Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Бир эле учурда үч слайддан турган каруселди көрсөтөт.Бир убакта үч слайд аркылуу өтүү үчүн Мурунку жана Кийинки баскычтарын колдонуңуз, же бир эле учурда үч слайд аркылуу өтүү үчүн аягындагы сыдырма баскычтарын колдонуңуз.
Кан-мээ тосмолору жана кан-мээ тосмолору биотерапевттик каражаттардын борбордук нерв системасындагы максаттарына жетүүсүнө жол бербейт, ошону менен неврологиялык ооруларды натыйжалуу дарылоого тоскоол болот.Мээнин жаңы транспортерлерин in vivo табуу үчүн биз T7 фагдык пептиддик китепкананы жана келемиштердин кануляцияланган аң-сезимдүү чоң бассейн моделин колдонуу менен сериялык түрдө чогултулган кан жана жүлүн суюктугун (CSF) киргиздик.Белгилүү фаг клондору тандоонун төрт раундунан кийин CSFде өтө байытылган.Жеке талапкер пептиддерин тестирлөө CSFтин 1000 эседен ашык байышын аныктады.Мээге пептиддик жеткирүүнүн биоактивдүүлүгү аныкталган жаңы транзиттик пептидге байланышкан BACE1 пептиддик ингибиторунун жардамы менен жүлүн суюктугундагы амилоид-β деңгээлинин 40% га төмөндөшү менен тастыкталды.Бул натыйжалар in vivo фаг тандоо ыкмалары менен аныкталган пептиддер терапиялык эффекти менен мээге макромолекулаларды системалуу жеткирүү үчүн пайдалуу каражаттар болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Борбордук нерв системасынын (ЦНС) максаттуу терапиясы боюнча изилдөөлөр негизинен оптималдаштырылган дары-дармектерди жана CNS максаттуу касиеттерин көрсөткөн агенттерди аныктоого багытталган, ал эми мээге дарыларды активдүү жеткирүү механизмдерин табууга азыраак күч жумшалган.Бул азыр өзгөрө баштады, анткени дары жеткирүү, өзгөчө чоң молекулалар, заманбап неврологиянын дары-дармектерин өнүктүрүүнүн ажырагыс бөлүгү.Борбордук нерв системасынын чөйрөсү кан-мээ тосмосу (BBB) ​​жана кан-мээ барьеринен (BCBB) 1 турган цереброваскулярдык тоскоолдук системасы менен жакшы корголгон, бул мээге дары-дармектерди жеткирүүнү кыйындатат1,2.Дээрлик бардык ири молекулалуу дары-дармектер жана 98% дан ашыгы кичинекей молекулалуу дарылар мээден жок кылынат3.Ошондуктан CNS 4,5 терапиялык дары-дармектерди натыйжалуу жана конкреттүү жеткирүү камсыз жаңы мээ транспорт системасын аныктоо абдан маанилүү болуп саналат.Бирок, BBB жана BCSFB ошондой эле дары жеткирүү үчүн сонун мүмкүнчүлүк берет, анткени алар мээнин бардык структураларына анын кеңири тамыры аркылуу кирет.Ошентип, мээге жеткирүүнүн инвазивдик эмес ыкмаларын колдонуу боюнча учурдагы аракеттер көбүнчө эндогендик BBB6 кабылдагычын колдонуу менен рецептордук транспорттун (PMT) механизмине негизделген.Трансферрин рецептордук жол7,8 колдонуу менен акыркы негизги жетишкендиктерге карабастан, жакшыртылган касиеттери менен жаңы жеткирүү системаларын андан ары өнүктүрүү талап кылынат.Бул максатта, биздин максатыбыз CSF транспорттук ортомчу жөндөмдүү пептиддерди аныктоо болгон, алар негизинен CNS макромолекулаларды жеткирүү же жаңы кабылдагыч жолдорун ачуу үчүн колдонулушу мүмкүн.Атап айтканда, цереброваскулярдык системанын спецификалык рецепторлору жана транспортерлери (BBB жана BSCFB) биотерапевтик препараттарды активдүү жана спецификалык жеткирүү үчүн потенциалдуу максаттар катары кызмат кыла алышат.Цереброспиналдык суюктук (ЖСФ) хороиддик өрүктүн (ЖС) секретордук продуктусу болуп саналат жана субарахноиддик мейкиндик жана карынча мейкиндиги аркылуу мээнин интерстициалдык суюктугу менен түз байланышта болот4.Жакында эле субарахноиддик мээ жүлүн суюктугу мээнин интерстицийине ашыкча тарай тургандыгы далилденген9.Биз паренхимдик мейкиндикке бул субарахноиддик агын трактынын жардамы менен же түздөн-түз BBB аркылуу киребиз деп үмүттөнөбүз.Буга жетүү үчүн биз бул эки башка жолдун бири менен ташылган пептиддерди идеалдуу түрдө аныктаган in vivo фагдарды тандоонун күчтүү стратегиясын ишке ашырдык.
Биз азыр китепкананын эң көп түрдүүлүгү менен баштапкы тандоо раунддарына мониторинг жүргүзүү үчүн CSF үлгүсүн алуу жана жогорку өткөрүү ырааттуулугу (HTS) менен ырааттуу in vivo фаг дисплейинин скрининг ыкмасын сүрөттөп беребиз.Скрининг кандын булганышын болтурбоо үчүн туруктуу имплантацияланган чоң цистерна (CM) каннуласы бар аң-сезимдүү келемиштерге жүргүзүлдү.Маанилүү нерсе, бул ыкма мээ-максаттуу жана цереброваскулярдык тоскоолдук аркылуу транспорттук иш менен пептиддерди да тандайт.Биз T7 фагдарын кичинекей болгондуктан (~ 60 нм) 10 колдондук жана алар эндотелийдик жана/же эпителий-медулла тосмосунун трансклеткалык өтүшүнө мүмкүндүк берген везикулаларды ташуу үчүн ылайыктуу деп эсептедик.Төрт раунддан кийин фаг популяциялары изоляцияланды, алар in vivo CSF ​​байытууну жана мээнин микротамырларынын ассоциациясын көрсөтүштү.Баарынан маанилүүсү, биз артыкчылыктуу жана химиялык синтезделген мыкты талапкер пептиддер мээ жүлүн суюктугуна белок жүк ташууга жөндөмдүү экенин көрсөтүү менен биздин ачылыштарды ырастай алдык.Биринчиден, CNS фармакодинамикалык таасирлери BACE1 пептидинин бир ингибитору менен жетектөөчү транзиттик пептидди айкалыштыруу аркылуу түзүлгөн.In vivo функционалдык скрининг стратегиялары мээнин жаңы транспорттук пептиддерин эффективдүү белок жүк ташуучулар катары аныктай аларын көрсөтүүдөн тышкары, биз ушул сыяктуу функциялык тандоо ыкмалары мээнин жаңы транспорттук жолдорун аныктоодо да маанилүү болот деп күтөбүз.
