Spas ji bo serdana Nature.com. Hûn guhertoyek gerokê bi piştgiriya CSS-ê ya sînorkirî bikar tînin. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Wekî din, ji bo misogerkirina piştgiriya domdar, em malperê bê şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Karûselek ji sê slaytan di carekê de nîşan dide. Bişkokên Berê û Paşê bikar bînin da ku hûn di carekê de di nav sê slaytan de bigerin, an jî bişkokên slaytê yên li dawiyê bikar bînin da ku hûn di carekê de di nav sê slaytan de bigerin.
Organelên neuralî yên xwe-komkirî platformek sozdar a in vitro ji bo modelkirina pêşkeftina mirovan û nexweşiyan temsîl dikin. Lêbelê, organoîd ji girêdana ku di vivo de heye bêpar in, ku gihîştinê sînordar dike û pêşî li entegrasyonê bi devreyên din ên ku tevgerê kontrol dikin digire. Li vir em nîşan didin ku organoîdên kortîkal ên ji hucreyên reh ên mirovan hatine wergirtin ku di korteksa somatosensor a mişkên tazî yên nûbûyî de hatine veguheztin celebên hucreyên gihîştî pêş dixin ku di nav devreyên hestî û motîvasyonê de entegre dibin. MRI mezinbûna organoîd a piştî veguheztinê di çend rêzikên hucreyên reh û heywanan de eşkere kir, di heman demê de analîza yek-navokî pêşveçûna kortîkogenezê û derketina holê ya bernameyek veguheztinê ya girêdayî çalakiyê eşkere kir. Bi rastî, neuronên kortîkal ên veguheztî taybetmendiyên morfolojîk, sînaptîk û membrana hundurîn ên tevlihevtir ji hevpîşeyên xwe yên in vitro nîşan didin, ku dihêle kêmasiyên neuronal di nexweşên bi sendroma Timothy de werin tespît kirin. Şopandina anatomîk û fonksiyonel nîşan daye ku organelên veguheztî têketinên talamokortîkal û kortîkortîkal distînin, û tomarên in vivo yên çalakiya neural pêşniyar dikin ku ev têketin dikarin bersivên hestî di hucreyên mirovan de çêbikin. Di dawiyê de, organoîdên kortîkal aksonan li seranserê mejiyê mişk dirêj dikin, û çalakkirina wan a optogenetîk dibe sedema tevgera lêgerîna xelatê. Bi vî awayî, neuronên korteksa mirovan ên veguheztî gihîştine û di nav devreyên mêvandar de beşdar dibin ku tevgerê kontrol dikin. Em hêvî dikin ku ev rêbaz tespîtkirina fenotipên asta zincîrê di hucreyên ji nexweşan hatine wergirtin de ku bi rêbazên din nayên tespîtkirin hêsan bike.
Mejiyê mirov ê di pêşketinê de pêvajoyek xwerêxistinkirinê ya berbiçav e ku tê de hucre zêde dibin, ji hev cuda dibin, koç dikin û bi hev ve girêdidin da ku devreyên neuronal ên fonksiyonel çêbikin ku bi rêya ezmûna hestî bêtir têne safîkirin. Pirsgirêkek sereke di têgihîştina pêşkeftina mejiyê mirov de, nemaze di çarçoveya nexweşiyê de, nebûna gihîştina tevna mejî ye. Organelên xwerêxistin, di nav de organoîdên korteksa mirov (hCO; ku wekî sfera korteksa mirov jî tê zanîn), dikarin 2,3,4,5,6 hilberînin. Lêbelê, çend sînorkirin sepandina wan a berfirehtir ji bo têgihîştina pêşkeftin û fonksiyona devreyên neural sînordar dikin. Bi taybetî, ne diyar e ka gihîştina hCO ji ber nebûna hin têketinên mîkrojîngehê û hestî yên di vivo de hene sînordar e. Wekî din, ji ber ku hCO di nav devreyên ku dikarin encamên tevgerî çêbikin de nehatine entegre kirin, kêrhatîbûna wan di modelkirina nexweşiyên neuropsîkiyatrîk ên genetîkî yên tevlihev û tevgerî de niha sînordar e.
Veguhestina hCO bo mejiyek zindî ya saxlem dikare van sînordarkirinan derbas bike. Lêkolînên berê nîşan dane ku neuronên mirovan ên ku têne veguheztin nav korteksa rodentan dikarin bijîn, proje bikin û bi şaneyên rodentan re têkilî daynin7,8,9,10,11,12. Lêbelê, ev ceribandin bi gelemperî li ser heywanên mezin têne kirin, ku dibe ku entegrasyona sînaptîk û aksonal sînordar bike. Li vir, em paradîgmayek veguheztinê vedibêjin ku tê de me hCO ya 3D ya ji şaneyên hiPS hatî wergirtin veguheztiye korteksa somatosensor a seretayî (S1) ya mişkên kêmasiya parastinê di qonaxek zû ya pêşkeftina plastîk de. Neuronên hCO (t-hCO) yên veguheztî gihîştinek girîng derbas dikin, têketinên talamokortîkal û kortîkal-kortîkal werdigirin ku bersivên hestyarî derdixin holê, û projeksiyonên aksonal dirêj dikin nav mejiyê mişk da ku tevgera lêgerîna xelatê ajotin. Gihiştina dirêjkirî ya t-hCO kêmasiyên neuronal di nexweşên bi sendroma Timothy (TS) de eşkere kiriye, nexweşiyek genetîkî ya giran ku ji ber mutasyonên di kanala kalsiyûmê ya celebê L CaV1.2 ya hesas a voltaja (ji hêla CACNA1C ve hatî kodkirin) de çêdibe.
Ji bo lêkolîna neuronên kortîkal ên mirovan di nav devreyan de in vivo, me bi awayekî stereotaktîk hCO3D ya saxlem veguhezt nav S1 ya mişkên atimîk ên piştî zayînê yên zû (rojên 3-7 piştî zayînê) (Wêne 1a û daneyên berfireh ên Wêne 1a-c). Di vê nuqteyê de, projeksiyonên aksonal ên talamokortîkal û kortîkokortîkal hîn neştergeriya xwe ya S1 temam nekirine (ref. 13). Bi vî rengî, ev rêbaz ji bo zêdekirina entegrasyona t-hCO hatiye sêwirandin dema ku bandora li ser devreyên endojîn kêm dike. Ji bo dîtina cihê t-hCO di heywanên zindî de, me ji nû ve avakirina mêjiyê mişkên bi giraniya T2 pêk anî (Wêne 1b û daneyên berfireh, Wêne 1d). t-hCO bi hêsanî hatin çavdêrîkirin û pîvandinên qebareya t-hCO3 dişibin yên ku ji perçeyên sabît hatine hesabkirin (Daneyên Berfireh Wêne 1d,e; P > 0.05). t-hCO bi hêsanî hatin çavdêrîkirin û pîvandinên qebareya t-hCO3 dişibin yên ku ji perçeyên sabît hatine hesabkirin (Daneyên Berfireh Wêne 1d,e; P > 0.05). t-hCO legko nablyudalisь, a объемные измерения t-hCO bыly analogicnы resschitannыm dlya fixirovannыh reszov (расширенные данные, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 bi ​​hêsanî hatin çavdêrîkirin, û pîvandinên qebareyî yên t-hCO3 dişibin yên ku ji bo beşên sabît hatine hesabkirin (daneyên berfireh, Şekil 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05＼很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO legko nablyudalsya, a объемные измерения t-hCO bыly analogicnы resschitannыm dlya fixirovannыh reszov (расширенные данные, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO bi hêsanî hate çavdêrîkirin, û pîvandinên qebareyî yên t-hCO3 dişibin yên ku ji bo beşên sabît hatine hesabkirin (daneyên berfireh, Şekil 1d, e; P > 0.05).Me t-hCO2 di %81ê heywanên veguheztî de bi qasî 2 meh piştî veguheztinê destnîşan kir (n = 72 heywan; hCO2 ji 10 xetên şaneyên hiPS; xetên şaneyên hiPS di Tabloya Pêvek 1 de). Ji van, %87 di korteksa mejî de cih girtin (Wêne 1c). Bi pêkanîna skanên MRI yên rêzefîlm di gelek xalên demê de di heman mişkê veguheztî de, me di nav 3 mehan de zêdebûnek neh qat di qebareya t-hCO2 de dît (Wêne 1d û daneyên berfireh, Wêne 1f). Heywanên veguheztî rêjeyek bilind a saxmayînê (%74) di 12 mehan piştî veguheztinê de hebûn (daneyên berfireh, Wêne 1g û Tabloya Pêvek 2), û tu kêmasiyên motor an bîranînê yên eşkere, glioz, an elektroensefalografya (EEG) nehatin dîtin. Daneyên Wêne 1g û tabloya pêvek 2). 1h–m û 3e).
a, Nexşeya sêwirana ceribandinê. hCO ya ji hucreyên hiPS hatî wergirtin di rojên 30-60 ên cûdabûnê de li S1 ya mişkên tazî yên nûbûyî hat veguheztin. b, Wêneyên MRI yên koronal û horizontal ên giraniya T2 ku t-hCO di S1 ​​de 2 meh piştî veguheztinê nîşan didin. Pîvana xêzikê, 2 mm. c, Pîvana rêjeyên serkeftina veguheztinê ji bo her xeta hucreya hiPS (n = 108, hejmarên di nav xêzikan de mîqdara t-hCO li ser xeta hucreya hIPS nîşan didin) û cîhê kortîkal an jî binkortîkal (n = 88) tê nîşandan. d, Wêneya MRI ya damareke koronar (çep; pîvana xêzikê, 3 mm) û ji nû ve avakirina volûmetrîk a 3D ya têkildar (pîvana xêzikê, 3 mm) ku zêdebûna t-hCO di nav 3 mehan de nîşan dide. e, Nirxandina qalibên t-hCO di korteksa mejî ya mişk de. Pîvana xêzikê, 1 mm. f, Wêneyên îmmunosîtokîmyayî yên temsîlkar ên t-hCO ji çepê jor ber bi rastê ve têne nîşandan (di dema cûdakirinê de): PPP1R17 (4 mehî), NeuN (8 mehî), SOX9 û GFAP (8 mehî), PDGFRα; (8 mehî), MAP2 (8 mehî) û IBA1 (8 mehî). Şêweya pîvanê, 20 µm. Hev-îfadekirina HNA hucreyên bi eslê xwe mirov nîşan dide. g, snRNA-seq: Wênekirina kêmkirina pîvanê ya piralî û projeksiyona yekgirtî (UMAP) ya hemî navokên t-hCO yên bi kalîte bilind piştî entegrasyona Seurat (n=3 nimûneyên t-hCO, n=2 xetên hucreyên hiPS). Astrosît, hucreyên xeta astrosîtê; cyc prog, pêşiyên gerok; GluN DL, neuronên glutamaterjîk ên kûr; GluN DL/SP, neuronên glutamaterjîk ên kûr û sublamellar; GluN UL, neuronên glutamaterjîk ên qata jorîn; olîgodendrosît, olîgodendrosît; OPC, hucreyên pêşiyên olîgodendrosîtê; RELN, neyronên reelin. h, analîza dewlemendkirina termê ya Ontolojiya Genê (GO) ya genan bi girîngî zêde bûye (P ya sererastkirî < 0.05, guherîna qatê > 2, di herî kêm 10% ji navikan de tê îfade kirin) di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO. h, analîza dewlemendkirina termê ya Ontolojiya Genê (GO) ya genan bi girîngî zêde bûye (P ya sererastkirî < 0.05, guherîna qatê > 2, di herî kêm 10% ji navikan de tê îfade kirin) di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO. h, Analiz obogaщения termov Gene Ontology (GO) ji bo genov bi girîngî aktîvasyon (skorrektirovannыy P <0,05, krasniy almeneniya > 2, эkspressiya po grayney mere in 10% not jarogi) hCO. h, Analîza dewlemendkirina termê ya Ontolojiya Genê (GO) ji bo genên bi aktîvasyona girîng (P<0.05 a sererastkirî, guherîna qatkirinê >2, îfade di herî kêm 10% navik de) di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（莃敕0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上调 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h. Онтологический (GO) analiz terma обогащения. h, gen di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO bi girîngî zêde bûn (P < 0.05 a sererastkirî, guherîna qatkirinê > 2, di herî kêm 10% ji navikan de tê îfade kirin). Analîza ontolojîk (GO) ya terma dewlemendkirinê.Xeta xalxalî nirxa aq ya 0.05 nîşan dide. i, wênekirina UMAP ya celebên hucreyên GluN di t-hCO de bi karanîna veguhastina nîşanê ji komek daneyên korteksa motorê ya mezinan a referansê 22 snRNA-seq. CT - hucreyên kortîkotalamîk, ET - hucreyên derveyî mejî, IT - hucreyên telencefalîk ên hundurîn, NP - projeksiyona nêzîk.
