Nature.com을 방문해 주셔서 감사합니다.사용 중인 브라우저 버전은 CSS 지원이 제한되어 있습니다.최상의 경험을 위해 업데이트된 브라우저를 사용하는 것이 좋습니다(또는 Internet Explorer에서 호환 모드 비활성화).그동안 지속적인 지원을 위해 스타일과 JavaScript 없이 사이트를 렌더링할 것입니다.
약물 테스트를 위해 심장의 생리적 환경을 정확하게 재현할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 시스템이 필요합니다.인간 심장 조직 배양 시스템의 제한된 가용성으로 인해 심장 약물 효과에 대한 부정확한 해석이 이루어졌습니다.여기에서 우리는 심장 주기의 수축기 및 이완기 단계 동안 심장 조각을 전기 기계적으로 자극하고 생리적 스트레칭을 겪는 심장 조직 배양 모델(CTCM)을 개발했습니다.배양 12일 후 이 접근법은 심장 부분의 생존력을 부분적으로 개선했지만 구조적 무결성을 완전히 보존하지는 못했습니다.따라서 소분자 스크리닝 후 100nM triiodothyronine(T3)과 1μM dexamethasone(Dex)을 배지에 첨가하면 12일 동안 절편의 미세구조가 유지됨을 발견했습니다.T3/Dex 치료와 함께 CTCM 시스템은 12일 동안 신선한 심장 조직과 동일한 수준의 전사 프로필, 생존 능력, 대사 활동 및 구조적 무결성을 유지했습니다.또한, 배양에서 심장 조직의 과도한 스트레칭은 비대 심장 신호를 유도하여 CTCM이 심장 스트레칭에 의해 유도된 비대 조건을 모방하는 능력에 대한 증거를 제공합니다.결론적으로 CTCM은 오랜 기간 동안 배양된 심장의 생리학 및 병태생리학을 모델링할 수 있어 신뢰할 수 있는 약물 스크리닝을 가능하게 합니다.
임상 연구에 앞서 인간 심장의 생리적 환경을 정확하게 재현할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 시스템이 필요합니다.이러한 시스템은 변경된 기계적 스트레치, 심박수 및 전기생리학적 특성을 모방해야 합니다.동물 모델은 일반적으로 인간의 심장1,2에서 약물의 효과를 반영하는 데 있어서 신뢰성이 제한된 심장 생리학을 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용됩니다.궁극적으로 이상적인 심장 조직 배양 실험 모델(CTCM)은 다양한 치료 및 약리학적 개입에 대해 매우 민감하고 구체적인 모델로, 인간 심장3의 생리학과 병태생리학을 정확하게 재현합니다.이러한 시스템의 부재는 심부전에 대한 새로운 치료법의 발견을 제한하고4,5 시장에서 빠져나가는 주요 원인으로 약물 심독성을 초래했습니다6.
지난 10년 동안 8개의 비심혈관 약물이 QT 간격 연장을 유발하여 심실 부정맥 및 돌연사를 유발하기 때문에 임상 사용에서 제외되었습니다7.따라서 심혈관 효능 및 독성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략에 대한 필요성이 증가하고 있습니다.약물 스크리닝 및 독성 테스트에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPS-CM)의 최근 사용은 이 문제에 대한 부분적인 해결책을 제공합니다.그러나 hiPS-CM의 미성숙 특성과 심장 조직의 다세포 복잡성 부족은 이 방법의 주요 한계입니다.최근 연구에 따르면 초기 hiPS-CM을 사용하여 자발적인 수축이 시작된 직후에 심장 조직 하이드로겔을 형성하고 시간이 지남에 따라 점차적으로 전기 자극을 증가시킴으로써 이러한 제한을 부분적으로 극복할 수 있음이 나타났습니다.그러나 이러한 hiPS-CM 미세 조직은 성인 심근의 성숙한 전기생리학적 및 수축 특성이 부족합니다.또한, 인간의 심장 조직은 내피 세포, 뉴런 및 간질 섬유아세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 이종 혼합물로 구성된 보다 복잡한 구조를 가지며 특정 세포외 매트릭스 단백질 세트에 의해 상호 연결됩니다.성인 포유류 심장에서 비심근세포 집단11,12,13의 이러한 이질성은 개별 세포 유형을 사용하여 심장 조직을 모델링하는 데 주요 장벽입니다.이러한 주요 제한 사항은 생리학적 및 병리학적 조건에서 손상되지 않은 심근 조직을 배양하기 위한 개발 방법의 중요성을 강조합니다.
인간 심장의 배양된 얇은(300 μm) 섹션은 온전한 인간 심근의 유망한 모델임이 입증되었습니다.이 방법은 인간의 심장 조직과 유사한 완전한 3D 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다.그러나 2019년까지 배양된 심장 절편의 사용은 짧은(24시간) 배양 생존으로 인해 제한되었습니다.이는 물리적-기계적 스트레치의 부족, 공기-액체 인터페이스 및 심장 조직의 요구를 지원하지 않는 단순 매체의 사용을 포함한 여러 요인 때문입니다.2019년에 여러 연구 그룹은 기계적 요인을 심장 조직 배양 시스템에 통합하면 배양 수명을 연장하고 심장 표현을 개선하며 심장 병리를 모방할 수 있음을 입증했습니다.2개의 우아한 연구 17 및 18은 일축 기계적 부하가 배양 중 심장 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.그러나 이러한 연구는 심장 부분이 등축 인장력 17 또는 선형 영양요구 부하 18로 부하되었기 때문에 심장 주기의 동적 3차원 물리-기계 부하를 사용하지 않았습니다.이러한 조직 스트레칭 방법은 많은 심장 유전자의 억제 또는 비정상적인 스트레칭 반응과 관련된 유전자의 과발현을 초래했습니다.특히 Pitoulis et al.19는 힘 변환기 피드백 및 장력 드라이브를 사용하여 심장 주기 재구성을 위한 동적 심장 절편 배양 욕을 개발했습니다.이 시스템은 보다 정확한 체외 심장 주기 모델링을 허용하지만, 방법의 복잡성과 낮은 처리량으로 인해 이 시스템의 적용이 제한됩니다.우리 실험실은 최근 전기 자극을 사용하는 단순화된 배양 시스템과 최대 6일20,21 동안 돼지 및 인간 심장 조직 섹션의 생존 가능성을 유지하기 위해 최적화된 배지를 개발했습니다.
현재 원고에서 우리는 심장 주기 동안 3차원 심장 생리학 및 병태생리학적 팽창을 요약하기 위해 체액성 신호를 통합하는 돼지 심장의 섹션을 사용하여 심장 조직 배양 모델(CTCM)을 설명합니다.이 CTCM은 전임상 약물 테스트를 위한 포유류 심장의 생리학/병태생리학을 모방하는 비용 효율적인 중간 처리량 심장 시스템을 제공함으로써 이전에는 달성하지 못한 수준으로 전임상 약물 예측의 정확도를 높일 수 있습니다.
혈역학적 기계적 신호는 체외에서 심근세포 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 22,23,24.현재 원고에서는 생리적 주파수(1.2Hz, 분당 72박자)에서 전기 및 기계적 자극을 모두 유도하여 성인 심장 환경을 모방할 수 있는 CTCM(그림 1a)을 개발했습니다.확장기 동안 조직이 과도하게 늘어나는 것을 방지하기 위해 3D 프린팅 장치를 사용하여 조직 크기를 25%까지 늘렸습니다(그림 1b).C-PACE 시스템에 의해 유도된 전기 페이싱은 심장 주기를 완전히 재현하기 위해 데이터 수집 시스템을 사용하여 수축기 100ms 전에 시작하도록 시간을 정했습니다.조직 배양 시스템은 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(독일 LB 엔지니어링)를 사용하여 유연한 실리콘 멤브레인을 주기적으로 확장하여 상부 챔버의 심장 슬라이스를 확장합니다.시스템은 압력 변환기를 통해 외부 공기 라인에 연결되어 압력(±1mmHg)과 시간(±1ms)을 정확하게 조정할 수 있었습니다(그림 1c).
a 장치의 배양 챔버 내부에서 파란색으로 표시된 7mm 지지 링에 조직 절편을 부착합니다.배양 챔버는 얇고 유연한 실리콘 막에 의해 공기 챔버와 분리됩니다.누출을 방지하기 위해 각 챔버 사이에 개스킷을 놓습니다.장치의 뚜껑에는 전기 자극을 제공하는 흑연 전극이 포함되어 있습니다.b 대형 조직 장치, 가이드 링 및 지지 링의 개략도.조직 섹션(갈색)은 가이드 링이 장치 외부 가장자리의 홈에 배치된 대형 장치에 배치됩니다.가이드를 사용하여 조직 아크릴 접착제로 코팅된 지지 링을 심장 조직 섹션 위에 조심스럽게 놓습니다.c 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(PPD)에 의해 제어되는 공기 챔버 압력의 함수로서 전기 자극 시간을 보여주는 그래프.압력 센서를 사용하여 전기 자극을 동기화하기 위해 데이터 수집 장치가 사용되었습니다.배양 챔버의 압력이 설정된 임계값에 도달하면 펄스 신호가 C-PACE-EM으로 전송되어 전기 자극을 트리거합니다.d 인큐베이터 선반에 놓인 4개의 CTCM 이미지.4개의 장치가 공압 회로를 통해 하나의 PPD에 연결되고 압력 센서가 지혈 밸브에 삽입되어 공압 회로의 압력을 모니터링합니다.각 장치에는 6개의 조직 섹션이 포함되어 있습니다.