Фагды таңгактоо кадамынан кийин бляшка түзүүчү бирдиктердин (PFU) негизинде, ар түрдүүлүгү болжол менен 109 болгон кокус 12-мер сызыктуу T7 фаг пептиддеринин китепканасы иштелип чыккан жана түзүлгөн (Материалдар жана методдорду караңыз).Биз бул китепкананы in vivo панорамалоодон мурун кылдат талдап чыкканыбызды белгилей кетүү маанилүү.Модификацияланган праймерлердин жардамы менен фаг китепканасынын үлгүлөрүн ПТР күчөтүү HTS үчүн түздөн-түз колдонулуучу ампликондорду түздү (Кошумча 1а сүрөт).а) HTS11 секвенирлөө каталарынан, б) праймерлердин сапатына (NNK) 1-12 жана в) күтүү режиминдеги китепканада жапайы типтеги (wt) фагдын (скелет кошумчалары) болушунан улам, текшерилген ырааттуулук маалыматын алуу үчүн ырааттуулукту чыпкалоо процедурасы ишке ашырылган (Кошумча 1б-сүрөт).Бул чыпкалоо кадамдары бардык HTS секвенирлөө китепканаларына тиешелүү.Стандарттык китепкана үчүн жалпысынан 233 868 окуу алынды, алардын 39% чыпкалоо критерийлеринен өттү жана китепкананы талдоо жана кийинки турлар үчүн тандоо үчүн пайдаланылды (Кошумча 1c-e сүрөт).Окуулар негизинен 36 нуклеотидде чокусу менен узундуктагы 3 базалык жупка эселенген (Кошумча 1c сүрөт), китепкананын дизайнын (NNK) 1-12 тастыктайт.Белгилей кетсек, китепкана мүчөлөрүнүн болжол менен 11% 12 өлчөмдүү жапайы типтеги (wt) магистралдык PAGISRELVDKL киргизүүнү камтыган, ал эми тизмектердин дээрлик жарымында (49%) киргизүү же жок кылуу камтылган.Китепкана китепканасынын HTS китепканадагы пептиддердин көп түрдүүлүгүн тастыктады: пептиддердин 81% дан ашыгы бир жолу гана табылган жана 1,5% гана ≥4 нускада болгон (Кошумча сүрөт 2a).Репертуардагы бардык 12 позициядагы аминокислоталардын (аа) жыштыктары бузулган NKK репертуарында пайда болгон кодондордун саны үчүн күтүлгөн жыштыктарга жакшы дал келген (Кошумча 2б-сүрөт).Бул кошумчалар менен коддолгон ааа калдыктарынын байкалган жыштыгы эсептелген жыштык менен (r = 0,893) жакшы корреляцияланган (Кошумча 2c сүрөт).Фаг китепканаларын инъекцияга даярдоо эндотоксинди күчөтүү жана чыгаруу кадамдарын камтыйт.Бул мурда фаг китепканаларынын ар түрдүүлүгүн азайтышы мүмкүн болгон12,13 көрсөтүлгөн.Ошондуктан, биз эндотоксинди алып салуудан өткөн пластина менен күчөтүлгөн фаг китепканасын тизип, АА жыштыгын баалоо үчүн аны баштапкы китепкана менен салыштырдык.Түпнуска бассейн менен күчөтүлгөн жана тазаланган бассейндин ортосунда күчтүү корреляция (r = 0,995) байкалды (Кошумча 2d сүрөт), бул T7 фагынын жардамы менен пластиналарда күчөтүлгөн клондордун ортосундагы атаандаштык чоң тенденцияны пайда кылбаганын көрсөтүп турат.Бул салыштыруу ар бир китепканадагы трипептиддик мотивдердин жыштыгына негизделген, анткени китепканалардын ар түрдүүлүгүн (~109) HTS менен да толук түшүрүү мүмкүн эмес.Ар бир позицияда aa жыштыгын талдоо, киргизилген репертуардын акыркы үч позициясында позицияга көз каранды кичинекей бир позицияны аныктады (Кошумча сүрөт 2e).Жыйынтыктап айтканда, биз китепкананын сапаты жана көп түрдүүлүгү алгылыктуу жана тандоонун бир нече раунддарынын ортосунда фаг китепканаларын күчөтүү жана даярдоодон улам ар түрдүүлүктүн бир аз гана өзгөрүүлөрү байкалган деген тыянакка келдик.
Цереброспиналдык суюктуктун үлгүсүн сериялык түрдө алуу BBB жана/же BCSFB (сүрөт 1a-b) аркылуу венага (iv) сайылган T7 фагынын идентификациясын жеңилдетүү үчүн аң-сезими бар келемиштердин CMсине кануланы хирургиялык жол менен имплантациялоо аркылуу жүргүзүлүшү мүмкүн.Биз in vivo тандоонун биринчи үч турунда эки көз карандысыз тандоо куралын (A жана B куралын) колдондук (сүрөт 1c).Биз тандоонун биринчи үч турунда киргизилген фагдын жалпы санын азайтуу менен тандоонун катаалдыгын акырындык менен жогорулаттык.Панировкалоонун төртүнчү раундунда биз А жана В бутактарынан үлгүлөрдү бириктирип, кошумча үч көз карандысыз тандоону жүргүздүк.Бул моделдеги T7 фаг бөлүкчөлөрүнүн in vivo касиеттерин изилдөө үчүн келемиштерге куйрук венасы аркылуу жапайы типтеги фаг (PAGISRELVDKL мастер кыстарма) сайылган.Ар кандай убакыт чектеринде мээ жүлүн суюктугунан жана кандан фагдарды калыбына келтирүү салыштырмалуу кичинекей T7 икосаэдрдик фагдардын кан бөлүмүнөн тез баштапкы тазалоо фазасына ээ экендигин көрсөттү (Кошумча 3-сүрөт).Киргизилген титрлерге жана келемиштердин кан көлөмүнө таянып, биз салмагынын болжол менен 1% гана экенин эсептедик.Венага инъекциядан 10 мүнөт өткөндөн кийин канда берилген дозадан фаг табылган.Бул алгачкы тез төмөндөөдөн кийин, жайыраак баштапкы клиренс 27,7 мүнөт жарым ажыроо мезгили менен ченелген.Маанилүүсү, CSF бөлүмүнөн өтө аз гана фагтар алынган, бул жапайы типтеги фагдардын CSF бөлүмүнө миграциясынын төмөн фонун көрсөтүп турат (Кошумча 3-сүрөт).Орточо алганда, кандагы T7 фагынын болжол менен 1 х 10-3% титрлери жана алгач инфузияланган фагтардын 4 х 10-8% сынагынын бүткүл мезгилинин ичинде (0-250 мин) мээ жүлүн суюктугунда аныкталган.Белгилеп кетсек, мээ жүлүн суюктугундагы жапайы фагдын жарым ажыроо мезгили (25,7 мин) канда байкалганга окшош болгон.Бул маалыматтар CSF бөлүмүн кандан бөлүп турган тосмо CM-каннуляцияланган келемиштерде бузулбаганын көрсөтүп турат, бул фаг китепканаларын in vivo тандоого, кандан CSF бөлүмүнө оңой жеткирилген клондорду аныктоого мүмкүндүк берет.
