Spas ji bo serdana Nature.com.Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgirîya CSS-ê sînordar e.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgirîya domdar, em ê malperê bê şêwaz û JavaScript pêşkêş bikin.
Biopsiya Liquid (LB) têgehek e ku di warê biyobijîkkî de zû populer dibe.Têgeh bi gelemperî li ser tespîtkirina perçeyên DNA-ya derveyî hucreyî (ccfDNA) ye ku bi gelemperî wekî perçeyên piçûk piştî mirina hucreyê di tevnên cihêreng de têne berdan.Beşek piçûk a van perçeyan ji tevn an jî organîzmayên biyanî (biyanî) çêdibe.Di xebata heyî de, me ev têgeh li midyayan, celebek senînel ku bi kapasîteya xweya bilind a parzûna ava deryayê tê zanîn, sepandiye.Em şiyana midyan bikar tînin ku wekî parzûnên xwezayî tevbigerin da ku perçeyên DNA yên hawîrdorê ji cûrbecûr çavkaniyan bigirin da ku agahdarî li ser cihêrengiya biyolojîk a ekosîstemên deryayî yên deryayî peyda bikin.Encamên me destnîşan dikin ku hemolîmfa mîdyayê perçeyên DNA yên ku bi mezinahîya wan pir diguhere, ji 1 heta 5 kb dihewîne.Rêzkirina guleyan nîşan da ku hejmareke mezin ji perçeyên DNA-yê bi eslê xwe mîkrobîkî biyanî ne.Di nav wan de, me perçeyên DNA yên ji bakterî, arkea û vîrusan, di nav de vîrusên ku têne zanîn ku cûrbecûr mêvandarên ku bi gelemperî di ekosîstemên deryaya deryayî de têne dîtin vegirtin, dîtin.Di encamnameyê de, lêkolîna me destnîşan dike ku têgeha LB-ya ku li midyalan tê sepandin çavkaniyek zanyarî ya dewlemend lê hîna hîn nenaskirî di derheqê cihêrengiya mîkrobîkî de di ekosîstemên deryayî yên deryayî de temsîl dike.
Bandora guherîna avhewa (CC) li ser pirrengiya biyolojîk a ekosîstemên deryayî herêmek lêkolînê ya ku bi lez zêde dibe ye.Germbûna gerdûnî ne tenê dibe sedema stresên girîng ên fîzyolojîkî, lê di heman demê de sînorên evolûsî yên aramiya germî ya organîzmayên deryayî jî dihêle, bandorê li jîngeha hejmarek celeban dike, û wan dihêle ku li şert û mercên xweştir bigerin [1, 2].Digel ku bandorê li cihêrengiya biyolojîkî ya metazoan dike, CC hevsengiya nazik a danûstendinên mêvandar-mikrobial têk dide.Ev dysbacteriosis mîkrob ji bo ekosîstemên deryayî metirsiyek ciddî çêdike ji ber ku ew organîzmayên deryayî ji pathogenên enfeksiyonê re mexdûrtir dike [3, 4].Tê bawer kirin ku SS di mirinên girseyî de rolek girîng dileyze, ku ev pirsgirêkek cidî ye ji bo birêvebirina ekosîstemên deryayî yên gerdûnî [5, 6].Ev pirsgirêkek girîng e ku ji ber bandorên aborî, ekolojîk û xwarinê yên gelek celebên deryayê hene.Ev bi taybetî ji bo bivalvesên ku li herêmên polar dijîn rast e, ku bandorên CK-ê bileztir û girantir in [6, 7].Di rastiyê de, bivalves wek Mytilus spp.bi berfirehî ji bo şopandina bandorên CC li ser ekosîstemên deryayî têne bikar anîn.Ne ecêb e, hejmareke nisbeten mezin ji biyomarkeran hatine pêşve xistin da ku tenduristiya wan bişopînin, bi gelemperî nêzîkatiyek du-ast tê bikar anîn ku bi biomarkerên fonksiyonel li ser bingeha çalakiya enzîmatîk an fonksiyonên hucreyî yên wekî zindîbûna hucreyê û çalakiya fagosîtîkî [8] bikar tînin.Van rêbazan di heman demê de pîvandina hûrbûna nîşaneyên zexta taybetî yên ku piştî girtina mîqdarên mezin ên ava deryayê di nav tevnên nerm de kom dibin jî vedihewîne.Lêbelê, kapasîteya bilind a filtrasyonê û pergala gerîdeya nîv-vekirî ya bivalves fersendek peyda dike ku biyomarkerên nû yên hemolymph bi karanîna têgîna biopsiya şil (LB), nêzîkatiyek hêsan û hindiktirîn dagîrker ji rêveberiya nexweş re peyda bike.nimûneyên xwînê [9, 10].Her çend çend celeb molekulên gerokî dikarin di LB-ya mirovî de werin dîtin, ev têgeh di serî de li ser bingeha analîza rêzgirtina DNA ya perçeyên DNA-ya derveyî hucreyî (ccfDNA) di plazmayê de ye.Di rastiyê de, hebûna DNA ya di plazmaya mirovî de ji nîvê sedsala 20-an ve tê zanîn [11], lê tenê di van salên dawî de ye ku hatina rêgezên rêzgirtinê yên berbelav bûye sedema tespîtkirina klînîkî ya li ser bingeha ccfDNA.Hebûna van perçeyên ADNyê yên di gerokê de beşek ji serbestberdana pasîf a DNAya genomîk (nukleer û mîtokondrî) piştî mirina şaneyê ye. Di mirovên saxlem de, giraniya ccfDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng / mL) lê di nexweşên ku ji patholojiyên cihêreng diêşin an jî di bin stresê de ne, dikare 5-10 carî zêde bibe, û di encamê de zirara tevnê çêdibe. Di mirovên saxlem de, giraniya ccfDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng / mL) lê di nexweşên ku ji patholojiyên cihêreng diêşin an jî di bin stresê de ne, dikare 5-10 carî zêde bibe, û di encamê de zirara tevnê çêdibe. Во норме ниская (<10 ng/ml), lê dikare di 5–10 de bolьnыh bi различной патологией или подвергающихся стрессу, приводаврщенйнему. Di mirovên saxlem de, giraniya cccDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng / mL), lê di nexweşên bi patholojiyên cihêreng de an di bin stresê de ku dibe sedema zirara tevneyê ew dikare 5-10 carî zêde bibe.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承口各种病理或承加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损 伤Navendên ccfDNA kêm kêm (<10 ng/ml) li lûtkeyê ne, lê dibe ku di 5-10-ê de li ser nexweşiyên nexweşî an stresê, ku ev yek dikare were xuyang kirin. Girêdanên ccfDNA bi gelemperî di mirovên saxlem de kêm in (<10 ng / ml), lê di nexweşên bi patholojiyên cihêreng an stresê de 5-10 qat zêde dibe, û di encamê de zirara tevnê çêdibe.Mezinahiya perçeyên ccfDNA pir diguhere, lê bi gelemperî ji 150 heta 200 bp diguhere.[12].Analîzkirina ccfDNA-ya xwe-derketî, ango, ccfDNA ji hucreyên mêvandar ên normal an veguherî, dikare were bikar anîn da ku guhartinên genetîkî û epigenetîk ên di genoma nukleerî û/an mîtokondrî de hene, bi vî rengî ji bijîjkan re bibe alîkar ku dermanên taybetî yên molekuler-armanc hilbijêrin [13] .Lêbelê, ccfDNA dikare ji çavkaniyên biyanî yên wekî ccfDNA ji hucreyên fetal ên di dema ducaniyê de an ji organên veguheztin [14,15,16,17] were bidestxistin.ccfDNA di heman demê de çavkaniyek girîng a agahdariyê ye ji bo tesbîtkirina hebûna asîdên nukleî yên ajanek enfeksiyonê (biyanî), ku destûrê dide teşxîskirina ne-dagirker a enfeksiyonên berbelav ên ku ji hêla çandên xwînê ve nehatine nas kirin, ji biopsiya dagirker a tevna vegirtî [18].Lêkolînên dawîn bi rastî destnîşan kir ku xwîna mirovan çavkaniyek dewlemend a agahdariyê heye ku dikare were bikar anîn da ku pathogenên vîrus û bakterî nas bike, û ku ji sedî 1% ji ccfDNA ya ku di plazmaya mirovan de tê dîtin bi eslê xwe biyanî ye [19].Van lêkolînan destnîşan dikin ku cûrbecûrbûna biyolojîk a mîkrobiomê ya zirav a organîzmê dikare bi karanîna analîza ccfDNA were nirxandin.Lêbelê, heya van demên dawî, ev têgeh bi taybetî di mirovan de û, bi rêjeyek hindik, di vertebrên din de hate bikar anîn [20, 21].
