Spas dikim ji bo seredana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin ji bo CSS-ê piştgiriyek sînordar heye. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî moda lihevhatinê ya di Internet Explorer-ê de qut bikin).
Morfogeneza zikê mirovî taybetiyên mîkrosaziya epîteliya 3D û organîzasyona fezayê ava dike. Ev avahiyek bêhempa ji bo domandina homeostaza rûvî hewce ye bi parastina şaneya şaneya kok a di krîptoya bingehîn de ji antîjenên mîkrobial ên derve û metabolîtên wan. Ji bilî vê, vilikên rovî û şaneyên mukusên mukus ên cewaz ên bi testa parastinê yên heyî diparêzin. rûvî. Ji ber vê yekê, ji nû ve afirandina strukturên epîtelyal ên 3D ji bo avakirina modelên rûvî yên in vitro pir girîng e. Nemaze, morfojeneya 3D ya xweser a epîteliya rûvî dikare bi fonksiyonên fîzyolojîk ên pêşkeftî û biomekanîka protokolê ya pêşkeftî ji nû ve veguhezîne, li vir ji nû ve veguhezîne. rûvî li ser çîpek mîkrofluîdîk û her weha di çîpek hîbrîd a bicîbûyî ya Transwell de. Em rêbazên hûrgulî ji bo çêkirina amûrê, çandina Caco-2 an şaneyên epîteliya organoid ên rovî di mîhengên adetî de û hem jî li ser platformek mîkrofluîdî, danasîna morfogeneza 3D, û taybetmendiya ji nûvekirina wênesaziya 3D ya bi karanîna fonksiyona epithelia ya mîkrojenê ya piralî vedibêjin. ure bi kontrolkirina herikîna şilava basolateral ji bo 5 d. Rêbaza meya morfojenezasyona in vitro stresa guhastinê û tevgera mekanîkî ya fîzyolojîkî ya têkildar bi kar tîne û pêdivî bi endezyariya hucreyê an manîpulasyonek tevlihev nake, ku dibe ku ji teknîkên din ên heyî derkeve. , û sepanên dermanxaneyê.
Ezmûnan destnîşan dikin ku şaneyên Caco-2 yên epîteliya rovî yên ku di rûvî-li-çîp1,2,3,4,5 an jî cîhazên mîkrofluîdî yên du-layer de hatine çandin6,7 dikarin di in vitro de bêyî têgihîştina zelal a mekanîzmaya bingehîn derbasê morfogeneza 3D-ya spontan bibin. Di lêkolîna me ya vê dawiyê de, me dît ku rakirina cîhazên bazogenerîkî ji kulpek mîkrofolojîkî têra xwe3 e morphogenesis in vitro, ku ji hêla Caco-2 û organoîdên rûvî yên ji nexweş ve hatî destnîşan kirin.Hucreyên epîtelyal hatin pejirandin. Di vê lêkolînê de, me bi taybetî bal kişand ser hilberîna hucreyê û belavkirina giran a dijberê Wnt-ya hêzdar, Dickkopf-1 (DKK-1), di nav çîp-çîp de û amûrên mîkrofluîdîk ên guhertî yên ku têlên Transwell-ê hene, bi navê "Chip Hybrid". proteîna 1, an jî Soggy-1-ê ku bi çîp ve girêdayî ye, morfojenezê asteng dike an jî qata epîteliya 3D ya pêşavankirî ya W dişewitîne, destnîşan dike ku stresa antagonîst a di dema çandê de berpirsiyarê morfogeneza rovî di vitro de ye. Ji ber vê yekê, nêzîkatiyek pratîkî ya ji bo bidestxistina astên epîhelel ên bi hêz e ji bo rakirina morphogenesisa hindiktirîn. dabeşkirina olateral bi şûştina çalak (mînak, di platformên rûvî-li-çîp an hîbrid-li-çîpek) an belavkirinê de. Medyaya basolateral (mînak, ji Transwell têxe rezervên mezin ên basolateral di bîran de).
Di vê protokolê de, em ji bo çêkirina mîkrodevicesên hybrîd-ê-ê-li-an-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-pelçiqandî (PDMS) an mîkrobên polîter ên insertên veguheztinê (gavên 6b, 7b, 8, 9) And Morphogenesis di Vitro (Step 10) de. membran, avakirina 2d monolayers, û biyolojîk û nûvekirina mîkrobekirî ya biomekanisî. Layera elial ku dikare bibe modela mezinbûna epithelial a morfogen, hevrêzên mîkrobîk ên mîkrob, enfeksiyonê pathogen, birîna pez, birîna epithelial, û dermanên proototîk
Protokola me dibe ku di warê bingehîn (mînak, biyolojiya mukoza rovî, biyolojiya hucreya bingehîn, û biyolojiya geşepêdanê) û lêkolîna sepandî (mînak, ceribandina dermanên pêş-klînîkî, modela nexweşiyê, endezyariya tevnê, û gastroenterolojî) de ji gelek zanyaran re bi bandor be. xeyal bikin ku stratejiya me ya teknîkî dikare li temaşevanên ku dînamîkên nîşankirina hucreyê di dema pêşkeftina rûvî, nûjenkirin an jî homeostasis de dixwînin were belav kirin. Wekî din, protokola me ji bo vekolîna enfeksiyonê di bin cûrbecûr ajanên enfeksiyonê de wekî Norovirus 8, Sendroma Tenduristiya Bêhnvedanê ya Zindî Coronavirus 2 (SARS-CoV-9briicium diyabetî) kêrhatî ye. kolerae.Temaşevanên patholojiya nexweşî û pathogenesis jî bikêr in. Bikaranîna pergalek mîkrofîzyolojiya rûvî ya li ser-çîp dikare rê bide hev-çandiya dirêjî 10 û paşerojê nirxandina parastina mêvandar, bersivên berevaniyê û tamîrkirina birînên bi pathogen-ê yên di rêça gastrointestinal (GI) de 11 pouchitis, an jî sendroma rovî ya hêrsbûyî dikare were simulasyon kirin dema ku qatên epîteliya rovî ya 3D bi karanîna qatên epîteliya rovî ya 3D ya nexweş têne amadekirin, ev nexweşî di nav de atrofiya vîloz, kurtbûna krîptê, zirara mukozal, an astengkirina astengiya epîtelîal heye. Biopsî an jî kompleksa organoîdî1 çêtir in2 testa stûnê hawîrdora nexweşiyê, xwendevan dikarin bifikirin ku celebên hucreyên têkildar ên nexweşiyê, wek şaneyên mononukleer ên xwîna dorhêl a nexweş (PBMCs), li modelên ku mîkromîmarên 3D-yên rûvî-şîfreya rûvî hene zêde bikin.şaneyên parastinê yên taybet ên tevnvîsê, 5.