Piştre me sîtomîmarîte û pêkhateya giştî ya hucreyî ya t-hCO nirxand. Boyaxkirina antîbodî ya hucreyên endotelê yên mişkan vaskularîzasyon bi t-hCO nîşan da, di heman demê de boyaxkirina IBA1 hebûna mîkrogliya mişkan li seranserê graftê nîşan da (Wêne 1f û daneyên berfireh, Wêne 3c, d). Boyaxkirina îmmuno-proteîn hucreyên antîjena navokî ya mirovan (HNA) yên erênî nîşan da ku PPP1R17 (pêşiyên kortîkal), NeuN (neuron), SOX9 û GFAP (hucreyên ji gliyayê hatine wergirtin) an PDGFRα (pêşiyên olîgodendrosîtan) bi hev re îfade dikin (Wêne 1f). Ji bo lêkolîna pêkhateya hucreyî ya t-hCO di çareseriya hucreyek yekane de, me piştî nêzîkî 8 mehan ji cûdakirinê rêzkirina RNA-ya yek-navokî (snRNA-seq) pêk anî. Parzûna girseyî û rakirina navikên mişkan 21,500 nexşeyên mononukleerî yên mirovan ên bi kalîte bilind derxist holê (Wêne 1g û daneyên berfireh, Wêne 4a, b). Şêweyên derbirîna nîşankerên celebê hucreyê yên tîpîk komên çînên sereke yên hucreyên kortîkal, di nav de neuronên glutamaterjîk ên kûr û rûberî, pêşiyên di nav xwînê de, olîgodendrosît, û rêza astrosîtan destnîşan kirin (Wêne 1g, daneyên berfireh, Wêne 4c, û Tabloya Pêvek 3). Boyaxkirina îmmuno ji bo SATB2 û CTIP2 nîşan da ku tevî hebûna bintîpên kortîkal, t-hCO stratîfîkasyonek anatomîk a zelal nîşan neda (daneyên berfireh, Wêne 3a). hCO ya snRNA-seq a hevaheng a qonaxê çînên hucreyên bi berfirehî dişibin hev hilberand, bi çend îstîsnayan, di nav de nebûna olîgodendrosîtan û hebûna neuronên GABAergîk, ku dibe ku şert û mercên in vitro yên guncan ên berê ji bo hucreyên pêşiyên lateral nîşan bidin15 (daneyên berfireh, Wêne 4f-i û Tabloya Pêvek 4). Analîza cudahiya derbirîna genan cudahîyên girîng di navbera neuronên glutamaterjîk û hCO de eşkere kir (Tabloya Pêvek 5), di nav de aktîvkirina setên genên ku bi gihîştina neuronal ve girêdayî ne wekî sînyalkirina sînaptîk, cihgirtina dendrîtîk, û çalakiya kanala voltaja-dergehkirî (Wêne 1h û Tabloya Pêvek 5). tablo 6). Li gorî vê, neuronên t-hCO yên glutamaterjîk ên kortîkal gihîştina transkrîpsiyonê ya bilez nîşan dan.
Ji bo zelalkirina ka ev guhertinên transkrîpsiyonê di t-hCO de bi cûdahiyên morfolojîk ên di navbera hCO in vitro û t-hCO in vivo de ve girêdayî ne, me piştî 7-8 mehan ji cûdakirinê hCO û hCO yên bi biosîtîn tijîkirî yên li gorî qonaxên hevberkirî di beşên akût de ji nû ve ava kirin. neuronên hCO (Wêne 2a). neuronên t-hCO bi girîngî mezintir bûn, 1,5 carî dirêjahiya soma, du caran zêdetir dendrît, û bi tevahî şeş qat zêdebûnek di dirêjahiya dendrîtîk a giştî de li gorî hCO in vitro hebûn (Wêne 2b). Wekî din, me dendika stûnên dendrîtîk di neuronên t-hCO de ji neuronên hCO pir zêdetir dît (Wêne 2c). Ev yek nîşan dide ku neuronên t-hCO dirêjkirin û şaxkirina dendrîtîk a berfireh derbas dikin, ku, bi hev re bi zêdebûna domdar a hucreyan re, dibe ku piştî veguheztinê beşdarî mezinbûna dijwar a t-hCO bibe (Wêne 1d û Daneyên Berfireh Wêne 1f). Vê yekê me han da ku em taybetmendiyên elektrofîzyolojîk lêkolîn bikin. Kapasîteya parzûnê heşt caran zêdetir bû (daneyên berfireh, Şekil 8d), potansiyela parzûnê ya rewşa bêhnvedanê bêtir hîperpolarîze bû (bi qasî 20 mV), û derzîkirina herikê rêjeyek herî zêde ya teşwîqkirinê di neuronên t-hCO3 de ji neuronên hCO3 bilindtir çêkir. in vitro (Şekil 2d), e), ku bi taybetmendiyên morfolojîk ên mezintir û tevlihevtir ên t-hCO3 re lihevhatî ye. Wekî din, pirbûna bûyerên herikê yên teşwîqker ên xweber (EPSC) di neuronên t-hCO3 de bi girîngî zêdetir bû (Şekil 2f), ku ev yek nîşan dide ku zêdebûna dendika stûnên dendrîtîk ên ku di neuronên t-hCO3 de têne dîtin bi teşwîqkirina fonksiyonel ve girêdayî ye. sînapsa cinsî. Me karakterê negihîştî yê neuronên hCO3 di vitro de bi tomar kirina neuronên glutamaterjîk ên nîşankirî piştrast kir (daneyên berfireh, Şekil 6a-c).
a, ji nû ve avakirina 3D ya neuronên hCO û t-hCO yên bi bîosîtîn dagirtî piştî 8 mehan ji cûdabûnê. b, Pîvana taybetmendiyên morfolojîk (n = 8 neuronên hCO, n = 6 neuronên t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 û ***P < 0.0001). b, Pîvana taybetmendiyên morfolojîk (n = 8 neuronên hCO, n = 6 neuronên t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 û ***P < 0.0001). б, colyчественная оценка морфологических оценка (n = 8 neyronov hCO, n = 6 neyronov t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, hejmartina taybetmendiyên morfolojîk (n=8 neuronên hCO, n=6 neuronên t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, û ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P =0 0.0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P =0 0.0001）. б, colyчественная оценка морфологических оценка (n = 8 neyronov hCO, n = 6 neyronov t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, hejmartina taybetmendiyên morfolojîk (n=8 neuronên hCO, n=6 neuronên t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, û ***P<0.0001).c, ji nû ve avakirina 3D ya şaxên dendrîtîk ên hCO û t-hCO piştî 8 mehan ji cudabûnê. Stêrkeyên sor stûnên dendrîtîk ên gumanbar nîşan didin. Pîvana densitiya stûna dendrîtîk (n = 8 neuronên hCO, n = 6 neuronên t-hCO; **P = 0.0092). d, Pîvandina potansiyela membrana bêhnvedanê (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; ***P < 0.0001). d, Pîvandina potansiyela membrana bêhnvedanê (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; ***P < 0.0001). d, n = 25 neyronov hCO, n = 16 neyronov t-hCO; *** P <0,0001). d, pîvandina potansiyela membrana bêhnvedanê (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, n = 25 neyronov hCO, n = 16 neyronov t-hCO; *** P <0,0001). d, pîvandina potansiyela membrana bêhnvedanê (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Pêlkirina potansiyela çalakiyê ya dubarekirî di hCO3 û t-hCO3 de ku ji hêla zêdekirina derzîkirina herikê ve tê çêkirin, û hejmartina rêjeya pêlkirina herî zêde (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Pêlkirina potansiyela çalakiyê ya dubarekirî di hCO3 û t-hCO3 de ku ji hêla zêdekirina derzîkirina herikê ve tê çêkirin, û hejmartina rêjeya pêlkirina herî zêde (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; ***P < 0.0001). e, dîsan vegerandin ji bo hCO û t-hCO, hCO û t-hCO zêde dibe, ev yek zêde dibe, û nirxa herî zêde ya nêzîkbûnê (n = 25 neyronov hCO, n = 16 neyronov hCO, n = 16 neyronov 0;0, t-hCO). e, ji nû ve geşbûna potansiyela çalakiyê di hCO3 û t-hCO3 de ku ji ber zêdebûna herikê û hejmartina rêjeya geşbûna herî zêde çêdibe (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大攚电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）. e, 25 neyronov hCO û t-hCO, n = 25 neyronov hCO, n = 1, n = 1 <0,0001). e, teqandina dubare ya potansiyelên çalakiyê yên hCO3 û t-hCO3 ku ji ber zêdebûna dabînkirina herikê û hejmartina rêjeya teqandina herî zêde çêdibe (n = 25 neuronên hCO3, n = 16 neuronên t-hCO3; *** P < 0.0001). f, EPSC-yên xweber (sEPSC) di neuronên hCO û t-hCO de di 8 mehan ji cûdabûnê de, û hejmartina pirbûna bûyerên sînaptîk (n = 25 neuronên hCO, n = 17 neuronên t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSC-yên xweber (sEPSC) di neuronên hCO û t-hCO de di 8 mehan ji cûdabûnê de, û hejmartina pirbûna bûyerên sînaptîk (n = 25 neuronên hCO, n = 17 neuronên t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSC (sEPSC) li neyronên hCO û t-hCO ji ber 8 meselên cudahiyên cuda û berhevoka nirxê hevsengiya hevgirtî (n = 25 nûjenên hCO, n = 17 hCO, n = 17 hCO;0 t;) nû. f, EPSC-yên xweber (sEPSC) di neuronên hCO û t-hCO de di 8 mehan de ji cûdakirin û hejmartina rêjeyên bûyerên sînaptîk (n=25 neuronên hCO, n=17 neuronên t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率猖性EPSCs神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率缄鼕CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001）. f, EPSC (sEPSC) di neyronên hCO û t-hCO de ji ber 8 cudahiyên cudahiyê û berhevoka nirxê hevsengiya hevpar (n = 25 neyronên hCO, n = 17 nehCO;0 t***). f, EPSC-yên xweber (sEPSC) di neuronên hCO û t-hCO de di 8 mehan de ji cûdakirin û hejmartina rêjeyên bûyerên sînaptîk (n = 25 neuronên hCO, n = 17 neuronên t-hCO; *** P<0.0001).Ji bo bf, hCO3 û t-hCO3 di rêza 1208-2 de ji heman koma cûdakirinê ya ku bi paralel hatî domandin hatin girtin. g, Analîza dewlemendkirina seta genan (ceribandina rastîn a Fisher a yekalî) ya genên ku bi girîngî zêde bûne (P < 0.05 a sererastkirî, guherîna qatkirinê > 2, di herî kêm 10% ji navikan de tê îfade kirin) di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO bi setên genên hem genên çalakiya bersiva zû (ERG) û hem jî yên bersiva dereng (LRG) ku ji lêkolînek mişk a in vivo hatine nas kirin16 û LRG-yên taybetî yên mirovan ji neuronên in vitro17. g, Analîza dewlemendkirina seta genan (ceribandina rastîn a Fisher a yekalî) ya genên ku bi girîngî zêde bûne (P < 0.05 a sererastkirî, guherîna qatkirinê > 2, di herî kêm 10% ji navikan de tê îfade kirin) di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO bi setên genên hem genên çalakiya bersiva zû (ERG) û hem jî yên bersiva dereng (LRG) ku ji lêkolînek mişk a in vivo hatine nas kirin16 û LRG-yên taybetî yên mirovan ji neuronên in vitro17. g, analîzkirina berevajîkirina encamên genov (odnostornniй точный критерий Фишера) genetîkên bi girîng ên aktîvasyon (skorrektirovannый P <0,05, kêmbûna guhertin > 2, kêmbûna kêmbûna kêmbûna şekirê% 2) neyronah t-hCO bi sravneniyu bi glutamatergicheskimi neyronami hCO li ser genovên wek rannego (ERG), tak û pozdnego (LRG) genov, parastina ji çalakiyên, ûdentificirovannыh di исследовании на мышах in vivo16, û specificheskih для человека LRG ji neyronov in vitro17. g, analîza dewlemendkirina seta genan (ceribandina rastîn a Fisher a yek-alî) ya genên bi aktîvasyona girîng (P<0.05 a sererastkirî, guherîna qatkirinê >2, îfade di herî kêm 10% ji navikan de) di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de li gorî setên neuronên glutamaterjîk ên hCO yên genên girêdayî çalakiyê yên zû (ERG) û dereng (LRG) yên ku di mişkên in vivo16 û LRG-yên taybetî yên mirovan de ji neuronên in vitro17 hatine nas kirin. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特R g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 刞萃 与<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （胞 核中 表达） 的体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, g, glutamatergic neyronы t-hCO, ji ber ku hCO-yê bi glutamatergîkên neyronamî yên hCO re çalak e (korektîrovannыy P<0,05, kêmbûna zêdebûnê> 2, kêmbûna 10% ji ber çavan точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие од ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 û neyronah in vitro17, specifichnыe для человека. g, neuronên glutamaterjîk ên t-hCO li gorî neuronên glutamaterjîk ên hCO bi girîngî zêde bûn (P <0.05 a sererastkirî, guherîna qat >2, herî kêm 10%). Analîza dewlemendkirina gena bersiva zû (ERG) û bersiva dereng (testa rastîn a Fisher a yek-alî) genên girêdayî çalakiya bersivê (LRG) ku di mişkên in vivo16 û neuronên in vitro de hatine nas kirin.17 LRG-yên taybetî yên mirovan.Xeta xalxalî nirxek P ya rastkirî ya Bonferroni ya 0.05 nîşan dide. h, îfadeya gena GluN (pakêta pseudo û pîvandina her genê) di kopiyên snRNA-seq ên genên LRG de di neuronên glutamaterjîk ên t-hCO de bi girîngî zêde bû. i, boyaxkirina îmmuno ku îfadeya SCG2 di neuronên t-hCO (jor) û hCO (jêr) de nîşan dide. Tîrên spî ber bi hucreyên SCG2+ ve nîşan didin. Şêweya pîvanê, 25 µm. Daneyên wekî navînî ± devîasyona standard têne îfade kirin.
Li ser bingeha çalakiya zêde ya t-hCO2 ku di perçeyên ex vivo de hatiye dîtin, snRNA-seq nîşan da ku transkrîptên genan di t-hCO2 de li gorî hCO2 di vitro de zêdebûnek girêdayî çalakiyê nîşan didin. Neuronên t-hCO2 yên glutamaterjîk astên bilindtir ên genên ku çalakiya bersiva dereng rêk dixin îfade kirin (Wêne 2g,h), ku di lêkolînên berê de di neuronên mişk û mirovan de hatine dîtin16,17. Mînakî, BDNF18, SCG2, û OSTN, genek rêkxistina çalakiya taybetî ya prîmatan, di neuronên t-hCO2 de li gorî neuronên hCO zêdebûna îfadeyê nîşan dan (Wêne 2g-i). Bi vî rengî, neuronên t-hCO2 taybetmendiyên gihîştinê yên zêdekirî li gorî neuronên hCO bi analîzên transkrîpsiyonî, morfolojîk û fonksiyonel nîşan dan.
