Spas ji bo serdana Nature.com.Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgirîya CSS-ê sînordar e.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgirîya domdar, em ê malperê bê şêwaz û JavaScript pêşkêş bikin.
Ji bo ceribandina narkotîkê pêdivî bi pergalek pêbawer a in vitro heye ku bikaribe hawîrdora fîzyolojîk a dil bi rast ji nû ve hilberîne.Hebûna tixûbdar a pergalên çanda tevna dilê mirovan rê li ber şîroveyên nerast ên bandorên dermanên dil vekiriye.Li vir, me modelek çanda tevna dil (CTCM) pêşxistiye ku bi elektromekanîkî perçeyên dil teşwîq dike û di qonaxên sistolîk û diastolîk ên çerxa dil de di bin dirêjbûna fîzyolojîk de derbas dibe.Piştî çandê ya 12 rojan, vê nêzîkatiyê bi qismî zindîbûna beşên dil baştir kir, lê yekbûna wan a binesaziyê bi tevahî neparast.Ji ber vê yekê, piştî ceribandina molekulên piçûk, me dît ku lêzêdekirina 100 nM triiodothyronine (T3) û 1 μM dexamethasone (Dex) li navgîna me mîkrostruktura beşan 12 rojan domand.Bi hevgirtina bi dermankirina T3 / Dex re, pergala CTCM 12 rojan profîlên transkrîpsiyonê, zindîbûn, çalakiya metabolîk, û yekbûna avahîsaziyê di heman astê de wekî tevna dilê nû dom kir.Wekî din, dirêjbûna zêde ya tevna dil di çandê de îşaretkirina dil hîpertrofîk çêdike, ku delîl ji kapasîteya CTCM re peyda dike ku şert û mercên hîpertrofîkî yên ku ji hêla dirêjbûna dil ve hatî çêkirin bişopîne.Di encamê de, CTCM dikare fîzyolojî û patofîzyolojiya dil di çandê de di nav demên dirêj de model bike, ku şansê dermanê pêbawer bike.
Berî lêkolîna klînîkî, pergalên in vitro yên pêbawer hewce ne ku dikarin hawîrdora fîzyolojîkî ya dilê mirov bi rengek rast nûve bikin.Pergalên weha divê dirêjbûna mekanîkî, rêjeya dil, û taybetmendiyên elektrofîzyolojîk ên guhezbar teqlîd bikin.Modelên heywanan bi gelemperî wekî platformek pîvandinê ji bo fîzyolojiya dil bi pêbaweriyek tixûbdar di ronîkirina bandorên dermanan di dilê mirovan de têne bikar anîn1,2.Di dawiyê de, Modela Ezmûnî ya Çanda Tîsa Dilê Ideal (CTCM) modelek e ku ji bo cûrbecûr destwerdanên dermanî û dermankolojîkî pir hesas û taybetî ye, ku bi rast fîzyolojî û pathofîzyolojiya dilê mirovî nûve dike3.Nebûna pergalek weha vedîtina dermankirinên nû ji bo têkçûna dil sînordar dike4,5 û bûye sedem ku kardiotoksîkiya narkotîkê bibe sedemek sereke ya derketina bazarê6.
Di deh salên borî de, heşt dermanên ne-kardiovaskuler ji karanîna klînîkî hatine derxistin ji ber ku ew dibin sedema dirêjkirina navberê QT ku dibe sedema aritmiya ventrikular û mirina ji nişka ve7.Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku pêdivî ye ku stratejiyên pêbawer ên pêş-klînîkî yên pêbawer ji bo nirxandina bandorkeriya dil û jehrê.Bikaranîna vê dawîyê ya kardiomyocytes (hiPS-CM) yên ku ji hucreyên stem ên pirzimanî yên ku ji hêla mirovan ve hatî çêkirin di ceribandina derman û ceribandina jehrê de çareseriyek qismî ji vê pirsgirêkê re peyda dike.Lêbelê, xwezaya negihîştî ya hiPS-CM û nebûna tevliheviya pirhucreyî ya tevna dil sînorên sereke yên vê rêbazê ne.Lêkolînên vê dawîyê destnîşan kirin ku ev sînor dikare bi karanîna destpêkê ya hiPS-CM-ê ve were derbas kirin da ku hîdrogelên tevna dil di demek kurt de piştî destpêkirina girêbestên spontan ava bike û hêdî hêdî bi zeman re stimulasyona elektrîkê zêde bike.Lêbelê, van mîkrobatên hiPS-CM ne xwediyê taybetmendiyên elektrofîzyolojîk û girêbestên gihîştî yên mîokardiya mezinan in.Wekî din, tevna dilê mirovî xwedan avahiyek tevlihevtir e, ku ji tevliheviyek heterojen a celebên hucreyên cihêreng, di nav de hucreyên endotelyal, noyron, û fîbroblastên stromal, pêk tê, ku ji hêla komên taybetî yên proteînên matrixê derveyî hucreyî ve girêdayî ne.Ev heterojeniya nifûsa ne-kardiomyocyte11,12,13 di dilê mammalê mezin de astengiyek sereke ye ji bo modelkirina tevna dil bi karanîna celebên hucreyên kesane.Van tixûbên sereke girîngiya pêşxistina rêbazên ji bo çandina tevna mîokardiya saxlem di bin şert û mercên fîzyolojîk û patholojîk de tekez dikin.
Beşên tenik (300 μm) yên dilê mirovî yên ku hatine çandin, îsbat kirine ku modelek hêvîdar a mîokardiya mirovî ya saxlem e.Ev rêbaz gihîştina pergalek pirhucreyî ya 3D ya bêkêmasî ya mîna tevna dilê mirovan peyda dike.Lêbelê, heya sala 2019-an, karanîna beşên dilê çandî ji hêla zindîbûna çandê ya kurt (24 demjimêran) ve sînorkirî bû.Ev ji ber çend faktoran e, di nav de nebûna dirêjbûna laşî-mekanîkî, pêwendiya hewa-avî, û karanîna medyayên hêsan ên ku piştgirî nadin hewcedariyên tevna dil.Di sala 2019-an de, gelek komên lêkolînê destnîşan kirin ku tevlêkirina faktorên mekanîkî di pergalên çanda tevna dil de dikare jiyana çandê dirêj bike, vegotina dil baştir bike, û patholojiya dil bişopîne.Du lêkolînên hêja 17 û 18 destnîşan dikin ku barkirina mekanîkî ya yekalî bandorek erênî li fenotîpa dil di dema çandê de dike.Lêbelê, van lêkolînan barkirina fizîkî-mekanîkî ya dînamîkî ya sê-alî ya çerxa dil bikar neanîn, ji ber ku beşên dil bi hêzên tîrêjê yên isometric 17 an jî bi barkirina auxotonîkî ya xêzkirî 18 hatine barkirin.Van rêbazên dirêjkirina tevnvîsê di tepisandina gelek genên dil de an jî zêde derbirîna genên ku bi bersivên dirêjkirina nenormal re têkildar in encam da.Bi taybetî, Pitoulis et al.19 ji bo ji nû ve avakirina çerxa dil bi karanîna bertekên veguherînerê hêzê û ajokarên tansiyonê, hemamek çanda dil a dînamîk pêşxist.Her çend ev pergal rê dide modela çerxa dil di vitro de rasttir, tevlihevî û kêmbûna rêgezê sepana vê pergalê sînordar dike.Laboratuvara me di van demên dawî de pergalek çandê ya sade bi karanîna stimulasyona elektrîkê û navgînek xweşbîn pêşxistiye da ku zindîbûna beşên beraz û tevna dilê mirovan heya 6 rojan biparêze20,21.
Di destnivîsa heyî de, em modelek çanda tevna dil (CTCM) rave dikin ku bi karanîna beşên dilê berzayê ku nîşanên humoral vedihewîne da ku di dema çerxa dil de fîzyolojiya dil ya sê-alî û belavbûna patofîzyolojîkî vebêje.Ev CTCM dikare rastbûna pêşbîniya narkotîkê ya pêş-klînîkî bigihîne astek ku berê qet negihîştiye bi peydakirina pergalek dil-biha-bandor, navîn-rêveberê ku ji bo ceribandina dermanê pêş-klînîkî fîzyolojî / pathofîzyolojiya dilê mammalan teqlîd dike.
Nîşaneyên mekanîkî yên hemodnamîk di domandina fonksiyona cardiomyocyte de di vitro 22,23,24 de rolek girîng dileyzin.Di destnivîsa heyî de, me CTCM pêşxistiye (Wêne 1a) ku dikare hawîrdora dil a mezinan teqlîd bike û hem di frekansên fîzyolojîkî de (1.2 Hz, 72 lêdan di hûrdemê de) teşwîqkirina elektrîkî û mekanîkî çêdike.Ji bo ku di dema diastole de ji dirêjbûna tevnvîsê dûr nekevin, amûrek çapkirinê ya 3D hate bikar anîn da ku mezinahiya tevlê %25 zêde bike (Wêne. 1b).Pevçûna elektrîkê ya ku ji hêla pergala C-PACE ve hatî çêkirin hate dem kirin ku 100 ms berî systole bi karanîna pergalek wergirtina daneyê dest pê bike da ku çerxa dil bi tevahî nûve bike.Pergala çanda tevnvîsê çalakkerek pneumatîk a bernamekirî (LB Engineering, Almanya) bikar tîne da ku bi çerxa membranek silîkonê ya maqûl berfireh bike da ku bibe sedema berbelavbûna pariyên dil di jûreya jorîn de.Pergal bi riya veguherînerek zextê ve bi xetek hewaya derveyî ve hate girêdan, ku ev yek gengaz kir ku meriv bi duristî zextê (± 1 mmHg) û demê (± 1 ms) eyar bike (Hêjîrê. 1c).
a Di hundurê jûreya çandê ya cîhazê de, beşa tevnê bi zengila piştevaniya 7 mm, ku bi rengê şîn tê xuyang kirin, girêdin.Odeya çandê ji jûreya hewayê bi parzûnek silîkonek nermik a tenik ve tê veqetandin.Di navbera her odeyê de gazek bixin da ku rê li ber rijandinê bigirin.Di qapaxê amûrê de elektrodên grafît hene ku teşwîqkirina elektrîkê peyda dikin.b Nûnertiya şematîkî ya amûra tevna mezin, zengila rêber û zengila piştgirîyê.Parçeyên tevnvîsê (qehweyî) li ser cîhaza pir mezin bi zengila rêberî ya ku di hêlîna li ser keviya derve ya cîhazê de tê danîn, têne danîn.Bi karanîna rêbernameyê, bi baldarî zengila piştgirîyê ya ku bi çîpek acrylic tevnvîsê hatî pêçandî li ser beşa tevna dil bi cîh bikin.c Grafikek ku dema stimulasyona elektrîkê wekî fonksiyonek zexta odeya hewayê ya ku ji hêla çalakkerek pneumatîk a bernamekirî (PPD) ve tê kontrol kirin nîşan dide.Amûrek wergirtina daneyê hate bikar anîn da ku bi karanîna senzorên zextê stimulasyona elektrîkê hevdeng bike.Dema ku zexta di odeya çandê de digihîje sînorê destnîşankirî, îşaretek pêlê ji C-PACE-EM re tê şandin da ku teşwîqkirina elektrîkê bike.d Wêneya çar CTCM-yên ku li ser refikek inkubatorê hatine danîn.Çar amûr bi yek PPD-ê ve bi navgîniyek pneumatîk ve têne girêdan, û senzorên zextê di valahiya hemostatîk de têne danîn da ku zexta di çerxa pneumatîk de bişopînin.Her amûrek şeş beşên tevnvîsê hene.
