Spas ji bo serdana Nature.com.Hûn guhertoyek gerokek bi piştgirîya CSS-ya sînorkirî bikar tînin.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Wekî din, ji bo ku piştgirîya domdar misoger bike, em malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Carouselek ji sê slaytan yekcar nîşan dide.Bişkokên Pêşî û Paşê bikar bînin da ku di yek carê de di nav sê slaytan de bigerin, an jî bişkokên sliderê yên li dawiyê bikar bînin da ku di her carê de di sê slaytan de bigerin.
Astengiya xwîn-mêjî û astengiya xwînê-mêjî pêşî li ajanên biyoterapeutîk digirin ku di pergala nerva navendî de bigihîjin armancên xwe, bi vî rengî dermankirina bi bandor a nexweşiyên neurolojîk asteng dike.Ji bo veguhezkerên mêjî yên nû di vivo de kifş bikin, me pirtûkxaneyek peptîdê fagê T7 destnîşan kir û xwîn û şilava cerebrospinal (CSF) bi rêzî berhev kir ku bi karanîna modelek hewza mezin a mêş a hişkirî ya kanûlkirî.Klonên fagê yên taybetî piştî çar gerên hilbijartinê di CSF de pir dewlemend bûn.Testkirina peptîdên berendamên kesane ji 1000 qat zêdetir dewlemendbûna di CSF de eşkere kir.Biyoaktîvbûna gihandina peptîd-navbeynkar a ji mêj ve bi kêmkirina 40% di asta amyloid-β de di şilava cerebrospinal de bi karanîna frensek peptîdê BACE1 ve girêdayî peptîda transît a nû ya naskirî hate pejirandin.Van encaman destnîşan dikin ku peptîdên ku bi rêbazên hilbijartina fagê in vivo ve têne nas kirin dibe ku ji bo radestkirina pergalî ya makromolekulan ji mêjî re bi bandorek dermanker bibin wesayîtên bikêr.
Lêkolîna dermankirinê ya armanckirî ya pergala nerva navendî (CNS) bi giranî li ser tespîtkirina derman û ajanên xweşbînkirî yên ku taybetmendiyên CNS-armanca xwe nîşan didin, bi hewildanek kêmtir li ser vedîtina mekanîzmayên ku gihandina dermanê çalak ber bi mêjî ve dimeşîne, sekinîye.Ev niha dest bi guhertinê dike ji ber ku radestkirina derman, nemaze molekulên mezin, beşek yekbûyî ya pêşkeftina dermanên neurozanistî ya nûjen e.Jîngeha pergala nerva navendî ji hêla pergala astengiya cerebrovascular ve, ku ji astengiya xwînê-mejî (BBB) ​​û astengiya xwînê-mejî (BCBB)1 pêk tê, baş tê parastin, ku ew gihandina dermanan ji mêjî re dijwar dike1,2.Tê texmîn kirin ku hema hema hemî dermanên molekulên mezin û zêdetirî 98% dermanên molekulên piçûk ji mêjî têne derxistin3.Ji ber vê yekê pir girîng e ku meriv pergalên veguheztina mêjî yên nû yên ku radestkirina dermanên dermanker ên bikêr û taybetî ji CNS 4,5 re peyda dike, nas bike.Lêbelê, BBB û BCSFB di heman demê de ji bo radestkirina narkotîkê jî fersendek hêja pêşkêşî dikin ji ber ku ew bi navgîniya vaskulasyona wê ya berfireh dikevin û dikevin hemî strukturên mêjî.Bi vî rengî, hewildanên heyî yên ji bo karanîna rêbazên ne-dagirker ên radestkirina mêjî bi giranî li ser mekanîzmaya veguheztina navbeynkar-receptor (PMT) bi karanîna receptorê BBB6-a endojen ve girêdayî ye.Tevî pêşkeftinên sereke yên vê dawiyê bi karanîna riya wergirên transferrînê7,8, pêşkeftina bêtir pergalên radestkirina nû bi taybetmendiyên çêtir hewce dike.Ji bo vê armancê, armanca me ev bû ku em peptîdên ku karibin navbeynkariya veguhastina CSF-ê bikin nas bikin, ji ber ku ew di prensîbê de dikarin ji bo gihandina makromolekulan berbi CNS an vekirina rêyên receptorên nû werin bikar anîn.Bi taybetî, receptor û veguhezerên taybetî yên pergala cerebrovaskuler (BBB û BSCFB) dikarin wekî armancên potansiyel ji bo radestkirina çalak û taybetî ya dermanên biyoterapî xizmet bikin.Avêla mêjî (CSF) hilberek veşartî ya korika koroîdê (CS) ye û rasterast bi şilava navberî ya mêjî re di nav cîhê subarachnoid û cîhê ventrikular re di têkiliyê de ye4.Di van demên dawî de hate destnîşan kirin ku şilava mêjî ya subarachnoid pir zêde di nav navberê mêjî de belav dibe9.Em hêvî dikin ku bi karanîna vê rêça ketina subarachnoid an rasterast bi navgîniya BBB ve bigihîjin cîhê parenşîmî.Ji bo ku em bigihîjin vê yekê, me stratejiyek bijartina fagê ya di vivo de bicîh kir ku bi îdeal peptîdên ku ji hêla van her du rêyên cihêreng ve têne veguheztin nas dike.
Naha em rêgezek birêkûpêk nîşana nîşana fagê ya di vivo de bi nimûneya CSF-ê re digel rêzgirtina berbi bilind (HTS) vedibêjin da ku qonaxên hilbijartinê yên destpêkê yên bi cihêrengiya pirtûkxaneyê ya herî bilind bişopînin.Paqijkirin li ser mişkên bihişmend bi kanûla çîsterna mezin (CM) ya ku bi domdarî hatî çandin hate kirin da ku ji gemariya xwînê dûr bikevin.Ya girîng, ev nêzîkatî hem armanckirina mêjî û hem jî peptîdên bi çalakiya veguheztinê li seranserê astengiya cerebrovascular hildibijêre.Me fajên T7 ji ber mezinahiya wan a piçûk (~ 60 nm)10 bikar anî û pêşniyar kir ku ew ji bo veguheztina vezîkulan guncan in ku destûrê didin derbasbûna transcellular a astengiya endotelyal û/an epithelial-medulla.Piştî çar geryanên panning, nifûsa fagê hatin veqetandin ku di vivo de dewlemendkirina CSF û komeleya mîkrobatê ya mêjî xurt nîşan dide.Ya girîng, me karîbû vedîtinên xwe piştrast bikin û destnîşan bikin ku peptîdên berendamê çêtirîn ên bijartî û bi kîmyewî hatine sentezkirin dikarin barkirina proteînê di nav şilava cerebrospinal de biguhezînin.Pêşîn, bandorên pharmacodînamîka yên CNS bi berhevkirina peptîdek veguheztinê ya pêşeng bi înhîbîtorek peptîdê BACE1 re hate saz kirin.Digel vê yekê ku em destnîşan dikin ku stratejiyên veguheztina fonksiyonel ên di vivo de dikarin peptîdên veguheztina mêjî yên nû wekî hilgirên barkêş ên proteîn ên bi bandor nas bikin, em li bendê ne ku nêzîkatiyên hilbijartinê yên fonksiyonel ên wekhev jî di naskirina riyên veguheztina mêjî yên nû de girîng bibin.
Li ser bingeha yekîneyên çêkirina plakê (PFU), piştî pêngava pakkirina fagê, pirtûkxaneyek ji peptîdên fagê T7 yên xêzkirî yên random 12-mer bi cihêrengiya nêzîkê 109 hate sêwirandin û afirandin (binihêrin Materyal û Rêbaz).Girîng e ku em bala xwe bidinê ku me bi baldarî ev pirtûkxane berî pankirina in vivo analîz kir.Zêdekirina PCR-ê ya nimûneyên pirtûkxaneya fagê bi karanîna primerên guhezbar amplîkonên ku rasterast ji HTS-ê re têkildar bûn çêkirin (Hêjîra Pêvek. 1a).Ji ber a) çewtiyên rêziknameya HTS11, b) bandorkirina li ser qalîteya destpêkeran (NNK) 1-12, û c) hebûna fagê (wt) celeb (wt) di pirtûkxaneya standby de, pêvajoyek fîlterkirina rêzê hate bicîh kirin ku tenê agahdariya rêzika pejirandî were derxistin (Hêjîrê 1b).Van gavên parzûnê li hemî pirtûkxaneyên rêzikên HTS-ê bicîh dibin.Ji bo pirtûkxaneya standard, bi tevahî 233,868 xwendin hatin bidestxistin, ji wan 39% pîvanên parzûnê derbas kirin û ji bo analîzkirina pirtûkxaneyê û hilbijartina ji bo gerên paşîn hatin bikar anîn (Wêneya Pêvek 1c–e).Xwendin bi giranî bi dirêjahiya 3 cotên bingehê pirjimar bûn bi lûtkeya 36 nukleotîdan (Hêjmara Pêvek. 1c), sêwirana pirtûkxaneyê (NNK) 1-12 piştrast dike.Nemaze, bi qasî 11% ji endamên pirtûkxaneyê pêvek PAGISRELVDKL-ya pişta 12-alî (wt) vedihewîne, û hema nîvê rêzikan (49%) têxistin an jêbirin hene.HTS ya pirtûkxaneya pirtûkxaneyê cihêrengiya bilind a peptîdên di pirtûkxaneyê de piştrast kir: zêdetirî 81% rêzikên peptîdê tenê carekê hatine dîtin û tenê 1.5% di ≥4 kopiyan de derketine (Hêjmara Pêvek. 2a).Frekansên asîdên amînî (aa) li her 12 cihên di repertuwarê de bi frekansên ku ji bo hejmara kodonên ku ji hêla repertuara dejenerekirî ya NKK-ê ve têne hilberandin re baş têkildar in (Hêjîra Pêvek. 2b).Frekansa dîtbarî ya bermayiyên aa yên ku ji hêla van pêvekan ve hatî kod kirin bi frekansa hesapkirî (r = 0,893) re baş têkildar bû (Hêjîra pêvek. 2c).Amadekirina pirtûkxaneyên fagê yên ji bo derzîlêdanê gavên zêdekirin û rakirina endotoxinê vedihewîne.Ev berê hate destnîşan kirin ku bi potansiyel cihêrengiya pirtûkxaneyên fagê kêm dike12,13.Ji ber vê yekê, me pirtûkxaneyek fagê ya bi plakaya zêdekirî ya ku ji rakirina endotoksînê derbas bû rêz kir û wê bi pirtûkxaneya orîjînal re berhev kir da ku frekansa AA texmîn bike.Têkiliyek xurt (r = 0,995) di navbera hewza orîjînal û hewza zêdekirî û paqijkirî de hate dîtin (Hêzên pêvek. 2d), ku destnîşan dike ku pêşbaziya di navbera klonên ku li ser lewheyên ku bi karanîna fagê T7 hatine zêdekirin de nebûn sedema nerastiyek mezin.Vê berhevokê li ser pirhejmariya motîfên tripeptide di her pirtûkxaneyê de ye, ji ber ku cihêrengiya pirtûkxaneyan (~ 109) bi HTS-ê jî bi tevahî nayê girtin.Analîza frekansiya aa li her pozîsyonê di sê pozîsyonên paşîn ên repertuwara têketinê de beralîbûnek piçûk a girêdayî pozîsyonê eşkere kir (Hêjmara Pêvek. 2e).Di encamnameyê de, me encam da ku kalîte û cihêrengiya pirtûkxaneyê meqbûl bû û tenê guhertinên piçûk di cihêrengiyê de ji ber zêdekirin û amadekirina pirtûkxaneyên fagê di navbera çend qonaxên hilbijartinê de hatin dîtin.