Ji bo nirxandina bêtir têkiliya gihîştina t-hCO bi pêşveçûna mêjiyê mirovan re, me berawirdkirinên transkrîptomîk ên celebên hucreyên korteksê yên fetus û mezinan19,20 û mezinan21,22 û her weha daneyên berfireh li ser îfadeya gena korteksê23 di dema pêşveçûnê de pêk anîn (daneyên berfireh, Şekil 5). ). bi xebatên berê 24, rewşa gihîştina transkrîptomê ya hCO û t-hCO ya gerdûnî di 7-8 mehan ji cûdabûnê de bi berfirehî bi dema pêşkeftina in vivo re lihevhatî ye û herî zêde wekhevî jiyana fetusê ya dereng e (Daneyên Berfireh Şekil 5a). Bi taybetî, me zêdebûna gihîştina transkrîptomê di t-hCO de li gorî hCO ya bi temen re, û her weha çalakkirina transkrîptomê ya bi sînaptogenez, astrogenez û mîyelînasyonê ve girêdayî dît (daneyên berfireh, Şekil 5b-d). Di asta hucreyî de, me delîlên jêrtîpek korteksê ya ziravtir di t-hCO de dîtin, bi komên neuronên glutamaterjîk ku bi jêrtîpên neuronên L2/3, L5, û L6 yên mezinan re hevûdu digirin (Şekil 1i). Berevajî vê, hevgirtina koman di navbera neuronên t-hCO yên glutamaterjîk û neuronên korteksa fetusê de di nîvê ducaniyê de sînordartir bû (daneyên berfireh, Wêne 5e-j). Ji bo diyarkirina ka neuronên t-hCO ji hêla fonksiyonel ve dişibin neuronên neokortîkal ên piştî zayînê yên mirovan, me tomarên elektrofîzyolojîk û ji nû ve avakirina anatomîk a neuronên pîramîdal ên L2/3 yên mirovan di beşên tûj ên korteksa piştî zayînê ya mirovan de pêk anîn (daneyên berfireh, Wêne 7a). Taybetmendiyên elektrofîzyolojîk ên neuronên pîramîdal ên L2/3 dişibin yên neuronên pîramîdal ên t-hCO (daneyên berfireh, Wêne 7e). Ji hêla morfolojîk ve, neuronên L2/3 ji nimûneyên mirovan ên piştî zayînê ji t-hCO bêtir dişibin hCO, her çend hucreyên L2/3 dirêjtir bûn, bi tevahî şaxên bêtir hebûn, û dendika stûnê bilindtir hebû (Wêne 3g û daneyên berfireh, Wêne 7b-). G).
a, veguheztina hCO ya ku ji hêla xetên şaneyên kontrol û TS hiPS ve hatî hilberandin nav mişkên nûbûyî. b, ji nû ve avakirina 3D ya neuronên t-hCO yên bi bîosîtîn dagirtî piştî 8 mehan ji cûdakirinê. c, pîvandina dirêjahiya dendrîtîk a navîn (n = 19 neuronên kontrol, n = 21 neuronên TS; **P = 0.0041). d, şaxên dendrîtîk ên ji kontrol û TS t-hCO3 yên 3D-ji nû ve hatine çêkirin di 8 mehan de ji cûdakirinê, û hejmartina dendika stûna dendrîtîk (n = 16 neuronên kontrolê, n = 21 neuronên TS, ***P < 0.0001). d, şaxên dendrîtîk ên ji kontrol û TS t-hCO3 yên 3D-ji nû ve hatine çêkirin di 8 mehan de ji cûdakirinê, û hejmartina dendika stûna dendrîtîk (n = 16 neuronên kontrolê, n = 21 neuronên TS, ***P < 0.0001). d, 3D-rekonstruction of daydritnыh ветвей на контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 kontrolên neyronov, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, P***TS). d, ji nû ve avakirina 3D ya şaxên dendrîtîk ji kontrol û t-hCO TS di 8 mehan de ji cûdakirin û hejmartina dendika stûna dendrîtîk (n=16 neuronên kontrolê, n=21 neuronên TS, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 =16，个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突挘 密度 1＇6n神经 元 ， n = 21 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-rekonstruksiyona roja mêtingerî û TS t-hCO bi 8 mêzyacev cudahiyên û kolîчественnaya odên pîlotên rojê (n = 16 kontrolên neyronov, n = 20, P *** 20, ***). d, ji nû ve avakirina 3D ya şaxên dendrîtîk ên kontrolê û TS t-hCO di 8 mehan de ji cûdakirin û hejmartina dendika stûna dendrîtîk (n=16 neuronên kontrolê, n=21 neuronên TS, ***P<0.0001).Stêrkên sor stûnên dendrîtîk ên gumanbar nîşan didin. e, EPSC-yên xweber di neuronên kontrol û TS t-hCO de piştî 8 mehan ji cudabûnê. f, nexşeya frekansa berhevkirî û hejmartina frekans û amplîtuda bûyerên sînaptîk (n=32 neuronên kontrolê, n=26 neuronên TS; **P=0.0076 û P=0.8102). g, Analîza Scholl a neuronên TS û kontrolê di hCO û t-hCO de. Xetên xêzkirî neuronên pîramîdal ên piştî zayînê yên L2/3 yên mirovî ji bo berawirdkirinê nîşan didin (n = 24 neuronên kontrolê yên t-hCO, n = 21 neuronên TS t-hCO, n = 8 neuronên kontrolê yên hCO, û n = 7 neuronên TS hCO). Daneyên wekî navînî ± devîasyona standard têne îfade kirin.
Şîyana t-hCO ya dubarekirina taybetmendiyên morfolojîk û fonksiyonel ên neuronên korteksa mirovan di astek bilind de me han da ku em lêkolîn bikin ka gelo t-hCO dikare ji bo tespîtkirina fenotipên nexweşiyê were bikar anîn. Me li ser TS, nexweşiyeke giran a pêşketina neuro ku ji ber mutasyonên qezenckirina-fonksiyonê di gena kodkirina CaV1.2 de çêdibe, ku transkrîpsiyona gena girêdayî çalakiyê di neuronan de dest pê dike, sekinî. Me hCO ji sê nexweşên TS yên ku cîgirtina herî gelemperî (p.G406R) hildigirtin û sê kontrol (Wêne 3a) bi dest xist. Piştî veguheztinê, me dît ku morfolojiya dendrîtîk di neuronên TS de li gorî kontrolê (Wêne 3b û daneyên berfirehkirî, Wêne 8a,b) guherî, bi du qat zêdebûna hejmara dendrîtên seretayî û zêdebûnek giştî di navînî û kêmbûna giştî ya dirêjahiya dendrîtîk de (Wêne 3c û daneyên berfirehkirî, Wêne 8c). Ev bi zêdebûna dendika stûnan û zêdebûna frekansa EPSC-yên xweber di TS de li gorî neuronên kontrolê ve girêdayî bû (Wêne 3d-f û daneyên berfirehkirî, Wêne 8g). Analîzên din qalibên şaxbûna dendrîtîk a neasayî di t-hCO TS de li gorî komên kontrolê eşkere kirin, lê di hCO TS ya in vitro de di qonaxek wekhev a cûdabûnê de ne xuya bû (Wêne 3g). Ev yek bi raporên me yên berê yên piçûkbûna dendrîtîk a girêdayî çalakiyê di TS de lihevhatî ye û şiyana vê platforma veguheztinê ji bo tespîtkirina fenotipên nexweşiyê di vivo de ronî dike.
Piştre me pirsî ka hucreyên t-hCO heta çi radeyê bi awayekî fonksiyonel di nav S1 ya mişk de hatine entegrekirin. S1 di rovîyan de ji navokên talamîk ên bazal û paşîn ên ventral ên ipsilateral, û her weha korteksên somatosensor ên motor û duyemîn ên ipsilateral, û S1 ya kontralateral têketinên sînaptîk ên bihêz werdigire (Wêne 4a). Ji bo vegerandina şêweya înnervasyonê, me hCO bi vîrusa harbûnê-dG-GFP/AAV-G enfeksiyon kir û 3 roj şûnda hCO veguhezand nav mişkê S1. Me 7-14 roj piştî veguheztinê îfadeya GFP ya dendik di neuronên S1 ya ipsilateral û ganglionên bazal ên ventral de dît (Wêne 4b, c). Wekî din, boyaxkirina antîkor a nîşankera talamîk netrîn G1 hebûna dawiya talamîk di t-hCO de eşkere kir (Wêne 4d, e). Ji bo nirxandina ka ev projeksiyonên aferant dikarin bersivên sînaptîk di hucreyên t-hCO de derxînin holê, me tomarên hucreyên tevahî ji hucreyên mirovan di beşên tûj ên qata talamokortîkal de pêk anîn. Stimulasyona elektrîkî ya S1 ya mişk, kapsula navxweyî, madeya spî, fîberên nêzîkî t-hCO an çalakkirina optogenetîk a dawiya talamusê ya ku opsîn-îfade dike di EPSC-yên latency-kurt ên bi t-hCO ve hatine çêkirin de di neuronên t-hCO yên ku li hember dijberê reseptora AMPA NBQX hatine danîn. (Wêne 4f, g û daneyên berfireh, Wêne 9a-g). Ev dane nîşan didin ku t-hCO bi awayekî anatomîkî di mejiyê mişk de entegre ye û dikare ji hêla tevna mêvandar a mişk ve were çalak kirin.
a, Diyagrama şematîk a ceribandineke şopandina harbûnê. b, GFP û îfadeya STEM121 a taybetî ya mirovan di navbera t-hCO û korteksa mejî ya mişk de (panela jorîn). Her wiha îfadeya GFP di navika bingehîn a ventral a ipsilateral a mişk (VB) (çepê jêrîn) û S1 ya ipsilateral (rastê jêrîn) de tê nîşandan. Şêweya pîvanê, 50 µm. Çargoşeyên sor deverên mejî yên ku wêne lê hatine kişandin temsîl dikin. c, pîvandina şaneyên ku GFP îfade dikin (n = 4 mişk). d, e — Termînalên talamusê yên Netrin G1+ di t-hCO de. d beşek koronal nîşan dide ku navikên t-hCO û VB tê de hene. Şêweya pîvanê, 2 mm. e îfadeya Netrin G1 û STEM121 di neuronên t-hCO (çep) û VB (rast) de nîşan dide. Şêweya pîvanê, 50 µm. Xeta xalxalî ya porteqalî sînorê t-hCO nîşan dide. f, g, Şopên niha yên neuronên t-hCO piştî teşwîqkirina elektrîkî di mişkê S1 (f) an kapsula navxweyî (g), bi (mor) an bê (reş) NBQX (çep). Mezinahîyên EPSC bi û bê NBQX (n = 6 neuronên S1, *P = 0.0119; û n = 6 neuronên kapsula navxweyî, **P = 0.0022) (navend). Rêjeya neuronên t-hCO yên ku EPSC di bersiva teşwîqkirina elektrîkî ya mişkê S1 (f) an kapsula navxweyî (g) (rast) de nîşan didin. aCSF, şileya mêjî ya çêkirî. h, diyagrama şematîk a ceribandina wênekirina 2P (çep). Derbirîna GCaMP6s di t-hCO de (navîn). Barika pîvanê, 100 µm. Demjimêra fluoresansê ya GCaMP6s (rast). i, Pûana Z ya fluoresansa çalakiya xweber. j, nîgarkirina şematîk a teşwîqkirina simbilan. k, rêyên fluoresansa 2P yên bi xala z di ceribandinekê de, li gorî devîasyona mûyên di dema sifir de (xeta xêzkirî) di şaneyên mînak de. l, bersivên xala z-ya navînî ya nifûsê ya hemî şaneyên ku li gorî devîasyona mûyên di dema sifir de (xeta xêzkirî) (sor) an jî mohrên demê yên bi awayekî rasthatî hatine çêkirin (gewr). m. Diyagrama şematîk a ceribandinê li ser nîşankirina optîkî. n, Xêzên voltaja xav ji şaneyek mînak t-hCO di dema teşwîqkirina lazerê şîn an jî devîasyona mûyên de. Tîrên sor lûtkeyên yekem ên ku ji ber ronahiyê (jor) an jî ji ber devîasyona mûyên de çêdibin (jêr) nîşan didin. Sîkirina gewr demên devîasyona mûyên de nîşan dide. o, Şêweyên ronahiyê yên herî bilind û bersivên devîasyona mûyên de. p, lûtkeyên hewldanek yekane, li gorî devîasyona mûyên di şaneyên mînakê de. 0 devîasyona mûyên devî nîşan dide (xeta xêzkirî). q, rêjeya şewitandina xala z-ya navînî ya nifûsê ji bo hemî şaneyên fotosensîf, li gorî devîasyona mûyên di dema sifir de (xeta xêzkirî) (sor) an jî mohrên demê yên bi awayekî rasthatî hatine çêkirin (gewr). r, Rêjeya yekîneyên hestiyar ên wêneyî yên ku bi girîngî ji hêla devîasyona mûyan ve têne modûlkirin (n = 3 mişk) (çep). Latency ya puana z ya herî zêde (n = 3 mişk; n = 5 (kesk vekirî), n = 4 (kesk tarî), û n = 4 (şîn) yekîneyên modûlasyona devîasyona mûyan ji bo her mişk) (rast). Daneyên wekî navînî ± devîasyona standard têne îfade kirin.
