Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Di vê navberê de, ji bo ku piştgiriya domdar misoger bikin, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript-ê nîşan bidin.
Biyopsiya şile (LB) têgehek e ku di warê biyopizîşkî de bi lez populer dibe. Ev têgeh bi giranî li ser tespîtkirina perçeyên DNAya derveyî hucreyê ya di gerê de (ccfDNA) ye, ku bi piranî wekî perçeyên piçûk piştî mirina hucreyê di tevnên cûrbecûr de têne berdan. Beşek piçûk ji van perçeyan ji tevn an organîzmayên biyanî (biyanî) çêdibin. Di xebata heyî de, me ev têgeh li ser mîdyeyan, cureyek çavdêr ku bi kapasîteya xwe ya fîltrekirina ava deryayê ya bilind tê zanîn, bicîh aniye. Em şiyana mîdyeyan bikar tînin ku wekî fîlterên xwezayî tevbigerin da ku perçeyên DNAya jîngehê ji çavkaniyên cûrbecûr bigirin da ku agahdarî li ser biyoçeşîtiya ekosîstemên peravên deryayî peyda bikin. Encamên me nîşan didin ku hemolîmfa mîdyeyê perçeyên DNA-yê dihewîne ku ji 1 heta 5 kb di mezinahiyê de pir diguherin. Rêzkirina gulebaranê nîşan da ku hejmareke mezin ji perçeyên DNA-yê ji eslê mîkrobî yê biyanî ne. Di nav wan de, me perçeyên DNA-yê ji bakteriyan, arkeyan û vîrusan dîtin, di nav de vîrusên ku têne zanîn ku cûrbecûr mêvandaran vedigirin ku bi gelemperî di ekosîstemên deryayî yên peravê de têne dîtin. Di encamê de, lêkolîna me nîşan dide ku têgeha LB-ê ya ku li ser midyan tê sepandin çavkaniyek dewlemend lê hîn nehatiye keşifkirin a zanînê li ser cihêrengiya mîkrobî di ekosîstemên peravên deryayî de temsîl dike.
Bandora guherîna avhewayê (CC) li ser biyoçeşeya ekosîstemên deryayî qadeke lêkolînê ye ku bi lez mezin dibe. Germbûna gerdûnî ne tenê dibe sedema stresên girîng ên fîzyolojîk, lê di heman demê de sînorên pêşketinî yên aramiya germî ya organîzmayên deryayî jî dixe, bandorê li jîngeha hejmarek cureyan dike, wan teşwîq dike ku li şert û mercên guncantir bigerin [1, 2]. Ji bilî bandorkirina li ser biyoçeşeya metazoan, CC hevsengiya nazik a têkiliyên mîkrobî-mêvandar têk dide. Ev dîsbakteriya mîkrobî gefek cidî li ser ekosîstemên deryayî çêdike ji ber ku ew organîzmayên deryayî ji patojenên enfeksiyonê re hesastir dike [3, 4]. Tê bawerkirin ku SS di mirinên girseyî de rolek girîng dilîzin, ku ev ji bo rêveberiya ekosîstemên deryayî yên gerdûnî pirsgirêkek cidî ye [5, 6]. Ev mijarek girîng e ji ber bandorên aborî, ekolojîk û xurekiyê yên gelek cureyên deryayî. Ev bi taybetî ji bo duqalikên ku li herêmên qutbî dijîn rast e, ku bandorên CK tavilê û girantir in [6, 7]. Bi rastî, duqalikên wekî Mytilus spp. bi berfirehî têne bikar anîn da ku bandorên CC li ser ekosîstemên deryayî bişopînin. Ne ecêb e ku hejmareke nisbeten mezin ji nîşankerên biyolojîk ji bo şopandina tenduristiya wan hatine pêşxistin, pir caran bi karanîna nêzîkatiyek du-astî ku nîşankerên biyolojîk ên fonksiyonel ên li ser bingeha çalakiya enzîmatîk an fonksiyonên hucreyî yên wekî zindîbûna hucreyê û çalakiya fagosîtîk vedihewîne [8]. Ev rêbaz di heman demê de pîvandina konsantrasyona nîşankerên zexta taybetî yên ku piştî kişandina mîqdarên mezin ên ava deryayê di tevnên nerm de kom dibin jî vedihewîne. Lêbelê, kapasîteya parzûnkirina bilind û pergala gera xwînê ya nîv-vekirî ya duqalikan derfetek peyda dike ku nîşankerên hemolîmfê yên nû bi karanîna têgeha biyopsiya şile (LB), nêzîkatiyek hêsan û kêm-dagirker ji bo rêveberiya nexweşan pêşve bibin. Her çend çend celeb molekulên di nav LB-ya mirovan de têne dîtin jî, ev têgeh bi giranî li ser analîza rêzkirina DNA-yê ya perçeyên DNA-ya derveyî hucreyê (ccfDNA) ya di nav plazmayê de ye. Bi rastî, hebûna DNA-ya di nav plazmaya mirovan de ji nîvê sedsala 20-an vir ve tê zanîn [11], lê tenê di salên dawî de ye ku derketina holê ya rêbazên rêzkirina bi rêjeya bilind rê li ber teşhîsa klînîkî ya li ser bingeha ccfDNA vekiriye. Hebûna van perçeyên DNA-yê yên di gera xwînê de qismî ji ber berdana pasîf a DNA-ya genomîk (nukleerî û mîtokondrî) piştî mirina şaneyê ye. Di kesên saxlem de, rêjeya ccfDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng/mL) lê di nexweşên ku ji nexweşiyên cûrbecûr dikişînin an jî rastî stresê tên de, ku dibe sedema zirara tevnan, dikare 5-10 caran zêde bibe. Di kesên saxlem de, rêjeya ccfDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng/mL) lê di nexweşên ku ji nexweşiyên cûrbecûr dikişînin an jî rastî stresê tên de, ku dibe sedema zirara tevnan, dikare 5-10 caran zêde bibe. Во норме ниская (<10 ng/ml), lê dikare di 5–10 de bolьnыh bi различной патологией или подвергающихся стрессу, приводаврщенйнему. Di mirovên saxlem de, rêjeya cccDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng/mL), lê di nexweşên bi nexweşiyên cûrbecûr an jî di bin stresê de ku dibe sedema zirara tevnan de, dikare 5-10 caran zêde bibe.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的患者中可增加5-10 倍，从而导致在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损 伤损伤Navendên ccfDNA kêm kêm (<10 ng/ml) li lûtkeyê ne, lê dibe ku di 5-10-ê de li ser nexweşiyên nexweşî an stresê, ku ev yek dikare were xuyang kirin. Di kesên saxlem de, rêjeya ccfDNA bi gelemperî kêm e (<10 ng/ml), lê di nexweşên bi nexweşiyên cûrbecûr an stresê de dikare 5-10 qat zêde bibe, ku dibe sedema zirara tevnê.Mezinahiya perçeyên ccfDNA pir diguhere, lê bi gelemperî di navbera 150 û 200 bp de ye. [12]. Analîza ccfDNA-ya xwe-derxistî, ango ccfDNA-ya ji hucreyên mêvandar ên normal an veguherî, dikare ji bo tespîtkirina guhertinên genetîkî û epîgenetîkî yên di genoma navokî û/an mîtokondrî de were bikar anîn, bi vî rengî alîkariya klînîsyenan dike ku dermankirinên taybetî yên molekulî-armanckirî hilbijêrin [13]. Lêbelê, ccfDNA dikare ji çavkaniyên biyanî yên wekî ccfDNA ji hucreyên fetusê di dema ducaniyê de an ji organên veguheztî were wergirtin [14,15,16,17]. ccfDNA di heman demê de çavkaniyek girîng a agahdariyê ye ji bo tespîtkirina hebûna asîdên nukleîk ên ajanek enfeksiyonê (biyanî), ku destûrê dide tespîtkirina ne-dagirker a enfeksiyonên berbelav ên ku bi çandên xwînê nayên destnîşankirin, ji biyopsiya dagirker a tevna vegirtî dûr dikeve [18]. Lêkolînên vê dawiyê bi rastî nîşan dane ku xwîna mirovan çavkaniyek dewlemend a agahdariyê dihewîne ku dikare ji bo destnîşankirina patojenên vîrus û bakterî were bikar anîn, û ku nêzîkî 1% ji ccfDNA-ya ku di plazmaya mirovan de tê dîtin ji eslê biyanî ye [19]. Ev lêkolîn nîşan didin ku biyolojîkbûna cûrbecûr a mîkrobioma gerok a organîzmayekê dikare bi karanîna analîza ccfDNA were nirxandin. Lêbelê, heta demek berê, ev têgeh tenê di mirovan de û, bi rêjeyek kêmtir, di movikdarên din de dihat bikar anîn [20, 21].