Nimûneya şilava serebrospinal dikare bi emeliyatkirina kannula di nav CM-ya mişkên hişmend de were kirin da ku nasîna fagê T7 ku bi navgînî (iv) bi navgîniya BBB û/an BCSFB ve hatî derzîkirin (iv) hêsantir bike (Wêne. 1a-b).Me du destikên hilbijartinê yên serbixwe (çekên A û B) di sê gerên pêşîn ên hilbijartina in vivo de bikar anîn (Hêjîrê. 1c).Me gav bi gav hişkiya hilbijartinê zêde kir bi kêmkirina hêjmara giştî ya fagê ku di sê tûrên pêşîn ên hilbijartinê de hatî destnîşan kirin.Ji bo gera çaremîn a panningê, me nimûneyên ji şaxên A û B berhev kirin û sê vebijarkên serbixwe yên din pêk anîn.Ji bo vekolîna taybetmendiyên in vivo yên pariyên fagê T7 di vê modelê de, fagê-cûre (PAGISRELVDKL master insert) bi riya damarê dûvikê li mişkan hate derzî kirin.Vegerandina fagê ji şilava cerebrospinal û xwînê di demên cihêreng de destnîşan kir ku fajên îkosahedral ên T7-ê yên nisbeten piçûk xwedan qonaxek paqijkirina destpêkê ya bilez ji beşa xwînê bûn (Hêjmara Pêvek. 3).Li ser bingeha titerên ku hatine rêve kirin û hêjeya xwîna mişkan, me hesab kir ku tenê bi qasî 1% wt.10 hûrdem piştî derzîlêdana hundurîn fagê ji dozê hatî dayîn di xwînê de hate dîtin.Piştî vê kêmbûna bilez a destpêkê, paqijiyek seretayî ya hêdîtir bi nîv-jiyana 27,7 hûrdeman hate pîvandin.Ya girîng, tenê pir hindik fage ji beşa CSF-ê hatin derxistin, ku paşverûyek kêm ji bo koçkirina fagê ya celeb-çovî ya di beşa CSF-ê de destnîşan dike (Hêjmara Pêvek. 3).Di navanserê navîn de, tenê di xwînê de 1 x 10-3% titerên fagê T7 û 4 x 10-8% ji fagên destpêkê yên înfuzyonê di tevaya heyama nimûneyê de (0-250 hûrdem) di ava cerebrospinal de hatin dîtin.Nemaze, nîv-jiyana (25.7 hûrdem) ya fagê-cûreya çolê di şilava cerebrospinal de mîna ya ku di xwînê de tê dîtin bû.Van daneyan destnîşan dikin ku astenga ku parzemîna CSF ji xwînê vediqetîne di mişkên CM-kannûlkirî de saxlem e, hişt ku hilbijartina in vivo ya pirtûkxaneyên fagê ji bo tespîtkirina klonên ku bi hêsanî ji xwînê di beşa CSF de têne veguheztin nas bike.
(a) Sazkirina rêbazek ji bo ji nû ve nimûnekirina şilava cerebrospinal (CSF) ji hewzek mezin.(b) Diagram ku cîhê hucreyî yê astengiya pergala nerva navendî (CNS) û stratejiya hilbijartinê ya ku ji bo nasîna peptîdên ku ji astengiya xwînê-mêjî (BBB) ​​û astenga xwîn-mejî derbas dibin destnîşan dike.(c) Nexşeya herikandinê ya venêrana fagê di vivo de.Di her gera hilbijartinê de, fag (nasnameyên heywanan ên di nav tîran de) bi derzîlêdanê ve têne derzî kirin.Du şaxên alternatîf ên serbixwe (A, B) heta tûra 4emîn a hilbijartinê ji hev cuda têne girtin.Ji bo qonaxên hilbijartinê 3 û 4, her klonek fagê ku ji CSF hatî derxistin bi destan hate rêz kirin.(d) Kînetîka fagê ku ji xwînê (dorên sor) û şilava cerebrospinal (sêgoşekên kesk) veqetandî ye di gera yekem a hilbijartinê de li du mişkên kanûlkirî piştî derzîlêdana hundurîn a pirtûkxaneya peptîdê T7 (2 x 1012 fage/heywan).Çargoşeyên şîn jimareya destpêkê ya navînî ya fagê di xwînê de destnîşan dikin, ku ji mêjera fagê hatî derzîkirin tê hesibandin, ku li gorî hêjmara xwînê ya giştî tê hesibandin.Çargoşeyên reş xala hevberdana xeta y-yê ku ji kombûna fagê xwînê veqetandî nîşan dide.(e,f) Frekansa têkildar û belavkirina hemî motîfên sêpeptîdê yên gengaz ên ku di peptîdê de têne dîtin pêşkêş bikin.Hejmara motîfên ku di 1000 xwendinê de hatine dîtin tê xuyang kirin.Pir girîng (p <0,001) motîfên dewlemendkirî bi xalên sor têne nîşankirin.(e) Scatterplot girêdanê ku frekansa têkildar a motîfa sêpeptîdê ya pirtûkxaneya derzîkirî bi fagêyên xwînê yên ji heywanên #1.1 û #1.2 re berhev dike.(f) Scatterplot girêdanê ku frekansên têkildar ên motîfên tripeptîdê fagê heywanan #1.1 û #1.2 yên ku di xwîn û şilava cerebrospinal de hatine veqetandin berhev dike.(g, h) Nûneratiya ID-a rêzê ya fagê ku bi xwînê ve dewlemendkirî ye (g) li hember pirtûkxaneyên derzîkirî û fagê ku bi CSF (h) ve dewlemendkirî ye li hember xwînê piştî gera hilbijartina in vivo di her du heywanan de.Mezinahiya koda yek tîpî destnîşan dike ka çend caran ew asîda amînî di wê pozîsyonê de çêdibe.Kesk = polar, mor = bêalî, şîn = bingehîn, sor = asîdî û reş = asîdên amînî hîdrofobîk.Figure 1a, b ji hêla Eduard Urich ve hatî çêkirin û çêkirin.