Piştre me pirsî gelo t-hCO dikare bi teşwîqên hestiyar di vivo de were çalak kirin. Me hCO ya ku nîşaneyên kalsiyûmê yên kodkirî yên genetîkî GCaMP6 îfade dikin, li mişkên S1 veguhezt. Piştî 150 rojan, me fotometrîya fîberê an jî wênekirina kalsiyûmê ya du-foton pêk anî (Wêne 4h û daneyên berfireh, Wêne 10a). Me dît ku hucreyên t-hCO çalakiya rîtmîk a senkronîze nîşan didin (Wêne 4i, Daneyên Berfireh, Wêne 10b û Vîdyoya Pêvek 1). Ji bo taybetmendiya çalakiya t-hCO ya lûtkeyê, me tomarên elektrofîzyolojîk ên derveyî hucreyê di mişkên veguheztinê yên bêhiş de pêk anîn (daneyên berfireh, Wêne 10c-f). Me ji wêneyên MRI koordînatên stereotaksîk çêkirine; bi vî rengî, ev yekîneyên tomarkirî neuronên mirovan ên gumanbar temsîl dikin, her çend elektrofîzyolojî bi tena serê xwe nahêle ku cureyek jêderk were destnîşankirin. Me teqînên çalakiya senkronîze çavdêrî kirin (daneyên berfireh, Wêne 10d). Teqîn bi qasî 460 ms dom kirin û bi demên bêdengiyê yên bi qasî 2 saniyeyan ji hev cuda bûn (daneyên berfireh, Şekil 10d, e). Yekîneyên takekesî bi navînî bi qasî sê guleyan di her teqînê de teqandin, ku ev bi qasî %73ê yekîneyên qeydkirî di her teqînê de ye. Çalakiyên yekîneyên takekesî pir bi hev ve girêdayî bûn, û ev hevahengî ji yên yekîneyên ku di heywanên nevakslêdankirî de hatine destnîşankirin û di heman şert û mercan de hatine tomar kirin bilindtir bûn (daneyên berfireh, Şekil 10f). Ji bo ku bersivên lûtkeyî yên neuronên ji mirovan hatine destnîşankirin bêtir diyar bikin, me ceribandinên nîşankirina ronahiyê li ser mişkên anestezkirî yên ku bi hCO veguheztine ku kanala katyonê ya hesas a ronahiyê rhodopsin 2 (hChR2) îfade dikin, pêk anîn, ku bi rêya wê neuronên t-hCO naskirina latency-kurt (kêmtir ji 10 ms) di bersiva teşwîqên ronahiya şîn de pêk tîne (Şekil 4m–o). Nûronên t-hCO di frekansên mîna yên ku di wênekirina kalsiyûmê de têne dîtin, û her weha tomarên elektrofîzyolojîk ên ku di t-hCO de di nebûna nîşankirina ronahiyê de hatine kirin, teqînên çalakiya xweber nîşan dan (daneyên berfireh, Şekil 10c-g). Di qonaxên têkildar ên hCO yên ku di vitro de hatine tomar kirin de çalakiyek xweber nehat dîtin. Ji bo nirxandina ka t-hCO dikare bi teşwîqên hestyarî were çalak kirin, me demek kurt mûyên mişk ji t-hCO dûr xistin (Şekil 4j,m û daneyên berfireh, Şekil 10h,k). Li gorî lêkolînên berê8,10, komek ji hucreyên t-hCO di bersiva guheztina mûyan de çalakiyek zêde nîşan dan, ku dema ku daneyên bi mohrên demê yên rasthatî re hatin berhev kirin nehat dîtin (Şekil 4k–q û daneyên berfireh, Şekil 10h–q). Bi rastî, bi qasî 54% ji yekîneyên yekane yên bi nîşana opto rêjeyek hişyariyê ya girîng zêde piştî teşwîqkirina mûyan nîşan dan, ku di dora 650 ms de gihîştin lûtkeyê (Şekil 4r). Bi hev re, ev daneyên hanê nîşan didin ku t-hCO3 têketinên fonksiyonel ên guncaw werdigire û dikare ji hêla teşwîqên hawîrdorê ve were çalak kirin.
Piştre me lêkolîn kir ka t-hCO dikare devreyên di mişkan de çalak bike da ku tevgerê kontrol bike. Me pêşî lêkolîn kir ka aksonên neuronên t-hCO di nav tevnên derdorê yên mişk de derdikevin. Me hCO bi lentîvîrusek ku hChR2 kod dike ku bi EYFP (hChR2-EYFP) ve hatiye girêdan, enfeksiyon kir. Piştî 110 rojan, me îfadeya EYFP li herêmên korteksê yên ipsilateral, di nav de korteksên bihîstinê, motorê û somatosensor, û her weha li herêmên subkortîkal, di nav de striatum, hippocampus û talamus, dît (Wêne 5a). Ji bo nirxandina ka ev projeksiyonên eferent dikarin bersivên sînaptîk di hucreyên mişkan de derxînin holê, me hucreyên t-hCO yên ku hChR2-EYFP îfade dikin bi tomar kirina hucreyên korteksa mejî ya mişkan di beşên mêjî yên tûj de bi awayekî optîkî çalak kir. Çalakkirina aksonên t-hCO bi ronahiya şîn EPSC-yên latency-kurt di neuronên korteksa pîramîdal ên mişkan de çêkir, ku ji hêla NBQX ve hatin asteng kirin (Wêne 5b-g). Herwiha, ev bersiv dikarin ji hêla tetrodotoksîn (TTX) ve werin astengkirin û ji hêla 4-aminopîrîdîn (4-AP) ve werin sererast kirin, ku ev yek nîşan dide ku ew ji ber girêdanên monosînaptîk çêbûne (Wêne 5e).
a, Diyagrama şematîk a şopandina aksonê (çep). Îfadeya t-hCO EYFP (rast). Şêweya pîvanê, 100 µm. A1, korteksa bihîstinê, ACC, korteksa cingulate ya pêş, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hîpokampus; Diyafragm, septuma lateral, mPFC, korteksa prefrontal a medial, piri, korteksa piriform, v. striatum, striatum ventral, VPM, navika ventropostomedial a talamusê, VTA, herêma tegmental a ventral. Çargoşeyên sor deverên mêjî yên ku wêne lê hatine kişandin temsîl dikin. b, Diyagrama şematîk a ceribandina teşwîqkirinê. c, d, Nimûneyên bersiva fotoherika ku ji ber ronahiya şîn çêdibe (jor) û voltaja (jêr) di hucreyên t-hCO yên mirovan (c) EYFP+ an mişk (d) EYFP- de. e, f, Şopên niha yên neuronên mişk piştî teşwîqkirina ronahiya şîn a axonên t-hCO bi TTX û 4-AR (kesk), TTX (gewr) an aCSF (reş) (e), bi (binefşî) an bê (reş) ) ) NBQX (e). g, derengketina bersivên ku ji hêla ronahiya şîn ve di hucreyên mişk de têne çêkirin (n = 16 hucre); barên horizontal derengketina navînî nîşan didin (7.13 ms) (çep). Mezinahiya EPSC-yên ji ronahiyê hatine derxistin ên ku bi NBQX an bêyî wê hatine tomar kirin (n = 7 xane; ***P < 0.0001) (navîn). Mezinahiya EPSC-yên ji ronahiyê hatine derxistin ên ku bi NBQX an bêyî wê hatine tomar kirin (n = 7 xane; ***P < 0.0001) (navîn). Zêdekirina cîhana EPSC, qeydkirî bi an bêyî NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (li navendê). Mezinahiya EPSC-yên bi ronahiyê ve hatine çêkirin ku bi NBQX an bêyî wê hatine tomar kirin (n = 7 hucre; ***P < 0.0001) (navend).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中） Zêdekirina cîhana EPSC, qeydkirî bi an bêyî NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (li navendê). Mezinahiya EPSC-yên bi ronahiyê ve hatine çêkirin ku bi NBQX an bêyî wê hatine tomar kirin (n = 7 hucre; ***P < 0.0001) (navend).Rêjeya şaneyên mişkê ku EPSC-yên ku bersiva ronahiya şîn didin nîşan didin (rast). h, Nexşeya şematîk a peywireke reftarî. d0, roja 0. i. Performansa heywanên nimûne di roja 1 (çep) an roja 15 (rast) a perwerdeyê de. Hejmara navînî ya lêdanan di roja 1 (çep) an roja 15 (navenda rastê) de hatine kirin (n = 150 ceribandinên ronahiya şîn, n = 150 ceribandinên ronahiya sor; ***P < 0.0001). Hejmara navînî ya lêdanan di roja 1 (çep) an roja 15 (navenda rastê) de hatine kirin (n = 150 ceribandinên ronahiya şîn, n = 150 ceribandinên ronahiya sor; ***P < 0.0001). Nêzîk, hemû roj di 1-ê de (sleva) an jî 15-ê (n = 150) ji bo cîhanê, n = 150-ê ji bo cîhanê; ***P <0,000). Hejmara navînî ya lêdanan di roja 1 (çep) an roja 15 (navend rast) de pêk hat (n = 150 ceribandinên ronahiya şîn, n = 150 ceribandinên ronahiya sor; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0.001 Nêzîk, hemû roj di 1-ê de (sleva) an jî 15-ê (n = 150) ji bo cîhanê, n = 150-ê ji bo cîhanê; ***P <0,000). Hejmara navînî ya lêdanan di roja 1 (çep) an roja 15 (navend rast) de pêk hat (n = 150 ceribandinên ronahiya şîn, n = 150 ceribandinên ronahiya sor; ***P < 0.0001).Lîzên berhevkirî ji bo ceribandinên ronahiya sor û şîn di roja 1-ê de (navenda çepê) an roja 15-an (rast). NS, ne girîng. j,k, Taybetmendiyên tevgerî yên hemî heywanên ku bi t-hCO-yê hChR2-EYFP (j) an fluorofora kontrolê (k) di roja 1-ê an 15-an de hatine veguheztin (hChR2-EYFP: n = 9 mişk, ** P = 0.0049; kontrol: n = 9, P = 0.1497). l, Pêşveçûna puana tercîhê (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Pêşveçûna puana tercîhê (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Pêşveçûna puana tercîhê (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Pêşveçûna puanên tercîhê (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, îfadeya FOS di bersiva çalakkirina optogenetîk a t-hCO di S1 ​​de. Wêneyên îfadeya FOS (çep), û hejmartin (n = 3 ji bo her komê; *P < 0.05, **P < 0.01 û ***P < 0.001) (rast) têne nîşandan. Wêneyên îfadeya FOS (çep), û hejmartin (n = 3 ji bo her komê; *P < 0.05, **P < 0.01 û ***P < 0.001) (rast) têne nîşandan. Nîşaneyên îzobrazeniya эkspressiy FOS (sleva) û diyardeyên kolîtîkî (n = 3 di grûpê de; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (serrast). Wêneyên îfadeya FOS (çep) û hejmartinê (n = 3 ji bo her komê; *P<0.05, **P<0.01, û ***P<0.001) têne nîşandan (rast).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右 Nîşaneyên îzobrazeniya эkspressiy FOS (sleva) û diyardeyên kolîtîkî (n = 3 di grûpê de; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (serrast). Wêneyên îfadeya FOS (çep) û hejmartinê (n = 3 ji bo her komê; *P<0.05, **P<0.01, û ***P<0.001) têne nîşandan (rast).Pîvana xêzikê, 100 µm. Daneyên wekî navînî ± xeletiya standard a BLA, tonsîla bazolateral, MDT, navika talamîk a dorsomedial, PAG, gewrê periaqueductal têne îfade kirin.
Di dawiyê de, me pirsî gelo t-hCO dikare tevgera mişkan modüle bike. Ji bo ceribandina vê yekê, me hCO ya ku hChR2-EYFP-ê îfade dike veguhezt nav S1, û 90 roj şûnda, me fîberên optîkî ji bo radestkirina ronahiyê têxe nav t-hCO. Piştre me mişk bi paradîgmayek şertkirina operant a guherandî perwerde kirin (Wêne 5h). Me ajal xistin odeyek ceribandina tevgerî û bi awayekî rasthatî teşwîqên lazer ên şîn (473 nm) û sor (635 nm) yên 5 çirkeyan sepandin. Ajalan xelatek avê distandin ger wan di dema teşwîqkirina ronahiya şîn de bilizandin lê di dema teşwîqkirina ronahiya sor de nelizandin. Di roja yekem a perwerdeyê de, ajal dema ku bi ronahiya şîn an sor têne teşwîqkirin di lêxistinê de ti cûdahiyek nîşan nedan. Lêbelê, di roja 15-an de, ajalên ku hChR2-EYFP-ya ku hCO-yê îfade dikin veguheztibûn, dema ku bi ronahiya şîn têne teşwîqkirin, li gorî teşwîqkirina ronahiya sor, lêdizînek çalaktir nîşan dan. Ev guhertinên di tevgerên lêdanê de di heywanên kontrolê de ku bi hCO3 hatine veguheztin û florofora kontrolê îfade dikin, nehatin dîtin (rêjeya serkeftina fêrbûnê: hChR2 %89, EYFP %0, Wêne 5i-1 û Vîdyoya Pêvek 2). Ev daneyan nîşan didin ku hucreyên t-hCO3 dikarin neuronên mişk çalak bikin da ku tevgera lêgerîna xelatê teşwîq bikin. Ji bo ku em bibînin ka kîjan devreyên neural ên t-hCO3 yên mişk dikarin di van guhertinên tevgerê de beşdar bibin, me bi awayekî optogenetîkî t-hCO3 di heywanên perwerdekirî de çalak kir û 90 hûrdeman şûnda tevn berhev kir. Îmmunohîstokîmya îfadeya proteîna FOS ya girêdayî çalakiyê di çend herêmên mêjî de eşkere kir ku di tevgera motîvekirî de beşdar in, di nav de korteksa prefrontal a navîn, talamusa navîn, û madeya gewr a periaqueductal, ku an di heywanên kontrolê yên bê teşwîqkirin an jî di heywanan de hate îfade kirin. birinc. 5m). Bi hev re, ev daneyan nîşan didin ku t-hCO3 dikare çalakiya neuronal a mişkê modûl bike da ku tevgerê ajot bike.
Organoîdên demarî sîstemeke sozdar temsîl dikin ji bo lêkolîna pêşketina mirovan û nexweşiyan di vitro de, lê ew ji ber nebûna girêdanên di navbera devreyên ku di vivo de hene de sînordar in. Me platformek nû pêşxistiye ku tê de me hCO2 veguheztiye nav S1 mişkên piştî zayînê yên bi lawaziya pergala parastinê ya zû da ku pêşketin û fonksiyona hucreyên mirovan di vivo de lêkolîn bikin. Me nîşan daye ku t-hCO celebên hucreyên gihîştî yên ku di vitro de nayên dîtin pêş dixe28 û ku t-hCO2 bi awayekî anatomîkî û fonksiyonel di mejiyê rovî de tê entegre kirin. Entegrasyona t-hCO2 di devreyên demarî yên rovî de rê da me ku em girêdanek di navbera çalakiya hucreyî ya mirovan û tevgera heywanên lêkolînkirî de saz bikin, ku nîşan dide ku neuronên t-hCO2 dikarin çalakiya neuronal a mişkan modûl bikin da ku bersivên tevgerî ajotin.