Di vê gotarê de, em potansiyela LB bikar tînin da ku ccfDNA ya Aulacomya atra, cureyek başûrî ku bi gelemperî li Giravên Kerguelen ên jêr-antarktîk tê dîtin, komek giravên li ser platoyek mezin ku 35 mîlyon sal berê çêbûye, analîz bikin. teqîna volkanîk. Bi karanîna pergalek ceribandinê ya in vitro, me dît ku perçeyên DNA-yê di ava deryayê de ji hêla mîdyeyan ve zû têne girtin û dikevin beşa hemolîmfê. Rêzkirina gulebaranê nîşan da ku hemolîmfa mîdyeyê ccfDNA perçeyên DNA-yê yên bi eslê xwe û ne-xwe dihewîne, di nav de bakteriya sîmbiyotîk û perçeyên DNA-yê ji biyomên tîpîk ên ekosîstemên peravên deryayî yên volkanîk ên sar. Hemolîmfa ccfDNA di heman demê de rêzikên vîrusî yên ku ji vîrusên bi rêzên mêvandar ên cûda hatine wergirtin jî dihewîne. Me her weha perçeyên DNA-yê ji heywanên pirhucreyî yên wekî masiyên hestî, anemonên deryayê, alg û kêzikan dîtin. Di encamê de, lêkolîna me nîşan dide ku têgeha LB dikare bi serkeftî li ser bêwerteberên deryayî were sepandin da ku repertuwarek genomîk a dewlemend di ekosîstemên deryayî de çêbike.
Mîdyayên şîn ên mezin (55-70 mm dirêj) Mytilus platensis (M. platensis) û Aulacomya atra (A. atra) di Kanûna 2018an de ji peravên kevirî yên navbera geliyan ên Port-au-France (049°21.235 Başûr, 070°13.490 Rojhilat) hatin berhevkirin. Giravên Kerguelen di Kanûna 2018an de. Mîdyayên şîn ên mezin ên din (Mytilus spp.) ji dabînkerê bazirganî (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) hatin wergirtin û di tankeke hewakirî ya bi germahîya kontrolkirî (4°C) de hatin danîn ku 10-20 L şorava sûnî ya 32‰ tê de hebû. (xwêya deryayê ya sûnî Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Ji bo her ceribandinê, dirêjahî û giraniya qalikên takekesî hatin pîvandin.
Protokoleke vekirî û belaş ji bo vê bernameyê li ser înternetê heye (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Bi kurtasî, hemolîmfa LB ji masûlkeyên abductor wekî ku hatiye vegotin [22] hate berhevkirin. Hemolîmf bi santrifujkirinê di 1200×g de ji bo 3 hûrdeman hate zelalkirin, supernatant heta bikaranînê hate cemidandin (-20°C). Ji bo îzolekirin û paqijkirina cfDNA, nimûne (1.5-2.0 ml) hatin helandin û bi karanîna kîta NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) li gorî rêwerzên çêker hatin pêvajokirin. ccfDNA heta analîza din di -80°C de hate hilanîn. Di hin ceribandinan de, ccfDNA bi karanîna Kîta Lêkolînerê DNA ya QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) hate îzolekirin û paqijkirin. DNAya paqijkirî bi karanîna ceribandinek standard a PicoGreen hate hejmartin. Belavbûna perçeyên ccfDNA-ya îzolekirî bi elektroforeza kapîlar bi karanîna biyoanalîzerek Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) û bi karanîna Kîta DNA-ya Hesasiyeta Bilind hate analîzkirin. Ceribandin bi karanîna 1 µl nimûneya ccfDNA-yê li gorî rêwerzên çêker hate kirin.
Ji bo rêzkirina perçeyên hemolîmfê ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pirtûkxaneyên tifinga şotan bi karanîna kîta Illumina DNA Mix a kîta Illumina MiSeq PE75 amade kir. Adaptorek standard (BioO) hat bikar anîn. Pelên daneyên xav ji Arşîva Xwendina Rêza NCBI (SRR8924808 û SRR8924809) hene. Kalîteya xwendina bingehîn bi karanîna FastQC [23] hat nirxandin. Trimmomatic [24] ji bo qutkirina adapteran û xwendinên bi kalîteya nebaş hat bikar anîn. Xwendinên tifinga şotan bi serên cotkirî bi FLASH di xwendinên yekane yên dirêjtir de bi hevgirtinek herî kêm 20 bp hatin yek kirin da ku ji nelihevhatinan dûr bikevin [25]. Xwendinên yekbûyî bi karanîna databasa Taksonomiya NCBI ya duqalikî (nirxa e < 1e−3 û 90% homologî) bi BLASTN hatin şîrovekirin, û maskkirina rêzikên kêm-tevlihevî bi karanîna DUST [26] hate kirin. Xwendinên yekbûyî bi karanîna databasa Taksonomiya NCBI ya duqalikî (nirxa e < 1e−3 û 90% homologî) bi BLASTN hatin şîrovekirin, û maskkirina rêzikên kêm-tevlihevî bi karanîna DUST [26] hate kirin. BLASTN bi alîkariya BLASTN-ê ji bo NCBI-ê ji nû ve hatî afirandin (girîngiya e < 1e-3 û 90% nirxa mezinbûnê), û maqûl e. было выполнено со DUST [26]. Xwendinên komkirî bi karanîna databasa taksonomiya duvalve ya NCBI (nirxa e < 1e-3 û 90% homologî) bi BLASTN hatin şîrovekirin, û maskkirina rêza tevliheviya kêm bi karanîna DUST [26] hate kirin.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 合并 读敹]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN bi bikaranîna taksonomicheskoy bazы dannыh dvuschatыh molluskov NCBI (значiya e <1e-3 û 90% nirxandî), û было выполнено со DUST [26]. Xwendinên komkirî bi karanîna databasa taksonomîk a NCBI duvalve (nirxa e <1e-3 û 90% homologî) bi BLASTN hatin şîrovekirin, û maskkirina rêza tevliheviya kêm bi karanîna DUST [26] hate kirin.Xwendin li du koman hatin dabeşkirin: yên bi rêzikên duqalikî ve girêdayî (li vir wekî xwexwendin têne binavkirin) û yên ne têkildar (xwexwendinên ne-xwe). Du kom bi karanîna MEGAHIT-ê ji hev cuda hatin komkirin da ku kontîgan çêbikin [27]. Di vê navberê de, belavbûna taksonomîk a xwendinên mîkrobioma biyanî bi karanîna Kraken2 [28] hate dabeşkirin û bi grafîkî bi nexşeya pîteyî ya Krona li ser Galaxy [29, 30] hate temsîl kirin. Ji ceribandinên me yên pêşîn, kmerên çêtirîn wekî kmers-59 hatin destnîşankirin. Dûvre kontîgên xweser bi hevrêzkirina bi BLASTN (databasa NCBI ya duvalve, nirxa e < 1e−10 û 60% homologî) ji bo şîrovekirinek dawî hatin destnîşankirin. Dûvre kontîgên xweser bi hevrêzkirina bi BLASTN (databasa NCBI ya duvalve, nirxa e < 1e−10 û 60% homologî) ji bo şîrovekirinek dawî hatin destnîşankirin. Têkiliyên xwedan berteka ji bo BLASTN-ê ve girêdayî ye (ji bo agahdariya nû ya NCBI-ê, girîngiya e <1e-10 û gemarî 60%) ji bo hişyariyê. Dûvre xwe-contig bi hevberkirina li dijî BLASTN (daneya NCBI ya duvalve, nirxa e <1e-10 û 60% homologî) ji bo şîrovekirina dawîn hatin destnîşankirin.