Me pirtûkxaneyek peptîdê fagê derzî li du mişkên amûrê CM (clades A û B) kir û fagê ji şilava cerebrospinal û xwînê veqetand (Wêne 1d).Paqijkirina bilez a destpêkê ya pirtûkxaneyê li gorî fagê-type çolê kêmtir diyar bû.Navgîniya nîv-jiyana pirtûkxaneya derzîkirî ya di her du heywanan de di xwînê de 24,8 hûrdem bû, mîna fagê celebê çolê, û 38,5 hûrdem di CSF de.Nimûneyên fagê yên xwîn û mêjî yên mêjî yên ji her heywanî ketin ber HTS û hemî peptîdên naskirî ji bo hebûna motîfek kurt a sêpeptîdê hatin analîz kirin.Motîvên Tripeptîdê hatin hilbijartin ji ber ku ew bingehek hindiktirîn ji bo damezrandina avahî û peptîd-proteîn danûstendinên peyda dikin14,15.Me di belavkirina motîfan de di navbera pirtûkxaneya fagê ya derzîkirî û klonên ku ji xwîna her du heywanan hatine derxistin de têkiliyek baş dît (Wêne. 1e).Daneyên destnîşan dikin ku pêkhateya pirtûkxaneyê di beşa xwînê de tenê bi hûrgulî dewlemend e.Frekansên amînoasîdê û rêzikên lihevkirinê li her pozîsyonê bi karanîna adaptasyona nermalava Weblogo16 bêtir hatine analîz kirin.Balkêş e, me di bermayiyên glycine xwînê de dewlemendbûnek xurt dît (Hêjîrêk 1g).Dema ku xwîn bi klonên ji CSF-ê hatine hilbijartin re hate berhev kirin, hilbijarkek bihêz û hin hilbijartî ya motîfan hate dîtin (Wêne. 1f), û hin asîdên amînî bi tercîhî li cihên ji berê diyarkirî yên di 12-endam de hebûn (Hêjî. 1h).Nemaze, heywanên kesane di şilava cerebrospinal de pir cûda bûn, di heman demê de dewlemendkirina glycine xwînê di her du heywanan de hate dîtin (Pêvek Fig. 4a-j).Piştî parzûna hişk a daneyên rêzikan di şilava mêjî ya heywanên #1.1 û #1.2 de, bi tevahî 964 û 420 peptîdên 12-mer ên yekta hatin bidestxistin (Hêjmara Pêvek. 1d–e).Klonên fagê yên veqetandî hatin zêdekirin û tûra duyemîn a hilbijartina in vivo hatin kirin.Fagê ku ji gera duyemîn a hilbijartinê hatî derxistin, di her heywanek de bi HTS-ê re hate şandin û hemî peptîdên naskirî wekî têketinek bernameyek nasîna motîfê hatin bikar anîn da ku rûdana motîfên tripeptîdê analîz bike (Hêjî. 2a, b, ef).Li gorî çerxa yekem a fagê ya ku ji CSF-ê hatî hilanîn, me li CSF-ê di şaxên A û B de vebijark û hilbijarkek din dît.Algorîtmayek nasnameya torê hate sepandin da ku diyar bike ka ew qalibên cihêreng ên rêzikên hevgirtî temsîl dikin.Wekheviyek eşkere di navbera rêzikên 12-alî yên ku ji hêla CSF-ê ve di klîdeya A-yê alternatîf (Wêne. 2c, d) û klîdeya B-yê (Hêjî. 2g, h) de hatine vejandin, hate dîtin.Analîzên hevgirtî yên di her şaxekê de profîlên hilbijartinê yên cihêreng ên ji bo peptîdên 12-mer (Hêjmara Pêvek. 5c,d) û zêdebûna rêjeya CSF/tîtera xwînê bi demê re ji bo klonên hevgirtî piştî gera duyemîn a hilbijartinê li gorî gera yekem a hilbijartinê eşkere kir (Hêjîra pêvek. 5e).).
Dewlemendkirina motîf û peptîdên di şilava cerebrospinal de ji hêla du gerên li dû hev ve hilbijartina pêşandana fagê ya fonksiyonel a in vivo.
Hemî fagên şilavê yên cerebrospinal ên ku ji gera yekem a her heywanî (heywanên #1.1 û #1.2) hatin derxistin, hatin berhev kirin, hatin zêdekirin, rêza HT-ê û ji nû ve bi hev re hatin derzîkirin (2 x 1010 fage/heywan) 2 mişkên SM-ê yên kanûlkirî (#1.1 → #).2.1 û 2.2, 1.2 → 2.3 û 2.4).(a,b,e,f) Scatterplotên pêwendiyê frekansa têkildar a motîfên tripeptîdê yên hemî fagên ku ji CSF-ê hatine wergirtin di gerên hilbijartina yekem û duyemîn de didin ber hev.Rêjeya têkildar û belavkirina motîfan ku hemî tripeptîdên hevgirtî yên gengaz ên ku di peptîdan de di her du alîyan de têne dîtin temsîl dikin.Hejmara motîfên ku di 1000 xwendinê de hatine dîtin tê xuyang kirin.Motîfên ku bi girîngî (p < 0.001) hatine hilbijartin an hatine derxistin di yek ji pirtûkxaneyên berhevkirî de bi xalên sor têne ronî kirin.(c, d, g, h) Nûneratiya logoya rêzê ya hemî rêzikên dirêj ên 12 asîdên amînî yên dewlemend ên CSF-ê yên li ser bingeha gerên 2 û 1 yên hilbijartina in vivo.Mezinahiya koda yek tîpî destnîşan dike ka çend caran ew asîda amînî di wê pozîsyonê de çêdibe.Ji bo temsîlkirina logoyê, frekansa rêzikên CSF yên ku ji heywanên kesane di navbera du gerên hilbijartinê de têne derxistin têne berhev kirin û rêzikên dewlemendkirî yên di tûra duyemîn de têne xuyang kirin: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 û (h) #1.2–#2.4.Asîdên amînî yên herî dewlemend li cihekî diyarkirî di (c, d) heywanan de ne.2.1 û no.2.2 an (g, h) di heywanan de ne.2.3 û no.2.4 bi reng têne xuyang kirin.Kesk = polar, mor = bêalî, şîn = bingehîn, sor = asîdî û reş = asîdên amînî hîdrofobîk.
Piştî gera sêyemîn a hilbijartinê, me 124 rêzikên peptîdê yên bêhempa (#3.1 û #3.2) ji 332 klonên fagê yên ji nû ve avakirî yên CSF-ê yên ji du heywanan veqetandî nas kirin (Hêjmara Pêvek. 6a).Rêzeya LGSVS (18,7%) xwedan rêjeya nisbî ya herî bilind bû, li dûv jî têlên çolê PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), û SARGSWREIVSLS (2,2%).Di tûra çaremîn a dawîn de, me du şaxên serbixwe yên hilbijartî ji sê heywanên cihê berhev kirin (Wêne. 1c).Ji 925 klonên fagê yên rêzkirî yên ku ji CSF hatine derxistin, di gera çaremîn de me 64 rêzikên peptîdê yên yekta dîtin (Hêjmara Pêvek. 6b), ku di nav wan de rêjeya nisbî ya fagê-type çolê daket 0,8%.Klonên CSF yên herî gelemperî di tûra çaremîn de LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) (3.6VDSDGLS) û GRPQKINGARVC (3.6%)RLCSS, SDG2% bûn.%)).Rêjeya dirêjahiya peptîdên hilbijartî ji ber ketina / jêbirina nukleotîdan an kodonên rawestana pêşwext ên di primerên pirtûkxaneyê de dema ku ji bo sêwirana pirtûkxaneya NNK kodonên dejenere têne bikar anîn e.Kodonên rawestana pêşwext peptîdên kurttir çêdikin û ji ber ku motîfa aa-ya bijarte dihewîne têne hilbijartin.Peptîdên dirêjtir dibe ku ji ketina / jêbirinên di primerên pirtûkxaneyên sentetîk de çêbibin.Ev kodona rawestanê ya sêwirandî li derveyî çarçovê bi cih dike û wê dixwîne heya ku kodonek rawestanê ya nû li jêrê xuya bibe.Bi gelemperî, me faktorên dewlemendkirinê ji bo her çar qonaxên hilbijartinê bi berhevkirina daneyên têketinê bi daneyên derketinê yên nimûneyê re hesab kirin.Ji bo gera yekem a verastkirinê, me titerên fagê yên çolê wekî referansek paşnavê ne-taybet bikar anîn.Balkêş e, hilbijartina fagê neyînî di çerxa yekem a CSF de pir xurt bû, lê ne di xwînê de (Hêjî. 3a), ku dibe ku ji ber kêmbûna îhtîmala belavbûna pasîf a piraniya endamên pirtûkxaneya peptîdê di nav beşa CSF de an fagên têkildar de ji bakterîofajan bi bandortir were girtin an ji nav xwînê were derxistin.Lêbelê, di tûra duyemîn a panningê de, hilbijartina xurt a fagê di CSF-ê de di her du kladeyan de hate dîtin, û destnîşan dike ku dora berê di fageyan de dewlemend bûye ku peptîdên ku girtina CSF-ê pêşve dixin nîşan didin (Hêjî. 3a).Dîsa, bêyî dewlemendkirina xwînê ya girîng.Her weha di tûrên sêyemîn û çaremîn de, klonên fagê di CSF de bi girîngî dewlemend bûn.Berhevdana frekansa nisbî ya her rêzika peptîdê ya yekta ya di navbera her du tûrên hilbijartinê yên dawî de, me dît ku rêzik di gera çaremîn a hilbijartinê de hê bêtir dewlemend bûne (Hêjîrê. 3b).Bi tevahî 931 motîfên tripeptîdê ji hemî 64 rêzikên peptîdê yên bêhempa bi karanîna her du rêgezên peptîdê hatine derxistin.Motîvên herî dewlemend ên di tûra çaremîn de ji bo profîlên dewlemendkirina wan li seranserê hemî doran ji nêz ve li gorî pirtûkxaneya derzîkirî hatine lêkolîn kirin (birrîn: 10% dewlemendkirin) (Hêjmara Pêvek. 6c).Nimûneyên giştî yên hilbijartinê destnîşan kirin ku piraniya motîvên lêkolînkirî di hemî qonaxên berê yên her du şaxên hilbijartinê de dewlemend bûne.Lêbelê, hin motîf (mînak SGL, VSG, LGS GSV) bi giranî ji clade A alternatîf bûn, lê yên din (mînak FGW, RTN, WGF, NTR) di clade B ya alternatîf de dewlemend bûn.
Rastkirina veguheztina CSF ya peptîdên peptîdên ku bi fage-pêşandan bi CSF-dewlemendkirî û peptîdên pêşeng ên biotinylated ên bi bargiranên streptavidînê ve girêdayî ne.
