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AFEX로 전처리한 옥수수 줄기 내 잔류 올리고당의 복합 분석을 위한 새로운 면역학적 및 질량 분석법. 목질셀룰로오스 바이오매스는 화석 연료의 지속 가능한 대안이며, 식품, 사료, 연료 및 화학물질과 같은 제품 생산을 위한 생명공학 기술 개발에 널리 사용됩니다. 이러한 기술의 핵심은 식물 세포벽에 존재하는 복합 탄수화물을 포도당, 자일로스, 아라비노스와 같은 단당으로 전환하는 비용 경쟁력 있는 공정 개발입니다. 목질셀룰로오스 바이오매스는 매우 반응성이 강하기 때문에 원하는 생성물을 얻으려면 열화학적 처리(예: 암모니아 섬유 박리(AFEX), 묽은 산(DA), 이온성 액체(IL))와 생물학적 처리(예: 효소 가수분해 및 미생물 발효)를 병행해야 합니다. 그러나 시판되는 곰팡이 효소를 가수분해 공정에 사용할 경우, 생성되는 가용성 당의 75~85%만이 단당류이고, 나머지 15~25%는 미생물이 항상 이용할 수 있는 것은 아닌 가용성의 난용성 올리고당입니다. 이전에 저희는 탄소 및 규조토 분리법과 크기 배제 크로마토그래피를 병행하여 가용성의 난용성 올리고당을 성공적으로 분리 및 정제했으며, 효소 저해 특성도 조사했습니다. 중합도(DP)가 높은 메틸화 우론산 치환 올리고당은 저중합도 및 중성 올리고당보다 시판 효소 블렌드로 처리하기가 더 어렵다는 것을 발견했습니다. 본 연구에서는 식물 바이오매스 글리칸에 특이적인 단일클론 항체(mAb)를 이용한 글리칸 프로파일링을 통해 식물 세포벽과 효소 가수분해물의 글리칸 결합을 특성화하는 방법, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MADI-ADI), 비행시간형 질량 분석법(TOF-MS) 등 여러 가지 추가 방법을 활용하여 보고합니다. MALDI-TOF-MS는 음이온의 2차 붕괴 후 분광법으로 얻은 구조 정보 진단 피크, 가스 크로마토그래피 및 질량 분석법(GC-MS)을 사용하여 유도체화 유무에 관계없이 올리고당 결합을 특성화합니다. 올리고당의 크기가 작기 때문에(DP 4–20), 이러한 분자는 mAb 결합 및 특성 분석에 사용하기 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 저희는 새로운 바이오틴 접합 기반 올리고당 고정화 방법을 적용하여 마이크로플레이트 표면에서 저분자량(DP)의 가용성 올리고당 대부분을 성공적으로 표지했습니다. 이 표지된 올리고당은 고처리량 단클론항체 시스템에서 특이적 결찰 분석을 위해 사용되었습니다. 이 새로운 방법은 향후 진단 목적으로 바이오마커에 존재하는 올리고당을 분리하고 특성화하는 데 사용될 수 있는 더욱 진보된 고처리량 당 분석법 개발을 촉진할 것입니다.
농업, 임업, 목질 및 목질 재료로 구성된 목질 셀룰로스 바이오매스는 식품, 사료, 연료 및 화학 전구체를 포함한 바이오 기반 제품 생산을 위한 잠재적인 공급 원료로, 고부가가치 제품을 생산합니다.1 식물 세포벽에 존재하는 탄수화물(셀룰로스 및 헤미셀룰로스 등)은 화학적 처리 및 생물변환(효소 가수분해 및 미생물 발효 등)을 통해 단당류로 분해됩니다. 일반적인 전처리에는 암모니아 섬유 팽창(AFEX), 묽은 산(DA), 이온성 액체(IL), 증기 폭발(SE)이 있으며, 이는 화학 물질과 열을 결합하여 식물 세포벽을 열어 목질 셀룰로스 생성을 줄입니다.3,4 물질의 완고함,5. 효소 가수분해는 상업용 활성 탄수화물 함유 효소(CAZymes)를 사용하여 고형분 부하에서 수행되고 형질전환 효모 또는 박테리아를 사용하는 미생물 발효를 통해 바이오 기반 연료 및 화학 물질을 생산합니다.6.
상업용 효소에 함유된 CAZyme은 복잡한 탄수화물-당 결합을 시너지 효과로 절단하여 단당류를 형성하는 효소들의 복잡한 혼합물로 구성됩니다. 앞서 보고한 바와 같이, 리그닌과 탄수화물의 방향족 중합체로 이루어진 복잡한 네트워크는 리그닌의 분해를 매우 어렵게 만들어 당 전환이 불완전하게 발생하고, 전처리된 바이오매스의 효소 가수분해 과정에서 생성되지 않은 올리고당의 15~25%가 축적됩니다. 이는 다양한 바이오매스 전처리 방법에서 흔히 발생하는 문제입니다. 이러한 병목 현상의 원인으로는 가수분해 중 효소 저해, 또는 식물 바이오매스에서 당 결합을 분해하는 데 필요한 필수 효소의 부재 또는 낮은 수준 등이 있습니다. 올리고당의 당 결합과 같은 당의 구성 및 구조적 특성을 이해하면 가수분해 중 당 전환율을 개선하여 생명공학 공정을 석유 유래 제품과 비용 경쟁력을 확보하는 데 도움이 될 것입니다.
