Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчи версиясы CSS үчүн чектелген колдоого ээ. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, колдоо үзгүлтүксүз болушу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Адамдын ичегисинин морфогенези 3D эпителий микроархитектурасынын жана мейкиндик түзүлүшүнүн крипт-виллус өзгөчөлүктөрүн белгилейт. Бул уникалдуу структура базалдык крипттеги өзөк клеткасынын уясын экзогендик микробдук антигендерден жана алардын метаболиттеринен коргоо аркылуу ичеги гомеостазын сактоо үчүн талап кылынат. ичеги-карындын былжыр челинин бети. Ошондуктан, 3D эпителий структураларын кайра түзүү in vitro ичеги моделдерин куруу үчүн абдан маанилүү. Белгилей кетчү нерсе, органикалык миметикалык ичеги-чип ичеги эпителийинин стихиялуу 3D морфогенезин индукциялай алат жана биомеханикалык процессти жакшыртат. ичегидеги ичеги морфогенезин микрофлюиддик чипте, ошондой эле Transwell орнотулган гибриддик чипте дузалайбыз. Биз аппаратты жасоонун, Како-2 же ичеги органоиддик эпителий клеткаларын кадимки шарттарда, ошондой эле микрофлюиддик платформада өстүрүүнүн деталдуу ыкмаларын сүрөттөп беребиз. lities .Бул протокол базотерапалдык суюктуктун агымын 5 күн бою контролдоо аркылуу ичегилердин функционалдык микроархитектурасын регенерациялоого жетишет. Биздин in vitro морфогенез методубуз физиологиялык жактан актуалдуу жылыш стрессти жана механикалык кыймылды колдонот жана татаал клетка инженериясын же манипуляцияны талап кылбайт, бул башка учурдагы ыкмалардан ашып түшүшү мүмкүн. биомедициналык, клиникалык жана фармацевтикалык колдонмолор үчүн in vitro 3D ичеги эпителий катмарларын жеди.
Тажрыйбалар көрсөткөндөй, ичегидеги эпителийдик Caco-2 клеткалары чипте өстүрүлгөн1,2,3,4,5 же кош катмарлуу микрофлюиддик аппараттар6,7 негизги механизмди так түшүнбөстөн, стихиялуу 3D морфогенезге өтүшү мүмкүн. Caco-2 жана пациенттен алынган ичеги органоиддери көрсөткөн 3D эпителий морфогенезин in vitro индукциялоо.Эпителий клеткалары текшерилди. Бул изилдөөдө биз өзгөчө күчтүү Wnt антагонисти Диккопф-1дин (DKK-1) клетканын түзүлүшүнө жана концентрациясынын бөлүштүрүлүшүнө өзгөчө көңүл бурдук. 1, чиптеги ичегиге бөлүнүп чыккан бырыштуу протеин 1 же Согги-1) морфогенезди токтотот же алдын ала структураланган 3D эпителий катмарын бузат. nt антагонисттер базолатералдык бөлүмдө активдүү жууш (мисалы, чипте ичеги же гибриддик-чип платформаларында) же диффузиялык .Базолатералдык медиа (мисалы, Transwell скважиналарындагы чоң базолатералдык резервуарларга киргизет).
Бул протоколдо биз полидиметилсилоксан (PDMS) негизиндеги тешиктүү мембраналар (кадамдар 6A, 7A, 8,B, polyesters68, polyesters68) боюнча ичеги эпителий клеткаларын маданияттуу үчүн чипте ичеги микротүзмөктөрүн жана Transwell-инсертивдүү гибрид микросхемаларын (1-5-кадамдар) даярдоонун деталдуу ыкмасын беребиз. , 9) жана индукцияланган 3D morphogenesis in vitro (кадам 10). Биз ошондой эле бир нече сүрөттөө ыкмаларын колдонуу менен кыртыш өзгөчө гистогенез жана тукумунан көз каранды уюлдук дифференциацияны көрсөткөн уюлдук жана молекулярдык өзгөчөлүктөрүн аныктадык (кадамдар 11-24). Биз morphogenesis induce induce such as humanal in histogenesis in vitro (кадам 10). техникалык деталдары менен маданият форматтары, анын ичинде тешиктүү мембраналардын беттик модификациясы, 2D моно катмарларынын түзүлүшү жана ичеги биохимиялык жана биомеханикалык микрочөйрөнүн көбөйүшү. in vitro. 2D эпителий бир катмарларынан 3D морфогенезди индукциялоо үчүн, биз эки өлчөмдүү чөйрөгө культуранын агымын чагылдыруу жолу менен морфоген антагонисттерин алып салдык. морфогенге көз каранды эпителий өсүшүн моделдөө үчүн колдонулушу мүмкүн болгон калыбына келүүчү 3D эпителий катмарынын пайдалуулугу, узунунан жайгашкан хост-микробиома ко-культуралары, патогендик инфекция, сезгенүү жаракаты, эпителий тосмосунун дисфункциясы жана пробиотиктерге негизделген терапия Example.influences.
Протоколубуз негизги (мисалы, ичеги-карындын былжыр челинин биологиясы, өзөк клеткасынын биологиясы жана өнүгүү биологиясы) жана прикладдык изилдөөлөрдөгү (мисалы, клиникага чейинки дары-дармектерди текшерүү, ооруну моделдөө, кыртыш инженериясы жана гастроэнтерология) кеңири таасир этүүчү окумуштуулардын кеңири чөйрөсүнө пайдалуу болушу мүмкүн. vitro, биз биздин техникалык стратегиябыз ичеги өнүктүрүү, регенерация же гомеостаз учурунда клетка сигналынын динамикасын изилдеп жаткан аудиторияга жайылтылышы мүмкүн деп ойлойбуз. Мындан тышкары, биздин протокол Norovirus 8, катуу курч респиратордук синдром Coronavirus 2 (SARSella-Comurdiicium) же Salselafflostricium 2 (SARSella-Comurdiicium) сыяктуу ар кандай инфекциялык агенттердин астында инфекцияны суракка алуу үчүн пайдалуу. Vibrio cholerae.Оорунун патологиясы жана патогенезинин аудиториялары да пайдалуу. Чиптеги ичеги микрофизиологиялык тутумун колдонуу узунунан биргелешип маданият 10 жана андан кийин ашказан-ичеги (GI) трактында 11 .Башка GI бузулуулары, синдро-лечердик оорулар, кроскулярдык оорулар менен байланышкан хоздун коргонуусун, иммундук реакцияларды жана патоген менен байланышкан жаракаттарды оңдоого мүмкүндүк берет. 3D ичеги эпителий катмарлары пациенттин 3D ичеги эпителий катмарлары менен даярдалганда колит, поучит же дүүлүктүрүүчү ичеги синдромун окшоштурса болот, бул ооруларга виллоздук атрофия, крипттин кыскарышы, былжырлуу катмардын бузулушу же эпителий тосмолорунун бузулушу кирет. Оору чөйрөсүнүн татаалдыгына байланыштуу окурмандар оорулуу перифериялык кандын мононуклеардык клеткалары (PBMCs) сыяктуу ооруга тиешелүү клетка түрлөрүн 3D ичеги виллус-крипт микроархитектурасын камтыган моделдерге кошууну ойлонушу мүмкүн.кыртыштарга тиешелүү иммундук клеткалар, 5.