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Daxuyaniya ku ji hêla BLASTN-ê ve girêdayî ye (ji bo agahdariya NCBI ji bo nûvekirina nû, girîng e <1e-10% sal,% 6) heye. Dûvre xwe-contig ji bo şîrovekirina dawî bi hevberkirina li dijî BLASTN (daneya duvalv a NCBI, nirxa e <1e-10 û 60% homologî) hatin destnîşankirin. Bi paralelî, kontîgên komên ne-xwe bi BLASTN (daneya nt NCBI, nirxa e < 1e−10 û 60% homologî) hatin şîrovekirin. Bi paralelî, kontîgên komên ne-xwe bi BLASTN (daneya nt NCBI, nirxa e < 1e−10 û 60% homologî) hatin şîrovekirin. Parallely chugerodnыe grouppovыe contigi bыly annotirovanы with helping BLASTN (based data nt NCBI, wateya e <1e-10 û gemology 60%). Bi heman awayî, kontîgên komên biyanî bi BLASTN (daneya NT NCBI, nirxa e <1e-10 û 60% homologî) hatin şîrovekirin.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Paralleke contigi, ne tê zanîn ku grûpek hevpar e, ji hêla BLASTN-ê ve girêdayî ye. Bi paralelî, kontîgên koma ne-xwe bi BLASTN (daneya nt NCBI, nirxa e <1e-10 û 60% homologî) hatin şîrovekirin. BLASTX li ser kontîgên ne-xwe jî bi karanîna databasa proteîna nr û RefSeq NCBI hate kirin (nirxa e < 1e−10 û 60% homologî). BLASTX li ser kontîgên ne-xwe jî bi karanîna databasa proteîna nr û RefSeq NCBI hate kirin (nirxa e < 1e−10 û 60% homologî). BLASTX ev yek ji bo ku li ser nefermî ve girêdayî ye, bi karanîna nermalava NCBI û RefSeq NCBI (navdêriya <1e-10 û gemologîya 60%) tê dîtin. BLASTX li ser kontîgên ne-xwe jî bi karanîna databasa proteîna nr û RefSeq NCBI hate kirin (nirxa e < 1e-10 û 60% homologî).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX bi tevahî li ser nefermî ye ku tê bikar anîn û ji bo belka nr û RefSeq NCBI tê bikaranîn (navdêra <1e-10 û gemolojî 60%). BLASTX li ser kontîgên ne-xwe jî bi karanîna databasa proteîna nr û RefSeq NCBI hate kirin (nirxa e <1e-10 û 60% homologî).Hewzên BLASTN û BLASTX ên kontîgên ne-xwe-kontîgên dawîn temsîl dikin (li pelê Pêvek binêre).
Prîmerên ku ji bo PCR-ê hatine bikar anîn di Tabloya S1-ê de hatine rêzkirin. Ji bo amplîfîkasyona genên hedef ên ccfDNA-yê Taq DNA polîmeraz (Bio Basic Canada, Markham, ON) hat bikar anîn. Mercên reaksiyonê yên jêrîn hatin bikar anîn: denaturasyon li 95°C ji bo 3 deqîqeyan, 95°C ji bo 1 deqîqeyê, germahiya germkirinê ya sabît ji bo 1 deqîqeyê, dirêjkirin li 72°C ji bo 1 deqîqeyê, 35 çerx, û di dawiyê de 72°C di nav 10 deqîqeyan de. . Berhemên PCR-ê bi elektroforezê di jelên agarozê (1.5%) de ku SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) di 95 V de tê de hene, hatin veqetandin.
Mîdya (Mytilus spp.) di 500 ml ava deryayê ya oksîjenkirî (32 PSU) de ji bo 24 saetan di 4°C de hatin aklimatîzekirin. DNAya plazmîd a ku tê de pêvekek heye ku rêza cDNA ya galectin-7 ya mirovî kod dike (hejmara gihîştina NCBI L07769) bi rêjeya dawî ya 190 μg/μl li şûşeyê hat zêdekirin. Mîdyayên ku di heman şert û mercan de bêyî lêzêdekirina DNAyê hatin înkubasyonkirin, kontrol bûn. Tanka kontrolê ya sêyemîn DNAya bê mîdyeyan dihewîne. Ji bo şopandina kalîteya DNAyê di ava deryayê de, di wextê diyarkirî de ji her tankê nimûneyên ava deryayê (20 μl; sê dubarekirin) hatin girtin. Ji bo şopandina DNAya plazmîdê, mîdyayên LB di demên diyarkirî de hatin berhevkirin û bi qPCR û ddPCR hatin analîzkirin. Ji ber rêjeya xwêya bilind a ava deryayê, berî hemî ceribandinên PCRê, alîkot di ava bi kalîteya PCRê (1:10) de hatin şilkirin.
PCR-ya dilopên dîjîtal (ddPCR) bi karanîna protokola BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada) hate kirin. Profîla germahiyê bikar bînin da ku germahiya çêtirîn diyar bikin (Tabloya S1). Dilop bi karanîna jeneratorek dilopên QX200 (BioRad) hatin çêkirin. ddPCR wiha hate kirin: 95°C ji bo 5 deqeyan, 50 çerxên 95°C ji bo 30 saniyeyan û germahiyek germkirinê ya diyarkirî ji bo 1 deqeyê û 72°C ji bo 30 saniyeyan, 4°C ji bo 5 deqeyan û 90°C di nav 5 deqeyan de. Hejmara dilopan û reaksiyonên erênî (hejmara kopiyan/µl) bi karanîna xwendevanek dilopên QX200 (BioRad) hate pîvandin. Nimûneyên bi kêmtirî 10,000 dilopan hatin redkirin. Her gava ku ddPCR hate xebitandin, kontrola qalibê nehat kirin.
qPCR bi karanîna Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Awistralya) û primerên taybetî yên LGALS7 hate kirin. Hemî PCR-yên hejmarî di 20 µl de bi karanîna QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) hatin kirin. qPCR bi înkubasyonek 15 hûrdemî li 95°C dest pê kir û dû re 40 çerx li 95°C ji bo 10 saniyeyan û li 60°C ji bo 60 saniyeyan bi yek berhevkirina daneyan. Xêzên helandinê bi karanîna pîvandinên li pey hev li 95°C ji bo 5 saniyeyan, 65°C ji bo 60 saniyeyan, û 97°C di dawiya qPCR de hatin çêkirin. Her qPCR sê caran hate kirin, ji bilî nimûneyên kontrolê.