(а) Чоң көлмөдөн жүлүн суюктугун (ЖСФ) кайра алуу ыкмасын түзүү.(б) борбордук нерв системасынын (CNS) тосмосунун клеткалык ордун жана кан-мээ тосмосун (BBB) ​​жана кан-мээ тосмосун кесип өткөн пептиддерди аныктоо үчүн колдонулган тандоо стратегиясын көрсөткөн диаграмма.(c) In vivo фагдын дисплей скринингинин схемасы.Тандоонун ар бир айлампасында фагдар (жебелердин ичиндеги жаныбарлардын идентификаторлору) венага сайылган.Эки көз карандысыз альтернативдик бутак (A, B) тандоонун 4-туруна чейин өзүнчө сакталат.3 жана 4 тандоо раунддары үчүн CSFден алынган ар бир фаг клону кол менен тизилди.(г) T7 пептиддик китепканасын (2 х 1012 фаг/жаныбар) венага инъекциядан кийин каннуляцияланган эки келемиште тандоонун биринчи раундунда кандан (кызыл тегерекчелер) жана жүлүн суюктугунан (жашыл үч бурчтуктар) бөлүнүп алынган фагдын кинетикасы.Көк квадраттар кандын жалпы көлөмүн эске алуу менен инъекцияланган фагдын өлчөмүнөн эсептелген кандагы фагдын орточо баштапкы концентрациясын көрсөтөт.Кара квадраттар кан фагынын концентрациясынан экстраполяцияланган y сызыгынын кесилишкен жерин көрсөтөт.(e,f) Пептидде табылган бардык мүмкүн болгон кайталанган трипептиддик мотивдердин салыштырмалуу жыштыгын жана бөлүштүрүүнү көрсөтүңүз.1000 окууда табылган мотивдердин саны көрсөтүлгөн.Маанилүү (р <0,001) байытылган мотивдер кызыл чекиттер менен белгиленген.(e) №1.1 жана №1.2 жаныбарлардан алынган кандан алынган фаг менен инъекцияланган китепкананын трипептиддик мотивинин салыштырмалуу жыштыгын салыштырган корреляциялык чачыранды.(f) Канда жана жүлүн суюктугунда бөлүнүп алынган жаныбарлардын фагынын трипептидинин №1.1 жана №1.2 мотивдеринин салыштырмалуу жыштыктарын салыштырган корреляциялык чачыратуу диаграммасы.(g, h) Канга байытылган фагдын (g) инъекцияланган китепканаларга жана CSF (h) менен байытылган фагдын эки жаныбарда тең in vivo тандоонун раундунан кийин канга каршы ырааттуулук ID өкүлчүлүгү.Бир тамгадан турган коддун көлөмү ошол аминокислота ошол абалда канчалык көп пайда болоорун көрсөтөт.Жашыл = полярдуу, кызгылт көк = нейтралдуу, көк = негизги, кызыл = кислота жана кара = гидрофобдук аминокислоталар.Сүрөт 1а, б Эдуард Урич тарабынан иштелип чыккан жана чыгарылган.
Биз фаг пептиддик китепканасын эки CM аспап келемиштерине (А жана В класстары) жана мээ жүлүн суюктугунан жана кандан бөлүнгөн фагга сайдык (Figure 1d).Китепкананын алгачкы тез тазаланышы жапайы типтеги фагга салыштырмалуу азыраак болгон.Инъекцияланган китепкананын жарым ажыроо мезгили эки жаныбарда тең канда 24,8 мүнөт, жапайы фагга окшош жана CSFде 38,5 мүнөттү түзгөн.Ар бир жаныбардан алынган кан жана жүлүн суюктугунун фаг үлгүлөрү HTSке дуушар болгон жана бардык аныкталган пептиддер кыска трипептиддик мотивдин бар-жоктугу үчүн анализденген.Трипептиддик мотивдер тандалып алынган, анткени алар түзүмүн түзүү жана пептид-белок өз ара аракеттенүүсү үчүн минималдуу негиз болуп берет14,15.Биз инъекцияланган фаг китепканасы менен эки жаныбардын канынан алынган клондордун ортосундагы мотивдерди бөлүштүрүүдө жакшы корреляцияны таптык (сүрөт 1e).Маалыматтар китепкананын курамы кан бөлүмүндө аз гана байыганын көрсөтүп турат.Амино-кислота жыштыктары жана консенсус тизмеги Weblogo16 программасынын адаптациясын колдонуу менен ар бир позицияда андан ары талданган.Кызыктуусу, биз кан glycine калдыктары күчтүү байытуу табылган (сүрөт. 1g).Канды CSFден тандалып алынган клондор менен салыштырганда, күчтүү тандоо жана мотивдердин айрым тандоосу байкалган (1f-сүрөт), ал эми кээ бир аминокислоталар 12 мүчөдө алдын ала аныкталган позицияларда артыкчылыктуу болгон (сүрөт 1h).Белгилеп кетсек, айрым жаныбарлар мээ жүлүн суюктугунда олуттуу айырмаланган, ал эми кандын глицин менен байышы эки жаныбарда байкалган (Кошумча 4a–j сүрөт).№1.1 жана №1.2 жаныбарлардын мээ-жүлүн суюктугундагы ырааттуулук маалыматтарын катуу чыпкалоодон кийин жалпысынан 964 жана 420 уникалдуу 12-мер пептиддери алынган (Кошумча 1d-e сүрөт).Бөлүнгөн фаг клондору күчөтүлгөн жана in vivo тандоонун экинчи туруна дуушар болгон.Тандоонун экинчи турунан алынган фаг ар бир жаныбарда HTSке дуушар болгон жана бардык аныкталган пептиддер трипептиддик мотивдердин пайда болушун талдоо үчүн мотивди таануу программасына киргизүү катары колдонулган (сүрөт 2a, b, ef).CSFден калыбына келтирилген фагдын биринчи циклине салыштырганда, биз А жана В бутактарындагы CSFдагы көптөгөн мотивдердин андан ары тандалып алынышын жана тандалбаганын байкадык (2-сүрөт).Тармакты идентификациялоо алгоритми алар ырааттуу ырааттуулуктун ар кандай үлгүлөрүн көрсөткөнүн аныктоо үчүн колдонулган.CSF тарабынан калыбына келтирилген 12 өлчөмдүү ырааттуулуктун ортосунда ачык окшоштук A альтернативалуу класста (сүр. 2c, d) жана B кладында байкалды (сүрөт 2g, h).Ар бир бутактагы топтолгон анализ 12-мер пептиддер үчүн ар кандай тандоо профилдерин (Кошумча 5c,d) жана тандоонун биринчи айлампасына салыштырмалуу экинчи турдан кийин топтолгон клондор үчүн убакыттын өтүшү менен CSF/кан титринин көбөйүшүн көрсөттү (Кошумча 5e).).
in vivo функционалдык фаг дисплей тандоонун эки ырааттуу раунддары менен жүлүн суюктугундагы мотивдерди жана пептиддерди байытуу.
Ар бир жаныбардын биринчи раундунан алынган бардык мээ жүлүн суюктугунун фагдары (жаныбарлар #1.1 жана #1.2) бириктирилген, күчөтүлгөн, HT-ырааттуулугу жана кайра сайылган (2 х 1010 фаг/жаныбар) 2 SM cannulated келемиштер (#1.1 → #).2.1 жана 2.2, 1.2 → 2.3 жана 2.4).(a,b,e,f) Биринчи жана экинчи тандоо раунддарында бардык CSFден алынган фагдардын трипептиддик мотивдеринин салыштырмалуу жыштыгын салыштырган корреляциялык чачырандылар.Эки багытта тең пептиддерде табылган бардык мүмкүн болгон кайталанган трипептиддерди чагылдырган мотивдердин салыштырмалуу жыштыгы жана таралышы.1000 окууда табылган мотивдердин саны көрсөтүлгөн.Салыштырылган китепканалардын биринде олуттуу түрдө (p <0,001) тандалган же алынып салынган мотивдер кызыл чекиттер менен белгиленет.(c, d, g, h) in vivo тандоонун 2 жана 1 раунддарына негизделген бардык CSFге бай 12 аминокислота узун ырааттуулугунун логотипинин чагылдырылышы.Бир тамгадан турган коддун көлөмү ошол аминокислота ошол абалда канчалык көп пайда болоорун көрсөтөт.Логотипти көрсөтүү үчүн эки тандоо раундунун ортосундагы айрым жаныбарлардан алынган CSF ырааттуулугунун жыштыгы салыштырылат жана экинчи турда байытылган тизмектер көрсөтүлөт: (c) #1.1–#2.1 (г) #1.1–#2.2 (г) #1.2–#2.3 жана (h) #1.2–#2.4.(c, d) жаныбарларда берилген позицияда эң байытылган аминокислоталар №.2.1 жана жок.2.2 же (г, ч) жаныбарларда №.2.3 жана жок.2.4 түстө көрсөтүлгөн.Жашыл = полярдуу, кызгылт көк = нейтралдуу, көк = негизги, кызыл = кислота жана кара = гидрофобдук аминокислоталар.