탄수화물의 구조를 결정하는 것은 어려운 일이며, 액체 크로마토그래피(LC)11,12, 핵자기공명분광법(NMR)13, 모세관 전기영동(CE)14,15,16, 질량 분석법(MS)17과 같은 여러 방법을 조합하여 사용해야 합니다. 18. 레이저 탈착 및 매트릭스를 이용한 이온화를 이용한 비행시간형 질량 분석법(MALDI-TOF-MS)과 같은 질량 분석법은 탄수화물 구조를 식별하는 데 매우 유용한 방법입니다. 최근에는 나트륨 이온 부가물의 충돌 유도 해리(CID) 탠덤 질량 분석법이 올리고당 부착 위치, 아노머 배열, 서열 및 분지 위치20, 21에 해당하는 지문을 식별하는 데 가장 널리 사용되고 있습니다.
글리칸 분석은 탄수화물 결합을 심층적으로 식별하는 데 탁월한 도구입니다.22 이 방법은 식물 세포벽 글리칸에 대한 단일클론 항체(mAb)를 프로브로 사용하여 복잡한 탄수화물 결합을 이해합니다. 전 세계적으로 250개 이상의 mAb가 사용 가능하며, 다양한 당류를 사용하여 다양한 선형 및 분지형 올리고당에 대해 설계되었습니다.24 식물 세포벽의 구조, 구성 및 변형을 특성화하는 데 여러 mAb가 널리 사용되어 왔습니다. 식물 세포 유형, 기관, 연령, 발생 단계 및 생장 환경에 따라 상당한 차이가 있기 때문입니다.25,26 최근 이 방법은 식물 및 동물 시스템의 소포 집단과 세포 내 마커, 발생 단계 또는 환경 자극에 의해 결정되는 글리칸 수송에서의 각각의 역할을 이해하고 효소 활성을 결정하는 데 사용되었습니다. 확인된 글리칸과 자일란의 다양한 구조에는 펙틴(P), 자일란(X), 만난(M), 자일로글루칸(XylG), 혼합 결합 글루칸(MLG), 아라비녹실란(ArbX), 갈락토만난(GalG), 글루쿠론산-아라비녹실란(GArbX) 및 아라비노-갈락탄(ArbG)29이 있습니다.
그러나 이러한 모든 연구 노력에도 불구하고, 고형분 함량(HSL) 가수분해 중 올리고당 축적의 특성, 즉 올리고당 방출, 가수분해 중 올리고머 사슬 길이 변화, 다양한 저분자량(DP) 중합체 및 이들의 곡선 분포에 초점을 맞춘 연구는 극소수에 불과합니다(30,31,32). 한편, 글리칸 분석은 글리칸 구조의 포괄적인 분석에 유용한 도구로 입증되었지만, 항체 분석법을 사용하여 수용성 저분자량 올리고당을 평가하는 것은 어렵습니다. 분자량이 5-10 kDa 미만인 더 작은 저분자량 올리고당은 ELISA 플레이트에 결합하지 않으며(33,34), 항체 첨가 전에 세척됩니다.
본 연구에서는 아비딘 코팅 플레이트에서 단일클론 항체를 사용하여 ELISA 분석을 최초로 시연합니다. 이 분석은 가용성 난치성 올리고당에 대한 단일 단계 바이오티닐화 과정과 글리콤 분석을 결합한 것입니다. 본 연구의 글리콤 분석 접근법은 가수분해된 당 조성의 트리메틸실릴(TMS) 유도체화를 이용한 상보적 올리고당 결합의 MALDI-TOF-MS 및 GC-MS 기반 분석을 통해 검증되었습니다. 이 혁신적인 접근법은 향후 고처리량 분석법으로 개발되어 생의학 연구에 폭넓게 적용될 수 있을 것입니다.35
효소와 항체의 번역 후 변형(예: 당화)은36 생물학적 활성에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 혈청 단백질의 당화 변화는 염증성 관절염에서 중요한 역할을 하며, 이러한 당화 변화는 진단 마커로 사용됩니다37. 문헌에 따르면 다양한 글리칸은 위장관 및 간의 만성 염증성 질환, 바이러스 감염, 난소암, 유방암, 전립선암을 포함한 다양한 질병에서 쉽게 발견되는 것으로 보고되었습니다38,39,40. 항체 기반 글리칸 ELISA 방법을 사용하여 글리칸의 구조를 이해하면 복잡한 MS 방법을 사용하지 않고도 질병 진단에 대한 확신을 높일 수 있습니다.