3D эпителий микроструктурасын секциялоо процессисиз эле бекитип, визуалдаштырууга мүмкүн болгондуктан, мейкиндик транскриптомикасы жана жогорку резолюциядагы же супер резолюциядагы сүрөттөө боюнча иштеген көрүүчүлөр эпителий уячаларындагы гендердин жана белоктордун мейкиндик-убакыт динамикасынын картасын түзүүгө кызыкдар болушу мүмкүн.Технологияга кызыкдар. Микробдук же иммундук стимулдарга жооп берүү. Мындан тышкары, ичеги гомеостазын координациялоочу узунунан жайгашкан хост-микробиоманын кайчылаш 10, 14 ар кандай микроб түрлөрүн, микробдук жамааттарды же фекалдык микробиот- g.on-да биргелешип өстүрүү аркылуу 3D ичеги былжырлуу катмарында түзүлүшү мүмкүн.платформада. Бул ыкма былжырлуу иммунологияны, гастроэнтерологияны, адамдын микробиомасын, культуромиканы жана клиникалык микробиологияны изилдеп жаткан аудитория үчүн өзгөчө жагымдуу болот. Мурда культураланбаган ичеги микробиоталарын лабораторияда өстүрүүгө умтулушат. Эгерде биздин in vitro морфогенез протоколубуз масштабдуу культурага ыңгайлаштырылышы мүмкүн болсо, 1946 же 1000 форматтагы бир нече форматтарга ылайыкташтырылган. s тынымсыз базотерапалдык бөлүмдөрдү толуктап, протокол ошондой эле тамак-аш өнөр жайы үчүн фармацевтикалык, биомедициналык же жогорку өндүрүмдүүлүктүү скрининг же валидация платформаларын иштеп чыгуучуларга жайылтылат. Принциптин далили катары, биз жакында мультиплекстүү жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгүн ишке ашыруу мүмкүнчүлүгүн көрсөттүк. коммерциялаштырылган16,17,18.Ошондуктан, биздин in vitro морфогенез методубуздун валидациясы тездетилиши мүмкүн жана көптөгөн изилдөө лабораториялары, өнөр жай же мамлекеттик жана жөнгө салуучу агенттиктер тарабынан кабыл алынышы мүмкүн. ичеги морфогенез процессинин кайталанышын баалоо үчүн бажы же коммерциялык орган-а-чип моделдери.
Адамга тиешелүү эксперименталдык моделдердин чектелген саны ичеги эпителийинин морфогенезин изилдөө үчүн колдонулган, бул негизинен in vitro 3D морфогенезин индукциялоо үчүн ишке ашырылуучу протоколдордун жоктугунан улам. Чындыгында, ичеги морфогенези жөнүндө азыркы билимдердин көбү жаныбарларды изилдөөгө негизделген (мисалы, зебра балыктары20, тоок балыктары202,202,202,2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000. этикалык жактан шек туудурган, эң негизгиси, адамдын өнүгүү процесстерин так аныктай албайт. Бул моделдер да көп тараптуу масштабдуу manner.Therefore.Therefore, 3D кыртыш структураларын калыбына келтирүү боюнча биздин протоколу in vivo жаныбарлардын моделдерин, ошондой эле башка салттуу статикалык 2D cellli 3D үлгүлөрүн сүрөттөлгөн, мурунку 2D клеткаларын эпизоддук түрдө сүрөттөгөн. ар кандай былжырлуу же иммундук стимулдарга жооп катары крипт-виллус огундагы дифференциацияланган клеткалардын мейкиндик локализациясын амин.3D эпителий катмарлары микроб клеткаларынын мейкиндик уячаларын жана кабыл алуучу факторлорго жооп катары экологиялык эволюцияны кантип жарышарын изилдөө үчүн мейкиндикти камсыздай алат (мисалы, ички жана сырткы былжыр катмарлары, IgA3D pepemoral жана антиморалдык секреция). илим ичеги микробиотасы өз жамааттарын кантип түзөрүн жана синергетикалык түрдө микробдук метаболиттерди (мисалы, кыска чынжырлуу май кислоталары) кантип өндүрөрүн түшүнүүгө мүмкүндүк берет, алар клеткалык уюмду жана базалдык крипттерде өзөк клеткасынын уячаларын калыптандырышат. Бул өзгөчөлүктөр 3D эпителий катмарлары in vitro орнотулганда гана көрсөтүлүшү мүмкүн.
3D ичеги эпителий структураларын түзүү биздин ыкма тышкары, бир нече in vitro ыкмалары бар. Ичеги органоиддик маданият белгилүү бир морфоген шарттарда ичеги клеткаларын өстүрүү негизинде заманбап кыртыш инженерия ыкмасы болуп саналат23,24,25.Бирок, 3D органоиддик моделдерин колдонуу, анткени, char-organoid талдоо көбүнчө chacrolenture-талдоо болуп саналат. ал люмен органоиддин ичинде камтылган, демек, микроб клеткалары же экзогендик антигендер сыяктуу люминалдык компоненттерди киргизүү чектелген.Органоиддик люмендерге кирүү микроинжектордун жардамы менен жакшыртылышы мүмкүн, 26,27, бирок бул ыкма invasive жана эмгекти көп талап кылат жана аткаруу үчүн атайын билимди талап кылат. Мындан тышкары, статикалык шарттарда гидрогелдик складдарда сакталган салттуу органоиддик маданияттар in vivo биомеханикасы активдүү чагылдырбайт.