Тандоонун үчүнчү раундунан кийин биз эки жаныбардан бөлүнүп алынган 332 CSF менен калыбына келтирилген фаг клондорунан 124 уникалдуу пептиддик ырааттуулукту (№3.1 жана №3.2) аныктадык (Кошумча 6a сүрөт).LGSVS ырааттуулугу (18,7%) эң жогорку салыштырмалуу пропорцияга ээ, андан кийин жапайы түрдөгү PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) жана SARGSWREIVSLS (2,2%).Акыркы төртүнчү турда биз үч башка жаныбардан өз алдынча тандалып алынган эки бутакты бириктирдик (сүрөт 1c).CSFден калыбына келтирилген 925 ырааттуу фаг клонунун ичинен төртүнчү раундда биз 64 уникалдуу пептиддик ырааттуулукту таптык (Кошумча 6b-сүрөт), алардын арасында жапайы фагдын салыштырмалуу үлүшү 0,8% га төмөндөдү.Төртүнчү раундда эң кеңири тараган CSF клондору LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) жана RLSSVDLSG (3,6%) болгон.%)).Тандалган пептиддердин узундугу диапазону нуклеотиддерди киргизүү/делециялоо же NNK китепканасынын дизайны үчүн бузулган кодондорду колдонууда китепкана праймерлериндеги мөөнөтүнөн мурда токтотуу кодондоруна байланыштуу.Эрте токтотуу кодондору кыскараак пептиддерди жаратат жана аларда жагымдуу аа мотиви камтылгандыктан тандалып алынат.Узунураак пептиддер синтетикалык китепканалардын праймерлерине киргизүү/жок кылуудан келип чыгышы мүмкүн.Бул долбоорлонгон аялдама кодонду кадрдын сыртына жайгаштырат жана ылдый жакта жаңы аялдама кодон пайда болгонго чейин окуйт.Жалпысынан алганда, биз бардык төрт тандоо турунун байытуучу факторлорун киргизген маалыматтарды тандоонун чыгаруу маалыматтары менен салыштырып эсептеп чыктык.Скринингдин биринчи раунду үчүн биз спецификалык эмес фондо шилтеме катары жапайы фаг титрлерин колдондук.Кызыктуусу, терс фаг тандоосу биринчи CSF циклинде абдан күчтүү болгон, бирок канда эмес (3а-сүрөт), бул пептиддик китепкананын көпчүлүк мүчөлөрүнүн CSF бөлүмүнө пассивдүү таралуу ыктымалдуулугунун төмөндүгүнө байланыштуу болушу мүмкүн же салыштырмалуу фагтар бактериопаларга караганда кан агымынан натыйжалуу кармалып же алынып салынат.Бирок, пандалоонун экинчи раундунда эки кладда тең CSFдагы фагдардын күчтүү тандоосу байкалды, бул мурунку раунд CSFтин кабыл алынышына көмөктөшүүчү пептиддерди көрсөткөн фагтарга байыгандыгын билдирет (сүрөт 3a).Дагы, олуттуу кан байытуу жок.Ошондой эле учунчу жана тертунчу раунддарда фагдардын клондору CSF менен бир кыйла байытылды.Тандоонун акыркы эки раундунун ортосундагы ар бир уникалдуу пептиддик ырааттуулуктун салыштырмалуу жыштыгын салыштырып, биз тандоонун төртүнчү айлампасында тизмектер дагы да байытылганын байкадык (сүрөт 3b).Бардыгы болуп 931 трипептиддик мотивдер эки пептиддик багытты колдонуу менен бардык 64 уникалдуу пептиддик ырааттуулуктан алынган.Төртүнчү раунддагы эң байытылган мотивдер инъекцияланган китепканага (кесип: 10% байытуу) салыштырмалуу бардык раунддар боюнча алардын байытуу профилдери боюнча кылдат изилденген (Кошумча 6c сүрөт).Тандоонун жалпы закон ченемдүүлүктөрү изилденген мотивдердин көбү эки тандоо тармагынын мурунку бардык турларында байыганын көрсөттү.Бирок, кээ бир мотивдер (мисалы, SGL, VSG, LGS GSV) басымдуу түрдө альтернативдүү А классынан болсо, башкалары (мисалы, FGW, RTN, WGF, NTR) альтернативалуу В классында байытылган.
CSF менен байытылган фаг менен көрсөтүлгөн пептиддердин жана стрептавидиндин пайдалуу жүктөрү менен конъюгацияланган биотинилденген лидер пептиддердин CSF ташуусунун валидациясы.
(а) Инъекцияланган (киргизүү = I) фагдын (PFU) титрлеринин жана аныкталган CSF фагынын титрлеринин (чыгыш = O) негизинде бардык төрт турда (R1-R4) эсептелген байытуу коэффициенттери.Акыркы үч раунд үчүн байытуу факторлору (R2-R4) мурунку раундга жана биринчи раундга (R1) салмактык маалыматтар менен салыштыруу жолу менен эсептелген.Ачык тилкелер жүлүн суюктугу, көлөкөлүү тилкелер плазма.(***p<0,001, Студенттин t-тестинин негизинде).(b) Тандоонун 4-турунан кийин CSFда чогултулган бардык фагтарга салыштырмалуу пропорциясына жараша орун алган эң көп фаг пептиддеринин тизмеси.Эң кеңири тараган алты фаг клондору түсү менен бөлүнгөн, номерленген жана аларды байытуу факторлору тандоонун 3 жана 4-турларынын ортосунда (киргизилген).(c,d) 4-раунддагы эң байытылган алты фаг клондору, бош фаг жана ата-энелик фаг пептиддик китепканалары CSF үлгүсүн алуу моделинде жекече талдоого алынган.CSF жана кан үлгүлөрү көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде чогултулган.(c) бирдей сандагы 6 талапкер фаг клондору (2 x 1010 фаг/жаныбар), бош фаг (№1779) (2 x 1010 фаг/жаныбар) жана запас фагынын пептиддик китепканасы (2 x 1012 фаг/жаныбар) Венадан кеминде 3-бөлүнгөн кан тамырга куюлат.Ар бир сайылган фаг клонунун жана фаг пептиддер китепканасынын CSF фармакокинетикасы убакыттын өтүшү менен көрсөтүлгөн.(г) үлгү алуу учурундагы бардык калыбына келтирилген фагтар/мл үчүн орточо CSF/кан катышын көрсөтөт.(e) Төрт синтетикалык лидер пептиддери жана бир шифрленген контроль биотин менен стрептавидин менен N-терминусу (тетрамер дисплейи) аркылуу туташтырылган, андан кийин инъекциядан кийин (куйрук тамыры iv, 10 мг стрептавидин/кг).Жок дегенде үч интубацияланган келемиштер (N = 3).).CSF үлгүлөрү көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде чогултулган жана стрептавидин концентрациялары CSF антистрептавидин ИФА аркылуу өлчөнгөн (nd = аныкталган эмес).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA тестинин негизинде).(f) №2002 эң байытылган фаг пептиддик клонунун (кызгылт көк) аминокислота ырааттуулугун тандоонун 4-турунан башка тандалган фаг пептиддик клондору менен салыштыруу.Окшош жана окшош аминокислота фрагменттери түстүү коддуу.