단일 공압 액추에이터를 사용하여 각각 6개의 조직 절편을 수용할 수 있는 4개의 CTCM 장치를 제어할 수 있었습니다(그림 1d).CTCM에서 공기 챔버의 공기압은 유체 챔버의 동기 압력으로 변환되고 심장 슬라이스의 생리적 확장을 유도합니다(그림 2a 및 보충 동영상 1).80mmHg에서 조직 스트레치의 평가.미술.조직 절편이 25% 늘어난 것으로 나타났습니다(그림 2b).이 백분율 스트레치는 정상 심장 섹션 수축성17,19,25에 대해 2.2-2.3 μm의 생리학적 근절 길이에 해당하는 것으로 나타났습니다.맞춤형 카메라 설정을 사용하여 조직 움직임을 평가했습니다(보조 그림 1).조직 운동의 진폭과 속도(그림 2c, d)는 수축기 및 이완기 동안의 심장 주기 및 시간 동안의 신장에 해당합니다(그림 2b).수축 및 이완 동안 심장 조직의 신장 및 속도는 배양에서 12일 동안 일정하게 유지되었습니다(그림 2f).배양 중 수축에 대한 전기 자극의 영향을 평가하기 위해 음영 알고리즘(보조 그림 2a, b)을 사용하여 활성 기형을 결정하는 방법을 개발했으며 전기 자극이 있는 기형과 없는 기형을 구별할 수 있었습니다.심장의 같은 부분(그림 2f).컷의 가동 영역(R6-9)에서 전기 자극 중 전압은 전기 자극이 없을 때보다 20% 더 높았으며 이는 수축 기능에 대한 전기 자극의 기여를 나타냅니다.
공기 챔버 압력, 유체 챔버 압력 및 조직 이동 측정의 대표적인 흔적은 챔버 압력이 유체 챔버 압력을 변경하여 조직 슬라이스의 해당 이동을 유발함을 확인합니다.b 백분율 스트레치(주황색)에 해당하는 조직 섹션의 백분율 스트레치(파란색)의 대표적인 흔적.c 심장 슬라이스의 측정된 동작이 측정된 동작 속도와 일치합니다.(d) 심장 조각에서 순환 운동(파란색 선)과 속도(주황색 점선)의 대표적인 궤적.e 주기 시간(다른 돼지에서 그룹당 n = 19 슬라이스), 수축 시간(그룹당 n = 19 슬라이스), 이완 시간(다른 돼지에서 그룹당 n = 19 슬라이스), 조직 이동(n = 25)의 정량화.슬라이스)/다른 돼지의 그룹), 최대 수축기 속도(n = 24(D0), 25(D12) 슬라이스/다른 돼지의 그룹) 및 피크 이완 속도(n=24(D0), 25(D12) 슬라이스/다른 돼지의 그룹).Two-tailed Student's t-test는 모든 매개변수에서 유의한 차이를 나타내지 않았습니다.f (빨간색) 및 전기 자극이 없는(파란색) 조직 섹션의 대표적인 변형 분석 흔적, 동일한 섹션의 조직 섹션의 10개 지역 영역.하단 패널은 서로 다른 섹션의 10개 영역에서 전기 자극이 있거나 없는 조직 섹션의 변형 비율 차이를 정량화한 것입니다. (n = 서로 다른 돼지의 8개 슬라이스/그룹, 양측 스튜던트 t-테스트 수행됨; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 서로 다른 돼지의 8개 슬라이스/그룹, 양측 스튜던트 t-테스트 수행됨; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 서로 다른 돼지의 8개 섹션/그룹, 양측 스튜던트 t-테스트; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 편/평, 자기 자신과 동종의 결, 운동을 하지 않는 것, ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 편/평, 자기 자신과 동종의 결, 운동을 하지 않는 것, ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8개 섹션/그룹, 상이한 돼지로부터, 양측 스튜던트 t-테스트; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
이전의 정적 생체 모방 심장 절편 배양 시스템[20, 21]에서는 전기 자극을 적용하고 배지 조성을 최적화하여 6일 동안 심장 절편의 생존력, 기능 및 구조적 무결성을 유지했습니다.그러나 10일 이후 이 수치는 급격히 떨어졌다.우리는 이전의 정적 생체모방 배양 시스템 20, 21 제어 조건(Ctrl)에서 배양된 섹션을 참조하고 동시 기계 및 전기 자극(CTCM) 하에서 이전에 최적화된 배지를 MC 조건 및 배양으로 사용합니다.라고 불리는 .첫째, 우리는 전기 자극이 없는 기계적 자극이 6일 동안 조직 생존력을 유지하기에 불충분하다고 판단했습니다(보충 그림 3a,b).흥미롭게도 STCM을 사용한 물리-기계적 및 전기적 자극의 도입으로 12일 심장 절편의 생존 가능성은 MTT 분석에서 볼 수 있듯이 Ctrl 조건이 아닌 MS 조건에서 신선 심장 절편과 동일하게 유지되었습니다(그림 1).3a).이는 심장 주기의 기계적 자극 및 시뮬레이션이 이전 정적 배양 시스템에서 보고된 것보다 두 배 더 오래 조직 절편을 생존할 수 있음을 시사합니다.그러나, 심장 트로포닌 T 및 코넥신 43의 면역표지화에 의한 조직 절편의 구조적 무결성 평가는 코넥신 43 발현이 같은 날 대조군보다 12일째에 MC 조직에서 유의하게 더 높았음을 보여주었다.그러나 connexin 43의 균일한 발현과 Z-disc 형성은 완전히 유지되지 않았다(Fig. 3b).인공 지능(AI) 프레임워크를 사용하여 국소화 강도 측면에서 심장 슬라이스의 구조적 무결성 및 형광을 자동으로 정량화하기 위해 트로포닌-T 및 코넥신 염색을 기반으로 하는 이미지 기반 딥 러닝 파이프라인인 조직 구조적 무결성을 정량화합니다.이 방법은 CNN(Convolutional Neural Network)과 심층 학습 프레임워크를 사용하여 참조에 설명된 대로 자동화되고 편향되지 않은 방식으로 심장 조직의 구조적 무결성을 안정적으로 정량화합니다.26. MC 조직은 정적 대조군 섹션과 비교하여 0일째에 개선된 구조적 유사성을 보였다.또한, Masson's trichrome 염색은 배양 12일째 대조군 조건과 비교하여 MS 조건에서 섬유증 비율이 현저히 낮음을 보여주었습니다(그림 3c).CTCM은 12일째에 심장 조직 절편의 생존력을 신선한 심장 조직과 비슷한 수준으로 증가시켰지만 심장 절편의 구조적 무결성을 크게 개선하지는 못했습니다.
