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Angustifolius lupine(NLL, Lupinus angustifolius L.)은 식량 생산과 토양 개량에 사용되는 콩과 식물입니다.작물로서 NLL의 세계적인 확장은 파괴적인 탄저병을 일으키는 루핀 탄저병을 포함하여 많은 병원성 진균을 유인했습니다.증가된 저항성을 부여하는 Lanr1과 AnMan의 두 대립 유전자가 NLL 육종에 사용되었지만 기본 분자 메커니즘은 알려지지 않았습니다.이 연구에서 Lanr1 및 AnMan 마커는 유럽 NLL 샘플을 스크리닝하는 데 사용되었습니다.통제된 환경에서 백신을 테스트한 결과 저항성 기증자 모두의 효능이 확인되었습니다.차등 유전자 발현 프로파일링은 대표적인 저항성 및 감수성 라인에서 수행되었습니다.탄저병 저항성은 유전자 온톨로지 용어 "GO:0006952 방어 반응", "GO:0055114 산화환원 과정" 및 "GO:0015979 광합성"의 과발현과 관련이 있었습니다.또한, Lanr1(83A:476) 계통은 접종 후 빠르게 중요한 전사체 재프로그래밍을 보인 반면, 다른 계통은 이 반응에서 약 42시간 지연을 보였다.방어 반응은 TIR-NBS, CC-NBS-LRR 및 NBS-LRR 유전자, 발병에 관여하는 10가지 단백질, 지질 전달 단백질, 엔도글루칸-1,3-β-글루코시다제, 글리신이 풍부한 세포벽 단백질 및 산소 반응 경로의 유전자와 관련이 있습니다.광합성과 관련된 유전자의 신중한 억제를 포함하여 83A:476에 대한 초기 반응은 곰팡이 생물학의 식물 성장 단계 동안 성공적인 보호와 일치하여 이펙터가 면역을 유발함을 시사합니다.전체 수평 항력과 마찬가지로 Mandeloop 반응이 느려집니다.
좁은 잎이 달린 루핀(NLL, Lupinus angustifolius L.)은 서부 지중해 지역이 원산지인 고단백 시리얼입니다1,2.현재 동물과 인간을 위한 식량 작물로 재배되고 있습니다.또한 공생 질소 고정 박테리아에 의한 질소 고정 및 토양 구조의 전반적인 개선으로 인해 윤작 시스템에서 녹비로 간주됩니다.NLL은 지난 세기에 급속한 가축화 과정을 거쳤으며 여전히 높은 번식 압력을 받고 있습니다3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.NLL의 광범위한 재배와 함께 병원성 진균의 연속은 새로운 농업 적소를 개발하고 새로운 작물 파괴 질병을 일으켰습니다. 루핀 농부와 육종가에게 가장 주목할만한 것은 병원성 진균인 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다. 루핀 농부와 육종가에게 가장 주목할만한 것은 병원성 진균인 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люpinа было появление antraknoза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. 루핀 농부들과 육종가들에게 가장 주목할만한 것은 병원성 진균 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 유발된 탄저병의 출현이었습니다.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini(Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люpinа является появление antraknoза, вызываемого патогенным грибком 콜 etotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. 루핀 농부와 육종가에게 가장 충격적인 것은 병원성 진균 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현입니다.이 질병에 대한 가장 초기 보고는 브라질과 미국에서 왔으며 전형적인 증상은 각각 1912년과 1929년에 나타났습니다.그러나 약 30년 후 병원균은 Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz로 지정되었다. & Sacc., 완전형 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 완전형 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld의 완전형. & Sacc., 글로메렐라 신굴라타(Stoneman) Spauld. & Sacc., 글로메렐라 신굴라타(Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной morfoлогии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. 슈렌크,. & H. 슈렌크, .및 H. 슈렌크. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。및 H. Schlenk, .20세기 중반에 수행된 예비 질병 표현형 분석은 NLL 및 황색 루핀(L. luteus L.) 접근에서 약간의 저항성을 보였지만 테스트된 모든 흰색 루핀(L. albus L.) 접근은 매우 감수성이었습니다15,16.연구에 따르면 탄저병의 발병은 강수량(대기 습도) 및 온도(12-28°C 범위) 증가와 관련되어 고온에서 저항성을 위반하는 것으로 나타났습니다17, 18. 사실, 분생포자가 발아하고 질병이 시작되는 데 필요한 시간은 습도가 높은 조건에서 12°C(16시간)보다 24°C(4시간)에서 4배 더 짧았습니다19.따라서 현재 진행 중인 지구 온난화는 탄저병의 확산으로 이어졌습니다.그러나 이 질병은 프랑스(1982)와 우크라이나(1983)에서 임박한 위협의 전조로 관찰되었지만 당시 루핀 산업에서는 명백히 무시되었습니다20,21.몇 년 후, 이 파괴적인 질병은 전 세계로 퍼졌고 호주, 폴란드, 독일과 같은 주요 루핀 생산 국가에도 영향을 미쳤습니다22,23,24.1990년대 중반에 탄저병 발병 후 광범위한 스크리닝 결과 NLL19 샘플에서 여러 저항성 기증자가 확인되었습니다.탄저병에 대한 NLL 저항성은 서로 다른 생식질 공급원에서 발견되는 두 개의 분리된 지배적 대립유전자에 의해 조절됩니다: Tanjil 품종의 Lanr1과 품종의 Wonga 및 AnMan.Mandalay 25, 26. 이러한 대립유전자는 육종 프로그램25,26,27,28,29,30에서 저항성 생식질 선택을 지원하는 분자 마커를 보완합니다.Lanr1 대립유전자를 보유하는 저항성 육종 계통 83A:476을 감수성 야생 계통 P27255와 교배하여 탄저병 저항성에 대해 분리하는 RIL 개체군을 얻었고, 이를 통해 Lanr1 유전자좌를 염색체 NLL-1131, 32, 33에 할당할 수 있었습니다. 게놈 프레임워크를 사용하여 인접 저항성 유전자좌에서 탄저병에 대한 연결 지도 마커의 정렬, NLL은 동일한 염색체(NLL-11)이지만 위치가 다릅니다29,34,35.그러나 적은 수의 RIL과 마커와 해당 대립유전자 사이의 유전적 거리가 크기 때문에 기본 유전자에 대해 신뢰할 수 있는 결론을 도출할 수 없습니다.한편, 루핀에서 역유전학을 사용하는 것은 재생 가능성이 매우 낮기 때문에 어렵기 때문에 유전자 조작이 번거롭습니다37.
83A:476(Lanr1) 및 Mandelup(AnMan)과 같은 동형접합 상태에서 원하는 대립유전자를 갖는 길들여진 생식질의 개발은 야생 개체군에서 반대되는 대립유전자 조합의 존재에 직면하여 탄저병 저항성을 연구할 수 있는 문을 열었습니다.분자 메커니즘의 가능성.특정 유전자형에 의해 생성된 방어 반응을 비교합니다.이 연구는 C. lupini 백신 접종에 대한 NLL의 초기 transcriptome 반응을 평가했습니다.먼저, Lanr1 및 AnMan 대립유전자를 표시하는 분자 마커를 사용하여 215개 라인을 포함하는 유럽 NLL 생식질 패널을 스크리닝했습니다.탄저병 표현형 분석은 제어된 조건 하에서 이전에 분자 마커로 선택된 50개의 NLL 라인에서 수행되었습니다.이러한 실험을 기반으로 탄저병 저항성과 Lanr1/AnMan 대립형질 조성이 다른 4개의 계통이 두 가지 상보적인 접근법인 고처리량 RNA 시퀀싱 및 실시간 PCR 정량화를 사용하여 차등 방어 유전자 발현 프로파일링을 위해 선택되었습니다.