(a) Rêjeyên zengînkirinê di her çar geryanên (R1-R4) de têne hesibandin li ser bingeha titerên fagê (PFU) yên derzîkirî (navnîşan = I) û titerên fagê yên CSF (derketin = O).Faktorên zengînkirinê ji bo sê tûrên paşîn (R2-R4) bi berhevdana gera berê û tûra yekem (R1) bi daneyên giraniyê re hatin hesibandin.Barên vekirî herikîna cerebrospinal in, barên şidandî plazma ne.(***p<0.001, li ser bingeha T-testa Xwendekarê).(b) Navnîşa peptîdên fagê yên herî zêde, ku li gorî rêjeya wan a têkildar bi hemî fagên ku di CSF-ê de piştî gera 4-an a hilbijartinê hatine berhev kirin têne rêz kirin.Şeş klonên fagê yên herî gelemperî bi reng, jimare û faktorên wan ên dewlemendkirina di navbera dora 3 û 4 ya hilbijartinê de têne ronî kirin.(c,d) Şeş klonên fagê yên herî dewlemend, pirtûkxaneyên fagê yên vala û peptîdên fagê yên dêûbavî yên ji dora 4-an bi rengek kesane di modelek nimûneya CSF de hatin analîz kirin.Nimûneyên CSF û xwînê di demên diyarkirî de hatin berhev kirin.(c) Wekhev 6 klonên fagê yên berendam (2 x 1010 fage/heywan), fajên vala (#1779) (2 x 1010 fage/heywan) û pirtûkxaneyên peptîdên fagê yên stok (2 x 1012 fage/heywan) bi kêmî ve 3 CM ji heywanê veqetandî tê derz kirin.Pharmacokinetics CSF ya her klona fagê û pirtûkxaneya peptîdê ya fagê bi demê re tê destnîşan kirin.(d) rêjeya navînî ya CSF / xwînê ji bo hemî fagên / mL yên nûvekirî di dema nimûneyê de nîşan dide.(e) Çar peptîdên pêşeng ên sentetîk û yek kontrolek tevlihev bi biotin bi streptavidin ve bi navgîniya N-termînalê (nîşandana tetramerê) ve hatin girêdan û dûv re jî derzîlêdanê (damara dûvikê iv, 10 mg streptavidin/kg).Bi kêmanî sê mişkên intubated (N = 3).).Nimûneyên CSF di xalên dema destnîşankirî de hatin berhev kirin û giraniya streptavidin bi CSF antî-streptavidîn ELISA (nd = nehate tespît kirin) hate pîvandin.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, li ser bingeha testa ANOVA).(f) Berawirdkirina rêza asîda amînî ya klona peptîda fagê ya herî dewlemend #2002 (binefşî) bi klonên peptîda fagê yên bijartî yên ji gera 4emîn a hilbijartinê.Parçeyên asîda amînî yên yeksan û dişibin rengîn têne kod kirin.
Ji hemî fagên dewlemendkirî yên di tûra çaremîn de (Wêne. 3b), şeş klonên berendam ji bo analîza kesane ya bêtir di modela nimûneya CSF de hatin hilbijartin.Mîqdarên wekhev ên şeş fagê namzed, fagê vala (bê têxe) û pirtûkxaneyên peptîdê prophage li sê heywanên CM-ya kanûlkirî hatin derzî kirin, û dermankokinetîk di astên CSF (Hêjî. 3c) û xwînê (Hêjmara Pêvek. 7) de hatin destnîşankirin.Hemî klonên fagê yên hatine ceribandin parça CSF-ê di astek 10-1000 carî ji ya fagê kontrolê ya vala (# 1779) bilindtir kirine armanc.Mînakî, klonên #2020 û #2077 bi qasî 1000 carî titerên CSF ji fagê kontrolê bilindtir bûn.Profîla pharmacokinetîkî ya her peptîdê hilbijartî cihêreng e, lê hemî wan xwedan şiyana malgirtina CSF-ya bilind in.Me ji bo klonên #1903 û #2011 bi demê re kêmbûnek domdar dît, dema ku ji bo klonên #2077, #2002 û #2009 zêdebûnek di 10 hûrdemên pêşîn de dibe ku veguheztina çalak nîşan bide lê pêdivî ye ku were verast kirin.Klonên #2020, #2002, û #2077 di astên bilind de stabîl bûn, dema ku giraniya CSF ya klona #2009 piştî zêdebûna destpêkê hêdî hêdî kêm bû.Dûv re me frekansa têkildar a her berendamê CSF bi giraniya xwîna wê re berhev kir (Wêne. 3d).Têkiliya navînî ya her berendamê CSF bi tîra xwîna wê re di hemî demên nimûneyê de destnîşan kir ku sê ji şeş berendaman bi girîngî di CSF xwînê de dewlemend bûne.Balkêş e, klona #2077 îstîqrara xwînê bilindtir nîşan da (Wêneya Pêvek 7).Ji bo ku em piştrast bikin ku peptîd bixwe dikarin barek ji bilî pariyên fagê bi rengekî aktîf veguhezînin beşa CSF, me çar peptîdên pêşeng ên ku bi biotinê ve hatine berhev kirin li xala N-yê ku peptîd bi parça fagê ve girêdayî ne, sentez kirin.Peptîdên biotinylated (hejmar 2002, 2009, 2020 û 2077) bi streptavidîn (SA) re hatin girêdan da ku formên pirmerîkî yên ku hinekî geometriya fagê dişibînin bidest bixin.Vê formatê di heman demê de rê da me ku em di xwînê û şilava cerebrospinal de wekî peptîdên proteîn ên barkêş-veguheztina SA-yê bipîvin.Ya girîng, dema ku peptîdên sentetîk di vê formata hevgirtî ya SA-yê de têne bikar anîn, daneyên fagê pir caran dikarin werin hilberandin (Wêne. 3e).Peptîdên şikestî di nav 48 demjimêran de xwedan rûdana destpêkê ya kêmtir û paqijkirina CSF-ya zûtirîn bi astên nenaskirî bûn.Ji bo ku em li ser riyên radestkirina van klonên fagê yên peptîdê li cîhê CSF-ê bigihîjin têgihiştinê, me cîhgirtina lêdanên peptîdên fagê yên takekesî bi karanîna immunohistochemistry (IHC) analîz kir da ku rasterast perçeyên fagê 1 saet piştî derzîlêdana hundurîn di vivo de tespît bike.Nemaze, klonên #2002, #2077, û #2009 dikarin di kapîlarên mêjî de bi rengvedanek bihêz ve werin tesbît kirin, dema ku fagê kontrolê (#1779) û klona #2020 nehatine tespît kirin (Wêneya Pêvek 8).Ev pêşniyar dike ku ev peptîd bi derbaskirina BBB-ê bi bandorek li ser mêjî de beşdar dibin.Ji bo ceribandina vê hîpotezê analîzek berfirehtir hewce ye, ji ber ku dibe ku riya BSCFB jî beşdar bibe.Dema ku rêza asîda amînî ya klona herî dewlemend (#2002) bi peptîdên din ên hilbijartî re were berhev kirin, hate destnîşan kirin ku hin ji wan xwedan dirêjkirinên asîda amînî yên mîna hev in, ku dibe ku mekanîzmayek veguheztinê ya mîna nîşan bide (Hêjî. 3f).
Ji ber profîla wê ya yekta ya plazmayê û zêdebûna girîng a CSF bi demê re, klona nîşana fagê #2077 di heyamek dirêjtir a 48 demjimêran de bêtir hate lêkolîn kirin û karîbû ku zêdebûna bilez a CSF-ya ku li gorî astên SA-yê domdar tê dîtin ji nû ve hilberîne (Wêne. 4a).Derbarê klonên fagê yên din ên naskirî de, #2077 ji bo kapîlarên mêjî bi tundî reng kir û bi lektîn nîşankera kapîlar re dema ku bi çarenûsa bilindtir were dîtin û dibe ku hin reng di cîhê parenkîmal de were temaşe kirin re hevrêziyek girîng nîşan da (Wêne 4b).Ji bo vekolînê bê ka gelo bandorên dermankolojîk ên bi navbeynkariya peptîdê dikarin di CNS de werin bidestxistin, me ceribandinek pêk anî ku tê de guhertoyên biotinylated i) peptîda transît #2077 û ii) peptîda astengkerê BACE1 bi SA re bi du rêjeyên cûda re tevlihev bûn.Ji bo yek kombînasyona me tenê înhîbîtora peptîdê BACE1 bikar anî û ji bo ya din jî me rêjeya 1:3 ya frenkera peptîdê BACE1 bi peptîd #2077 bikar anî.Her du nimûne bi hundurê venoz ve hatin rêve kirin û asta xwînê û mîzê ya beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) bi demê re hate pîvandin.Abeta40 di CSF de hate pîvandin ji ber ku ew astengkirina BACE1 di parenşîma mêjî de nîşan dide.Wekî ku tê hêvî kirin, her du kompleks bi girîngî asta xwînê ya Abeta40 kêm kirin (Wêne. 4c, d).Lêbelê, tenê nimûneyên ku têkiliyek peptide no.2077 û înhîbîtorek peptîdê BACE1 ku bi SA-yê ve hatî girêdan bû sedema kêmbûnek girîng a Abeta40 di şilava cerebrospinal de (Wêne. 4c).Daneyên nîşan dide ku peptide no.2077 karibe proteîna SA ya 60 kDa veguhezîne nav CNS û di heman demê de bandorên dermankolojîkî bi înhîbîtorên SA-konjugated ên peptîda BACE1 re jî çêdike.