막대 그래프는 정적 배양(D12 Ctrl) 또는 CTCM(D12 MC)(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl), 12(D12 MC) 슬라이스/다른 돼지 그룹에서 12일 동안 신선한 심장 절편(D0) 또는 심장 절편 배양의 MTT 생존력을 정량화한 것을 보여줍니다. 단방향 ANOVA 테스트가 수행됩니다. D0에 비해 ####p < 0.0001 및 **p < D12 Ctrl에 비해 0.01). 막대 그래프는 정적 배양(D12 Ctrl) 또는 CTCM(D12 MC)(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl ), 12(D12 MC) 슬라이스/그룹에서 12일 동안 신선한 심장 절편(D0) 또는 심장 절편 배양의 MTT 생존력을 정량화한 것을 보여줍니다. 편도 ANOVA 테스트가 수행됩니다. D0 및 **p <에 비해 ####p < 0.0001 D12 Ctrl에 비해 0.01).히스토그램은 정적 배양(D12 대조군) 또는 CTCM(D12 MC)(n = 18(D0), 15(D12 대조군))에서 12일 동안 MTT 신선한 심장 절편(D0) 또는 심장 절편 배양의 생존력의 정량화를 보여줍니다.####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0에 비해 ####p < 0.0001 및 D12 Ctrl에 비해 **p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM(D12 MC) (n = 18(D0), 15(D12 Ctrl) 中新鲜脏切心片(D0) 或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜脏切心片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)고정 배양(D12 대조군) 또는 CTCM(D12 MC)(n = 18(D0), 15(D12 대조군))에서 12일 동안 배양된 신선한 심장 절편(D0) 또는 심장 절편에서 MTT 생존력의 정량화를 보여주는 히스토그램, 상이한 돼지로부터의 12(D12 MC) 절편/그룹, 일원 ANOVA 테스트;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0에 비해 ####p < 0.0001, **D12 Ctrl에 비해 p < 0.01).b 새로 분리된 심장 절편(D0) 또는 정적 조건(Ctrl) 또는 CTCM 조건(MC)에서 12일 동안 배양된 심장 절편의 Troponin-T(녹색), connexin 43(빨간색) 및 DAPI(파란색) 대표적인 면역형광 이미지(빈 눈금 = 100 μm). 심장 조직 구조적 무결성의 인공 지능 정량화(다른 돼지에서 각각 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 슬라이스/그룹, 단방향 ANOVA 테스트가 수행됩니다. D0에 비해 ####p < 0.0001, D12 Ctrl에 비해 ****p < 0.0001). 심장 조직 구조적 무결성의 인공 지능 정량화(다른 돼지에서 각각 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 슬라이스/그룹, 단방향 ANOVA 테스트가 수행됩니다. D0에 비해 ####p < 0.0001, D12 Ctrl에 비해 ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) срезов /групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). 인공 지능에 의한 심장 조직의 구조적 완전성 정량화(다른 돼지의 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 섹션/그룹, 일원 ANOVA 테스트 수행, ####p < 0.0001 대 D0 및 ****p < 0.0001 D12 Ctrl과 비교).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 슬라이스/각각 다른 돼지 그룹, 단방향 ANOVA 테스트;####p < 0.0001 与D0 相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl相比).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 슬라이스/각각 다른 돼지 그룹화, 일원 분산 분석 테스트;####p < 0.0001 与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl相比). Искусственный intеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срез ов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 대 D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). 심장 조직의 구조적 무결성을 정량화하기 위한 인공 지능(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 섹션/각각 다른 돼지 그룹, 일원 ANOVA 테스트; ####p<0.0001 대 .D0 비교를 위해 ****p < 0.0001 D12 Ctrl과 비교). c Masson의 삼색 염색(스케일 베어 = 500 μm)으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량화(오른쪽)(다른 돼지에서 각각 n = 10 슬라이스/그룹, 일원 ANOVA 테스트가 수행됩니다. ####p < 0.0001은 D0에 비해, ***p < 0.001은 D12 Ctrl에 비해). c Masson's trichrome 얼룩(스케일 베어 = 500 μm)으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량화(오른쪽)(각각 다른 돼지에서 n = 10 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 테스트 수행, #### p < 0.0001 D0에 비해 ***p < 0.001 D12 Ctrl에 비해). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масс она (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson의 trichrome 얼룩(코팅되지 않은 스케일 = 500 μm)으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량화(오른쪽) c 用Masson 3색 染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 3색 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm) (n = 10 个 切片 组 每组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный anaлиз (справ) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масс она (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсио нного анализа;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson의 삼색 염색(blank = 500 µm)으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량화(오른쪽)(n = 10 절편/그룹, 각각 다른 돼지에서, 단방향 분산 분석으로 테스트; ### # D0에 비해 p < 0.0001, D12 Ctrl에 비해 ***p < 0.001).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
우리는 배양 배지에 작은 분자를 첨가함으로써 CTCM 배양 동안 심근 세포 무결성이 개선되고 섬유증 발달이 감소할 수 있다는 가설을 세웠습니다.따라서 교란 요인이 적기 때문에 정적 제어 배양20,21을 사용하여 작은 분자를 스크리닝했습니다.Dexamethasone(Dex), triiodothyronine(T3) 및 SB431542(SB)가 이 화면에 선택되었습니다.이러한 작은 분자는 이전에 근절 길이, T-세관 및 전도 속도를 증가시켜 심근세포의 성숙을 유도하기 위해 hiPSC-CM 배양에 사용되었습니다.또한 Dex(글루코코르티코이드)와 SB는 모두 염증을 억제하는 것으로 알려져 있습니다29,30.따라서 우리는 이러한 작은 분자 중 하나 또는 조합을 포함하면 심장 섹션의 구조적 무결성을 향상시킬 수 있는지 여부를 테스트했습니다.초기 스크리닝을 위해, 세포 배양 모델에서 일반적으로 사용되는 농도(1μM Dex27, 100nM T327 및 2.5μM SB31)를 기준으로 각 화합물의 용량을 선택했습니다.배양 12일 후, T3와 Dex의 조합은 최적의 심근세포 구조적 무결성과 최소한의 섬유질 리모델링을 가져왔습니다(보충 그림 4 및 5).또한 이러한 농도의 T3 및 Dex를 두 배 또는 두 배로 사용하면 정상 농도와 비교하여 유해한 효과가 발생했습니다(보충 그림 6a, b).
초기 스크리닝 후, 우리는 4가지 배양 조건의 일대일 비교를 수행했습니다(그림 4a): Ctrl: 최적화된 배지를 사용하여 이전에 설명한 정적 배양에서 배양된 심장 절편;20.21 TD: T3 및 Ctrl s는 수요일에 Dex를 추가했습니다.MC: 이전에 최적화된 배지를 사용하여 CTCM에서 배양된 심장 절편;및 MT: 매체에 T3 및 Dex가 추가된 CTCM.배양 12일 후, MS 및 MT 조직의 생존력은 MTT 분석으로 평가한 신선한 조직에서와 동일하게 유지되었습니다(그림 4b).흥미롭게도, 트랜스웰 배양(TD)에 T3 및 Dex를 추가해도 Ctrl 조건에 비해 생존력이 크게 향상되지 않았으며, 이는 심장 절편의 생존력을 유지하는 데 기계적 자극의 중요한 역할을 나타냅니다.
12일 동안 배지에 대한 기계적 자극 및 T3/Dex 보충의 효과를 평가하기 위해 사용된 4가지 배양 조건을 묘사하는 실험 설계 다이어그램. b 막대 그래프는 신선한 심장 슬라이스(D0)(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC) 슬라이스/그룹과 비교하여 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 후 12일의 생존력 정량화를 보여줍니다. D0에 비해 p < 0.001 및 D12 Ctrl에 비해 **p < 0.01). b 막대 그래프는 신선한 심장 슬라이스(D0)(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC) 슬라이스/그룹과 비교하여 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 후 12일의 생존력 정량화를 보여줍니다. D0에 비해 p < 0.001 및 D12 ctrl에 비해 **p < 0.01). b Гистограмma показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во во всех 4 условиях кул ьтивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/ группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 컨트롤). b 막대 그래프는 신선한 심장 절편(D0)(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC) 절편/그룹과 비교하여 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 후 12일째 생존력의 정량화를 보여줍니다. 0.001 대 D0 및 **p < 0.01 by D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和 D12 MT)，자율동료12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试;b 4 12 (D12 MC) b Гистограма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), от разных свиней 12(D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сра внению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b 신선한 심장 절편(D0)(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT)과 비교하여 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT) 모두를 보여주는 히스토그램, 다른 돼지 12(D12 MC) 절편/그룹, 일원 분산 분석 테스트; ####p<0.0001, ###p<0.001 대 D0, **p<0.01 대 . 컨트롤 D12). c 막대 그래프는 신선한 심장 슬라이스(D0)와 비교한 모든 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT)에서 배양 12일 후 포도당 플럭스의 정량화를 보여줍니다(다른 돼지에서 n = 6 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 테스트 수행, D0에 비해 ###p < 0.001, D12 Ctrl에 비해 ***p < 0.001). c 막대 그래프는 신선한 심장 슬라이스(D0)와 비교한 모든 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT)에서 배양 12일 후 포도당 플럭스의 정량화를 보여줍니다(다른 돼지에서 n = 6 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 테스트 수행, D0에 비해 ###p < 0.001, D12 Ctrl에 비해 ***p < 0.001). c Гистограмma показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во во всех 4 условиях культ ивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c 히스토그램은 신선한 심장 절편(D0)과 비교한 모든 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT)에서 배양 12일 후 포도당 플럭스의 정량화를 보여줍니다(다른 돼지의 n = 6 절편/그룹, 수행된 일원 분산 분석 테스트; D0에 비해 ###p < 0.001, D12 Ctrl에 비해 ***p < 0.001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行 ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/猪 , 来自 猪 , , , , , , , , 猪 猪向执行 ANOVA 测试; c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 일간 после культивирования для всех 4 условий к ультивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторо нний Были проведены тесты ANOVA; c 신선한 심장 절편(D0)(n = 6 절편/그룹, 다른 돼지에서)과 비교하여 모든 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT)에 대해 배양 후 12일째에 포도당 플럭스의 정량화를 보여주는 히스토그램, D0에 비해 ###p < 0.001, D12(대조군)에 비해 ***p < 0.001로 ANOVA 테스트가 수행되었습니다.d 10개의 지역 조직 절편 지점에서 신선한(파란색), 12일째 MC(녹색) 및 12일째 MT(빨간색) 조직의 변형 분석 플롯(n = 4 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 테스트, 그룹 간에 유의미한 차이는 없음).e 10-12일 동안 정적 조건(Ctrl) 또는 MT 조건(MT)에서 배양된 심장 섹션과 비교하여 신선한 심장 섹션(D0)에서 차등적으로 발현된 유전자를 보여주는 화산 플롯.f 각 배양 조건에서 배양된 심장 절편에 대한 근절 유전자의 히트맵.오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
지방산 산화에서 당분해로의 전환에 대한 대사 의존성은 심근 세포 탈분화의 특징입니다.미성숙 심근 세포는 주로 ATP 생산을 위해 포도당을 사용하며 cristae가 거의 없는 저형성 미토콘드리아를 가지고 있습니다.포도당 이용 분석은 MC 및 MT 조건에서 포도당 이용이 0일 조직과 유사하다는 것을 보여주었습니다(그림 4c).그러나 Ctrl 샘플은 신선한 조직에 비해 포도당 이용이 크게 증가한 것으로 나타났습니다.이는 CTCM과 T3/Dex의 조합이 조직 생존력을 향상시키고 12일 배양된 심장 절편의 대사 표현형을 보존함을 나타냅니다.또한 균주 분석은 MT 및 MS 조건에서 12일 동안 신선한 심장 조직에서와 동일한 균주 수준을 유지함을 보여주었습니다(그림 4d).