이전 연구에서는 고착성 올리고당이 전처리 및 효소 가수분해 후에도 가수분해되지 않은 상태로 남아 있음을 보여주었습니다(그림 1). 이전 연구에서는 AFEX로 전처리한 옥수수대 가수분해물(ACSH)8에서 올리고당을 분리하기 위해 활성탄 고상 추출법을 개발했습니다. 초기 추출 및 분리 후, 올리고당은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가 분획하고 분자량 순으로 수집했습니다. 다양한 전처리에서 분리된 당 단량체와 올리고머는 당 조성 분석을 통해 분석했습니다. 다양한 전처리 방법으로 얻은 당 올리고머의 함량을 비교할 때, 고착성 올리고당의 존재는 바이오매스를 단당류로 전환하는 과정에서 흔히 발생하는 문제이며, 이는 당 수율을 최소 10-15%, 심지어 최대 18%까지 감소시킬 수 있습니다. 미국. 이 방법은 올리고당 분획의 추가 대량 생산에 사용됩니다. 그 결과로 생성된 ACH와 그에 따른 다양한 분자량을 갖는 분획은 이 연구에서 올리고당의 특성을 분석하기 위한 실험 물질로 사용되었습니다.
전처리 및 효소 가수분해 후, 잔류 올리고당은 가수분해되지 않은 상태로 남아 있었습니다. (A)는 활성탄과 규조토로 구성된 충진층을 이용하여 AFEX 전처리 옥수수대 가수분해물(ACSH)에서 올리고당을 분리하는 올리고당 분리 방법입니다. (B) 올리고당 분리 방법입니다. 올리고당은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가 분리되었습니다. (C) 다양한 전처리(희석산: DA, 이온성 액체: IL 및 AFEX)를 통해 분리된 당 단량체 및 올리고머입니다. 효소 가수분해 조건: 25%(w/w)의 높은 고형물 부하(글루칸 부하량 약 8%), 96시간 가수분해, 20mg/g 상업용 효소 부하(Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 비율) 및 (D) AFEX 전처리 옥수수 짚(ACS)에서 방출된 포도당, 자일로스 및 아라비노스의 당 단량체 및 올리고머.
글리칸 분석은 고체 바이오매스 잔류물에서 분리한 추출물 내 글리칸의 포괄적인 구조 분석에 유용한 도구임이 입증되었습니다. 그러나 저분자량 올리고당은 ELISA 플레이트에 고정하기 어렵고 항체 첨가 전에 세척되기 때문에 이러한 전통적인 방법에서는 수용성 당류가 과소 평가됩니다.41 따라서 항체 결합 및 특성 분석을 위해, 아비딘 코팅 ELISA 플레이트에 가용성이고 순응성이 없는 올리고당을 코팅하기 위해 단일 단계 바이오티닐화 방법을 사용했습니다. 이 방법은 기존에 제작한 ACSH와 분자량(또는 중합도, DP)에 기반한 분획을 사용하여 테스트했습니다. 단일 단계 바이오티닐화는 탄수화물의 환원 말단에 바이오틴-LC-히드라지드를 첨가하여 올리고당 결합 친화도를 증가시키는 데 사용되었습니다(그림 2). 용액에서 환원 말단의 헤미아세탈기는 바이오틴-LC-히드라지드의 히드라지드기와 반응하여 히드라존 결합을 형성합니다. 환원제 NaCNBH3의 존재 하에서 히드라존 결합은 안정한 비오틴화된 최종 생성물로 환원됩니다. 당 환원 말단의 변형을 통해 저당도 올리고당의 ELISA 플레이트 결합이 가능해졌으며, 본 연구에서는 글리칸 표적 단클론 항체를 사용하여 아비딘 코팅 플레이트에서 이 결합을 수행했습니다.
ELISA를 이용한 바이오틴화 올리고당에 대한 단일클론 항체 스크리닝. (A) 올리고당의 바이오틴화와 NeutrAvidin 코팅 플레이트에서 글리칸 표적 단일클론 항체를 이용한 ELISA 스크리닝을 병행한 결과, (B) 반응 생성물의 바이오틴화를 위한 단일 단계 절차를 보여줍니다.
올리고당이 결합된 항체가 있는 아비딘 코팅 플레이트를 1차 및 2차 항체에 첨가하고 빛과 시간에 민감한 배지에서 세척했습니다. 항체 결합이 완료되면 TMB 기질을 첨가하여 플레이트를 배양했습니다. 최종적으로 황산으로 반응을 중단했습니다. 배양된 플레이트를 ELISA 판독기를 사용하여 각 항체의 결합 강도를 측정하고 항체 특이적 가교 결합을 검출했습니다. 실험에 대한 자세한 내용과 매개변수는 해당 섹션의 "재료 및 방법"을 참조하십시오.
