내식성 및 화학적으로 불활성인 금속 합금도 제공됩니다. 이 믹서의 최대 작동 압력은 최대 20,000psi입니다. 그림 1a는 이 유형의 표준 믹서보다 더 작은 내부 용량을 사용하면서도 최대 혼합 효율을 제공하도록 설계된 60µl Mott 정적 믹서의 사진입니다. 이 새로운 정적 믹서 설계는 새로운 적층 제조 기술을 사용하여 크로마토그래피 산업에서 정적 혼합을 달성하기 위해 현재 사용되는 어떤 믹서보다 내부 유량을 적게 사용하는 고유한 3D 구조를 만듭니다. 이러한 믹서는 액체가 내부의 복잡한 기하학적 장벽을 통과할 때 단면적과 경로 길이가 서로 다른 상호 연결된 3차원 유동 채널로 구성됩니다.그림 1b는 입구와 출구에 산업 표준 10-32 나사산 HPLC 압축 피팅을 사용하고 특허받은 내부 믹서 포트의 파란색 음영 테두리가 있는 새로운 믹서의 개략도를 보여줍니다.내부 유동 경로의 단면적 차이와 내부 유동 체적 내 유동 방향의 변화는 난류 및 층류 영역을 생성하여 미시적, 중시적 및 거시적 규모에서 혼합을 유발합니다.이 독특한 믹서의 설계는 전산 유체 역학(CFD) 시뮬레이션을 사용하여 유동 패턴을 분석하고 사내 분석 테스트 및 고객 현장 평가를 위한 프로토타입 제작 전에 설계를 개선했습니다.적층 제조는 밀링 머신, 선반 등의 기존 가공 없이 CAD 도면에서 직접 3D 기하학적 구성 요소를 인쇄하는 프로세스입니다. 이 새로운 정적 믹서는 CAD 도면을 기반으로 믹서 본체를 제작하고 적층 제조를 통해 부품을 층층이 제작(프린팅)하는 공정을 사용하여 제작되도록 설계되었습니다. 약 20마이크론 두께의 금속 분말 층을 증착하고, 컴퓨터 제어 레이저를 사용하여 분말을 선택적으로 용융시켜 고체 형태로 융합합니다. 이 분말 층 위에 또 다른 층을 도포하고 레이저 소결을 적용합니다. 부품이 완전히 완성될 때까지 이 공정을 반복합니다. 그런 다음 레이저 접합되지 않은 부품에서 분말을 제거하여 원본 CAD 도면과 일치하는 3D 프린팅 부품을 만듭니다. 최종 제품은 미세유체 공정과 다소 유사하지만, 주요 차이점은 미세유체 부품이 일반적으로 2차원(평면)인 반면, 적층 제조를 사용하면 복잡한 유동 패턴을 3차원 형상으로 구현할 수 있다는 것입니다. 이 수도꼭지는 현재 316L 스테인리스 스틸과 티타늄 소재의 3D 프린팅 부품으로 제공됩니다. 대부분의 금속 합금, 폴리머 및 일부 세라믹 소재를 이 공정을 사용하여 부품을 제작할 수 있으며, 향후 설계/제품에 적용될 예정입니다.
쌀. 1. 90 μl Mott 정적 믹서의 사진 (a)와 다이어그램 (b)는 믹서 유체 흐름 경로의 단면을 파란색으로 표시했습니다.