마커 Lanr1(Anseq3 및 Anseq4) 및 AnMan(Anseq4) 및 AnMan(AnManM1)을 사용하여 NLL 생식질 세트(N = 215)를 스크리닝한 결과 단 하나의 라인(95726, Salamanca-b 근처)이 모든 마커에 대한 "저항성" 대립유전자를 증폭하는 반면, "'감수성' 대립유전자의 존재"는 158(~73. 5%) 라인.13개의 라인은 Lanr1 마커의 2개의 "저항성" 대립유전자를 생성하였고, 8개의 라인은 Lanr1의 "저항성" 대립유전자를 생성하였다.채점자.AnMan 마커의 "저항성" 대립유전자(보충 표 S1).2개의 계통은 Anseq3 마커에 대해 이형접합이었고 하나는 AnManM1 마커에 대해 이형접합이었다.42개 라인(19.5%)은 Anseq3 및 Anseq4 대립유전자의 반대 위상을 가지고 있으며, 이는 이 두 유전자좌 사이의 높은 재조합 빈도를 나타냅니다.통제된 조건 하에서 탄저병 표현형(보충 표 S2)은 탄저병의 중증도에 반영된 테스트된 유전자형의 저항성에 가변성을 나타냈습니다.평균 점수의 차이는 1.8(보통 저항성)에서 6.9(감수성)까지 범위였으며 식물 무게 차이는 0.62(감수성)에서 4.45g(저항성) 범위였습니다. 실험의 두 복제에서 관찰된 값(질병 심각도 점수의 경우 0.51, 식물 중량의 경우 P = 0.00017 및 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개 변수(-0.59 및 -0.77, P < 0.0001) 사이에 유의한 상관 관계가 있었습니다. 실험의 두 복제에서 관찰된 값(질병 중증도 점수의 경우 0.51, 식물 중량의 경우 P = 0.00017 및 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개 변수(-0.59 및 -0.77, P < 0.0001) 사이에 유의한 상관 관계가 있었습니다. Выявлена ​​достоверная корrelяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 및 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 및 -0,77, Р < 0,0001) 0, 0001). 두 번의 실험 반복에서 관찰된 값(질병 중증도 점수의 경우 0.51, 식물 중량의 경우 P = 0.00017 및 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개변수(-0.59 및 -0.77, P < 0.0001) 사이에 유의한 상관 관계가 발견되었습니다(0.0001).에서 两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51，P=0.00017，植物重量为0.61，P<0.0001）以及这两个参数之间(- 0.59 와 - 0.77, P < 0.0001).에서 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 (疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0.51 , p = 0.00017 , 植物 为 为0.61 ， p <0.0001) 以及 两 个 参数之间 (（（（-0.59 和–0.59 和–0.59 和–0.59 和-0.77，P<0.0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 및 Mасса растения 0,61, P <0,0001), 및 между этими двумя параметрами (-0,59 및 -0,0001) 0,77, P <0,0001. 중복으로 관찰된 값(질병 중증도 점수 0.51, P = 0.00017 및 식물 중량 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개변수(-0.59 및 -0 .0001) 사이에 0.77, P<0.0001 사이에 유의한 상관관계가 있었습니다. ).감수성 식물에서 볼 수 있는 전형적인 증상은 "shepherd's bow" 구조와 유사한 줄기의 뒤틀림과 뒤틀림을 포함하며, 주황색/분홍색 스포로조이트가 있는 타원형 병변이 뒤따릅니다(보충 그림 1).Lanr1(83A:476 및 Tanjil) 및 AnMan(Mandelup) 유전자를 보유하는 호주 가입은 중간 정도의 저항성을 나타냅니다(0.0331 및 0.0036)."저항성" Lanr1 및/또는 AnMan 대립유전자도 포함하는 일부 계통은 질병의 증상을 나타냅니다.
흥미롭게도 "내성" 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통은 Boregine(두 매개변수에 대해 P 값 < 0.0001), Bojar(점수에 대해 P 값 < 0.0001, 식물 무게에 대해 0.001) 및 Population B-549/79b(점수에 대해 P 값 < 0.0001 및 무게에 중요하지 않음). 흥미롭게도 "내성" 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통은 Boregine(두 매개변수에 대해 P 값 < 0.0001), Bojar(점수에 대해 P 값 < 0.0001, 식물 무게에 대해 0.001) 및 Population B-549/79b(점수에 대해 P 값 < 0.0001 및 무게에 중요하지 않음). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчи вости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих пар аметров), Bojar(значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для масы растения) 및 популяции B-549/79b(значение P <0,0001 для оценки и нез начимо для массы). 흥미롭게도, '내성' 마커 대립유전자가 결여된 몇몇 NLL 계통은 Boregine(두 매개변수에 대해 P 값 < 0.0001), Bojar(평가의 경우 P 값 < 0.0001, 식물 무게의 경우 0.001) 및 모집단 B-549/79b(평가의 경우 P 값 < 0.0001)와 같이 탄저병에 대한 높은 수준의 저항성을 나타냈습니다(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 비슷하거나 더 높음). 무게에는 중요하지 않음).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan 基因型相当或更高），例如Boreg ine(两个参数的P 值< 0.0001), Bojar(P 值<得分为0.0001, 생물중량 为0.001) 및 种群B-549/79b(得分P值< 0.0001, 중량불량). "항원성" 마커가 없는 일부 NLL 시스템은 Boregine(두 매개변수 P < 0.0001), Bojar(P 값 < 0.0001, 식물 무게 0.001) 및 균주 B-549/79b(P 값 < 0.0001, 무게 중요하지 않음)와 같이 높은 수평 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자 이상과 동일)을 나타내는 것이 흥미롭습니다. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчив ости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (зна чение P <0,0001, масса растения 0,001) 및 популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). 흥미롭게도 '저항성' 마커 대립유전자가 없는 일부 NLL 계통은 Boregine(두 매개변수 모두에 대한 P 값 <0.0001), Bojar(P 값 < 0.0001, 식물 무게 0.001) 및 개체군 B-549/79b(P 값 < 0.0001, 무게는 중요하지 않음)와 같이 높은 수준의 탄저병 저항성을 나타냈습니다(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 비슷하거나 더 높음). ).이 현상은 마커 유전자형과 질병 표현형(P 값이 ~0.42에서 ~0.98까지) 사이에 관찰된 상관관계 결여를 설명하는 새로운 저항의 유전적 원천의 가능성을 시사합니다.따라서 Kolmogorov-Smirnov 테스트는 탄저병 저항성에 대한 데이터가 점수(P-값 0.25 및 0.11) 및 식물 질량(P-값 0.47 및 0.55)에 대해 대략적으로 정규 분포를 나타내는 것으로 나타나 Lanr1 및 AnMan보다 더 많은 대립유전자가 관련되어 있다고 가정합니다.
탄저병 저항성 스크리닝 결과에 따라 transcriptome 분석을 위해 83A:476, Boregine, Mandelup 및 Population 22660의 4개 계통을 선택했습니다. 이들 계통은 이전 테스트에서와 동일한 조건으로 RNA sequencing에 의한 접종 실험에서 탄저병 저항성에 대해 다시 테스트되었습니다.점수 값은 다음과 같다: Boregin(1.71±1.39), 83A: 476(2.09±1.38), Mandelup(3.82±1.42) 및 모집단 22660(6.11±1.29).
Illumina NovaSeq 6000 프로토콜은 샘플당 평균 40.5Mread 쌍(29.7~54.4Mread)을 달성했습니다(보충 표 S3).참조 시퀀스의 정렬 점수 범위는 75.5%에서 88.6%입니다.생물학적 복제 사이의 실험 변이 사이의 판독 횟수 데이터의 평균 상관 관계는 0.812에서 0.997(평균 0.959) 범위였습니다. 분석된 35,170개의 유전자 중 2917개는 발현되지 않았으며 나머지 4785개 유전자는 무시할 수 있는 수준(기본 평균 < 5)으로 발현되었습니다. 분석된 35,170개의 유전자 중 2917개는 발현되지 않았으며 나머지 4785개 유전자는 무시할 수 있는 수준(기본 평균 < 5)으로 발현되었습니다. Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительн ом уровне (базовое среднее <5). 분석된 35,170개 유전자 중 2917개는 발현되지 않았으며 나머지 4785개 유전자는 무시할 수 있는 수준(기본 평균 <5)으로 발현되었습니다.에서 分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительну экспрессию (базо вое среднее значение <5). 분석된 35,170개 유전자 중 2917개는 발현되지 않았고 나머지 4785개 유전자는 무시할만한 수준의 발현을 보였습니다(기본 평균 <5).따라서, 실험 동안 발현된 것으로 간주되는 유전자의 수(기본 평균 ≥ 5)는 27,468(78.1%)이었다(보충 표 S4).