Бир нече изилдөө топтору колдонгон башка ыкмалар гелдин бетинде обочолонгон адамдын ичеги клеткаларын өстүрүү аркылуу ичеги эпителийинин түзүлүшүн тууроо үчүн алдын ала структураланган 3D гидрогель складдарын колдонушат. 3D басып чыгарылган, микро-майдаланган же литографиялык түрдө даярдалган калыптардын жардамы менен гидрогель складдарын жасоо. морфогендик градиенттер, жогорку пропорциялуу эпителий түзүмүн жана строма-эпителий кайчылашуусун орнотуу менен стромалык клеткаларды скелетке киргизет. Бирок, алдын ала структураланган складдардын табияты стихиялуу морфогенетикалык процесстин өзүн көрсөтүүгө жолтоо болушу мүмкүн. генези жана ээ физиологиялык function.Another акыркы изилдөө бир microfluidic платформа hydrogel scaffolds колдонулган жана үлгүлүү ичеги эпителий түзүмдөрү лазер-оюд ыкмаларды колдонуу менен. Чычкан ичеги органоиддер ичеги түтүк структураларды түзүү үчүн оюп үлгүлөрүн ээрчип, жана intraluminal суюктуктун агымы бул microfluidic моделин recapitulated. морфогенетикалык процесстер ичегидеги механобиологиялык кыймылдарды да камтыбайт. Ошол эле топтун 3D басып чыгаруу ыкмалары стихиялуу морфогенетикалык процесстери бар миниатюралык ичеги түтүктөрүн түзө алган. Түтүктүн ичинде ар кандай ичеги сегменттеринин татаал жасалгасына карабастан, бул моделде люминалдык суюктуктун агымы жана механикалык деформация жок. Мындан тышкары, моделдин иштөө жөндөмдүүлүгү, өзгөчө, биоклеткадагы басып чыгаруу процессинин толук шарттары менен чектелген болушу мүмкүн. Анын ордуна, биздин сунуштаган протокол ичегилердин стихиялуу морфогенезин, физиологиялык жактан ылайыктуу жылышуу стрессин, ичеги моторикасын туураган биомеханиканы, көз карандысыз апикалдык жана базотерапалдык бөлүмдөрдүн жеткиликтүүлүгүн жана модулдук татаал биологиялык микрочөйрөлөрдү кайра түзүүнү камсыз кылат. бар ыкмалары.
Биздин протокол толугу менен 3D эпителий морфогенезине багытталган, маданиятта бир гана эпителий клеткалары жана мезенхималдык клеткалар, эндотелий клеткалары жана иммундук клеткалар сыяктуу башка курчаган клеткалар жок. Мурда сүрөттөлгөндөй, биздин протоколдун өзөгү эпителий морфогенезинин индукциясы болуп саналат. Чиптеги ичегилердин жана чиптеги гибриддердин модулдуктуулугу бизге толкундуу 3D эпителий катмарын, эпителий-мезенхималдык өз ара аракеттенишүүлөр33,34 сыяктуу кошумча биологиялык татаалдыктарды, клеткадан тышкаркы матрицаны (ECM) жайгаштыруу 35 жана биздин моделде крипталдык клеткалардагы крипталдык клеткалардын өзгөчөлүктөрү бойдон калууда. мезенхимадагы тромалык клеткалар (мисалы, фибробласттар) ECM протеиндерин өндүрүүдө жана ичеги морфогенезин жөнгө салууда негизги ролду ойнойт35,37,38. Биздин моделге мезенхимдик клеткалардын кошулушу морфогенетикалык процессти жана клеткалардын биригүү эффективдүүлүгүн жогорулатты. Эндотелийдик катмар (б.а., капиллярларды регулярдоочу иммундук клеткалар) жана клеткалардын маанилүү ролун ойнойт. ичеги микрочөйрөсүндө recruitment40. Мындан тышкары, кыртыш моделдери көп органдардын өз ара аракеттешүүсүн көрсөтүү үчүн иштелип чыкканда, кыртыш моделдеринин ортосунда туташтырылуучу кан тамырлардын компоненттери милдеттүү шарт болуп саналат. Ошондуктан, эндотелий клеткалары орган-деңгээлдеги физиологиялык өзгөчөлүктөрдү моделдөө үчүн киргизилиши керек болушу мүмкүн. тубаса адаптациялык иммундук кайчылаш, жана ичеги-карын ооруларын туураган контекстинде ткандардын өзгөчө иммунитети.
Гибриддик чиптерди колдонуу чипте ичегиге караганда жөнөкөй, анткени аппараттын жөндөөлөрү жөнөкөй жана Transwell кошумчаларын колдонуу ичеги эпителийинин масштабдуу маданиятын түзүүгө мүмкүндүк берет. Бирок полиэстер мембраналары бар коммерциялык Трансвелл кошумчалары ийкемдүү эмес жана перистальтикага окшош кыймылдарды симуляциялай албайт. апикалдык капталдагы жылыш стресс. Албетте, апикалдык отсектеги статикалык касиеттер гибриддик чиптерде узак мөөнөттүү бактериялык биргелешип маданиятты сейрек иштетет. Гибриддик чиптерди колдонууда Transwell койгучтарында 3D морфогенезди бекем индукциялай алсак, физиологиялык жактан тиешелүү суюктуктун агымынын жетишсиздиги микросхемалардын апикалдык биомеханикасын чектеши мүмкүн.
Чиптеги ичеги жана чиптеги гибриддик культуралардагы адамдын крипт-виллус огунун толук масштабдуу реконструкциялары толук аныктала элек. Морфогенез эпителийдин бир катмарынан башталгандыктан, 3D микроархитектуралары сөзсүз түрдө вивоклеткадагы криптификацияланган популяциянын криптификацияланган доменине морфологиялык окшоштугун камсыз кыла албайт. микроинженердик 3D эпителий, крипт жана виллдуу аймактар ​​так ажыратылган эмес. Чиптеги жогорку каналдар микроинженердик эпителийдин бийиктигин жогорулатууга алып келгени менен, максималдуу бийиктик дагы эле ~300–400 мкм менен чектелет. Адамдын ичегисинин иш жүзүндөгү тереңдиги жана чоң крипттердин 1 μ50 м ге салыштырмалуу ly, ал эми ичке ичеги вилласынын бийиктиги ~600 мкм41.