Төртүнчү раунддагы бардык байытылган фагдардын ичинен (сүрөт 3b), CSF үлгүсүн алуу моделинде андан ары жеке талдоо үчүн алты талапкер клон тандалып алынган.Алты талапкер фагдын, бош фагдын (киргизүү жок) жана профагдын пептиддик китепканаларынын бирдей өлчөмдөгү үч канулдашкан CM жаныбарларына сайылган жана фармакокинетикасы CSF (сүрөт 3c) жана кан (Кошумча сүрөт 7) анализдеринде аныкталган.Сыналган бардык фаг клондору бош башкаруу фагынан (№1779) 10-1000 эсе жогору деңгээлдеги CSF отсекине багытталган.Мисалы, №2020 жана №2077 клондорунун CSF титрлери контролдук фагга караганда 1000 эсе жогору болгон.Ар бир тандалган пептиддин фармакокинетикалык профили ар түрдүү, бирок алардын бардыгында жогорку CSF гоминг жөндөмү бар.Биз №1903 жана №2011 клондор үчүн убакыттын өтүшү менен үзгүлтүксүз төмөндөшүн байкадык, ал эми №2077, №2002 жана №2009 клондор үчүн биринчи 10 мүнөттүн ичинде көбөйүү активдүү транспортту көрсөтүшү мүмкүн, бирок аны текшерүү керек.№2020, №2002 жана №2077 клондору жогорку деңгээлде турукташкан, ал эми #2009 клонунун CSF концентрациясы баштапкы жогорулагандан кийин акырындык менен төмөндөгөн.Андан кийин биз ар бир CSF талапкеринин салыштырмалуу жыштыгын анын кандагы концентрациясы менен салыштырдык (сүрөт 3d).Ар бир CSF талапкеринин орточо титринин анын кан титринин бардык үлгүлөрдү алуу убагындагы корреляциясы алты талапкердин үчөө кандын CSF менен олуттуу байыганын көрсөттү.Кызыктуусу, №2077 клон кандын туруктуулугун көрсөткөн (Кошумча 7-сүрөт).Пептиддердин өздөрү фаг бөлүкчөлөрүнөн башка жүктөрдү жигердүү түрдө CSF бөлүкчөсүнө ташууга жөндөмдүү экендигин тастыктоо үчүн биз пептиддер фаг бөлүкчөсүнө кошулган N-терминуста биотин менен туундуланган төрт лидер пептидди синтездедик.Биотинилденген пептиддер (2002, 2009, 2020 жана 2077) фаг геометриясын бир аз туураган мультимерикалык формаларды алуу үчүн стрептавидин (SA) менен конъюгацияланган.Бул формат ошондой эле жүк ташуучу протеин пептиддери катары кандагы жана жүлүн суюктугунда SA экспозициясын өлчөөгө мүмкүндүк берди.Маанилүүсү, синтетикалык пептиддер бул SA-конъюгацияланган форматта (сүрөт 3e) башкарылганда фаг маалыматтары көп учурда кайталанышы мүмкүн.Шифрленген пептиддердин баштапкы таасири азыраак жана 48 сааттын ичинде аныкталбаган деңгээлдер менен CSF клиренси тезирээк болгон.Бул пептиддик фаг клондорун CSF мейкиндигине жеткирүү жолдору жөнүндө түшүнүк алуу үчүн, биз фаг бөлүкчөлөрүн in vivo инъекциясынан 1 сааттан кийин түздөн-түз аныктоо үчүн иммуногистохимиянын (IHC) жардамы менен жеке фагдык пептиддердин локализациясын талдадык.Белгилей кетсек, №2002, №2077 жана №2009 клондорун мээ капиллярларында күчтүү боёп табууга болот, ал эми контролдук фаг (№1779) жана №2020 клон табылган жок (Кошумча 8-сүрөт).Бул бул пептиддер BBB аркылуу так мээге таасирин тийгизет деп көрсөтүп турат.Бул гипотезаны текшерүү үчүн дагы деталдуу талдоо талап кылынат, анткени BSCFB маршруту да тартылышы мүмкүн.Эң байытылган клондун (#2002) аминокислота ырааттуулугун башка тандалган пептиддер менен салыштырганда, алардын кээ бирлеринин окшош аминокислота узартуулары бар экени белгиленген, бул окшош ташуу механизмин көрсөтүшү мүмкүн (сүрөт 3f).
Уникалдуу плазма профилинин жана убакыттын өтүшү менен CSFтин олуттуу өсүшүнөн улам, №2077 фаг дисплей клону дагы 48 сааттык убакыттын ичинде изилденип, туруктуу SA деңгээли менен байланышта байкалган CSFдин тез өсүшүн кайталай алган (сүрөт 4a).Башка аныкталган фаг клондоруна келсек, №2077 мээнин капиллярлары үчүн катуу боёлуп, жогорку резолюцияда караганда капиллярдык маркер лектин менен олуттуу коллокализацияны жана паренхималдык мейкиндикте кандайдыр бир боёкторду көрсөттү (4b-сүрөт).Пептиддик ортомчу фармакологиялык эффекттердин CNSде алынышы мүмкүн экендигин иликтөө үчүн биз эксперимент жүргүздүк, анда i) #2077 транзиттик пептидинин жана ii) BACE1 ингибиторунун пептидинин биотинилденген версиялары эки башка катышта SA менен аралаштырылды.Бир айкалышы үчүн биз BACE1 пептидинин ингибиторун гана колдондук, экинчиси үчүн BACE1 пептидинин ингибиторунун №2077 пептидине 1:3 катышын колдондук.Эки үлгү тең венага киргизилип, кандын жана жүлүн суюктугунун бета-амилоиддик пептид 40 (Abeta40) деңгээли убакыттын өтүшү менен ченелген.Abeta40 CSF менен өлчөнгөн, анткени ал мээ паренхимасында BACE1 бөгөт коюуну чагылдырат.Күтүлгөндөй, эки комплекс тең Abeta40тун кан деңгээлин бир кыйла азайткан (сүрөт 4c, г).Бирок, пептиддердин аралашмасын камтыган үлгүлөр гана.2077 жана SA конъюгацияланган BACE1 пептидинин ингибитору мээ-жүлүн суюктугунда Abeta40 олуттуу төмөндөшүнө себеп болгон (сүрөт. 4c).Маалыматтар көрсөткөндөй, пептид №.2077 60 кДа SA протеинди CNSке ташууга жөндөмдүү жана ошондой эле BACE1 пептидинин SA-конъюгацияланган ингибиторлору менен фармакологиялык эффекттерди жаратат.