첫 번째 시점부터 모든 NLL 계통은 전사체를 재프로그래밍하여 C. lupini(균주 Col-08)의 접종에 반응했지만(표 1), 계통 간에 상당한 차이가 관찰되었습니다.따라서, 저항 라인 83A:476(Lanr1 유전자 보유)은 이 시점에서 다른 시점에 비해 분리된 업 및 다운 유전자의 수가 31-69배 증가하여 첫 번째 시점(6hpi)에서 상당한 전사체 재프로그래밍을 보여주었습니다.또한, 이 피크는 두 번째 시점(12hpi)에서 몇 개의 유전자 발현만 크게 변경되었기 때문에 수명이 짧았습니다.흥미롭게도, 이식편 테스트에서도 높은 수준의 저항성을 보인 Boregine은 실험 중에 이러한 대규모 전사 재프로그래밍을 거치지 않았습니다.그러나 차별적으로 발현된 유전자(DEG)의 수는 12 HPI에서 Boregine과 83A:476에서 동일했습니다.Mandelup과 모집단 22660 모두 마지막 시점(48 l/s)에서 DEG 피크를 보여 방어 반응이 상대적으로 지연되었음을 나타냅니다.
83A:476은 다른 모든 라인과 비교하여 6 HPI에서 C. lupini에 대한 반응으로 대규모 전사체 재프로그래밍을 수행했기 때문에 이 시점에서 관찰된 DEG의 ~91%는 계통 특이적이었습니다(그림 1).그러나 Boregine, Mandelup 및 모집단 22660에서 각각 68.5%, 50.9% 및 52.6% DEG가 특정 시점에서 83A:476에서 발견된 것과 겹침으로써 연구 라인 사이의 초기 응답에서 약간의 겹침이 있었습니다.그러나 이러한 DEG는 현재 83A:476을 사용하여 감지된 모든 DEG의 작은 부분(0.97–1.70%)만을 차지했습니다.또한 식물 방어 반응의 공통 구성 요소인 지질 전달 단백질(TanjilG_32225), 엔도글루칸-1,3-β-글루코시드 효소(TanjilG_23384), SAM22(TanjilG_31528 및 TanjilG_31531)와 같은 두 가지 스트레스 유발 단백질, 기본 라텍스 단백질(TanjilG_32352) 및 2개의 글리신이 풍부한 구조적 세포벽 단백질(TanjilG_19701 및 TanjilG_19702).또한 24 HPI(총 16-38% DEG)에서 83A:476과 Boregine 사이 및 48 HPI(총 14-20% DEG)에서 Mandelup과 Population 22660 사이에 트랜스크립톰 반응에서 상대적으로 높은 중첩이 있었습니다.
Colletotrichum lupini(1999년 폴란드 Wierzhenice의 루핀 밭에서 얻은 균주 Col-08)로 접종된 좁은 잎이 달린 루핀(NLL) 계통에서 차별적으로 발현된 유전자(DEG)의 수를 보여주는 벤 다이어그램.분석된 NLL 계통은 83A:476(내성, Lanr1 대립 유전자 보유), Boregine(내성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 내성, AnMan 대립 유전자 보유) 및 인구 22660(매우 감수성 있음)이었습니다.약어 hpi는 예방접종 후 시간을 의미합니다.그래프를 단순화하기 위해 0 값이 제거되었습니다.
6 hpi에서 과발현된 유전자 세트를 표준 R 유전자 도메인의 존재에 대해 분석했습니다(보충 표 S7).이 연구는 83A:476에서만 NBS-LRR 도메인을 가진 고전적인 질병 저항성 유전자의 전사체 유도를 밝혔습니다.이 세트는 1개의 TIR-NBS-LRR 유전자(tanjilg_05042), 5개의 CC-NBS-LRR 유전자(tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 및 tanjilg_16162), 4개의 NBS-LR, Tanjilg_16162) 및 4개의 NBS-LRRE(tanjilg_161)로 구성되었습니다. 62) 및 Four NBS-Lrr(tanjilg_16162) 및 Four NBS-LRR(TANJILG_16162).이들 유전자 모두는 보존된 서열로 배열된 정규 도메인을 갖는다.NBS-LRR 도메인 유전자 외에도 여러 RLL 키나아제가 6 hpi에서 활성화되었습니다. 즉, Boregine(TanjilG_19877)에서 1개, Mandelup(TanjilG_07141 및 TanjilG_19877)에서 2개, 인구 22660(TanjilG_09014 및 TanjilG_10361)에서 2개, 83A 27:476에서 2개 .
C. lupini (Col-08 균주) 접종에 대한 반응으로 발현이 크게 변경된 유전자를 Gene Ontology (GO) 농축 분석 (보충 표 S8)에 적용했습니다. 가장 빈번하게 과장된 생물학적 과정 용어는 "GO:0006952 방어 반응"으로, 16개 중 6개(시간 × 선) 조합에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2). 가장 빈번하게 과장된 생물학적 과정 용어는 "GO:0006952 방어 반응"으로, 16개 중 6개(시간 × 선) 조합에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлял ся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). 가장 빈번하게 과장된 생물학적 과정 용어는 'GO:0006952 방어 반응'으로, 16개 중 6개(시간 × 계보) 조합에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6 个中，具高显着性（P 值< 0.00 1)(图2)。 가장 대표적인 생물학적 과정 용어는 "GO:0006952 방어 반응"으로, 16개(时间×线) 조합 중 6개 조합에서 나타나며 유의성이 높다(P value < 0.001)(图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 방어 대응», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). 가장 빈번하게 과대 표현된 생물학적 과정 용어는 'GO:0006952 방어 반응'으로, 16개 조합 중 6개 조합(시간 × 선)에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2).이 용어는 83A의 두 시점(476 및 Boregine(6 및 24 hpi))과 Mandelup 및 Population 22660(각각 12 및 6 hpi)의 한 시점에서 과도하게 표현되었습니다.이것은 저항성 계열의 항진균 반응을 강조하는 예상 결과입니다.또한, 83A:476은 C. lupini에 대해 특정 방어 반응을 나타내는 "GO:0055114 redox process"라는 용어로 표현되는 산화적 폭발과 관련된 유전자를 빠르게 유도하여 반응한 반면, Boregine은 'GO'라는 용어와 관련된 특정 방어 반응을 나타냈다.:0006950 스트레스 반응”.인구 22660은 2차 대사산물과 관련된 수평 저항 반응을 활성화하여 "GO:0016104 트리테르펜 생합성 과정" 및 "GO:0006722 트리테르펜 대사 과정"(두 용어 모두 동일한 유전자 집합에 속함)이라는 용어를 강조하여 GO 용어 농축 분석의 결과를 고려하여 Mandelup 반응 안정성은 Boregine과 인구 22660 사이에 있었습니다. 또한 초기 반응 83A :476(6hpi) 및 지연 반응 Mandelup 및 Population 22660에는 용어 GO:0015979 '광합성' 및 기타 관련된 생물학적 과정이 포함됩니다.
탄저균 루핀(1999년 폴란드 Wierzhenice의 루핀 밭에서 얻은 Col-08 균주)을 접종한 좁은 잎 루핀(NLL)의 전사체 반응 동안 차별적으로 발현된 유전자의 주석에서 선택된 생물공정 유전자 온톨로지 용어는 크게 과장되어 있습니다.분석된 NLL 계통은 83A:476(내성, 동형 접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(내성, 유전적 배경 미지), Mandelup(중등도 내성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유) 및 인구 22660(감수성)이었습니다.