Di gotara heyî de, em potansiyela LB bikar tînin da ku ccfDNA ya Aulacomya atra, celebek başûrî ku bi gelemperî li Giravên Kerguelen ên subantarktîk tê dîtin, bikar bînin, komek giravan li ser deştek mezin a ku 35 mîlyon sal berê ava bûye.teqîna volkanîk.Bi karanîna pergalek ceribandinê ya in vitro, me dît ku perçeyên DNA yên di ava deryayê de zû ji hêla midiyan ve têne girtin û dikevin beşa hemolymph.Rêzkirina çekan destnîşan kir ku ccfDNA hemolîmpeya midyayê perçeyên DNA yên bi eslê xwe û ne-xwe dihewîne, di nav de bakteriyên sîmbiotîk û perçeyên DNA yên ji biyomên tîpîk ên ekosîstemên deryayî yên volkanîkî yên sar.Hemolymph ccfDNA di heman demê de rêzikên vîrusê yên ku ji vîrusên bi rêzikên mêvandar ên cihêreng têne girtin jî dihewîne.Her wiha me perçeyên DNA yên ji heywanên pirşaneyî yên wekî masiyên hestî, anemonên deryayê, alga û kêzikan jî dîtin.Di encamnameyê de, lêkolîna me destnîşan dike ku têgeha LB dikare bi serfirazî li ser bêwergirên deryayî were sepandin da ku di ekosîstemên deryayî de repertuarek genomîkî ya dewlemend çêbike.
Kesên mezin (55-70 mm dirêj) Mytilus platensis (M. platensis) û Aulacomya atra (A. atra) ji peravên zinarî yên intertidal ên Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .) hatin berhev kirin.Giravên Kerguelen di Kanûna 2018an de. Mîdyeyên din ên şîn ên mezinan (Mytilus spp.) ji dabînkerek bazirganî (PEI Mussel King Inc., Girava Prince Edward, Kanada) hatin wergirtin û li tankek hewayê ya bi germahîya kontrolkirî (4°C) ku tê de 10-20 lître 32‰ şêlimek çêkirî tê de hatin danîn.(Xwêya deryayê ya çêkirî Reef Crystal, Okyanûsa Instant, Virginia, USA).Ji bo her ceribandinê, dirêjî û giraniya şêlên kesane hate pîvandin.
Protokolek gihîştina vekirî ya belaş ji bo vê bernameyê bi serhêl heye (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Bi kurtasî, hemolymph LB ji masûlkeyên abductor wekî ku hatî destnîşan kirin hate berhev kirin [22].Hemolymph bi santrîfujasyonê li 1200 × g ji bo 3 hûrdeman hate zelal kirin, supernatant hate cemidandin (-20 ° C) heya ku were bikar anîn.Ji bo veqetandin û paqijkirina cfDNA, nimûneyên (1.5-2.0 ml) hatin helandin û bi karanîna kîteya cfDNA ya NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) li gorî rêwerzên çêker hatin hilanîn.ccfDNA heta analîzek din li -80°C hate hilanîn.Di hin ceribandinan de, ccfDNA bi karanîna QIAamp DNA Lêkolînerê Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) hate veqetandin û paqij kirin.ADN-ya paqijkirî bi karanîna pîvanek standard PicoGreen hate pîvandin.Dabeşkirina perçeya ccfDNA ya veqetandî bi elektroforezek kapîlar ve bi karanîna biyoanalyzerek Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) bi karanîna Kîteyek DNA ya bi Hesasiya Bilind ve hate analîz kirin.Vekolîn bi karanîna 1 μl ji nimûneya ccfDNA li gorî rêwerzên çêker hate kirin.
Ji bo rêzgirtina parçeyên hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pirtûkxaneyên gulebaranê bi karanîna kîta Illumina DNA Mix ya kîta Illumina MiSeq PE75 amade kir.Adapterek standard (BioO) hate bikar anîn.Pelên daneya xav ji Arşîva Xwendina Rêzeya NCBI (SRR8924808 û SRR8924809) hene.Kalîteya xwendina bingehîn bi karanîna FastQC [23] hate nirxandin.Trimmomatic [24] ji bo qutkirina adaptoran û xwendinên ne kalîte hatî bikar anîn.Xwendinên gulebaranê yên bi dawîyên hevgirtî FLASH di xwendinên yekta dirêjtir de bi hevgirtina herî kêm 20 bp hatin yek kirin da ku ji hevûdu dûr nekevin [25]. Xwendinên hevgirtî bi BLASTN re bi karanîna databasek NCBI Taxonomy ya bivalve (nirxa e < 1e−3 û 90% homolojî) hate şîrove kirin, û maskekirina rêzikên kêm-tevlihevî bi karanîna DUST [26] hate kirin. Xwendinên hevgirtî bi BLASTN re bi karanîna databasek NCBI Taxonomy ya bivalve (nirxa e < 1e−3 û 90% homolojî) hate şîrove kirin, û maskekirina rêzikên kêm-tevlihevî bi karanîna DUST [26] hate kirin. BLASTN bi alîkariya BLASTN-ê ji bo NCBI-ê ji bo NCBI-ê (rengdêriya e < 1e-3 û 90% hemû kêmasiyan) DUST [26]. Xwendinên hevgirtî bi BLASTN-ê bi karanîna databasa taksonomiya bivalve ya NCBI (nirxa e < 1e-3 û 90% homolojî) hate şîrove kirin, û bi karanîna DUST [26] maskeya rêza tevliheviya kêm hate kirin.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数 注释合并的读数低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 合并 读数复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩 ​​掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN bi bikaranîna taksonomicheskoy bazы dannыh dvuschatыh molluskov NCBI (значiya e <1e-3 û 90% ji bo kêmbûna nirxan), û tije bi DUST [26]. Xwendinên hevgirtî bi BLASTN-ê re bi karanîna databasa taksonomî ya NCBI-ya bivalve (nirxa e <1e-3 û 90% homolojî) hate şîrove kirin, û bi karanîna DUST [26] maskeya rêza tevliheviya kêm hate kirin.Xwendin li du koman hatin dabeş kirin: bi rêzikên bivalve ve girêdayî (li vir bi xwe-xwendî têne gotin) û negirêdayî (xwe-xwendî ne).Du kom ji hev cuda bi karanîna MEGAHIT ve hatin berhev kirin da ku konteng çêbikin [27].Di vê navberê de, belavkirina taksonomîkî ya xwendinên mîkrobioma biyanî bi karanîna Kraken2 [28] hate dabeşkirin û bi grafîkî ji hêla nexşeyek Krona pie li ser Galaxy [29, 30] ve hate destnîşan kirin.Ji azmûnên me yên pêşîn de kmers-59-a çêtirîn hate destnîşankirin. Dûv re guheztinên xwe ji hêla BLASTN-ê (danûstandina NCBI ya duvalve, e nirx < 1e−10 û 60% homolojî) ji bo annotasyonek dawîn hatin nas kirin. Dûv re guheztinên xwe ji hêla BLASTN-ê (danûstandina NCBI ya duvalve, e nirx < 1e−10 û 60% homolojî) ji bo annotasyonek dawîn hatin nas kirin. Têkiliyên xwedan berteka ji bo BLASTN-ê ve girêdayî ye (ji bo agahdariya nû ya NCBI-ê, girîngiya e <1e-10 û gemarî 60%) ji bo hişyariyê. Dûv re guheztinên xwe bi hevberdana li dijî BLASTN (Daneya danezana bivalve NCBI, nirxa <1e-10 û 60% homolojî) ji bo şîrovekirina dawîn hatin nas kirin.