(a) Клоналдык инъекция (2 × 10 фаг/жаныбар) T7 фагынын CSF пептидинин №2077 (RLSSVDSDLSGC) жана инъекцияланбаган башкаруу фагынын (№1779) узак мөөнөттүү фармакокинетикалык профилдерин көрсөтүүчү кеминде үч CM-интубацияланган келемиштерге.(б) №2077 пептидинин жана идиштердин (лектин) каршы боялышын көрсөткөн фаг-инъекцияланган келемиштердеги (2 × 10 10 фаг/жаныбар) өкүл кортикалдык микровесселдердин конфокалдык микроскопиялык сүрөтү.Бул фаг клондору 3 келемишке берилип, перфузияга чейин 1 саатка айланууга уруксат берилди.Мээлер кесилген жана T7 фаг капсидине каршы поликлоналдык FITC белгиленген антителолор менен боёлгон.Перфузияга жана андан кийинки фиксацияга он мүнөт калганда, DyLight594-белгиленген лектин венага киргизилген.Капиллярлардын жана периваскулярдык мээ ткандарынын люмендеринде микротамырлардын жана фагдардын (жашыл) люминалдык тарабынын лектин менен боёлгон флуоресценттик сүрөттөрү (кызыл).Масштаб тилкеси 10 мкм туура келет.(c, d) Биотинилденген BACE1 ингибитор пептидинин жалгыз же биотинилденген транзиттик пептид №2077 менен айкалышта стрептавидинге кошулган, андан кийин эң аз дегенде үч каннуляцияланган CM келемиштерин (10 мг стрептавидин/кг) венага инъекциялаган.Aβ40 менен BACE1 пептиддик ингибитору ортомчу кыскартуу көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде кандагы (кызыл) жана жүлүн суюктугунда (кызгылт сары) Aβ1-40 ELISA менен өлчөнгөн.Жакшыраак түшүнүктүү болуу үчүн графикте 100% масштабында чекиттүү сызык тартылат.(c) 3:1 катышында транзиттик пептид №2077 жана BACE1 ингибитор пептидине конъюгацияланган стрептавидин менен дарыланган келемиштерде кандагы (кызыл үч бурчтуктар) жана жүлүн суюктугунда (кызгылт сары үч бурчтуктар) Aβ40 пайызынын азайышы.(г) BACE1 ингибитор пептидине кошулган стрептавидин менен дарыланган келемиштердин канынын Aβ40 (кызыл тегерекчелер) жана жүлүн суюктугунун (кызгылт сары тегерекчелер) пайыздык азайышы.Контролдоодогу Aβ концентрациясы 420 пг/мл болгон (стандарттык четтөө = 101 пг/мл).
Фаг дисплейи биомедициналык изилдөөлөрдүн бир нече багыттарында ийгиликтүү колдонулду17.Бул ыкма in vivo тамыр ар түрдүүлүгүн изилдөөлөр18,19, ошондой эле мээ тамырлары 20,21,22,23,24,25,26 багытталган изилдөөлөр үчүн колдонулган.Бул изилдөөдө биз бул тандоо ыкмасын колдонууну мээ тамырларына багытталган пептиддерди түздөн-түз аныктоо үчүн гана эмес, кан-мээ тосмосун кесип өтүү үчүн активдүү транспорттук касиетке ээ талапкерлерди табууга да кеңейттик.Биз азыр CM интубацияланган келемиштерде in vivo тандоо процедурасын иштеп чыгууну сүрөттөп, анын CSF homing касиеттери бар пептиддерди аныктоо үчүн потенциалын көрсөтөбүз.12-мер кокустук пептиддердин китепканасын көрсөткөн T7 фагынын жардамы менен биз T7 фагынын кан-мээ тосмосуна ыңгайлашуу үчүн жетиштүү кичинекей (болжол менен диаметри 60 нм)10 экенин көрсөтө алдык, ошону менен кан-мээ тосмосун же хороид плексусун түздөн-түз кесип өтөт.Кануляцияланган CM келемиштерден CSF жыйноо жакшы көзөмөлдөнгөн in vivo функционалдык скрининг ыкмасы экенин жана алынган фаг кан тамырлар менен байланышып гана тим болбостон, кан-мээ тосмосу аркылуу ташуучу катары да иштегенин байкадык.Мындан тышкары, бир эле учурда кан чогултуу жана CSF жана кандан алынган фагтарга HTS колдонуу менен, биз CSFти тандообузга кандын байытуусу же тандоонун раунддарынын ортосунда кеңейүүгө жарамдуулугу таасир этпегендигин тастыктадык.Бирок кан бөлүмү тандоо процедурасынын бир бөлүгү болуп саналат, анткени CSF бөлүмүнө жете алган фагдар мээде байыша турганчалык узакка чейин жашап, кан агымында айланышы керек.HTS чийки маалыматтарынан ишенимдүү ырааттуулук маалыматын алуу үчүн биз анализдин иш процессинде платформага тиешелүү секвенирлөө каталарына ылайыкташтырылган чыпкаларды ишке киргиздик.Скрининг ыкмасына кинетикалык параметрлерди киргизүү менен биз жапайы типтеги T7 фагтарынын тез фармакокинетикасын (t½ ~ 28 мин) кандагы24, 27, 28 тастыктадык, ошондой эле алардын мээ-жүлүн суюктугундагы жарым ажыроо мөөнөтүн аныктадык (t½ ~ 26 мин) мүнөтүнө).Кандагы жана CSFдагы окшош фармакокинетикалык профилдерге карабастан, фагдын кандагы концентрациясынын 0,001% гана CSFда аныкталышы мүмкүн, бул жапайы типтеги T7 фагынын гематоэнцефалдык тосмо аркылуу төмөн фон мобилдүүлүгүн көрсөтөт.Бул иш in vivo пандалоо стратегияларын колдонууда тандоонун биринчи раундунун маанилүүлүгүн баса белгилейт, өзгөчө, жүгүртүүдөн тез тазаланган фаг системалары үчүн, анткени CNS отсекине бир нече клондор жете алат.Ошентип, биринчи турда китепкананын ар түрдүүлүгүнүн кыскарышы абдан чоң болду, анткени бул өтө катуу CSF моделинде акырында чектелген сандагы клондор чогултулган.Бул in vivo панорама стратегиясына CSF бөлүмүндө активдүү топтоо, кан бөлүмүндө клондун жашоосу жана алгачкы 10 мүнөттүн ичинде кандан T7 фаг клондорун тез алып салуу сыяктуу бир нече тандоо кадамдары камтылган (сүрөт 1d жана кошумча сүрөт 4M).).Ошентип, биринчи раунддан кийин CSFде ар кандай фаг клондору аныкталган, бирок айрым жаныбарлар үчүн бирдей баштапкы бассейн колдонулган.Бул китепкана мүчөлөрүнүн көп сандагы булак китепканалары үчүн бир нече катуу тандоо кадамдары ар түрдүүлүктүн олуттуу кыскарышына алып келерин көрсөтүп турат.Ошондуктан, кокустук окуялар баштапкы тандоо процессинин ажырагыс бөлүгү болуп калат, натыйжага чоң таасир этет.Кыязы, баштапкы китепканадагы клондордун көбү CSF байытууга абдан окшош.Бирок, ошол эле эксперименттик шарттарда да, тандоо натыйжалары баштапкы бассейнде ар бир конкреттүү клондун аз санынан улам айырмаланышы мүмкүн.