본 연구에서는 ACSH뿐만 아니라 목질셀룰로오스 가수분해물에서 분리한 조올리고당 및 정제올리고당 분획에 존재하는 가용성 올리고당의 특성을 분석함으로써 이 새롭게 개발된 방법이 특정 응용 분야에 유용함을 입증합니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 바이오아실화 글리콤 분석법을 사용하여 ACSH에서 확인된 가장 흔한 에피토프 치환 자일란은 대개 우론산(U) 또는 메틸우론산(MeU)과 펙틴산 아라비노갈락탄입니다. 이들 중 대부분은 비가수분해 고형물(UHS)의 글리칸 분석에 대한 이전 연구에서도 발견되었습니다.43
세포벽 글리칸에 대한 단일클론 항체를 사용하여 난용성 올리고당 에피토프를 검출합니다. "중성" 분획은 ACN 분획이고 "산성" 분획은 FA 분획입니다. 히트맵에서 더 밝은 빨간색은 에피토프 함량이 높음을 나타내고, 더 밝은 파란색은 빈 배경을 나타냅니다. 눈금의 색상 값은 N=2인 제형의 원시 OD 값을 기준으로 합니다. 항체가 인식하는 주요 에피토프는 오른쪽에 표시되어 있습니다.
이러한 비셀룰로오스 구조는 가장 흔히 사용되는 상업용 효소를 포함하는 시험용 상업용 효소 혼합물에서 가장 흔한 셀룰라아제와 헤미셀룰라아제로는 절단할 수 없었습니다. 따라서 가수분해를 위해서는 새로운 보조 효소가 필요합니다. 필수적인 비셀룰로오스 보조 효소가 없으면, 이러한 비셀룰로오스 결합은 모당 중합체를 더 짧은 단편으로 광범위하게 가수분해하고 상업용 효소 혼합물을 사용하여 용해하더라도 단당류로의 완전한 전환을 방해합니다.
신호 분포와 결합 강도에 대한 추가 연구에서는 높은 DP 당 분획(A, B, C, DP 최대 20+)에서 결합 에피토프가 낮은 DP 분획(D, E, F, DP)보다 이량체에서 낮다는 것을 보여주었습니다(그림 1). 산성 단편은 중성 단편보다 비셀룰로오스 에피토프에서 더 흔합니다. 이러한 현상은 높은 DP 및 산성 부분이 효소 가수분해에 더 저항성이 있다는 이전 연구에서 관찰된 패턴과 일치합니다. 따라서 비셀룰로오스 글리칸 에피토프와 U 및 MeU 치환의 존재는 올리고당의 안정성에 크게 기여할 수 있습니다. 낮은 DP 올리고당의 경우, 특히 에피토프가 이량체 또는 삼량체 올리고당인 경우 결합 및 검출 효율이 문제가 될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이는 특정 mAb에 결합하는 에피토프를 하나만 포함하는 다양한 길이의 시판 올리고당을 사용하여 테스트할 수 있습니다.
따라서 구조 특이적 항체를 사용하여 특정 유형의 난치성 결합을 확인했습니다. 사용된 항체의 종류, 적절한 연결 패턴, 그리고 생성되는 신호 강도(최대 및 최소)에 따라 새로운 효소를 확인하고 효소 혼합물에 반정량적으로 첨가하여 더욱 완전한 당전환을 달성할 수 있습니다. ACSH 올리고당 분석을 예로 들어, 각 바이오매스 물질에 대한 글리칸 결합 데이터베이스를 구축할 수 있습니다. 여기서 항체의 친화도 차이를 고려해야 하며, 친화도를 알 수 없는 경우 서로 다른 항체의 신호를 비교할 때 어려움이 발생할 수 있습니다. 또한, 동일한 항체에 대한 샘플 간의 글리칸 결합 비교가 가장 효과적일 수 있습니다. 이러한 난치성 결합을 CAZyme 데이터베이스에 연결하여 효소를 확인하고, 후보 효소를 선정하고, 결합 파괴 효소를 검사하거나, 바이오리파이너리에서 사용할 수 있도록 이러한 효소를 발현하는 미생물 시스템을 개발할 수 있습니다.44
목질셀룰로오스 가수분해물에 존재하는 저분자량 올리고당의 특성 분석을 위한 대체 방법을 면역학적 방법이 어떻게 보완하는지 평가하기 위해, MALDI(그림 4, S1-S8)와 동일 패널(그림 5)의 올리고당 부분에 대한 GC-MS 기반 TMS 유래 당 분석을 수행했습니다. MALDI는 올리고당 분자의 질량 분포가 의도된 구조와 일치하는지 비교하는 데 사용됩니다. 그림 4는 중성 성분인 ACN-A와 ACN-B의 질량 분포를 보여줍니다. ACN-A 분석 결과, DP 4-8(그림 4)에서 DP 22(그림 S1)에 이르는 다양한 펜토스 당이 확인되었으며, 이들의 질량은 MeU-자일란 올리고당에 해당합니다. ACN-B 분석 결과, DP 8-15를 갖는 펜토스 및 글루콕실란 계열이 확인되었습니다. 그림 S3과 같은 보충 자료에서, FA-C 산성 부분 질량 분포도는 DP가 8~15인 다양한 (Me)U 치환된 오탄당을 보여주는데, 이는 ELISA 기반 단클론 항체 스크리닝에서 발견되는 치환된 자일란과 일치합니다. 에피토프 또한 일치합니다.