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来語菆别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Daxuyaniya ku ji hêla BLASTN-ê ve girêdayî ye (ji bo agahdariya NCBI ji bo nûvekirina nû, girîng e <1e-10% sal,% 6) heye. Dûv re ji bo annotasyona paşîn bi berhevkirina li dijî BLASTN (Database NCBI bivalve, e nirx <1e-10 û 60% homolojî) ve, xwe-girêdan hatin nas kirin. Digel vê yekê, girêvên koma ne-xwe bi BLASTN (danûstandinên nt NCBI, e nirx < 1e−10 û 60% homolojî) hatin şîrove kirin. Digel vê yekê, girêvên koma ne-xwe bi BLASTN (danûstandinên nt NCBI, e nirx < 1e−10 û 60% homolojî) hatin şîrove kirin. Parallely chugerodnыe grouppovыe contigi bыly annotirovanы with helping BLASTN (based data nt NCBI, wateya e <1e-10 û gemology 60%). Di paralelê de, girêkên koma biyanî bi BLASTN (danûstendeya NT NCBI, e nirx <1e-10 û 60% homolojî) hatin şîrove kirin.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Paralleke contigi, ne tê zanîn ku grûpek hevpar e, ji hêla BLASTN-ê ve girêdayî ye. Digel vê yekê, girêkên koma ne-xwe bi BLASTN (danûstandinên nt NCBI, e nirx <1e-10 û 60% homolojî) hatin şîrove kirin. BLASTX di heman demê de bi karanîna databasên NCBI proteîna nr û RefSeq (nirxa e < 1e−10 û 60% homolojî) li ser girêkên ne-xwe jî hate kirin. BLASTX di heman demê de bi karanîna databasên NCBI proteîna nr û RefSeq (nirxa e < 1e−10 û 60% homolojî) li ser girêkên ne-xwe jî hate kirin. BLASTX ev yek ji bo ku li ser nefermî ve tê vekolandin bi karanîna belka nr û RefSeq NCBI (navdêriya <1e-10 û gemolojî 60%). BLASTX di heman demê de bi karanîna databasên proteînên nr û RefSeq NCBI (nirxa e < 1e-10 û 60% homolojî) li ser girêkên ne-xwe jî hate kirin.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX bi tevahî li ser nefermî ye ku tê bikar anîn û ji bo belka nr û RefSeq NCBI tê bikaranîn (navdêra <1e-10 û gemolojî 60%). BLASTX di heman demê de bi karanîna databasên proteîna nr û RefSeq NCBI (nirxa e <1e-10 û 60% homolojî) li ser girêkên ne-xwe jî hate kirin.Hezên BLASTN û BLASTX yên ne-xwe-berhevokên dawîn temsîl dikin (binihêrin pelê Pêvek).
Destpêkên ku ji bo PCR têne bikar anîn di Tabloya S1 de têne navnîş kirin.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ji bo zêdekirina genên armancê ccfDNA hate bikar anîn.Mercên reaksiyonê yên jêrîn hatin bikar anîn: denaturasyon li 95 °C ji bo 3 hûrdem, 95 °C ji bo 1 hûrdem, germahiya lêdanê ji bo 1 hûrdem, dirêjkirin li 72 °C ji bo 1 hûrdeman, 35 dor û di dawiyê de 72 °C di nav 10 hûrdeman de..Berhemên PCR bi elektroforezê di gêlên agarose de (1.5%) ku tê de SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) li 95 V veqetandin.
Midye (Mytilus spp.) di 500 ml ava deryayê ya oksîjenkirî (32 PSU) de 24 saetan di 4°C de hatin aklimatîzekirin.Plasmîd DNAya ku tê de têxe rêzika cDNA ya galektîn-7 a mirovî (numreya gihîştina NCBI L07769) bi giraniya paşîn a 190 μg/μl li şûşê hate zêdekirin.Mideyên ku di heman şert û mercan de bêyî zêdekirina DNA'yê hatin inkubasyon kirin kontrol kirin.Di tanka kontrolê ya sêyemîn de ADN-ya bê midye hebû.Ji bo şopandina kalîteya DNA ya di ava deryayê de, nimûneyên ava deryayê (20 μl; sê dubarekirin) ji her tankê di dema destnîşankirî de hatin girtin.Ji bo şopandina DNA ya plasmidê, mîdeyên LB di demên destnîşankirî de hatin berhev kirin û ji hêla qPCR û ddPCR ve hatin analîz kirin.Ji ber naveroka xwê ya zêde ya ava deryayê, aliqut di nav ava kalîteya PCR de (1:10) berî hemî ceribandinên PCR-ê hatin rijandin.
PCR dilopek dîjîtal (ddPCR) bi karanîna protokola BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada) hate kirin.Ji bo destnîşankirina germahiya optimum profîla germahiyê bikar bînin (Table S1).Drop bi karanîna jeneratorek dakêşanê ya QX200 (BioRad) hatin çêkirin.ddPCR bi vî awayî hate kirin: 95°C ji bo 5 hûrdem, 50 çerxên 95°C ji bo 30 s û germahiyek lêdanê ya diyarkirî ji bo 1 hûrdeman û 72 °C ji bo 30 s, 4 °C ji bo 5 hûrdeman û 90 °C di nav 5 hûrdeman de.Hejmara dilopan û reaksiyonên erênî (hejmara kopiyan/µl) bi karanîna xwendevanek dilopek QX200 (BioRad) hate pîvandin.Nimûneyên bi kêmtirî 10,000 dilopan hatin red kirin.Her gava ku ddPCR hate xebitandin, kontrolkirina nimûneyê nehat kirin.
qPCR bi karanîna Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Awistralya) û LGALS7 primerên taybetî hate kirin.Hemî PCR-yên mîqdar di 20 µl de bi karanîna Kîteya PCR Kesk a QuantiFast SYBR (QIAGEN) hatin kirin.qPCR bi inkubasyonek 15 hûrdemî li 95°C dest pê kir û dûv re 40 dewran li 95°C ji bo 10 çirkeyan û li 60°C ji bo 60 çirkeyan bi berhevkirina yek daneyê.Kevirên helandinê bi karanîna pîvandinên li dû hev li 95°C ji bo 5 s, 65°C ji bo 60 s, û 97°C di dawiya qPCR de hatin çêkirin.Her qPCR sê caran hate kirin, ji bilî nimûneyên kontrolê.