Bi karanîna çalakkerek pneumatîk a yekane, me karî 4 cîhazên CTCM kontrol bikin, ku her yek ji wan dikare 6 beşên tevnvîsê bigire (Hêjîrê. 1d).Di CTCM de, tansiyona hewayê di jûreya hewayê de di jûreya şilavê de vediguhezîne zexta hevdemî û berfirehbûna fîzyolojîkî ya perçeya dil çêdike (Wêne 2a û Fîlma Pêvek 1).Nirxandina dirêjbûna tevnê li 80 mm Hg.Fen.dirêjbûna beşên tevnvîsê bi %25 nîşan da (Hêjîra 2b).Ev rêjeyek rêjeyê hate destnîşan kirin ku bi dirêjahiya sarkomerê fîzyolojîkî ya 2.2-2.3 μm ji bo girêbesta beşa dil ya normal re têkildar e17,19,25.Tevgera tevnvîsê bi karanîna mîhengên kamera xwerû hate nirxandin (Wêneya Pêvek 1).Mezinahî û leza tevgera tevnvîsê (Wêne. 2c, d) bi dirêjbûna di dema çerxa dil û dema di dema systole û diastole de re têkildar e (Wêne. 2b).Zêdebûn û leza tevna dil di dema kişandin û rehetbûnê de 12 rojan di çandê de domdar ma (Wêne. 2f).Ji bo nirxandina bandora stimulasyona elektrîkê ya li ser girêbestê di dema çandê de, me rêbazek ji bo destnîşankirina deformasyona çalak bi karanîna algorîtmayek şemitandinê pêş xist (Hêjîra pêvek. 2a,b) û karîbû di navbera deformasyonên bi û bê stimulasyona elektrîkê de ji hev cuda bikin.Heman beşa dil (Hêjîr. 2f).Li devera gerok a qutkirinê (R6-9), voltaja di dema teşwîqkirina elektrîkê de% 20 ji nebûna stimulasyona elektrîkê bilindtir bû, ku ev yek beşdariya stimulasyona elektrîkê di fonksiyona girêbestê de destnîşan dike.
Şopên nûner ên zexta odeya hewayê, zexta jûreya şilavê, û pîvandinên tevgera tevnvîsê piştrast dikin ku zexta odeyê zexta jûreya şilavê diguhezîne, û dibe sedema tevgerek têkildar a perçeya tevnê.b Şopên temsîlî yên ji sedî dirêjbûnê (şîn) yên beşên tevnvîsê yên ku bi ji sedî dirêjbûnê (porteqalî) re têkildar in.c Tevgera pîvandî ya perçeya dil bi leza pîvandî ya tevgerê re hevaheng e.(d) Rêgezên temsîla tevgera dorhêl (xêza şîn) û lezê (xêza xalîçeya porteqalî) di perçeyek dil de.e Hijdarkirina dema çerxê (n = 19 perçe ji bo komê, ji berazên cihêreng), dema girêbestê (n = 19 perçe ji bo her komê), dema bêhnvedanê (n = 19 perçe her komê, ji berazên cihêreng), tevgera tevnê (n = 25 ).perçe)/koma ji berazên cihêreng), leza lûtkeya sîstolîk (n = 24 (D0), 25 (D12) perçe/kom ji berazên cihêreng) û rêjeya rihetbûnê ya lûtkeyê (n=24 (D0), 25 (D12) perçe/kom ji berazên cihêreng).T-testa Xwendekarê du-tewra di ti parametreyê de cûdahiyek girîng nîşan neda.f Şopên analîza çenga temsîlî yên beşên tevnê bi (sor) û bê (şîn) stimulasyona elektrîkê, deh deverên herêmî yên beşên tevnê ji heman beşê.Panelên jêrîn pîvana cûdahiya sedî ya tansiyonê di beşên tevnvîsê de bi û bê teşwîqkirina elektrîkê li deh deveran ji beşên cihêreng nîşan didin. (n = 8 perçe/kom ji berazên cihêreng, T-testa Xwendekarê Du-Dîlî tê kirin; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 perçe/kom ji berazên cihêreng, T-testa Xwendekarê Du-Dîlî tê kirin; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу од разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 beş/kom ji berazên cihêreng, T-testa Xwendekarê du dûvik; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，5p < 0.01，5 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，5p < 0.01，5 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 beş/kom, ji berazên cihêreng, T-testa Xwendekarê du dûvik; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.
Di pergala meya çanda paşîn a dil biomimetîkî ya statîkî ya berê de [20, 21], me bi sepandina teşwîqkirina elektrîkê û xweşbînkirina pêkhateya navîn ve zindîbûn, fonksiyon û yekparebûna strukturî ya pariyên dil 6 rojan domand.Lêbelê, piştî 10 rojan, ev hejmar pir kêm bûn.Em ê li beşên ku di pergala meya çanda biomimetîkî ya statîk a berê ya 20, 21 şert û mercên kontrolê (Ctrl) de hatine çandin vebêjin û em ê navgîniya xweya berê xweşbînkirî wekî şert û çandên MC-ê di bin stimulasyona mekanîkî û elektrîkî ya hevdem de (CTCM) bikar bînin.gazî kirin.Pêşî, me diyar kir ku stimulasyona mekanîkî ya bêyî stimulasyona elektrîkê ji bo domandina zindîbûna tevneyê 6 rojan têrê nake (Hêjmara Pêvek. 3a,b).Balkêş e, bi danasîna teşwîqkirina fîzyo-mekanîkî û elektrîkê bi karanîna STCM, zindîbûna beşên dil 12-rojî wekî di beşên dilê nû de di bin şert û mercên MS de, lê ne di bin şert û mercên Ctrl de, wekî ku ji hêla analîza MTT ve hatî xuyang kirin (Wêne. 1) dimîne.3a).Ev pêşniyar dike ku teşwîqkirin û simulasyona mekanîkî ya çerxa dil dikare beşên tevnvîsê du caran bi qasî ku di pergala meya çanda statîk a berê de hatî ragihandin zindî bihêle.Lêbelê, nirxandina yekbûna strukturî ya beşên tevnvîsê ji hêla immunolabelkirina troponina dil T û connexin 43 ve destnîşan kir ku îfadeya connexin 43 di roja 12-an de di tevnvîsên MC de ji yên kontrolên di heman rojê de pir girîngtir bû.Lêbelê, îfadeya yekgirtî ya girêdana 43 û damezrandina Z-dîskê bi tevahî nehatin parastin (Hêjîrê. 3b).Em çarçoveyek îstîxbarata sûnî (AI) bikar tînin da ku yekparebûna strukturê tevnvîsê binirxînin26, boriyek fêrbûna kûr a li ser bingeha wêneyê ku li ser bingeha troponin-T û rengkirina girêdanê43 ye43 bikar tînin da ku bixweber yekbûna avahî û floransê ya perçeyên dil di warê hêza herêmîbûnê de bihejmêre.Vê rêbazê Tora Neuralî ya Hevbeş (CNN) û çarçoveyek fêrbûna kûr bikar tîne da ku bi pêbaweriya yekbûna avahîsaziya tevna dil bi rengek otomatîk û bêalî, wekî ku di referansê de hatî destnîşan kirin, bihejmêre.26. tevna MC bi roja 0-ê re li gorî beşên kontrolê yên statîk wekheviya strukturel çêtir nîşan da.Wekî din, rengdêra trikromê ya Masson di bin şert û mercên MS-ê de rêjeyek girîng a fibrozê li gorî şertên kontrolê yên roja 12-ê çandê diyar kir (Hêjîr. 3c).Digel ku CTCM di roja 12-an de zindîbûna beşên tevna dil zêde kir heya astek mîna ya tevna dilê nû, ew yekbûna strukturî ya beşên dil bi girîngî baştir nekir.