이 연구는 탄저병 저항성에 기여하는 유전자를 확인하는 것을 목표로 했기 때문에 GO "GO: 0006952 방어 반응" 및 "GO: 0055114 산화환원 과정"이라는 용어에 할당된 유전자는 기준선이 ≥ 30이고 적어도 한 줄을 의미하므로 컷오프로 분석했습니다.× log2의 통계적으로 유의한 값을 결합한 시점(변화 배수).이러한 기준을 충족하는 유전자의 수는 GO:0006952의 경우 65개, GO:0055114의 경우 524개였습니다.
83A:476은 용어 GO:0006952로 주석이 달린 2개의 DEG 피크를 나타냈는데, 첫 번째는 인치당 6개 유전자(64개 유전자, 상향 및 하향 조절)이고 두 번째는 인치당 24개 유전자(15개 유전자, 상향 조절만)이다.Boregine은 또한 GO:0006952가 동일한 시점에서 정점에 도달했지만 DEG가 적고(11 및 8) 우선적으로 활성화됨을 보여주었습니다.Mandeloop는 12 및 48 HPI에서 GO:0006952의 두 피크를 보여주었으며 둘 다 12개의 유전자(활성화 유전자가 있는 첫 번째 유전자와 억제 유전자만 있는 두 번째 유전자)를 가지고 있는 반면, 6 HPI(13개 유전자)의 22660 인구는 증가 피크가 더 우세했습니다.규제.이러한 피크에서 GO:0006952 DEG의 96.4%는 동일한 유형의 반응(위 또는 아래)을 가졌고, 이는 관련 유전자 수의 차이에도 불구하고 방어 반응에서 상당한 중복을 나타냄을 나타냅니다.용어 GO:0006952와 관련된 가장 큰 시퀀스 그룹은 클래스 10 병인 관련 단백질(PR-10) 단백질 클레이드 및 핵심 단백질 라텍스에 속하는 기아 스트레스 관련 메시지 단백질 22(SAM22 유사)를 암호화합니다.유사한(MLP 유사) 단백질) 단백질(그림 3).두 집단은 표현의 성격과 반응의 방향이 달랐다.SAM22 유사 단백질을 암호화하는 유전자는 초기 시점(6 또는 12 hpi)에서 일관되고 상당한 유도를 보였고 실험 종료 시(48 hpi) 일반적으로 반응하지 않은 반면, MLP 유사 단백질은 6 hpi에서 조정을 보였습니다.hpi.83A:476 및 48hp/in의 Mandelup, 거의 모든 다른 데이터 포인트는 응답하지 않았습니다.또한, SAM22-유사 단백질 유전자의 발현 프로파일의 차이는 탄저병 저항성의 관찰된 가변성을 따랐는데, 더 많은 저항성 계통이 더 민감한 유전자보다 이러한 유전자를 유의하게 유도하는 더 많은 시점을 가졌기 때문입니다.또 다른 LlR18A/B 유사 PR-10 유전자는 SAM22 유사 단백질 유전자와 매우 유사한 발현 패턴을 보였다.
생물학적 과정 용어인 "GO:0006952 방어 반응"의 주요 구성 요소와 Lanr1 및 AnMan 대립 유전자 후보 유전자의 발현 패턴을 확인했습니다.Log2 척도는 동일한 시점에서 접종된 식물(Colletotrichum lupini, 균주 Col-08, lupine field, Wizhenica, Poland, 1999)과 대조군(sham-inoculated) 식물 사이의 log2 값(변화 배수)을 나타낸다.다음의 협엽 루핀 계통을 분석하였다: 83A:476(내성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(내성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 내성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유) 및 Population 22660(감수성).
또한, RNA-seq 후보 유전자 Lanr1(TanjilG_05042) 및 AnMan(TanjilG_12861)의 발현 프로파일을 평가하였다(도 3).TanjilG_05042 유전자는 첫 번째 시점(6 hpi)에서만 83A:476에서 유의한 반응(활성화)을 보인 반면, TanjilG_12861은 Mandeloop에서 6 hpi(다운 레귤레이션) 및 24 hpi(6 hpi)의 두 시점에서만 유의미했습니다.와 함께.).조정 가능) ).
GO:0055114 "산화환원 과정"이라는 용어에서 가장 과발현된 유전자는 시토크롬 P450 단백질과 퍼옥시다제를 암호화하는 유전자였습니다(그림 4).6 HPI에서 83A:476으로부터 분리된 샘플의 경우, 최대 또는 최소 log2(변화 배수) 값(유전자의 86.6%에 대해)이 일반적으로 접종된 식물과 대조군 식물 사이에서 관찰되었으며, 이는 접종된 성별에 대한 이 유전자형의 높은 반응을 강조합니다.83A:476은 6 hpi(503개 유전자)에서 가장 중요한 GO: 0055114 DEG를 나타낸 반면, 계통의 나머지는 48 hpi(Boregine, 31개 유전자; Mandelup, 85개 유전자; 및 Population 22660, 78개 유전자)).GO:0055114 계열의 대부분의 유전자에서 백신 접종에 대한 두 가지 유형의 반응(활성화 및 억제)이 관찰되었습니다.흥미롭게도, 용어 GO에 대해 확인된 DEG의 최대 97.6%: 48 hp의 Mandelupe에서 0055114 이러한 관찰은 훨씬 더 작은 규모(즉, 돌연변이된 산화환원 유전자의 수, 85 대 503)에도 불구하고 탄저병에 대한 mandeloup의 지연된 전사체 반응의 패턴이 83A:476의 초기 반응과 유사함을 시사합니다.Boregine 및 Population 22660에서 이 수렴은 각각 51.6% 및 75.6%로 더 낮습니다.
생물학적 공정 용어인 "GO:0055114 Redox 공정"의 주요 성분 발현 양상이 밝혀졌다.Log2 척도는 동일한 시점에서 접종된 식물(Colletotrichum lupini, 균주 Col-08, lupine field, Wizhenica, Poland, 1999)과 대조군(sham-inoculated) 식물 사이의 log2 값(변화 배수)을 나타낸다.다음의 협엽 루핀 계통을 분석하였다: 83A:476(내성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(내성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 내성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유) 및 Population 22660(감수성).
83A:476 C. lupini(Strain Col-08) 접종에 대한 전사체 반응에는 용어 GO:0015979 "광합성" 및 기타 관련된 생물학적 과정에 기인하는 유전자의 조정된 침묵도 포함됩니다(도 5).이 GO:0015979 DEG 세트에는 83A:476에서 6hpi에서 상당히 억제된 105개의 유전자가 포함되어 있습니다.이 부분집합에서, 두 유전자형에 공통적인 19 DEG를 포함하여 22660 집단에서 동시에 48 HPI 및 35개에서 Mandelup에서 37개의 유전자가 하향조절되었습니다.용어 GO: 0015979와 관련된 DEG는 어떤 조합(라인 x 시간)에서도 크게 활성화되지 않았습니다.
생물학적 과정인 "GO:0015979 광합성"이라는 용어의 주요 구성요소의 발현 양상이 밝혀졌다.Log2 척도는 동일한 시점에서 접종된 식물(Colletotrichum lupini, 균주 Col-08, lupine field, Wizhenica, Poland, 1999)과 대조군(sham-inoculated) 식물 사이의 log2 값(변화 배수)을 나타낸다.다음의 협엽 루핀 계통을 분석하였다: 83A:476(내성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(내성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 내성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유) 및 Population 22660(감수성).
차별적 발현 분석의 결과에 기초하고 아마도 병원성 진균에 대한 방어 반응에 관여하는 것으로 추정되는 이 7개 유전자 세트는 실시간 PCR에 의한 발현 프로파일의 정량화를 위해 선택되었습니다(보충 표 S9).