Ji ber ku midye bi rêjeya xweya fîltrekirinê ya bilind têne zanîn, me pêşî lêkolîn kir ka ew dikarin perçeyên DNA yên di ava deryayê de fîlter bikin û bihêlin.Di heman demê de me eleqedar kir ku gelo ev perçe di pergala wan a lîmfatîk a nîvvekirî de kom dibin.Me bi şopandina çarenûsa perçeyên DNA yên çareserker ên ku li tankên mîdeyên şîn hatine zêdekirin, ev pirsgirêk bi ezmûnî çareser kir.Ji bo hêsankirina şopandina perçeyên ADNyê, me ADNya plasmîdê ya biyanî (ne xwe) ku gena galektîn-7 a mirovî dihewîne, bikar anî.ddPCR perçeyên DNA yên plasmîdê di ava deryayê û midyan de dişopîne.Encamên me nîşan didin ku heke mîqdara perçeyên DNAyê di ava behrê de bi demê re (heta 7 rojan) di nebûna midyalan de bi domdarî bimîne, wê demê di hebûna midyan de ev ast hema hema bi tevahî di nav 8 demjimêran de winda dibe (Hêjîr. 1a,b).Parçeyên DNA yên exogenous bi hêsanî di nav 15 hûrdeman de di şilava intravalvular û hemolymph de hatin dîtin (Wêne. 1c).Van perçeyan hîna jî 4 demjimêran piştî xuyangkirinê dikarin werin tespît kirin.Ev çalakiya parzûnkirinê ya bi perçeyên DNA re bi çalakiya parzûnkirina bakterî û algayan re tê berhev kirin [31].Van encaman destnîşan dikin ku midye dikarin ADN-ya biyanî di beşên xwe yên şilî de fîltre bikin û kom bikin.
Girêdanên têkildar ên DNA-ya plazmidê ya di ava deryayê de di hebûna (A) an tunebûna (B) ya midyan de, bi ddPCR tê pîvandin.Di A-yê de, encam wekî sedî têne diyar kirin, ku sînorên qutiyan ji sedî 75-an û 25-an temsîl dikin.Kûpa logarîtmîkî ya birêkûpêk bi rengê sor tê xuyang kirin, û devera ku bi rengê gewr hatî siyakirin 95% navbera pêbaweriyê temsîl dike.Di B-yê de, xeta sor navînî û xeta şîn 95% navbera pêbaweriyê ya ji bo berhevdanê temsîl dike.C Kombûna ADNya plazmîdê di hemolînf û şilava valvular a midyan de di demên cûda de piştî lêzêdekirina ADNya plasmîdê.Encam wekî kopiyên bêkêmasî yên hatine tespît kirin / mL (± SE) têne pêşkêş kirin.
Dûv re, me eslê ccfDNA-yê di mideyên ku ji nivînên midyan ên li Giravên Kerguelen, komek giravên dûr a ku bandora antropogenîk a tixûbdar heye, hatine berhev kirin, lêkolîn kir.Ji bo vê armancê, cccDNA ji hemolymphên midyeyê bi rêbazên ku bi gelemperî ji bo paqijkirina cccDNA ya mirovî têne bikar anîn veqetandin û paqij kirin [32, 33].Me dît ku hûrgelên navînî yên hemolymph ccfDNA di mîdeyan de di mîkrogramên per ml hemolymph kêm de ne (li Tablo S2, Agahdariya Pêvek binêre).Ev rêza tansiyonan ji mirovên saxlem (nanogram kêm per milliliter) pir mezintir e, lê di rewşên kêm de, di nexweşên penceşêrê de, asta ccfDNA dikare bigihîje çend mîkrograman li her mililiter [34, 35].Analîzek belavkirina mezinahiya hemolymph ccfDNA destnîşan kir ku van perçeyan di mezinahiyê de pir cûda dibin, ji 1000 bp heya 1000 bp.heta 5000 bp (Hêjîrê 2).Encamên bi vî rengî bi karanîna Kîta Lêkolînê ya QIAamp-a-based silica hatin bidestxistin, rêbazek ku bi gelemperî di zanistiya dadrêsî de tê bikar anîn da ku bi lez DNA-ya genomîk ji nimûneyên DNA-ya nizm, tevî ccfDNA [36] veqetîne û paqij bike.
Nûnera elektroforegrama ccfDNA ya hemolymfê midye.Bi NucleoSnap Plasma Kit (jor) û QIAamp DNA Lêkolîner Kit ve hatî derxistin.B Pîvana kemanê ku belavkirina berhevokên hemolymph ccfDNA (± SE) di mîdeyan de nîşan dide.Xêzên reş û sor bi rêzê çerxa navîn û çarika yekem û sêyemîn temsîl dikin.
Nêzîkî 1% ji ccfDNA di mirov û prîmatan de çavkaniyek biyanî heye [21, 37].Ji ber pergala gera xwînê ya nîv-vekirî ya bivalves, ava deryayê ya dewlemend-mikrobial, û belavkirina mezinahiya ccfDNA midye, me hîpotez kir ku ccfDNA hemolymph midye dibe ku hewzek zengîn û cihêreng a DNAya mîkrobial hebe.Ji bo ceribandina vê hîpotezê, me hemolymph ccfDNA ji nimûneyên Aulacomya atra yên ku ji Giravên Kerguelen hatine berhev kirin rêz kir, ku ji 10 mîlyonî zêdetir xwendin, 97,6% ji wan kontrola kalîteyê derbas kir.Dûv re xwendin li gorî çavkaniyên xweser û ne-xwe bi karanîna databasên dubendî yên BLASTN û NCBI hatin dabeş kirin (Wêne. S1, Agahdariya Pêvek).
Di mirovan de, DNA hem navokî û hem jî mitokondrî dikare di nav xwînê de were berdan [38].Lêbelê, di lêkolîna heyî de, ne gengaz bû ku bi hûrgulî ADNya genomîkî ya navokî ya midiyan were ravekirin, ji ber ku genoma A. atra nehatiye rêzkirin an jî diyar kirin.Lêbelê, me bi karanîna pirtûkxaneya bivalve (Hêjî. S2, Agahdariya Pêvek) karîbû çend perçeyên ccfDNA yên eslê xwe nas bikin.Me her weha hebûna perçeyên ADN-ê yên bi eslê xwe bi zêdekirina PCR-ya rêberî ya wan genên A. atra yên ku hatine rêzkirin piştrast kir (Wêne. 3).Bi heman awayî, ji ber ku genoma mîtokondrî ya A. atra di databasên giştî de heye, mirov dikare delîlan ji bo hebûna perçeyên ccfDNA yên mîtokondrî di hemolîmfa A. atra de bibîne.Hebûna parçeyên DNA yên mîtokondrî bi zêdekirina PCR-ê hate piştrast kirin (Hêjîra 3).
Genên cihêreng ên mîtokondrî di hemolîmfa A. atra (nîqteyên sor - jimareya stok: SRX5705969) û M. platensis (noqteyên şîn - jimareya stok: SRX5705968) ku ji hêla PCR ve hatî zêdekirin de hebûn.Figure ji Breton et al., 2011 B Amplification of hemolymph supernatant from A. atra Li ser kaxezê FTA hatî hilanîn.Pûçek 3 mm bikar bînin da ku rasterast li lûleya PCR-ê ya ku tê de tevliheviya PCR-ê tê de zêde bikin.