grafikek Bar mîqdarbûna MTT ya pariyên dilê teze (D0) an çanda pariyên dil ji bo 12 rojan nîşan dide an di çanda statîk de (D12 Ctrl) an jî di CTCM (D12 MC) de (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ji ceribandinên cuda cuda ##p .0001 li gorî D0 û **p <0.01 li gorî D12 Ctrl). grafikek Bar mîqdarkirina MTT-ya jîndarbûna pariyên dilê teze (D0) an jî çanda pariyên dil ji bo 12 rojan nîşan dide an di çanda statîk de (D12 Ctrl) an jî di CTCM (D12 MC) de (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC, yek ji ceribandinên cuda cuda ## MC) tê kirin. 0,0001 li gorî D0 û ** p <0,01 li gorî D12 Ctrl).histogram pîvana zindîbûna beşên dilê teze yên MTT (D0) an çanda beşên dil ji bo 12 rojan nîşan dide di çanda statîk (kontrola D12) an jî CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). ) ), 12 (D12 MC) beşên / grûpek ji cûrbecûr beraz e;####p < 0,0001 по сравнению со D0 и **p < 0,01 ji sravneniyu bi D12 Ctrl). ####p <0.0001 li gorî D0 û **p <0.01 li gorî D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0) 15 (D12 Ctrl)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向进行单向盛行单向向他的漋0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D12 MC)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相*)histograma ku pîvana zindîbûna MTT di beşên dilê teze (D0) an beşên dil de ku 12 rojan di çanda statîk (kontrola D12) an CTCM (D12 MC) de hatine çandin (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)) , 12 (D12 MC) beşên/komek ji testa ANOVA-ya cûda de, 12 rojan nîşan dide####p < 0,0001 li ser D0, ** p < 0,01 bi D12 Ctrl). ####p < 0.0001 li gorî D0, ** p <0.01 li gorî D12 Ctrl).b Troponin-T (kesk), connexin 43 (sor) û DAPI (şîn) di beşên dil teze veqetandî (D0) an beşên dil de ku di bin şert û mercên statîk (Ctrl) an şert û mercên CTCM (MC) de 12 rojan hatine çandin) wêneyên immunofluorescence nûner (pîvana vala = 100 μm). Pîvana îstîxbarata çêkirî ya yekbûna avahîsaziya tevna dil (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) perçe/kom her yek ji berazên cihêreng, testa ANOVA-ya yekalî tê kirin; ####p < 0.0001 li gorî D0 û ****p <0.0201 berawirdî). Pîvana îstîxbarata çêkirî ya yekbûna avahîsaziya tevna dil (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) perçe/kom her yek ji berazên cihêreng, testa ANOVA-ya yekalî tê kirin; ####p < 0,0001 li gorî D0 û ****p < 0,0001 berawirdî). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/групп срезов/групп од разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный D0 и ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Pîvankirina yekbûna avahîsaziya tevna dil ji hêla îstîxbarata sûnî (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) beş/komên ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yekalî pêk hat; ####p < 0.0001 beramberî D0 û ****p < 0.00 li gorî Ctrl < 0.00).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) perçe/kom her yek ji berazên cuda, testa yek-alî ##00D00;比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) perçe/kom her yek ji berazên cuda, yekalî ##000p testa ANOVA; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односотный тест. внения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Zehmetiya çêkirî ji bo pîvandina yekbûna avahîsaziya tevna dil (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) beş/koma her yek ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yekalî; ####p<0.0001 berberî .D0 Ji bo danberhevê ****p <1 Ctrl beramberî D1). c Wêneyên temsîlî (çep) û hejmarkirin (rast) ji bo pariyên dil ên ku bi renga Massonê ya trikromê hatine xêzkirin (Scale bare = 500 μm) (n = 10 perçe/kom her yek ji berazên cûda, testa ANOVA ya yekalî tê kirin; ####p < 0,0001 D 0,0001 < 0,0001 li gorî D1 < 0,0001) c Wêneyên temsîlî (çep) û hejmarkirin (rast) ji bo pariyên dil ên bi renga Masson's trichrome rengkirî ne (Scale bare = 500 μm) (n = 10 perçe/kom her yek ji berazên cihê, testa ANOVA ya yekalî tê kirin; #### p <0,0001 li gorî D0001 < 0,0001 D001 < 0.0001) c Reçensatîvnыe îzobrajenîya (sleva) û colyчестnыe ocenka (sправa) li ser dilê xwe, okraşennыh sêhromnыm taybetmendiya Massona (têkiliya massteb bê zelal = 500 mkm) (n = 10 testên cuda yên cuda ; #### p < 0,0001 по sravneniyu со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c Wêneyên temsîlî (çep) û jimartin (rast) yên beşên dil ên ku bi rengdêra trikroma Masson (pîvana nepêçandî = 500 μm) hatine xemilandin (n = 10 beş/kom ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yekalî pêk hat; #### p < 0 .0001 li gorî D0 û 1 ***tr li gorî D0.1 <1 ***p). c.切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比Ｘ0l0*** . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 漋#D１比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Reпрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) srezov serdca, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая шкала = 500 mkm) analîza кторного дисперсионного ;### #p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c Wêneyên temsîlî (çep) û hêjmar (rast) yên beşên dil ên ku bi renga Masson's trichrome (vala = 500 μm) hatine xemilandin (n = 10 beş/kom, her yek ji berazek cûda, bi analîza yekalî ya veguheztinê ve hatî ceribandin ;### # p <0.0001 ***p <1 C li gorî D0, li gorî D0,Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.
Me hîpotez kir ku bi lê zêdekirina molekulên piçûk li navgîniya çandê, yekbûna cardiomyocyte dikare were baştir kirin û pêşveçûna fibrosis di dema çanda CTCM de kêm bibe.Ji ber vê yekê me molekulên piçûk bi karanîna çandên xweyên kontrolê yên statîk20,21 vekolandin ji ber hejmarek piçûk a faktorên tevlihev.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), û SB431542 (SB) ji bo vê ekranê hatin hilbijartin.Van molekulên piçûk berê di çandên hiPSC-CM de hatine bikar anîn da ku bi zêdekirina dirêjahiya sarcomer, T-tubul û leza rêgirtinê re mezinbûna cardiomyocytes çêbike.Wekî din, hem Dex (glukokortîkoidek) û hem jî SB têne zanîn ku iltîhaba ditepisînin29,30.Ji ber vê yekê, me ceriband ka tevlêbûna yek an berhevokek ji van molekulên piçûk dê yekbûna strukturî ya beşên dil baştir bike.Ji bo vekolîna destpêkê, dozaja her pêkhateyekê li ser bingeha hûrgelên ku bi gelemperî di modelên çanda hucreyê de têne bikar anîn (1 μM Dex27, 100 nM T327, û 2.5 μM SB31) hate hilbijartin.Piştî 12 rojên çandê, tevhevkirina T3 û Dex di yekparebûna avahîsaziya cardiomyocyte ya çêtirîn û nûvekirina fibrousê ya hindiktirîn de encam da (Wêneyên Pêvek 4 û 5).Wekî din, karanîna van tansiyonên T3 û Dex duqat an ducarî li gorî tansiyonên normal bandorên zirardar derdixe holê (Hêjmara Pêvek. 6a,b).
Piştî vekolîna destpêkê, me berhevokek serî-bi-ser a 4 şert û mercên çandê pêk anî (Wêne 4a): Ctrl: beşên dil ên ku di çanda meya statîk a ku berê hatî diyar kirin de bi karanîna navgîna meya xweşbînkirî hatine çandin;20.21 TD: T3 û Ctrl s Roja Çarşemê Dex Zêde kirin;MC: beşên dil di CTCM de bi karanîna navgîniya meya berê xweşbînkirî têne çandin;û MT: CTCM bi T3 û Dex li navîn zêde kirin.Piştî 12 rojên çandiniyê, zindîbûna tevnên MS û MT wekî tevnên nû yên ku ji hêla ceribandina MTT ve têne nirxandin (Hêl. 4b) dimîne.Balkêş e, lêzêdekirina T3 û Dex li çandên transwell (TD) li gorî şert û mercên Ctrl encamek başbûnek girîng a zindîbûnê çênebû, ku rola girîng a stimulasyona mekanîkî di domandina zindîbûna beşên dil de destnîşan dike.
Diagramek sêwirana ezmûnî ya ku çar şert û mercên çandê destnîşan dike ku ji bo nirxandina bandorên stimulasyona mekanîkî û lêzêdekirina T3 / Dex li ser navîn ji bo 12 rojan têne bikar anîn. b Grafika bar di her 4 şert û mercên çandê de (Ctrl, TD, MC, û MT) li gorî pariyên dilê teze (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD û D12 MT), 12 (D12 MC-yek, testa #pVA-yê ji hev cuda tê kirin, 12 (D12 MC-yek-pisîk) ji slicên #pV-yê cuda tê kirin, hêjmarkirina zindîbûnê 12 rojên piştî çandê nîşan dide. 0.0001, ###p <0.001 li gorî D0 û ** p <0.01 li gorî D12 Ctrl). b Grafika bar di her 4 şert û mercên çandê de (Ctrl, TD, MC, û MT) li gorî pariyên dilê teze (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD û D12 MT), 12 (D12 MC-yek, testa #pVA-yê ji hev cuda tê kirin, 12 (D12 MC-yek-pisîk) ji slicên #pV-yê cuda tê kirin, hêjmarkirina zindîbûnê 12 rojên piştî çandê nîşan dide. 0.0001, ###p <0.001 li gorî D0 û **p <0.01 li gorî D12 ctrl). b Gistogramma nîşan dide kolîçestîvnûyu оценку жизнеспособности через 12 dnй piştî kultura di hemû 4 şert û mercên (kontrol, TD, MC û MT) li ser sravneniyu bi sînevîzyonê (D10, CrdD) (D10, CrdD0) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) резов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; b Grafika barkê di her 4 şert û mercên çandê de (kontrol, TD, MC, û MT) jimarebûna jîndarbûnê nîşan dide (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, û D12 MT), 12 (D12 MC ji beşên cihêreng #p00, testa #p0, MC, ji yek grûp) 001, ###p < 0.001 beramberî D0 û **p <0.01 li gorî D12 Ctrl). b. D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 测试；####p < 0.0001，#0##0 0.01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по sravneniyu со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, MC2 и D12) gruppa, testa têkilîtornniy ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению со D0, **p <0,01 по сравнению со kontrola D12). b Histograma ku her 4 şert û mercên çandê (kontrol, TD, MC û MT) nîşan dide li gorî beşên dilê teze (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD û D12 MT), ji berazên cihê 12 (D12 MC) beş/kom, yek-alî testa ANOVA, ##0#0p<0. 0, ** p<0.01 beramberî kontrola D12). c Grafika bar hejmartina herikîna glukozê ya 12 rojan piştî çandê di her 4 şert û mercên çandê de (Ctrl, TD, MC, û MT) li gorî pariyên dilê teze (D0) nîşan dide (n = 6 perçe/kom ji berazên cihê, testa ANOVA ya yekalî tê kirin; ###p < 0.001 û li gorî D1 < 0.001, li gorî D001, li gorî D001 < ***p < 0.001 ). c Grafika bar hejmartina herikîna glukozê ya 12 rojan piştî çandê di her 4 şert û mercên çandê de (Ctrl, TD, MC, û MT) li gorî pariyên dilê teze (D0) nîşan dide (n = 6 perçe/kom ji berazên cihê, testa ANOVA ya yekalî tê kirin; ###p < 0.001 û li gorî D1 < 0.001, li gorî D001, li gorî D001 < ***p < 0.001 ). c Gistogramma показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (kontrol, TD, MC û MT) по sravneniyu bi sravnыy swas (6) resam (6) j ###p < 0,001 li ser D0 и ***p < 0,001 bi D12 Ctrl. c Histogram hejmartina herikîna glukozê ya 12 rojên piştî çandê di bin her 4 şert û mercên çandê de (kontrol, TD, MC û MT) li gorî beşên dilê teze (D0) nîşan dide (n = 6 beş/kom ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yekalî hate kirin; ###p < 0.001 li gorî D0 û 0.001. c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盟萩12：糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与10pD0. l 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 扑试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogramma, показывающая кольчественную оценку потока глюкозы через 12 дней по культивирования за сите 4 şertи культивирования (контроль, TD, MC û MT) ji ber sravnenija ###p < 0,001 li ser D0, ***p < 0,001 bi D12 (kontrol) ji bo sravneniyu, ***p < 0,001 ji bo testên ANOVA. c Histograma ku ji bo her 4 şert û mercên çandê (kontrol, TD, MC, û MT) li gorî beşên dilê teze (D0) (n = 6 beş/kom, ji berazên cihêreng, yekalî, ji berazên cihêreng, yekalî, ceribandinên ANOVA hatin kirin, ###p <0,001) hatin kirin.d Di deh xalên beşa tevna herêmî de (n = 4 perçe / kom, testa ANOVA-ya yek-alî, testa ANOVA-ya yekalî, 12 MC (kesk), û roja 12 MT (kesk), û roja 12 MT (sor) tevnên taze (şîn), roja 12 MT (sor).e Pîşesaziya volkanê ku di beşên dilê teze (D0) de genên bi rengek cûda diyarkirî nîşan dide li gorî beşên dil ên ku di bin şert û mercên statîk (Ctrl) an di bin şert û mercên MT (MT) de ji bo 10-12 rojan hatine çandin.f Nexşeya germê ya genên sarcomere ji bo beşên dil ên ku di bin her şert û mercên çandê de hatine çandin.Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.