Platforma ku em rave dikin li gorî lêkolînên berê yên li ser veguheztina şaneyên mirovan bo mejiyên rovî, xwedî gelek avantajên baş e. Pêşîn, me hCO2 veguhezt nav korteksa pêşketinê ya mişkên piştî zayînê yên zû, ku dibe ku entegrasyona anatomîk û fonksiyonel hêsan bike. Ya duyemîn, çavdêriya MRI ya t-hCO2 rê da me ku em pozîsyon û mezinbûna graftê di heywanên zindî de lêkolîn bikin, ku rê da me ku em lêkolînên pir-heywanî yên demdirêj bikin û pêbaweriya çend xetên şaneyên hiPS saz bikin. Di dawiyê de, me organoîdên saxlem veguhezt, li şûna rawestandinên şaneyên yekane yên îzolekirî, ku ji bo şaneyên mirovan kêmtir wêranker in û dikarin entegrasyon û çêbûna neuronên korteksa mirovan di mejiyên mişkan de pêşve bibin.
Em qebûl dikin ku tevî pêşketinên di vê platformê de, sînorkirinên demkî, cîhî û cureyên cuda rê li ber çêbûna devreyên demarî yên mirovan bi rastbûnek bilind digirin, tewra piştî veguheztinê di qonaxek zû ya pêşkeftinê de jî. Bo nimûne, ne diyar e ka çalakiya xweber a ku di t-hCO de tê dîtin fenotipek pêşkeftinê ya dişibihe çalakiya rîtmîk a ku di dema pêşkeftina korteksê de tê dîtin temsîl dike, an jî ji ber nebûna celebên hucreyên tepeserker ên di t-hCO de hene. Bi heman awayî, ne diyar e ku nebûna laminasyonê di t-hCO de heta çi radeyê bandorê li girêdana zincîrê dike30. Xebata pêşerojê dê li ser entegrekirina celebên hucreyên din ên wekî mîkrogliya mirovan, hucreyên endotelyal ên mirovan, û rêjeyên cûda yên interneuronên GABAergic wekî ku bi karanîna civîna 6 di vitro de tê xuyang kirin, û her weha têgihîştina ka entegrekirin û pêvajoykirina demarî çawa dikare di asta t-hCO ya guhertî de çêbibe. astên transkrîpsiyonî, sînaptîk û tevgerî di hucreyên ji nexweşan hatine wergirtin de.
Bi tevayî, ev platforma in vivo çavkaniyek bihêz temsîl dike ku dikare pêşveçûna mêjiyê mirovan û lêkolîna nexweşiyan a in vitro temam bike. Em pêşbînî dikin ku ev platform dê bihêle ku em fenotipên asta zincîrê yên nû di hucreyên ji nexweşan hatine wergirtin de kifş bikin û stratejiyên dermankirinê yên nû biceribînin.
Me hCO2.5 ji şaneyên HiPS wekî ku berê hatiye vegotin çêkir. Ji bo destpêkirina hilberîna hCO ji şaneyên hiPS ên ku li ser tebeqeyên xwarinê hatine çandin, koloniyên saxlem ên şaneyên hiPS bi karanîna dispase (0.35 mg/mL) ji firaxên çandiniyê hatin derxistin û veguheztin kulturên plastîk ên bi girêdana pir kêm ku firaxên bi navgîniya çandina şaneyên hiPS dihewînin. (Corning) bi du astengkerên SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) û SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) û astengkerê ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ve hate zêdekirin. Di 5 rojên pêşîn de, navgîniya şaneyên hiPS rojane hate guhertin û dorsomorphine û SB-431542 hatin zêdekirin. Di roja şeşemîn de di rewşa rawestandinê de, sferoîdên neural hatin veguheztin navgîna neural a ku neurobasal-A (10888, Life Technologies), pêveka B-27 bê vîtamîna A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisîlîn û streptomîsîn (1:100, Life Technologies) tê de heye û bi faktora mezinbûna epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) û faktora mezinbûna fîbroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) heta roja 24-an hate zêdekirin. Ji roja 25-an heta roja 42-an, navgîn bi faktora neurotrofîk a ji mêjî (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) û neurotrofîn 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) bi guhertinên navgînê her du rojan hate zêdekirin. Di roja şeşemîn de di rewşa rawestandinê de, sferoîdên neural hatin veguheztin navgîna neural a ku neurobasal-A (10888, Life Technologies), pêveka B-27 bê vîtamîna A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisîlîn û streptomîsîn (1:100, Life Technologies) tê de heye û bi faktora mezinbûna epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) û faktora mezinbûna fîbroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) heta roja 24-an hate zêdekirin. Ji roja 25-an heta roja 42-an, navgîn bi faktora neurotrofîk a ji mêjî (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) û neurotrofîn 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) bi guhertinên navgînê her du rojan hate zêdekirin.Di roja şeşemîn de di rewşa rawestandinê de, sferoîdên neuralî bo navgînek neuralî hatin veguheztin ku tê de Neurobasal-A (10888, Life Technologies), pêveka B-27 bê vîtamîna A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) û penisîlîn hebûn.и стрептомицин (1:100, Teknolojiyên Jiyanê) û pêvekên epidermalnыm faktorom rosta (EGF; 20 ng/ml; Sîstemên R&D) и faktorom rosta fibroblastov 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) heta 24-. û streptomycin (1:100, Life Technologies) û heta roja 24an bi faktora mezinbûna epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) û faktora mezinbûna fîbroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) ve hate zêdekirin.Ji rojên 25an heta 42an, faktora neurotrofîk a ji mêjî (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) û neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) li navgînê hatin zêdekirin, û navgîn her du rojan carekê hate guhertin.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A7生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life TechnologiesＴ 画 画 体b-27 补充剂 (12587 ， Teknolojiyên Jiyanê） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 神经 培养 基 中 10 ， Teknolojiyên Jiyanê） 表皮 生长 因子 (((20 ng ml-1 ； r & d Systems) 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D瀴2 Systems） Li ser 6-й день суспензии на нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100) streptomicin (1:100, Life Technologies) со добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 ng мл-1; Sîstemên R&D) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng мл-1) 1; Di roja 6an de, rawestandinên neurosphere hatin guhertin bo pêvekek ku tê de neurobasal-A (10888, Life Technologies), pêveka B-27 bê vîtamîna A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycina penisîlîn-bêbandorkirî (1:100, Life Technologies) hebû ku bi faktora mezinbûna epidermal (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) û faktora mezinbûna fîbroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 hebû; Pergalên R&D) heta 24-rojan. Sîstemên R&D) heta roja 24an.Ji rojên 25an heta 42an, faktora neurotrofîk a ji mêjî (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) û faktora neurotrofîk 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) her du rojan carekê li navgîna çandiniyê hatin zêdekirin. Navgîn carekê hate guhertin.Ji roja 43-an pê ve, hCO2 di navgîna neurobasal-A ya bê lêzêde (NM; 1088022, Thermo Fisher) de bi guhertina navgînê her 4-6 rojan hate parastin. Ji bo bidestxistina hCO2 ji şaneyên hiPS ên ku di bin şert û mercên bê xwarin de hatine çandin, şaneyên hiPS bi Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) re di 37°C de ji bo 7 hûrdeman hatin înkubekirin, bûn şaneyên yekane, û li ser plakayên AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) bi dendika 3 × 106 şaneyên yekane di her bîrê de di navgîna Essential 8 de ku bi astengkerê ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) hatiye zêdekirin, hatin çandin. Piştî 24 demjimêran, medyaya di bîrê de bi pîpetê ber bi jor û jêr ve hate rijandin nav medyaya ku medyaya Essential 6 (A1516401, Life Technologies) bi dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) û SB-431542 (10 μM; 1614) lê hatiye zêdekirin, ku tê de ye. Ji rojên 2 heta 6, medyaya Essential 6 rojane bi dorsomorphine û pêveka SB-431542 hate guhertin. Ji roja şeşemîn pê ve, rawestandinên neurosferê bo medyaya neurobasal hatin veguheztin û wekî ku li jor hatî vegotin hatin parastin.
Hemû prosedurên li ser heywanan li gorî rêbernameyên lênêrîna heywanan ên ku ji hêla Komîteya Rêveberiya Lênêrîna Heywanan a Laboratuwara Zanîngeha Stanford (APLAC) ve hatine pejirandin, hatin kirin. Mişkên ducanî yên RNU (rnu/+) yên eutimîk (Charles River Laboratuwars) hatin kirîn an jî li malê hatin bicihkirin. Heywan li ser çerxek ronahî-tarî ya 12 demjimêran bi xwarin û avê ad libitum hatin hiştin. Kûçikên mişkên tazî (FOXN1–/–) yên sê heta heft rojan bi mezinbûna mûyên negihîştî berî qirkirinê hatin destnîşankirin. Kûçik (nêr û mê) bi 2-3% îzoflurane hatin anestez kirin û li ser çarçoveyek stereotaksîk hatin danîn. Trepanasyonek serê bi qûtra nêzîkî 2-3 mm li jor S1 hate kirin dema ku yekparçeyiya dura mater hate parastin. Dûv re derziyek 30-G (nêzîkî 0.3 mm) li derveyî kraniotomiyê bikar bînin da ku dura qul bikin. Dûv re HCO li ser parafîlmek zirav a 3 × 3 cm bidin û navgîniya zêde derxînin. Bi karanîna şîrîngeke Hamiltonê ku bi derziyeke 23 G, 45° ve girêdayî ye, hCO2 bi nermî bikşînin dawiya herî dûr a derziyê. Piştre şîrîngê li ser pompeya şîrîngê ya ku bi cîhaza stereotaksîk ve girêdayî ye deynin. Piştre serê derziyê li ser qulikeke qulkirinê ya 0,3 mm fireh a ku berê di dura de hatiye çêkirin (z = 0 mm) deynin û şîrîngê 1-2 mm (z = bi qasî –1,5 mm) teng bikin heta ku derzî di navbera dura mater A de be. mohreke qalind çêdibe. Piştre şîrîngê ber bi navenda rûyê kortikalê li z = -0,5 mm bilind bikin û hCO2 bi rêjeya 1-2 µl di hûrdemê de derzî bikin. Piştî temamkirina derzîkirina hCO, derzî bi rêjeya 0,2-0,5 mm di hûrdemê de tê kişandin, çerm tê dirûtin, û kûçikê piçûk tavilê li ser balîfeke germ a germ tê danîn heta ku bi tevahî baş bibe. Hin heywan bi du alîyan hatine veguheztin.
Hemû prosedurên li ser heywanan li gorî rêbernameyên lênêrîna heywanan ên ku ji hêla Zanîngeha Stanford APLAC ve hatine pejirandin, hatin kirin. Mişk (piştî veguheztinê ji 60 rojan zêdetir) bi anesteziya 5% îzoflurane hatin çalak kirin û di dema wênekirinê de bi 1-3% îzoflurane hatin anestez kirin. Ji bo dîtbarîkirinê, skanerek qulên horizontal a 7 Tesla ya bi parastvanek çalak Bruker (Bruker Corp.) bi ajokera gradient a International Electric Company (IECO), pêvekek gradient a bi parastvan bi çapa navxweyî ya 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) bi karanîna AVANCE.III, şiyanên RF-ya pir-pêl û pir-navokî yên heşt-kanal, û platforma Paravision 6.0.1-a pêvek hate bikar anîn. Tomarkirin bi karanîna pêlek RF-ya volûmetrîk a bi çalak veqetandî bi çapa navxweyî ya 86 mm û pêlek RF-ya çar-kanal a krîyo-sarbûyî tenê ji bo wergirtinê hate kirin. Axial 2D Turbo-RARE (dema dubarekirinê = 2500 ms, dema dengdanê = 33 ms, 2 navînî) bi 16 girtina perçeyan, qalindahiya perçeyan 0.6–0.8 mm, ku 256 × 256 nimûne dihewîne. Sînyal bi karanîna bobîna RF ya volûmetrîk a transîverê çargoşeyî bi çapa navxweyî ya 2 cm (Rapid MR International, LLC) hatin wergirtin. Di dawiyê de, fonksiyonên texmîna rûyê Imaris (BitPlane) yên çêkirî ji bo renderkirina 3D û analîza qebareyê bikar bînin. Veguhastinek serketî wekî yek hate pênasekirin ku tê de deverên sînyala MRI ya giraniya T2 ya domdar di nîvkada veguheztî de çêbûn. Redkirina graftê wekî graftek hate pênasekirin ku deverên sînyala MRI ya giraniya T2 ya domdar di nîvkada veguheztî de çênekiriye. t-hCO ya subkortîkal ji analîza paşê hate derxistin.
Ji bo îfadekirina stabîl a GCaMP6s di hCO3 de ji bo wênekirina kalsiyûmê ya du-foton, şaneyên hiPS bi pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro hatin enfeksiyon kirin û dû re antîbiyotîk hatin hilbijartin. Bi kurtasî, şaneyên bi EDTA veqetiyan û di 1 ml navgîniya Essential 8 de bi dendika nêzîkî 300,000 şaneyan di hebûna polîbrenê (5 μg/ml) û 15 μl vîrusê de hatin sekinandin. Dûv re şaneyên 60 hûrdeman di sekinandinê de hatin înkubasyon kirin û bi dendika 50,000 şaneyan di her bîrê de hatin çandin. Piştî tevlihevkirinê, şaneyên bi 5-10 μg ml-1 puromycin ji bo 5-10 rojan an jî heta ku koloniyên stabîl xuya bibin hatin derman kirin. Infeksiyona hCO ya akût wekî ku berê hatiye vegotin5 bi hin guhertinan hate kirin. Bi kurtasî, roja 30-45 hCO3 veguhezînin nav lûleyên mîkrosantrifûjê yên Eppendorf ên 1.5 ml ku 100 µl navgîniya demarî tê de hene. Dû re bi qasî 90 µl ji navgînê tê derxistin, 3-6 µl ji lentîvîrusa tîter bilind (ji 0.5 x 108 heta 1.2 x 109) li lûleyê tê zêdekirin, û hCO2 ji bo 30 deqîqeyan tê veguheztin înkubatorê. Dû re 90-100 µl navgînê li her lûleyê zêde bikin û lûleyan tevahiya şevê vegerînin înkubatorê. Roja din, hCO2 di plakayên girêdana kêm de veguhezînin navgîna demarî ya teze. Piştî 7 rojan, hCO2 ji bo dîtbarîkirin û nirxandina kalîteya enfeksiyonê veguheztin plakayên binê cam ên 24-qulikî. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE û pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ji hêla VectorBuilder ve hatine çêkirin. Lentîvîrus di piraniya ceribandinan de tê bikar anîn ji ber ku ew di nav genoma mêvandar de entegre ye, ku dihêle ku derbirîna gena raportor di xetên hucreyên vegirtî de çêbibe. Ji bo şopandina nexweşiya harbûnê, di rojên 30-45an de hCO bi harbûna-ΔG-eGFP û AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmîda #67528, Addgene) re hev-enfeksiyon hate kirin, 3 rojan bi tevahî hate şuştin, û di S1 ​​de ji bo mişkan hate veguheztin û 7-14 rojan di bin bandora harbûnê de hate hiştin.