Ji ber naveroka pir mîkrobîkî ya di ava deryayê de, me di destpêkê de bal kişand ser taybetmendiya rêzikên DNA yên mîkrobî yên di hemolymph de.Ji bo vê yekê, em du stratejiyên cuda bikar tînin.Stratejiya yekem Kraken2, bernameyek dabeşkirina rêzikan-based algorithm bikar anî ku dikare rêzikên mîkrobial bi rastiyek ku bi BLAST û amûrên din re tê berhev kirin nas bike [28].Zêdetirî 6719 xwendin hatine destnîşankirin ku bi eslê xwe bakterî ne, dema ku 124 û 64 bi rêzê ji arkea û vîrusan in (Wêne. 4).Parçeyên DNA yên bakterî yên herî zêde Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), û Bacteroidetes (17%) bûn (Hêjîra 4a).Ev dabeşkirin bi lêkolînên berê yên mîkrobioma mîdya şîn a marine re hevaheng e [39, 40].Gammaproteobacteria çîna sereke ya Proteobacteria bûn (44%), di nav wan de gelek Vibrionales (Hêjî. 4b).Rêbaza ddPCR hebûna parçeyên DNA yên Vibrio di ccfDNA ya A. atra hemolymph de piştrast kir (Wêne. 4c) [41].Ji bo bidestxistina bêtir agahdarî li ser eslê bakterî ya ccfDNA, nêzîkbûnek zêde hate girtin (Hêjîra S2, Agahdariya Pêvek). Di vê rewşê de, xwendinên ku li hev ketine wekî xwendinên dawiya cot hatine berhev kirin û wekî xwedan (bivalves) an nexwestî bi karanîna BLASTN û nirxek e-ya 1e−3 û qutbûnek bi homologiya >90% hatine dabeş kirin. Di vê rewşê de, xwendinên ku li hev ketine wekî xwendinên dawiya cot hatine berhev kirin û wekî xwedan (bivalves) an nexwestî bi karanîna BLASTN û nirxek e-ya 1e−3 û qutbûnek bi homologiya >90% hatine dabeş kirin. Di vê yekê de têgihîştinek e ku ji ber vê yekê ve girêdayî ye. ji sedî 90%. Di vê rewşê de, xwendinên hevgirtî wekî xwendinên hev-dawî hatin berhev kirin û bi karanîna BLASTN û nirxa e-ya 1e-3 û qutkirina bi > 90% homologî wekî xwecî (bivalve) an ne-orijînal hatin dabeş kirin.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 咄怺怺怺皒倢怺怺我 倢末端读值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 猿1-e3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Di vê yekê de têgihîştinek e ku ji ber vê yekê ve girêdayî ye, ji ber vê yekê ji ber vê yekê ve girêdayî ye. ji sedî 90%. Di vê rewşê de, xwendinên hevgirtî wekî xwendinên hev-dawî hatin berhev kirin û bi karanîna e BLASTN û nirxên 1e-3 û bendek homoolojiyê> 90% wekî xwe (bivalves) an ne-orijînal hatin dabeş kirin.Ji ber ku genoma A. atra hê nehatiye rêzkirin, me stratejiya komkirina de novo ya berhevkara Rêzkirina Nifşê Pêşerojê (NGS) MEGAHIT bikar anî.Bi tevahî 147,188 pevgirêdan wekî bi eslê xwe ve girêdayî (bivalves) hatine nas kirin.Dûv re van pêvekan bi e-nirxên 1e-10 bi karanîna BLASTN û BLASTX ve hatin teqandin.Vê stratejiyê hişt ku em 482 perçeyên ne-bivalve yên di A. atra ccfDNA de hene nas bikin.Zêdetirî nîvî (57%) ji van perçeyên ADNyê ji bakteriyan, bi giranî ji sîmbyonên gill, di nav wan de sembîyonên sulfotrofîk, û ji gill symbions Solemya velum (Hêjî. 5) hatine wergirtin.
Pirbûna nisbî di asta cureyê de.B Cihêrengiya mîkrobîkî ya du fîlên sereke (Firmicutes û Proteobacteria).Amplification nûnerê ddPCR C Vibrio spp.A. Parçeyên gena 16S rRNA (şîn) di sê hemolîmfê atra de.
Bi tevahî 482 konteyên berhevkirî hatin analîz kirin.Profîla gelemperî ya belavkirina taksonomîkî ya şîroveyên pêwendiya metagenomîk (prokaryotes û eukaryotes).B Dabeşkirina hûrgulî ya perçeyên DNA yên bakterî yên ku ji hêla BLASTN û BLASTX ve têne nas kirin.
Analîza Kraken2 jî nîşan da ku di ccfDNA ya midyayê de perçeyên DNA yên arkeal hene, di nav wan de perçeyên DNA yên Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), û Thaurmarcheota (11%) (Hêjî. 6a).Hebûna perçeyên DNA yên ku ji Euryarchaeota û Crenarchaeota hatine wergirtin, ku berê di civata mîkrobîkî ya mideyên Kalîforniyayê de hatine dîtin, divê ne surprîz be [42].Her çend Euryarchaeota bi gelemperî bi şert û mercên giran re têkildar e, naha tê zanîn ku hem Euryarchaeota û hem jî Crenarcheota di nav jîngeha krîogenîk a deryayî de di nav prokaryotên herî gelemperî de ne [43, 44].Hebûna mîkroorganîzmayên metanogenîk ên di midiyan de ne ecêb e, ji ber ku raporên vê dawiyê yên rijandina metanê ya berfireh ji lehiyên binî yên li Deşta Kerguelen [45] û hilberîna metanê ya mîkrobîkî ya gengaz a ku li peravên Giravên Kerguelen tê dîtin [46].
Dûv re bala me çû ser xwendinên ji vîrusên DNA.Li gorî zanîna me, ev yekem lêkolîna derveyî-armanca naveroka vîrusê ya midye ye.Wekî ku tê hêvîkirin, me perçeyên DNA yên bakterîofajan (Caudovirales) dîtin (Hêjîrê 6b).Lêbelê, DNA-ya virusê ya herî gelemperî ji fîlimek nucleocytoviruses tê, ku wekî virusa DNA ya mezin a sîtoplazmîkî ya nukleer (NCLDV) jî tê zanîn, ku ji her vîrusê xwedan genoma herî mezin e.Di nav vê fêlê de, piraniya rêzikên ADNyê ji malbatên Mimimidoviridae (58%) û Poxviridae (21%) ne, ku mêvandarên xwezayî yên wan vertebrîs û bendewar in, dema ku beşek piçûk ji van rêzikên ADN-ê ji algayên virolojîk ên naskirî ne.Kezebên eukaryotî yên deryayî diêşîne.Rêz jî ji vîrusa Pandora, vîrusa dêw a ku ji her cûreyên vîrusê yên naskirî mezinahiya genomê ya herî mezin e, hatine wergirtin.Balkêş e, rêza mêvandarên ku têne zanîn ku bi vîrusê vegirtî ne, wekî ku ji hêla rêzgirtina hemolymph ccfDNA ve hatî destnîşankirin, bi nisbet mezin bû (Wêne S3, Agahdariya Pêvek).Di nav wan de vîrusên ku kêzikên wek Baculoviridae û Iridoviridae dikevin, û her weha vîrusên ku bi ameba, alga û vertebrîdan dikevin dihewîne.Me di heman demê de rêzikên ku bi genoma Pithovirus sibericum re têkildar in jî dîtin.Pitoviruses (ku wekî "vîrûsên zombî" jî têne zanîn) yekem car ji permafrostê ya 30,000 salî ya li Sîbîryayê hatine veqetandin [47].Bi vî rengî, encamên me bi raporên berê re hevaheng in ku destnîşan dikin ku hemî celebên nûjen ên van vîrusan tune ne [48] û dibe ku ev vîrus di ekosîstemên deryayî yên subarktîk ên dûr de hebin.