추정 단백질 유전자 TanjilG_10657은 대조군(모방) 식물과 비교하여 모든 연구 라인 및 시점에서 유의하게 유도되었습니다(보충 표 S10, S11).또한 TanjilG_10657의 발현 프로파일은 모든 계통에 대해 실험이 진행되는 동안 증가하는 경향을 보였다.모집단 22660은 24 HPI에서 114배 활성화 및 가장 높은 상대 발현 수준(4.4 ± 0.4)으로 접종에 대한 TanjilG_10657의 가장 높은 민감도를 나타냈습니다(그림 6a).PR10 LlR18A 단백질 유전자인 TanjilG_27015는 또한 대부분의 데이터 포인트에서 통계적으로 유의미한 모든 라인과 시점에 걸쳐 활성화를 보여주었습니다(그림 6b).TanjilG_10657과 유사하게 TanjilG_27015의 가장 높은 상대 발현 수준은 22660 접종 집단에서 24 HPI(19.5 ± 2.4)로 관찰되었습니다.산성 endochitinase 유전자 TanjilG_04706은 Boregine 6 hpi를 제외한 모든 라인과 모든 시점에서 유의하게 상향 조절되었습니다(그림 6c).83A:476(10.5배)의 첫 번째 시점(6 HPI)에서 강하게 유도되었고 다른 계통에서는 적당히 증가(6.6-7.5배)하였다.실험 중 TanjilG_04706의 발현은 83A:476과 Boregine에서 비슷한 수준을 유지한 반면 Mandelup과 Population 22660에서는 상당히 증가하여 상대적으로 높은 값(각각 5.9 ± 1.5 및 6.2 ± 1.5)에 도달했습니다.Endoglucan-1,3-β-glucosidase 유사 유전자 TanjilG_23384는 모집단 22660을 제외한 모든 계통에서 처음 두 시점(6 및 12 hpi)에서 높은 활성화를 보였다(도 6d).TanjilG_23384의 가장 높은 상대 발현 수준은 Mandelup(2.7 ± 0.3) 및 83A:476(1.5 ± 0.1)에서 두 번째 시점(12 hpi)에서 관찰되었습니다.24 HPI에서 TanjilG_23384 발현은 연구된 모든 라인에서 상대적으로 낮았습니다(0.04 ± 0.009에서 0.44 ± 0.12로).
정량적 PCR에 의해 밝혀진 선택된 유전자(ag)의 발현 프로파일.숫자 6, 12 및 24는 백신 접종 후 시간을 나타냅니다.LanDExH7 및 LanTUB6 유전자는 정규화에 사용되었고 LanTUB6은 시리즈 간 보정에 사용되었습니다.오차 막대는 각각 세 가지 기술 복제의 평균인 세 가지 생물학적 복제를 기반으로 한 표준 편차를 나타냅니다. 접종된 식물(폴란드 Wierzenica의 루핀 밭에서 1999년에 얻은 Colletotrichum lupini, 균주 Col-08)과 대조군(모의 접종) 식물 사이의 발현 수준 차이의 통계적 유의성은 데이터 포인트 위에 표시됩니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001). 접종된 식물(폴란드 Wierzenica의 루핀 밭에서 1999년에 얻은 Colletotrichum lupini, 균주 Col-08)과 대조군(모의 접종) 식물 사이의 발현 수준 차이의 통계적 유의성은 데이터 포인트 위에 표시됩니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001). 1999년 г. оля люpinа в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0 ,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). 접종된 식물(폴란드 Wierzhenice의 루핀 밭에서 1999년에 얻은 Colletotrichum lupini, 균주 Col-08)과 대조군(가짜 접종) 식물 사이의 발현 수준에서 통계적으로 유의한 차이가 데이터 포인트 위에 표시됩니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, *** P 값 ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标(*P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值<0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаmm Col-08, полученный с полей люпин Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). 접종된 식물(Colletotrichum lupini, 균주 Col-08, 1999년 폴란드 Verzhenice의 루핀 밭에서 획득)과 대조군(가짜 접종) 식물 사이의 발현 수준의 통계적으로 유의한 차이가 데이터 포인트 위에 표시됩니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001).분석된 NLL 계통은 83A:476(내성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Mandelup(중등도 내성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), Boregine(내성, 알려지지 않은 유전적 배경) 및 인구 22660(감수성)이었습니다.
Lanr1 유전자좌의 후보 유전자 TanjilG_05042는 RNA-seq 연구에서 얻은 프로파일과 현저하게 다른 발현 패턴을 보였다(도 6e).Mandelup 및 22660 집단에서 이 유전자의 상당한 활성화가 관찰되었으며(각각 최대 39.7배 및 11.7배), 상대적으로 높은 발현 수준(각각 최대 1.4 ± 0.14 및 7.2 ± 1.3)을 나타냈습니다.83A:476은 또한 TanjilG_05042 유전자의 일부 상향조절(최대 3.8배)을 밝혔지만, 달성된 상대 발현 수준(0.044 ± 0.002)은 Mandelup 및 22660 집단에서 관찰된 것보다 30배 이상 낮았습니다.qPCR로 분석한 결과, 모의 백신 접종(대조군) 변이체에서 유전자형 간 발현 수준의 유의한 차이가 나타났으며, 집단 22660과 83A:476 사이, 그리고 집단 22660과 22660 사이에 58배의 차이에 도달했습니다. Boregine과 Mandalup 간에 2배의 차이가 달성되었습니다.
AnMan 유전자좌의 후보 유전자인 TanjilG_12861은 83A:476에서 백신 접종에 반응하여 활성화되었고 Mandelup은 22660 인구에서 중립적이었고 Boregine에서 하향 조절되었습니다(그림 6f).TanjilG_12861 유전자의 상대적인 발현은 접종된 83A에서 가장 높았다: 476(0.14±0.01).17.4 kDa 클래스 I 열충격 단백질 유전자 TanjilG_05080 HSP17.4는 모든 연구된 균주 및 시점에서 상대적 발현 수준이 더 낮았다(도 6g).가장 높은 값은 22660명의 인구에서 24 HPI로 관찰되었습니다(0.14 ± 0.02, 백신 접종에 대한 반응에서 8배 증가).
유전자 발현 프로파일의 비교(그림 7)는 TanjilG_10657과 TanjilG_27015(r = 0.89), TanjilG_05080(r = 0.85), TanjilG_05042(r = 0.80) 및 TanjilG_04706(r = 0.79)의 네 가지 다른 유전자 사이에 높은 상관관계를 나타냈습니다.이러한 결과는 방어 반응 동안 이러한 유전자의 공동 조절을 나타낼 수 있습니다.TanjilG_12861 및 TanjilG_23384 유전자는 다른 유전자에 비해 낮은 Pearson 상관 계수 값(각각 0.08에서 0.43 및 -0.19에서 0.28)으로 서로 다른 발현 양상을 보였다.
유전자 발현 프로파일 간의 상관관계는 정량적 PCR을 사용하여 검출되었습니다.다음의 협엽 루핀 계통을 분석하였다: 83A:476(내성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Mandelup(중등도 내성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), Boregine(내성, 유전적 배경 불명) 및 Population 22660(감수성).접종된 식물(1999년 폴란드 Wierzhenice의 루핀 밭에서 얻은 Colletotrichum lupini, 균주 Col-08) 및 대조군(가짜 접종된) 식물을 포함하는 3개의 시점(접종 후 6, 12 및 24시간)을 계산하였다.척도는 Pearson 상관 계수의 값을 보여줍니다.
인치당 6마력에서 얻은 데이터를 기반으로 WGCNA는 초기 방어 반응에 초점을 맞추기 위해 접종된 식물과 대조 식물을 비교하여 식별된 9981 DEG에서 수행되었습니다(보충 표 S12).22개의 유전자 모듈(클러스터)이 유전자형과 실험적 변이체 사이의 상관관계(양성 또는 음성) 발현 프로파일을 갖는 것으로 발견되었습니다. 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660의 순서로 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660의 순서로 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденця б ыла сильнее у контрольных растений). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660의 순서로 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在物对照植中）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> 모집단 22660 的 顺序 下降 （，在种中，这种在在植物中更）。。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была с ильнее у контрольных растений). 평균적으로 유전자 발현 수준은 시리즈 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660에서 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다).백신접종은 특히 모듈 18, 19, 14, 6 및 1(효과의 내림차순), 음성 조절(예: 모듈 9 및 20) 또는 중립적 효과(예: 모듈 11, 22, 8 및 13)에서 유전자 발현의 상향 조절을 초래했습니다.GO 용어 농축 분석(보충 표 S13)은 qPCR(TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 및 TanjilG_27015)에 의해 분석된 유전자를 포함하여 최대 활성화된 접종된 모듈(18)에 대한 "GO: 0006952 보호 반응"을 밝혔습니다.모듈 18 농축기(그림 8)는 PR-10 유사 LlR18B 단백질을 인코딩하는 TanjilG_26536 유전자로 확인되었으며, 모듈 9 농축기는 광시스템 II PsbQ 단백질을 인코딩하는 TanjilG_28955 유전자로 확인되었습니다.후보 탄저병 저항성 유전자 Lanr1, TanjilG_05042는 모듈 22(그림 9)에서 발견되었으며 "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolism processes" 및 "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" 용어와 관련되어 TanjilG_01212 허브를 전달합니다.유전자는 열 스트레스 전사 인자 A-4a(HSFA4a)를 암호화합니다.