Ji bo îmmûnosîtokîmyayê, heywan hatin anestezkirin û bi rêya transkardiyal bi PBS hatin perfuzkirin û piştre bi 4% paraformaldehîd (PFA di PBS de; Electron Microscopy Sciences) hatin perfuzkirin. Mejî ji bo 2 saetan an jî tevahiya şevê di 4°C de di 4% PFA de hatin sabîtkirin, ji bo 48-72 saetan di 30% sukroz de di PBS de hatin krîoprezervkirin, û di 1:1, 30% sukroz de hatin bicihkirin: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) û beşên koronal di 30 µm de bi karanîna krîostatek (Leica) hatin çêkirin. Ji bo îmmûnohîstokîmyaya beşên stûr, heywan bi PBS hatin perfuzkirin, û mejî bi karanîna vibratomek (Leica) di 300-400 µm de bi awayekî koronal hat parçekirin û perçekirin û beş ji bo 30 deqîqeyan bi 4% PFA hatin sabîtkirin. Dû re perçeyên krîyosection an jî yên stûr bi PBS hatin şuştin, di germahiya odeyê de ji bo saetekê hatin astengkirin (10% seruma kerê normal (NDS) û 0.3% Triton X-100 di PBS de hatiye şilkirin) û bi çareseriya astengkirinê di 4°C de hatin astengkirin. – Înkubasyon Krîyosection tevahiya şevê û perçeyên stûr jî ji bo 5 rojan hatin înkubasyonkirin. Antîkorên sereke yên ku hatine bikaranîn ev in: antî-NeuN (mişk, 1:500; ab104224, abcam) antî-CTIP2 (mişk, 1:300; ab18465, abcam), antî-GFAP (kerguh, 1:1,000; Z0334, Dako), antî-GFP (mirîşk, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), antî-HNA (mişk, 1:200; ab191181, abcam), antî-NeuN (kerguh, 1:500; ABN78, Millipore), antî-PDGFRA (kerguh, 1:200; sc-338, Santa Cruz), antî-PPP1R17 (kerguh, 1:200; HPA047819, Atlas Antîbodies), antî-RECA-1 (mişk, 1:50; ab9774, abcam), antî-SCG2 (kerguh, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), antî-SOX9 (bizin, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (bizin, 1:100; AF1166, R&D Systems), antî-STEM121 (mişk, 1:200; Y40410, Takara Bio), antî-SATB2 (mişk, 1:50; ab51502, abcam), antî-GAD65/67 (kerguh, 1:400; ABN904, Millipore) û antî-IBA1 (bizin, 1:100; ab5076, abcam). Antîkorên sereke yên ku hatine bikaranîn ev bûn: antî-NeuN (mişk, 1:500; ab104224, abcam) antî-CTIP2 (mişk, 1:300; ab18465, abcam), antî-GFAP (kerguh, 1:1,000; Z0334, Dako), antî-GFP (mirîşk, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), antî-HNA (mişk, 1:200; ab191181, abcam), antî-NeuN (kerguh, 1:500; ABN78, Millipore), antî-PDGFRA (kerguh, 1:200; sc-338, Santa Cruz), antî-PPP1R17 (kerguh, 1:200; HPA047819, Atlas Antîbodies), antî-RECA-1 (mişk, 1:50; ab9774, abcam), antî-SCG2 (kerguh, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), antî-SOX9 (bizin, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (bizin, 1:100; AF1166, R&D Systems), antî-STEM121 (mişk, 1:200; Y40410, Takara Bio), antî-SATB2 (mişk, 1:50; ab51502, abcam), antî-GAD65/67 (kerguh, 1:400; ABN904, Millipore) û antî-IBA1 (bizin, 1:100; ab5076, abcam). Anti-NeuN (mыshinыe, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (1:03, 1:03, ZP); -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200;-1: Анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, 20357-1-AP, 20357-1-AP, 20357-1-AP, 20357-1-AP, 1:500, AF3075, Pergalên R&D), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, Sîstemên R&D), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2,1:5; anti-GAD65/67 (crolik, 1:400; ABN904, Millipore) û anti-IBA1 (koza, 1:100; аб5076, абкам). Antîkorên sereke yên ku hatine bikaranîn ev bûn: antî-NeuN (mişk, 1:500; ab104224, abcam), antî-CTIP2 (mişk, 1:300; ab18465, abcam), antî-GFAP (kerguh, 1:1000; Z0334, Dako), antî-GFP (mirîşk, 1:1000; GTX13970, GeneTex), antî-HNA (mişk, 1:200; ab191181, abcam), antî-NeuN (kerguh, 1:500; ABN78, Millipore), antî-PDGFRA (kerguh, 1:200; sc-338, Santa Cruz), antî-PPP1R17 (kerguh, 1:200; HPA047819, Antîkorên Atlas), antî-RECA-1 (mişk, 1:50; ab9774, abcam), dij-SCG2 (kerguh, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), dij-SOX9 (bizin, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (bizin, 1:100; AF1166, R&D Systems), dij-STEM121 (mişk, 1:200; Y40410, Takara Bio), dij-SATB2 (mişk, 1:50; ab51502, abcam), dij-GAD65/67 (kerguh, 1:400; ABN904, Millipore) û dij-IBA1 (bizin, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81,abkamera,,抗NeuN（兔,1:500,ABN78,Millipore,抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100;20357-1-AP,Proteintech,,抗SOX9,山羊,1:500,R&D Systems）,Netrin G1a（山羊（山羊（山羊（山羊，61D，1:AF0，1:AF0 Systems，抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181, abcam, , 抗NeuN, , 1:500 , ABN78 , Millipore , 抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:110（（山羊，1:100（山羊， Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), dij-SATB2 (mişk, 1:50; ab51502, abcam), dij-GAD65/67 (kergoşk, 1:400; ABN904, Millipore) û dij-IBA1 (bizin, 1:100; ab5076, abcam).Antîkorên sereke yên ku hatine bikaranîn ev bûn: antî-NeuN (mişk, 1:500; ab104224, abcam), antî-CTIP2 (mişk, 1:300; ab18465, abcam), antî-GFAP (kergoşk, 1:1000; Z0334, Dako). , antî-GFP (mirîşk, 1:1000; GTX13970, GeneTex), antî-HNA (mişk, 1:200; ab191181, abcam), antî-NeuN (kergoşk, 1:500; ABN78, Millipore), antî-PDGFRA (kergoşk, 1:200; sc-338, Santa Cruz), antî-PPP1R17 (kergoşk, 1:200; HPA047819, antîkorê Atlas), antî-RECA-1 (mişk, 1:50; ab9774, abcam), antî-SCG2 (kergoşk), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, Pergalên R&D), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, Pergalên R&D), antî -STEM121 (мышь, 1:20020,YATARA); (mыshь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (crolik, 1:400; ABN904, Millipore) û anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). 20357-1-AP, Proteintech), antî-SOX9 (bizin, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (bizin, 1:100; AF1166, R&D Systems), antî-STEM121 (mişk, 1:200; Y40410, Takara Bio), antî-SATB2 (mişk, 1:50; ab51502, abcam), antî-GAD65/67 (kergoşk, 1:400; ABN904, Millipore), û antî-IBA1 (bizin, 1:100; ab5076, abkam).Paşê beş bi PBS hatin şuştin û bi antîkorê duyemîn re ji bo saetekê di germahiya odeyê de (beşên cemidî) an jî tevahiya şevê di 4°C de (beşên stûr) hatin înkubekirin. Antîkorê duyemîn ê Alexa Fluor (Life Technologies) ku di çareseriya astengkirinê de bi rêjeya 1:1000 hatiye şilkirin, hat bikaranîn. Piştî şuştina bi PBS, navik bi Hoechst 33258 (Life Technologies) hatin xuyangkirin. Di dawiyê de, slayt bi bergên qapaxê (Fisher Scientific) bi karanîna Aquamount (Polysciences) li ser mîkroskopê hatin danîn û li ser mîkroskopa floresan a Keyence (analîzatorê BZ-X) an mîkroskopa konfokal a Leica TCS SP8 (Las-X) li ser wêneyê hatin analîzkirin. Wêne bi karanîna bernameya ImageJ (Fiji) hatin pêvajokirin. Ji bo pîvandina rêjeya neuronên mirovan di t-hCO û korteksa mişk de, wêneyên çarçikî yên bi firehiya 387.5 μm li navenda t-hCO, li an nêzîkî qiraxa korteksa mişk hatin girtin. Qonaxên graftê bi nirxandina guhertinên di şefafiyeta tevnê, navikên HNA+ û/an hebûna otofluoresansa tevnê de hatin destnîşankirin. Di her wêneyê de, hejmara giştî ya şaneyên NeuN+ û HNA+ bi hejmara giştî ya şaneyên NeuN+ di heman deverê de hate dabeş kirin. Ji bo ku tenê şaneyên bi navikên di plana wêneyê de werin jimartin, tenê şaneyên ku di heman demê de Hoechst+ in jî di hesabê de têne girtin. Du wêneyên ku bi kêmî ve 1 mm ji hev cuda ne, ji bo kêmkirina xeletiya îstatîstîkî hatin navînî kirin.
Hefteyek berî berhevkirina nimûneyan, heywanên veguheztina hCO (nêzîkî 8 mehan ji cudabûnê) di odeyek tarî de bi hirçên qutkirî ji bo kêmkirina teşwîqkirina hestan bi cîh bikin. Veqetandina navokan wekî ku berê hatiye vegotin, bi hin guhertinan hate kirin. Bi kurtasî, t-hCO û hCO bi karanîna lîza hucreyê ya mekanîkî ya deterjan û hûrkera tevna cam a 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) hatin hilweşandin. Navokên xav dûv re bi karanîna fîlterek 40 µm hatin fîlterkirin û berî ku gradyana dendika sukrozê were pêkanîn, ji bo 10 hûrdeman li 320 g li 4 °C hatin santrifûjkirin. Piştî gava santrifûjkirinê (320 g ji bo 20 hûrdeman li 4 °C), nimûne di 0.04% BSA/PBS de bi zêdekirina 0.2 yekîneyên µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ji nû ve hatin süspendekirin û ji fîlterek herikîna 40 µm re derbas bûn. Paşê navikên ji hev veqetandî di PBS-ê de ku %0.02 BSA tê de heye ji nû ve hatin daliqandin û li ser çîpa Chromium Single Cell 3′ hatin barkirin (texmîna vegerandina 8,000 şaneyan di her rêzê de). Pirtûkxaneyên snRNA-seq bi Chromium Single hull 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) hatin amadekirin. Pirtûkxaneyên snRNA-seq bi Chromium Single hull 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) hatin amadekirin. Biblioteki snRNA-seq были приготовлены со помош Chromium Single cell 3′ GEM, Pirtûkxane & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pirtûkxaneyên snRNA-seq bi karanîna Chromium Single hull 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) hatin amadekirin. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Pirtûkxane & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Pirtûkxane & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) Biblioteku snRNA-seq amade ye bi bikaranîna Chromium Single Cell 3' GEM, Pirtûkxane & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pirtûkxaneya snRNA-seq bi karanîna Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) hate amadekirin.Pirtûkxaneyên ji nimûneyên cûda ji hêla Admera Health ve li ser NovaSeq S4 (Illumina) hatin kom kirin û rêzkirin.
Asta derbirîna genan ji bo her barkoda navokî ya gumanbar bi karanîna pakêta nermalava analîzê ya 10x Genomics CellRanger (guhertoya 6.1.2) hate hejmartin. Bi taybetî, xwendin li hember tevlîheviyek ji genomên referansê yên mirovan (GRCh38, Ensemble, guhertoya 98) û mişkan (Rnor_6.0, Ensemble, guhertoya 100) ên ku bi fermana mkref hatine afirandin û bi karanîna fermana count bi –include-introns=TRUE ve ji bo hejmartinê xwendinên ku li herêmên intronê hatine nexşekirin hatine navandin, hatin hevber kirin. Ji bo nimûneyên t-hCO3, navokên mirovan li gorî şerta parastî ya ku herî kêm %95ê hemî xwendinên nexşekirî bi genoma mirovan re li hev dikin hatin nas kirin. Hemî analîzên paşîn li ser rêzek barkodê ya fîltrekirî ya ku ji CellRanger derketiye bi karanîna pakêta R (guhertoya 4.1.2) Seurat (guhertoya 4.1.1)32 hatin kirin.