CSF менен байытылган мотивдер кандагылардан айырмаланат.Кызыктуусу, биз айрым жаныбарлардын канындагы глицинге бай пептиддерге карай биринчи жылышты белгиледик.(1g-сүрөт, кошумча сүрөт 4e, 4f).Глицин пептиддерин камтыган фаг туруктуураак болушу мүмкүн жана жүгүртүүдөн азыраак чыгарылат.Бирок, бул глицинге бай пептиддер мээ жүлүн суюктугунун үлгүлөрүндө табылган жок, бул куратордук китепканалар эки башка тандоо баскычтарынан өткөнүн көрсөтүп турат: бири канга, экинчиси мээ жүлүн суюктугуна топтолгон.Тандоонун төртүнчү раундунун натыйжасында CSF менен байытылган клондор кеңири сыналган.Жекече сыналган клондордун дээрлик бардыгы бош башкаруу фагына салыштырмалуу CSF менен байытылганы тастыкталды.Бир пептиддик хит (# 2077) кененирээк изилденген.Ал башка хиттерге салыштырмалуу плазманын жарым ажыроо мөөнөтүн узагыраак көрсөттү (3d-сүрөт жана Кошумча 7-сүрөт) жана эң кызыгы, бул пептидде C-терминуста цистеиндин калдыктары бар.Жакында пептиддерге цистеиндин кошулушу альбумин 29 менен байланышып, алардын фармакокинетикалык касиеттерин жакшыртышы мүмкүн экени аныкталган.Бул учурда пептид №2077 үчүн белгисиз жана кошумча изилдөөнү талап кылат.Кээ бир пептиддер CSF байытууда валенттүүлүккө көз карандылыкты көрсөттү (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес), бул T7 капсидинин көрсөтүлгөн беттик геометриясына байланыштуу болушу мүмкүн.Биз колдонгон T7 системасы фаг бөлүкчөсүнө ар бир пептиддин 5-15 көчүрмөсүн көрсөткөн.IHC келемиштердин мээ кабыгына тамырга сайылган талапкер коргошун фаг клондоруна аткарылган (Кошумча 8-сүрөт).Маалыматтар, жок эле дегенде, үч клон (No 2002, № 2009 жана № 2077) BBB менен өз ара аракеттенгенин көрсөттү.Бул BBB өз ара CSF топтоо же түздөн-түз BCSFB үчүн бул клондордун кыймылына алып келет, жокпу, аныктоо керек.Маанилүү нерсе, биз тандалган пептиддер синтезделип, протеин жүктөрү менен байланышканда алардын CSF транспорттук мүмкүнчүлүктөрүн сактап калаарын көрсөтөбүз.N-терминалдык биотинилденген пептиддердин SA менен байланышы кандагы жана жүлүн суюктугунда алардын тиешелүү фаг клондору менен алынган натыйжаларды кайталайт (сүрөт 3e).Акырында, коргошун пептид №2077 SA менен конъюгацияланган BACE1 биотинилденген пептиддик ингибиторунун мээнин иш-аракетине көмөктөшө аларын көрсөтүп, CSFдеги Abeta40 деңгээлин олуттуу түрдө төмөндөтүү аркылуу CNSте белгилүү фармакодинамикалык эффекттерди жаратат (4-сүрөт).Биз бардык хиттердин пептиддик ырааттуулугун гомология боюнча издөө аркылуу маалымат базасынан эч кандай гомологдорду аныктай алган жокпуз.Белгилей кетчү нерсе, T7 китепканасынын көлөмү болжол менен 109, ал эми 12-мерс үчүн теориялык китепкананын өлчөмү 4 х 1015. Ошондуктан, биз 12-мер пептиддик китепкананын ар түрдүүлүк мейкиндигинин аз гана бөлүгүн тандап алдык, бул дагы оптималдаштырылган пептиддерди бул чектеш ырааттуулуктун мейкиндигин баалоо аркылуу аныктоого болот дегенди билдириши мүмкүн.Гипотетикалык жактан алганда, бул пептиддердин табигый гомологдорун таба албаганыбыздын себептеринин бири эволюция учурунда кээ бир пептиддик мотивдердин мээге көзөмөлсүз киришине жол бербөө үчүн тандоодон ажыратылышы мүмкүн.
Чогуу алганда, биздин натыйжалар in vivo дагы майда-чүйдөсүнө чейин цереброваскулярдык тоскоолдуктун транспорттук системаларын аныктоо жана мүнөздөө боюнча келечектеги иш үчүн негиз түзөт.Бул ыкманын негизги жөндөөлөрү функционалдык тандоо стратегиясына негизделген, ал мээнин тамырын байланыштыруучу касиеттери бар клондорду гана аныктабастан, ошондой эле ийгиликтүү клондор CNS бөлүмүндө in vivo биологиялык тоскоолдуктарды кесип өтүү үчүн ички активдүүлүккө ээ болгон маанилүү кадамды камтыйт.Бул пептиддердин ташуу механизмин жана алардын мээнин аймагына мүнөздүү микроваскулярдуулук менен байланышуу артыкчылыктарын түшүндүрүү болуп саналат.Бул BBB жана рецепторлорду ташуу үчүн жаңы жолдорду ачууга алып келиши мүмкүн.Биз аныкталган пептиддер түздөн-түз цереброваскулярдык рецепторлорго же BBB же BCSFB аркылуу ташылуучу циркуляциялык лиганддарга байланыша алат деп күтөбүз.Бул иште табылган CSF транспорттук активдүүлүгү менен пептиддик векторлор андан ары изилденет.Учурда биз бул пептиддердин мээнин өзгөчөлүгүн алардын BBB жана/же BCSFB аркылуу өтүү жөндөмдүүлүгүн изилдеп жатабыз.Бул жаңы пептиддер жаңы рецепторлорду же жолдорду табуу жана макромолекулаларды, мисалы, биологиялык заттарды мээге жеткирүү үчүн жаңы жогорку эффективдүү платформаларды иштеп чыгуу үчүн өтө баалуу куралдар болот.
Чоң цистернаны (CM) мурда сүрөттөлгөн ыкманын модификациясын колдонуу менен каннуляциялоо.Анестезияланган Wistar келемиштери (200-350 г) стереотаксикалык аппаратка орнотулуп, баш сөөгүн ачуу үчүн кырылган жана асептикалык жактан даярдалган баш терисинин үстүнөн орто кесүү жасалган.Үстүнкү тешиктин аймагында эки тешик бургула жана тешиктерге бекитүүчү бурамалар бекитилет.Кошумча тешик CM салып дат баспас болоттон жасалган cannula стереотактикалык жетекчилик үчүн каптал желке кырка бургуланган.Кануланын тегерегине стоматологиялык цементти сүйкөп, бурамалар менен бекитиңиз.Фото-катуудан жана цементти катуулаткандан кийин теринин жарааты 4/0 супрамиддик тигүү менен жабылды.Канюланы туура жайгаштыруу жүлүн суюктугунун (ЖСФ) өзүнөн-өзү агып чыгышы менен тастыкталат.Стереотаксикалык аппараттан чычканды алып салыңыз, операциядан кийинки тийиштүү жардамды жана ооруну башкарууну алыңыз жана мээ жүлүн суюктугунда кандын белгилери байкалганга чейин, жок эле дегенде, бир жума калыбына келтирүүгө мүмкүнчүлүк бериңиз.Wistar келемиштери (Crl:WI/Han) Чарльз дарыясынан (Франция) алынган.Бардык келемиштер атайын патогенсиз шарттарда сакталган.Бардык жаныбарларга жасалган эксперименттер Швейцариянын Базель шаарынын Ветеринардык кеңсеси тарабынан жактырылган жана № 2474 Animal License (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels in therapeutic Candidas in Mea-spinal Fluid and Brain) аткарылган.