Ji ber ku mîkrosaziya epîteliya 3D dikare bêyî pêvajoya beşkirinê were rastkirin û xuyang kirin, temaşevanên ku li ser transkriptomîka cîhê û wênekêşiya bi rezîliya bilind an super-çareseriyê dixebitin dibe ku bi nexşeya me ya dînamîkên feza-demî yên gen û proteînan li ser niçikên epîtelal eleqedar bibin.Bi teknolojiyê re eleqedar e. Bersiv ji teşwîqên mîkrobial an jî yên belengaz re. Wekî din, xaçerêya mêvandar-mikrobioma dirêjî 10, 14 ku homeostaza rûvî hevrêz dike, dikare di tebeqeya mukoza rovî ya 3D de bi hev-çandkirina cûrbecûr cûrbecûr mîkrobial, civakên mîkrobial an bi taybetî di mîkrobiota fekal de were saz kirin.di platformê de. Ev nêzîkatî bi taybetî ji temaşevanên ku imunolojiya mukozal, gastroenterolojî, mîkrobioma mirovî, kulturomîk û mîkrobiyolojiya klînîkî dixwînin, balkêş e ku dixwazin mîkrobiota rûvî ya berê neçandkirî di laboratîfê de biçînin. Ger protokola meya morfogeneza in vitro dikare li gorî formên çandî yên domdar ên 6 an jî 2-49-formatên çandî yên domdar were adaptekirin. di heman demê de ev protokol dikare ji wan kesên ku ji bo pîşesaziya xwarinê platformên kontrolkirina derman, bijîjkî an jî bi rêjeyek bilind-rêveberê pêşve dixin jî were belav kirin. Wekî delîlek prensîb, me vê dawiyê îmkana pergala morfogenesisa piralî ya pirzimanî nîşan da ku dikare bi rengek bazirganî ya 24-1, hilberên 24-1-ê organîzekirî, 1-ê pirtir-1-hilberên plakeyê-6-ê de hatine pîvandin. Ji ber vê yekê, pejirandina rêbaza meya morfojenezasyona in vitro dikare ji hêla gelek laboratîfên lêkolînê, pîşesazî an hukûmet û saziyên birêkûpêk ve were bilez kirin û bi potansiyel were pejirandin da ku ji nûvebernamekirina hucreyî ya morfogenesisa in vitro rûvî ya di asta transkriptomî de ji bo ceribandina derman an biyoterapeutîk were fêm kirin. dubarekirina pêvajoya morfogenesis gut.
Jimarek sînorkirî ya modelên ceribandinê yên têkildar ji bo lêkolîna morfogeneza epîteliya rûvî hatine bikar anîn, bi taybetî ji ber nebûna protokolên bikêrhatî ji bo peydakirina morfogeneza 3D di vitro de. Bi rastî, piraniya zanyariyên heyî di derbarê morfogeneza rûvî de li ser lêkolînên heywanan in (mînak, masî 20, mişk21, mişk21, pirsiyar 21 an mirîşkên ku herî zêde dikarin biha bibin, û bi giranî biha bibin, ew 22). Ya girîng, pêvajoyên pêşveçûna mirovan bi awakî rast diyar nekin. Ev model di heman demê de di şiyana wan a ceribandina piralî de pir kêm in. Ji ber vê yekê, protokola me ya ji nû vejenkirina strukturên tevna 3D di vitro de ji modelên heywanan ên vivo û her weha modelên din ên çanda şaneyên 2D yên statîk ên kevneşopî dişoxilîne. Wekî ku şaneyên 3-ê yên cihêreng ên ku berê hatine diyar kirin, destûr daye ku em şaneyên cihêreng ên 3 yên ku berê hatine diyar kirin lêkolîn bikin. eksê krîpt-vîlûsê di bersivdayîna cûrbecûr teşwîqên mukozal an jî berevaniyê de. Tebeqên epîteliya 3D dikare cîhek peyda bike da ku lêkolîn bike ka hucreyên mîkrobial çawa pêşbaziyê dikin da ku xêzên mekanî û pêşkeftina ekolojîk wekî bersivek faktorên mêvandar ava bikin (mînak, tebeqeyên mukozê yên hundur û der, derdana IgA û peptîdên antîmikrobial, ebioguter ên mîkrobialê, biphurt çawa dikare têgihîştina peptîdên mîkrobialê,biphur3D). civakên xwe ava dike û bi hevrêzî metabolîtên mîkrobial çêdike (mînak, asîdên rûn ên zincîra kurt) ku rêxistina şaneyê û şaneyên şaneyên stem ên di krîptên bingehîn de çêdike.
Ji xeynî rêbaza me ya çêkirina strukturên epîteliya rovî ya 3D, gelek rêbazên in vitro hene. Çanda organoidal a rovî teknîkeke herî pêşketî ya endezyariya tevnê ye ku li ser çandina şaneyên stem ên rovîyê di bin şert û mercên morfojenê yên taybetî de ye23,24,25.Lêbelê, karanîna modelên organoîd ên 3D ji bo analîza guhastinê-mizgînî bi gelemperî ji bo analîzkirina guhastinê an veguheztina mîzê ye. di hundurê organoîdê de girtî ye û, ji ber vê yekê, danasîna pêkhateyên ronahiyê yên wekî şaneyên mîkrobial an antîjenên biyanî sînorkirî ye.Gihîştina lûmenên organoîdan bi karanîna mîkroînjektorek dikare were baştir kirin,26,27, lê ev rêbaz dagirkerî û kedkar e û ji bo performansê hewceyê zanîna pispor e. Wekî din, çandên organoîd ên kevneşopî yên ku di îskeleyên hîdrogelê de di bin şert û mercên statîk de têne domandin, di biomekanîka vivo de bi rengek rast çalak nagirin.