ACS에 존재하는 가용성 비순응성 올리고당의 MALDI-MS 스펙트럼. (A) 메틸화된 우론산(DP 4-8)으로 치환된 글루쿠록실란 올리고당을 함유하는 ACN-A 저중량 범위 분획, (B) 글루쿠록실란(DP 8-15)으로 치환된 ACN-B 자일란 및 메틸화된 우론산 올리고당을 나타낸다.
난치성 올리고당의 글리칸 잔기 조성 분석. (A) GC-MS 분석을 이용하여 얻은 다양한 올리고당 분획의 TMS 당 조성. (B) 올리고당에 존재하는 다양한 TMS 유래 당의 구조. ACN - 중성 올리고당을 포함하는 아세토니트릴 분획, FA - 산성 올리고당을 포함하는 페룰산 분획.
그림 S9에 나타난 바와 같이 올리고당 분획의 LC-MS 분석에서도 또 다른 흥미로운 결론이 도출되었습니다(분석 방법은 전자 보충 자료 참조). ACN-B 분획의 연결 과정에서 헥소스와 -OAc기의 단편이 반복적으로 관찰되었습니다. 이는 글리콤 및 MALDI-TOF 분석에서 관찰된 단편화를 확인할 뿐만 아니라, 전처리된 목질셀룰로오스 바이오매스에서 잠재적인 탄수화물 유도체에 대한 새로운 정보를 제공합니다.
TMS 당 유도체화를 이용하여 올리고당 분획의 당 조성을 분석했습니다. GC-MS를 사용하여 올리고당 분획에서 신경당(비유도체)과 산성당(GluA와 GalA)의 조성을 확인했습니다(그림 5). 글루쿠론산은 산성 성분 C와 D에, 갈락투론산은 산성 성분 A와 B에 존재하며, 두 성분 모두 산성당의 고밀도 당(DP) 성분입니다. 이러한 결과는 ELISA 및 MALDI 데이터를 확인할 뿐만 아니라, 올리고당 축적에 대한 기존 연구 결과와도 일치합니다. 따라서 올리고당의 바이오틴화 및 후속 ELISA 스크리닝을 이용한 최신 면역학적 방법이 다양한 생물학적 시료에서 용해성 난치성 올리고당을 검출하기에 충분하다고 생각합니다.
ELISA 기반 mAb 스크리닝 방법은 여러 가지 다른 방법으로 검증되었으므로, 이 새로운 정량적 방법의 잠재력을 더욱 탐구하고자 했습니다. 두 가지 상용 올리고당인 자일로헥사사카라이드 올리고당(XHE)과 23-α-L-아라비노푸라노실-자일로트리오스(A2XX)를 구입하여 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 새로운 mAb 접근법을 사용하여 테스트했습니다. 그림 6은 바이오틴 결합 신호와 올리고당 농도의 log 농도 사이의 선형 상관관계를 보여주며, 이는 랭뮤어 흡착 모델 가능성을 시사합니다. mAb 중 CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, CCRC-M151은 XHE와 상관관계를 보였고, CCRC-M108, CCRC-M109, LM11은 1nm에서 100nm의 범위에서 A2XX와 상관관계를 보였습니다. 실험 중 항체의 가용성이 제한적이어서 각 올리고당 농도에 대한 실험은 제한적으로 수행되었습니다. 일부 항체는 동일한 올리고당을 기질로 사용하더라도 매우 다르게 반응한다는 점에 유의해야 합니다. 이는 항체가 약간 다른 에피토프에 결합하고 결합 친화도가 매우 다를 수 있기 때문일 것입니다. 새로운 mAb 접근법을 실제 샘플에 적용하면 정확한 에피토프 식별의 메커니즘과 함의는 훨씬 더 복잡해질 것입니다.
두 가지 상용 올리고당을 사용하여 다양한 글리칸 표적 mAb의 검출 범위를 측정했습니다. 올리고당 농도의 log 농도에 따른 선형 상관관계는 (A) XHE와 mAb의 랭뮤어 흡착 패턴을 나타내며, (B) A2XX와 mAb의 랭뮤어 흡착 패턴을 나타냅니다. 해당 에피토프는 이 분석에서 기질로 사용된 상용 올리고당의 구조를 나타냅니다.
글리칸 표적 단일클론 항체(글리코믹 분석 또는 ELISA 기반 mAb 스크리닝)를 사용하는 것은 식물 바이오매스를 구성하는 대부분의 주요 세포벽 글리칸을 심층적으로 특성화하는 강력한 도구입니다. 그러나 기존의 글리칸 분석은 대부분의 올리고당이 ELISA 플레이트에 효율적으로 고정화되지 않기 때문에 더 큰 세포벽 글리칸만 특성화합니다. 본 연구에서는 AFEX 전처리 옥수수대를 고형분 함량에서 효소 가수분해했습니다. 당 분석을 통해 가수분해물 내 난분해성 세포벽 탄수화물의 조성을 확인했습니다. 그러나 가수분해물 내 작은 올리고당에 대한 mAb 분석은 과소평가되고 있으며, ELISA 플레이트에 올리고당을 효과적으로 고정화하기 위한 추가적인 도구가 필요합니다.