Сүрөттөө көз карашынан алганда, 3D микроархитектураларын in situ супер-резолюциялуу сүрөттөө чиптеги ичеги менен чектелиши мүмкүн, анткени объективдүү линзадан эпителий катмарына чейинки талап кылынган иш аралык бир нече миллиметрге барабар. Бул көйгөйдү чечүү үчүн алыскы объект талап кылынышы мүмкүн. Мындан тышкары, чиптеги ичегилердин катмар-катмар микрофабрикациясы ар бир катмардын ортосунда туруктуу адгезияны камтыгандыктан, эпителий катмарынын беттик түзүлүшүн изилдөө үчүн үстүнкү катмарды ачуу же алып салуу өтө кыйынга турат. Мисалы, сканерлөөчү электрондук микроскоптун (SEM) жардамы менен.
PDMS гидрофобдук чакан молекулалар менен алектенген микрофлюиддик негиздеги изилдөөлөрдө чектөөчү фактор болуп калды, анткени PDMS мындай гидрофобдук молекулаларды спецификалык түрдө адсорбциялай алат. PDMSге альтернативалар башка полимердик материалдар менен каралышы мүмкүн. Же болбосо, PDMSдин беттик модификациясы (мисалы, полиэтилендик материалдар менен (мисалы, g243) ) гидрофобдук молекулалардын адсорбциясын азайтуу үчүн каралышы мүмкүн.
Акыр-аягы, биздин методубуз жогорку өндүрүмдүү скрининг же “бир өлчөмгө ылайыктуу” колдонуучуга ыңгайлуу эксперименталдык платформаны камсыз кылуу жагынан жакшы мүнөздөлгөн эмес. Учурдагы протокол ар бир микротүзмөк үчүн шприц насосун талап кылат, ал CO2 инкубаторунда мейкиндикти ээлейт жана масштабдуу эксперименттердин алдын алат. Үзгүлтүксүз толтурууга жана базотерапалдык чөйрөнү алып салууга мүмкүндүк берүүчү 384-кудуктуу тешикчелер).
In vitro адамдын ичеги эпителийинин 3D морфогенезин индукциялоо үчүн, биз эки параллелдүү микроканалды жана ортосунда серпилгичтүү тешикче кабыкчаны камтыган микрофлюиддик чип ичеги аппаратын колдондук. Ошондой эле люмен-капиллярдык интерфейсти түзүү үчүн бир каналдуу микрофлюиддик аппаратты колдонууну көрсөттүк. Transwell inserts боюнча. Эки платформада тең адамдын ар кандай ичеги эпителий клеткаларынын морфогенези базотерапал бөлүмдөн морфоген антагонисттерин алып салуу үчүн агымдын багыттуу манипуляциясын колдонуу аркылуу көрсөтүлүшү мүмкүн. Бүткүл эксперименталдык процедура (1-сүрөт) беш бөлүктөн турат: (i) ичегидеги микрофабрикация (I) ичегидеги микрофабрикация (Transwell чипси5 же Transwell чипси1); ) ичеги эпителий клеткаларын (Caco-2 клеткалары) же адамдын ичеги органоиддерин даярдоо;кутучалар 2-5), (iii) ичеги микросхемаларында же гибрид микросхемаларында ичеги эпителий клеткаларынын маданияты (6-9-кадамдар), (iv) 3D морфогенездин in vitro индукциясы (10-кадам) жана (v) ) 3D эпителий микроструктурасын мүнөздөш үчүн (төмөндө тиешелүү контролдук топтун 24-кадамдары иштелип чыккан). эпителий морфогенезди мейкиндик, убактылуу, шарттуу же процедуралык башкарууга салыштыруу менен in vitro морфогенезинин натыйжалуулугун жеди.
Биз эки башка маданият платформасын колдондук: түз каналдар менен чипте ичеги же сызыктуу эмес ийилген каналдар, же 1 кутучада сүрөттөлгөндөй даярдалган Transwell (TW) пластинкаларын камтыган гибриддик чиптер жана 1-5-кадам. клетка булагы (Caco-2 же адамдын ичеги органоиддери) жана бул протоколдо колдонулган культура процедурасы. "In vitro морфогенез" Како-2 же органоидден алынган эпителий клеткалары ичеги чипинде же гибриддик чиптин Transwell кошумчаларында өстүрүлө турган жалпы кадамдарды көрсөтөт, андан кийин программанын эпиморфозунун саны индукцияланат же эпителийдин саны 3D мүнөзгө ээ. Ар бир жебенин астында көрсөтүлөт. Колдонмо, мисалы, клетканын дифференциациясында, ичеги физиологиясын изилдөөдө, хост-микробиоманын экосистемаларын түзүүдө жана ооруну моделдөөдө орнотулган ичеги эпителий катмарларын кантип колдонууга болорун мисалдар менен камсыз кылат. ичеги чипинде.MUC2 сигналы бокал клеткаларында жана былжыр челдин беттеринен бөлүнүп чыккан былжырда болот. Ичеги физиологиясындагы флуоресценттик сүрөттөр флуоресценттүү буудай урук агглютининин жардамы менен сиал кислотасы жана N-ацетилглюкозамин калдыктары үчүн боёгондо пайда болгон былжырды көрсөтөт. чиптеги ичегидеги с. Сол панель микроинженердик 3D Caco-2 эпителий клеткалары менен жашыл флуоресценттүү протеинди (GFP) туюнткан E. coli ко-культурасын көрсөтөт. Оң панелде 3D Caco-2 эпителий клеткалары менен биргелешип өстүрүлгөн GFP E. coli локализациясын көрсөтөт, андан кийин immunofluiasered (F- модели) менен иммунофлюресценттүү. ing бактериялык антигендер (мисалы, липополисахарид, LPS) жана иммундук клеткалар (мисалы, PBMC);жашыл).Caco-2 клеткалары 3D эпителий катмарын түзүү үчүн культураланган. Масштаб тилкеси, 50 μm. Төмөнкү катардагы сүрөттөр: "Клеткалардын дифференциациясы" шилтеменин уруксаты менен ылайыкташтырылган.2.Оксфорд университетинин басмасы;Ref.5 уруксаты менен чыгарылган.NAS;Реф.3 уруксаты менен ыңгайлаштырылган "Хост-микробдун биргелешкен маданияты".NAS;"Ооруну моделдөө" маалымдамасынын уруксаты менен ылайыкташтырылган.5.УИА.