설계 단계에서 정적 믹서 성능에 대한 전산유체역학(CFD) 시뮬레이션을 실행하여 효율적인 설계를 개발하고 시간과 비용이 많이 드는 시행착오 실험을 줄입니다. COMSOL Multiphysics 소프트웨어 패키지를 사용하여 정적 믹서 및 표준 배관(믹서 미사용 시뮬레이션)의 CFD 시뮬레이션을 수행합니다. 압력 구동 층류 유체역학을 사용하여 부품 내 유체 속도와 압력을 파악하는 모델링을 수행합니다. 이동상 화합물의 화학적 이동과 결합된 이 유체역학은 두 가지 다른 농축 액체의 혼합을 이해하는 데 도움이 됩니다. 비교 가능한 해를 찾는 동안 계산의 용이성을 위해 이 모델은 10초에 해당하는 시간의 함수로 연구됩니다. 이론 데이터는 포인트 프로브 투영 도구를 사용한 시간 상관 연구에서 얻었으며, 출구 중앙의 지점을 데이터 수집 지점으로 선택했습니다. CFD 모델과 실험 테스트에서는 비례 샘플링 밸브와 펌핑 시스템을 통해 두 가지 다른 용매를 사용하여 샘플링 라인의 각 용매에 대한 교체 플러그를 사용했습니다. 이 용매들은 정적 믹서에서 혼합됩니다. 그림 2와 3은 각각 표준 파이프(믹서 없음)와 Mott 정적 믹서를 통한 유동 시뮬레이션을 보여줍니다. 그림 2와 같이 정적 믹서가 없는 상태에서 물과 순수 아세토니트릴을 번갈아 가며 튜브에 연결하는 개념을 보여주기 위해 길이 5cm, 내경 0.25mm의 직관에서 시뮬레이션을 수행했습니다. 시뮬레이션은 튜브와 믹서의 정확한 치수와 0.3ml/min의 유속을 사용했습니다.
쌀. 2. HPLC 튜브, 즉 믹서가 없는 상태에서 발생하는 현상을 나타내기 위해 내경 0.25mm의 5cm 튜브에서 CFD 유동을 시뮬레이션했습니다. 빨간색은 물의 질량 분율을 나타냅니다. 파란색은 물이 없는 상태, 즉 순수한 아세토니트릴을 나타냅니다. 두 가지 액체가 교대로 흐르는 플러그 사이에서 확산 영역을 볼 수 있습니다.
쌀. 3. COMSOL CFD 소프트웨어 패키지로 모델링한 30ml 용량의 정적 혼합기. 범례는 혼합기 내 물의 질량 분율을 나타냅니다. 순수한 물은 빨간색, 순수한 아세토니트릴은 파란색으로 표시되어 있습니다. 시뮬레이션된 물의 질량 분율 변화는 두 액체의 혼합 색상 변화로 표현됩니다.
그림 4는 혼합 효율과 혼합 부피 간의 상관관계 모델에 대한 검증 연구를 보여줍니다. 혼합 부피가 증가하면 혼합 효율도 증가합니다. 저자들이 아는 한, 이 CFD 모델에서는 믹서 내부에 작용하는 다른 복잡한 물리적 힘을 고려할 수 없으므로 실험 시험에서 혼합 효율이 더 높아집니다. 실험 혼합 효율은 기저 사인파의 감소율로 측정되었습니다. 또한, 배압이 증가하면 일반적으로 혼합 수준이 높아지는데, 이는 시뮬레이션에서는 고려되지 않습니다.
다음 HPLC 조건과 테스트 설정을 사용하여 원시 사인파를 측정하여 다양한 정적 믹서의 상대적 성능을 비교했습니다. 그림 5의 다이어그램은 일반적인 HPLC/UHPLC 시스템 레이아웃을 보여줍니다. 정적 믹서는 펌프 바로 뒤, 주입기 및 분리 컬럼 앞에 믹서를 배치하여 테스트했습니다. 대부분의 배경 사인파 측정은 정적 믹서와 UV 검출기 사이에 있는 주입기와 모세관 컬럼을 우회하여 수행됩니다. 신호 대 잡음비(SNR) 평가 및/또는 피크 모양 분석 시 시스템 구성은 그림 5에 나와 있습니다.
그림 4. 다양한 정적 믹서의 혼합 효율 대 혼합 부피 그래프. 이론적인 불순물은 실험적인 불순물 데이터와 동일한 경향을 보이며, 이는 CFD 시뮬레이션의 타당성을 확인시켜 줍니다.