(a) Derziya klonal (2 × 10 fage/heywan) fagê T7 ku profîlên dermanokînetîk ên demdirêj ên peptîda CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) û fagê kontrolê yê nederzkirî (#1779) di herî kêm sê mişkên CM-întubkirî de nîşan dide.(b) Wêneya mîkroskopî ya konfokal a mîkro damarên kortîkal ên temsîlî yên di mişkên ku bi fagê hatine derzîkirin (2 × 10 10 fage/heywan) ku berevajîkirina peptîda #2077 û damaran (lektîn) nîşan dide.Van klonên fagê ji 3 mişkan re hatin şandin û 1 demjimêr berî perfusionê hate hiştin.Mejî hatin perçekirin û bi antîbozên FITC-labelkirî yên polyclonal ên li dijî kapsîda fagê T7 hatin reng kirin.Deh hûrdeman berî perfuzyonê û dûv re rastkirin, lektîn-etîketkirî ya DyLight594 bi hundurê venoz ve hate bikar anîn.Wêneyên fluorescentê ku lektîn (sor) li aliyê ronahiyê yên mîkro damar û fagê (kesk) di lûmena kapilaran û tevna mejî ya perîvaskular de nîşan dide.Barê pîvanê bi 10 μm re têkildar e.(c, d) Peptîda astengker BACE1 ya biotinylated tenê an bi peptîda transît a biotinylated #2077 re bi streptavidînê re hate girêdan û dûv re bi derzîlêdana hundurîn a herî kêm sê mişkên CM-ya kanûlkirî (10 mg streptavidin/kg).Kêmkirina bi navbeynkariya peptîdê BACE1 di Aβ40 de bi Aβ1-40 ELISA di xwînê (sor) û şilava cerebrospinal (porteqalî) de di xalên dema destnîşankirî de hate pîvandin.Ji bo zelalbûna çêtir, li ser grafîkê bi pîvanek 100% xêzek xalî tê kişandin.(c) Kêmkirina sedî Aβ40 di xwînê de (sêgoşekên sor) û şilava cerebrospinal (sêgoşeyên porteqalî) di mişkên ku bi streptavîdîn ve girêdayî peptîda transît #2077 û peptîdê astengker BACE1 bi rêjeyek 3:1 ve hatî derman kirin.(d) Kêmkirina sedî di xwînê de Aβ40 (derdorên sor) û şilava cerebrospinal (derdorên porteqalî) yên mişkên ku bi streptavidînê hatine dermankirin tenê bi peptîdek astengker BACE1 ve girêdayî ye.Giraniya Aβ di kontrolê de 420 pg/ml bû (veguhastina standard = 101 pg/ml).
Nîşandana Phage di gelek warên lêkolîna biyolojîkî de bi serfirazî hate sepandin17.Ev rêbaz ji bo lêkolînên cihêrengiya damarên in vivo18,19 û her weha lêkolînên ku damarên mêjî dikin armanc20,21,22,23,24,25,26, hatiye bikar anîn.Di vê lêkolînê de, me sepana vê rêbaza hilbijartinê ne tenê ji bo nasîna rasterast a peptîdên ku damarên mêjî hedef digirin, lê di heman demê de ji bo vedîtina berendamên xwedan taybetmendiyên veguheztina çalak jî dirêj kir ku astengiya xwîn-mêjî derbas bikin.Em naha pêşveçûna pêvajoyek hilbijartinê ya in vivo di mişkên CM intubated de vedibêjin û potansiyela wê ji bo naskirina peptîdên bi taybetmendiyên CSF-ê yên xwemalî destnîşan dikin.Bi karanîna fagê T7 ku pirtûkxaneyek ji 12-mer peptîdên bêserûber nîşan dide, me karî destnîşan bikin ku fagê T7 têra xwe piçûk e (nêzîkî 60 nm bi pîvanê ye)10 ku li benda xwîn-mêjî were adaptekirin, bi vî rengî rasterast astenga xwîn-mêjî an jî plexusa korîdê derbas bike.Me dît ku berhevkirina CSF ji mişkên CM-ya kanûlkirî rêbazek vekolîna fonksiyonel a vivo-ya baş-kontrolkirî bû, û ku fagê hatî derxistin ne tenê bi vaskulatorê ve girêdayî ye, lê di heman demê de wekî veguhezkarek li seranserê astengiya xwîn-mêjî jî kar dike.Wekî din, bi hevdemî berhevkirina xwînê û sepandina HTS li ser CSF û fagên ji xwînê, me piştrast kir ku bijartina me ya CSF ji dewlemendkirina xwînê an guncanbûna ji bo berfirehbûna di navbera gerîdeyên hilbijartinê de ne bandor bû.Lêbelê, parçeya xwînê beşek prosedûra hilbijartinê ye, ji ber ku fagên ku dikarin xwe bigihînin beşa CSF-ê divê bi qasî dirêj sax bimînin û di nav xwînê de bizivirin da ku xwe di mêjî de dewlemend bikin.Ji bo ku em agahdariya rêza pêbawer ji daneya HTS ya xav derxînin, me parzûnên ku li gorî xeletiyên rêzikên taybetî yên platformê di xebata analîzê de hatine adaptekirin bicîh kirin.Bi tevlêkirina parametreyên kînetîk di nav rêbaza vekolînê de, me pharmacokinetica bilez a fagên T7-ya çolê (t½ ~ 28 hûrdem) di xwînê24, 27, 28 de piştrast kir û her weha nîv-jiyana wan di şilava cerebrospinal de (t½ ~ 26 hûrdem) di hûrdemê de destnîşan kir.Tevî profîlên pharmacokinetîkî yên wekhev di xwînê û CSF de, tenê 0,001% ji berhevoka xwînê ya fagê dikare di CSF de were tesbît kirin, ku livîna paşverû ya kêm a fagê T7-ya çolê li seranserê astengiya xwîn-mejî nîşan dide.Ev xebat girîngiya gera yekem a hilbijartinê ronî dike dema ku stratejiyên pankirina in vivo bikar tîne, nemaze ji bo pergalên fagê yên ku bi lez ji tîrêjê têne paqij kirin, ji ber ku çend klon dikarin bigihîjin beşa CNS.Ji ber vê yekê, di tûra yekem de, kêmkirina cihêrengiya pirtûkxaneyê pir mezin bû, ji ber ku di vê modela CSF-ê ya pir hişk de di dawiyê de tenê hejmareke sînorkirî ya klonan hatin berhev kirin.Ev stratejiya pankirina in vivo çend gavên hilbijartinê yên wekî berhevkirina çalak di beşa CSF de, zindîbûna klonê di beşa xwînê de, û rakirina bilez a klonên fagê T7 ji xwînê di nav 10 hûrdemên pêşîn de vedihewîne (Hêjî. 1d û Hêjmara Pêvek. 4M).).Bi vî rengî, piştî tûra yekem, di CSF de klonên fagê yên cûda hatin nas kirin, her çend heman hewza destpêkê ji bo heywanên kesane hate bikar anîn.Ev pêşniyar dike ku gelek gavên bijartina hişk ji bo pirtûkxaneyên çavkaniyê yên bi hejmareke mezin ji endamên pirtûkxaneyê re dibin sedema kêmbûnek girîng a cihêrengiyê.Ji ber vê yekê, bûyerên rasthatî dê bibin parçeyek bingehîn a pêvajoya hilbijartina destpêkê, ku bandorek mezin li encamê bike.Ihtîmal e ku gelek klonên di pirtûkxaneya orîjînal de xwedî meyla dewlemendkirina CSF-ê ya pir dişibin.Lêbelê, tewra di bin heman şert û mercên ceribandinê de, dibe ku encamên hilbijartinê ji ber hejmarek piçûk a her klonek taybetî ya di hewza destpêkê de cûda bibin.