Both ичеги-на-чип жана гибрид микросхемалардын жумшак litography1,44 тарабынан кремний калыптардан бузуп жана SU-8.The үлгү менен үлгү болгон PDMS репликаларды колдонуу менен даярдалган. параллелдүү түз микроканалдарды пайда кылып, чипте татаал ичегиге айланган (кеңейтилген маалымат-сүрөт. 1b), ал суюктуктун калуу убактысынын көбөйүшүн, сызыктуу эмес агымдардын схемаларын жана өстүрүлгөн клеткалардын көп октуу деформациясын (сүрөт 2a–f) индукциялоо үчүн ийри микроканалдын жуптарын камтыйт (сүрөт 2a–f) комплекстүү биоканикага айланды. тандаса болот.Биз бүктөлгөн Gut-Chip да күчтүү 3D морфогенезди 3D морфогенезди культураланган клетканын түрүнө карабастан, баштапкы Gut-Chipге салыштырмалуу эпителий өсүштүн окшош даражасы менен окшош убакыт алкагында бекемдей турганын көрсөттүк. SU-8 үлгүлөрү бар ds калыптангандан кийин терс өзгөчөлүктөрдү камсыз кылган (сүрөт.2a).Чип боюнча ичеги даярдоо үчүн, даярдалган жогорку PDMS катмары ырааттуу түрдө тешиктүү PDMS пленка менен байланыштырылган жана андан кийин бир корона дарылоочу (сүрөт. 2b-f) аркылуу кайтарылгыс байланыш менен төмөнкү PDMS катмары менен түздөлгөн. жакшы киргизет (сүрөт. 2h жана Extended маалыматтар Сүрөт. 2). Байланыш процесси PDMS репликасынын беттерин жана айнек менен кычкылтек плазмасын же коронаны дарылоо аркылуу жүргүзүлөт. Силикон түтүкчөсүнө тиркелген microfabricated аппаратты стерилизациялоодон кийин, аппаратты орнотуу 3D morphogenesis intestilig intestinal Fig аткарууга даяр болгон.
а, SU-8 үлгүсүндөгү кремний калыптарынан PDMS бөлүктөрүн даярдоонун схемалык иллюстрациясы. Кургай элек PDMS эритмеси кремний калыпка куюлган (солдо), 60 °C (ортодо) айыгып, куюлган (оңдо). Калыптан ажыратылган PDMS бөлүктөргө кесилген жана андан ары колдонуу үчүн тазаланган. PDMS тешиктүү мембранасын жасоо үчүн колдонулат.d, Жогорку жана төмөнкү PDMS компоненттеринин жана чогулган чиптеги ичеги аппаратынын сүрөттөрүнүн сериясы.e, Жогорку, кабыкча жана төмөнкү PDMS компоненттеринин тегиздөө схемасы. Ар бир катмар плазма же корона менен кайра кайтарылгыс түрдө туташтырылган. s жана vacuum chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture.The силикон түтүк жана шприц менен чогулган чип боюнча жасалма ичеги бир coverslip боюнча жайгаштырылган.The чип аппарат кайра иштетүү үчүн 150 мм Петри табак капкагын жайгаштырылган.The binder жабуу үчүн колдонулат. гибриддик микросхемалардын жардамы менен морфогенез. Трансвелл кыстармалары өз алдынча маданиятка даярдалган ичеги эпителий клеткаларынын 2D моно катмарлары ичеги 3D морфогенезин индукциялоо үчүн гибриддик чипке киргизилген. Орточо Transwell insert.Elsevier.
Бул протоколдо, Caco-2 клетка линиясы жана ичеги органоиддери эпителий булактары катары колдонулган (сүрөт. 3a). Клеткалардын эки түрү тең өз алдынча өстүрүлгөн (2-куту жана 5-куту) жана чиптеги ичеги же Transwell inserts.Cells confluent болгондо ECM-капталган микроканалдарды себүү үчүн колдонулган (Ca95% клеткалары менен капталган), 10 жана 50-бөлүмдөр) Т-фляшкалар трипсинация суюктугу менен диссоциацияланган клетка суспензияларын даярдоо үчүн жыйналат (2-куту). Ичеги биопсияларынан же хирургиялык резекциялардан алынган адамдын ичеги органоиддери Матригелдин склад күмбөздөрүндө 24 көзөнөктүү плиталарда өстүрүлгөн. спондин, жана Ноггин) жана өсүү факторлору 3 кутучада сүрөттөлгөндөй даярдалган органоиддер диаметри ~500 мкмге чейин өскүчө күн сайын толукталып турду. Толугу менен өстүрүлгөн органоиддер жыйналып, ичегиге себүү үчүн бир клеткаларга бөлүнөт же чиптеги Transwell кыстармалар (5-куту). n оорусу, колоректалдык рагы же кадимки донор), жабыркаган жер (мисалы, жабыркабаган аймакка каршы жара) жана тракттагы ашказан-ичегинин жайгашкан жери (мисалы, он эки эли ичеги, жеюнум, ичеги, сокур ичеги, жоон ичеги же көтөн чучуктун). с.