본 연구에서는 올리고당 바이오티닐화와 NeutrAvidin™ 코팅 플레이트에서의 ELISA 스크리닝을 병행하는 새롭고 효율적인 올리고당 고정화 방법을 보고합니다. 고정화된 바이오티닐화 올리고당은 항체에 대한 충분한 친화도를 보여 난용성 올리고당을 신속하고 효율적으로 검출할 수 있었습니다. 질량 분석법을 기반으로 한 이러한 난용성 올리고당의 성분 분석은 이 새로운 면역 스크리닝 접근법의 결과를 확인시켜 주었습니다. 따라서 본 연구는 올리고당 바이오티닐화와 글리칸 표적 단일클론 항체를 이용한 ELISA 스크리닝의 조합이 올리고당의 가교 결합을 검출하는 데 사용될 수 있으며, 올리고당의 구조를 규명하는 다른 생화학 연구에도 널리 적용될 수 있음을 보여줍니다.
이 바이오틴 기반 글리칸 프로파일링 방법은 식물 바이오매스에서 가용성 올리고당의 난용성 탄수화물 결합을 연구할 수 있는 최초의 연구입니다. 이는 바이오매스의 일부 부분이 바이오연료 생산에 있어 왜 그렇게 고착되는지 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 글리콤 분석 방법의 중요한 간극을 메우고 식물 올리고당을 넘어 더 광범위한 기질로 적용 범위를 확장합니다. 향후 바이오틴화에 로봇 기술을 활용하고, ELISA를 이용한 고처리량 시료 분석에 개발한 방법을 활용할 계획입니다.
파이오니어 33A14 교배종 종자에서 재배한 옥수수짚(CS)은 2010년 콜로라도주 레이에 있는 크래머 농장에서 수확되었습니다. 토지 소유주의 허가를 받아 이 바이오매스를 연구용으로 사용할 수 있습니다. 샘플은 습기가 6% 미만인 상태로 지퍼백에 담아 실온에서 보관했습니다. 샘플은 습기가 6% 미만인 상태로 지퍼백에 담아 실온에서 보관했습니다. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. 샘플은 실내 온도와 습도가 6% 미만인 지퍼백에 넣어 보관했습니다.제품은 室温下以干燥< 6% 의 물분율이 自封袋中입니다.제품 재고가 室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностьу < 6%. 샘플은 습도 < 6%의 실온에 지퍼백에 보관합니다.본 연구는 지역 및 국가 지침을 준수했습니다. 성분 분석은 NREL 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 성분 분석 결과, 글루칸 31.4%, 자일란 18.7%, 아라비난 3.3%, 갈락탄 1.2%, 아세틸 2.2%, 리그닌 14.3%, 단백질 1.7%, 회분 13.4%로 구성되었습니다.
Cellic® CTec2(138mg 단백질/ml, lot VCNI 0001)는 Novozymes(미국 노스캐롤라이나주 프랭클린턴)에서 제조한 셀룰라아제, β-글루코시다아제, Cellic® HTec2(157mg 단백질/ml, lot VHN00001)의 복합 혼합물입니다. 펙틴 분해 효소의 복합 혼합물인 Multifect Pectinase®(72mg 단백질/ml)는 DuPont Industrial Biosciences(미국 캘리포니아주 팔로알토)에서 기증했습니다. 효소 단백질 농도는 킬달 질소 분석법(AOAC 방법 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., 미국 뉴욕주 이타카)을 사용하여 단백질 함량을 추정하고 비단백질 질소 함량을 차감하여 측정했습니다. 규조토 545는 EMD Millipore(미국 매사추세츠주 빌러리카)에서 구입했습니다. 활성탄(DARCO, 100메시 과립), Avicel(PH-101), 너도밤나무 자일란 및 기타 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다.
AFEX 전처리는 GLBRC(Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA)에서 수행되었습니다. 전처리는 140°C에서 15분 동안 수행되었습니다. 스테인리스 스틸 벤치탑 배치 반응기(Parr Instruments Company)에 무수 암모니아와 바이오매스의 60%(w/w) 비율로 1:1로 투입하여 46시간 동안 반응했습니다. 반응 시간은 30분이었습니다. 반응기를 140°C로 가열하자 암모니아가 빠르게 방출되어 바이오매스가 실온으로 빠르게 회복되었습니다. AFEX 전처리 옥수수대(ACS)의 조성은 무처리 옥수수대(UT-CS)의 조성과 유사했습니다.