Di dawiyê de, me ceriband ku em bibînin ka em dikarin perçeyên DNA yên ji heywanên pirhucreyî yên din bibînin.Bi tevahî 482 girêkên biyanî ji hêla BLASTN û BLASTX ve bi pirtûkxaneyên nt, nr û RefSeq (jenomîk û proteîn) ve hatine nas kirin.Encamên me destnîşan dikin ku di nav perçeyên biyanî yên ccfDNA yên heywanên pirşaneyî de ADN ya hestiyên hestî serdest e (Wêne. 5).Parçeyên DNA yên kêzik û cureyên din jî hatine dîtin.Beşek nisbeten mezin a perçeyên DNA-yê nehatine nas kirin, dibe ku ji ber kêmbûna hejmareke mezin a celebên deryayî di databasên genomîk de li gorî celebên bejayî [49].
Di gotara heyî de, em têgeha LB-ê li midyalan bicîh dikin, argûman dikin ku rêzgirtina guleyan a hemolymph ccfDNA dikare di pêkhatina ekosîstemên deryayî yên deryayî de têgihiştinê peyda bike.Bi taybetî, me dît ku 1) hemolîmfa midya di nav xwe de pîvazên nisbeten bilind (asta mîkrogram) perçeyên ADN-ê yên bi nisbeten mezin (~ 1-5 kb) vedihewîne;2) ev perçeyên ADNyê hem serbixwe ne û hem jî ne serbixwe ne 3) Di nav çavkaniyên biyanî yên van perçeyên ADNyê de, me ADNya bakterî, arkeal û viral û her weha ADNya heywanên din ên pirxaneyî dîtin;4) Kombûna van perçeyên ccfDNA yên biyanî di hemolînfê de bi lez çêdibe û beşdarî çalakiya parzûnkirina navxweyî ya midyan dibe.Di encamê de, lêkolîna me destnîşan dike ku têgeha LB, ku heya nuha bi giranî di warê biyolojîkî de hatî sepandin, çavkaniyek zanyarî ya dewlemend lê nenaskirî kod dike ku dikare were bikar anîn da ku pêwendiya di navbera celebên sentinel û hawîrdora wan de çêtir fam bike.
Ji bilî prîmatan, veqetandina ccfDNA di mammalan de, di nav de mişk, kûçik, pisîk û hespan jî hatiye ragihandin [50, 51, 52].Lêbelê, li gorî zanîna me, lêkolîna me yekem e ku vedîtin û rêzkirina ccfDNA di celebên deryayî de bi pergalek gerîdeya vekirî rapor dike.Ev taybetmendiya anatomîkî û şiyana parzûnkirinê ya midyan, bi kêmî ve, dibe ku taybetmendiyên mezinahiya cihêreng ên perçeyên ADN-yê yên gerok li gorî celebên din rave bike.Di mirovan de, piraniya perçeyên DNA yên ku di xwînê de dizivirin perçeyên piçûk in ku mezinahiya wan di navbera 150 û 200 bp de ne.bi lûtkeya herî zêde 167 bp [34, 53].Parçeyek piçûk lê girîng a perçeyên ADNyê di navbera 300 û 500 bp mezinahî ne, û bi qasî 5% ji 900 bp dirêjtir in.[54].Sedema vê belavkirina mezinbûnê ev e ku çavkaniya sereke ya ccfDNA di plazmayê de wekî encama mirina hucreyê pêk tê, an ji ber mirina hucreyê an ji ber nekroza şaneyên hematopoietîkî yên di nav mirovên saxlem de an jî ji ber apoptoza hucreyên tumorê yên di nexweşên penceşêrê de ( ku wekî DNA-ya tumorê ya gerok tê zanîn)., ctDNA).Dabeşkirina mezinahiya hemolymph ccfDNA ya ku me di mîdeyan de dît di navbera 1000 û 5000 bp de ye, ku destnîşan dike ku ccfDNA ya midye xwedan orjînek cûda ye.Ev hîpotezek mentiqî ye, ji ber ku mîdye xwedan pergalek damarî ya nîv-vekirî ye û li hawîrdorên avî yên deryayî yên ku tê de giraniya DNA ya genomîkî ya mîkrobial heye dijîn.Di rastiyê de, ceribandinên me yên laboratîfê ku DNA-ya exogenous bikar tînin destnîşan kirin ku midye perçeyên DNA di ava deryayê de kom dikin, bi kêmanî piştî çend demjimêran ew piştî girtina hucreyî têne hilweşandin û / an berdan û / an di rêxistinên cihêreng de têne hilanîn.Ji ber kêmbûna hucreyan (hem prokaryotic û hem jî eukaryotî), karanîna beşên intravalvular dê mîqdara ccfDNA ji çavkaniyên xweser û hem jî ji çavkaniyên biyanî kêm bike.Ji ber ku girîngiya xweparastina xwerû ya bivalve û hejmareke mezin a fagosîtên gerok, me bêtir hîpotez kir ku tewra ccfDNA-ya biyanî jî di fagosîtên gerok de dewlemend dibe ku DNA-ya biyanî bi ketina mîkroorganîzmayan û/an bermahiyên hucreyî berhev dike.Bi hev re, encamên me destnîşan dikin ku hemolymph bivalve ccfDNA depoyek yekta ya agahdariya molekulî ye û rewşa wan wekî celebek sentinel xurt dike.
Daneyên me destnîşan dikin ku rêzkirin û analîzkirina perçeyên hemolymph ccfDNA yên ku ji bakteriyan hatine wergirtin dikare di derheqê flora bakterî ya mêvandar û bakteriyên ku di ekosîstema deryaya derdorê de hene de agahdariya sereke peyda bike.Teknîkên rêzgirtina guleyan rêzikên bakteriya hevbeş A. atra gill eşkere kirin ku heke rêbazên nasandina 16S rRNA yên kevneşopî bihatana bikar anîn, ev yek jî ji ber bertengiya pirtûkxaneya referansê.Di rastiyê de, bikaranîna me ya daneyên LB yên ku ji M. platensis di heman qata midyayê de li Kerguelenê hatine berhev kirin, nîşan da ku pêkhatina hevrêzên bakterî yên bi gill ve girêdayî ji bo her du celebên midyayan yek e (Hêjîrê S4, Agahdariya Pêvek).Ev wekheviya du mîdeyên genetîkî yên cihêreng dibe ku pêkhatina civakên bakterî yên di depoyên sar, sulfur û volkanîkî yên Kerguelen de nîşan bide [55, 56, 57, 58].Asta bilind a mîkroorganîzmayên kêmkirina sulfurê dema ku mîdeyên ji deverên peravê yên biyoturbatkirî têne berhev kirin baş hatine diyar kirin [59], wek peravên Port-au-France.Ihtimalek din jî ev e ku flora mîdyaya hevbeş dikare ji hêla veguheztina horizontal ve were bandor kirin [60, 61].Zêdetir lêkolîn hewce ye ku pêwendiya di navbera jîngeha deryayî, rûbera deryayê, û pêkhatina bakteriyên simbiotîk ên di mîdeyan de were destnîşankirin.Ev lêkolîn niha berdewam in.