а, ичеги чипте ичеги morphogenesis индукция үчүн Workflow.Caco-2 адамдын ичеги эпителий жана ичеги органоиддери 3D morphogenesis.The изоляцияланган эпителий клеткалары даярдалган ичеги-на-а-чиптенсе аппаратка себилген болчу көрсөтүү үчүн бул протоколдо колдонулат (клеткаларга тиркелет жана чиптаталган) P. күнү MS тешиктүү кабыкчасы 0 (D0), апикалдык (AP) агымы башталган жана биринчи 2 күн (агымы, AP, D0-D2) үчүн сакталып турат. Basolateral (BL) агымы да циклдик сунуу кыймылдар менен бирге башталат (созулуп, агымы, AP жана BL) толук 2D monolayer кийин пайда болгондо sppopred monolayer spp. идидик маданият (морфогенез, D5). Фазалык контраст сүрөттөрү ар бир эксперименттик кадамда же убакыт чекитинде Caco-2 клеткаларынын репрезентативдик морфологиясын көрсөтөт (тилкелүү график, 100 мкм). Ичеги морфогенезинин тиешелүү каскаддарын сүрөттөөчү төрт схемалык диаграмма (жогорку оң жакта). Сызык жебелер S суюктуктун агымынын үстүнкү багытын көрсөтөт. -2 эпителий (солдо). Чоңойтулган аймакты (ак сызыкчалуу кутуча) бөлүп көрсөтүүчү бөлүктө 3D Caco-2 катмарында (оңдо) калыбына келтирилген микровиллдер көрсөтүлгөн (оңдо).c, белгиленген Caco-2 3D горизонталдык маңдайынан көрүнүшү, клаудин (ZO-1, кызыл) жана F-актин (жашыл) клеткалардын визуалдык конустары менен тынымсыз чек ара мембраналары) ичеги чиптеринде. Ортоңку схеманы көрсөткөн жебелер ар бир конфокалдык көрүнүш үчүн фокалдык тегиздиктин жайгашкан жерин көрсөтөт.d, 3, 7, 9, 11 жана 13-күндөрдөгү фазалык контрасттык микроскопия аркылуу алынган чипте өстүрүлгөн органоиддердин морфологиялык өзгөрүүлөрүнүн убакыт жүрүшү. 7.f күнү алынган кесимдеги ичеги, сөңгөк клеткалары үчүн маркерлерди көрсөтүүчү иммунофлуоресценттик сүрөттөр (LGR5;кызыл), бокал клеткалары (MUC2; жашыл), F-актин (боз) жана өзөктөр (көк) 3 күн бою ичеги чиптеринде өстүрүлгөн, тиешелүүлүгүнө жараша (Солдо) жана 13 күндүк (ортодо) органоиддер эпителий катмарында. Ошондой эле, LGR5 сигналын баса белгилеген Кеңейтилген 3-сүрөттү караңыз. 3D органоиддик эпителий плазма мембранасын маданияттын 13-күнүндө CellMask боёгу менен боёп (оңдо) чипте ичегиде орнотулган. Башкасы көрсөтүлбөсө, шкала тилкеси 50 мкм түзөт.b Маалыматтын уруксаты менен кайра басылган.2.Оксфорд университетинин басмасы;c Шилтеменин уруксаты менен ылайыкталган.2.Оксфорд университетинин басмасы;e жана f шилтеме аркылуу уруксаты менен ылайыкташтырылган.12 Creative Commons License CC BY 4.0 астында.
Чиптеги ичегиде, ийгиликтүү ECM каптоо үчүн PDMS тешиктүү мембранасынын гидрофобдук бетин өзгөртүү керек. Бул протоколдо биз PDMS мембраналарынын гидрофобдугун өзгөртүү үчүн эки башка ыкманы колдонобуз. Caco-2 клеткаларын өстүрүү үчүн, UV/озон менен дарылоо аркылуу беттик активдештирүү жалгыз эле PCMMSD мембранасынын гидрофобдугун жана PCM2 клеткаларынын гидрофобдугун азайтуу үчүн жетиштүү болгон. .Бирок, органоиддик эпителийдин microfluidic маданияты PDMS microchannels.After ырааттуу polyethyleneimine (PEI) жана glutaraldehyde колдонуу менен ECM белоктор натыйжалуу депозитке жетүү үчүн химиялык негизделген жер үстүндөгү functionalization талап кылат. Беттик өзгөртүүлөр кийин, ECM белоктор иштеп жаткан PDMS бетине жабуу үчүн депонирленген, андан кийин microfluidic epithelie киргизүү болуп саналат. суюк клетка маданияты клеткалар толук монокатмарды түзмөйүнчө, үстүнкү микроканалга чөйрөнү гана перфузиялоо менен башталат, ал эми төмөнкү микроканал статикалык шарттарды сактайт. Беттин активдештирүү жана ECM каптоо үчүн оптималдаштырылган ыкма органоиддик эпителийди PDMS бетинде 3D morphogenesis түрткү берет.
Transwell маданияттар да клетка себүү алдында ECM каптоо талап кылынат;бирок, Transwell культуралары тешиктүү койгучтардын бетин активдештирүү үчүн татаал алдын ала тазалоо кадамдарын талап кылбайт. Transwell койгучтарындагы Caco-2 клеткаларын өстүрүү үчүн, тешиктүү кыстармалардагы ECM каптоо диссоциацияланган Како-2 клеткаларынын тиркөөнү (<1 саат) жана бекем туташуу тосмосунун пайда болушун (<1-2 күн) тездетет. кабыкчанын бетине (<3 ч) ed жана органоиддер тосмо бүтүндүгү менен толук монокатмар пайда чейин сакталат .Transwell культуралар гибрид микросхемаларын колдонбостон 24-кудуктуу пластиналарда жүргүзүлөт.
In vitro 3D морфогенези суюктуктун агымын белгиленген эпителий катмарынын базотерапалдык жагына колдонуу менен башталышы мүмкүн. Чиптеги ичегиде эпителий морфогенези чөйрө жогорку жана төмөнкү микроканалдарга перфузияланганда башталган (сүрөт. 3a). Мурда сүрөттөлгөндөй, суюктуктун агымын тынымсыз киргизүү үчүн маанилүү болуп саналат. морфоген ингибиторлору.Тешиктүү мембраналар менен байланышкан клеткаларды жетиштүү азыктандыруучу заттар менен сыворотка менен камсыз кылуу жана люминдик жылма стрессти жаратуу үчүн, биз адатта ичегидеги кош агымды чипте колдонобуз. Гибриддик чиптерде эпителий моно катмарларын камтыган Transwell кошумчалары гибриддик чиптерге киргизилди.Андан кийин, transwell inserts гибриддик чиптерге киргизилди. эки маданият платформасында базотерапалдык агым башталгандан 3-5 күн өткөндөн кийин пайда болгон.