Ji ber ku midye bi rêjeya xwe ya bilind a parzûnkirinê têne nasîn, me pêşî lêkolîn kir ka gelo ew dikarin perçeyên DNA-yê yên di ava deryayê de parzûn bikin û biparêzin. Her wiha me eleqedar bû ka ev perçe di pergala wan a lîmfatîk a nîv-vekirî de kom dibin an na. Me ev pirsgirêk bi şopandina çarenûsa perçeyên DNA-yê yên çareserker ên ku li tankên mideyên şîn hatine zêdekirin bi awayekî ceribandinî çareser kir. Ji bo hêsankirina şopandina perçeyên DNA-yê, me DNA-ya plazmîdî ya biyanî (ne xwe) ku gena galectin-7 a mirovî dihewîne bikar anî. ddPCR perçeyên DNA-ya plazmîdî di ava deryayê û mideyan de dişopîne. Encamên me nîşan didin ku heke mîqdara perçeyên DNA-yê di ava deryayê de di nebûna mideyan de bi demê re (heta 7 rojan) nisbeten sabît bimîne, wê hingê di hebûna mideyan de ev ast di nav 8 demjimêran de hema hema bi tevahî winda dibe (Wêne 1a,b). Perçeyên DNA-ya eksojen di nav 15 hûrdeman de di şilava navvalvular û hemolîmfê de bi hêsanî hatin tespît kirin (Wêne 1c). Ev perçe hîn jî dikarin heta 4 demjimêran piştî eşkerekirinê werin tespît kirin. Ev çalakiya parzûnkirinê ya li gorî perçeyên DNA-yê bi çalakiya parzûnkirinê ya bakterî û algayan re berawirdî ye [31]. Ev encam nîşan didin ku midye dikarin DNAya biyanî di beşên şileya xwe de parzûn bikin û kom bikin.
Têkeliyên nisbî yên DNAya plazmîdê di ava deryayê de di hebûna (A) an nebûna (B) ya midyan de, ku bi ddPCR-ê hatine pîvandin. Di A-yê de, encam wekî rêjeyên sedî têne diyar kirin, sînorên qutiyan sedîyên 75 û 25 temsîl dikin. Xêza logarîtmîk a lihevhatî bi sor tê nîşandan, û herêma bi gewr tarîkirî navbera baweriya 95% temsîl dike. Di B-yê de, xeta sor navînî temsîl dike û xeta şîn navbera baweriya 95% ji bo têkeliyê temsîl dike. C Berhevkirina DNAya plazmîdê di hemolîmf û şileya valvular a midyan de di demên cûda de piştî lêzêdekirina DNAya plazmîdê. Encam wekî kopiyên mutleq ên hatine tespîtkirin/mL (±SE) têne pêşkêş kirin.
Piştre, me lêkolîn li ser eslê ccfDNA di mîdyayên ku ji nivînên mîdyayan li Giravên Kerguelen hatine berhevkirin, komek giravên dûr ên bi bandora antropojenîk a sînorkirî, lêkolîn kir. Ji bo vê armancê, cccDNA ji hemolîmfên mîdyayan bi rêbazên ku bi gelemperî ji bo paqijkirina cccDNA ya mirovan têne bikar anîn hate veqetandin û paqij kirin [32, 33]. Me dît ku rêjeya navînî ya ccfDNA ya hemolîmfê di mîdyayan de di rêjeya hemolîmfê ya kêm mîkrogram di her ml de ye (li Tabloya S2, Agahiyên Pêvek binêre). Ev rêjeya rêjeyan ji mirovên saxlem pir mezintir e (nanogramên kêm di her milîlîtreyê de), lê di rewşên kêm de, di nexweşên penceşêrê de, asta ccfDNA dikare bigihîje çend mîkrogram di her milîlîtreyê de [34, 35]. Analîzek li ser belavbûna mezinahiya hemolîmfê ccfDNA nîşan da ku ev perçe di mezinahiyê de pir diguherin, ji 1000 bp heya 1000 bp heya 5000 bp (Wêne 2). Encamên wekhev bi karanîna QIAamp Investigator Kit-a li ser bingeha silîkayê, ku rêbazek e ku bi gelemperî di zanista dadwerî de tê bikar anîn da ku bi lez DNA-ya genomîk ji nimûneyên DNA-ya bi konsantrasyona nizm, di nav de ccfDNA [36], were veqetandin û paqijkirin, hatin bidestxistin.
Elektroforegrama ccfDNA ya nûner a hemolîmfa midyeyê. Bi NucleoSnap Plasma Kit (jor) û QIAamp DNA Investigator Kit hatiye derxistin. Nexşeya B Violin belavbûna konsantrasyonên ccfDNA (±SE) yên hemolîmfê di midyeyan de nîşan dide. Xetên reş û sor bi rêzê navîn û çartîlên yekem û sêyem temsîl dikin.
Nêzîkî %1ê ccfDNAyê di mirov û prîmatan de ji çavkaniyek biyanî ye [21, 37]. Ji ber pergala gera xwînê ya nîv-vekirî ya masiyên duqalikî, ava deryayê ya dewlemend bi mîkrobî, û belavbûna mezinahiya ccfDNAya mîdyeyê, me texmîn kir ku ccfDNAya hemolîmfa mîdyeyê dibe ku hewzek dewlemend û cihêreng a DNAya mîkrobî dihewîne. Ji bo ceribandina vê hîpotezê, me ccfDNAya hemolîmfa ji nimûneyên Aulacomya atra yên ji Giravên Kerguelen hatine berhevkirin rêz kir, ku zêdetirî 10 mîlyon xwendin bi dest xistin, ku %97.6ê wan ji kontrola kalîteyê derbas bûn. Dûv re xwendin li gorî çavkaniyên xwe û ne-xwe bi karanîna databasayên masiyên duqalikî yên BLASTN û NCBI hatin dabeş kirin (Wêne S1, Agahiyên Pêvek).
Di mirovan de, hem DNAya navokî û hem jî ya mîtokondrî dikarin bikevin nav xwînê [38]. Lêbelê, di vê lêkolînê de, ne gengaz bû ku bi hûrgulî DNAya genomîk a navokî ya midyan were vegotin, ji ber ku genoma A. atra nehatiye rêzkirin an jî ravekirin. Lêbelê, me karibû hejmarek perçeyên ccfDNA yên bi eslê xwe bi karanîna pirtûkxaneya duqalikî nas bikin (Wêne S2, Agahiyên Pêvek). Me hebûna perçeyên DNA yên bi eslê xwe jî bi amplîfîkasyona PCR ya rasterast a wan genên A. atra yên ku hatine rêzkirin piştrast kir (Wêne 3). Bi heman awayî, ji ber ku genoma mîtokondrî ya A. atra di databasên giştî de heye, meriv dikare delîlên hebûna perçeyên ccfDNA yên mîtokondrî di hemolîmfa A. atra de bibîne. Hebûna perçeyên DNAya mîtokondrî bi amplîfîkasyona PCR hate piştrast kirin (Wêne 3).
Di hemolîmfa A. atra (xalên sor - hejmara stokê: SRX5705969) û M. platensis (xalên şîn - hejmara stokê: SRX5705968) de cûrbecûr genên mîtokondrî hebûn ku bi PCR-ê hatin amplîfîkkirin. Wêne ji Breton et al., 2011 B hatîye adaptekirin. Amplîfîkasyona supernatantê hemolîmfê ji A. atra Li ser kaxezê FTA hatîye hilanîn. Ji bo ku rasterast li lûleya PCR-ê ya ku têkelê PCR-ê tê de heye zêde bikin, qulikek 3 mm bikar bînin.