과도하게 표현된 생물학적 프로세스 용어 "GO: 0006952 방어 반응"이 있는 모듈의 유전자 동시 발현에 대한 가중 네트워크 분석.결찰은 qPCR에 의해 분석된 4개의 유전자(TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 및 TanjilG_27015)를 강조하기 위해 단순화되었습니다.
과도하게 표현된 생물학적 프로세스 용어 "GO: 0006355: Transcriptional regulation, DNA templating"을 사용하고 후보 탄저병 저항성 유전자 Lanr1 TanjilG_05042를 포함하는 모듈의 유전자 공동 발현에 대한 가중 네트워크 분석.연결을 단순화하여 TanjilG_05042 유전자와 중앙 TanjilG_01212 유전자를 분리했습니다.
호주에서 수집된 탄저병 저항성 스크리닝은 초기에 출시된 대부분의 품종이 감수성이 있음을 보여주었습니다.Kalya, Coromup 및 Mandelup은 적당한 저항성으로 설명되었으며 Wonga, Tanjil 및 83A:476은 높은 저항성으로 설명되었습니다26,27,31.Lanr1로 명명된 동일한 저항성 대립유전자를 가졌고, Coromup과 Mandelup은 AnMan10, 26, 39로 명명된 다른 대립유전자를 가졌고 Kalya는 다른 대립유전자를 전달했습니다., Lanr2.독일에서 탄저병 저항성에 대한 스크리닝 결과, LanrBo36으로 명명된 Lanr1 이외의 후보 대립유전자를 갖는 저항성 계열 Bo7212가 확인되었습니다.
우리의 연구는 테스트된 생식질에서 Lanr1 대립유전자의 매우 낮은 빈도(약 6%)를 밝혔습니다.이 관찰은 Anseq3 및 Anseq4 마커를 사용하여 동유럽 생식질을 스크리닝한 결과와 일치하며, 이는 Lanr1 대립유전자가 두 개의 벨로루시 계통에만 존재함을 보여줍니다.이는 Lanr1 대립유전자가 마커 지원 육종의 주요 대립유전자 중 하나인 호주와 달리 아직 현지 육종 프로그램에서 널리 사용되지 않는다는 것을 시사합니다.이는 호주 보고서와 비교하여 유럽 현장 조건에서 Lanr1 대립유전자가 제공하는 저항 수준이 낮기 때문일 수 있습니다.또한 호주의 강우량이 많은 지역에서 탄저병에 대한 연구는 Lanr1 대립 유전자에 의해 매개되는 저항 반응이 병원체의 성장과 급속한 발달을 선호하는 기상 조건에서는 효과적이지 않을 수 있음을 보여주었습니다.실제로 본 연구에서는 Lanr1 대립유전자를 보유하는 유전자형에서도 일부 탄저병 증상이 관찰되어 C. lupini의 발달에 최적의 조건에서 저항성이 사라질 수 있음을 시사한다.또한, Lanr1 유전자좌로부터 대략 1cM 떨어진 Anseq3 및 Anseq4 마커의 존재에 대한 위양성 해석이 가능하다 28,30,43 .
우리의 연구는 Lanr1 대립유전자를 가지고 있는 83A:476이 첫 번째 분석 시점(6 hpi)에서 대규모 전사체 재프로그래밍으로 C. lupini 접종에 반응하는 반면, AnMan 대립유전자를 보유하는 Mandelup에서는 전사체 반응이 훨씬 나중에 관찰되었음을 보여주었습니다.(24에서 48 마력으로).방어 반응의 이러한 시간적 변화는 질병 증상의 차이와 관련이 있으며, 이는 저항에 대한 성공적인 반응을 위한 조기 병원체 인식의 중요성을 강조합니다.식물 조직을 감염시키려면 탄저균 포자가 숙주 표면에서 발아, 세포 분열, 부착기 형성 등 여러 발달 단계를 거쳐야 합니다.부속지는 숙주의 표면에 부착되어 숙주 조직으로의 침투를 용이하게 하는 감염성 구조입니다.따라서 완두콩 추출물에서 C. gloeosporioides의 포자는 배양 75-90분 후에 핵의 1차 분열을 보였고, 90-120분 후에 발아관이 형성되었으며, 4시간 후에 억제되었다45 .Mango C. gloeosporioides는 3시간 부화 후 40% 이상의 분생포자 발아율을 보였고, 4시간 후 약 20%의 압압자 형성을 보였다.C. gloeosporioides의 독성 관련 CAP20 유전자는 4시간 46분 후에 고농도의 CAP20 단백질과 함께 아보카도 표면 왁스에서 3.5시간 배양 후 착생 포자 형성에서 전사 활성을 보였다.유사하게, C. trifolii에서 멜라닌 생합성 유전자의 활성은 2시간 배양 동안 유도되었고, 1시간 후에 부착기(appressorium)가 형성되었다.잎 조직에 대한 연구에서 C. acutatum을 접종한 딸기는 8 hpi에서 첫 번째 억제를 보인 반면 C. coccodes를 접종한 토마토는 4 hpi에서 첫 번째 억제를 보였습니다48,49.Colletotrichum spp의 시간 척도와 대체로 일치합니다.전염성 과정.83A:476에 대한 신속한 방어 반응은 이 계열에 식물 저항성 및 효과기 유발 면역(ETI) 유전자가 관련되어 있음을 시사하는 반면, Mandelup의 지연 반응은 미세 관련 분자 패턴 유발 면역(MTI) 가설을 뒷받침합니다 50. 83A: 476 및 Mandelup에 대한 초기 반응.ETI는 종종 아나필락시스 쇼크(anaphylactic shock)로 알려진 감염 부위에서 프로그램된 세포 사멸로 끝나는 가속화되고 강화된 MTI 반응으로 간주되기 때문에 지연된 반응에서 상향 또는 하향 조절된 유전자 사이의 부분적 중첩도 이 개념을 뒷받침합니다51,52 .
Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response"라는 용어가 과장되게 표현된 대부분의 유전자는 스트레스 유발 금식 메시지 22 단백질(SAM22와 유사)의 11개 상동체와 7개의 주요 라텍스 단백질 유사(MLP)입니다.-유사 단백질 31, 34, 43 및 423은 서열 유사성을 보였다.SAM22 유사 유전자는 탄저병 저항성(83A:476 및 Boregine)의 증가된 수준을 보여주면서 더 오래 지속되는 상당한 활성화를 보여주었습니다.그러나 MLP 유사 유전자는 후보 저항성 대립 유전자(6 hpi에서 83A:476/Lanr1 및 24 hpi에서 Mandelup/AnMan)를 보유하는 계통에서만 하향 조절되었습니다.식별된 모든 SAM22 유사 상동체는 약 105kb에 이르는 유전자 클러스터에서 유래하는 반면 MLP 유사 유전자는 게놈의 별도 영역에서 유래한다는 점에 유의해야 합니다.이러한 SAM22 유사 유전자의 조정된 활성화는 Diaporthetoxica 접종에 대한 NLL 내성에 대한 이전 연구에서도 발견되었으며, 이는 방어 반응의 수평적 구성 요소에 관여함을 시사합니다.이 결론은 살리실산, 진균 유도제 또는 과산화수소로 치료하거나 상해에 대한 SAM22 유사 유전자의 긍정적인 반응에 대한 보고에 의해 뒷받침됩니다.