Nêzîktêdayînên din ên ku ji hêla gelek komên lêkolînê ve hatine xebitandin, îskeleyên hîdrogelê yên 3D yên pêşavankirî bikar tînin da ku bi çandina şaneyên rûvî yên mirovî yên veqetandî li ser rûyê gêlê, strukturên epîtelyal ên rûvî bişibînin. gradient, bi tevlêkirina şaneyên stromalê yên di îskeleyê de, avahiyek epîtelyal bi rêjeyek bilind û xaçepirsa stroma-epithelial saz dike. Lêbelê, cewherê îskeleyên pêşavankirî dibe ku pêşî li pêşandana pêvajoya morfogenetîk a spontan bi xwe bigire. Ev model jî hewcedariya ronahiyê ya dînamîk an stresê ya ku di bin şaneyên ronahiyê de ronahiyê an jî şaneyên nav-testî yên di bin ronahiyê de ne peyda dikin. Fonksiyona fîzyolojîk. Lêkolînek din a vê dawiyê îskeleyên hîdrogelê di platformek mîkrofluîdîk de bikar anîne û strukturên epîteliya rovî yên bi qalibkirî bi teknîkên lazer-xurkirinê bikar tînin. Organoîdên rovî yên mişk qalibên xêzkirî dişopînin da ku strukturên tubular ên rûvî ava bikin, û herikîna şilavê ya hundurîn dikare bi karanîna modulek mîkrofluîdîk û ne jî modulek mîkrofluîdîk veguhezîne. Tevgerên mekanobîolojîk. Teknîkên çapkirina 3D ji heman komê karîbûn lûleyên rûvî yên piçûk bi pêvajoyên morfogenetîk ên spontan biafirînin.Tevî ku di hundurê lûlê de çêkirina tevlihev a beşên rûvî yên cihêreng, di vê modelê de herikîna şilava ronahiyê û deformasyona mekanîkî jî tune ye. Wekî din, xebitandina modelê dibe ku bikêr be, nemaze piştî ku pêvajoya çapkirina bi hucreyê bi tevahî biqede. Di şûna wê de, protokola me ya pêşniyarkirî morfogeneza rûvî ya spontan, stresa şilbûnê ya têkildar ji hêla fîzyolojîkî ve, biomekanîka ku tevgera rûvî dişibînin, gihîştina beşên apikal û basolateral ên serbixwe, û ji nû ve afirandina mîkro hawîrdorên biyolojîkî yên tevlihev ên modularîteyê peyda dike. Ji ber vê yekê, rêbazên me yên in vitro yên lihevhatina morfogenesisê yên heyî dikarin nêzîkatiyên protokola morfogenesisê ya heyî peyda bikin.
Protokola me bi tevahî li ser morfogeneza epîtelyal a 3D ye, di çandê de tenê şaneyên epîtelyal hene û ti celebên din ên şaneyên derdorê yên wekî şaneyên mezenkîmal, şaneyên endotelyal, û şaneyên parastinê tune. Wekî ku berê jî hate behs kirin, bingeha protokola me bi rakirina morfojenê li moda mêtingeralalalî ya ku li mêtingerên mezûnê-alî yên ku ji hêla me ve girêdayî ye. gut-li-çîp û hîbrid-li-çîp dihêle ku em qata epîteliya 3D ya bêdawî ji nû ve biafirînin, tevliheviyên biyolojîkî yên din ên wekî danûstendinên epîtelyal-mezenkîmal33,34, matrixa der-hucreyî (ECM) rabûna 35 û, di modela me de, şaneyên krîpto-vilûs ên din ên ku di hucreyên bingehîn de têne hesibandin. fîbroblast) di mezenşîmê de di hilberîna proteînên ECM û rêziknameya morfogeneza rovî de di vivo35,37,38 de rolek sereke dilîzin. Zêdekirina şaneyên mezenkîmal li modela me pêvajoya morfogenetîk û karîgeriya girêdana şaneyê zêde kir. Tebeqeya endotelyal (ango, kapîlar an şaneyên lîmfatîk ên ji nû ve veguhezîne490 girîng dilîzin). di mîkro hawîrdora rûvî de. Wekî din, hêmanên vaskulasyonê yên ku dikarin di navbera modelên tevnvîsê de werin girêdan şertek pêşwext in dema ku modelên tevnvîsê ji bo nîşankirina danûstendinên pir organan têne sêwirandin. Ji ber vê yekê, hucreyên endothelial dibe ku hewce bike ku were nav kirin da ku taybetmendiyên fîzolojolojî yên rasttir bi çareseriya asta organê model bike. Bersiva nexwestî ya ji nexweşan di şaneyên xweparastinê de, ji bo hucreyên xweparastinê yên xaçparêz ên dijderbasdar jî hene. k, û xweparastina tevne-taybetî di çarçoweya teqlîdkirina nexweşiya rûvî de.
Bikaranîna çîpên hîbrîd ji gut-li-çîp-ê sadetir e ji ber ku sazkirina cîhazê sadetir e û karanîna têkelên Transwell rê dide ku çanda epîtelîyûmê ya gurçikê ya berbelavkirî çêbibe.Lêbelê, têkelên Transwell ên ku bi parzûnên polesterê yên bazirganî têne peyda kirin ne elastîk in û nekarin tevgerên çîpê yên mîna peristaltîk ên di stasyonê de bêtir bi cîh bikin. Bêyî stira şûştinê li aliyê apîkal. Eşkere ye, ku taybetmendiyên statîk ên di beşa apîkî de kêm caran hev-çandiya bakteriyan a demdirêj di çîpên hîbrîd de pêk tîne. Dema ku em dikarin di nav çîpên hîbrîd de morfojenezên 3D bi hêz bikin dema ku çîpên hîbrîd bikar tînin, kêmbûna çîpên fîzyolojîkî dibe ku ji bo fîzyolojiya çîpên potansiyel ve girêdayî biyomekanîk û herikîna şilavê platforma fîzyolojîkî ya têkildar bisînor bike.
Ji nû veavakirina tev-pîvana eksê şîp-vilusa mirovî di çandên rûvî-li-çîp û hîbrid-li-çîp-ê de bi tevahî nehatine saz kirin. Ji ber ku morfojenez ji yek-layerek epîtelîal dest pê dike, mîkroarchitekturên 3D ne hewce ye ku wekheviya morfolojîkî bi krîptoyan re peyda bike ku di nav nifûsa mîkro-hucreyê de nezîkî şaneya mîkro-şîfrekirî ye. epîteliya 3D ya nezilandî, deverên çîp û şîn bi zelalî nehatine veqetandin. Her çend kanalên jorîn ên li ser çîpê dibe sedema bilindbûna epîteliya mîkro endezyarkirî, bilindahiya herî zêde hîn jî di navbera ~ 300-400 µm de sînordar e. Kûrahiya rastîn a krîptên rûvî yên mirovî di rêza krîptên rûvî yên mirovî de bi rêzdarî 4, bilindahiya rûvî ya mirovî di çîpên piçûk û 0~0 de ye. ji parzûna rûviya biçûk ~ 600 μm41 e.