Motîfên ku di CSF de dewlemendkirî ji yên di xwînê de cûda dibin.Balkêş e, me guheztina yekem a berbi peptîdên dewlemend ên glycine di xwîna heywanên kesane de destnîşan kir.(Hêjîra 1g, Hêjmarên Pêvek. 4e, 4f).Fagên ku peptîdên glycine vedihewîne dibe ku aramtir be û kêm be ku ji gerguhêz were derxistin.Lêbelê, van peptîdên dewlemend ên glycine di nimûneyên şilava cerebrospinal de nehatin tespît kirin, û destnîşan dike ku pirtûkxaneyên hilbijartî du gavên hilbijartinê yên cihêreng derbas kirin: yek di xwînê de û ya din destûr da ku di şilava cerebrospinal de kom bibe.Klonên CSF-dewlemendkirî yên ku ji gera çaremîn a hilbijartinê derketine bi berfirehî hatine ceribandin.Nêzîkî hemî klonên ceribandina kesane hatine pejirandin ku di CSF-ê de li gorî fageya kontrolê ya vala dewlemend bûne.Yek peptide hit (# 2077) bi hûrgulî hate lêkolîn kirin.Ew li gorî lêdanên din nîv-jiyanek plazmayê dirêjtir nîşan da (Wêne 3d û Wêneya Pêvek 7), û balkêş e, ku ev peptîd li C-termînalê bermayek cysteine ​​vedigire.Di demên dawî de hate destnîşan kirin ku lêzêdekirina cysteine ​​li peptîdan dikare taybetmendiyên wan ên pharmacokinetic bi girêdana bi albumin 29 re baştir bike.Ev niha ji bo peptide #2077 nenas e û lêkolînek din hewce dike.Hin peptîd di dewlemendkirina CSF-ê de girêdayîbûnek valence nîşan dan (daneyên ku nayên xuyang kirin), ku dibe ku bi geometriya rûbera xuyakirî ya kapsîda T7 ve têkildar be.Pergala T7 ya ku me bikar anî 5-15 kopiyên her peptîdê li ser perçeyek fagê nîşan da.IHC li ser klonên fagê pêşeng ên berendam ên ku bi navgînî di korteksa mêjî ya mişkan de hatine derzî kirin hate kirin (Hêjmara Pêvek. 8).Daneyan destnîşan kir ku bi kêmî ve sê klone (hejmar 2002, jimar 2009 û hejmar 2077) bi BBB re têkilî danîbûn.Dimîne ku were destnîşankirin ka gelo ev pêwendiya BBB di berhevkirina CSF-ê de an tevgera van klonan rasterast li BCSFB-ê encam dide.Ya girîng, em destnîşan dikin ku peptîdên bijartî dema ku têne sentez kirin û bi barkêşiya proteînê ve têne girêdan kapasîteya veguheztina CSF-ya xwe diparêzin.Girêdana peptîdên biotinylated-N-termînalê bi SA-ê re di bingeh de encamên ku bi klonên wan ên fagê yên têkildar di xwînê û şilava mêjî de hatine bidestxistin dubare dike (Hêjî. 3e).Di dawiyê de, em destnîşan dikin ku peptide #2077 dikare çalakiya mêjî ya peptîdek biotinylated frensî ya BACE1-ê ku bi SA-yê ve girêdayî ye pêşve bibe, bi kêmkirina girîng a asta Abeta40 di CSF-ê de dibe sedema bandorên dermankodînamîkî yên diyar ên di CNS de (Hêjî. 4).Em nekarîn di databasê de ti homologan nas bikin bi kirina lêgerînek homolojiya rêza peptîdê ya hemî lêdan.Girîng e ku were zanîn ku mezinahiya pirtûkxaneya T7 bi qasî 109 e, dema ku mezinahiya pirtûkxaneya teorîkî ya ji bo 12-mersan 4 x 1015 e. Ji ber vê yekê, me tenê perçeyek piçûk ji cîhê cihêrengiya pirtûkxaneya peptîdê ya 12-mer hilbijart, ku ev tê vê wateyê ku peptîdên xweşbîntir dikarin ji hêla van sequîsan ve cîhê naskirî têne destnîşankirin.Bi hîpotezîkî, yek ji sedemên ku me ti homologên xwezayî yên van peptîdan nedîtine dibe ku di dema pêşkeftinê de hilbijartî be ku pêşî li ketina bêkontrol a hin motîfên peptîdê di mêjî de bigire.
Bi hev re, encamên me bingehek ji bo xebata pêşerojê peyda dikin da ku pergalên veguheztinê yên astengiya cerebrovascular di vivo de bi hûrgulî nas bikin û diyar bikin.Sazkirina bingehîn a vê rêbazê li ser bingeha stratejiyek hilbijartinê ya fonksiyonel e ku ne tenê klonên xwedan taybetmendiyên girêdana damarên mêjî nas dike, lê di heman demê de pêngavek krîtîk jî vedihewîne ku tê de klonên serketî xwedan çalakiya xwerû ne ku ji astengên biyolojîkî di vivo de derbasî beşa CNS bibin.ronîkirina mekanîzmaya veguheztina van peptîd û tercîha wan a ji bo girêdana bi mîkrovaskulatora taybetî ya herêma mêjî re ye.Ev dibe sedema vedîtina riyên nû ji bo veguheztina BBB û receptoran.Em hêvî dikin ku peptîdên naskirî dikarin rasterast bi receptorên cerebrovaskuler an bi lîgandên gerok ên ku bi navgîniya BBB an BCSFB ve têne veguheztin ve girêbidin.Vektorên peptîd ên bi çalakiya veguheztina CSF ku di vê xebatê de hatine kifş kirin dê bêtir werin lêkolîn kirin.Em niha li taybetmendiya mêjî ya van peptîdan ji bo kapasîteya wan a derbaskirina BBB û / an BCSFB lêkolîn dikin.Van peptîdên nû dê ji bo vedîtina potansiyel a receptor an rêyên nû û ji bo pêşkeftina platformên nû yên pir bikêrhatî ji bo gihandina makromolekulan, wekî biyolojîk, ji mêjî re amûrên pir hêja bin.
Cisterna mezin (CM) bi guheztinek rêbaza ku berê hatî destnîşan kirin kanûl bikin.Mişkên Wistar ên bêhestkirî (200-350 g) li ser alavek stereotaksîk hatin danîn û birînek navîn li ser serê şilandî û aseptîk a amadekirî hate çêkirin da ku serê serê xwe eşkere bike.Li devera çîçeka jorîn du qul bikolin û pêlên rastkirinê di kulan de bixin.Ji bo rêberiya stereotaktîk a kanûla pola zengarnegir di nav CM-ê de qulikek din di lûleya deryaya paşîn de hate vekirin.Çîmentoya diranan li dora kanûlayê bixin û bi kulman vekin.Piştî kişandina wêne û hişkbûna çîmentoyê, birîna çerm bi 4/0 supramid suture hate girtin.Cihkirina rast a kanûlayê bi rijandina spontan a şilava cerebrospinal (CSF) ve tê pejirandin.Mişk ji amûra stereotaksîk derxînin, lênihêrîna guncan a piştî emeliyatê û rêveberiya êşê bistînin, û bihêlin ku ew bi kêmî ve hefteyek baş bibe heya ku nîşanên xwînê di şilava cerebrospinal de neyên dîtin.Mişkên Wistar (Crl:WI/Han) ji Çemê Charles (Fransa) hatine wergirtin.Hemî mişk di bin şert û mercên taybetî yên bê pathogen de hatin girtin.Hemî ceribandinên heywanan ji hêla Ofîsa Veterinary ya Bajarê Basel, Swîsre ve hatî pejirandin û li gorî lîsansa Heywanê ya Hejmar 2474 (Nirxandina Veguhestina Mejiyê Aktîv ji hêla Pîvandina Astên Namzetên Dermankirinê yên di Fluid Cerebrospinal û Mejiyê Rat de) hatine kirin.
Bi kenula CM di destê xwe de bi nermî mişkê hişyar bikin.Datura ji kanûlayê derxînin û 10 μl şilava cerebrospinal ku xweber diherike berhev bikin.Ji ber ku patenta kanûlayê di dawiyê de têk çû, tenê nimûneyên şilava cerebrospinal zelal bêyî delîlên gemarî an rengvedana xwînê di vê lêkolînê de hatin girtin.Di heman demê de, bi qasî 10-20 μl xwîn ji birînek piçûk a li serê dûvikê di lûleyên bi heparîn (Sigma-Aldrich) de hate girtin.CSF û xwîn di demên cûda de piştî derzîlêdana hundurîn a fagê T7 hatin berhev kirin.Nêzîkî 5-10 μl şilek hate avêtin berî ku her nimûneya CSF were berhev kirin, ku bi qebareya mirî ya kateterê re têkildar e.
Pirtûkxane bi karanîna vektora T7Select 10-3b wekî ku di manuala pergala T7Select de hatî destnîşan kirin (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) hatine çêkirin.Bi kurtasî, têkelek DNA ya 12-mer a rasthatî di forma jêrîn de hate sentez kirin:
Kodona NNK-ê hate bikar anîn da ku ji kodonên rawestana ducarî û zêdederxistina asîda amînoyê ya di hundurê de nehêle.N rêjeyek hevmolar a bi destan a her nukleotîdê ye, û K jî rêjeyek hevmolar a bi destan a nukleotîdên adenîn û sîtosîn e.Herêmên yek zincîre bi înkubasyonek din bi dNTP (Novagen) û enzîma Klenow (New England Biolabs) li tampon Klenow (New England Biolabs) ji bo 3 demjimêran di 37°C de veguherî ADN-ya dubendî.Piştî reaksiyonê, ADN-ya dubendî bi barîna EtOH hate vegerandin.ADN-ya ku derket holê bi enzîmên sînordar EcoRI û HindIII (her du jî ji Roche) hate xwar.Dûv re pêveka qutkirî û paqijkirî (QIAquick, Qiagen) (T4 lîgaza, New England Biolabs) di çarçovê de li vektorek T7-ya ku ji berê ve hatî veqetandin piştî asîda amînî ya 348 a gena kapsîdê 10B hate girêdan.Reaksiyonên lîgasyonê 18 saetan berî pakkirina in vitro di 16° C. de hatin vehewandin.Pakêkirina fagê di vitro de li gorî rêwerzên ku bi kîta klonkirinê ya T7Select 10-3b (Novagen) ve hatî peyda kirin û çareseriya pakkirinê bi karanîna Escherichia coli (BLT5615, Novagen) carekê ji bo lîzkirinê hate zêdekirin.Lîzat hatin santrîfujkirin, titrakirin û li -80° C. wekî çareseriyeke stok a glycerol hatin cemidandin.