이 테스트에 사용된 HPLC 시스템은 Chemstation 소프트웨어를 실행하는 PC로 제어되는 UV 검출기가 장착된 Agilent 1100 시리즈 HPLC였습니다.표 1은 두 가지 사례 연구에서 기본 사인파를 모니터링하여 믹서 효율을 측정하기 위한 일반적인 튜닝 조건을 보여줍니다.실험 테스트는 두 가지 다른 용매 예에서 수행되었습니다.케이스 1에서 혼합된 두 용매는 용매 A(탈이온수에 20 mM 아세트산 암모늄)와 용매 B(80% 아세토니트릴(ACN)/20% 탈이온수)였습니다.케이스 2에서 용매 A는 탈이온수에 0.05% 아세톤(라벨)을 넣은 용액이었습니다.용매 B는 80/20% 메탄올과 물을 섞은 것입니다.케이스 1에서 펌프는 0.25 ml/min ~ 1.0 ml/min의 유량으로 설정되었고,케이스 2에서 펌프는 1 ml/min의 일정한 유량으로 설정되었습니다. 두 경우 모두 용매 A와 B의 혼합물 비율은 A가 20%, B가 80%였습니다. 케이스 1에서는 검출기를 220nm로 설정하였고, 케이스 2에서는 아세톤의 최대 흡수 파장을 265nm로 설정하였습니다.
표 1. 케이스 1 및 2에 대한 HPLC 구성 케이스 1 케이스 2 펌프 속도 0.25ml/min ~ 1.0ml/min 1.0ml/min 용매 A 탈이온수에 20mM 아세트산 암모늄 탈이온수에 0.05% 아세톤 용매 B 80% 아세토니트릴(ACN) / 20% 탈이온수 80% 메탄올 / 20% 탈이온수 용매 비율 20% A / 80% B 20% A / 80% B 검출기 220nm 265nm
6. 신호의 기준선 드리프트 성분을 제거하기 위해 저역 통과 필터를 적용하기 전과 후에 측정한 혼합 사인파의 플롯.
그림 6은 Case 1에서 혼합된 베이스라인 잡음의 전형적인 예이며, 베이스라인 드리프트 위에 반복되는 사인파 패턴이 중첩되어 나타납니다. 베이스라인 드리프트는 배경 신호의 느린 증가 또는 감소입니다. 시스템이 충분히 오랫동안 평형을 이루지 못하면 일반적으로 감소하지만, 시스템이 완전히 안정된 경우에도 불규칙적으로 드리프트됩니다. 이러한 베이스라인 드리프트는 시스템이 가파른 경사 또는 높은 역압 조건에서 작동할 때 증가하는 경향이 있습니다. 이러한 베이스라인 드리프트가 있는 경우 샘플 간 결과를 비교하기 어려울 수 있으며, 원시 데이터에 저역 통과 필터를 적용하여 저주파 변동을 필터링함으로써 평탄한 베이스라인을 갖는 진동 플롯을 얻을 수 있습니다. 그림 6은 또한 저역 통과 필터를 적용한 후 믹서의 베이스라인 잡음 플롯을 보여줍니다.
CFD 시뮬레이션과 초기 실험 테스트를 완료한 후, 위에서 설명한 내부 구성 요소를 사용하여 30µl, 60µl, 90µl의 세 가지 내부 용량을 가진 세 대의 정적 믹서를 개발했습니다. 이 범위는 저진폭 기준선을 생성하기 위해 향상된 혼합 및 저분산이 요구되는 저분석물 HPLC 응용 분야에 필요한 용량 및 혼합 성능 범위를 포함합니다. 그림 7은 세 가지 용량의 정적 믹서를 사용하고 믹서를 설치하지 않은 경우, 예 1의 테스트 시스템(추적자로 아세토니트릴과 아세트산 암모늄)에서 얻은 기본 사인파 측정값을 보여줍니다. 그림 7에 제시된 결과에 대한 실험 테스트 조건은 용매 유속 0.5ml/min에서 표 1에 설명된 절차에 따라 4회 테스트 모두 일정하게 유지되었습니다. 데이터 세트에 오프셋 값을 적용하여 신호 중복 없이 나란히 표시할 수 있습니다. 오프셋은 믹서의 성능 수준을 판단하는 데 사용되는 신호의 진폭에 영향을 미치지 않습니다. 믹서가 없을 때의 평균 사인파 진폭은 0.221 mAi였지만, 30 µl, 60 µl 및 90 µl에서 정적 Mott 믹서의 진폭은 각각 0.077, 0.017 및 0.004 mAi로 떨어졌습니다.