Ji hêla wênekêşiyê ve, wênekêşandina di cih de-çareserkirina mîkroşengerên 3D-ê de dibe ku bi zikê li ser çîpê ve were sînordar kirin, ji ber ku dûrahiya xebatê ya pêwîst ji lenseya objektîf heya tebeqeya epîtelyal di rêza çend milîmetreyan de ye. ji ber vê yekê, ji ber ku mîkrofabrîkasyona rûvî ya qat bi qat a li ser çîpê ve girêdayîbûna domdar a di navbera her qatek de heye, vekirina an rakirina tebeqeya jorîn ji bo vekolîna strukturên rûkala qata epîtelyal zehf dijwar e. Mînakî, bi karanîna mîkroskopa elektronîkî ya şopandinê (SEM).
Hîdrofobîtiya PDMS di lêkolînên mîkrofluîdîk ên ku bi molekulên piçûk ên hîdrofobî re mijûl dibin de faktorek sînordar e, ji ber ku PDMS dikare bi rengek netaybetî molekulên weha hîdrofobîk veşêre. Alternatîfên PDMS dikare bi materyalên din ên polîmerî re were hesibandin. Wekî din, guheztina rûkalê ya PDMS (mînak, pîvazkirina 4 etylen glycol2) adsorbasyona molekulên hîdrofobî kêm bike.
Di dawiyê de, rêbaza me di warê peydakirina vekolînek berz an jî platforma ceribandinê ya bikarhêner-heval "yek-pîvan" de baş nehatiye destnîşan kirin. Protokola heyî ji her mîkrodevîzek pompek sirincê hewce dike, ku cîhê di inkubatorek CO2 de digire û pêşî li ceribandinên mezin digire. têlên poroz ên ku destûrê didin dagirtin û rakirina domdar a medyaya basolateral).
Ji bo ku em di vitro de morfogeneza 3D ya epîteliya rovî ya mirovî çêkin, me amûrek rûvî ya mîkrofluîdî ya ku du mîkrokanalên paralel û parzûnek porozek elastîk di nav de vedihewîne bikar anî da ku navgînek lumen-kapîlar biafirîne. Di heman demê de em karanîna amûrek mîkrofluîdî ya yek-kanal a ku li ser çîpek herikîna baskê ya hîbrîdê ya domdar a ku li ser çîpek herikîna bazinê ya domdar e, destnîşan dikin. Sert. Di her du platforman de, morfojenezên cûrbecûr şaneyên epîteliya rovî ya mirovî dikare bi sepandina manîpulasyona arasteyî ya herikê ji bo rakirina antagonîstên morfojenê ji beşa basolateral ve were destnîşan kirin. Tevahiya prosedûra ceribandinê (Wêne 1) ji pênc beşan pêk tê: (i) mîkrofabrîkkirina çîpê rûvî an jî Çîpa Transwell-amadekirinê şaneyên (hucreyên Caco-2) an organoîdên rovî yên mirovî;qutiyên 2-5), (iii) çanda şaneyên epîteliya rovîyê li ser çîpên rovî an çîpên hîbrîd (gavên 6-9), (iv) înduksîyona morfogeneza 3D in vitro (qonaxa 10) û (v)) ji bo karakterîzekirina mîkrostruktura epîteliya 3D (gavên 11-24-ê de mîkrostruktura epîteliya 3D bi bandor hate sêwirandin) morfogeneza in vitro bi berhevdana morfogeneza epîtelyal bi kontrolên mekanî, demkî, şertî, an prosedurî ​​re.
Me du platformên çandê yên cihêreng bikar anîn: gut-li-çîpek bi kanalên rasterast an kanalên nelihevkirî yên nehêl, an çîpên hîbrîd ên ku têlên Transwell (TW) di nav amûrek mîkrofluîdîk de hene, ku wekî ku di Box 1-ê de hatî destnîşan kirin, û gav 1 -5."Çêkirina cîhazê" gavên sereke di çêkirina çîpek yekane an çîpek hîbrîdî ya çîpek Hucreyê de diyar dike. aco-2 an organoîdên rûvî yên mirovî) û prosedûra çandê ya ku di vê protokolê de hatî bikar anîn." Morfogeneza In vitro" gavên giştî nîşan dide ku tê de Caco-2 an şaneyên epîtelyal ên ji organoîdan têne çandin li ser çîpek rûvî an jî li ser navdêrên Transwell çîpek hîbrîd têne çandin. Nimûneyên ka meriv çawa qatên epîteliya rovî dikare were bikar anîn, mînakî, di taybetmendiya cûdabûna hucreyê de, lêkolînên fîzyolojiya rûvî, damezrandina ekosîstemên mîkrobiomên mêvandar, û modelkirina nexweşiyan. Wêneyên immunofluorescence di "Cûdahiya Hucreyê" de nucles, F-actin û MUC3D nîşana çîpê Caco-gutal MUC3D nîşan didin. di şaneyên gopalê de û mukusa ku ji rûberên mukozê têne derxistin de heye. Wêneyên fluorescentê yên di Fîzolojiya Gewrê de mûkus nîşan didin ku bi rengkirina bermahiyên asîta sialîk û N-acetylglucosamine bi karanîna agglutinin mîkroba genim tê çêkirin. co-kultura E. coli nîşan dide ku proteîna floransê ya kesk (GFP) bi şaneyên epîtelyal ên 3D Caco-2 yên mîkro endezyarkirî nîşan dide. Panela rastê cîhgirtina GFP E. coli ya ku bi şaneyên epîteliya 3D Caco-2 ve hatî çandin nîşan dide, li dûv re rengkirina immunofluorescence bi F-lezgîniya tendurustî (modela nuwazeyîllûsûsûstîv) çîpên rûvî yên iltîhaba rûvî di bin dijwariya fîzyolojîkî de bi antîjenên bakterî (mînak, lîpopolîsakarîd, LPS) û şaneyên parastinê (mînak, PBMC;kesk). Hucreyên Caco-2 ji bo avakirina qatek epîtelyal a 3D hatin çandin. Barê pîvanê, 50 μm. Wêneyên di rêza jêrîn de: "Cûdahiya şaneyan" bi destûra referansê hatî adaptekirin.2.Weşanxaneya Zanîngeha Oxfordê;Bi destûra Ref.5 ve hatî nûve kirin.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" bi destûra ref.3 ve hatî adaptekirin.NAS;"Modelkirina Nexweşiyê" bi destûra referansê ve hatî adaptekirin.5.NAS.