Ji bo ku tenê navokên bi kalîte bilind di analîza paşê de cih bigirin, ji bo her nimûneyek pêvajoyek fîlterkirina dubarekirî hate bicîh kirin. Pêşî, navokên bi kalîte nizm ên ku ji 1000 genên bêhempa kêmtir têne dîtin û ji %20 zêdetir mîtokondriyên giştî têne destnîşankirin û rakirin. Piştre, matrîksa hejmara genê ya xav bi rêya regresyona binomî ya neyînî ya rêkûpêk bi karanîna fonksiyona sctransform(vst.flavor="v2") hate normalîzekirin, ku her weha 3000 genên herî guhêrbar bi karanîna parametreyên xwerû destnîşan kir. Kêmkirina pîvanê li ser genên guhêrbar ên jorîn bi karanîna Analîza Pêkhateya Sereke (PCA) bi parametreyên xwerû bi karanîna pîvanek seta daneyê ya 30 hate kirin (dims = 30 li ser bingeha vekolîna dîtbarî ya cihên çokan hate hilbijartin û ji bo hemî nimûne û analîzên ensemble hate bikar anîn). Piştre me çend dewreyên komkirina dubare (çareserî = 1) pêk anîn da ku genan li gorî jimara genê ya anormal kêm (navîn li jêr sedî 10-an), jimara genê mîtokondrî ya anormal zêde (navîn li jor sedî 95-an) dabeş bikin da ku hucreyên gumanbar ên kalîteya nizm nas bikin û jê bibin. Kom û/an rêjeyek bilind a cêwîyên gumanbar ên ku bi karanîna pakêta DoubletFinder33 hatine nas kirin (puana navînî ya DoubletFinder li jor sedî 95-an). Nimûneyên t-hCO3 (n=3) û nimûneyên hCO3 (n=3) bi karanîna fonksiyona IntegrateData bi jorîn re ji hev cuda hatin entegre kirin. parametreyan. Piştre, wekî ku li jor hatî vegotin, dewreyeke din a fîlterkirina kalîtîf a koma daneyên yekbûyî hate kirin.
Piştî rakirina kernelên bi kalîteya nizm, daneya yekbûyî hate komkirin (çareserî = 0.5) û ji bo armancên dîtbarîkirina UMAP34 hate bicîhkirin. Genên nîşanker ji bo her komekê bi karanîna fonksiyona FindMarkers bi parametreyên xwerû yên ku ji daneyên îfadeya genê ya normalîzekirî hatine hesibandin hatin destnîşankirin. Em çînên şaneyên sereke bi hevberkirina daneyên referansa korteksa fetus û mezinan bi îfadeya gena nîşanker 19,20,21,35 û anotasyonê nas dikin û dabeş dikin. Bi taybetî, pêşengên gerok bi îfadeya MKI67 û TOP2A hatin nas kirin. Komên pêşwext bi nebûna transkrîptên mîtotîk, hevgirtina bilind bi komên pêşwext ên glial ên pirpotansiyel ên ku di korteksa fetusê ya metafaza dereng de hatine vegotin, û îfadeya EGFR û OLIG1 hatin destnîşankirin. Em terma astrosît bikar tînin da ku çend rewşên cûdakirina astrosîtê, ji gliaya radyal a dereng bigire heya gihîştina astrosîtan, vedihewînin. Komên astrosîtan astên bilind ên SLC1A3 û AQP4 îfade dikin û hatiye nîşandan ku bi bincelebên gliaya radyal a fetus û/an astrosîtên mezinan re nexşe dikin. OPC PDGFRA û SOX10 îfade dikin, di heman demê de olîgodendrosît nîşankerên mîelinasyonê (MOG û MYRF) îfade dikin. Neuronên glutamaterjîk bi hebûna transkrîptên neuronal (SYT1 û SNAP25), nebûna nîşankerên GABAergic (GAD2), û îfadeya NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, an SATB2 hatin destnîşankirin. Neuronên GluN bêtir li binsınıfên jorîn (îfadeya SATB2 û windabûna BCL11B) û kûr (îfadeya BCL11B) hatin dabeş kirin. Neuronên binplaqeya texmînkirî (SP) nîşankerên SP18 yên naskirî yên wekî ST18 û SORCS1 ji bilî nîşankerên GluN yên kûr îfade dikin. Hucreyên mîna pleksusa koroîd bi îfadeya TTR hatin destnîşankirin, û hucreyên mîna meningeal genên têkildarî fîbroblast îfade kirin û hucreyên pîal/damarî yên koma daneyên referansê nexşandin.
Analîza cuda ya derbirîna genan di navbera binçînên t-hCO û hCO de bi karanîna rêbaza pseudo-batch a nû pêşkeftî ku di nimûneyên ku bi karanîna pakêta Libra R (guhertoya 1.0.0) hatine bicîhkirin de hatine hilberandin, hate kirin. Bi taybetî, testên îhtîmala logarîtmîk a edgeR (guhertoya 3.36.0, pakêta R) ji bo koman bi berhevkirina hejmara genan di hucreyan de ji bo çînek hucreyek diyarkirî ji bo her dubarekirina nimûneyê hatin kirin. Ji bo dîtbarîkirina nexşeya germê, nirxên normalîzekirî yên li ser mîlyon (CPM) bi karanîna edgeR (fonksiyona cpm()) û pîvankirî têne hesibandin (ji bo bidestxistina navînî = 0, devîasyona standard = 1). Analîza dewlemendkirina Ontolojiya Genê (GO) ya genên t-hCO GluN ên bi girîngî zêdekirî hate kirin (nirxa P ya rastkirî ya Benjamini-Hochberg kêmtir ji 0.05 ku di herî kêm 10% hucreyên t-hCO GluN de tê îfade kirin û zêdebûna qat di guhertinê de herî kêm 2 caran). bi karanîna ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 hate kirin. Em sepana ToppFun bi parametreyên xwerû bikar tînin û nirxên P-yê yên ku ji testên hîpergeometrîk ên bi şîroveyên GO-yê hatine hesabkirin hatine sererastkirin radigihînin.
Ji bo ku komên me yên snRNA-seq bi komên şaneyên şîrovekirî yên ji lêkolînên referansê yên RNA-seq-a şaneya yekane ya seretayî an snRNA-seq-a mezinan19,20,21,22 re hevber bikin, me rêbaza entegrasyona daneyên cotkirî bikar anî. Me herikîna xebatê ya normalîzekirina SCTransform (v2) di Seurat de bikar anî da ku hevberdanên komê di navbera komên daneyan de entegre bikin û bidin ber hev (bi karanîna heman parametreyên wekî jorîn). Ji bo karîgeriya hesabkirinê, komên daneyan ên takekesî bi awayekî rasthatî heta 500 şaneyan an navokan ji bo her komek orîjînal hatin dabeş kirin. Bi karanîna rêbazek mîna ya ku berê hatî vegotin, hevberdana komê wekî rêjeya şaneyan an navokên di her komek komkirî de ku bi etîketa koma referansê re hevber bûn hate destnîşankirin. Ji bo bêtir dabeşkirina GluN-an, me herikîna xebatê ya TransferData ya Seurat ji bo daneyên binkoma GluN bikar anî da ku etîketên komên daneyan ên referansê li şaneyên me yên GluN bidin.
Ji bo nirxandina rewşa gihîştina transkrîptoma gerdûnî ya nimûneyên t-hCO û hCO, me nimûneyên xwe yên pseudo-bulk bi BrainSpan/psychENCODE23 re berhev kirin, ku ji rêzek RNA ya mezin pêk tê ku pêşveçûna mêjiyê mirovan vedihewîne. Me PCA li ser matrîksa îfadeya genê ya bi şêwaza normalîzekirî ya hevbeş ji nimûneyên kortîkal 10 hefte piştî ducaniyê û paşê, di 5567 genan de (tevî daneyên me) pêk anî ku berê di nimûneyên kortîkal ên BrainSpan de wekî çalak hatine nas kirin (wekî ku ji% 50 mezintir di guherîna pêşveçûnê de bi temenê ve bi karanîna modelek kubîk ve hatî rave kirin)38. Wekî din, me genên ku bi îmzeyên transkrîptoma sereke yên pêşkeftina neuro ve girêdayî ne bi karanîna faktorîzasyona matrîksa ne-neyînî wekî ku berê hatî vegotin derxist. Giraniyên nimûneyê yên ku bi karanîna prosedûra faktorîzasyona matrîksa ne-neyînî hatine hesibandin di Şekil 5b de bi daneyên berfireh ji bo her yek ji pênc îmzeyên ku ji hêla Zhu et al. ve hatine vegotin têne xêz kirin.38 Dîsa, nîşankerên transkrîpsiyonê yên girêdayî çalakiyê ji lêkolînên berê hatine weşandin hatine derxistin. Bi taybetî, ERG û LRG di neuronên glutamaterjîk de ku ji hêla berhevkirina snRNA-seq ya korteksa dîtbarî ya mişk ve piştî teşwîqkirina dîtbarî ji Tabloya Pêvek 3 Hrvatin et al.16 ve hatine destnîşankirin, bi girîngî zêde bûn. LRG-yên dewlemendkirî yên mirovan ji kulturên mêjiyê fetusê yên mirovan ên bi KCl-çalakkirî hatin bidestxistin û 6 demjimêr piştî teşwîqkirinê hatin berhevkirin, û genên fîltrekirî di mirovan de bi girîngî zêde bûn lê di rovîyan de ne (Tabloya Pêvek 4). Analîza dewlemendkirina seta genan bi karanîna van setên genan bi karanîna testa rast a Fisher a yek-alî hate kirin.
Mişkan bi îzofluranê bêhiş bikin, mêjî derxînin û ji bo beşên ku tê de hene, di çareseriya sar (nêzîkî 4°C) ya oksîjenkirî (95% O2 û 5% CO2) de bi cih bikin: 234 mM sûkroz, 11 mM glukoz, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 û 0.5 mM CaCl2 (nêzîkî 310 mOsm). Beşên koronal ên mêjiyê mişkan (300-400 µm) ku t-hCO dihewînin, bi karanîna vibratoma Leica VT1200 wekî ku berê hatiye vegotin hatine çêkirin39. Piştre beş bi kêmî ve 45 deqîqe berî tomarkirinê bi oksîjenasyona domdar a germahiya odeyê hatin veguhastin bo odeyeke beşkirinê ku tê de aCSF ji van pêkhateyan hatibû amadekirin: 10 mM glukoz, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 û 126 mM NaCl (298 mOsm). Beş di odeyeke binavbûyî de hatin tomarkirin ku li wir bi berdewamî bi aCSF (şûşeya 95% O2 û 5% CO2) hatin perfuzkirin. Hemû dane di germahiya odeyê de hatin tomarkirin. Nêronên t-hCO bi pîpeteke cama borosîlîkat a ku bi çareseriyeke ku tê de 127 mM glukonatê potasyûm, 8 mM NaCl, 4 mM magnezyûm ATP, 0.3 mM sodyûm GTP, 10 mM HEPES, û 0.6 mM EGTA, pH 7.2, çareseriya navxweyî bi KOH (290 mOsm) hatibû rastkirin, tijî bû, hatin bidawîkirin. Ji bo başbûnê, biosîtîn (%0.2) li çareseriya tomarkirinê hate zêdekirin.
Daneyên bi karanîna amplîfîkatorek MultiClamp 700B (Molecular Devices) û dîjîtalîzatorek Digidata 1550B (Molecular Devices) hatin bidestxistin, bi fîltrekirina frekansên nizm li 2 kHz hatin fîltrekirin, li 20 kHz hatin dîjîtalîzekirin, û bi karanîna Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). û fonksiyonên MATLAB-ê yên xwerû (Mathworks) hatin analîzkirin. Potansiyela girêdanê bi karanîna JPCalc hate hesabkirin û tomar li gorî nirxa hesabkirî ya -14 mV hatin sererastkirin. Operasyona IV ji rêze gavên niha di gavên 10-25 pA de, ji -250 heta 750 pA pêk tê.
Talamus, madeya spî, û aferentên S1 di dema tomarkirina patch-clamp a neuronên hCO3 de, wekî ku berê hatiye vegotin, di perçeyên talamokortîkî de bi elektrîkî hatin teşwîqkirin. Bi kurtasî, mejî li ser maseyeke çapkirina 3D ya ku bi goşeyek 10° ve hatiye xwar kirin, hate danîn, û pêşiya mejî bi goşeyek 35° hate birîn. Piştre mejî bi rûyê birîn ve hate zeliqandin û perçe kirin, aksonên derketî yên talamokortîkî hatin parastin. Elektrodên tungsten ên duqutbî (0.5 MΩ) li ser mîkromanipulatorek duyemîn hatin siwarkirin û bi stratejîkî hatin bicihkirin da ku çar herêmên her şaneyê teşwîq bikin (kapsulê hundurîn, madeya spî, S1 û hCO3). Bersivên sînaptîk piştî teşwîqkirina fazîkî ya 300 µA li 0.03–0.1 Hz tomar bikin.
Nêronên hCO yên ku hChR2-ê îfade dikin di 480 nm de hatin çalak kirin û pulsên ronahiyê yên ku ji hêla LED (Prizmatix) ve hatine çêkirin bi rêya objektîfek ×40 (0.9 NA; Olympus) hatin sepandin da ku îfadeya hChR2 li nêzî şaneyan tomar bikin. Qûtra qada ronîkirî bi qasî 0.5 mm ye û hêza giştî 10-20 mW ye. Firehiya pulsê li 10 ms hate danîn, ku bi pulsa ku di dema ceribandina fêrbûna tevgerî de hatî dayîn re têkildar e. Frekansên teşwîqê yên cûrbecûr hatin bikar anîn, ji 1 heta 20 Hz, lê tenê pulsa yekem a rêzeyê ji bo hejmartinê hate bikar anîn. Navberên di navbera trênan de bi gelemperî ji 30 saniyeyan dirêjtir in da ku bandora li ser rêyên astengker an hêsanker ên sînaptîk kêm bikin. Ji bo ceribandina ka bersiva hChR2 monosînaptîk bû, me TTX (1 μM) li serşokê heta ku reaksiyona EPSC winda bû, û dûv re 4-aminopîrîdîn (4-AP; 100 μM) hate sepandin. Bi gelemperî, bersivek di nav çend hûrdeman de tê vegerandin, bi derengketinek hinekî dirêjtir di navbera pêxistina LED û çêkirina EPSC de. NBQX (10 μM) hate bikar anîn da ku were ceribandin ka bersiv ji hêla wergirên AMPA ve tê rêvebirin an na.