Girêdana metabolîk a li ser veguheztina ji oksîdasyona asîda rûn ber bi glycolîzê ve nîşanek cûdahiya kardiomyocyte ye.Kardiomyocytên negihîştî di serî de glukozê ji bo hilberîna ATP bikar tînin û mîtokondrîyên hîpoplastîk ên bi çend cristae5,32 hene.Analîzên karanîna glukozê destnîşan kirin ku di bin şert û mercên MC û MT de, karanîna glukozê mîna ya di tevnên roja 0 de bû (Wêne 4c).Lêbelê, nimûneyên Ctrl di karanîna glukozê de li gorî tevna nû zêdebûnek girîng nîşan dan.Ev destnîşan dike ku hevgirtina CTCM û T3 / Dex zindîbûna tevnvîsê zêde dike û fenotîpa metabolê ya beşên dil ên çandî yên 12-rojî diparêze.Wekî din, analîza çelimê nîşan da ku astên çewsandinê 12 rojan di bin şert û mercên MT û MS-ê de wekî di tevna dilê teze de dimîne (Wêne. 4d).
Ji bo analîzkirina bandora giştî ya CTCM û T3/Dex li ser dîmendera transkrîpsiyona gerdûnî ya tevna perçeya dil, me RNAseq li ser perçeyên dil ji her çar şert û mercên çanda cihêreng pêk anî (Daneyên Pêvek 1).Balkêş e, beşên MT-ê wekheviya transkrîpsiyonê ya bilind bi tevna dilê nû re destnîşan kirin, bi tenê 16 ji 13,642 genan bi rengek cûda têne diyar kirin.Lêbelê, wekî ku me berê jî nîşan da, perçeyên Ctrl piştî 10-12 rojan di çandê de 1229 genên bi rengek cûda diyar kirin (Wêne. 4e).Van daneyan ji hêla qRT-PCR genên dil û fibroblast ve hatine pejirandin (Hêjmara Pêvek. 7a-c).Balkêş e, beşên Ctrl kêmkirina genên çerxa dil û hucreyê û aktîvkirina bernameyên genê înflamatuar nîşan da.Van daneyan destnîşan dikin ku veqetandek, ku bi gelemperî piştî çandiniya demdirêj pêk tê, di bin şert û mercên MT de bi tevahî kêm dibe (Hêjmara Pêvek. 8a,b).Lêkolîna bi baldarî li ser genên sarcomere nîşan da ku tenê di bin şert û mercên MT de genên ku sarcomere (Hêl. 4f) û kanala îyonê (Hêveka Pêvek. 9) kod dikin têne parastin, ku wan di bin şert û mercên Ctrl, TD û MC de ji tepisandinê diparêze.Van daneyan destnîşan dikin ku bi tevlihevkirina stimulasyona mekanîkî û mîzahî (T3 / Dex), transkriptoma perçeya dil dikare piştî 12 rojan di çandê de mîna perçeyên dilê nû bimîne.
Van vedîtinên transkrîpsiyonê ji hêla vê rastiyê ve têne piştgirî kirin ku yekrêziya strukturî ya kardiomyocytes di beşên dil de çêtirîn di bin şert û mercên MT-ê de 12 rojan tê parastin, wekî ku ji hêla girêdana 43-a saxlem û herêmî ve tê xuyang kirin (Wêne. 5a).Wekî din, fibroza di beşên dil de di bin şert û mercên MT de li gorî Ctrl û mîna beşên dilê nû bi girîngî kêm bû (Hêjî. 5b).Van daneyan destnîşan dikin ku berhevoka teşwîqkirina mekanîkî û dermankirina T3 / Dex bi bandor avahiya dil di beşên dil de di çandê de diparêze.
Wêneyên immunofluorescence nûnerê troponin-T (kesk), connexin 43 (sor), û DAPI (şîn) di beşên dil ên nû veqetandî (D0) de an jî 12 rojan di her çar şert û mercên çanda beşa dil de têne çandin (barê pîvan = 100 μm).). Pîvana îstîxbarata çêkirî ya yekitiya avahîsaziya tevna dil (n = 7 (D0 û D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC û D12 MT) perçe/kom ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yekalî tê kirin; ####p < 0.0001 li gorî D0 û D12 tr <0.0001 li gorî D0 û 001 <0 tr <0. l). Pîvana îstîxbarata çêkirî ya yekbûna avahîsaziya tevna dil (n = 7 (D0 û D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC û D12 MT) perçe/kom ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yek-alî tê kirin; #### p <0.0001 li gorî D0 û D12 001 li gorî 0.000 <0. l). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) резов/группу от разных свиней0 01 по sravneniyu со D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по sravneniyu bi D12 Ctrl). Pîvankirina yekbûna avahî ya tevna dil bi karanîna îstîxbarata çêkirî (n = 7 (D0 û D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC û D12 MT) beş/kom ji berazên cihêreng, testa ANOVA ya yek-alî pêk hat; #### p <0,0001 li gorî D0 û *p 05 an 0.1 <00p < .对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p 2tr1D对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 (d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相0tr0l相比）.Pîvana yekbûna avahîsaziya tevna dil bi karanîna îstîxbarata sûnî di berazên cihêreng de (n = 7 (D0 û D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC û D12 MT) beş/kom) bi ceribandinek ANOVA ya yekalî;#### p < 0,0001 по сравнению со D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). #### p <0.0001 li gorî D0 û *p <0.05 an ****p <0.0001 li gorî D12 Ctrl). b Wêneyên temsîlî û hejmartina pariyên dil ên ku bi rengdêra trikroma Masson hatine rengkirin (bara pîvanê = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, û D12 MC), 9 (D12 MT) perçe/kom ji berazên cihêreng tê berhev kirin.#00; û ***p <0.001, an ****p <0.0001 li gorî D12 Ctrl). b Wêneyên temsîlî û hejmartina pariyên dil ên ku bi rengdêra trikroma Masson hatine rengkirin (bara pîvanê = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, û D12 MC), 9 (D12 MT) perçe/kom ji berazên cihêreng tê berhev kirin.#00; û ***p <0.001, an ****p <0.0001 li gorî D12 Ctrl). b Representativnыe isobrazheniya and colyчественная оценка оценка resov cerdca, okrashennыh trichromnыh crustelem Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 TD) ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по sravneniyu со D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по sravneniyu bi D12 Ctrl). b Wêneyên temsîlî û hejmartina beşên dil ên ku bi rengdêra trikromê ya Masson (bara pîvanê = 500 μm) hatine xêzkirin (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD û D12 MC), 9 (D12 MT) beş/kom ji berazên cihêreng, pêk anîne <.#00001 yek alî <.#0001. 001 an ****p < 0.0001 beramberî D12 Ctrl). b.和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 1#0###P 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 《 尺 尺 《 d！ ！ d1 = 500 μm） l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切燉 切燉 切燉 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分方差分方差分析00， ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Representativnыe isobrazheniya and colyчественная оценка оценка на sredca, okraşennыh trichrom Massona (масна линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 TD û D12 MC) , один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). b Wêneyên temsîlî û hejmartina beşên dil ên ku bi trikroma Masson (bara pîvanê = 500 μm) hatine xêzkirin (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD û D12 MC), 9 (D12 MT) beşên ji beraz/komên cihê, yek rêbaza ANOVA; #p<000, berawirdkirin <0#0#0. ****p < 0.0001 li gorî D12 Ctrl).Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.
Di dawiyê de, şiyana CTCM-ê ku hîpertrofiya dil bişibîne bi zêdekirina dirêjbûna tevna dil hate nirxandin.Di CTCM de, zexta lûtkeya odeya hewayê ji 80 mmHg berbi 80 mmHg zêde bû.Fen.(drêjbûna normal) heya 140 mmHg Huner.(Hêjîra 6a).Ev bi zêdebûna 32% ya dirêjbûnê re têkildar e (Wêne. 6b), ku berê wekî rêjeya ji sedî ya têkildar a ku ji bo beşên dil tê xwestin ji bo bidestxistina dirêjahiya sarkomerê ya mîna ya ku di hîpertrofiyê de tê dîtin hate destnîşan kirin.Dirêjbûn û leza tevna dil di dema kişandin û rihetbûnê de di şeş rojên çandê de domdar ma (Wêne. 6c).Tîma dil ji şert û mercên MT şeş rojan di bin dirêjbûna normal (MT (Normal)) an şert û mercên zêde dirêjkirinê (MT (OS)) de bû.Jixwe piştî çar rojan di çandê de, biyomarkera hîpertrofîk NT-ProBNP di navgînê de di bin şert û mercên MT (OS) de li gorî şert û mercên MT (normal) bi girîngî hate bilind kirin (Wêne. 7a).Wekî din, piştî şeş rojên çandiniyê, mezinahiya hucreyê di MT (OS) de (Wêne. 7b) li gorî beşên dilê MT (normal) bi girîngî zêde bû.Wekî din, veguheztina nukleerî ya NFATC4 di nav tevnên zêde dirêjkirî de bi girîngî zêde bû (Wêne. 7c).Van encaman pêşkeftina pêşkeftî ya nûvekirina patholojîkî piştî hîperdistensionê destnîşan dikin û piştgirî didin têgîna ku cîhaza CTCM dikare wekî platformek were bikar anîn da ku li ser îşaretkirina hîpertrofiya dil a ku ji hêla dirêj ve hatî çêkirin lêkolîn bike.