Hem çîpên gut-li-çîp û hem jî çîpên hîbrîd bi karanîna kopiyên PDMS-ê yên ku ji qalibên silîkonê bi lîtografiya nerm1,44 hatine hilanîn û bi SU-8 hatine çêkirin hatine çêkirin. Sêwirana mîkrokanalên di her çîpê de bi berçavgirtina hîdrodînamîkên wekî stresa qermiçî û zexta hîdrodînamîk1,4,12-ê tê destnîşankirin. mîkrokanalên rastê yên paralel li hev hatine veqetandin, veguheriye rûvî-li-çîpek tevlihev (Daneyên Berfireh Fig. 1b) ku cotek mîkrokanalên kelandî vedihewîne da ku zêdekirina dema rûniştinê ya şilavê, şêwazên herikîna nehêl, û deformasyona pir eksî ya hucreyên çandî (Hêjî. 2a. li ser-çîpek dikare were hilbijartin. Me destnîşan kir ku Gut-Chip-ê ya tevlihev jî di çarçoveyek demkî ya heman rengî de morfogeneza 3D-ê jî bi xurtî çêdike û bi astek wekhev a mezinbûna epîtelyal li gorî ya orîjînal Gut-Chip, bêyî ku guh bide celebê şaneya çandî. Ji ber vê yekê, ji bo peydakirina morphogenesis 3D. Nimûneyên SU-8 piştî hilweşandinê taybetmendiyên neyînî peyda kirin (Hêjî.2a). Ji bo çêkirina rûvî li ser çîpekê, tebeqeya PDMS-ya jorîn a amadekirî bi dû hev re bi fîlimek PDMS-ê ya porez ve hate girêdan û dûv re bi girêdana nevegerandî bi karanîna dermankerek koronayê bi qata PDMS-ya jêrîn ve hate girêdan (Wêne. 2b–f). s (Hêjîra 2h û Daneyên Berfireh Hêj. 2). Pêvajoya girêdanê bi dermankirina rûberên kopyaya PDMS û camê bi plazmaya oksîjenê an dermankirina koronayê tê kirin.Piştî sterilîzekirina cîhaza mîkrofabrîk a ku bi lûleya silîkonê ve girêdayî ye, sazkirina cîhazê ji bo pêkanîna morfogeneza 3D ya pîtsazkirina 3D amade bû.
a, Nimûneya şematîk a amadekirina parçeyên PDMS-ê ji qalibên sîlîkonê yên SU-8-ê yên qalibkirî. Çareseriya PDMS-ê ya neçalakkirî li qalibekî siliconê (çep) hat rijandin, li 60 °C (navîn) hat saxkirin û (rast). qalibê ku ji bo çêkirina perdeya porez a PDMS-ê tê bikar anîn.d, Rêzek wêneyên pêkhateyên jorîn û jêrîn ên PDMS-ê û amûra rûvî ya li ser-çîpê hatî berhev kirin. ed mîkrokanal û odeyên valahiya.g, Sazkirina gut-li-çîpekê ji bo çanda şaneyên mîkrofluîdî. Rovîya çêkirî ya li ser çîpek ku bi lûleya silîkonê û sirincek hatî komkirin, li ser pêçekê hate danîn. Amûra çîpê li ser qapaxê firaqek Petri ya 150 mm hate danîn ji bo girtina qumaşê. û morfogeneza 3D bi bikaranîna çîpên hîbrîd. Navgînên Transwell ên ku serbixwe ji bo çandê hatine amadekirin monolaytên 2D yên şaneyên epîtelyal ên rovîyê ketin nav çîpê hîbrîd da ku morfogeneza 3D ya rovî çêbike. Navgîn bi mîkrokanalên li binê şaneya şaneyê tê perfus kirin.Elsevier.
Di vê protokolê de, rêza şaneya Caco-2 û organoîdên rûvî wekî çavkaniyên epîtelyal hatin bikar anîn (Hêl. 3a). Her du celeb şaneyên serbixwe hatin çandin (Quttîka 2 û Qutiya 5) û ji bo tovê mîkrokanalên pêçandî yên ECM-ê yên rûvî-çîp an jî têlên Transwell-ê hatin bikar anîn. beşên 10 û 50) yên di flaskên T-yê de ji bo amadekirina suspensionên şaneyên veqetandî ji hêla şilava trîpsinîzasyonê ve têne berhev kirin. pondin, û Noggin) û faktorên mezinbûnê yên ku di çarçoveyek 3-ê de hatî destnîşan kirin her rojek din hate zêdekirin heya ku organoid bi qasê ~ 500 μm mezin bûn. Organoidên bi tevahî mezinbûyî têne berhev kirin û di nav şaneyên yekane de têne dabeş kirin da ku li ser rûvî an jî têxê Transwell li ser çîpê (Qutax 5). Weke ku me berê ragihandibû, li gorî nexweşiya 13kolatîf dikare cûda bibe. , penceşêra kolorektal, an jî doxtorê normal), cihê birînê (mînak, birîn li hember devera ku birîn nebûye) û cîhê mîdeya rûvî ya di rêkê de (mînak, duodenum, jejunum, ileum, cecum, kolon, an rektum). Em protokolek xweşbînkirî di Qutîka 5-ê de pêşkêş dikin ji bo çandina organoîdên kolonî yên ku bi gelemperî ji organoîdên koloidî yên piçûktir (ji organoîdên koloîdî yên bi tîpîk zêdetir testê dikin).