그림 7. 케이스 1(아세토니트릴과 아세트산 암모늄 지시약)의 HPLC UV 검출기 신호 오프셋 대 시간. 믹서 없이 용매를 혼합한 경우, 30µl, 60µl 및 90µl Mott 믹서를 사용한 경우 정적 믹서의 볼륨이 증가함에 따라 혼합이 개선됨(신호 진폭 감소)을 보여줍니다. (실제 데이터 오프셋: 0.13(믹서 없음), 더 나은 표시를 위해 0.32, 0.4, 0.45mA).
그림 8에 표시된 데이터는 그림 7과 동일하지만 이번에는 내부 용적이 50µl, 150µl 및 250µl인 일반적으로 사용되는 세 가지 HPLC 정적 믹서의 결과가 포함됩니다.Rice.그림 8. 정적 믹서 없이 용매를 혼합한 경우, 새로운 Mott 정적 믹서 시리즈 및 세 가지 기존 믹서를 사용한 경우(실제 데이터 오프셋은 더 나은 표시 효과를 위해 각각 0.1(믹서 없음), 0.32, 0.48, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9mA임)에 대한 HPLC UV 검출기 신호 오프셋 대 시간 플롯입니다.기본 사인파의 감소 백분율은 믹서가 설치되지 않은 경우의 진폭에 대한 사인파의 진폭의 비율로 계산됩니다. 사례 1과 2에 대해 측정된 사인파 감쇠 백분율은 새로운 정적 믹서와 업계에서 일반적으로 사용되는 7개의 표준 믹서의 내부 용적과 함께 표 2에 나열되어 있습니다.그림 8과 9의 데이터와 표 2에 제시된 계산은 Mott 정적 믹서가 이러한 테스트 조건에서 기존 HPLC 믹서의 성능을 훨씬 능가하는 최대 98.1%의 사인파 감쇠를 제공할 수 있음을 보여줍니다.그림 9. 정적 믹서 없음(결합), 새로운 Mott 정적 믹서 시리즈 및 2개의 기존 믹서를 보여주는 사례 2(추적자로 메탄올과 아세톤)에 대한 HPLC UV 검출기 신호 오프셋 대 시간 플롯(실제 데이터 오프셋은 0, 11(믹서 없음), 0.22, 0.3, 0.35mA 및 더 나은 표시를 위한 것입니다).업계에서 일반적으로 사용되는 7개의 믹서도 평가했습니다. 여기에는 회사 A(믹서 A1, A2, A3)의 내부 용량이 서로 다른 세 가지 믹서와 회사 B(믹서 B1, B2, B3)가 포함됩니다. 회사 C는 한 가지 크기만 지정되었습니다.
표 2. 정적 믹서 교반 특성 및 내부 용적 정적 믹서 사례 1 사인파 회수: 아세토니트릴 시험(효율) 사례 2 사인파 회수: 메탄올 물 시험(효율) 내부 용적(µl) 믹서 없음 – - 0 Mott 30 65% 67.2% 30 Mott 60 92.2% 91.3% 60 Mott 90 98.1% 97.5% 90 믹서 A1 66.4% 73.7% 50 믹서 A2 89.8% 91.6% 150 믹서 A3 92.2% 94.5% 250 믹서 B1 44.8% 45.7% 9 35 믹서 B2 845.% 96.2% 370 믹서 C 97.2% 97.4% 250
그림 8과 표 2의 결과를 분석한 결과, 30 µl Mott 정적 믹서는 A1 믹서와 동일한 혼합 효율, 즉 50 µl를 가지고 있지만 30 µl Mott는 내부 용적이 30% 적습니다. 60 µl Mott 믹서를 150 µl 내부 용적 A2 믹서와 비교했을 때 혼합 효율이 89%에 비해 92%로 약간 개선되었지만 더 중요한 것은 이 더 높은 수준의 혼합이 믹서 용적의 1/3에서 달성되었다는 것입니다. 유사한 믹서 A2. 90 µl Mott 믹서의 성능은 내부 용적이 250 µl인 A3 믹서와 동일한 추세를 따랐습니다. 