Şopên nûner ên zexta odeya hewayê, zexta jûreya şilavê, û pîvandinên tevgera tevnvîsê piştrast dikin ku zexta odeyê zexta jûreya şilavê diguhezîne, û dibe sedema tevgerek têkildar a perçeya tevnê.b Ji bo beşên tevnvîsê yên bi gelemperî dirêjkirî (porteqalî) û zêde dirêjkirî (şîn).c Grafika bar ku dema dewrê nîşan dide (n = 19 perçe ji bo komê, ji berazên cihêreng), dema kişandinê (n = 18-19 perçe ji bo komê, ji berazên cihêreng), dema bêhnvedanê (n = 19 perçe ji bo komê, ji berazên cihêreng) ), berfirehiya tevgera tevnvîsê (n = 14 perçe / berazên cûda), ji berazên cihêreng) û rêjeya bêhnvedanê ya lûtkeyê (n = 14 (D0), 15 (D6) ) beş/kom) ji berazên cihêreng), testa T-ya Xwendekarê ya du dûvik di ti pîvanan de cûdahiyek girîng nîşan neda, ku destnîşan dike ku ev pîvan di 6 rojên çanda bi voltaja zêde de domdar mane.Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.
grafikek Bar jimarekirina berhevoka NT-ProBNP di medyaya çandê de ji pariyên dil ên ku di bin şert û mercên dirêjbûna normal MT (Norm) an zêde dirêjbûn (OS) de hatine çandin (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, û D4 MTOS) perçe/koma ji berazên cihêreng. Grafikek Bar jimarekirina berhevoka NT-ProBNP di medyaya çandê de ji pariyên dil ên ku di bin şert û mercên dirêjbûna normal MT (Norm) an zêde dirêjbûn (OS) de hatine çandin (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, û D4 MTOS) perçe/koma ji berazên cuda ** 1 ANOVA ji berazên cuda re tê berhev kirin.Histograma mîqdar a berhevoka NT-ProBNP di navgîna çandê de ji pariyên dil ên ku di bin şert û mercên dirêjbûna MT-ya normal (norm) an jî zêde dirêjkirî (OS) de hatine çandin (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, û D4). MTOS) perçeyên /koma ji berazên cihêreng têne kirin, du-faktora analîzê tê kirin;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). ** p <0.01 li gorî dirêjbûna normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养埾鸭NT-ProBNP 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分,p < 0,01）. Pîvanek ji berhevdana NT-ProBNP di perçeyên dil de ku di bin şert û mercên dirêjbûna normal MT (Norm) an zêde dirêjkirina (OS) de hatine çandin (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ji cûda cûda动; ** li gorî dirêjbûna normal, p <0.01).histogram Pîvana hûrgelên NT-ProBNP di pariyên dil de ku di bin şert û mercên dirêjbûna MT-ya normal (norm) an jî zêde dirêjkirî (OS) de hatine çandin (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) û D4 MTOS) perçe/kom ji berazên cihêreng, analîza dualî ya cûdabûnê;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). ** p <0.01 li gorî dirêjbûna normal). b Wêneyên temsîlî ji bo pariyên dil ên bi troponin-T û WGA (çep) û pîvankirina mezinahiya şaneyê (rast) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) şaneyên/koma ji 10 perçeyên cihêreng ên ji berazên cihêreng, bi troponin-T û WGA (çep) hatine xemilandin. b Wêneyên temsîlî ji bo pariyên dil ên bi troponin-T û WGA (çep) û pîvankirina mezinahiya şaneyê (rast) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) şaneyên/kom ji 10 perçeyên cihêreng ên ji berazên cihêreng hatine xemilandin. b Representativnыe isobrazheniya srezov serdca, okrashennыh troponinom-T and AZP (sleva) and colychestvennogo diyardeyeka dubendî (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток, 369 (D6 MTNorm) - ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). b Wêneyên temsîlî yên beşên dil ên bi troponin-T û AZP (çep) û hejmartina mezinahiya şaneyê (rast) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) şaneyên/kom ji 10 beşên cihêreng ên ji berazên cihêreng, bi T-testa xwendekar a du dûvik a bi troponîn-T û AZP (çep) hatine xemilandin. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表惞30D ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比,****p < 0.0001）. b Wêneyên temsîlî yên pariyên dil bi calcarein-T û WGA (çep) û mezinahiya şaneyê (rast) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ji 10 perçeyên cihêreng (D6 MTNorm)) Hucre/组，两方法 bi testkirina normal 组，两方法0.0001). b Reпрезентативные изображения срезов клеток, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размери клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm cuda) ji 10 ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). b Wêneyên nûnerê beşên dil ên bi troponin-T û AZP (çep) hatine xêzkirin û pîvandina mezinahiya şaneyê (rast) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ji 10 beşên cihêreng ji berazên cihêreng) Xane/kom, pîvana du dûvik Pîvana xwendekaran t;****p <0.0001 li gorî çenga normal). c Wêneyên nûner ên ji bo roja 0 û roja 6-ê perçeyên dilê MTOS-ê yên ku ji bo troponin-T û NFATC4 immunebeledkirî ne û pîvandina veguheztina NFATC4 ber bi navokên CM-yan ve (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) perçe/kom ji berazên cihêreng, du-tîp tê kirin. c Wêneyên nûner ên ji bo roja 0 û roja 6-ê perçeyên dilê MTOS-ê yên ku ji bo troponin-T û NFATC4 immunobelkirî ne û hejmartina veguheztina NFATC4 ber bi navokên CM-yan ve (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) perçe/kom ji berazên cihêreng, du-tehlîl kirin *. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых за troponina-T û NFATC4, û grûbek оценка транслокации NFATC4 во ядра кавернозных клеток (D0 =D3 (MT6) ных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; c Wêneyên nûnerê ji bo beşên dil di 0 û 6 rojên MTOS de, ji bo troponin-T û NFATC4 immunobeledkirî, û pîvandina veguheztina NFATC4 di navokê şaneyên şikeftê de (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) perçe/komek ji berazên cihêreng) du-du ceribandin kirin;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性努天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性弛的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学甪t 0.甪t 0. c Wêneyên nûnerê nîşankirina calcanin-T û NFATC4 第0天和第6天MTOS perçeyên dil, û NFATC4 ji nucleya hucreya NFATC4 cuda 易位至CM 的 mîqdara化 (n = 4 (D6, 礇礻),间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 ден за иммуномаркировки тропониом-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиња (n = 4, MT6) -критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Wêneyên nûnerê perçeyên dil MTOS di rojên 0 û 6 de ji bo nîşankirina troponin-T û NFATC4 immunebeling û jimarekirina veguheztina NFATC4 di navokê ya CM de ji berazên cihêreng (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) perçe/kom, du dûvikên xwendekaran <0;Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.
Lêkolîna dil-vaskuler a wergerî modelên hucreyî hewce dike ku hawîrdora dil bi rast ji nû ve hilberîne.Di vê lêkolînê de, amûrek CTCM hate pêşxistin û taybetmendî kirin ku dikare beşên ultra-thin ên dil teşwîq bike.Pergala CTCM stimulasyona elektromekanîkî ya fîzyolojîkî ya hevdemkirî û dewlemendkirina şilava T3 û Dex vedigire.Gava ku beşên dilê berazan ji van faktoran re hatin rûxandin, zindîbûna wan, yekbûna avahîsaziyê, çalakiya metabolîk, û vegotina transkrîpsiyonê wekî di tevna dilê nû de piştî 12 rojên çandê heman dimîne.Wekî din, dirêjbûna zêde ya tevna dil dikare bibe sedema hîpertrofiya dil ku ji hêla hîperextensionê ve hatî çêkirin.Bi tevayî, ev encam piştgirî didin rola krîtîk a şert û mercên çanda fîzyolojîkî di domandina fenotîpek dil a normal de û platformek ji bo ceribandina derman peyda dikin.
Gelek faktor beşdarî afirandina jîngehek çêtirîn ji bo xebitîn û zindîbûna cardiomyocytes dibin.Ya herî eşkere ji van faktoran bi (1) danûstendinên navserokî, (2) stimulasyona elektromekanîkî, (3) faktorên humoral, û (4) substratên metabolîk ve girêdayî ne.Têkiliyên fîzyolojîk-hucre-hucreyê hewceyê torên sê-alî yên tevlihev ên celebên hucreyê yên ku ji hêla matrixek derveyî hucre ve têne piştgirî kirin hewce dike.Danûstandinên şaneyên weha yên tevlihev dijwar e ku di vitro de ji hêla co-kultura celebên hucreyên ferdî ve werin çêkirin, lê bi karanîna xwezaya organotîpî ya beşên dil bi hêsanî têne bidestxistin.
Dirêjbûna mekanîkî û stimulasyona elektrîkî ya cardiomyocytes ji bo domandina fenotîpa dil33,34,35 krîtîk e.Dema ku teşwîqkirina mekanîkî bi berfirehî ji bo şert û pîrbûna hiPSC-CM hatîye bikar anîn, gelek lêkolînên xweşik di van demên dawî de bi karanîna barkirina yekaxial hewl dane teşwîqkirina mekanîkî ya perçeyên dil di çandê de.Van lêkolînan destnîşan dikin ku barkirina mekanîkî ya yekalî ya 2D di dema çandê de bandorek erênî li fenotîpa dil dike.Di van lêkolînan de, beşên dil an bi hêzên tîrêjê yên îsometrîk17, barkirina auxotonîkî ya xêzkirî18 hatine barkirin, an jî çerxa dil bi karanîna bertekên veguherînerê hêzê û ajokarên tansiyonê ji nû ve hatî çêkirin.Lêbelê, van rêbazan bêyî xweşbîniya hawîrdorê dirêjkirina tevna yekaxial bikar tînin, di encamê de gelek genên dil têne tepisandin an jî zêde îfadekirina genên ku bi bersivên dirêjkirina nenormal re têkildar in.CTCM ku li vir hatî diyar kirin stimulusek elektromekanîkî ya 3D peyda dike ku çerxa dil ya xwezayî di warê dema çerxê û dirêjbûna fîzyolojîk de (25% dirêjbûn, 40% systole, 60% diastole, û 72 lêdan di hûrdemê de) dişixule.Her çend ev teşwîqkirina mekanîkî ya sê-alî bi tenê ji bo domandina yekbûna tevnvîsê ne bes e, ji bo ku bi têra zindîbûna tevnvîsê, fonksiyon û yekparçebûnê bi domdarî were domandin pêdivî ye ku têkeliyek nermî û mekanîkî ya bi karanîna T3 / Dex.
Faktorên humoral di modulkirina fenotîpa dilê mezinan de rolek girîng dileyzin.Ev di lêkolînên HiPS-CM de hate ronî kirin ku tê de T3 û Dex li medyaya çandê hatin zêdekirin da ku mezinbûna hucreyê zûtir bikin.T3 dibe ku bandorê li veguheztina asîdên amînî, şekir û kalsiyûmê li ser parzûnên hucreyê bike36.Wekî din, T3 vegotina MHC-α û kêmkirina MHC-β pêşve dike, û avakirina myofibrilên bilez ên di kardiomyocytên gihîştî de li gorî myofibrilên hêdî di CM-ya fetusê de pêşve dike.Kêmasiya T3 di nexweşên hîpotîroîd de dibe sedema windabûna bandên myofibrillar û kêmbûna rêjeya pêşveçûna tone37.Dex li ser receptorên glukokortîkoidê tevdigere û hate destnîşan kirin ku di dilên perfused ên veqetandî de girêbesta myokardial zêde dike;38 tê fikirîn ku ev çêtirbûn bi bandora li ser têketina depo-ya kalsiyûmê (SOCE) 39,40 ve girêdayî ye.Wekî din, Dex bi receptorên xwe ve girêdide, dibe sedema bertekek hundurîn a berfireh a ku fonksiyona berevaniyê û iltîhaba ditepisîne30.