MLP 유사 유전자는 많은 식물 종에서 박테리아, 바이러스 및 병원성 진균 감염을 포함한 다양한 비생물적 및 생물적 스트레스에 반응하는 것으로 나타났습니다55.식물과 병원균 사이의 특정 상호 작용에 대한 반응 방향은 크게 증가하는 것(즉, Verticillium dahliae로 목화에 침입하는 동안)에서 현저하게 감소하는 것(즉, Alternaria spp.로 사과 나무에 감염시킨 후)까지 다양했습니다56,57.F. niger 감염에 대한 아보카도 방어와 사과나무 Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola 및 Alternaria alternata는 사과 병원형입니다58,59.또한, MLP 유사 423 유전자를 과발현하는 사과 캘러스는 저항성 관련 유전자의 발현이 낮았고 진균 감염에 더 취약했습니다59.Fusarium oxysporum f에 이어 MLP 유사 423 유전자도 내성 일반 콩 생식질에서 억제되었습니다.cn.콩 감염 60.
RNA-seq 연구에서 확인된 PR-10 계열의 다른 구성원은 상향 조절에 반응하는 LlR18A 및 LlR18B 유전자와 지질 전달 단백질 DIR1에 대한 상향 조절(1개 유전자) 또는 하향 조절(3개 유전자) 유전자였습니다..또한 WGCNA는 이 모듈에서 LlR18B 유전자를 허브로 강조하는데, 이는 백신 접종에 매우 민감하고 여러 보호 반응 유전자를 가지고 있습니다.LlR18A 및 LlR18B 유전자는 병원성 박테리아에 대한 반응으로 황색 루핀 잎에서 유도되었으며, D.toxica 접종 후 NLL 줄기에서도 유도되었으며, 이들 유전자의 벼 상동체인 RSOsPR10은 아마도 jasmonic acid 신호 경로에 관여하는 것으로 추정되는 진균 감염에 의해 빠르게 유도되었습니다. SAR).보호 반응의 발달과 함께 DIR1 단백질은 먼 기관에서 SAR을 유도하기 위해 체관부를 통해 감염의 초점에서 운반됩니다.흥미롭게도, TanjilG_02313 DIR1 유전자는 라인 84A:476 및 인구 22660에서 첫 번째 시점에서 유의하게 유도되었지만 탄저병 저항성은 라인 84A:476에서만 성공적으로 발생했습니다.이는 NLL에서 DIR1 유전자의 일부 하위 기능화를 나타낼 수 있는데, 이는 나머지 3개의 동족체가 6 hpi에서 83A:476 라인에서만 접종에 반응하고 이 반응이 하향 지시되었기 때문입니다.
본 연구에서 “GO:0055114 Redox process”라 불리는 생물학적 과정에 해당하는 가장 흔한 성분은 cytochrome P450 protein, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase였다.또한 WGCNA는 HSFA4a 동족체를 Lanr1 저항 유전자 후보 TanjilG_05042와 같은 모듈을 운반하는 허브로 정의합니다.HSFA4a는 식물에서 핵 전사의 산화 환원 의존성 조절의 구성 요소입니다.
사이토크롬 P450 단백질은 호르몬, 지방산, 스테롤, 세포벽 성분, 생체 고분자 및 보호 화합물의 생합성뿐만 아니라 생체이물질의 대사를 포함한 1차 및 2차 대사에서 NADPH 및/또는 O2 의존성 수산화 반응을 촉매하는 산화환원효소입니다. 많은 수의 변경된 상동체(37)와 상향 수정을 반영하는 특정 유전자 간의 반응 패턴의 차이로 인해 7..그러한 큰 단백질 수퍼패밀리에서 NLL 유전자의 추정되는 생물학적 기능을 밝히기 위해 RNA-seq 데이터만을 사용하는 것은 매우 추측에 가깝습니다.그러나 일부 시토크롬 P450 유전자는 알레르기 반응에 기여하는 것을 포함하여 병원성 진균 또는 박테리아에 대한 저항성 증가와 관련이 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다69,70,71.
Class III 과산화효소는 염분, 가뭄, 높은 광도 및 병원체 공격과 같은 환경 스트레스에 대한 반응뿐만 아니라 식물 성장 및 발달 동안 광범위한 대사 과정에 관여하는 다기능 식물 효소입니다.과산화효소는 Stylosanthes humilis 및 C. gloeosporioides, Lens culinaris 및 C. truncatum, Phaseolus vulgaris 및 C. lindemuthianum, Cucumis sativus 및 C. lagenarium73,74,75,76을 포함하여 탄저병과 여러 식물 종의 상호작용에 관여합니다.곰팡이가 식물 조직에 침투하기 전에 응답이 매우 빠르고 때로는 4 HPI에서도 발생합니다73.과산화효소 유전자는 D.toxica NLL 접종에도 반응했습니다.산화 폭발을 조절하거나 산화 스트레스를 제거하는 일반적인 기능 외에도, 과산화효소는 특정 화합물의 리그닌화, 소단위 또는 가교 동안 세포벽 강화를 기반으로 물리적 장벽을 생성하여 병원체 성장을 방해할 수 있습니다.이 기능은 6 HPI에서 83A:476 저항성 라인에서 우리 연구에서 상당히 상향조절된 것으로 추정되는 리그닌 형성 음이온 퍼옥시다제를 암호화하는 TanjilG_03329 유전자에 인 실리코에 기인할 수 있지만, 반응하지 않은 다른 균주 및 시점에서는 그렇지 않습니다.
리놀레산의 9S-/13S-리폭시게나아제는 지질 생합성 산화 경로의 첫 번째 단계입니다78.이 경로의 산물은 캘로오스 및 펙틴 침전물의 형성을 통한 세포벽 강화 및 활성 산소종 생성을 통한 산화 스트레스 조절을 포함하여 식물 방어에서 여러 기능을 가지고 있습니다79,80,81,82,83.현재 연구에서 리놀레산 9S-/13S-리폭시게나아제의 발현은 모든 균주에서 변경되었지만 감수성 집단 22660에서는 다른 시점에서 상향 조절이 우세한 반면 저항성 Lanr1 및 AnMan 대립유전자를 보유하는 균주에서는 이러한 유전자형 사이의 보호 탄저병 반응에서 옥시리핀 층의 다양화를 강조합니다.
1-아미노시클로프로판-1-카르복실레이트 옥시다제(ACO) 동족체는 루핀을 접종했을 때 상당히 상향조절(9개 유전자) 또는 하향조절(2개 유전자)되었습니다.두 가지 예외를 제외하고 이러한 모든 응답은 6hp에서 발생했습니다.83A:476.ACO 단백질에 의해 매개되는 효소 반응은 에틸렌 생산의 속도 제한 단계이므로 고도로 규제됩니다84.에틸렌은 식물 발달과 비생물적 및 생물적 스트레스 조건에 대한 반응을 조절하는 데 다양한 역할을 하는 식물 호르몬입니다.ACO 전사의 유도와 에틸렌 신호전달 경로의 활성화는 반응성 산소종과 파이토알렉신의 생성을 조절함으로써 반생물영양 진균인 oryzae oryzae에 대한 벼의 저항성을 증가시키는 데 관여합니다.M. oryzae와 C. lupini 사이에서 발견된 매우 유사한 잎 감염 과정88,89은 본 연구에서 보고된 83A:476 계열에서 ACO 상동체의 상당한 상향 조절을 배경으로 NLL 탄저병 에틸렌에 대한 저항성을 부여할 가능성을 분자 경로의 신호 중심 단계로 이동시킵니다.
본 연구에서는 광합성과 관련된 많은 유전자의 대규모 억제가 83A:476의 6 hpi와 Mandeloop 및 22660 인구의 48 hpi에서 관찰되었습니다.이러한 변화의 범위와 진행은 레벨에 비례합니다.이 실험에서 탄저병 저항성이 관찰되었다.최근에 광합성 관련 전사체의 강력하고 초기 억제가 병원성 박테리아 및 진균을 포함한 식물-병원체 상호작용의 여러 모델에서 보고되었습니다.감염에 대한 반응으로 광합성과 관련된 유전자의 신속함(일부 상호 작용에서 2 HPI로부터) 및 전반적인 억제는 활성 산소 종의 배치 및 알레르기 반응을 매개하는 살리실산 경로와의 상호 작용을 기반으로 식물 면역을 유발할 수 있습니다 90,94.