내부 용적이 3배 감소한 상태에서도 혼합 성능이 98%와 92% 향상되었습니다. 믹서 B와 C에 대해서도 유사한 결과와 비교가 얻어졌습니다. 그 결과, 새로운 정적 믹서 시리즈인 Mott PerfectPeakTM은 경쟁사의 믹서보다 더 높은 혼합 효율을 제공하지만 내부 용적은 더 작아 더 나은 배경 잡음과 더 나은 신호 대 잡음비, 더 나은 분석물 감도, 피크 모양 및 피크 분해능을 제공합니다. Case 1과 Case 2 연구 모두에서 혼합 효율의 유사한 경향이 관찰되었습니다. Case 2의 경우, (메탄올과 아세톤을 지표로) 60ml Mott, 비슷한 믹서 A1(내부 용적 50µl) 및 비슷한 믹서 B1(내부 용적 35µl)의 혼합 효율을 비교하기 위해 테스트를 수행했습니다. 믹서를 설치하지 않으면 성능이 좋지 않았지만 기준 분석에 사용되었습니다. 60ml Mott 믹서는 혼합 효율이 90% 증가하여 테스트 그룹에서 가장 우수한 믹서임이 입증되었습니다. 비슷한 믹서 A1은 혼합 효율이 75% 향상되었고, 비슷한 B1 믹서는 45% 향상되었습니다. 영어: Case 1의 사인 곡선 테스트와 동일한 조건에서 유량만 변경하여 일련의 믹서에서 유량에 따른 기본 사인파 감소 테스트를 수행했습니다.데이터는 0.25~1ml/min의 유량 범위에서 사인파의 초기 감소가 세 믹서 볼륨 모두에서 비교적 일정하게 유지되었음을 보여주었습니다.두 개의 작은 볼륨 믹서의 경우 유량이 감소함에 따라 사인파 수축이 약간 증가하는데, 이는 믹서에서 용매의 체류 시간이 증가하여 확산 혼합이 증가하기 때문으로 예상됩니다.사인파의 빼기는 유량이 더 감소함에 따라 증가할 것으로 예상됩니다.그러나 사인파 기저 감쇠가 가장 높은 가장 큰 믹서 볼륨의 경우 사인파 기저 감쇠는 거의 변하지 않았으며(실험적 불확실성 범위 내) 값은 95%~98%였습니다.쌀. 10. 사례 1에서 유량에 따른 사인파의 기본 감쇠. 이 시험은 아세토니트릴과 물의 80/20 혼합물의 80%와 20 mM 아세트산 암모늄의 20%를 주입하여 가변 유량을 사용하는 사인 시험과 유사한 조건에서 수행되었습니다.
새롭게 개발된 특허받은 PerfectPeakTM 인라인 정적 믹서 제품군은 30µl, 60µl, 90µl의 세 가지 내부 용량을 제공하며, 향상된 혼합 성능과 낮은 분산 플로어를 요구하는 대부분의 HPLC 분석에 필요한 용량 및 혼합 성능 범위를 충족합니다. 새로운 정적 믹서는 새로운 3D 프린팅 기술을 사용하여 독특한 3D 구조를 만들어 유체역학적 정적 혼합 성능을 향상시키고 내부 혼합물의 단위 부피당 베이스 노이즈를 가장 높은 비율로 줄임으로써 이를 달성합니다. 기존 믹서의 내부 용량의 1/3을 사용하여 베이스 노이즈를 98%까지 줄였습니다. 이러한 믹서는 액체가 내부의 복잡한 기하학적 장벽을 통과할 때 단면적과 경로 길이가 서로 다른 상호 연결된 3차원 유동 채널로 구성됩니다. 새로운 정적 믹서 제품군은 경쟁 믹서보다 향상된 성능을 제공하지만, 내부 용량은 더 작아 신호 대 잡음비가 더 우수하고 정량 한계가 낮으며, 피크 모양, 효율 및 분해능이 향상되어 감도가 더 높아집니다.
이번 호에서는 크로마토그래피 - 환경 친화적인 RP-HPLC - 분석 및 정제 과정에서 아세토니트릴을 이소프로판올로 대체하기 위한 코어-셸 크로마토그래피의 활용 - 새로운 가스 크로마토그래피에 대해 다룹니다.
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