Encamên me destnîşan dikin ku teşwîqkirina mekanîkî ya laşî (MS) performansa çandê ya giştî li gorî Ctrl çêtir kir, lê di çandê de di nav 12 rojan de nekarî zindîbûn, yekparebûna avahîsaziyê, û îfadeya dil bidomîne.Li gorî Ctrl, lêzêdekirina çandên T3 û Dex li CTCM (MT) zindîbûn çêtir kir û profîlên veguheztinê yên wekhev, yekparebûna avahî, û çalakiya metabolîk bi tevna dilê nû re 12 rojan domand.Wekî din, bi kontrolkirina asta dirêjbûna tevnvîsê, modelek hîpertrofiya dil a ku ji hêla hîperextension ve hatî çêkirin bi karanîna STCM hate afirandin, ku pirrengiya pergala STCM destnîşan dike.Pêdivî ye ku were zanîn ku her çend ji nû vesazkirina dil û fibrosis bi gelemperî organên bêkêmasî yên ku hucreyên wan ên gerok dikarin cytokines guncan û her weha fagocytosis û faktorên din ên nûvekirinê peyda bikin jî vedihewînin, beşên dil hîn jî dikarin di bersiva stres û trawmayê de pêvajoya fibrotîk bişibînin.nav myofibroblasts.Ev berê di vê modela perçeya dil de hate nirxandin.Pêdivî ye ku were zanîn ku parametreyên CTCM dikarin bi guheztina zext / amplituda elektrîkî û frekansê ve werin modul kirin da ku gelek şert û mercan wekî tachycardia, bradycardia, û piştevaniya gerîdeya mekanîkî (dilê mekanîkî ya nebarkirî) simul bikin.Ev pergalê ji bo ceribandina narkotîkê rêgezek navîn dike.Qabiliyeta CTCM-ê ji bo modela hîpertrofiya dil a ku ji hêla zordestiyê ve hatî çêkirin rê li ber ceribandina vê pergalê ji bo terapiya kesane vedike.Di encamê de, lêkolîna heyî destnîşan dike ku dirêjbûna mekanîkî û teşwîqkirina humoral ji bo domandina çanda beşên tevna dil krîtîk e.
Her çend daneyên ku li vir têne pêşkêş kirin destnîşan dikin ku CTCM ji bo modelkirina myocardiumê saxlem platformek pir hêvîdar e, vê rêbaza çandê hin sînor hene.Sînordariya sereke ya çanda CTCM ev e ku ew zextên mekanîkî yên dînamîkî yên domdar li ser perçeyan ferz dike, ku rê li ber şiyana şopandina çalak a girêbestên perçeyên dil di her dewrê de digire.Wekî din, ji ber piçûkbûna beşên dil (7 mm), şiyana nirxandina fonksiyona systolic li derveyî pergalên çandê bi karanîna senzorên hêza kevneşopî sînordar e.Di destnivîsa heyî de, em bi nirxandina voltaja optîkî wekî nîşanek fonksiyona peymanê bi qismî vê sînordariyê derbas dikin.Lêbelê, ev tixûb dê xebatek din hewce bike û dibe ku di pêşerojê de bi danasîna rêbazên ji bo şopandina optîkî ya fonksiyona perçeyên dil di çandê de, wekî nexşeya optîkî ya bi karanîna kalsiyûm û rengên hestiyar-voltajê, were çareser kirin.Sînorkirinek din a CTCM ev e ku modela xebatê stresa fîzyolojîkî (pêşbarkirin û barkirin) manîpule nake.Di CTCM de, zext di rêgezên berevajî de hate hilberandin da ku 25% dirêjbûna fîzyolojîkî di diastole (tevahî dirêjî) û systole (dirêjahiya girêbestê di dema teşwîqkirina elektrîkê de) di tevnên pir mezin de ji nû ve hilberîne.Pêdivî ye ku ev sînor di sêwiranên CTCM-ê yên pêşerojê de bi zexta têr li ser tevna dil ji her du aliyan ve were rakirin û bi sepandina têkiliyên zext-volima rastîn ên ku di odeyên dil de çêdibin.
Remodelkirina zêde-dirêjkirî ya ku di vê destnivîsê de hatî ragihandin bi teqlîdkirina nîşanên hîperstretchê yên hîpertrofîk sînorkirî ye.Bi vî rengî, ev model dikare di lêkolîna îşaretkirina hîpertrofîkî ya ku bi dirêjbûnê ve hatî çêkirin de bêyî hewcedariya faktorên mîzahî an neuralî (yên ku di vê pergalê de nîn in) de bibe alîkar.Lêkolînên din hewce ne ku pirjimariya CTCM zêde bikin, mînakî, co-çandkirina bi hucreyên belengaz re, veguheztina faktorên mîzahî yên plazmayê, û înnervasyon dema ku hev-çandî bi hucreyên neuronal re dê îmkanên modelkirina nexweşiyê bi CTCM re baştir bike.
Di vê lêkolînê de 13 beraz hatin bikaranîn.Hemî prosedurên heywanan li gorî rêwerzên sazûmaniyê hatine kirin û ji hêla Komîteya Lênihêrîn û Bikaranîna Heywanan a Saziyê ya Zanîngeha Louisville ve hatine pejirandin.Kevana aortê hat girtin û dil bi 1 lître kardioplegiya sterîl (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparîn, pH heta 7) hate perfun kirin. dil di çareseriya kardioplejîk a qeşa-sar de hatin parastin heya ku li laboratûvarê li ser qeşayê ku bi gelemperî <10 hûrdem e. dil di çareseriya kardioplejîk a qeşa-sar de hatin parastin heya ku li laboratûvarê li ser qeşayê ku bi gelemperî <10 hûrdem e. Serdca хранили в ледяном кардиоплегическом blovawe to transportirovki di laboratorên lüdu de, что обычно занимает <10 мин. dil di çareseriya kardioplejîk a qeşa-sar de hatin hilanîn heya ku berbi laboratuarê li ser berfê, ku bi gelemperî <10 hûrdem digire.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钒将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钒 Derжиte Serdca во ледяной кардиоплегии до транспортировки во лабораторию на льду, обычно <10 мин. Dil li ser cardioplegia berfê bihêlin heya ku berbi laboratuarê li ser qeşayê veguhezînin, bi gelemperî <10 hûrdem.
Amûra CTCM di nermalava sêwirana bi alîkariya komputerê (CAD) de SolidWorks hate pêşve xistin.Odeyên çandê, dabeşker û odeyên hewayê ji plastika acrylic a zelal a CNC têne çêkirin.Zengila paşîn a bi dirêjahiya 7 mm di navendê de ji polîetîlenê bi tîrêjiya bilind (HDPE) hatî çêkirin û xwedan zengilek o-ring e ku zengila silikonê ya ku ji bo girtina medyayê di binê de tê bikar anîn bicîh tîne.Parzûnek silîka zirav jûreya çandê ji plakaya veqetandinê vediqetîne.Parzûna silîkonê bi lazerê ji pelê silîkonê 0,02 ″ stûr tê birrîn û xwedan hişkiya 35A ye.Gasketên silîkonê yên jêrîn û jorîn bi lazerê ji pelê silîkonê 1/16 înç qutkirî ne û xwedan hişkiya 50A ne.Ji bo girêdana blokê û çêkirina pêçek hewayê 316L çîpên pola zengarnegir û gwîzên baskê têne bikar anîn.
Destûrek çapkirî ya taybetî (PCB) ji bo ku bi pergala C-PACE-EM ve were yek kirin hatî çêkirin.Soketên girêdana makîneya swîsreyî ya li ser PCB bi elektrodên grafît ve bi têlên sifir-zivkirî û tûncên 0-60 yên tûncê yên ku di nav elektrodê de têne qewirandin ve têne girêdan.Rêzeya çapkirî di berga çapera 3D de tê danîn.
Amûra CTCM ji hêla çalakkerek pneumatîk a bernamekirî (PPD) ve tê kontrol kirin ku zextek gerîdokek kontrolkirî ya mîna çerxa dil diafirîne.Her ku zexta hundurê jûreya hewayê zêde dibe, membrana silîkonê ya maqûl ber bi jor ve berfireh dibe, navgînê di bin cîhê tevnê de bi zorê dihêle.Wê gavê qada tîrêjê dê bi vê derxistina şilê ve were dirêj kirin, ku berfirehbûna fîzyolojîk a dil di dema diastole de teqlîd dike.Di lûtkeya rihetbûnê de, teşwîqkirina elektrîkê bi elektrodên grafît ve hate sepandin, ku zexta di odeya hewayê de kêm kir û bû sedema kişandina beşên tevnvîsê.Di hundurê boriyê de valvek hemostatîk bi senzorek zextê heye ku zexta di pergala hewayê de tespît bike.Zexta ku ji hêla sensora zextê ve tê hîs kirin li berhevkarek daneyê ya ku bi laptopê ve girêdayî ye tê sepandin.Ev rê dide çavdêriya domdar a zextê di hundurê odeya gazê de.Dema ku zexta jûreyê ya herî zêde gihîşt (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), amûra wergirtina daneyê hate ferman kirin ku ji pergala C-PACE-EM re sînyalek bişîne da ku ji bo 2 ms sînyalek voltaja bifazîk çêbike, li 4 V hatî danîn.
Beşên dil hatin girtin û şert û mercên çandê yên di 6 bîran de wiha hatin kirin: Dilên berhevkirî ji keştiya veguheztinê veguhezînin tepsiyek ku tê de kardioplegiya sar (4 ° C.) heye.Malika çepê bi kelekek sterîl hate veqetandin û perçeyên 1-2 cm3 hate birîn.Van blokên tevnvîsê bi adhesive tevnvîsê ve bi piştgirên tevnvîsê ve hatin girêdan û li serşokê mîkrotomê ya vibrasyonê ya ku tê de çareseriya Tyrode's heye û bi domdarî oksîjen kirin (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KM4 .7-g01, 6 mM KC1, 0,6 mM (g01-g0), 6 mM KC1, 0,1-g0, 0. mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M çareserî), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M çareserî), heta 1 L ddH2O).Mîkrotoma vibrasyonê hate danîn ku perçeyên stûr ên 300 μm bi frekansa 80 Hz, mezinahiya vibrasyonê ya horizontî 2 mm, û rêjeya pêşkeftinê 0,03 mm / s.Serşokê tevnvîsê bi qeşayê hate dorpêç kirin da ku çareserî sar bimîne û germahî di 4 °C de hate domandin.Beşên tevnvîsê ji hemama mîkrotomê veguherînin hemamek inkubasyonê ya ku li ser qeşayê çareseriya Tyrode bi domdarî oksîjenkirî vedihewîne heya ku bes beşên yek plakaya çandê werin bidestxistin.Ji bo çandên transwell, beşên tevnvîsê bi piştgirên polîuretanê yên 6 mm berfire ve hatin girêdan û di 6 ml navgînek xweşbînkirî (199 navîn, 1x pêveka ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline û 2X antîbiyotîk-antîfungal) hatin danîn.Stimulasyona elektrîkê (10 V, frekansa 1.2 Hz) bi navgîniya C-Pace ve li beşên tevnvîsê hate sepandin.Ji bo şert û mercên TD, T3 û Dex nû li 100 nM û 1 μM di her guherîna navîn de hatin zêdekirin.Navgîn rojek 3 caran berî veguheztinê bi oksîjenê têr kirin.Beşên tîrêjê di inkubatorek li 37°C û %5 CO2 de hatin çandin.