Микроинженердик 3D эпителий катмарларынын морфологиялык өзгөчөлүктөрүн, анын ичинде фазалык контрасттык микроскопия, дифференциалдык интерференциялык контраст (DIC) микроскопия, SEM же иммунофлуоресценттик конфокалдык микроскопия (3 жана 4-сүрөттөр) сыяктуу сүрөттөөнүн ар кандай ыкмаларын колдонуу менен талданса болот. телиалдык катмарлар. PDMS жана полиэстер пленкаларынын оптикалык ачыктыгынан улам, чиптеги ичеги жана гибриддик чип платформалары түзмөктү бөлүүнүн же демонтаждоону талап кылбастан, реалдуу убакыт режиминде жеринде сүрөт тартууну камсыздай алат. Иммунофлуоресценттик сүрөттү ишке ашырууда (1, 3cб-сүрөттөр жана типтүү клеткалар менен фиксацияланган), f/volt% ), альдегид (PFA), андан кийин Triton X-100 жана 2% (салмак/көлөм) ) бодо малдын сывороткасы альбумини (BSA) иретинде. Клетканын түрүнө жараша ар кандай фиксаторлор, өткөргүчтөр жана бөгөттөөчү агенттер колдонулушу мүмкүн. Негизги антителолордун тукумуна көз каранды клетканы же аймакты бутага алган биринчи антителолорду экинчи микросхемадагы антителолор менен бирге экинчи антимобилдүү микросхемалар менен бирге колдонушат. ядрону (мисалы, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индолду, DAPI) же F-актинди (мисалы, флуоресцент менен белгиленген фаллоидинди) көздөгөн боёк боёгу.1, “Клетканын дифференциациясы” жана “Ичеги физиологиясы”), микроб клеткаларынын кокус колонизациясы (1-сүрөт, “Хост-микробдун биргелешип маданияты”), иммундук клеткалардын тартылышы (1-сүрөт, “Ооруну моделдөө”) же 3D эпителий морфологиясынын контурлары (Fig. 2-сүрөттө көрсөтүлгөн ref.As сүрөттөлгөндөй, төмөнкү микроканал катмарынан үстүнкү катмарды бөлүү үчүн, 3D эпителий морфологиясы, ошондой эле апикалдык щетка чек арасындагы микровилл SEM (сүрөт. 3b) аркылуу көргөзүлүшү мүмкүн. Дифференциациялоо маркерлеринин экспрессиясын сандык PCR5 аткаруу менен баалоого болот же бул клетканын эпителиалдык катмарын өстүрүү бир клеткалуу. с же гибриддик чиптер трипсинация жолу менен жыйналып, андан кийин молекулярдык же генетикалык анализ үчүн колдонулат.
а, Гибриддик чипте ичеги морфогенезин индукциялоо үчүн Workflow.Caco-2 жана ичеги органоиддери бул протоколдо гибриддик чип платформасында 3D морфогенезди көрсөтүү үчүн колдонулат. Диссоциацияланган эпителий клеткалары даярдалган Transwell койгучтарына себилген (TW Transwell кыстарылган жана полиэстердик клеткалар ылдыйда каралат). жакшы кыстармалар, бардык клеткалар статикалык шарттарда өстүрүлгөн (TW маданияты). 7 күндөн кийин, эпителий клеткаларынын 2D моно катмарын камтыган бир Transwell кыстаруусу гибриддик чипке бириктирилген, базотерапалдык агымды (Flow, BL), акырында 3D эпителиалдык катмардын муунга алып келген (Flow, BL), бул адамдын эпителийинин 3D эпителиалдык катмарынын (morphase epithelial microphase morphases microphase көрсөтүүсү). кадимки донордон (C103 сызыгы) ар бир эксперименттик кадамда же убакыттын чекитинде көтөрүлгөн жоон ичегиден алынган lial клеткалары. Жогорку катмарлардагы схемалар ар бир кадам үчүн эксперименталдык конфигурацияны көрсөтөт.b, Гибриддик чиптер (сол схема) органоиддик эпителий клеткаларынын 3D морфогенезине алып келиши мүмкүн (жогоркудан ылдыйга карай, микроскопиялык ар кандай көз караштар, Z ортоңку көрүнүшү менен төмөнкү конфосу алынган;оң схемалык жана тиешелүү чекиттүү сызыктарды караңыз).ачык морфологиялык мүнөздөмөлөрдү көрсөттү. F-актин (көгүл), ядро ​​(боз).c, Fluorescence confocal micrographs (3D бурчтуу көрүнүшү) органоиддик-туунду эпителий клеткаларынын статикалык Transwell (TW; ак сызык кутусунун ичинде салынган) менен гибриддик чипке (эң чоң толук тартылуу) 2D салыштыруу. вертикалдуу кесилген көрүнүштөр (жогорку оң бурчка киргизилген; "XZ") ошондой эле 2D жана 3D өзгөчөлүктөрүн көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 100 мкм.c Шилтеменин уруксаты менен кайра басылган.4.Elsevier.
Башкаруу элементтери бир эле клеткаларды (Како-2 же ичеги органоиддик эпителий клеткалары) кадимки статикалык маданият шарттарында эки өлчөмдүү моно катмарларга өстүрүү жолу менен даярдалышы мүмкүн. Белгилей кетчү нерсе, микроканалдардын көлөмүнүн чектелгендигинен улам аш болумдуу заттын азайышы (б.а. ~4 мкл баштапкы ичеги-чиптин үстүнкү каналында жана эпителиалдык агымдын баштапкы дизайнында, ошондой эле эпителийдин эпителиалдык агымы үчүн болушу мүмкүн). салыштырылган.
Жумшак литография процесси таза бөлмөдө жүргүзүлүшү керек. Чиптеги ар бир катмар (жогорку жана төмөнкү катмарлар жана мембраналар) жана гибрид чиптер үчүн ар кандай фотомаскалар колдонулган жана өзүнчө кремний пластинкаларында жасалган, анткени микроканалдардын бийиктиги ар кандай болгон. чип 200 микрон.
3 дюймдук кремний пластинасын ацетон кошулган идишке салыңыз. Пластинканы 30 секунда акырын айлантып, андан соң аба менен кургатып коюңуз. Вафлиди IPA бар тарелкага өткөрүп, андан кийин тазалоо үчүн табакчаны 30 секунд айлантыңыз.