Beşên hCO yên tûj wekî ku berê hatiye vegotin hatin çêkirin. Bi kurtasî, beşên hCO di nav agarozê ya %4 de hatin bicihkirin û veguheztin şaneyên ku tê de 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 û 10 mM d-(+)-glukoz hebûn. Beş di germahiya odeyê de bi karanîna vibratorek Leica VT1200 di 200-300 µm de hatin birîn û di germahiya odeyê de di ASF de hatin hilanîn. Piştre, tomarkirina patch-camp a tevahiya şaneyan li ser beşên hCO di bin mîkroskopa rasterast SliceScope (Scientifica) de hate kirin. Beş bi aCSF (%95 O2 û% 5 CO2) hatin perfuzkirin û sînyalên şaneyan di germahiya odeyê de hatin tomar kirin. Nêronên hCO bi karanîna pîpeteke cama borosîlîkat a ku bi çareseriyeke tijîkirî ya ku 127 mM glukonatê potasyûm, 8 mM NaCl, 4 mM magnezyûm ATP, 0.3 mM sodyûm GTP, 10 mM HEPES, û 0.6 mM EGTA, pH-ya navxweyî 7, 2, bi KOH (osmolarîteya 290) ve hatîye sererastkirin, hatin sepandin. Ji bo armancên vejandinê, %0.2 Biosîtîn li çareseriya navxweyî zêde bikin.
Daneyên ji hêla Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ve bi karanîna amplîfîkatorek MultiClamp 700B (Molecular Devices) û dîjîtalîzatorek Digidata 1550B (Molecular Devices) hatin bidestxistin, bi fîltrekirina frekansên nizm li 2 kHz hatin fîltrekirin, li 20 kHz hatin dîjîtalîzekirin, û bi karanîna Clampfit (guhertoya 10.6) ji bo analîzê, cîhazên molekulî) û fonksiyonên MATLAB-ê yên xwerû (MATLAB 2019b, Mathworks) hatin analîzkirin. Potansiyela girêdanê bi karanîna JPCalc hate hesabkirin û tomar li gorî potansiyela girêdanê ya hesabkirî ya -14 mV hatin sererastkirin. Operasyona IV ji rêze gavên niha di gavên 5-10 pA de ji -50 heta 250 pA pêk tê.
Ji bo ji nû ve avakirina morfolojîk a neuronên tengkirî, %0.2 bîosîtîn (Sigma-Aldrich) li çareseriya navxweyî hate zêdekirin. Xane piştî şikandinê herî kêm 15 deqîqeyan têne amadekirin. Dûv re pîpet hêdî hêdî ji bo 1-2 deqîqeyan tê kişandin heta ku parzûna qeydkirî bi tevahî were morkirin. Piştî prosedurên fîzyolojiya beşê, beş şevekê di 4°C de di %4 PFA de hatin sabît kirin, bi PBS X3 hatin şuştin, û bi DyLight 549 an DyLight 405 (Vector Labs) a bi streptavidin ve girêdayî 1:1000 hatin şilkirin. Xaneyên ku bi bîosîtîn (%2; Sigma-Aldrich) tijî bûn di dema tomarkirina klampa patchê de di germahiya odeyê de ji bo 2 saetan hatin nîşankirin. Dûv re beş bi karanîna Aquamount (Thermo Scientific) li ser slaytên mîkroskopê hatin siwarkirin û roja din li ser mîkroskopa konfokal a Leica TCS SP8 bi karanîna objektîfek rûnê bi vebûna hejmarî ×40 1.3, mezinkirin ×0.9–1.0, xy hatin xuyang kirin. Rêjeya nimûnegirtinê bi qasî 7 pîksel di her mîkronê de ye. Z-stack bi navberên 1 µm bi rêzê hatin bidestxistin, û mozaîkên z-stack û dirûtina otomatîk a li ser bingeha Leica hatin kirin da ku tevahiya dara dendrîtîk a her neuronê were nixumandin. Piştre neuron bi karanîna navrûya neuTube 40 nîv-destî hatin şopandin û pelên SWC hatin çêkirin. Dûv re pel li pêveka SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, guhertoya 2.1.0; NIH) hatin barkirin.
Li gorî protokoleke ku ji aliyê Lijneya Nirxandina Sazûmanî ya Zanîngeha Stanford ve hatiye pejirandin, tevnên korteksa mirovan bi razîbûna agahdar hatine wergirtin. Du nimûneyên tevnên piştî zayînê yên mirovan (3 û 18 salî) bi rezeksiyona korteksa pêşîn (gyrusa pêşîn a navîn) wekî beşek ji emeliyata epîlepsiya berxwedêr hatine wergirtin. Piştî rezeksiyonê, tevn di NMDG-aCSF-ya sar de hatine berhevkirin ku tê de hene: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukoz, 2 mM thiourea, 5 mM sodyûm askorbat, 3 mM sodyûm pîruvat, 0.5 mM CaCl2 4H2O û 10 mM MgSO4 7H2O. Bi asîda hîdroklorîk a konsantrekirî heta pH 7.3-7.4 tîtrat bikin. Tevn di nav 30 hûrdeman de radestî laboratûarê hatine kirin û beşên koronal li gorî prosedûra ku li jor hatî vegotin hatine girtin.
Hemû prosedurên heywanan li gorî rêbernameyên lênêrîna heywanan ên ku ji hêla Zanîngeha Stanford APLAC ve hatine pejirandin, hatin kirin. Mişk (piştî veguheztinê ji 140 rojan zêdetir) bi anesteziya 5% îzoflurane hatin teşwîqkirin û di nav emeliyatê de bi 1-3% îzoflurane hatin anestezkirin. Heywan di çarçoveyek stereotaksîk (Kopf) de hatin danîn û buprenorfîn (SR) bi berdana domdar di bin çerm de hat derzîkirin. Serê serî hat eşkerekirin, paqijkirin û 3-5 pêçên hestî hatin danîn. Ji bo hedefgirtina t-hCO3, me ji wêneyên MRI koordînatên stereotaksîk çêkirin. Li cihê balkêş qulikek burr hat kolandin û fîber (bi qutra 400 µm, NA 0.48, Doric) 100 µm li binê rûyê hCO3 hatin daxistin û bi çîmentoya diranan a ku bi UV-ê tê dermankirin (Relyx) bi ser serê serî ve hatin girêdan.
Tomarkirinên fotometrîk ên fîberê wekî ku berê hatiye vegotin hatin kirin42. Ji bo tomarkirina çalakiya xweber, mişk di qefeseke paqij de hatin danîn û kabloyeke patch a fîber optîk a bi qûtra 400 µm (Doric) ku bi pergala bidestxistina daneyên fotometrîk ên fîber optîk ve girêdayî ye, bi kabloya fîber optîk a çandinî ve hate girêdan. Di dema tomarkirina çalakiya motorê ya 10 hûrdeman de, ajal azad bûn ku qefesê bigerin. Ji bo tomarkirina çalakiya ku hatiye çêkirin, mişk (zêdetirî 140 rojan piştî çandinê) bi 5% îzoflurane ji bo destpêkirinê û 1-3% îzoflurane ji bo parastinê hatin anestezkirin. Ajalê di çarçoveyek stereotaktîk (Kopf) de bi cîh bikin û mûyên li aliyê dijberî yê t-hCO3 heta bi qasî 2 cm têne qutkirin û di nav toreke ku bi aktûatorek pîezoelektrîkî (PI) ve girêdayî ye re derbas dibin. Kabloyeke patch a fîber optîk a 400 µm (Doric) bi fîbera çandinî ve hate girêdan û bi pergala bidestxistina daneyan ve hate girêdan. Paşê mûyên li aliyê dijberî yê t-hCO3 50 caran (2 mm li 20 Hz, 2 s ji bo her pêşkêşkirinê) di demên rasthatî de ji hêla ajokerek pîezoelektrîkî ve di heyamek tomarkirinê ya 20 hûrdeman de hatin xwar kirin. Pakêta Piştgiriya Arduino MATLAB bikar bînin da ku dema xwarbûnê bi koda MATLAB-a xwerû kontrol bikin. Bûyer bi karanîna pulsên mantiqa tranzîstor-tranzîstor (TTL) bi nermalava bidestxistina daneyan re têne senkronîze kirin.
Mişk (zêdetirî 140 roj piştî veguheztinê) bi anesteziya 5% îzofluranê hatin çalakirin û di dema emeliyatê de bi 1-3% îzofluranê hatin anestezkirin. Heywan di çarçoveyek stereotaksîk (Kopf) de hatin danîn û buprenorphine SR û dexamethasone di bin çerm de hatin derzîkirin. Qoq tê eşkerekirin, paqijkirin û 3-5 pêçên hestî têne danîn. Ji bo hedefgirtina t-hCO, me ji wêneyên MRI koordînatên stereotaksîk çêkirin. Kranîotomiyek dorhêl (bi qasî 1 cm di qutr) de bi makîneyek qulkirina bilez rasterast li ser hCO ya veguheztî hate kirin. Dema ku hestî bi qasî ku pêkan zirav be, lê berî ku tevahiya hestiyê qul bikin, bi karanîna forceps dîska pelvîk a mayî ya saxlem derxînin da ku t-hCO ya bingehîn were eşkere kirin. Kranîotomî bi şorba sterîl hate dagirtin, û pêçek û pinek serê taybetî bi çîmentoya diranan a bi UV-saxlemkirî (Relyx) li qoqê hatin girêdan.
Wênekêşiya du-fotonî bi mîkroskopa pirfotonî ya Bruker bi objektîfa Nikon LWD (×16, 0.8 NA) hate kirin. Wênekêşiya GCaMP6 li 920 nm bi mezinkirina yekane ya plana z-yê ya 1.4x û navînî 8x 7.5 fps hate kirin. Mişk bi anesteziya 5% îzoflurane hatin teşwîqkirin û bi 1-3% îzoflurane hatin parastin. Mişk di nav amûrek serî ya xwerû de hatin danîn û di bin lensê de hatin bicihkirin. Tomarkirinek paşîn a 3-deqeyî ya çalakiya motorê hate bidestxistin. Di nav 20 deqeyan de tomarkirinê, 50 puff (her pêşkêşkirinek 100 ms dirêj) bi awayekî rasthatî bi karanîna picospricer li ser balîfa musketê ya li hember t-hCO3 hatin şandin. Pakêta Piştgiriya Arduino MATLAB bikar bînin da ku dema teqînê bi koda MATLAB-a xwerû kontrol bikin. Bûyeran bi nermalava bidestxistina daneyan (PrairieView 5.5) bi karanîna pulsên TTL senkronîze bikin. Ji bo analîzê, wêne ji bo tevgera xy bi karanîna rastkirina affine di bernameya MoCo de ku li Fîjiyê hate destpêkirin hatin rastkirin. Derxistina şopên fluoresansê ji şaneyên takekesî bi karanîna CNMF-E43. Fluoresans ji bo her herêma balkêş hate derxistin, veguherî xêzên dF/F, û dûv re veguherî z-score.
Mişk (piştî veguheztinê zêdetirî 140 rojan) bi anesteziya 5% îzofluranê hatin çalakirin û di dema emeliyatê de bi 1-3% îzofluranê hatin anestezkirin. Heywan di çarçoveyek stereotaksîk (Kopf) de hatin danîn û buprenorphine SR û dexamethasone bi awayekî binçerm hatin derzîkirin. Qûçikên li aliyê dijberî yê t-hCO3 heta bi qasî 2 cm hatin birîn û bi toreke ku bi aktûatorek pîezoelektrîkî ve girêdayî ye ve hatin derbaskirin. Qoq tê eşkerekirin û paqijkirin. Vîdeyek erdê ya ji pola zengarnegir bi qoqê ve tê girêdan. Ji bo hedefgirtina t-hCO3, me ji wêneyên MRI koordînatên stereotaksîk çêkirin. Bi makîneyeke qulkirinê ya bilez, li jor t-hCO3, kraniotomiyek dorhêlî (bi qasî 1 cm di qûtra de) pêk bînin. Dema ku hestî bi qasî ku pêkan zirav be, lê berî ku tevahiya hestiyê qul bikin, bi darê zorê dîska pelvisê ya saxlem a mayî derxînin da ku t-hCO3 ya binî eşkere bikin. Hucreyên ferdî bi karanîna sondajên silîkonê yên densiteya bilind ên 32-kanal an 64-kanal (Cambridge Neurotech) ên ku bi pêçên erdê ve hatine erdîkirin û bi amplîfîkatorên RHD (Intan) pêş-zêdekirî hatine tomar kirin. Manîpulator bikar bînin da ku elektrodan bi rêya kraniotomiyê, ku bi şorba sterîl tijî ye, daxin cihê hedef. Berhevkirina daneyan bi frekanseke 30 kHz bi karanîna pergala bidestxistina daneyan a Open Ephys hate kirin. Tomarkirin tenê dema ku me çalakiya xweber a rîtmîk a pir têkildar di zêdetirî 10 kanalan de tespît kir berdewam kir, ku ev yek nîşan dide ku elektrod di nav şaneyê de ne (li gorî daneyên wênekirina kalsiyûmê yên du-foton). Tomarkirinek paşîn a 10-deqîqeyî ya çalakiya motorê hate bidestxistin. Dûv re mûyên li aliyê dijberî yê t-hCO3 50 caran (2 mm li 20 Hz, 2 s ji bo her pêşkêşkirinê) di demên rasthatî de ji hêla ajokerek pîezoelektrîkî ve di heyamek tomarkirinê ya 20 deqeyî de hatin xwar kirin. Bi karanîna Pakêta Piştgiriya MATLAB ji bo Arduino (MATLAB 2019b), dema xwarbûnê bi koda MATLAB-a xwerû kontrol bikin. Ji bo senkronîzekirina bûyeran bi nermalava berhevkirina daneyan re, pulsên TTL bikar bînin.
Ji bo ceribandinên nîşankirina optîkî, kordonek patch optîkî ya 200 µm (Doric) ku bi lazerek 473 nm (Omicron) ve girêdayî ye, bi fîberek optîkî ya 200 µm ve li ser kraniotomiyê hatî danîn ve hate girêdan. Yekser berî vê, hêza jumperê li ser 20 mW rast bikin. Manîpulatorê bikar bînin da ku elektrodan bi riya kraniotomiyê, ku bi şorbeya sterîl tije ye, daxin cihê hedef. Di destpêka tomarkirinê de, deh pulsên ronahiyê yên 473 nm (frekans 2 Hz, dema pulsê 10 ms) hatin weşandin. Hucreyên hestiyar ên foton wekî hucreyên ku di 70% an jî zêdetir ceribandinan de di nav 10 ms ronahiyê de bersivek tûj nîşan dan, hatin pênasekirin.