Ji bo çandên CTCM, beşên tevnvîsê li ser çapkerek 3D-ya xwerû ya çêkirî di fişek Petri de ku çareseriya Tyrode ya guhertî tê de heye, hatin danîn.Amûr ji bo zêdekirina mezinahiya perçeya dil ji% 25 ji qada zengila piştgiriyê hatî çêkirin.Ev tê kirin da ku beşên dil piştî ku ji çareseriya Tyrode berbi navîn û di dema diastole de têne veguheztin dirêj nebin.Bi karanîna benîştek histoakrîlîk, beşên 300 μm qalind li ser zengilek piştgirî ya bi dirêjahiya 7 mm hatin veqetandin.Piştî ku beşên tevnvîsê bi zengila piştgirîyê ve girêdin, beşên tevnvîsê yên zêde jêkin û beşên tevnvîsê yên pêvekirî dîsa bixin nav hemama çareseriya Tyrode li ser qeşayê (4°C) heta ku beşên bes ji bo yek amûrekê werin amadekirin.Dema pêvajoyê ya tevahî ji bo hemî cîhazan divê ji 2 demjimêran derbas nebe.Piştî ku 6 beşên tevnvîsê bi zengilên piştevaniya wan ve hatin girêdan, cîhaza CTCM hate berhev kirin.Odeya çandê ya CTCM bi 21 ml navgîniya pêş-oksîjenkirî ve tê dagirtin.Parçeyên tevnê veguhezînin jûreya çandê û bi baldarî bi pîpetê gulikên hewayê derxînin.Dûv re beşa tevnvîsê di qulikê de tê rêve kirin û bi nermî li cîhê xwe tê pêçandin.Di dawiyê de, kapika elektrodê li ser cîhazê bixin û amûrê veguhezînin inkubatorê.Dûv re CTCM bi lûleya hewayê û pergala C-PACE-EM ve girêdin.Çalakgera pneumatîk vedibe û valahiya hewayê CTCM vedike.Pergala C-PACE-EM hate mîheng kirin ku 4 V li 1.2 Hz di dema pacing biphasîk de ji bo 2 ms.Navgîn rojê du caran dihat guherandin û elektrod rojê carekê dihatin guhertin da ku grafît li ser elektrodê kom nebe.Ger hewce be, beşên tevnvîsê dikarin ji bîrên çanda wan werin rakirin da ku her kulîlkên hewayê yên ku di bin wan de ketine derxînin.Ji bo şert û mercên dermankirina MT, T3 / Dex bi her guherîna navîn re bi 100 nM T3 û 1 μM Dex nû hate zêdekirin.Amûrên CTCM di inkubatorek li 37 ° C û 5% CO2 de hatin çandin.
Ji bo bidestxistina trajektorên dirêjkirî yên perçeyên dil, pergalek kamerayek taybetî hate pêşve xistin.Kamerayek SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japonya) bi lensek makro ya Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA) hate bikar anîn.Piştî ku navgîn bi navgînek nû ve hatî veguheztin, dîmen li germahiya odeyê hate kirin.Kamera di goşeya 51° de ye û vîdyoyê bi 30 frame di çirkeyê de tê tomar kirin.Pêşîn, nermalava çavkaniya vekirî (MUSCLEMOTION43) bi Wêne-J re hate bikar anîn da ku tevgera perçeyên dil bihejmêre.Maske bi karanîna MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) hate afirandin da ku deverên balkêş ji bo lêdana dilşikên dil diyar bike da ku ji deng dûr nekevin.Maskên dabeşkirî yên bi destan li ser hemî wêneyan di rêzek çarçoveyê de têne sepandin û dûv re derbasî pêveka MUSCLEMOTION dibin.Muscle Motion giraniya navînî ya pîxelan di her çarçoveyê de bikar tîne da ku tevgera xwe li gorî çarçoveya referansê bihejmêre.Daneyên hatine tomarkirin, fîltrekirin û ji bo pîvandina dema çerxê û nirxandina dirêjbûna tevneyê di dema çerxa dil de hatine bikar anîn.Vîdyoya tomarkirî bi karanîna parzûnek dîjîtal a sifir-qonaxa yekem-paş-pêvajoyê hate çêkirin.Ji bo pîvandina dirêjbûna tevnê (lût-to-lûtkê), analîza lûtke-bi-lûtkê hate kirin da ku di îşareta tomarkirî de lûtk û lûtkeyan cuda bikin.Digel vê yekê, hilweşandin bi karanîna polînomîyek rêza 6-an tête kirin da ku dravê nîşanê ji holê rabike.Koda bernameyê di MATLAB-ê de hate pêşve xistin da ku tevgera tevnvîsê ya gerdûnî, dema çerxê, dema rihetbûnê, û dema girêbestê diyar bike (Kodê Bernameya Pêvek 44).
Ji bo analîza zirav, bi karanîna heman vîdyoyên ku ji bo nirxandina dirêjkirina mekanîkî hatine afirandin, me pêşî du wêneyên ku li gorî nermalava MUSCLEMOTION lûtkeyên tevgerê (herî zêde (jor) û nizmtirîn (jêr) xalên tevgerê temsîl dikin, şopandin.Dûv re me deverên tevnvîsê parçe kirin û şêwazek algorîtmaya şidandinê li tevna perçekirî bicîh kirin (Hêjmara Pêvek. 2a).Dûv re tevna perçekirî li deh rûberan hate dabeş kirin, û tansiyona li ser her rûxarê bi karanîna hevkêşeya jêrîn hate hesibandin: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, ku Sup û Sdown bi rêzê dûrahiya şeklê ji siyên jorîn û jêrîn ên qumaşê ne (Hêjîra pêvek. .2b).
Beşên dil di 48 saetan de di 4% paraformaldehyde de hatine sabît kirin.Tiştên sabît di 1 saetan de di 10% û 20% sukrozê de, dûv re di 30% sukrozê de bi şev dehîderat kirin.Dûv re beş di nav kompleksa germahiya birrîna optimum (tevlîheva OCT) de hatin bicîh kirin û hêdî hêdî di hemamek berfê ya îsopentan / zuwa de hatin cemidandin.Blokên binavkirina OCT-ê heya veqetandinê di -80 °C de hilînin.Slaytên wekî beşên bi qalindahiya 8 mîkrom hatin amadekirin.
Ji bo rakirina OCT ji beşên dil, slaytan li ser bloka germkirinê di 95 °C de 5 hûrdem germ bikin.1 ml PBS li her slaydekê zêde bikin û 30 hûrdeman li germahiya odeyê bihêlin, dûv re bi danîna %0,1 Triton-X li PBS-ê 15 hûrdem li germahiya jûreyê, beşan biperçiqînin.Ji bo ku antîbodên ne-taybet bi nimûneyê ve girê nedin, 1 ml ji %3 çareseriya BSA li slaytan zêde bikin û 1 saetê li germahiya odeyê bihêlin.Dûv re BSA hate rakirin û slaytên bi PBS hatin şûştin.Her nimûne bi qelemê nîşan bikin.Antîbodên seretayî (1:200 di 1% BSA de hatî rijandin) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) û troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) li ser 90 hûrdeman hatin zêdekirin, dûv re li dijî 1% antîbodîyên Alexsa yên duyemîn hatin zêdekirin (2000 antîbodîsên duyemîn). 488 (Thermo Scientific; #A16079), li dijî rabbit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) ji bo 90 hûrdemên din 3 caran bi PBS hate şuştin Ji bo ku rengkirina armancê ji paşxanê veqetîne, me tenê antîbodya duyemîn wekî kontrol bikar anî. Di dawiyê de, renga DAPI-ê hate zêdekirin û lekerên nukleerî yên bi sliberên nazik hatin danîn. -x mezinkirin) û mîkroskopa Keyence bi mezinbûna 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) li 5 μg / ml di PBS de ji bo rengkirina WGA hate bikar anîn û li beşên sabît 30 hûrdem li germahiya odeyê hate sepandin.Dûv re slayt bi PBS hatin şûştin û reşa Sûdanê li her slaytekê hate zêdekirin û 30 hûrdeman înkuba kirin.Dûv re slaytên bi PBS hatin şûştin û navgîna vekêşana vectashield hate zêdekirin.Slides li ser mîkroskopa Keyence bi mezinbûna 40x hatine xuyang kirin.
OCT ji nimûneyên ku li jor hatî destnîşan kirin hate derxistin.Piştî rakirina OCT-ê, şevekê slaytan di çareseriya Bouin de bihêlin.Dûv re slayt 1 saetê bi ava serjêkirî hatin şuştin û dûv re 10 hûrdeman di nav çareseriyek Bibrich aloe acid fuchsin de hatin danîn.Dûv re slaytên bi ava distîlkirî hatin şûştin û 10 hûrdeman di nav çareseriyek ji %5 fosfomolîbdenum/5% asîda fosfotungstîk de hatin danîn.Bêyî şuştinê, slaytan rasterast ji bo 15 hûrdeman veguhezînin nav çareseriya şîn a anilîn.Dûv re slayt bi ava serjêkirî hatin şûştin û 2 hûrdeman di nav çareseriyek asîda acetîk a ji %1 de hatin danîn.Slides di 200 N etanolê de hatin hişk kirin û veguheztin xylene.Slaytên rengkirî bi karanîna mîkroskopa Keyence bi armancek 10x ve hatin xuyang kirin.Rêjeya qada fibrosis bi karanîna nermalava Keyence Analyzer hate hejmartin.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), hejmara katalogê V13154, li gorî protokola çêker bi hin guhertinan.Bi taybetî, pişkek neştergerî ya bi dirêjahiya 6 mm hate bikar anîn da ku di dema analîza MTT-ê de mezinahiya tevnek yekgirtî were piştrast kirin.Li gorî protokola hilberîner, tevnhev bi rengek ferdî di nav bîrên plakaya 12-kaniyê ya ku substrata MTT-ê tê de tê vedan kirin.Ev beş 3 saetan di germahiya 37°C de têne înkubakirin û tevna zindî substrata MTT-ê metabolîze dike û pêkhateyek formazan a binefşî çêdike.Li şûna çareseriya MTT 1 ml DMSO û li 37 °C 15 hûrdeman înkuba bikin da ku formazanê binefşî ji beşên dil derxînin.Nimûne di DMSO de 1:10 di lewheyên jêrîn ên zelal ên 96-kal de hatin rijandin û tundiya rengê mor di 570 nm de bi karanîna xwendevanek plakaya Cytation (BioTek) hate pîvandin.Xwendin li gorî giraniya her perçeyek dil normal bûn.