Пиранха эритмеси (суутек перекиси менен концентрленген күкүрт кислотасынын аралашмасы, 1:3 (көлөм/көлөм)) кремний пластинкасынын бетинен органикалык калдыктарды максималдуу түрдө алып салуу үчүн колдонсо болот.
Пиранха эритмеси өтө дат жана жылуулукту жаратат. Кошумча коопсуздук чаралары керек. Таштандыларды утилдештирүү үчүн эритмени муздатып, таза, кургак таштанды контейнерине өткөрүп бериңиз. Экинчи контейнерлерди колдонуңуз жана таштанды контейнерлерин туура этикеткалаңыз. Көбүрөөк процедуралар үчүн мекеменин коопсуздук эрежелерин аткарыңыз.
Вафлилерди 200 °C ысык пластинкага 10 мин коюу менен суусуздандырыңыз. Кургатуудан кийин пластинаны муздатуу үчүн абада беш жолу чайкады.
Тазаланган кремний пластинкасынын ортосуна ~10 г фоторезист SU-8 2100 куюңуз. Фоторезистти пластинкага тегиз жайылтуу үчүн кычкачты колдонуңуз. Фоторезистти жабышчаак жана оңой жайылтуу үчүн вафельди кээде 65°C ысык плитага коюңуз. Вафлиди түздөн-түз ысык плитага койбоңуз.
SU-8 айланма каптоо аркылуу пластинкага бирдей бөлүштүрүлдү. SU-8дин кирүүчү айлануусун 5–10 секундага 100 айн/с ылдамдыкта 500 айн/мин таралышы үчүн программалаңыз. Негизги айланууну 200 мкм калыңдыкка коюңуз микросхемадагы ичегинин үстүнкү катмары үчүн м бийиктиги; ылдыйдагы “Критикалык кадамдарды” караңыз) 300 rpm/s 30 секундага 1200 айн/мин ылдамдыкта орнотулган.
Негизги айлануу ылдамдыгын кремний пластинкасындагы SU-8 үлгүсүнүн максаттуу калыңдыгына жараша жөнгө салууга болот.
Чиптеги ичегинин үстүңкү катмары үчүн 500 мкм бийиктиктеги SU-8 үлгүлөрүн жасоо үчүн, бул кутучанын айлануу каптоосу жана жумшак бышыруу кадамдары (7 жана 8-кадамдар) ырааттуу түрдө кайталанып (9-кадамды караңыз) 250 мкм эки катмардан жасалган. .
SU-8 капталган вафлилерди этияттык менен ысык табакка 65 °C температурада 5 мүнөт коюу менен жумшак бышырыңыз, андан кийин орнотууну 95 °Cге которуп, кошумча 40 мүнөт инкубациялаңыз.
Жогорку микроканалдагы SU-8 үлгүсүнүн 500 мкм бийиктигине жетүү үчүн 7 жана 8-кадамдарды кайталап, эки 250 мкм калың SU-8 катмарын жаратыңыз.
UV маскасын тегиздөөчү каражатты колдонуу менен, пластинанын экспозиция убактысын эсептөө үчүн өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык лампа сынагын жүргүзүңүз.(экспозиция убактысы, мс) = (экспозициялык доза, мДж/см2)/(лампа кубаттуулугу, мВт/см2).
Экспозиция убактысын аныктагандан кийин фотомасканы УК масканы түздөөчүнүн маска кармагычына коюп, фотомасканы СУ-8 капталган вафлиге коюңуз.
UV дисперсиясын азайтуу үчүн фотомасканын басылган бетин түздөн-түз кремний пластинкасынын SU-8 капталган тарабына коюңуз.
SU-8 капталган пластинаны жана фотомасканы вертикалдуу түрдө 260 мДж/см2 ультрафиолет нуруна чейин алдын ала белгиленген экспозиция убактысына чыгарыңыз (бул кутучанын 10-кадамын караңыз).
Ультрафиолет нурунун таасиринен кийин, SU-8 капталган кремний пластиналар 200 μm бийиктиктеги үлгүлөрдү даярдоо үчүн 65 °C температурада 5 мүнөт жана 95 °C температурада 15 мүнөттө бышырылган.
Иштеп чыгуучу айнек идишке куюлуп, бышырылган вафли идишке салынат. SU-8 иштеп чыгуучунун көлөмү айнек пластинанын өлчөмүнө жараша ар кандай болушу мүмкүн. Ачыкка чыкпаган SU-8ди толугу менен алып салуу үчүн жетиштүү SU-8 иштеп чыгуучусун колдонуңуз. мезгил-мезгили менен жумшак айлануу менен.
Иштелип чыккан көктү ~ 10 мл жаңы иштеп чыгуучу менен чайкаңыз, андан кийин пипетка аркылуу эритмени чачуу менен IPA.
Вафлиди плазма тазалагычка салып, 1,5 мүнөткө кычкылтек плазмасына (атмосфералык газ, максаттуу басым 1 × 10−5 Торр, кубаттуулугу 125 Вт) тийгизиңиз.
Вафлиди ичинде айнек слайды бар вакуум эксикаторуна коюңуз. Вафли менен слайддарды жанаша жайгаштырууга болот. Вакуум эксикатору бир табак менен бир нече катмарга бөлүнсө, слайддарды төмөнкү камерага, ал эми пластиналарды үстүнкү камерага коюңуз. 100 мкЛ trichlorooc, H1luper, H1H2ty, Drop ташыңыз. айнек слайдга e эритмеси жана силанизация үчүн вакуум колдонулат.
Тоңдурулган Caco-2 клеткаларынын флаконун 37°C суу мончосунда эритип, андан кийин эриген клеткаларды 15 мл 37°C алдын ала жылытылган Caco-2 чөйрөсүн камтыган T75 колбага өткөрүңүз.
~90% кошулганда Caco-2 клеткаларын өткөрүү үчүн, адегенде жылуу Како-2 чөйрөсү, PBS жана 0,25% трипсин/1 мМ EDTA 37°C суу мончосунда.
Vacuum aspiration.Wash клеткаларды 5 мл жылуу PBS менен эки жолу менен орто соруп вакуум аспирациясын кайталап жана жаңы PBS кошуу.