Dirêjahî û giraniya hemolymph ccfDNA, hêsaniya wê ya paqijkirinê, û qalîteya wê ya bilind ku destûrê dide rêzgirtina bilez a gulebaranê hin ji gelek avantajên karanîna ccfDNA ya midya ne ji bo nirxandina cihêrengiya biyolojîkî di ekosîstemên deryayî yên deryayî de.Ev nêzîkatî bi taybetî ji bo karakterîzekirina civakên viral (viromes) di ekosîstemek diyarkirî de bi bandor e [62, 63].Berevajî bakterî, arkea û eukaryotan, genomên vîrusê genên ku ji hêla fîlogenetîkî ve hatine parastin ên wekî rêzikên 16S nagirin.Encamên me destnîşan dikin ku biopsiyên şil ên ji celebên nîşanker ên wekî midye dikare were bikar anîn da ku hejmareke pir mezin ji perçeyên vîrusê ccfDNA yên ku têne zanîn ku mêvandarên ku bi gelemperî ekosîstemên deryayî yên peravê dijîn vegirtinê têne bikar anîn.Di nav de vîrusên ku têne zanîn protozoa, arthropod, kêzik, nebat, û vîrusên bakterî (mînak, bakteriofag) dixin dihewîne.Dema ku me hemolymph ccfDNA vîroma mîdeyên şîn (M. platensis) ku di heman qata midyeyê de li Kerguelen hatî berhev kirin lêkolîn kir, belavokek bi vî rengî hate dîtin (Table S2, Agahdariya Pêvek).Rêzkirina guleyan a ccfDNA bi rastî nêzîkatiyek nû ye ku di lêkolîna viroma mirovan an celebên din de geş dibe [21, 37, 64].Ev nêzîkatî bi taybetî ji bo lêkolîna vîrusên DNA-ya du-zindî bikêr e, ji ber ku ti genek yekane di nav hemî vîrusên DNA-ya du-zindî de nayê parastin, ku çîna herî cihêreng û berfireh a vîrusên li Baltimore temsîl dike [65].Tevî ku piraniya van vîrusan nepenîskirî dimînin û dibe ku vîrusên ji parçeyek bi tevahî nenas ê cîhana vîrusê [66] tê de bin jî, me dît ku virom û rêzikên mêvandar ên mideyên A. atra û M. platensis di navbera her du celeban de ne.bi heman rengî (binihêre jimar S3, agahdariya zêde).Ev wekhevî ne ecêb e, ji ber ku dibe ku ew kêmasiya hilbijartî di hilgirtina DNA ya li hawîrdorê de nîşan bide.Lêkolînên paşerojê yên ku RNA-ya paqijkirî bikar tînin niha hewce ne ku ji bo taybetmendiya RNA virome.
Di lêkolîna xwe de, me boriyek pir hişk ku ji xebata Kowarski û hevkarên xwe [37] hatî adaptekirin, bikar anî, yên ku jêbirina du-gavekî ya xwendin û girêdanên hevgirtî berî û piştî kombûna ccfDNA-ya xwemalî bikar anîn, ku di encamê de rêjeyek zêde ya xwendinên nenexşeyî peyda bû.Ji ber vê yekê, em nekarin rê bidin ku hin ji van xwendinên nenexşekirî hîn jî eslê xwe hebin, di serî de ji ber ku me genomek referansê ji bo vî cureyê midya tune.Me di heman demê de ev boriyê bikar anî ji ber ku em ji chimerasên di navbera xwendinên bixwe û ne-xwendî û dirêjahiya xwendinê ya ku ji hêla Illumina MiSeq PE75 ve hatî çêkirin de fikar bûn.Sedemek din a piraniya xwendinên nenas ev e ku pir mîkrobên deryayî, nemaze li deverên dûr ên wekî Kerguelen, nehatine şîrove kirin.Me Illumina MiSeq PE75 bikar anî, bi texmîna dirêjahiya perçeya ccfDNA ya mîna ccfDNA ya mirovî.Ji bo lêkolînên paşerojê, ji ber ku encamên me destnîşan dikin ku hemolymph ccfDNA ji mirovan û/an mammalan xwedan xwendinên dirêjtir e, em pêşniyar dikin ku ji bo perçeyên ccfDNA yên dirêjtir platformek rêzgirtinê bikar bînin.Ev pratîk dê ji bo analîzên kûrtir tespîtkirina bêtir nîşanan hêsantir bike.Bidestxistina rêzika genomê ya nukleerî ya A. atra ya ku niha nayê peyda kirin dê cûdakirina ccfDNA ji çavkaniyên xwe û ne-xwe jî pir hêsan bike.Ji ber ku lêkolîna me li ser îhtîmala sepandina têgeha biopsiya şil li midiyan rawestiyaye, em hêvî dikin ku ji ber ku ev têgeh di lêkolînên pêşerojê de were bikar anîn, dê amûr û xetên nû werin pêşve xistin da ku potansiyela vê rêbazê ji bo lêkolîna cihêrengiya mîkrobialî ya midiyan zêde bike.ekosîstema deryayê.
Wekî biyomarkerek klînîkî ya ne-dagirker, bilindbûna asta plazmaya mirovan a ccfDNA bi nexweşiyên cihêreng, zirara tevnvîsê û şert û mercên stresê re têkildar e [67,68,69].Ev zêdebûn bi berdana perçeyên DNA yên bi eslê xwe ve piştî zirara tevnê ve girêdayî ye.Me vê pirsgirêkê bi karanîna stresa germê ya tûj, ku tê de mîdye bi kurtasî li germahiya 30 °C ve hat xêz kirin.Me di sê ceribandinên serbixwe de ev analîz li ser sê celebên mideyên cûda pêk anî.Lêbelê, me di asta ccfDNA de piştî stresa germê ya tûj ti guhartinek nedît (binihêre Figure S5, agahdariya zêde).Dibe ku ev vedîtin, bi kêmanî di beşekê de, vê rastiyê rave bike ku mîdye xwedan pergalek gera xwînê ya nîv vekirî ye û ji ber çalakiya xweya fîlterkirina bilind, mîqdarên mezin DNA yên biyanî berhev dike.Ji aliyek din ve, midye, mîna gelek nemirovan, dibe ku li hember zirara tevnvîsê ya ku ji stresê çêdibe bêtir berxwedêr bin, bi vî rengî berdana ccfDNA di hemolympha xwe de sînordar dike [70, 71].