CTCM 및 T3/Dex가 심장 절편 조직의 전 세계 전사 환경에 미치는 전반적인 영향을 분석하기 위해 4가지 다른 배양 조건 모두에서 심장 절편에 대해 RNAseq를 수행했습니다(보충 자료 1).흥미롭게도 MT 섹션은 13,642개 유전자 중 16개만 차별적으로 발현되어 신선한 심장 조직과 높은 전사 유사성을 보였습니다.그러나 이전에 보여준 것처럼 Ctrl 슬라이스는 배양에서 10-12일 후에 1229개의 차별적으로 발현된 유전자를 표시했습니다(그림 4e).이 데이터는 심장 및 섬유아세포 유전자의 qRT-PCR에 의해 확인되었습니다(보충 그림 7a-c).흥미롭게도 Ctrl 섹션은 심장 및 세포 주기 유전자의 하향 조절과 염증 유전자 프로그램의 활성화를 보여주었습니다.이 데이터는 장기간 배양 후에 일반적으로 발생하는 탈분화가 MT 조건에서 완전히 약화됨을 시사합니다 (보충 그림 8a, b).sarcomere 유전자에 대한 신중한 연구는 MT 조건에서만 sarcomere (그림 4f)와 이온 채널 (보조 그림 9)을 암호화하는 유전자가 보존되어 Ctrl, TD 및 MC 조건에서 억제로부터 보호한다는 것을 보여주었습니다.이 데이터는 기계 및 체액 자극(T3/Dex)의 조합으로 심장 절편 전사체가 배양 12일 후 신선한 심장 절편과 유사하게 유지될 수 있음을 보여줍니다.
이러한 전사 결과는 온전하고 국소화된 코넥신 43(그림 5a)에서 볼 수 있듯이 심장 절편에서 심근 세포의 구조적 무결성이 12일 동안 MT 조건에서 가장 잘 보존된다는 사실에 의해 뒷받침됩니다.또한 MT 조건에서 심장 절편의 섬유증은 Ctrl에 비해 크게 감소했으며 신선한 심장 절편과 유사합니다(그림 5b).이 데이터는 기계적 자극과 T3/Dex 처리의 조합이 배양에서 심장 절편의 심장 구조를 효과적으로 보존함을 보여줍니다.
새로 분리된 심장 절편(D0) 또는 4개의 심장 절편 배양 조건 모두에서 12일 동안 배양된 트로포닌-T(녹색), 코넥신 43(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(눈금 막대 = 100μm).). 심장 조직 구조적 무결성의 인공 지능 정량화(다른 돼지의 n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 슬라이스/그룹, 단방향 ANOVA 테스트가 수행됩니다. D0에 비해 ####p < 0.0001 및 *p < 0.05 또는 D12 Ctrl에 비해 ****p < 0.0001). 심장 조직 구조적 무결성의 인공 지능 정량화(다른 돼지의 n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 슬라이스/그룹, 단방향 ANOVA 테스트가 수행됩니다. D0에 비해 #### p < 0.0001 및 *p < 0.05 또는 D12 Ctrl에 비해 ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искуственного интеллекта (n = 7 (D0 및 D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D 12 MC 및 D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен одноfactорный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 또는 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). 인공 지능을 사용하여 심장 조직의 구조적 무결성 정량화(다른 돼지의 n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 섹션/그룹, 일원 ANOVA 테스트 수행, #### p < 0.0001 D0 및 *p < 0.05 또는 ****p < 0.0001 D12 Ctrl에 비해).对不同猪的心脏组织结构完整性(n = 7(D0 和 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 와 D12 MT)切片/组)进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0. 0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比).对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td , d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。단방향 ANOVA 테스트로 다양한 돼지(n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 섹션/그룹)에서 인공 지능을 사용하여 심장 조직의 구조적 무결성 정량화;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0에 비해 *p < 0.05 또는 ****p < 0.0001 D12 Ctrl에 비해). b Masson's trichrome 염색으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지 및 정량화(Scale bar = 500 µm)(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9(D12 MT) 절편/다른 돼지의 그룹, 단방향 ANOVA 테스트 수행, D0에 비해 ####p < 0.0001 및 ***p < 0.001 또는 ****p < 0 D12 Ctrl에 비해 .0001). b Masson's trichrome 염색으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지 및 정량화(Scale bar = 500 µm)(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9(D12 MT) 절편/다른 돼지의 그룹, 단방향 ANOVA 테스트 수행, D0에 비해 ####p < 0.0001 및 ***p < 0.001 또는 ****p < 0 D12 Ctrl에 비해 .0001). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная) линейка = 500 mкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ### #p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson's trichrome 얼룩(축척 막대 = 500µm)으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지 및 정량화(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9(D12 MT) 절편/다른 돼지 그룹, 일원 분산 분석 수행, ####p < 0.0001 대 D0 및 ***p < 0.001 또는 ****p < 0.0001 대 D12 컨트롤). b 用Masson 3색 染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）(n=10（D0，D12 Ctrl，D12 TD 와 D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析; b 用 masson 3색 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 的 9 个 d1 2 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因方差分析；### #p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9(D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, *** p < 0,001 또는 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson's trichrome(축척 막대 = 500µm)으로 염색된 심장 절편의 대표 이미지 및 정량화(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 다른 돼지/그룹의 9(D12 MT) 절편, 하나의 ANOVA 방법; D0에 비해 ####p < 0.0001, D12에 비해 ***p < 0.001 또는 ****p < 0.0001 컨트롤).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
마지막으로, 심장 비대를 모방하는 CTCM의 능력은 심장 조직 스트레치를 증가시켜 평가했습니다.CTCM에서 최고 공기실 압력은 80mmHg에서 80mmHg로 증가했습니다.미술.(정상 스트레치) 최대 140mmHg Art.(그림 6a).이것은 신장의 32% 증가에 해당하며(그림 6b), 이전에는 비대에서 볼 수 있는 것과 유사한 근절 길이를 달성하기 위해 심장 섹션에 필요한 해당 백분율 신장으로 표시되었습니다.수축 및 이완 동안 심장 조직의 스트레치 및 속도는 배양 6일 동안 일정하게 유지되었습니다(그림 6c).MT 조건의 심장 조직은 6일 동안 정상 스트레치(MT(Normal)) 또는 오버스트레치 조건(MT(OS))에 노출되었습니다.이미 배양 4일 후, 비대 바이오마커 NT-ProBNP는 MT(정상) 조건에 비해 MT(OS) 조건에서 배지에서 상당히 증가했습니다(그림 7a).또한 배양 6일 후 MT(OS)의 세포 크기(그림 7b)는 MT 심장(정상)의 절편에 비해 유의하게 증가했습니다.또한 NFATC4 핵 전위는 과도하게 늘어난 조직에서 유의하게 증가했습니다(그림 7c).이러한 결과는 고혈압 후 병리학적 리모델링의 점진적인 발전을 보여주고 CTCM 장치가 신장 유발 심장 비대 신호를 연구하기 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다는 개념을 뒷받침합니다.