Ji ber naveroka mîkrobî ya zêde di ava deryayê de, me di destpêkê de li ser taybetmendiya rêzikên DNA-ya mîkrobî di hemolîmfê de sekinî. Ji bo vê yekê, em du stratejiyên cûda bikar tînin. Stratejiya yekem Kraken2 bikar anî, bernameyek dabeşkirina rêzikên li ser bingeha algorîtmayê ku dikare rêzikên mîkrobî bi rastbûnek berawirdî bi BLAST û amûrên din re nas bike [28]. Zêdetirî 6719 xwendin hatin destnîşankirin ku ji eslê bakterî ne, di heman demê de 124 û 64 ji arkea û vîrusan bûn, bi rêzê ve (Wêne 4). Parçeyên DNA-ya bakterî yên herî zêde Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), û Bacteroidetes (17%) bûn (Wêne 4a). Ev belavbûn bi lêkolînên berê yên li ser mîkrobioma mîdyaya şîn a deryayî re lihevhatî ye [39, 40]. Gammaproteobacteria çîna sereke ya Proteobacteria bû (44%), di nav de gelek Vibrionales (Wêne 4b). Rêbaza ddPCR hebûna perçeyên DNA-ya Vibrio di ccfDNA-ya hemolîmfa A. atra de piştrast kir (Wêne 4c) [41]. Ji bo ku bêtir agahdarî li ser eslê bakterî yê ccfDNA bi dest bixin, rêbazek din hate girtin (Wêne S2, Agahdariya Pêvek). Di vê rewşê de, xwendinên ku li hevdu ketine wekî xwendinên dawiya-cotkirî hatine berhevkirin û bi karanîna BLASTN û nirxa e ya 1e−3 û qutbûnek bi homologiya ji %90 zêdetir wekî xwendinên xwe (duqalv) an ne-xwe hatine dabeşkirin. Di vê rewşê de, xwendinên ku li hevdu ketine wekî xwendinên dawiya-cotkirî hatine berhevkirin û bi karanîna BLASTN û nirxa e ya 1e−3 û qutbûnek bi homologiya ji %90 zêdetir wekî xwendinên xwe (duqalv) an ne-xwe hatine dabeşkirin. Di heman demê de ev yek ji wan kesane ye ku ev yek ji wan kesane ye. 1e-3 и отсечения со omologiey> 90%. Di vê rewşê de, xwendinên hevgirtî wekî xwendinên cot-dawî hatin berhevkirin û bi karanîna BLASTN û nirxa e ya 1e-3 û qutkirina bi homologiya ji %90 zêdetir wekî xwemalî (duqalikî) an ne-orjînal hatin dabeşkirin.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皌e >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 猿1-e3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 Di vê yekê de têgihîştinek e ku ji ber vê yekê ve girêdayî ye. 1e-3 и gemarî> 90%. Di vê rewşê de, xwendinên hevgirtî wekî xwendinên cot-dawî hatin berhevkirin û wekî xwe (duqal) an ne-orjînal bi karanîna nirxên eBLASTN û 1e-3 û eşikek homologiyê >90% hatin dabeşkirin.Ji ber ku genoma A. atra hîn nehatiye rêzkirin, me stratejiya komkirina de novo ya komkera MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) bi kar anî. Bi tevahî 147,188 kontîg wekî girêdayî (duvalves) ên eslê xwe hatine destnîşankirin. Dûv re ev kontîg bi nirxên e yên 1e-10 bi karanîna BLASTN û BLASTX hatin teqandin. Vê stratejiyê rê da me ku em 482 perçeyên ne-duvalve yên di ccfDNA ya A. atra de destnîşan bikin. Zêdetirî nîvê (57%) van perçeyên DNA ji bakteriyan hatine wergirtin, bi piranî ji sîmbîyontên gilî, di nav de sîmbîyontên sulfotrofîk, û ji sîmbîyontên gilî Solemya velum (Wêne 5).
Pirbûna nisbî di asta celebê de. B Cûrbecûrîya mîkrobî ya du fîlayên sereke (Firmicutes û Proteobacteria). Zêdebûna nûner a ddPCR C Vibrio spp. A. Parçeyên gena 16S rRNA (şîn) di sê hemolîmfên atra de.
Bi tevahî 482 kontîgên berhevkirî hatin analîzkirin. Profîla giştî ya belavbûna taksonomîk a şîrovekirinên kontîgên metagenomîk (prokaryot û eukaryot). B Belavbûna berfireh a perçeyên DNA yên bakterî yên ku ji hêla BLASTN û BLASTX ve hatine destnîşankirin.
Analîza Kraken2 her wiha nîşan da ku ccfDNA ya mîdyeyan perçeyên DNAya arkeal dihewîne, di nav de perçeyên DNA yên Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), û Thaurmarcheota (11%) (Wêne 6a). Hebûna perçeyên DNA yên ji Euryarchaeota û Crenarchaeota hatine wergirtin, ku berê di civaka mîkrobî ya mîdyeyên Kalîforniyayê de hatine dîtin, divê ne surprîz be [42]. Her çend Euryarchaeota pir caran bi şert û mercên ekstrem ve girêdayî ye jî, naha tê zanîn ku hem Euryarchaeota û hem jî Crenarcheota di nav prokaryotên herî gelemperî yên di jîngeha krîyojenîk a deryayî de ne [43, 44]. Hebûna mîkroorganîzmayên metanojenîk di mîdyeyan de ne ecêb e, ji ber raporên dawî yên li ser rijandina metanê ya berfireh ji rijandina binê li ser Platoya Kerguelen [45] û hilberîna metanê ya mîkrobî ya gengaz ku li peravên Giravên Kerguelen hatiye dîtin [46].
Paşê bala me çû ser xwendinên ji vîrusên DNAyê. Bi qasî ku em dizanin, ev yekem lêkolîna derveyî armancê ye li ser naveroka vîrusê ya midyan. Wekî ku dihat hêvîkirin, me perçeyên DNAyê yên bakterîofaj (Caudovirales) dîtin (Wêne 6b). Lêbelê, DNAya vîrusî ya herî gelemperî ji fîlûmek nukleosîtovîrusan tê, ku wekî vîrusa DNAya mezin a sîtoplazmayî ya navokî (NCLDV) jî tê zanîn, ku xwediyê genoma herî mezin a her vîrusî ye. Di nav vê fîlûmê de, piraniya rêzikên DNAyê yên malbatên Mimimidoviridae (%58) û Poxviridae (%21) ne, ku mêvandarên wan ên xwezayî movikdar û artropod in, di heman demê de beşek piçûk ji van rêzikên DNAyê yên algayên vîrusî yên naskirî ne. Algayên eukaryotîk ên deryayî enfeksiyon dike. Rêz ji vîrusa Pandora jî hatine wergirtin, vîrusa gewre ya ku mezinahiya genoma herî mezin a her cinsên vîrusî yên naskirî heye. Bi balkêşî, rêza mêvandarên ku bi vîrusê vegirtî ne, wekî ku bi rêzkirina hemolîmfê ccfDNA ve hatî destnîşankirin, nisbeten mezin bû (Wêne S3, Agahiyên Pêvek). Ew vîrusên ku kêzikan wekî Baculoviridae û Iridoviridae, û her weha vîrusên ku amîba, alg û movikdaran vedigirin jî dihewîne. Me her wiha rêzikên ku bi genoma Pithovirus sibericum re li hev dikin dîtin. Pîtovîrus (ku wekî "vîrusên zombî" jî têne zanîn) cara yekem ji permafrostê 30,000 salî li Sîbîryayê hatine veqetandin [47]. Bi vî rengî, encamên me bi raporên berê re lihevhatî ne ku nîşan didin ku ne hemî cureyên nûjen ên van vîrusan nemane [48] û ku dibe ku ev vîrus di ekosîstemên deryayî yên subarktîk ên dûr de hebin.