결론적으로, 가장 저항성이 강한 혈통(83A:476)에 대해 제안된 방어 반응 메커니즘에는 R 유전자(아마도 TIR-NBS-LRR TanjilG_05042)에 의한 빠른 병원체 인식과 알레르기 반응 매개 살리실산 및 에틸렌 신호 전달, 이후 장거리 SAR 확립이 포함됩니다.행동은 DIR-1 단백질에 의해 지원됩니다.C. lupini 감염의 생물영양 기간은 매우 짧고(약 2일) 괴사 성장이 뒤따른다는 점에 유의해야 합니다95.이러한 단계 사이의 전이는 괴사 및 기주 식물에서 과민 반응의 유발인자 역할을 하는 에틸렌 유도성 단백질의 발현과 관련될 수 있습니다.따라서 생물영양 단계에서 C. lupini를 성공적으로 포획하기 위한 시간 창은 매우 좁습니다.6 hpi에서 83A:476에서 관찰된 산화환원 및 광합성과 관련된 유전자의 재프로그래밍은 곰팡이 균사의 진행과 일치하며 생물영양 단계에서 성공적인 보호 반응의 발달을 예고합니다.Mandelup 및 22660 집단의 transcriptomic 반응은 괴사 성장으로 전환하기 전에 곰팡이를 포획하기에는 너무 지연될 수 있지만, PR-10 단백질의 상대적으로 빠른 조절이 수평 저항을 촉진하기 때문에 Mandelup이 22660 집단보다 더 효과적일 수 있습니다.
정식 R 유전자에 의해 구동되는 ETI는 탄저병에 대한 콩 저항성에 대한 일반적인 메커니즘인 것으로 보입니다.따라서 모델 콩과 식물 Medicago truncatula에서 탄저병에 대한 저항성은 TIR-NBS-LRR97 식물 R 유전자 클래스의 구성원인 RCT1 유전자에 의해 부여됩니다.이 유전자는 또한 감수성 식물로 옮겨졌을 때 알팔파에서 광범위한 탄저병 저항성을 부여합니다.일반 콩(P. vulgaris)에서 현재까지 24개 이상의 탄저병 저항성 유전자가 확인되었습니다.이러한 유전자 중 일부는 표준 R 유전자가 없는 영역에서 발견되지만 TIR-NBS-LRRs99를 포함하여 NBS-LRR 유전자 클러스터를 운반하는 많은 다른 유전자는 염색체의 가장자리에 있습니다.게놈 전체 SSR 연구는 또한 일반 콩에서 NBS-LRR 유전자와 탄저병 저항성의 연관성을 확인했습니다.표준 R 유전자는 또한 백색 루핀 101의 주요 탄저병 저항성 유전자좌를 운반하는 게놈 영역에서 발견되었습니다.
우리의 연구는 식물 감염의 초기 단계(바람직하게는 12 hpi 이하)에서 활성화된 즉각적인 저항 반응이 병원성 진균 Collelotrichum lupini에 의해 유발된 탄저병으로부터 잎이 좁은 루핀을 효과적으로 보호한다는 것을 보여줍니다.높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 Lanr1 및 AnMan 저항성 유전자에 의해 매개되는 NLL 식물에서 탄저병 저항성 유전자의 차등 발현 프로파일을 시연했습니다.성공적인 방어에는 식물이 병원체와 처음 접촉한 후 몇 시간 내에 산화환원, 광합성 및 병인 발생과 관련된 단백질의 유전자를 신중하게 설계하는 것이 포함됩니다.유사한 보호 반응이지만 시간이 지연되어 질병으로부터 식물을 보호하는 데 훨씬 덜 효과적입니다.Lanr1 유전자에 의해 매개되는 탄저병 저항성은 R 유전자의 전형적인 빠른 반응(이펙터 유발 면역)과 유사하지만 AnMan 유전자는 수평 반응(미생물 관련 분자 패턴에 의해 유발되는 면역)을 제공할 가능성이 높으며 중간 수준의 지속 가능성을 제공합니다.
탄저병 마커 스크리닝에 사용된 215개의 NLL 계통은 74개 품종, 교배 또는 육종으로 얻은 60개 계통, 5개의 돌연변이 및 76개의 야생 또는 원시 생식질로 구성되었습니다.노선은 주로 폴란드(58), 스페인(47), 독일(27), 호주(26), 러시아(19), 벨로루시(7), 이탈리아(5) 등 17개국에서 왔다.10개국에서.이 세트에는 참조 저항성 계통도 포함됩니다: 83A:476, Lanr1 대립유전자를 보유하는 Tanjil, Wonga 및 AnMan 대립유전자를 보유하는 Mandelup.라인은 폴란드 Wiatrowo의 Poznań Plant Breeding Ltd.에서 관리하는 European Lupine Genetic Resource Database에서 얻었습니다 (보충 표 S1).
식물은 통제된 조건(광주기 16시간, 낮에는 25°C, 밤에는 18°C)에서 재배되었습니다.두 개의 생물학적 복제물을 분석했습니다.프로토콜에 따라 DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 3주 된 잎에서 DNA를 분리했습니다.분리된 DNA의 품질과 농도는 분광광도법(NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 평가되었습니다.탄저병 저항성 유전자 AnMan(Cv. Mandelup에서 유래)을 표시하는 AnManM1 마커 및 유전자 Lanr1(Cv. Tanjil에서 유래) 옆에 있는 마커 Anseq3 및 Anseq4를 분석했습니다 11,26,28.저항성 대립유전자에 대한 동형접합체는 "1"로, 감수성은 "0"으로, 이형접합체는 0.5로 점수화되었습니다.
마커 AnManM1, AnSeq3 및 AnSeq4에 대한 스크리닝 결과 및 최종 후속 실험을 위한 종자의 가용성에 기초하여 탄저병 저항성 표현형 분석을 위해 50개의 NLL 계통이 선택되었습니다.낮에는 22°C, 밤에는 19°C의 온도 범위에서 14시간 광주기를 갖는 컴퓨터 제어 온실에서 이중으로 분석을 수행했습니다.종피가 너무 단단하여 종자 휴면을 방지하고 균일한 발아를 보장하기 위해 파종 전에 종자를 긁어냅니다(배아 반대쪽 종피를 날카로운 칼날로 잘라내기).식물은 멸균 토양 (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, 폴란드 바르샤바)이있는 화분 (11 × 11 × 21cm)에서 재배되었습니다.그레이터 폴란드(Greater Poland)의 Verzhenitsa(52° 27' 42" N 17° 04' 05" E)의 들판에서 자란 좁은 잎 루핀 식물의 줄기에서 1999년에 자란 Colletotrichum lupini Col-08 균주로 접종을 수행했습니다.영역을 확보하십시오.분리균주를 SNA 배지에서 20℃ 블랙 라이트 하에서 21일 동안 배양하여 포자형성을 유도하였다.파종 4주 후, 식물이 4-6엽기에 도달했을 때, ml당 0.5 x 106개의 분생포자의 농도로 분생포자 현탁액을 분무하여 접종을 수행하였다.접종 후 분생포자의 발아와 감염 과정을 촉진하기 위해 약 98%의 습도와 25℃의 온도에서 24시간 동안 암실에 두었다.그런 다음 식물을 낮 22°C/밤 19°C, 습도 70%에서 14시간 광주기 조건에서 재배했습니다.질병 점수는 접종 22일 후에 만들어졌으며 줄기와 잎에 괴사 병변의 유무에 따라 0(면역)에서 9(매우 감수성)까지 범위가 지정되었습니다.또한 채점 후 식물체의 무게를 측정하였다.마커 유전자형과 질병 표현형 사이의 관계는 점 2-서열 상관관계(탄저병 저항성 표현형 분석을 위한 라인 세트에서 이형접합 마커의 부재)로 계산되었습니다.