a, Xebata ji bo peydakirina morfogeneza rûvî di çîpa rûvî de. Di vê protokolê de epîteliya rûvî ya mirovî Caco-2 û organoîdên rûvî têne bikar anîn da ku morfogeneza 3D nîşan bidin. Hucreyên epîtelyal ên veqetandî di cîhaza rûvî-li-çîp a amadekirî de hatin tovandin. Carekê hucreyên MS-ê li ser çîp têne girêdan (MS-amadekirin) û pê ve têne girêdan. parzûn di roja 0 (D0) de, herikîna apical (AP) dest pê dike û 2 rojên ewil tê domandin (herikîn, AP, D0-D2). Herikîna basolateral (BL) jî ligel tevgerên dirêjkirinê yên çerkî (dirêjbûn, herikîn, AP û BL) dest pê dike dema ku yekrengek bi tevahî 2D çêdibe. fogenesis, D5). Wêneyên berevajiya qonaxê morfolojiya nûneriya şaneyên Caco-2 di her gav an xala ceribandinê de nîşan didin (grafika bar, 100 μm). Çar diyagramên şematîk ku kaskadên têkildar ên morfogeneza rûvî diyar dikin (roja rastê). ft). Navbera ku qada mezinkirî ronî dike (qûtika şikestî ya spî) mîkroviliyên ji nû ve vejenkirî yên li ser qata 3D Caco-2 (rast) nîşan dide.c, dîmena pêşiyê ya asoyî ya Caco-2 3D-ya sazkirî, claudin (ZO-1, sor) û membranên sînorê firçeya domdar bi etîketa F-actin (kesk) şaneyên nuqtîkî yên dîtbarî (kesk) û şaneyên nuqteyên elektrîkê yên dîtbarî (kesk) çîpên testînal. Tîrên ku ber bi şemaka navîn ve îşaret dikin ji bo her dîmenek konfokal cîhê balefirgeha navendê destnîşan dikin.d, Demjimêra guheztinên morfolojîk ên organoîdên ku li ser çîpek ku bi mîkroskopiya berevajî qonaxa di rojên 3, 7, 9, 11 û 13 de hatî çandin, hatîye wergirtin. Di nav de (rastê jorîn) mezinkirina bilind a wêneya egûtê ya DY-ê li ser wênemikroîdê D-yê hatî peyda kirin. Parçeya ku di roja 7.f de hatî kişandin, wêneyên immunofluorescence sergirtî ku nîşankerên şaneyên stem nîşan didin (LGR5;magenta), xaneyên gopalê (MUC2; kesk), F-aktîn (gewr) û navokên (ciyan) ku li ser çîpên rûvî 3 rojan hatine mezinkirin, bi rêzê (Çep) û 13-rojî (navîn) organoîdên li ser tebeqeya epîtelyayê. Her weha Binêre Daneyên Berfireh 3, ku LGR5-ê nîşana mîkrofêl22 nîşan dide. ure (rast) epîteliya organoid a 3D ya ku di rûvî de li ser çîpê hatî damezrandin bi rengkirina parzûna plazmayê bi boyaxa CellMask (rast) roja 13-ê çandê. Barê pîvanê 50 μm e heya ku wekî din neyê gotin.b Bi destûr ji referansê ve hatî çap kirin.2.Weşanxaneya Zanîngeha Oxfordê;c Bi destûra Referansa Adapted.2.Weşanxaneya Zanîngeha Oxfordê;e û f bi destûr ji hêla referansê ve hatî adapte kirin.12 Di bin lîsansa Creative Commons CC BY 4.0.
Di zikê li ser çîpê de, pêdivî ye ku rûbera hîdrofobî ya parzûna poroz a PDMS-ê were guheztin ji bo pêlavkirina serketî ya ECM Cayê. Di vê protokolê de, em du awayên cihêreng bikar tînin da ku hîdrofobîtiya parzûnên PDMS-ê biguhezînin. e.Lêbelê, çanda mîkrofluîdî ya epîteliya organoidê pêdivî bi fonksiyonelkirina rû-bingeha kîmyewî heye da ku bigihîje depokirina bikêr a proteînên ECM bi sepandina polîetîlenîmîn (PEI) û glutaraldehyde li ser mîkrokanalên PDMS. Piştî guheztina rûkalê, proteînên ECM hatin razandin da ku şaneyên rûbera PDMS-ê veşêrin û dûv re şaneyên PDMS-ê tê helandin. çanda şaneya mîkrofluîdî bi perfuskirina tenê navgînê di mîkrokanala jorîn de dest pê dike heya ku şaneyek yekrengek bêkêmasî çêbike, dema ku mîkrokanala jêrîn şert û mercên statîk diparêze. Ev rêbaza xweşbînkirî ya ji bo aktîvkirina rûkalê û pêxistina ECM rê dide girêdana epîteliya organoid da ku morfogeneza 3D li ser rûyê PDMS çêbike.
Beriya tovkirina şaneyê, çandên Transwell jî pêdiviya ECM-ê hewce dike;Lêbelê, çandên Transwell ji bo aktîvkirina rûbera têkelên poroz hewcedarî gavên pêş-dermankirinê yên tevlihev nînin. Ji bo mezinbûna şaneyên Caco-2 li ser têlên Transwell, pêçandina ECM li ser têlên poroz girêdana şaneyên Caco-2 yên veqetandî (<1 saet) û avakirina astenga lihevhatina teng (<1-2 roj) li ser organoîdên veguhêzkirî yên ECM lez dike. inserts, bi rûxara perdeyê ve (<3 h) ve têne girêdan û heya ku organoîdan yekrengek bêkêmasî ya bi yekparebûna astengî ava bikin têne domandin. Çandên Transwell bêyî karanîna çîpên hîbrîd di lewheyên 24-kalî de têne çêkirin.
Morfogeneza 3D in vitro dikare bi sepandina herikîna şilavê li aliyê basolateralî yê qatek epîteliya damezrandî were destpêkirin. Di rûvî de li ser çîpê, morfogeneza epîtelyal dest pê kir dema ku navgîn di nav mîkrokanalên jorîn û jêrîn de hate perfus kirin (Hêjîrê. 3a). Wekî ku berê hatî diyar kirin, girîng e ku meriv herikîna şilavê ya domdar di hilkişîna morphogenê ya domdar de were destnîşan kirin. ors.Ji bo ku têra xurek û serum ji şaneyên ku li ser parzûnên poroz ve girêdayî ne peyda bikin û stresa rijandina ronahiyê biafirînin, em bi gelemperî di rûvîyê de herikîna dualî li ser çîpê sep dikin. Di çîpên hîbrîd de, têlên Transwell ên ku yekrengên epîtelîal vedihewînin di nav çîpên hîbrîd de hatin danîn. piştî destpêkirina herikîna basolateral di her du platformên çandê de.