Di dawiyê de, me ceriband da ku em bibînin ka em dikarin perçeyên DNA-yê ji heywanên pirhucreyî yên din bibînin. Bi tevahî 482 kontîgên biyanî ji hêla BLASTN û BLASTX ve bi pirtûkxaneyên nt, nr û RefSeq (genomîk û proteîn) hatin nas kirin. Encamên me nîşan didin ku di nav perçeyên biyanî yên ccfDNA-yê yên heywanên pirhucreyî de DNA-ya hestiyên hestî serdest e (Wêne 5). Perçeyên DNA-yê ji kêzikan û cureyên din jî hatine dîtin. Beşek nisbeten mezin ji perçeyên DNA-yê nehatine nas kirin, dibe ku ji ber kêmbûna temsîla hejmareke mezin ji cureyên deryayî di databasên genomîk de li gorî cureyên bejayî [49].
Di vê gotarê de, em têgeha LB li ser midyan bikar tînin, û dibêjin ku rêzkirina guleya hemolîmfa ccfDNA dikare têgihîştinê li ser pêkhateya ekosîstemên peravên deryayî peyda bike. Bi taybetî, me dît ku 1) hemolîmfa midyan dihewîne rêjeyên nisbeten bilind (asta mîkrogram) ji perçeyên DNA yên di gerê de yên nisbeten mezin (~1-5 kb); 2) ev perçeyên DNA hem serbixwe û hem jî ne-serbixwe ne 3) Di nav çavkaniyên biyanî yên van perçeyên DNA de, me DNAya bakterî, arkeal û vîrusî, û her weha DNAya heywanên pirhucreyî yên din dît; 4) Berhevkirina van perçeyên ccfDNA yên biyanî di hemolîmfê de bi lez çêdibe û beşdarî çalakiya fîlterkirina navxweyî ya midyan dibe. Di encamê de, lêkolîna me nîşan dide ku têgeha LB, ku heta niha bi giranî di warê biyotibbê de hatiye sepandin, çavkaniyek dewlemend lê nehatî lêkolîn kirin a zanînê kod dike ku dikare were bikar anîn da ku têkiliya di navbera cureyên çavdêr û jîngeha wan de çêtir were fêm kirin.
Ji bilî prîmatan, veqetandina ccfDNA di memikan de, di nav de mişk, kûçik, pisîk û hespan jî, hatiye ragihandin [50, 51, 52]. Lêbelê, bi qasî ku em dizanin, lêkolîna me yekem lêkolîna ku tespîtkirin û rêzkirina ccfDNA di cureyên deryayî yên bi pergala gera vekirî de radigihîne ye. Ev taybetmendiya anatomîk û şiyana fîlterkirinê ya mîdyeyan, bi kêmanî beşek jê, dibe ku taybetmendiyên cûda yên mezinahiya perçeyên DNA yên di nav xwînê de li gorî cureyên din rave bike. Di mirovan de, piraniya perçeyên DNA yên di nav xwînê de digere perçeyên piçûk in ku mezinahiya wan ji 150 heta 200 bp ye, bi lûtkeya herî zêde 167 bp [34, 53]. Beşek piçûk lê girîng a perçeyên DNA di navbera 300 û 500 bp de ne, û bi qasî 5% ji 900 bp dirêjtir in. [54]. Sedema vê belavkirina mezinahîyê ew e ku çavkaniya sereke ya ccfDNA di plazmayê de wekî encama mirina şaneyan çêdibe, an ji ber mirina şaneyan an jî ji ber nekroza şaneyên hematopoietîk ên di nav rê de di kesên saxlem de an jî ji ber apoptoza şaneyên tumorê di nexweşên penceşêrê de (ku wekî DNAya tumorê ya di nav rê de tê zanîn). , ctDNA). Belavbûna mezinahîya hemolîmfa ccfDNA ku me di mîdyeyan de dît ji 1000 heta 5000 bp diguhere, ku ev yek nîşan dide ku ccfDNAya mîdyeyan xwedî esleke cuda ye. Ev hîpotezeke mantiqî ye, ji ber ku mîdye xwedî pergaleke damarî ya nîv-vekirî ne û di jîngehên avî yên deryayî de dijîn ku tê de DNAya genomîk a mîkrobî ya bi konsantrasyonên bilind hene. Bi rastî, ceribandinên me yên laboratîfê yên ku DNAya eksojen bikar tînin nîşan dane ku mîdye perçeyên DNAyê di ava deryayê de kom dikin, bi kêmanî piştî çend demjimêran ew piştî kişandina şaneyan û/an berdan û/an jî di rêxistinên cûda de têne hilanîn. Ji ber kêmbûna hucreyan (hem prokaryotîk û hem jî eukaryotîk), karanîna beşên nav-valvular dê mîqdara ccfDNA-yê ji çavkaniyên xwe û hem jî ji çavkaniyên biyanî kêm bike. Bi berçavgirtina girîngiya parastina xwemalî ya duvalvan û jimara mezin a fagosîtên di nav xwînê de, me bêtir texmîn kir ku tewra ccfDNA-ya biyanî jî di fagosîtên di nav xwînê de dewlemend e ku DNA-ya biyanî dema ku mîkroorganîzma û/an bermayiyên hucreyî digirin kom dikin. Bi hev re, encamên me nîşan didin ku ccfDNA-ya hemolîmfa duvalvan depoyek bêhempa ya agahdariya molekulî ye û statuya wan wekî cureyek çavdêr xurt dike.
Daneyên me nîşan didin ku rêzkirin û analîzkirina perçeyên hemolîmfa ccfDNA yên ji bakteriyan hatine wergirtin dikare agahdariya sereke li ser flora bakteriya mêvandar û bakteriyên ku di ekosîstema deryayî ya derdorê de hene peyda bike. Teknîkên rêzkirina guleyan rêzikên bakteriya komensal A. atra gill eşkere kirine ku ger rêbazên nasnameya 16S rRNA yên kevneşopî bihatana bikar anîn, dê ji dest bidana, ji ber ku beşek ji ber xeletiya pirtûkxaneya referansê ye. Bi rastî, karanîna me ya daneyên LB yên ji M. platensis di heman qata mîdyeyê de li Kerguelenê hatine berhevkirin nîşan da ku pêkhateya sîmbîyontên bakterî yên bi gill ve girêdayî ji bo her du cureyên mîdyeyê yek bû (Wêne S4, Agahiyên Pêvek). Ev dişibiya du mîdyeyên genetîkî yên cûda dibe ku pêkhateya civakên bakteriyan di depoyên sar, sulfur û volkanîk ên Kerguelenê de nîşan bide [55, 56, 57, 58]. Asta bilindtir a mîkroorganîzmayên kêmkirina sulfur dema ku mîdye ji deverên peravê yên biyoturbatkirî têne berhev kirin baş hatine vegotin [59], wekî perava Port-au-France. Îhtîmaleke din jî ew e ku flora midya komensal dibe ku ji hêla veguhestina horizontî ve bandor bibe [60, 61]. Ji bo destnîşankirina têkiliya di navbera jîngeha deryayî, rûyê erdê û pêkhateya bakteriyên sîmbiyotîk di midyayan de lêkolînên bêtir hewce ne. Ev lêkolîn niha berdewam in.