공기 챔버 압력, 유체 챔버 압력 및 조직 이동 측정의 대표적인 흔적은 챔버 압력이 유체 챔버 압력을 변경하여 조직 슬라이스의 해당 이동을 유발함을 확인합니다.b 정상적으로 늘어난(주황색) 조직 섹션과 과도하게 늘어난(파란색) 조직 섹션에 대한 대표적인 스트레치 백분율 및 스트레치 속도 곡선.c 주기 시간(다른 돼지에서 그룹당 n = 19 슬라이스), 수축 시간(다른 돼지에서 그룹당 n = 18-19 슬라이스), 이완 시간(n = 다른 돼지에서 그룹당 19 슬라이스), 조직 이동의 진폭(다른 돼지에서 n = 14 슬라이스/그룹), 최고 수축기 속도(다른 돼지에서 n = 14 슬라이스/그룹) 및 최고 이완 속도(n = 14(D 0), 15(D6) ) 섹션/그룹), 양측 스튜던트 t-테스트는 어떤 매개변수에서도 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 이러한 매개변수가 과전압 배양 6일 동안 일정하게 유지되었음을 나타냅니다.오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
a MT 일반 스트레치(Norm) 또는 오버스트레칭(OS) 조건(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS) 슬라이스/그룹에서 배양된 심장 절편의 배양 배지에서 NT-ProBNP 농도의 막대 그래프 정량화, 양방향 ANOVA가 수행됩니다. 정상 스트레치와 비교하여 **p < 0.01). a MT normal stretch(Norm) 또는 overstretching(OS) 조건에서 배양된 심장 절편의 배양 배지에서 NT-ProBNP 농도의 막대 그래프 정량화(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS) 절편/다른 돼지 그룹, 양방향 ANOVA 수행; **p < 0.01 정상 신장과 비교).정상적인 MT 스트레치(norm) 또는 오버스트레치(OS)(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4).MTOS) 슬라이스/다른 돼지의 그룹에서 배양된 심장 절편의 배양 배지에서 NT-ProBNP 농도의 정량적 히스토그램, 분산의 2인자 분석이 수행됩니다.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01, 일반 스트레치와 비교). a 에서MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化(n = 4 (D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 和 D4 MTOS)来自不同猪的切片/组, 进行双向方差分析; **与正常拉伸相比, p < 0.01). MT 정상 스트레치 (Norm) 또는 오버 스트리치 (OS) 조건 하에서 배양 된 심장 슬라이스에서 NT-ProBNP 농도의 정량화 (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm 和 d4 mtos), 상이한 切片 切片/组 组 双向 方方发 发动 发动 **;히스토그램 정상적인 MT 스트레치(norm) 또는 오버스트레치(OS) 조건에서 배양된 심장 슬라이스에서 NT-ProBNP 농도의 정량화(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm) 및 D4 MTOS) 슬라이스/다른 돼지 그룹, 양방향 분산 분석;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01, 일반 스트레치와 비교). b 트로포닌-T 및 WGA(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽)로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 세포/그룹, 서로 다른 돼지의 10개 절편, 양측 스튜던트 t-테스트가 수행됩니다. ****p < 0.0001, 정상 스트레치와 비교). b 트로포닌-T 및 WGA(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽)로 염색된 심장 절편에 대한 대표 이미지(n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 세포/그룹, 서로 다른 돼지의 10개 절편, Two-tailed Student t-test가 수행됩니다. 정상 스트레치와 비교하여 ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-кри терий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b 트로포닌-T 및 AZP(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽)로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 세포/그룹, 서로 다른 돼지의 10개 절편, 양측 스튜던트 t-테스트를 ​​수행했습니다. 정상 균주와 비교하여 ****p < 0.0001). b 用肌钙蛋白-T 和WGA(左)和细胞大小量化(右)染色心脏切片的代表性图像（n=330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验; 与正常拉伸相比，****p < 0.0001). b calcarein-T 및 WGA(왼쪽) 및 세포 크기(오른쪽)로 염색된 심장 슬라이스의 대표 이미지(n = 330(D6 MTOS), 10개의 다른 슬라이스에서 369개(D6 MTNorm)) b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 에서 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; **** p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b 트로포닌-T 및 AZP로 염색된 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 세포 크기의 정량화(오른쪽)(다른 돼지의 10개 절편에서 n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm)) 세포/그룹, 양측 기준 스튜던트 t;****p < 0.0001 정상 변형률과 비교). c 트로포닌-T 및 NFATC4에 대해 면역 표지된 0일 및 6일 MTOS 심장 슬라이스의 대표 이미지 및 NFATC4의 CM 핵으로의 전좌의 정량화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 슬라이스/다른 돼지 그룹, Two-tailed Student t-테스트가 수행됨, *p < 0.05). c 트로포닌-T 및 NFATC4에 대해 면역표지된 0일 및 6일 MTOS 심장 절편의 대표 이미지 및 NFATC4의 CM 핵으로의 전위의 정량화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 슬라이스/다른 돼지 그룹, 양측 스튜던트 t-테스트가 수행됨, *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 및 6 дней MTOS, 이미 для тропонина-Т 및 NFATC4 및 количественная оценк а транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t- критерий стьюдента; *p < 0,05). c 트로포닌-T 및 NFATC4에 대해 면역 표지된 0일 및 6일 MTOS의 심장 절편에 대한 대표 이미지 및 해면 세포의 핵에서 NFATC4 전위의 정량화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 슬라이스/다른 돼지 그룹)는 양측 스튜던트 t-테스트를 ​​수행했습니다.*p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0), 3(D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验; *p < 0.05). c 칼카닌-T 및 NFATC4 면역 표지화 ά0天和第6天MTOS 심장 절편, 및 상이한 NFATC4 易位至CM 세포 핵의 양화로부터의 NFATC4의 대표 이미지(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影; *p < 0.05). C репееентатив 익은 염천 적 MTOS на 0 и 6 день для имуно 처이 MTOS нировро 기호 적 Âter womtos ¢ rровесопонино, а а Â Â транслокации nfatc4 В ядра cm от разных сви 익 (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) срез/гуп랍, два-два-rа-rа-rа-rа-rа-rа-rа-rа-rа-серерерсу сее сее r; c 다른 돼지의 CM 핵에서 NFATC4 전좌의 정량화 및 트로포닌-T 및 NFATC4 면역 표지화를 위한 0일 및 6일째 MTOS 심장 슬라이스의 대표 이미지(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 슬라이스/그룹, 양측 t -기준 스튜던트; *p < 0.05).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
중개 심혈관 연구에는 심장 환경을 정확하게 재현하는 세포 모델이 필요합니다.이 연구에서는 심장의 초박막 부분을 자극할 수 있는 CTCM 장치를 개발하고 특성화했습니다.CTCM 시스템에는 생리학적으로 동기화된 전기 기계 자극과 T3 및 Dex 유체 강화가 포함됩니다.돼지 심장 절편이 이러한 인자에 노출되었을 때, 그들의 생존력, 구조적 완전성, 대사 활동 및 전사 발현은 배양 12일 후에 신선한 심장 조직에서와 동일하게 유지되었습니다.또한, 심장 조직의 과도한 신장은 과신전으로 인한 심장의 비대를 유발할 수 있습니다.전반적으로, 이러한 결과는 정상적인 심장 표현형을 유지하는 생리적 배양 조건의 중요한 역할을 지원하고 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공합니다.
심근 세포의 기능과 생존을 위한 최적의 환경을 만드는 데는 많은 요인이 기여합니다.이러한 요인 중 가장 분명한 것은 (1) 세포간 상호작용, (2) 전기기계적 자극, (3) 체액성 요인 및 (4) 대사 기질과 관련이 있습니다.생리학적 세포 간 상호 작용에는 세포 외 기질이 지원하는 여러 세포 유형의 복잡한 3차원 네트워크가 필요합니다.이러한 복잡한 세포 상호 작용은 개별 세포 유형의 공동 배양에 의해 시험관 내에서 재구성하기 어렵지만 심장 절편의 기관형 특성을 사용하여 쉽게 달성할 수 있습니다.
심근 세포의 기계적 스트레칭 및 전기 자극은 심장 표현형 유지에 중요합니다.기계적 자극은 hiPSC-CM 컨디셔닝 및 성숙에 널리 사용되어 왔지만 최근 몇 가지 우아한 연구에서 단축 로딩을 사용하여 문화에서 심장 조각의 기계적 자극을 시도했습니다.이러한 연구는 2D 단축 기계적 하중이 배양 중 심장의 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.이 연구에서 심장의 부분은 아이소메트릭 인장력17, 선형 영양요구 부하18로 로드되거나 심장 주기가 힘 변환기 피드백 및 장력 드라이브를 사용하여 재현되었습니다.그러나 이러한 방법은 환경 최적화 없이 일축 조직 신장을 사용하여 많은 심장 유전자의 억제 또는 비정상적인 신장 반응과 관련된 유전자의 과발현을 초래합니다.여기에 설명된 CTCM은 주기 시간 및 생리적 스트레치(25% 스트레치, 40% 수축기, 60% 확장기 및 분당 72박자) 측면에서 자연 심장 주기를 모방하는 3D 전기 기계 자극을 제공합니다.이 3차원 기계적 자극만으로는 조직 무결성을 유지하기에 충분하지 않지만 T3/Dex를 사용한 체액 자극과 기계적 자극의 조합은 조직 생존력, 기능 및 무결성을 적절하게 유지하는 데 필요합니다.
체액성 요인은 성인 심장 표현형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.이것은 세포 성숙을 가속화하기 위해 배양 배지에 T3 및 Dex를 첨가한 HiPS-CM 연구에서 강조되었습니다.T3는 세포막을 가로지르는 아미노산, 당 및 칼슘의 수송에 영향을 미칠 수 있습니다36.또한 T3는 MHC-α 발현 및 MHC-β 하향 조절을 촉진하여 태아 CM에서 느린 연축 근섬유와 비교하여 성숙한 심근 세포에서 빠른 연축 근섬유 형성을 촉진합니다.갑상선 기능 저하증 환자의 T3 결핍은 근섬유 밴드의 손실과 톤 발달 속도 감소를 초래합니다37.Dex는 글루코코르티코이드 수용체에 작용하며 고립된 관류 심장에서 심근 수축성을 증가시키는 것으로 나타났습니다.38 이러한 개선은 SOCE(calcium deposit-driven entry)39,40에 대한 효과와 관련이 있는 것으로 생각됩니다.또한 Dex는 수용체에 결합하여 면역 기능과 염증을 억제하는 광범위한 세포 내 반응을 일으킵니다30.