Taybetmendiyên morfolojîk ên qatên epîteliya 3D ên mîkrojenerî dikarin bi sepandina modalîteyên wênekêşiyê yên cihêreng werin analîz kirin, di nav de mîkroskopiya berevajiya qonaxê, mîkroskopiya berevajiyê destwerdana cihêreng (DIC), SEM, an mîkroskopa konfokal a immunofluorescence (Wêneyên 3 û 4). Pevçûnek qonax an jî DIC-ê di her kêliyê de dikare bi hêsanî were şopandin. .Ji ber zelalbûna optîkî ya PDMS û fîlimên polester, hem platformên gut-li-çîp û hem jî çîpên hîbrîd dikarin wênekêşana li cîhê rast-demê peyda bikin, bêyî ku pêdivî bi beşkirin an jihevxistina cîhazê hebe. Dema ku wênekêşiya immunofluorescence pêk tîne (Wêne 1, 3c, f û 4b bi şaneyên tîpîk voltformde, bi 4bwformal, bi taybetî%wformde, FA) li pey Triton X-100 û 2% (wt/vol)) albumîn seruma bowî (BSA), bi rêz. Li gorî celebê şaneyê, fîksatîfên cihêreng, permeabilîzator û ajanên astengker dikarin bêne bikar anîn. Antîbozên seretayî yên ku şaneyên girêdayî rêzê an jî nîşankerên herêmê dikin hedef, ji bo ronîkirina şaneyên çîpên duwem ên ku li cihê xwe neguhêzbar in, li dûv çîpên duwem ên ku li ser çîpên dijmijêkirî ne. 4',6-diamidîno-2-fenîlen) îndol, DAPI) an F-aktîn (mînak, phalloidin bi fluorescentî tê nîşankirin). Ji bo tespîtkirina hilberîna mukusê jî wênekêşiya zindî ya li ser bingeha fluorescentê dikare li cîh were çêkirin (Hêjî.1, "cudakirina şaneyê" û "fîzyolojiya rûvî"), kolonîzasyona rasthatî ya şaneyên mîkrobial (Hêjî. 1, "Host-microbe hev-çand"), peydakirina hucreyên parastinê (Hêjî. 1, 'Modelkirina Nexweşiyê') an xêzên epîteliya 3D, veqetandina morfolojiya gûtê (Whenb. her qatek ji qata mîkrokanala jêrîn, wekî ku di ref. 2-ê de hatî diyar kirin. Wekî ku di jimar 2 de tê xuyang kirin, morfolojiya epîteliya 3D û her weha mîkroviliyên li ser sînorê firçeya apikal dikarin bi SEM (Hêjî. 3b) werin xuyang kirin. Ragihandina nîşankerên cudabûnê bi pêkanîna PCR5-ya mîqdar an jî şaneyên yek-hucreyî dikare bi pêkanîna PCR5-ya mîqdar an jî şaneyên yek-hucreyî di çîpên ARN-ê de mezin dibin. çîpên brid bi trîpsinîzasyonê têne berhev kirin û paşê ji bo analîza molekulî an genetîkî têne bikar anîn.
a, Xebata ji bo peydakirina morfogeneza rovî di çîpeke hîbrid de. Caco-2 û organoîdên rovî di vê protokolê de têne bikar anîn da ku morfogeneza 3D di platformek çîpê ya hîbrîd de nîşan bidin. Hucreyên epîteliya yên veqetandî di nav têlên Transwell ên amadekirî de hatin çandin (TW amade; hemû şaneyên di bin şert û mercên statîk de (çanda TW) hatin çandin. Piştî 7 rojan, têketina Transwell a yekane ku tê de monolayek 2D ya şaneyên epîtelyal tê de di nav çîpek hîbrîd de hate entegre kirin da ku herikînek basolateral (Flow, BL) destnîşan bike, ku di dawiyê de rê li ber nifşek epîteliya 3D ya 3D vekir. Rêza 103) di her gav ceribandinê an xala demê de kolonî hildikişin. Skematîkên di tebeqeyên jor de veavakirina ceribandinê ya ji bo her gavê destnîşan dikin.b, çîpên hîbrîd (şematîka çepê) dikarin bibin sedema morfojeneya 3D ya şaneyên epîteliya organoid bi jor-bi jêr ve mîkroskopiya konfokal û nêrînên mîkroskopiya konfokal ên ji jor ber bi jêr ve, li pozîsyona Z-ya jêrîn têne girtin.xêzên xalîçeyî yên rast û yên têkildar bibînin).taybetiyên morfolojîkî yên eşkere nîşan da.F-aktîn (ciyan), navok (gewr).c, Mîkrografên konfokal ên fluoresansê (dîtina goşeyî 3D) ya şaneyên epîtelyal ên organoîdî yên ku di Transwella statîk de hatine çandin (TW; di nav qutîka bişkoka spî de) li hember çîpê hîbrîd (mezintirîn fîşeka tam) ku 2D dîmena 2D ya vertîkal berhev dike. di quncikê jorê yê rastê de tê danîn; "XZ") taybetmendiyên 2D û 3D jî nîşan dide. Barê pîvanê, 100 μm.c Bi destûra referansê ji nû ve çapkirî ye.4.Elsevier.
Kontrolên bi çandî di heman hucreyan de (caco-2 an organîzasyona organîzasyonê) di nav kanala çanda kevneşopî ya kevneşopî de (ango 4 μl di nav sêwirana jorîn a gut-ê de). Her weha diherike jî dikare were berhev kirin.
Pêvajoya lîtografiya nerm divê li jûreyek paqij were kirin. Ji bo her qatek li ser çîpê (tebeqên jorîn û jêrîn û membran) û çîpên hîbrîd, wênemaskên cihêreng hatine bikar anîn û li ser pêlên silicon ên cihêreng hatine çêkirin ji ber ku bilindahiyên mîkrokanalan cûda bûn. Bilindahiya armancê ya mîkrokanalên jorîn û jêrîn ên rûvîyê li ser çîpê 2000 μm û bilindahiya kanalê bi rêzdarî 2000 μm e. 200 μm.