Medya perçeya dil bi medyaya ku 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) vedihewîne ji bo ceribandina karanîna glukozê wekî ku berê hatî destnîşan kirin hate guheztin.Piştî 4 saetan ji înkubasyonê, 100 µl navgînê têxin lûleya mîkrosentrîfujê ya vekirî ya ku tê de 100 µl HCl 0,2 N heye.Dûv re lûle di lûleya sîntilasyonê ya ku tê de 500 μl dH2O tê de hate danîn da ku [3H]2O 72 saetan di 37 °C de biherike.Dûv re lûleya mîkrosentrîfujê ji lûleya sîntilasyonê derxînin û 10 ml ava şilandinê lê bikin.Jimartina sîntilasyonê bi karanîna analyzerek şilkirina şil a Tri-Carb 2900TR (Pargîdaniya Packard Bioscience, Meriden, CT, USA) hate kirin.Dûv re karanîna glukozê li gorî çalakiya taybetî ya [5-3H] -glukozê, hevsengiya netemamî û paşverû, dilopkirina [5-3H]-ji glukoza nelabelkirî, û berevajîkirina sîntilasyonê hate hesibandin.Daneyên bi girseya beşên dil têne normal kirin.
Piştî homojenkirina tevnê li Trizol, RNA ji beşên dil bi karanîna Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 li gorî protokola çêker hate veqetandin.Amadekirina pirtûkxaneya RNAsec, rêzkirin û analîzkirina daneyan bi vî rengî hate kirin:
Ji bo amadekirina pirtûkxaneya ARNyê ji bo her nimûneyê 1 μg RNA wekî materyalê destpêkê hate bikar anîn.Pirtûkxaneyên rêzgirtinê bi karanîna Kit Amadekirina Pirtûkxaneya NEBNext UltraTM RNA ji bo Illumina (NEB, USA) li dû pêşnîyarên çêker hatin afirandin, û ji bo her nimûneyê kodên nîşankirinê li rêzikên taybetmendiyê hatin zêdekirin.Bi kurtasî, mRNA ji RNA-ya tevayî bi karanîna mûçikên magnetîkî yên bi oligonukleotîdên poly-T ve girêdayî hate paqij kirin.Parçekirin bi karanîna kationên duvalent di germahiya bilind de di NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) de pêk tê.CDNA ya yekem bi karanîna primerên hexamer ên rasthatî û transkrîptaza berevajî M-MuLV (RNase H-) hate sentez kirin.Dûv re cDNA-ya duyemîn bi karanîna DNA-polymerase I û RNase H tê sentez kirin. Zêdengên mayî bi çalakiya eksonukleaz/polîmerazê ve vediguhezin lûtkeyan.Piştî adenîlasyona 3' dawiya perçeya ADNyê, NEBNext Adapterek bi avahiyek lûleya porê pê ve tê girêdan da ku wê ji hîbrîdîzasyonê re amade bike.Ji bo hilbijartina perçeyên cDNA yên bi dirêjahiya bijartî 150-200 bp.Parçeyên pirtûkxaneyê bi karanîna pergala AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA) hatin paqij kirin.Dûv re, 3 μl BERSÎVEK EZÎMA (NEB, USA) bi cDNA-ya bijartî ya bi mezinahiyê ve ku bi adapterê ve hatî girêdan 15 hûrdeman li 37 °C û dûv re 5 hûrdem li 95 °C berî PCR hate bikar anîn.Dûv re PCR bi karanîna Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primerên gerdûnî yên PCR, û primerên Indeks (X) hate kirin.Di dawiyê de, hilberên PCR hatin paqij kirin (pergala AMPure XP) û kalîteya pirtûkxaneyê li ser pergala Agilent Bioanalyzer 2100 hate nirxandin.Pirtûkxaneya cDNA paşê bi karanîna rêzkerek Novaseq hate rêzkirin.Pelên wêneya xav ji Illumina bi karanîna CASAVA Base Calling veguherî xwendinên xav.Daneyên xav di pelên formata FASTQ(fq) de têne hilanîn ku rêzikên xwendinê û taybetmendiyên bingehîn ên têkildar vedihewîne.HISAT2 hilbijêrin da ku rêzikên fîlterkirî bi jenoma referansa Sscrofa11.1-ê re hevaheng bikin.Bi gelemperî, HISAT2 genomên her mezinahiyê piştgirî dike, tevî genomên ji 4 mîlyar bingehên mezintir, û nirxên xwerû ji bo pir pîvanan têne danîn.Bihevkirina xwendina ji daneyên RNA Seq dikare bi karanîna HISAT2, pergala zûtirîn a ku heya niha peyda dibe, bi heman an jî çêtir rastiyek ji her rêbazek din re bi bandor were rêz kirin.
Pirbûna transkriptan rasterast asta vegotina genê nîşan dide.Asta vegotina genê ji hêla pirbûna transkrîpsiyonê (hejmarkirina rêzikan) ve bi genom an exons ve têne nirxandin.Hejmara xwendinê bi astên vegotina genê, dirêjahiya genê, û kûrahiya rêzkirinê re têkildar e.FPKM (parçeyên ji hezar cotên bingehîn ên transkrîptê yên ku li ser mîlyon cotên bingehîn têne rêz kirin) hatin hesibandin û P-nirxên îfadeya cihêreng bi karanîna pakêta DESeq2 hatin destnîşankirin.Dûv re me rêjeya vedîtina derewîn (FDR) ji bo her nirxa P bi karanîna rêbaza Benjamini-Hochberg9 li ser bingeha fonksiyona R-ya çêkirî "p.adjust" hesab kir.
RNA ya ku ji beşên dil veqetandî ye, bi karanîna mixa SuperScript IV Vilo Master ji Thermo (Thermo, jimar. cat. 11756050) veguherî cDNA-yê bi giraniya 200 ng/μl.RT-PCR-ya mîqdar bi karanîna plakaya berteka zelal a Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-baş (Thermo, cat. No. 4483319) û adhesive optîkî ya mîkroamp (Thermo, cat. no. 4311971) hate kirin.Tevra reaksiyonê ji 5 μl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 μl Taqman Primer û 3,5 μl H2O di her bîrekê de tevlihev bû.Demjimêlên qPCR yên standard hatin xebitandin û nirxên CT-ê bi karanîna amûrek PCR-ya rastîn a Applied Biosystems Quantstudio 5 (modula 384-baş; hilber # A28135) hatin pîvandin.Destpêkên Taqman ji Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL81 (Ss03375629_u1), RGL81 (Ss0800N) hatin kirîn 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss08_m245 nirxa xaniyan ji bo nimûneyên Ss08_m1 normalîze kirin) GAPDH.
Daxuyaniya medyayê ya NT-ProBNP bi karanîna kîta NT-ProBNP (beraz) (Nimreya pisîkê MBS2086979, MyBioSource) li gorî protokola çêker hate nirxandin.Bi kurtasî, 250 μl ji her nimûne û standardek ducar li her bîrekê hate zêdekirin.Yekser piştî lêkirina nimûneyê, 50 µl Assay Reagent A li her bîrekê zêde bikin.Bi nermî plakê bihejînin û bi sealantê veşêrin.Dûv re tablet 1 saetê di germahiya 37°C de hatin înkubakirin.Dûv re çareseriyê aspire bikin û bi 350 μl 1X çareseriya şuştinê 4 caran kaniyan bişon, her carê çareseriya şuştinê 1-2 hûrdeman bişon.Dûv re 100 μl Assay Reagent B li her bîrekê lê zêde bikin û bi sealantê plakê veşêrin.Tablet bi nermî hat hejandin û 30 hûrdeman di 37°C de hate înkubakirin.Çareseriyê aspir bikin û bi 350 μl 1X çareseriya şuştinê 5 caran bîran bişon.90 μl çareseriya substratê li her bîrekê zêde bikin û plakê bixin.Plateyê 10-20 hûrdeman di germahiya 37°C de bihelînin.50 µl Çareseriya Rawestandinê li her bîrekê zêde bikin.Plate tavilê bi karanîna plakaya Cytation (BioTek) ku li 450 nm hatî danîn hate pîvandin.
Analîzên hêzê hatin kirin da ku pîvanên komê hilbijêrin ku dê hêza> 80% peyda bike da ku 10% guheztina bêkêmasî ya di parametreyê de bi rêjeya xeletiya 5% Tîpa I-yê bibîne. Analîzên hêzê hatin kirin da ku pîvanên komê hilbijêrin ku dê hêza> 80% peyda bike da ku 10% guheztina bêkêmasî ya di parametreyê de bi rêjeya xeletiya 5% Tîpa I-yê bibîne. Analîzkirina îmkanên bi tevahî ji bo hilberandina grûpê, ku çapkirinê > 80% jêhatîbûn ji bo nûvekirinê 10% absolutnogo guherbarên parametra bi 5% demjimêrên cureyê I. Analîzkirina hêzê hate kirin da ku mezinahiyên komê hilbijêrin ku dê hêza> 80% peyda bike da ku 10% guheztina pîvana bêkêmasî bi rêjeya xeletiya 5% ya Tîpa I-yê bibîne.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％觥检测参数中10％绝对变化和5％褧朋参进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％觥检测参数中10％绝对变化和5％褧朋参 Ji bo vebijarkên cuda yên grûpên taybet ên ji bo hilberandina vebijarkan, ji bo 80% vebijarkên ji bo kêmasiya 10% absolutnogo guherbarên parametrov û 5% demjimêr ji bo cureyên I. Analîzek hêzê hate kirin da ku mezinahiya komê hilbijêrin ku dê> 80% hêz peyda bike da ku 10% guheztina pîvana bêkêmasî û 5% rêjeya xeletiya celeb I peyda bike.Beriya azmûnê beşên tevnî bi korfelaqî hatin hilbijartin.Hemî analîz bi şertê kor bûn û nimûne tenê piştî ku hemî dane hatin analîz kirin hatin deşîfre kirin.Nermalava GraphPad Prism (San Diego, CA) ji bo pêkanîna hemî analîzên statîstîkî hate bikar anîn. Ji bo hemî statîstîkan, p-nirx di nirxên <0.05 de girîng têne hesibandin. Ji bo hemî statîstîkan, p-nirx di nirxên <0,05 de girîng têne hesibandin. Dlya hemû statîstîkên p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ji bo hemî statîstîkan, p-nirx di nirxên <0,05 de girîng têne hesibandin.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Dlya hemû statîstîkên p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ji bo hemî statîstîkan, p-nirx di nirxên <0,05 de girîng têne hesibandin.T-testa Xwendekarê du-tevlihev li ser daneyan bi tenê 2 danberhevan hate kirin.Ji bo destnîşankirina girîngiya di navbera gelek koman de ANOVA yek-alî an du-alî hate bikar anîn.Dema ku ceribandinên post-hoc têne kirin, rastkirina Tukey hate sepandin ku ji bo berhevdana pirjimar were hesibandin.Daneyên RNAsec dema ku FDR û p.adjust dihejmêrin wekî ku di beşa Rêbazan de hatî destnîşan kirin xwedan ramanên statîstîkî yên taybetî ne.
Ji bo bêtir agahdarî li ser sêwirana lêkolînê, li Rapora Lêkolîna Xwezayê ya ku bi vê gotarê ve girêdayî ye binêre.