우리의 결과는 물리적 기계적 자극(MS)이 Ctrl에 비해 전반적인 배양 성능을 향상시켰지만 배양에서 12일 동안 생존력, 구조적 무결성 및 심장 표현을 유지하지 못했다는 것을 나타냅니다.Ctrl과 비교하여 CTCM(MT) 배양에 T3 및 Dex를 추가하면 생존력이 향상되고 12일 동안 신선한 심장 조직과 유사한 전사 프로필, 구조적 완전성 및 대사 활동이 유지됩니다.또한, 조직 신축 정도를 조절하여 STCM을 이용하여 과신전 유도 심장 비대 모델을 생성하여 STCM 시스템의 다양성을 보여줍니다.심장 리모델링 및 섬유증은 일반적으로 순환 세포가 식균 작용 및 기타 리모델링 인자뿐만 아니라 적절한 사이토카인을 제공할 수 있는 온전한 기관을 포함하지만, 심장의 일부는 여전히 스트레스 및 외상에 대한 반응으로 섬유화 과정을 모방할 수 있습니다.근섬유아세포로.이것은 이전에 이 심장 슬라이스 모델에서 평가되었습니다.CTCM 매개변수는 빈맥, 서맥 및 기계적 순환 지원(기계적 무부하 심장)과 같은 많은 조건을 시뮬레이션하기 위해 압력/전기 진폭 및 주파수를 변경하여 변조될 수 있음에 유의해야 합니다.이것은 시스템을 약물 테스트를 위한 중간 처리량으로 만듭니다.과로 유발 심장 비대를 모델링하는 CTCM의 능력은 개인화된 치료를 위해 이 시스템을 테스트할 수 있는 길을 열어줍니다.결론적으로 본 연구는 기계적 신장과 체액 자극이 심장 조직 섹션의 배양을 유지하는 데 중요하다는 것을 보여줍니다.
여기에 제시된 데이터는 CTCM이 온전한 심근을 모델링하기 위한 매우 유망한 플랫폼임을 시사하지만, 이 배양 방법에는 몇 가지 제한이 있습니다.CTCM 배양의 주요 한계는 각 주기 동안 심장 슬라이스 수축을 능동적으로 모니터링하는 기능을 배제하는 슬라이스에 지속적인 동적 기계적 응력을 부과한다는 것입니다.또한 심장 부분의 작은 크기(7mm)로 인해 기존의 힘 센서를 사용하여 배양 시스템 외부에서 수축기 기능을 평가하는 기능이 제한됩니다.현재 원고에서는 수축 기능의 지표로 광 전압을 평가하여 이 한계를 부분적으로 극복합니다.그러나 이러한 제한은 추가 작업이 필요하며 칼슘 및 전압에 민감한 염료를 사용한 광학 매핑과 같은 문화에서 심장 조각의 기능을 광학적으로 모니터링하는 방법을 도입하여 향후에 해결될 수 있습니다.CTCM의 또 다른 한계는 작업 모델이 생리적 스트레스(예압 및 후부하)를 조작하지 않는다는 것입니다.CTCM에서는 압력을 반대 방향으로 유도하여 매우 큰 조직에서 확장기(완전 확장) 및 수축기(전기 자극 중 수축 길이)의 25% 생리적 확장을 재현했습니다.이 제한은 양쪽에서 심장 조직에 적절한 압력을 가하고 심실에서 발생하는 정확한 압력-용적 관계를 적용하여 향후 CTCM 설계에서 제거되어야 합니다.
이 원고에 보고된 과도한 스트레칭으로 인한 리모델링은 비대성 하이퍼스트레치 신호를 모방하는 것으로 제한됩니다.따라서, 이 모델은 (이 시스템에 존재하지 않는) 체액 또는 신경 인자 없이 신장 유도 비대 신호 연구에 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 면역 세포와의 공동 배양, 순환 혈장 체액 인자 및 신경 세포와의 공동 배양 시 신경 분포와 같이 CTCM의 다중성을 증가시키기 위한 추가 연구가 CTCM으로 질병 모델링의 가능성을 향상시킬 것입니다.
이 연구에는 13마리의 돼지가 사용되었습니다.모든 동물 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며 University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.대동맥 궁을 고정하고 심장을 1L의 멸균 심정지(110mM NaCl, 1.2mM CaCl2, 16mM KCl, 16mM MgCl2, 10mM NaHCO3, 5U/mL 헤파린, pH 최대 7.4)로 관류했습니다. 심장은 일반적으로 10분 미만인 얼음 위의 실험실로 이송될 때까지 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보존되었습니다. 심장은 일반적으로 10분 미만인 얼음 위의 실험실로 이송될 때까지 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보존되었습니다. сердца хранили в леяно 처 woter waltrорриоп막 담근아 ско 처 растворе до транспортировки В Â hrатататорор젤er на  ч v람어. 심장은 일반적으로 10분 미만이 소요되는 얼음 위의 실험실로 운반될 때까지 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관되었습니다.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 MIN. 일반적으로 10분 미만의 얼음으로 실험실로 이송될 때까지 얼음 심정지증에 마음을 유지하십시오.
CTCM 장치는 SolidWorks 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어에서 개발되었습니다.배양 챔버, 칸막이 및 공기 챔버는 CNC 투명 아크릴 플라스틱으로 만들어집니다.직경 7mm의 백업 링은 중앙에 고밀도 폴리에틸렌(HDPE)으로 만들어졌으며 아래에 미디어를 밀봉하는 데 사용되는 실리콘 O링을 수용할 수 있는 O링 홈이 있습니다.얇은 실리카 막이 분리 플레이트에서 배양 챔버를 분리합니다.실리콘 멤브레인은 0.02인치 두께의 실리콘 시트에서 레이저로 절단되며 경도는 35A입니다.하단 및 상단 실리콘 개스킷은 1/16″ 두께의 실리콘 시트에서 레이저 절단되었으며 경도는 50A입니다.316L 스테인리스 스틸 나사와 윙 너트는 블록을 고정하고 기밀 밀봉을 만드는 데 사용됩니다.
전용 인쇄 회로 기판(PCB)은 C-PACE-EM 시스템과 통합되도록 설계되었습니다.PCB의 스위스 기계 커넥터 소켓은 은도금 구리선과 전극에 나사로 조인 청동 0-60 나사로 흑연 전극에 연결됩니다.인쇄 회로 기판은 3D 프린터의 덮개에 배치됩니다.
CTCM 장치는 심장 주기와 유사하게 제어된 순환 압력을 생성하는 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(PPD)에 의해 제어됩니다.공기실 내부의 압력이 증가함에 따라 유연한 실리콘 막이 위로 확장되어 조직 부위 아래의 매체를 밀어냅니다.이완기 동안 심장의 생리적 확장을 모방하여 조직 영역이 체액의 배출에 의해 늘어납니다.이완이 절정에 이르렀을 때 흑연 전극을 통해 전기 자극을 가하여 공기실의 압력을 낮추고 조직 절편을 수축시켰다.파이프 내부에는 공기 시스템의 압력을 감지하는 압력 센서가 있는 지혈 밸브가 있습니다.압력 센서에서 감지된 압력은 노트북에 연결된 데이터 수집기에 적용됩니다.이를 통해 가스 챔버 내부의 압력을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다.최대 챔버 압력(표준 80mmHg, 140mmHg OS)에 도달하면 데이터 수집 장치가 C-PACE-EM 시스템에 신호를 보내도록 명령하여 4V로 설정된 2ms 동안 2상 전압 신호를 생성했습니다.
심장 절편을 얻었고 6개의 웰에서의 배양 조건을 다음과 같이 수행하였다: 수확된 심장을 이송 용기로부터 차가운(4℃) 심정지가 들어 있는 트레이로 옮긴다.좌심실을 멸균 칼날로 분리하고 1-2 cm3의 조각으로 절단하였다.이 조직 블록을 조직 접착제로 조직 지지대에 부착하고 Tyrode 용액을 함유하는 진동 마이크로톰 조직 욕에 넣고 연속적으로 산소화(3g/L 2,3-부탄디온 모노옥심(BDM), 140mM NaCl(8.18g), 6mM KCl(0.447g), 10mM D-글루코스(1.86g), 10mM HEPES(2.38g), mM MgCl2(1ml 1M 용액), 1.8mM CaCl2(1.8ml 1M 용액), 최대 1L ddH2O).진동 마이크로톰은 80Hz의 주파수, 2mm의 수평 진동 진폭 및 0.03mm/s의 전진 속도에서 300μm 두께의 절편을 절단하도록 설정되었습니다.용액을 차갑게 유지하기 위해 티슈 수조를 얼음으로 둘러싸고 온도를 4°C로 유지했습니다.조직 절편을 마이크로톰 배스에서 하나의 배양 플레이트에 대해 충분한 절편이 얻어질 때까지 얼음에 지속적으로 산소가 공급된 Tyrode 용액을 포함하는 배양 배스로 옮깁니다.트랜스웰 배양을 위해 조직 절편을 멸균된 6mm 너비의 폴리우레탄 지지대에 부착하고 6ml의 최적화 배지(199 배지, 1x ITS 보충제, 10% FBS, 5ng/ml VEGF, 10ng/ml FGF-알칼리성 및 2X 항생제-항진균제)에 넣었습니다.전기 자극(10V, 주파수 1.2Hz)을 C-Pace를 통해 조직 섹션에 적용했습니다.TD 조건의 경우, 신선한 T3 및 Dex를 각 배지 교환 시 100nM 및 1μM로 첨가했습니다.배지는 하루에 3번 교체하기 전에 산소로 포화됩니다.조직 절편을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
CTCM 배양을 위해 조직 절편을 수정된 Tyrode 용액이 들어 있는 페트리 접시에 있는 맞춤형 3D 프린터에 배치했습니다.이 장치는 지지 링 면적의 25%까지 심장 조각의 크기를 늘리도록 설계되었습니다.이것은 Tyrode 용액에서 매체로 옮겨진 후 그리고 이완기 동안 심장 부분이 늘어나지 않도록 하기 위해 수행됩니다.히스토아크릴 접착제를 사용하여 300μm 두께의 절편을 직경 7mm의 지지 링에 고정했습니다.지지 링에 조직 절편을 부착한 후, 여분의 조직 절편을 잘라내어 하나의 장치에 대해 충분한 절편이 준비될 때까지 부착된 조직 절편을 얼음(4°C)의 Tyrode 용액 수조에 다시 넣습니다.모든 장치의 총 처리 시간은 2시간을 초과하지 않아야 합니다.6개의 조직 섹션을 지지 링에 부착한 후 CTCM 장치를 조립했습니다.CTCM 배양 챔버는 21ml의 전산소화 배지로 미리 채워져 있습니다.조직 절편을 배양 챔버로 옮기고 피펫으로 기포를 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 조직 섹션을 구멍으로 안내하고 제자리에 부드럽게 밀어 넣습니다.마지막으로 장치에 전극 캡을 놓고 장치를 인큐베이터로 옮깁니다.그런 다음 CTCM을 에어 튜브와 C-PACE-EM 시스템에 연결합니다.공압 액추에이터가 열리고 공기 밸브가 CTCM을 엽니다.C-PACE-EM 시스템은 2ms 동안 2상 페이싱 동안 1.2Hz에서 4V를 전달하도록 구성되었습니다.전극에 흑연이 축적되는 것을 방지하기 위해 매체는 하루에 두 번, 전극은 하루에 한 번 교체했습니다.필요한 경우 배양 웰에서 조직 절편을 제거하여 그 아래에 있을 수 있는 기포를 제거할 수 있습니다.MT 처리 조건의 경우, T3/Dex를 100nM T3 및 1μM Dex로 배지를 교체할 때마다 새롭게 첨가했습니다.CTCM 장치는 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에서 배양되었습니다.