Heya nuha, analîza DNA ya cihêrengiya biyolojîkî di ekosîstemên avî de bi giranî li ser metabarkodkirina DNA ya hawîrdorê (eDNA) ye.Lêbelê, ev rêbaz bi gelemperî di analîzên biyolojîkî de dema ku primers têne bikar anîn sînorkirî ye.Bikaranîna rêziknameya gulebaranê tixûbên PCR û bijartina beralîkirî ya komên primer derdixe holê.Ji ber vê yekê, di wateyekê de, rêbaza me nêziktir e ji rêbaza rêzgirtina eDNA-ya Shotgun-ê ya ku vê dawiyê hatî bikar anîn, ku dikare rasterast DNA-ya perçekirî rêz bike û hema hema hemî organîzmayan analîz bike [72, 73].Lêbelê, hejmarek pirsgirêkên bingehîn hene ku LB ji rêbazên eDNA yên standard cuda dikin.Bê guman, cûdahiya sereke di navbera eDNA û LB de karanîna mêvandarên parzûna xwezayî ye.Ji bo lêkolîna eDNA-yê bikaranîna cureyên deryayê yên wekî spong û bivalves (Dresseina spp.) wekî parzûnek xwezayî ji bo lêkolîna eDNA hatiye ragihandin [74, 75].Lêbelê, lêkolîna Dreissena biyopsiyên tevnvîsê yên ku DNA jê hatî derxistin bikar anîn.Analîzkirina ccfDNA ya ji LB ne hewceyî biopsiya tevnvîsê, amûr û lojîstîkên pispor û carinan biha û bi eDNA an biopsiya tevnê ve girêdayî ye.Bi rastî, me vê dawiyê ragihand ku ccfDNA ji LB dikare bi piştgiriya FTA-yê bêyî domandina zincîreyek sar were hilanîn û analîz kirin, ku ev yek ji bo lêkolîna li deverên dûr dijwariyek mezin e [76].Derxistina ccfDNA ji biopsiyên şil jî hêsan e û DNA-ya kalîteya bilind ji bo rêzgirtina guleyan û analîza PCR peyda dike.Ev avantajek mezin e ku hin hûrgelên teknîkî yên bi analîza eDNA ve girêdayî ne [77].Sadebûn û lêçûna kêm a rêbaza nimûneyê jî bi taybetî ji bo bernameyên çavdêriya demdirêj minasib e.Digel şiyana fîlterkirina wan a bilind, taybetmendiyek din a naskirî ya bivalves kompozîsyona kîmyewî ya mucopolysaccharide ya mukusa wan e, ku vegirtina vîrusan pêşve dike [78, 79].Ev yek bivalves dike parzûnek xwezayî ya îdeal ji bo taybetmendiya cihêrengiya biyolojîk û bandora guheztina avhewa di ekosîstema avî ya diyarkirî de.Her çend hebûna perçeyên DNA-yê yên ku ji mêvandar têne derxistin wekî sînordariyek rêbazê li gorî eDNA-yê were dîtin, lê lêçûna ku bi hebûna ccfDNA-ya xwemalî ya bi eDNA-yê re têkildar e di heman demê de ji bo pir agahdariya ku ji bo lêkolînên tenduristiyê peyda dibe tê fêm kirin.offset host.Di nav vê yekê de hebûna rêzikên vîrusê yên ku di genomê mêvandarê mêvandar de ne yekgirtî ye.Ev bi taybetî ji bo midiyan girîng e, ji ber hebûna retrovirusên leukemîk ên ku bi horizontî ve têne veguheztin di bivalves de [80, 81].Feydeyek din a LB li ser eDNA ev e ku ew çalakiya fagosîtîkî ya hucreyên xwînê yên di hemolymphê de, ku mîkroorganîzmayan (û genomên wan) diqulipîne, bikar tîne.Fagocytosis fonksiyona sereke ya hucreyên xwînê yên di duvalves de ye [82].Di dawiyê de, rêbaz ji kapasîteya bilind a parzûnê ya midiyan (bi navînî 1,5 l/h ava deryayê) û gerîdeya du-rojî sûd werdigire, ku tevlihevkirina qatên cûda yên ava deryayê zêde dike, rê dide girtina eDNA ya heterolog.[83, 84].Ji ber vê yekê, analîza ccfDNA ya midye rêyek balkêş e ku ji ber bandorên xwarin, aborî û hawîrdorê yên midyan têne dayîn.Mîna analîzkirina LB-ya ku ji mirovan hatî berhev kirin, ev rêbaz di heman demê de îmkana pîvandina guheztinên genetîkî û epigenetîk ên di DNA-ya mêvandar de di bersivdayîna maddeyên exogenous de vedike.Mînakî, teknolojiyên rêzgirtinê yên nifşa sêyemîn dikare were pêşbînîkirin ku analîza methylasyonê ya berfireh a genomê di ccfDNA ya xwemalî de bi karanîna rêzgirtina nanoporê pêk bîne.Pêdivî ye ku ev pêvajo ji hêla vê rastiyê ve were hêsan kirin ku dirêjahiya perçeyên ccfDNA yên midyeyê bi îdeal bi platformên rêzgirtinê yên dirêj-xwendî re hevaheng e ku destûrê dide analîza metilasyona DNA-ya berfireh a genomê ji yek rêzgirtinê bêyî hewcedariya veguherînên kîmyewî. 85,86] Ev îhtîmalek balkêş e, ji ber ku hate destnîşan kirin ku gelek şêwazên metîlasyonê yên DNA-yê li ser nifûsa hawirdorê bersivek nîşan dide.Ji ber vê yekê, ew dikare di derheqê mekanîzmayên bingehîn ên ku bersivê de piştî rûdana guheztina avhewa an gemaran re têgihiştinek hêja peyda bike [87].Lêbelê, karanîna LB ne bê sînor e.Hêjayî gotinê ye, ji bo vê yekê hebûna celebên nîşanker di ekosîstemê de hewce dike.Wekî ku li jor behs kir, karanîna LB-ê ji bo nirxandina cihêrengiya biyolojîk a ekosîstemek diyarkirî jî pêdivî bi boriyek biyoinformatîk a hişk heye ku hebûna perçeyên DNA-yê ji çavkaniyê digire nav xwe.Pirsgirêkek din a sereke hebûna genomên referansê yên ji bo celebên deryayî ye.Hêvîdar e ku înîsiyatîfên wekî Projeya Genomên Mammalên Deryayî û projeya Fish10k ya vê dawiyê hatî damezrandin [88] dê di pêşerojê de analîzên weha hêsan bikin.Serîlêdana konsepta LB ji organîzmayên fîlter-xwarinê yên deryayî re di heman demê de bi pêşkeftinên herî dawîn ên teknolojiya rêzgirtinê re jî hevaheng e, ku ew ji bo pêşkeftina biyomarkerên pir-ohm baş guncan e da ku di bersiva stresa jîngehê de agahdariya girîng di derbarê tenduristiya jîngehên deryayî de peyda bike.
Daneyên rêzgirtina genomê di bin Bioprojects SRR8924808 de li Arşîva Xwendina Rêzeya NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 hatine razandin.
Brierley AS, Kingsford MJ Bandora guherîna avhewa li ser jîyana deryayî û ekosîstema.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Bandorên hevgirtî yên guheztina avhewa û stresên din ên herêmî li ser jîngeha deryayî bifikirin.jîngeha zanistî ya giştî.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Zanyarî ya yekem adarê.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kêmkirina tolerasyona germê di bin şert û mercên stresa germê ya dubarekirî de mirina zêde ya havîna mideyên şîn diyar dike.Rapora zanistî 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Guhertinên vê dawîyê di berbelavbûn, sedem û asta mirinên heywanan de.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Gelek pathogenên ne-cure-taybetî dibe ku bûne sedema mirina girseyî ya Pinna nobilis.Jîyan.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Bandora potansiyela guherîna avhewa li ser nexweşiyên zoonotîk ên Arktîkê.Tenduristiya Int J Circumpolar.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Mîdyeyên şîn (Mytilus edulis spp.) Wekî organîzmayên nîşanê di şopandina qirêjiya peravê de: vekolînek.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Di tedawiya penceşêrê de yekbûna biopsiya şilavê.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Pîvanbûna biopsiya şil: Destûrê dide ku DNAya tumorê belav bibe.Nat Rev Cancer.2017; 17: 223-38.
Mandel P., Metais P. Asîdên nukleîk di plazmaya mirovan de.Deqeyên civînê yên alîgirên Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rolek nû ji bo DNA-ya bê hucre wekî nîşanek molekular ji bo dermankirina penceşêrê.Quantification analîza biomolar.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsiya Liquid dikeve klînîkê - Pirsgirêkên pêkanînê û pirsgirêkên pêşerojê.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW û yên din.ADNya fetal di plazma û seruma dayikê de heye.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Lêkolîna qursa ducaniyê û tevliheviyên wê bi karanîna RNA-ya derveyî hucreyî ya di xwîna jinan de di dema ducaniyê de vedigire.Dopediatrics.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsiya şil: ADN-ya bê şaneya xêrxwaz ji bo tesbîtkirina birînên alojenîk ên di grafika gurçikê de tê bikar anîn.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Nûvekirinên di teşhîskirina berî zayînê de: rêzgirtina genomê ya plazmaya dayikê.Anna MD.2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Tespîtkirina bilez a pathogen bi rêzgirtina metagenomîkî ya nifşê din a şilavên laş ên vegirtî.Nat Medicine.2021; 27: 115-24.