Zêdekirina rasterast a PCR-ê ya herêmên guhêrbar ên fagê yên ku di nav şorbe an plakaya de bi karanîna primerên fusion 454/Roche-amplicon ên xwedan hatine zêdekirin.Destpêka hevberdanê ya pêş de rêzikên li kêleka herêma guhêrbar (NNK) 12 (taybet-şablon), GS FLX Titanium Adapter A, û ​​rêzek kilîta pirtûkxaneyê ya çar-bingeh (TCAG) vedihewîne (Wêjeya Pêvek 1a):
Destpêka fusionê ya berevajî di heman demê de biotin ku ji bo girtina mêşan û GS FLX Titanium Adapter B ya ku ji bo zêdekirina klonal di dema emulsyon PCR-ê de hewce ye ve girêdayî ye:
Dûv re amplicons li gorî protokola 454 GS-FLX Titanium ketin ber pyrosequencing 454 / Roche.Ji bo rêzgirtina bi destan a Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl Analyzer DNA), DNA-ya fagê T7 bi PCR-ê hate zêdekirin û bi cotên pêşîn ên jêrîn ve hate rêzkirin:
Kevirên ji plakên takekesî bi karanîna Kita Roche Fast Start DNA Polymerase (li gorî rêwerzên çêker) hatin zêdekirin PCR.Destpêkek germ (10 hûrdem li 95 °C) û 35 çerxên zêdekirinê (50 s li 95 °C, 1 hûrdem li 50 °C, û 1 hûrdem li 72 °C) pêk bînin.
Fagê ji pirtûkxaneyan, fagê celebê çolê, fagê ku ji CSF û xwînê hatî xilas kirin, an klonên kesane di Escherichia coli BL5615 de di şûşeya TB (Sigma Aldrich) de an jî di firaqên 500 cm2 (Thermo Scientific) de ji bo 4 saetan li 37°C hatin zêdekirin.Fag bi şuştina plakan bi tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) an jî bi berhevkirina plaketan bi tîpên pîpetên sterîl ji lewheyan hatin derxistin.Fag ji supernatantê çandê an tampon derxistinê bi yek dor barîna polîetîlen glycol (PEG 8000) (Promega) ve hatin veqetandin û di tampon Tris-EDTA de ji nû ve hatin sekinandin.
Fagê hatî zêdekirin 2-3 geryanên rakirina endotoxinê bi karanîna mêşên rakirina endotoxinê (Miltenyi Biotec) berî derzîlêdana hundurîn (IV) (500 μl / heywan) hate kirin.Di tûra yekem de, 2 × 1012 fage hatin destnîşan kirin;di ya duyemîn de, 2×1010 fage;di gerên hilbijartinê yên sêyemîn û çaremîn de, her heywanek 2 × 109 fage.Naveroka fagê di CSF de û nimûneyên xwînê yên ku di xalên dema destnîşankirî de hatine berhev kirin bi hejmartina plakeyê li gorî rêwerzên çêker (destûra pergalê T7Select) hate destnîşankirin.Hilbijartina fagê bi derzîlêdana hundurîn a pirtûkxaneyên paqijkirî di nav damarê dûvikê de an bi vejûjû derzîlêdana fagê ku ji CSF-ê ji dewra hilbijartinê ya berê hatî derxistin hate kirin, û berhevkirina paşîn bi rêzdarî di 10 hûrdeman, 30 hûrdem, 60 hûrdem, 90 hûrdem, 120 hûrdem, 180 hûrdem, û nimûneyên xwînê 240 deqe û 240 deqe.Bi tevahî çar tûrên panning in vivo hatin kirin ku tê de her du şaxên bijartî ji hev cuda hatin hilanîn û di sê gerên pêşîn ên hilbijartinê de hatin analîz kirin.Hemî têkelên fagê yên ku ji CSF-ê ji du tûrên pêşîn ên hilbijartinê hatine derxistin, ketin ber 454/Roche pyrosequencing, di heman demê de hemî klonên ku ji CSF-ê ji du gerên hilbijartinê yên paşîn hatine derxistin bi destan hatine rêzkirin.Hemî fagên xwînê yên ji tûra yekem a hilbijartinê jî di bin 454/Roche pyrosequencing de hatin kirin.Ji bo derzîlêdana klonên fagê, fagên hilbijartî di E. coli (BL5615) de li ser 500 cm2 lewheyên li 37°C ji bo 4 saetan hatin zêdekirin.Klonên ferdî yên bijartî û bi destan hatine rêzkirin di navgîna TB de hatin belav kirin.Piştî derxistina fagê, paqijkirin û rakirina endotoxinê (wekî ku li jor hatî destnîşan kirin), 2 × 1010 fage/heywan di 300 μl de bi hundurê venozê ve li yek dûvikê hate derzî kirin.
Preprocessing û fîlterkirina kalîteyî ya daneyên rêzê.Daneyên Raw 454/Roche bi karanîna nermalava firoşkarê ji formatek nexşeya tîrêjê ya standard a binary (sff) veguheztin formatek pearson ku mirov dikare bixwîne (fasta).Pêvajoya din a rêzika nukleotidê bi karanîna bername û nivîsarên xwedan C-yê (pakêta nermalavê ya neçapkirî) wekî ku li jêr hatî destnîşan kirin hate kirin.Analîzkirina daneyên bingehîn pêvajoyên fîlterkirina pir-qonaxa hişk vedihewîne.Ji bo fîlterkirina xwendinên ku rêzek DNA ya derbasdar a 12merî tê de tune ne, xwendin bi rêzê ve hatin rêz kirin ji bo destpêkirina etîketê (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), nîşana rawestanê (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) û têketina paşîn (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT) bi karanîna gerdûnî-ceribandinêlihevkirin ku di her hevrêziyê de heya 2 nakokiyan rê dide31.Ji ber vê yekê, xwendinên bê destpêk û etîketên rawestanê û xwendinên ku têlên paşnavê vedihewînin, ango, rêzikên ku ji hejmara destûrkirî ya nelihevkirinê zêdetir in, ji pirtûkxaneyê hatin rakirin.Wekî ku ji bo xwendinên mayî, rêzika DNA ya N-mer ku ji nîşana destpêkê dirêj dibe û berî nîşana rawestanê diqede, ji rêzika xwendinê ya orîjînal hate derxistin û bêtir hate pêvajo kirin (li vir şûnde wekî "navdêr" tê binav kirin).Piştî wergerandina têkelê, beşa piştî kodona rawestanê ya yekem a li dawiya 5 'ya primerê ji têxê tê derxistin.Wekî din, nukleotîdên ku di dawiya 3'ya primerê de ber bi kodonên netemam ve diçin jî hatin rakirin.Ji bo nehêlana têlên ku tenê rêzikên paşxanê vedihewînin, têlên wergerandî yên ku bi nimûneya asîda amînî "PAG" dest pê dikin jî hatin rakirin.Peptîdên ku dirêjahiya wan a piştî wergerandinê ji 3 asîdên amînî kêmtir e ji pirtûkxaneyê hatin rakirin.Di dawiyê de, di hewza têxê de zêdebûnê derxînin û frekansa her insertek bêhempa diyar bikin.Encamên vê analîzê navnîşek rêzikên nukleotîd (navdêr) û frekansên wan (xwendin) hene (Wêneyên Pêvek 1c û 2).
Komên DNA yên N-mer ji hêla wekheviya rêzikê ve tê xêzkirin: Ji bo ji holê rakirina xeletiyên rêzgirtinê yên taybetî yên 454/Roche (wek pirsgirêkên bi rêzkirina dirêjkirina homopolîmeran) û rakirina zêdegaviyên kêmtir girîng, têketinên rêza DNA yên N-mer ên berê hatine fîltrekirin (navdêr) li gorî wekheviyê têne rêz kirin.têxistin (heta 2 bingehên nelihev têne destûr kirin) bi karanîna algorîtmayek dubarekirî ya ku bi vî rengî hatî destnîşan kirin: têxistin pêşî li gorî frekansa xwe (bilindtirîn berbi nizm), û heke heman bin, li gorî dirêjahiya wan (ji herî dirêj berbi kurttirîn) ve têne rêz kirin.Ji ber vê yekê, têketina herî pir û dirêj "koma" yekem diyar dike.Frekansa komê li ser frekansa sereke tê danîn.Dûv re, her têketina ku di navnîşa birêkûpêk de maye, hate ceribandin ku ji hêla hevrêziya Needleman-Wunsch ve li komê were zêdekirin.Ger hejmara nelihevkirin, têxistin, an jêbirinên di hevkêşiyekê de ji tixûbek 2 derbas neke, lêvekirinek li komê tê zêdekirin, û frekansa giştî ya komê bi çend caran tê zêdekirin zêde dibe.Têkiliyên ku li komekê têne zêdekirin wekî ku têne bikar anîn têne nîşankirin û ji pêvajoyek din têne derxistin.Ger rêzika têxê li komeke berê ya heyî neyê zêdekirin, rêzika têxê ji bo afirandina komek nû bi frekansa têketina guncaw tê bikar anîn û wekî ku hatî bikar anîn nîşankirin.Dema ku her rêzika têketinê ji bo avakirina komek nû were bikar anîn an jî dikare di komekek berê de were bicîh kirin, dubarekirin bi dawî dibe.Beriya her tiştî, têlên komkirî yên ku ji nukleotîdan pêk tên di dawiyê de li rêzikên peptîdê (pirtûkxaneyên peptîdê) têne wergerandin.Encama vê vekolînê komek têkel û frekansên wan ên têkildar e ku hejmara xwendinên li pey hev pêk tîne (Hêjmara Pêvek. 2).