심장 슬라이스의 늘어난 궤적을 얻기 위해 특수 카메라 시스템이 개발되었습니다.SLR 카메라(Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan)는 Navitar Zoom 7000 18-108mm 매크로 렌즈(Navitar, San Francisco, CA)와 함께 사용되었습니다.배지를 신선한 배지로 교체한 후 실온에서 시각화를 수행하였다.카메라는 51° 각도로 배치되고 비디오는 초당 30프레임으로 녹화됩니다.먼저 오픈 소스 소프트웨어(MUSCLEMOTION43)를 Image-J와 함께 사용하여 심장 슬라이스의 움직임을 정량화했습니다.노이즈를 피하기 위해 박동 심장 슬라이스에 대한 관심 영역을 정의하기 위해 MATLAB(MathWorks, Natick, MA, USA)을 사용하여 마스크를 생성했습니다.수동으로 분할된 마스크는 프레임 시퀀스의 모든 이미지에 적용된 다음 MUSCLEMOTION 플러그인으로 전달됩니다.근육 동작은 각 프레임의 평균 픽셀 강도를 사용하여 참조 프레임에 상대적인 움직임을 정량화합니다.데이터를 기록하고 필터링하여 주기 시간을 정량화하고 심장 주기 동안 조직 신장을 평가하는 데 사용했습니다.녹화된 비디오는 1차 영위상 디지털 필터를 사용하여 후처리되었습니다.조직 스트레치(peak-to-peak)를 정량화하기 위해 피크-투-피크 분석을 수행하여 기록된 신호에서 피크와 최저점을 구별했습니다.또한 신호 드리프트를 제거하기 위해 6차 다항식을 사용하여 추세 제거를 수행합니다.전체 조직 운동, 주기 시간, 이완 시간 및 수축 시간을 결정하기 위해 MATLAB에서 프로그램 코드가 개발되었습니다(보충 프로그램 코드 44).
스트레인 분석을 위해 기계적 스트레칭 평가를 위해 생성된 동일한 비디오를 사용하여 먼저 MUSCLEMOTION 소프트웨어에 따라 모션 피크(가장 높은(위) 및 가장 낮은(아래) 모션 지점)를 나타내는 두 개의 이미지를 추적했습니다.그런 다음 조직 영역을 분할하고 분할된 조직에 음영 알고리즘의 형태를 적용했습니다(보조 그림 2a).그런 다음 분할된 조직을 10개의 하위 표면으로 나누고 각 표면의 응력을 다음 방정식을 사용하여 계산했습니다. Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, 여기서 Sup 및 Sdown은 각각 직물의 상단 및 하단 그림자로부터 모양의 거리입니다(보충 그림 .2b).
심장 절편을 4% 파라포름알데히드로 48시간 동안 고정시켰다.고정 조직을 10% 및 20% 수크로스에서 1시간 동안 탈수시킨 다음, 30% 수크로스에서 밤새 탈수시켰다.그런 다음 절편을 최적 절단 온도 화합물(OCT 화합물)에 묻고 이소펜탄/드라이아이스 수조에서 서서히 동결했습니다.분리될 때까지 -80°C에서 OCT 임베딩 블록을 보관하십시오.슬라이드는 8μm 두께의 섹션으로 준비되었습니다.
심장 부분에서 OCT를 제거하려면 가열 블록의 슬라이드를 95°C에서 5분 동안 가열합니다.각 슬라이드에 1ml PBS를 추가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 실온에서 15분 동안 PBS에 0.1% Triton-X를 설정하여 섹션에 침투합니다.비특이적 항체가 샘플에 결합하는 것을 방지하기 위해 슬라이드에 3% BSA 용액 1ml를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 BSA를 제거하고 슬라이드를 PBS로 세척했습니다.연필로 각 샘플을 표시합니다.일차 항체(1% BSA에 1:200 희석)(코넥신 43(Abcam; #AB11370), NFATC4(Abcam; #AB99431) 및 트로포닌-T(Thermo Scientific; #MA5-12960)를 90분에 걸쳐 첨가한 다음 마우스 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific에 1% BSA에 1:200 희석)에 대한 이차 항체를 추가했습니다. ; #A16079), 토끼 Alexa Fluor 594(Thermo Scientific; #T6391)에 대해 추가 90분 동안 PBS로 3회 세척 표적 염색을 배경과 구별하기 위해 이차 항체만을 대조군으로 사용했습니다. 마지막으로 DAPI 핵 염색을 추가하고 슬라이드를 vectashield(Vector Laboratories)에 넣고 매니큐어로 밀봉했습니다. -x 배율) 및 40배 배율의 Keyence 현미경.
PBS에서 5 μg/ml의 WGA-Alexa Fluor 555(Thermo Scientific; #W32464)를 WGA 염색에 사용하고 실온에서 30분 동안 고정 섹션에 적용했습니다.그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고 Sudan black을 각 슬라이드에 첨가하고 30분 동안 배양했습니다.그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고 vectashield 포함 배지를 추가했습니다.슬라이드는 Keyence 현미경에서 40x 배율로 시각화되었습니다.
위에서 설명한 대로 샘플에서 OCT를 제거했습니다.OCT를 제거한 후 밤새 Bouin 용액에 슬라이드를 담그십시오.그 후 슬라이드를 증류수로 1시간 동안 헹구고 Bibrich aloe acid fuchsin 용액에 10분 동안 두었다.그런 다음 슬라이드를 증류수로 세척하고 5% 인몰리브덴/5% 인텅스텐산 용액에 10분 동안 두었다.헹구지 않고 슬라이드를 직접 아닐린 블루 용액으로 15분 동안 옮깁니다.그런 다음 슬라이드를 증류수로 세척하고 1% 아세트산 용액에 2분 동안 두었다.슬라이드를 200 N 에탄올에서 건조하고 크실렌으로 옮겼습니다.스테인드 슬라이드는 10x 대물렌즈가 있는 Keyence 현미경을 사용하여 시각화되었습니다.섬유증 면적 백분율은 Keyence Analyzer 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay(Invitrogen, Carlsbad, CA), 카탈로그 번호 V13154, 제조업체의 프로토콜에 따라 약간 수정됨.특히, MTT 분석 동안 균일한 조직 크기를 보장하기 위해 직경 6mm의 수술용 펀치를 사용했습니다.제조사의 프로토콜에 따라 MTT 기질을 포함하는 12-웰 플레이트의 웰에 조직을 개별적으로 플레이팅하였다.절편을 37℃에서 3시간 동안 배양하고 살아있는 조직이 MTT 기질을 대사하여 보라색 포르마잔 화합물을 형성합니다.MTT 용액을 1ml DMSO로 교체하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 심장 절편에서 보라색 포르마잔을 추출합니다.샘플을 96-웰 투명 바닥 플레이트에서 DMSO로 1:10으로 희석하고 Cytation 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 570nm에서 자주색 강도를 측정했습니다.판독 값은 심장의 각 조각의 무게로 정규화되었습니다.