Dirêjahî û giraniya hemolîmfa ccfDNA, hêsaniya paqijkirina wê, û kalîteya bilind ji bo rêdana rêzkirina bilez a bi rêbaza şotgunê hin ji gelek avantajên karanîna ccfDNA ya mîdyeyan ji bo nirxandina biyolojîk cihêrengiyê di ekosîstemên peravên deryayî de ne. Ev rêbaz bi taybetî ji bo taybetmendiya civakên vîrusî (vîrom) di ekosîstemek diyarkirî de bi bandor e [62, 63]. Berevajî bakterî, arkea û eukaryotan, genomên vîrusî genên fîlojenetîk parastî yên wekî rêzikên 16S nagirin. Encamên me nîşan didin ku biyopsiyên şile ji cureyên nîşanker ên wekî mîdyeyan dikarin werin bikar anîn da ku hejmareke nisbeten mezin ji perçeyên vîrusa ccfDNA werin destnîşankirin ku tê zanîn ku mêvandaran vegirtî dikin ku bi gelemperî di ekosîstemên deryayî yên peravê de dijîn. Ev vîrusên ku tê zanîn ku protozoa, artropod, kêzik, nebat û vîrusên bakterî (mînak, bakterîofaj) vegirtî dikin jî di nav xwe de digire. Belavbûnek dişibihe vê yekê dema ku me vîroma hemolîmfa ccfDNA ya mîdyeyên şîn (M. platensis) ku di heman qata mîdyeyan de li Kerguelen hatine berhevkirin lêkolîn kir (Tabloya S2, Agahiyên Pêvek). Bi rastî jî rêzkirina şotgun a ccfDNA rêbazek nû ye ku di lêkolîna vîroma mirovan an cureyên din de cih digire [21, 37, 64]. Ev rêbaz bi taybetî ji bo lêkolîna vîrusên DNA-ya du-telî bikêr e, ji ber ku di nav hemî vîrusên DNA-ya du-telî de tu genek nayê parastin, ku çîna vîrusên herî cihêreng û berfireh li Baltimore temsîl dike [65]. Her çend piraniya van vîrusan nehatine dabeşkirin û dibe ku vîrusên ji beşek bi tevahî nenas a cîhana vîrusê di nav xwe de bigirin [66], me dît ku vîrom û rêzên mêvandar ên mideyên A. atra û M. platensis di navbera her du cureyan de ne. bi heman rengî (li wêneya S3, agahdariya zêde binêre). Ev dişibiya wê ne ecêb e, ji ber ku dibe ku nebûna bijartîbûnê di wergirtina DNA-ya heyî ya di jîngehê de nîşan bide. Lêkolînên pêşerojê yên ku RNA-ya paqijkirî bikar tînin niha ji bo taybetmendiya vîroma RNA hewce ne.
Di lêkolîna me de, me boriyek pir hişk bikar anî ku ji xebata Kowarski û hevkarên wî [37] hatiye adaptekirin, yên ku berî û piştî komkirina ccfDNA-ya xwemalî jêbirina du-gavî ya xwendinên komkirî û kontîgan bikar anîn, ku di encamê de rêjeyek bilind a xwendinên nexebitî çêbû. Ji ber vê yekê, em nikarin red bikin ku hin ji van xwendinên nexebitî hîn jî eslê xwe hebin, bi giranî ji ber ku me genoma referansê ji bo vê cureyê mîdyeyê tune. Me ev boriyek jî bikar anî ji ber ku em ji kîmerayên di navbera xwendinên xwe û ne-xwe de û dirêjahiya xwendinê ya ku ji hêla Illumina MiSeq PE75 ve hatî çêkirin bi fikar bûn. Sedemek din a piraniya xwendinên nexebitî ev e ku piraniya mîkrobên deryayî, nemaze li deverên dûr ên wekî Kerguelen, nehatine şîrovekirin. Me Illumina MiSeq PE75 bikar anî, bi texmîna ku dirêjahiya perçeyên ccfDNA dişibin ccfDNA-ya mirovan. Ji bo lêkolînên pêşerojê, ji ber ku encamên me nîşan didin ku hemolîmfa ccfDNA xwendinên dirêjtir ji mirovan û/an memikan hene, em pêşniyar dikin ku platformek rêzkirinê bikar bînin ku ji bo perçeyên ccfDNA yên dirêjtir guncantir e. Ev pratîk dê pir hêsantir bike ku bêtir nîşanan ji bo analîzek kûrtir nas bikin. Bidestxistina rêza genoma navokî ya A. atra ya temam a ku niha peyda nabe dê di heman demê de cûdakirina ccfDNA ji çavkaniyên xwe û ne-xwe jî pir hêsan bike. Ji ber ku lêkolîna me li ser îhtîmala sepandina têgeha biyopsiya şile li ser midyan sekinîye, em hêvî dikin ku ji ber ku ev têgeh di lêkolînên pêşerojê de tê bikar anîn, amûr û boriyên nû dê werin pêşve xistin da ku potansiyela vê rêbazê ji bo lêkolîna cihêrengiya mîkrobî ya midyan zêde bikin. ekosîstema deryayî.
Wekî nîşaneyek klînîkî ya ne-dagirker, asta bilind a ccfDNA ya plazmaya mirovan bi nexweşiyên cûrbecûr, zirara tevnê û şert û mercên stresê ve girêdayî ye [67,68,69]. Ev zêdebûn bi berdana perçeyên DNA yên bi eslê xwe piştî zirara tevnê ve girêdayî ye. Me ev pirsgirêk bi karanîna stresa germê ya akût çareser kir, ku tê de mêş demek kurt li germahiya 30 °C hatin danîn. Me ev analîz li ser sê celebên cûda yên mêşan di sê ceribandinên serbixwe de pêk anî. Lêbelê, me piştî stresa germê ya akût tu guhertinek di asta ccfDNA de nedît (li Wêne S5, agahdariya zêde binêre). Ev vedîtin dibe ku, bi kêmanî beşek, rastiya ku mêş xwedî pergalek gera xwînê ya nîv-vekirî ne û ji ber çalakiya wan a fîlterkirinê ya bilind gelek DNA-ya biyanî kom dikin rave bike. Ji hêla din ve, mêş, mîna gelek bêwerteberan, dibe ku li hember zirara tevnê ya ji ber stresê berxwedêrtir bin, bi vî rengî berdana ccfDNA di hemolîmfa wan de sînordar bikin [70, 71].