Waferek 3 înç ya siliconê têxin nav firaqek bi aceton. Bi nermî 30 saniyeyan bizivirînin, dûv re waferê bi hewa zuwa bikin. Vaferê bi IPA veguhezînin tabloyek, dûv re plakaya 30 saniyan bizivirînin da ku paqij bikin.
Çareseriya piranhayê (tevliheviya hîdrojen peroksîtê û asîda sulfurîk a konsantrekirî, 1:3 (vol / vol)) dikare bi vebijarkî were bikar anîn da ku rakirina bermahiyên organîk ji rûbera silicon waferê zêde bike.
Çareseriya Piranhayê pir gemarî ye û germê çêdike. Tedbîrên ewlehiyê yên zêde hewce ne. Ji bo avêtina çopê, bihêlin ku çareserî sar bibe û veguhezîne konteynirek çopê ya paqij û zuwa. Konteynirên duyemîn bikar bînin û konteynerên çopê bi rêkûpêk etîket bikin. Ji kerema xwe rêwerzên ewlehiyê yên sazgehê ji bo prosedurên berfirehtir bişopînin.
Waferan 10 deqeyan li ser 200 °C bixin ser firaxeke germ a 200 °C.
~ 10 g ji fotoresîst SU-8 2100 birijînin ser navenda vafera siliconê ya paqijkirî. Ji bo ku wênebergir bi heman rengî li ser waferê belav bikin, pîncê bikar bînin. Carinan waferê bixin ser plaşek germ a 65°C da ku wênebergir kêmtir zeliqîne û bi hêsanî belav bibe. Vaferê rasterast li ser plakaya germ nehêlin.
SU-8 bi vekirina pêlavê spin li ser waferê bi yeksan hate belav kirin. Zivirandina SU-8-ê ji bo 5-10 s bername bike da ku di 500 rpm de bi leza 100 µm/s belav bibe. Berhevoka sereke ji bo 200 µm bilindahiya 200 µm saz bike, 5-1500 rpm stûrahiya mak 5 ji bo 1,500 rpm Tebeqeya jorîn a rûvî ya li ser çîpê; li "Gavên krîtîk" li jêr binêre) bi leza 300 rpm/s 30 çirk li 1200 rpm hatî danîn.
Leza zivirîna sereke dikare li gorî stûrahiya armancê ya SU-8-ê ya li ser wafera silicon were sererast kirin.
Ji bo çêkirina qalibên SU-8 yên 500 µm bilindahî ji bo tebeqeya jorîn a rûvî ya li ser çîpê, pêlava spin û gavên nermik ên pijandinê yên vê Qutiyê (pêngavên 7 û 8) bi dû hev hatin dûbarekirin (li gav 9 binêre) da ku du qatên 250 μm A qatek stûr a SU-8, ku dikare bi 5 qatek U02-yê qutiyek bi 5 qat û join veqetîne were çêkirin. bilind.
Bi nermî vaferên SU-8 yên pêçandî bipijin, bi baldarî 5 hûrdeman li ser plakaya germ a li 65 °C bi cîh bikin, dûv re mîhengê biguherînin 95 °C û 40 hûrdeman din jî înkuba bikin.
Ji bo ku di mîkrokanala jorîn de bigihîje 500 μm bilindahiyek nimûneya SU-8, gavên 7 û 8 dubare bikin da ku du qatên SU-8 stûr ên 250 μm çêbikin.
Bi karanîna Aligner Mask UV, li gorî rêwerzên çêker ceribandinek lampeyê pêk bînin da ku dema vegirtina waferê hesab bikin.
Piştî destnîşankirina dema ragirtinê, maskeya wêneyê li ser xwedêgiravî maskeya aligner-a maskeya UV bi cîh bikin û maskeya wêneyê li ser wafera pêçandî ya SU-8 bi cîh bikin.
Rûyê çapkirî yê wênemaskê rasterast li ser milê SU-8 yê pêça siliconê bixin da ku belavbûna UV kêm bikin.
Ji bo dema ronahiyê ya pêşwext diyarkirî, wafer û maskeya wênekêş a SU-8 berbi 260 mJ/cm2 ronahiya UV-ê vekin.
Piştî vegirtina UV, SU-8-sîlîkonên pêçandî li 65°C ji bo 5 deqîqeyan û 95°C ji bo 15 hûrdeman li ser her plakaya germê hatin pijandin da ku qalibên bi bilindahiya 200 μm werin çêkirin. Dema piştî pijandinê li 95°C ber 30 min dirêj bikin da ku qalibên bi bilindahiya 5000 çêkin.
Pêşdebir tê rijandin nav firaqek cam, û wafera pijyayî di firaxê de tê danîn. Hêjmara pêşdebirê SU-8 dibe ku li gorî mezinahiya plakaya camê biguhere. Ji bo ku SU-8-ya nexuyakirî bi tevahî ji holê rabike, pê ewle bine. al rotation nerm.
Qalibê pêşkeftî bi ~ 10 mL pêşdebirê nû bişon û dûv re jî IPA bi rijandina çareseriyê bi karanîna pipetê.
Waferê têxin nav paqijkerek plazmayê û 1,5 hûrdem li ber plazmaya oksîjenê (gaza atmosferê, tansiyona armancê 1 × 10−5 Torr, hêz 125 W) bixin xwarê.
Vaferê têxin nav valahiya valahiya ku di hundirê wê de şûşeyek şûşe heye.Wafer û slaytan dikarin li kêleka hev bên danîn.Eger valahiya valahiya bi lewhekê di çend qatan de were dabeşkirin, şemitokan têxin jûreya jêrîn û fîşekan jî di jûreya jorîn de. şûşê dihejînin û ji bo silankirinê valahiya xwe bicîh dikin.
Fîşeka şaneyên Caco-2 yên cemidî di hemamek avê ya 37°C de bihelînin, dûv re şaneyên hilanîn veguhezînin fîşekek T75 a ku tê de 15 mL navgîna Caco-2 ya 37 °C pêş-germkirî heye.
Ji bo ku hucreyên Caco-2 bi ~90% lihevhatinê derbas bikin, pêşî navgîniya Caco-2, PBS, û 0,25% trypsin / 1 mM EDTA di hemamek avê ya 37 °C de germ bikin.
Bi aspirasyona valahiya navgînê aspirate bikin. Bi dûbarekirina aspirasyona valahiyê û lê zêdekirina PBS ya nû, şaneyên du caran bi 5 ml PBS germ bişon.