고형분 함량이 높은 ACSH 25%(w/w)(덱스트란 함량 약 8%)를 올리고당 대량 생산을 위한 출발 물질로 제조하였다. ACS의 효소 가수분해는 Cellic® Ctec2(글루칸 1g당 단백질 10mg, 전처리 바이오매스), Htec2(노보자임스, 노스캐롤라이나주 프랭클린턴), 글루칸 1g당 단백질 5mg, 그리고 Multifect Pectinase(제넨코, 미국)를 포함하는 시판 효소 혼합물을 사용하여 수행하였다. 효소 가수분해는 작업 용량 3L, pH 4.8, 50°C, 250 rpm의 5L 생물 반응기에서 수행하였다. 96시간 동안 가수분해한 후, 가수분해물을 6000 rpm에서 30분간 원심분리하고, 그 후 14000 rpm에서 30분간 원심분리하여 가수분해되지 않은 고형물을 제거했습니다. 그런 다음, 가수분해물을 0.22 mm 필터 비이커를 사용하여 멸균 여과했습니다. 여과된 가수분해물은 멸균 병에 담아 4°C에서 보관한 후 탄소 분획으로 분리했습니다.
NREL 실험실 분석 절차에 따른 추출물 기반 바이오매스 샘플의 구성 분석: 구성 분석을 위한 샘플 준비(NREL/TP-510-42620) 및 바이오매스의 구조적 탄수화물 및 리그닌 결정(NREL/TP-510-42618)47.
가수분해물 스트림의 올리고당 분석은 오토클레이브 기반 산 가수분해법을 사용하여 2ml 규모로 수행되었습니다. 가수분해물 시료를 10ml 스크류 캡 배양 튜브에 넣고 72% 황산 69.7µl와 혼합한 후, 121°C의 벤치탑에서 1시간 동안 배양하고 얼음 위에서 식힌 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 바이알에 여과했습니다. 올리고당 농도는 산 가수분해된 시료의 총 당 농도에서 가수분해되지 않은 시료의 단당류 농도를 빼서 측정했습니다.
산 가수분해된 바이오매스 내 포도당, 자일로스, 아라비노스 농도는 Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼에 오토샘플러, 컬럼 히터, 등용매 펌프, 굴절률 검출기를 장착한 Shimadzu HPLC 시스템을 사용하여 분석했습니다. 컬럼은 50°C로 유지되었고, 5 mM H₂SO₄를 0.6 ml/min의 유량으로 용출했습니다.
가수분해물 상층액을 희석하여 단량체 및 올리고당 함량을 분석하였다. 효소 가수분해 후 얻은 단량체 당은 Bio-Rad(Hercules, CA) Aminex HPX-87P 컬럼과 애쉬 가드 컬럼이 장착된 HPLC로 분석하였다. 컬럼 온도는 80°C로 유지하였고, 이동상은 물을 0.6 ml/min의 유속으로 사용하였다. 올리고당은 참고문헌 41, 48, 49에 기재된 방법에 따라 121°C에서 묽은 산을 이용하여 가수분해하여 측정하였다.
사카라이드 분석은 이전에 설명된 절차 27, 43, 50, 51을 사용하여 원시, AFEX 전처리 및 모든 비가수분해 바이오매스 잔류물(연속 세포벽 추출물 생산 및 해당 mAb 스크리닝 포함)에서 수행되었습니다.글리콤 분석을 위해 식물 세포벽 재료의 알코올 불용성 잔류물은 바이오매스 잔류물에서 준비되고 이전에 설명된 바와 같이 옥살산 암모늄(50mM), 탄산나트륨(50mM 및 0.5% w/v), CON(1M 및 4M, 둘 다 1% w/v 수소화붕소나트륨 함유) 및 산성 아염소산염과 같은 점점 더 공격적인 시약으로 연속 추출됩니다52,53. 그런 다음 추출물을 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 mAb50의 복합 패널에 대해 ELISA를 수행했고 mAb 결합 반응은 열 지도로 표시했습니다. 식물 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 mAb는 실험실 재고(CCRC, JIM 및 MAC 시리즈)에서 구입했습니다.
올리고당의 1단계 바이오틴화. 탄수화물과 바이오틴-LC-히드라지드의 접합은 다음 절차를 사용하여 수행했습니다. 바이오틴-LC-히드라지드(4.6 mg/12 μmol)를 디메틸 설폭사이드(DMSO, 70 μl)에 넣고 격렬하게 교반하면서 65°C에서 1분간 가열하여 용해했습니다. 빙초산(30 μl)을 첨가하고, 혼합물을 시아노수소화붕소나트륨(6.4 mg/100 μmol)에 붓고 65°C에서 약 1분간 가열한 후 완전히 용해했습니다. 그런 다음, 반응 혼합물 5~8 μl를 건조된 올리고당(1~100 nmol)에 첨가하여 환원 말단에 비해 10배 이상의 몰 과량의 표지를 얻었습니다. 반응을 65°C에서 2시간 동안 수행한 후, 샘플을 즉시 정제했습니다. 환원 없이 표지 실험에는 시아노붕소수소나트륨을 사용하지 않았으며, 샘플은 65°C에서 2.5시간 동안 반응시켰습니다.