Heta niha, analîza DNA ya biyolojîk di ekosîstemên avî de bi giranî li ser metabarkodkirina DNAya jîngehê (eDNA) disekine. Lêbelê, ev rêbaz bi gelemperî di analîza biyolojîk de sînordar e dema ku prîmer têne bikar anîn. Bikaranîna rêzkirina shotgun sînorkirinên PCR û hilbijartina alîgir a setên prîmeran derbas dike. Bi vî rengî, bi awayekî, rêbaza me nêzîktirî rêbaza rêzkirina eDNA Shotgun a ku vê dawiyê bi rêça bilind tê bikar anîn e, ku dikare rasterast DNAya perçebûyî rêz bike û hema hema hemî organîzmayan analîz bike [72, 73]. Lêbelê, hejmarek pirsgirêkên bingehîn hene ku LB ji rêbazên standard ên eDNA cuda dikin. Bê guman, cûdahiya sereke di navbera eDNA û LB de karanîna mêvandarên fîlterên xwezayî ye. Bikaranîna cureyên deryayî yên wekî sifinc û duqalik (Dresseina spp.) wekî fîlterek xwezayî ji bo lêkolîna eDNA hatiye ragihandin [74, 75]. Lêbelê, lêkolîna Dreissena biyopsiyên tevnê bikar anîn ku DNA ji wan hate derxistin. Analîza ccfDNA ji LB biyopsiya tevnê, alavên taybetî û carinan biha û lojîstîkên têkildarî eDNA an biyopsiya tevnê hewce nake. Bi rastî, me vê dawiyê ragihand ku ccfDNA ji LB dikare bi piştgiriya FTA bêyî parastina zincîra sar were hilanîn û analîz kirin, ku ev ji bo lêkolînên li deverên dûr dijwariyek mezin e [76]. Derxistina ccfDNA ji biyopsiyên şile jî hêsan e û DNA-ya bi kalîte bilind ji bo rêzkirina gulebaranê û analîza PCR peyda dike. Ev avantajek mezin e ji ber hin sînorkirinên teknîkî yên têkildarî analîza eDNA [77]. Sadebûn û lêçûna kêm a rêbaza nimûnegirtinê jî bi taybetî ji bo bernameyên çavdêriya demdirêj guncan e. Ji bilî şiyana wan a fîlterkirinê ya bilind, taybetmendiyek din a baş-naskirî ya duqalikan pêkhateya kîmyewî ya mukopolisakarîdê ya mukusa wan e, ku vegirtina vîrusan pêşve dixe [78, 79]. Ev yek duqalikan dike fîlterek xwezayî ya îdeal ji bo taybetmendiya biyolojîk û bandora guherîna avhewayê li ekosîstemek avî ya diyarkirî. Her çend hebûna perçeyên DNA-yê yên ji mêvandar hatine wergirtin dikare wekî sînorkirinek rêbazê li gorî eDNA-yê were dîtin jî, lêçûna têkildarî hebûna ccfDNA-yek xwemalî ya wisa li gorî eDNA-yê di heman demê de ji bo mîqdara mezin a agahdariya ku ji bo lêkolînên tenduristiyê heye têgihîştî ye. mêvandarê offset. Ev hebûna rêzikên vîrusî yên ku di nav genoma mêvandar de hatine entegre kirin vedihewîne. Ev bi taybetî ji bo mîdyeyan girîng e, ji ber hebûna retrovîrusên losemîk ên ku bi awayekî horizontî têne veguheztin di duqalikan de [80, 81]. Sûdek din a LB-ê li ser eDNA-yê ev e ku ew çalakiya fagosîtîk a şaneyên xwînê yên di nav hemolîmfê de bikar tîne, ku mîkroorganîzmayan (û genomên wan) digire nav xwe. Fagosîtoz fonksiyona sereke ya şaneyên xwînê di duqalikan de ye [82]. Di dawiyê de, rêbaz ji kapasîteya fîlterkirina bilind a mîdyeyan (bi navînî 1.5 l/saet ava deryayê) û gera du-rojî sûd werdigire, ku tevlihevkirina tebeqeyên cûda yên ava deryayê zêde dike, ku dihêle eDNA-ya heterolog were girtin. [83, 84]. Ji ber vê yekê, analîza ccfDNA ya mîdyeyan rêyek balkêş e ji ber bandorên xurek, aborî û jîngehî yên mîdyeyan. Mîna analîza LB ya ji mirovan hatî berhevkirin, ev rêbaz di heman demê de îhtîmala pîvandina guhertinên genetîkî û epîgenetîkî di DNAya mêvandar de di bersiva madeyên derveyî de vedike. Mînakî, teknolojiyên rêzkirina nifşa sêyemîn dikarin werin pêşbînîkirin ku analîza metilasyonê ya tevahiya genomê di ccfDNAya xwemalî de bi karanîna rêzkirina nanopore pêk bînin. Divê ev pêvajo bi vê rastiyê were hêsankirin ku dirêjahiya perçeyên ccfDNA yên mîdyeyan bi îdealî bi platformên rêzkirina dirêj-xwendinê re hevaheng e ku destûrê didin analîza metilasyona DNA ya tevahiya genomê ji yek rêzkirinê bêyî hewcedariya veguherînên kîmyewî.85,86] Ev îhtîmalek balkêş e, ji ber ku hatiye nîşandan ku qalibên metilasyona DNA bersivek ji stresa jîngehê re nîşan didin û di gelek nifşan de berdewam dikin. Ji ber vê yekê, ew dikare têgihîştinek hêja li ser mekanîzmayên bingehîn ên ku bersivê piştî rûbirûbûna guherîna avhewayê an gemaran birêve dibin peyda bike [87]. Lêbelê, karanîna LB bê sînorkirin nine. Ne hewce ye ku bê gotin, ev hebûna cureyên nîşanker di ekosîstemê de hewce dike. Wekî ku li jor hate gotin, karanîna LB ji bo nirxandina biyolojîkbûna ekosîstemek diyarkirî di heman demê de pêdivî bi boriyek biyoenformatîkî ya hişk heye ku hebûna perçeyên DNA-yê ji çavkaniyê li ber çavan digire. Pirsgirêkek din a girîng hebûna genomên referansê ji bo cureyên deryayî ye. Tê hêvî kirin ku destpêşxeriyên wekî Projeya Genomên Memikên Deryayî û projeya Fish10k ya ku vê dawiyê hatî damezrandin [88] dê di pêşerojê de analîzek wusa hêsan bikin. Sepandina têgeha LB li ser organîzmayên ku fîlterên deryayî dixwin jî bi pêşkeftinên herî dawî di teknolojiya rêzkirinê de lihevhatî ye, ku wê ji bo pêşxistina nîşankerên pir-ohm baş guncan dike da ku agahdariya girîng li ser tenduristiya jîngehên deryayî di bersiva stresa jîngehê de peyda bike.
Daneyên rêzkirina genomê di Arşîva Xwendina Rêzikan a NCBI de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 di bin Bioprojects SRR8924808 de hatine hilanîn.
Brierley AS, Kingsford MJ Bandora guherîna avhewayê li ser jiyana deryayî û ekosîsteman. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, û yên din. Bandorên hevbeş ên guherîna avhewayê û stresorên din ên herêmî li ser jîngeha deryayî bifikirin. jîngeha zanistî ya giştî. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Zanyarî ya yekem adarê. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kêmkirina toleransa germê di bin şert û mercên stresa germê ya dubarekirî de mirina bilind a midyayên şîn di havînê de rave dike. Rapora zanistî 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, û yên din. Guhertinên dawî di pirbûn, sedem û rêjeya mirina heywanan de. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Gelek pathogenên ne-cure-taybetî dibe ku bûne sedema mirina girseyî ya Pinna nobilis. Jîyan. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Bandora potansiyel a guherîna avhewayê li ser nexweşiyên zoonotîk ên Arktîkê. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. û yên din. Mîdyayên şîn (Mytilus edulis spp.) wekî organîzmayên sînyalê di çavdêriya qirêjiya peravê de: nirxandinek. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Entegrasyona biyopsiya şile di dermankirina penceşêrê de. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, û yên din. Pîvandina biyopsiya şile: Dihêle ku DNAya tumorê bigerre. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asîdên nukleîk di plazmaya mirovan de. Protokolên civînên şîrketên girêdayî Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Roleke nû ji bo DNAya bêhucre wekî nîşankerek molekulî ji bo dermankirina penceşêrê. Pîvandina analîza biyomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biyopsiya şile dikeve klînîkê - pirsgirêkên pêkanînê û zehmetiyên pêşerojê. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW û yên din. DNAya fetusê di plazma û seruma dayikê de heye. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Lêkolîna li ser rêça ducaniyê û tevliheviyên wê bi karanîna RNA-ya derveyî hucreyê ya di xwîna jinan de di dema ducaniyê de. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, û yên din. Biyopsiya şile: DNAya bê şaneya donor ji bo tespîtkirina lezyonên alogenîk di grafta gurçikê de tê bikar anîn. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Nûjenî di teşhîsa berî zayînê de: rêzkirina genoma plazmaya dayikê. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, û yên din. Tesbîtkirina bilez a patojenan bi rêzkirina metagenomîk a nifşê din a şilavên laş ên vegirtî. Nat Medicine. 2021;27:115-24.