이전에 설명한 바와 같이 포도당 활용 분석을 위해 심장 슬라이스 배지를 1 μCi/ml [5-3H]-글루코스(Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA)를 함유하는 배지로 교체했습니다.배양 4시간 후, 배지 100 μl를 0.2 N HCl 100 μl가 들어 있는 열린 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.그런 다음 튜브를 500 μl의 dH2O가 들어 있는 신틸레이션 튜브에 넣어 [3H]2O를 37°C에서 72시간 동안 증발시켰습니다.그런 다음 섬광 튜브에서 미세 원심 분리기 튜브를 제거하고 섬광 유체 10ml를 추가합니다.섬광 계수는 Tri-Carb 2900TR 액체 섬광 분석기(Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA)를 사용하여 수행되었습니다.그런 다음 [5-3H]-포도당 비활성, 불완전한 평형 및 배경, 표지되지 않은 포도당에 대한 [5-3H]-의 희석 및 섬광 카운터 효율을 고려하여 포도당 이용률을 계산했습니다.데이터는 심장 섹션의 질량으로 정규화됩니다.
Trizol에서 조직 균질화 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874를 사용하여 심장 절편에서 RNA를 분리했습니다.RNAsec 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석은 다음과 같이 수행되었습니다.
샘플당 1μg의 RNA를 RNA 라이브러리 준비를 위한 출발 물질로 사용했습니다.시퀀싱 라이브러리는 제조업체의 권장 사항에 따라 Illumina용 NEBNext UltraTM RNA 라이브러리 준비 키트(NEB, USA)를 사용하여 생성되었으며 인덱스 코드는 각 샘플의 속성 시퀀스에 추가되었습니다.간단히 말하면, 폴리-T 올리고뉴클레오티드가 부착된 자기 비드를 사용하여 전체 RNA로부터 mRNA를 정제하였다.단편화는 NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5X)에서 고온에서 2가 양이온을 사용하여 수행됩니다.첫 번째 가닥 cDNA는 랜덤 헥사머 프라이머와 M-MuLV 역전사효소(RNase H-)를 사용하여 합성되었습니다.그런 다음 두 번째 가닥 cDNA는 DNA 중합효소 I 및 RNase H를 사용하여 합성됩니다. 나머지 오버행은 엑소뉴클레아제/중합효소 활성에 의해 평활 말단으로 변환됩니다.DNA 절편의 3' 말단을 아데닐화한 후 헤어핀 루프 구조의 NEBNext Adapter를 부착하여 혼성화를 준비한다.바람직한 길이 150-200 bp의 cDNA 단편 선택용.라이브러리 단편은 AMPure XP 시스템(Beckman Coulter, Beverly, USA)을 사용하여 정제되었습니다.그런 다음 어댑터로 연결된 크기 선택 cDNA가 있는 3 μl USER Enzyme(NEB, USA)을 PCR 전에 37°C에서 15분 동안 사용한 다음 95°C에서 5분 동안 사용했습니다.그런 다음 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소, 범용 PCR 프라이머 및 인덱스(X) 프라이머를 사용하여 PCR을 수행했습니다.마지막으로 PCR 산물을 정제하고(AMPure XP 시스템) Agilent Bioanalyzer 2100 시스템에서 라이브러리 품질을 평가했습니다.그런 다음 cDNA 라이브러리는 Novaseq 시퀀서를 사용하여 시퀀싱되었습니다.Illumina의 원시 이미지 파일은 CASAVA Base Calling을 사용하여 원시 읽기로 변환되었습니다.원시 데이터는 읽기 시퀀스 및 해당 기본 품질을 포함하는 FASTQ(fq) 형식 파일에 저장됩니다.HISAT2를 선택하여 필터링된 시퀀싱 읽기를 Sscrofa11.1 참조 게놈과 일치시킵니다.일반적으로 HISAT2는 40억 염기보다 큰 게놈을 포함하여 모든 크기의 게놈을 지원하며 대부분의 매개변수에 기본값이 설정되어 있습니다.RNA Seq 데이터의 스플라이싱 읽기는 현재 사용 가능한 가장 빠른 시스템인 HISAT2를 사용하여 효율적으로 정렬할 수 있으며 다른 방법보다 동일하거나 더 나은 정확도를 제공합니다.
풍부한 전사물은 유전자 발현 수준을 직접적으로 반영합니다.유전자 발현 수준은 게놈 또는 엑손과 관련된 풍부한 전사물(시퀀싱 카운트)에 의해 평가됩니다.읽기 횟수는 유전자 발현 수준, 유전자 길이 및 시퀀싱 깊이에 비례합니다.FPKM(100만 염기쌍당 시퀀싱된 전사체의 1000 염기쌍당 단편)을 계산하고 차등 발현의 P-값을 DESeq2 패키지를 사용하여 결정했습니다.그런 다음 기본 제공 R-함수 "p.adjust"를 기반으로 하는 Benjamini-Hochberg 방법9을 사용하여 각 P 값에 대한 거짓 발견률(FDR)을 계산했습니다.
심장 절편에서 분리한 RNA는 Thermo의 SuperScript IV Vilo Master mix(Thermo, 카탈로그 번호 11756050)를 사용하여 200ng/μl 농도의 cDNA로 전환되었습니다.정량적 RT-PCR은 Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-웰 투명 반응 플레이트(Thermo, 카탈로그 번호 4483319) 및 microamp 광학 접착제(Thermo, 카탈로그 번호 4311971)를 사용하여 수행되었습니다.반응 혼합물은 5µl Taqman Fast Advanced Master mix(Thermo, cat # 4444557), 0.5µl Taqman Primer 및 3.5µl H2O 혼합으로 구성됩니다.Applied Biosystems Quantstudio 5 실시간 PCR 기기(384웰 모듈; 제품 번호 A28135)를 사용하여 표준 qPCR 주기를 실행하고 CT 값을 측정했습니다.Taqman 프라이머는 Thermo(GAPDH(Ss03375629_u1), PARP12(Ss06908795_m1), PKDCC(Ss06903874_m1), CYGB(Ss06900188_m1), RGL1(Ss06868890_m1), ACTN1(Ss01009508_m1)에서 구입했습니다. mH), GATA4(Ss03383805_u1), GJA1(Ss03374839_u1), COL1A2(Ss03375009_u1), COL3A1(Ss04323794_m1), ACTA2(Ss04245588_m1) 모든 샘플의 CT 값을 하우스키핑 유전자 GAPD로 정규화하였다. H.
NT-ProBNP의 미디어 릴리스는 제조업체의 프로토콜에 따라 NT-ProBNP 키트(돼지)(Cat. No. MBS2086979, MyBioSource)를 사용하여 평가되었습니다.간략하게, 각 샘플 및 표준 250μl를 각 웰에 중복하여 추가했습니다.샘플을 추가한 직후 Assay Reagent A 50µl를 각 웰에 추가합니다.플레이트를 부드럽게 흔들고 실런트로 밀봉합니다.그런 다음 정제를 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다.그런 다음 용액을 흡인하고 매번 1-2분 동안 세척 용액을 배양하면서 350 μl의 1X 세척 용액으로 웰을 4회 세척합니다.그런 다음 웰당 분석 시약 B 100µl를 추가하고 플레이트 밀봉제로 밀봉합니다.정제를 부드럽게 흔들고 37°C에서 30분 동안 배양했습니다.용액을 흡인하고 1X 세척 용액 350 μl로 웰을 5회 세척합니다.각 웰에 기질 용액 90 μl를 추가하고 플레이트를 밀봉합니다.플레이트를 37°C에서 10-20분 동안 배양합니다.각 웰에 정지 용액 50µl를 추가합니다.450nm로 설정된 Cytation(BioTek) 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 즉시 측정했습니다.
5% 유형 I 오류율로 매개변수의 절대적인 10% 변화를 감지하기 위해 80% 이상의 검정력을 제공할 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다. 5% 유형 I 오류율로 매개변수의 절대적인 10% 변화를 감지하기 위해 80% 이상의 검정력을 제공할 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. 검정력 분석을 수행하여 5% 유형 I 오류율로 10% 절대 매개변수 변경을 감지하기 위해 >80% 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택했습니다.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。 Был проведен analyз мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютн ого изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. 10% 절대 매개변수 변경 및 5% 제1종 오류율을 감지하기 위해 >80% 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다.조직 섹션은 실험 전에 무작위로 선택되었습니다.모든 분석은 블라인드 조건이었고 샘플은 모든 데이터가 분석된 후에만 해독되었습니다.GraphPad Prism 소프트웨어(San Diego, CA)를 사용하여 모든 통계 분석을 수행했습니다. 모든 통계에서 p-값은 0.05 미만의 값에서 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 통계에서 p-값은 0.05 미만의 값에서 유의한 것으로 간주되었습니다. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. 모든 통계에서 p-값은 0.05 미만의 값에서 유의한 것으로 간주되었습니다.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. 모든 통계에서 p-값은 0.05 미만의 값에서 유의한 것으로 간주되었습니다.양측 스튜던트 t-테스트는 단 2번의 비교로 데이터에 대해 수행되었습니다.단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 여러 그룹 간의 유의성을 결정했습니다.사후 테스트를 수행할 때 다중 비교를 설명하기 위해 Tukey의 수정이 적용되었습니다.방법 섹션에 설명된 대로 FDR 및 p.adjust를 계산할 때 RNAsec 데이터에는 특별한 통계적 고려 사항이 있습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 Nature Research Report 초록을 참조하십시오.