바이오틴화 올리고당 샘플의 ELISA 코팅 및 세척. 바이오틴화 샘플 25 μl(농축 샘플 100 μl를 0.1 M 트리스 완충액(TBS) 5 ml에 희석)를 아비딘 코팅 플레이트의 각 웰에 첨가했습니다. 대조군 웰은 0.1 M TBS에 10 μg/ml 농도의 바이오틴 50 μl를 코팅했습니다. 공시험 측정을 위한 코팅에는 탈이온수를 사용했습니다. 정제를 실온에서 2시간 동안 암소에서 배양했습니다. Grenier flat 3A 프로그램 11을 사용하여 0.1 M TBS에 0.1% 탈지유를 넣고 플레이트를 3회 세척했습니다.
1차 항체 첨가 및 세척. 각 웰에 1차 항체 40 µl를 첨가합니다. 마이크로플레이트를 실온, 암실에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 Grenier Flat 3A 세척 프로그램 #11을 사용하여 0.1M TBS에 0.1% 우유를 첨가하여 3회 세척합니다.
2차 항체를 첨가하고 세척합니다. 각 웰에 마우스/랫트 2차 항체 50 µl(0.1% 우유와 0.1 M TBS 용액에 1:5000으로 희석)를 첨가합니다. 마이크로플레이트를 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 그런 다음 Grenier Flat 5A 플레이트 세척 프로그램 #12를 사용하여 0.1% 우유와 0.1 M TBS 용액으로 5회 세척합니다.
기질 추가. 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB) 50 µl를 기본 기질에 첨가합니다(15ml의 탈이온수에 완충액 2방울, TMB 3방울, 과산화수소 2방울을 첨가). TMB 기질을 준비합니다. 사용 전 볼텍싱합니다. 마이크로플레이트를 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
단계를 완료하고 정제의 농도를 측정합니다. 각 웰에 1N 황산 50 µl를 넣고 ELISA 판독기를 사용하여 450~655nm에서 흡광도를 측정합니다.
다음 분석물질들을 탈이온수에 1mg/ml 농도로 용액을 제조합니다: 아라비노스, 람노스, 푸코스, 자일로스, 갈락투론산(GalA), 글루쿠론산(GlcA), 만노스, 글루코스, 갈락토스, 락토스, N-아세틸만노사민(manNAc), N-아세틸글루코사민(glcNAc), N-아세틸갈락토사민(galNAc), 이노시톨(내부 표준물질). 표 1에 제시된 1mg/ml 농도의 당 용액을 첨가하여 두 가지 표준물질을 제조했습니다. 시료를 냉동하고 -80°C에서 수분이 모두 제거될 때까지(보통 약 12~18시간) 동결건조합니다.
분석용 저울의 나사형 캡 튜브에 시료 100~500µg을 넣습니다. 넣은 양을 기록합니다. 시료를 특정 농도의 용매에 녹여 액상 시료로 튜브에 넣는 것이 가장 좋습니다. 각 시료 튜브에는 1mg/ml 이노시톨 20µl를 내부 표준물질로 사용합니다. 시료에 첨가하는 내부 표준물질의 양은 표준 튜브에 첨가하는 내부 표준물질의 양과 같아야 합니다.
무수 메탄올 8ml를 스크류 캡 바이알에 넣습니다. 그런 다음 3N 메탄올성 HCl 용액 4ml를 넣고 뚜껑을 닫고 흔듭니다. 이 과정에서는 물을 사용하지 않습니다.
올리고당 샘플과 표준 TMS 튜브에 1M HCl 메탄올 용액 500µl를 첨가합니다. 샘플을 열 블록에서 80°C에서 하룻밤(168시간) 동안 배양합니다. 메탄올 분해 생성물을 건조 매니폴드를 사용하여 실온에서 건조합니다. 메탄올 200µl를 첨가하고 다시 건조합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다. 샘플에 메탄올 200µl, 피리딘 100µl, 아세트산 무수물 100µl를 첨가하고 잘 섞습니다. 샘플을 실온에서 30분 동안 배양한 후 건조합니다. 메탄올 200µl를 첨가하고 다시 건조합니다.
Tri-Sil 200 µl를 넣고 튜브를 80°C로 가열하여 20분간 가열한 후 실온으로 식힙니다. 건조 매니폴드를 사용하여 샘플을 약 50 µl 용량으로 추가 건조합니다. 샘플이 완전히 건조되도록 두지 않았다는 점에 유의하십시오.
헥산 2ml를 넣고 볼텍싱하여 잘 섞습니다. 파스퇴르 피펫(5-8mm) 끝부분에 유리솜을 5-3/4인치 직경 피펫 위에 꽂아 채웁니다. 시료를 3000g에서 2분간 원심분리합니다. 불용성 잔류물은 침전됩니다. 시료를 100-150µl로 건조합니다. 약 1µl의 시료를 GC-MS에 주입합니다. 초기 온도는 80°C, 반응 시간은 2분입니다(표 2).