Nifşa Motîf: Li ser bingeha navnîşek peptîdên bêhempa, pirtûkxaneyek ku tê de hemî nimûneyên asîda amînî yên mumkun (aa) yên ku li jêr têne xuyang kirin, hate afirandin.Her şêweyek gengaz a dirêjahiya 3 ji peptîdê hate derxistin û şêwaza wê ya berevajî ligel pirtûkxaneyek motîfek hevpar a ku hemî şêweyên (trîpeptîd) vedihewîne, hate zêdekirin.Pirtûkxaneyên motîfên pir dubarekirî hatin rêzkirin û zêdebûn hatin rakirin.Dûv re, ji bo her trîpeptîdek di pirtûkxaneya motîfê de, me hebûna wê ya di pirtûkxaneyê de bi karanîna amûrên hesabkirinê kontrol kir.Di vê rewşê de, frekansa peptîdê ku tê de motîfa sêpeptîda hatî dîtin tê zêdekirin û li motîfa di pirtûkxaneya motîfê de ("hejmara motîfan") tê destnîşankirin.Encama hilberîna motîfê rêzek du-alî ye ku hemî bûyerên tripeptîd (motîf) û nirxên wan ên têkildar vedihewîne, ku ev hejmar hejmarên xwendinên rêzkirî ne ku dema ku xwendin têne fîltrekirin, komkirin û wergerandin motîfa têkildar peyda dike.Metrîkên ku li jor bi berfirehî hatine destnîşan kirin.
Normalîzekirina hejmara motîfan û belavokên têkildar: Hejmara motîfan ji bo her nimûneyê bi karanîna normalîze kirin.
ku ni hejmara xwendinên ku mijar i ye.Bi vî rengî, vi rêjeya rêjeya xwendinê (an peptîdên) ku motîfa i-yê di nimûneyê de vedihewîne destnîşan dike.P-nirxên ji bo hejmara ne-normalîzekirî ya motîfan bi karanîna testa rastîn a Fisher ve têne hesibandin.Di derbarê korelogramên hejmara motîfan de, têkiliyên Spearman bi karanîna hejmara normalkirî ya motîfan bi R re hatin hesibandin.
Ji bo dîtina naveroka asîdên amînî li her cîhek di pirtûkxaneya peptîdê de, logogramên malperê 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) hatin afirandin.Pêşîn, naveroka asîdên amînî li her cîhek peptîdê 12-mer di matrixek 20×12 de tê hilanîn.Dûv re, komek ji 1000 peptîdên ku di her pozîsyonê de heman naveroka asîda amînî ya têkildar dihewîne di forma rêza bilez de têne çêkirin û wekî têketinê ji web-logo 3 re tê peyda kirin, ku li her pozîsyonê nûneriyek grafîkî ya naveroka asîda amînî ya têkildar diafirîne.ji bo pirtûkxaneyek peptîdê ya diyarkirî.Ji bo xuyangkirina danûstendinên piralî, nexşeyên germahiyê bi karanîna amûrek navxweyî ya pêşkeftî ya R-yê (biosHeatmap, pakêtek R-ya ku hîna-ne-çapkirî) hatine afirandin.Dendrogramên ku di nexşeyên germahiyê de têne pêşkêş kirin bi karanîna rêbaza komkirina hîyerarşîk a Ward bi metrika dûrbûna Euclidean ve hatine hesibandin.Ji bo analîzkirina îstatîstîkî ya daneyên xalîkirina motîfê, nirxên P yên ji bo pîvana nenormal bi karanîna testa rastîn a Fisher têne hesibandin.P-nirxên ji bo daneyên din di R-ê de bi karanîna T-test an ANOVA-ê ya Xwendekarê têne hesibandin.
Klonên fagê yên bijartî û fagên bê navber bi hundurê venozê bi riya dûvikê (2×1010 fage/heywan di 300 μl PBS de) hatin derzî kirin.Deh hûrdeman berî perfusion û dûv re rastkirin, heman heywanan bi hundurê 100 μl lektînek bi etîketa DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) hatin derz kirin.60 hûrdem piştî derzîlêdana fagê, mişk bi 50 ml PBS ve di nav dil de hatin rijandin û piştre 50 ml 4% PFA/PBS.Nimûneyên mejî di şevekê de di 4% PFA/PBS de hatin qewirandin û bi şev di 4°C de di 30% sukrozê de hatin şilkirin.Nimûne di tevliheviya OCT de bi lez têne cemidandin.Analîzên immunohistokîmyayî yên nimûneyên cemidî li germahiya odeyê li ser 30 μm kryosectionên ku bi 1% BSA ve hatine asteng kirin û bi antîbozên FITC-labelkirî yên poliklonal ên li dijî fagê T7 (Novus NB 600-376A) di 4 °C de hatine inkubasyon kirin.Di şevekê de inkub bikin.Di dawiyê de, beş 3 caran bi PBS hatin şuştin û bi mîkroskopa lazer a konfokal (Leica TCS SP5) hatin lêkolîn kirin.
Hemî peptîdên xwedan paqijiya herî kêm 98% ji hêla GenScript USA ve hatine sentez kirin, biotinylated û lyophilized.Biotin bi navbeynkarek glycînek sêqalî ya zêde li N-terminus ve tê girêdan.Hemî peptîd bi karanîna spektrometriya girseyî kontrol bikin.
Streptavidîn (Sigma S0677) bi 5-qatî zêdehiyek equimolar a peptîdê biotinylated, peptîdê astengker BACE1 biotinylated, an bi hevgirtinek (rêjeya 3:1) ya peptîdê astengker BACE1 biotinylated û BACE1 peptîdê înhibitor DM5/BSSO-10% biotinylated hat tevlihev kirin.Berî derzîlêdanê 1 saet li germahiya odeyê.Peptîdên bi streptavîdîn-conjugated bi dozek 10 mg/kg intravenoz di nav yek ji dûvikên mişkên bi valahiya mêjî de hatin derzî kirin.
Giraniya kompleksên streptavidin-peptide ji hêla ELISA ve hate nirxandin.Plateyên mîkrotîterê yên Nunc Maxisorp (Sigma) bi şev li 4°C bi 1,5 μg/ml antî-streptavîdîn a mişkî hatin pêçan (Thermo, MA1-20011).Piştî astengkirinê (tampon astengkirin: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatîn, 1% BSA) 2 saetan li germahiya odeyê, plakaya bi 0,05% Tween-20/PBS (tampon şuştinê) ji bo 3 Duyemîn şuştin, 1 nimûneyên CSF bi bloka 1 blokê ve hatin zêdekirin û 0,000, CSF 1:115).Dûv re plakaya bi şev li 4 ° C bi antîpîdê tespîtkirinê (1 μg / ml, antî-streptavîdîn-HRP, Novus NB120-7239) hate înkubakirin.Piştî sê gavên şuştinê, streptavidîn bi inkubasyonê di nav çareseriya substrate TMB (Roche) de heya 20 hûrdeman hate tespît kirin.Piştî ku pêşveçûna rengan bi 1M H2SO4 rawestîne, vegirtinê li 450 nm bipîve.
Fonksiyona kompleksa streptavidin-peptide-BACE1 ji hêla Aβ(1-40) ELISA ve li gorî protokola çêker (Wako, 294-64701) hate nirxandin.Bi kurtasî, nimûneyên CSF di navberek standard (1:23) de hatin rijandin û di şevekê de li 4°C di lewheyên 96-kaniyê yên ku bi antîpodê girtina BNT77 ve hatî pêçandî hatin inkubasyon.Piştî pênc gavên şuştinê, antîpota BA27-a HRP-a hevgirtî hate zêdekirin û 2 demjimêran li 4 ° C., paşê pênc gavên şuştinê.Aβ (1-40) bi inkubasyonê di çareseriya TMB de 30 hûrdem li germahiya odeyê hate tespît kirin.Piştî ku pêşkeftina rengan bi çareseriya rawestanê hate sekinandin, vegirtinê di 450 nm de bipîve.Nimûneyên plazmayê beriya Aβ(1-40) ELISA bi derxistina qonaxa zexm hatin kirin.Plazmayê li 0,2% DEA (Sigma) di lewheyên 96-kaniyê de hat zêdekirin û 30 hûrdeman li germahiya odeyê hate înkubakirin.Piştî şuştina li pey hev lewheyên SPE (Oasis, 186000679) bi av û 100% metanol, nimûneyên plazmayê li lewheyên SPE hatin zêdekirin û hemî şilek hatin rakirin.Nimûne hatin şûştin (pêşî bi 5% metanol paşê 30% metanol) û bi 2% NH4OH/90% metanol hatin şuştin.Piştî zuwakirina eluate di 55 ° C de ji bo 99 hûrdeman di heyama N2 ya domdar de, nimûne di navberên standard de kêm bûn û Aβ(1-40) wekî ku li jor hatî destnîşan kirin hate pîvandin.
Meriv çawa vê gotarê vedibêje: Urich, E. et al.Radestkirina kargo ji mêjî re bi karanîna peptîdên transît ên ku di vivo de têne nas kirin.zanist.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB û Moos T. Radestkirina dermanên macromolecular ji mêjî re bi karanîna terapiya armanckirî.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Radestkirina dermanên peptîd û proteîn li seranserê astengiya xwînê-mêjî.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Astengiya xwînê-mêjî: di pêşkeftina dermanê mêjî de astengiyek.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, û Byrd, A. Perspektîfên ji bo radestkirina dermanê çêtir û armanckirina mêjî bi riya riya choroid plexus-CSF.Lêkolîna Pharmaceutical 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Nûjenkirina biyodermanan bi hespên Trojan ên molekulî ji bo radestkirina mêjî.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, peptîdê ku bi navbeynkariya receptorê WM-ê veguhezîne li ser astengiya xwîn-mêjî.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Bi karanîna gerokên molekulî yên yekvalent, ketina mêjî û bandoriya antîpên dermankirinê zêde bikin.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Veguheztina receptorê Transferrîn (TfR) girtina mêjî ya guhertoyên hevahengiya antîkorên TfR diyar dike.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).