Колунда CM cannula менен чычканды акырын эсинде сактаңыз.Датураны каннуладан чыгарып, өзүнөн-өзү агып жаткан 10 мкл жүлүн суюктугун чогултуңуз.Каннуланын ачыктыгы акыры бузулгандыктан, бул изилдөөгө кандын булганышынын же түсүнүн өзгөрүшүнүн эч кандай далили жок таза мээ жүлүн суюктугунун үлгүлөрү гана киргизилген.Параллелдүү, болжол менен 10-20 мкл кан куйруктун учундагы кичинекей кесиктен гепарин (Сигма-Олдрих) бар түтүкчөлөргө алынган.CSF жана кан тамырга T7 фаг сайылгандан кийин ар кандай убакыт чекиттеринде чогултулган.Ар бир CSF үлгүсүн чогултуу алдында болжол менен 5-10 мкл суюктук ташталды, бул катетердин өлүк көлөмүнө туура келет.
Китепканалар T7Select тутумдук колдонмосунда сүрөттөлгөндөй T7Select 10-3b векторунун жардамы менен түзүлгөн (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Кыскача айтканда, кокус 12-мер ДНК кыстаруу төмөнкү форматта синтезделген:
NNK кодону кош аялдама кодондорун жана кыстармада аминокислота ашыкча экспрессиясын болтурбоо үчүн колдонулган.N – ар бир нуклеотиддин кол менен аралашкан эквимолярдык катышы, ал эми К – аденин менен цитозин нуклеотиддеринин кол менен аралашкан эквимолярдык катышы.Бир катарлуу аймактар ​​dNTP (Novagen) жана Klenow ферменти (New England Biolabs) менен Klenow буферинде (New England Biolabs) 3 саат бою 37°Cде андан ары инкубациялоо жолу менен кош тилкелүү ДНКга айландырылды.Реакциядан кийин, EtOH тундурмасы менен кош тилкелүү ДНК калыбына келтирилди.Алынган ДНК чектөө ферменттери EcoRI жана HindIII (экөө тең Roche компаниясынан) менен сиңирилген.Бөлүнгөн жана тазаланган (QIAquick, Qiagen) кыстарма (T4 ligase, New England Biolabs) андан кийин 10B капсид генинин 348 аминокислотасынан кийин алдын ала бөлүнгөн T7 векторуна рамка ичинде байланган.Лигациялоо реакциялары in vitro таңгагынан 18 саат мурун 16°С температурада инкубацияланган.Фагды таңгактоо in vitro T7Select 10-3b клондоо комплекти (Novagen) менен берилген нускамаларга ылайык жүргүзүлдү жана таңгактоочу эритме ичеги таякчасын (BLT5615, Novagen) колдонуу менен лизис үчүн бир жолу күчөтүлдү.Лизаттар центрифугаланган, титрленген жана глицериндин запастык эритмеси катары -80°Сте тоңдурулган.
Проприетардык 454/Рош-ампликон синтездик праймерлерин колдонуу менен сорподо же пластинкада күчөтүлгөн фагдын өзгөрмөлүү аймактарын түз ПТР күчөтүү.Алдыга бириктирүү праймери өзгөрмө аймагын (NNK) 12 (үлгүгө тиешелүү), GS FLX Titanium Adapter A жана төрт базалык китепкана ачкыч ырааттуулугун (TCAG) камтыйт (Кошумча 1а сүрөт):
Тескери синтез праймеринде ошондой эле мончокторду кармоо үчүн тиркелген биотин жана эмульсия ПТР учурунда клондук күчөтүү үчүн зарыл болгон GS FLX титан адаптери бар:
Андан кийин ампликондор 454 GS-FLX Titanium протоколуна ылайык 454/Roche пиросеквенциясына дуушар болгон.Кол менен Sanger секвенирлөө үчүн (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) T7 фаг ДНКсы ПТР аркылуу күчөтүлгөн жана төмөнкү праймер жуптары менен секвенирленген:
Жеке бляшкалардагы кыстармалар Roche Fast Start ДНК Полимераза комплектинин жардамы менен ПТР күчөтүүсүнө дуушар болгон (өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык).Ысык баштоону (95 °Cде 10 мин) жана 35 жогорулатуу циклин (95 °Cде 50 с, 50 ​​°Cде 1 мин жана 72 °Cде 1 мин) аткарыңыз.
Китепканалардагы фаг, жапайы типтеги фаг, CSF жана кандан куткарылып алынган фаг же жеке клондор Escherichia coli BL5615 TB сорпасында (Sigma Aldrich) же 500 см2 идиштерде (Thermo Scientific) 37°Cде 4 саат бою күчөтүлгөн.Пластиналарды Tris-EDTA буфери (Fluka Analytical) менен чайкоо же стерилдүү пипетка учтары бар бляшкаларды чогултуу жолу менен плиталардан фаг алынган.Фаглар полиэтиленгликолдун (PEG 8000) бир айлампасы менен (Промега) культуралык супернатанттан же экстракция буферинен бөлүнүп алынган жана Трис-ЭДТА буферинде кайра суспензияланган.
Күчөтүлгөн фаг венага (IV) сайганга чейин (500 мкл/жаныбар) эндотоксинди кетирүүчү мончокторду (Miltenyi Biotec) колдонуу менен 2-3 раунд эндотоксинди алып салууга дуушар болгон.Биринчи турда 2×1012 фагдар киргизилген;экинчисинде, 2×1010 фагдар;үчүнчү жана төртүнчү тандоо турларында малга 2×109 фаг.Көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде чогултулган CSF жана кан үлгүлөрүндөгү фагдын мазмуну өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык (T7Select тутумдук колдонмосу) бляшкалар менен аныкталды.Фагды тандоо тазаланган китепканаларды куйрук тамырга инъекциялоо жолу менен же мурунку тандоо раундунан CSFден алынган фагды кайра инъекциялоо жолу менен аткарылды жана кийинки түшүм 10 мүнөттө, 30 мүнөттө, 60 мүнөттө, 90 мүнөттө, 120 мүнөттө, 180 мүнөттө жана 240F кан үлгүсүндө аткарылды.Бардыгы болуп in vivo пандалоонун төрт раунду өткөрүлдү, анда эки тандалган бутак өзүнчө сакталып, тандоонун алгачкы үч раундунун жүрүшүндө талдоого алынды.Тандоонун алгачкы эки раундунан CSFден алынган бардык фагдар 454/Roche пиросеквенирлөөсүнө дуушар болгон, ал эми тандоонун акыркы эки раундунан CSFден алынган бардык клондор кол менен тизилген.Тандоонун биринчи раундундагы бардык кан фагдары да 454/Рош пиросеквенциясына дуушар болушкан.Фаг клондорун инъекциялоо үчүн тандалган фагдар E. coliде (BL5615) 500 см2 пластиналарда 37°С температурада 4 саат бою күчөтүлгөн.Жекече тандалып алынган жана кол менен тизилген клондор кургак учук чөйрөсүндө көбөйтүлгөн.Фагды экстракциялоодон, тазалоодон жана эндотоксинди алып салуудан кийин (жогоруда айтылгандай), 2 × 1010 фаг/жаныбар 300 мкл бир куйрук венага венага сайылган.
Алдын ала кайра иштетүү жана ырааттуу маалыматтарды сапаттык чыпкалоо.Raw 454/Roche маалыматтары экилик стандарттык агым картасы форматынан (sff) сатуучу программалык камсыздоону колдонуу менен Pearson адам окуй турган форматына (fasta) айландырылган.Нуклеотиддердин ырааттуулугун андан ары иштетүү, төмөндө сүрөттөлгөндөй, менчик C программаларын жана сценарийлерин (чыгарылбаган программалык пакет) колдонуу менен аткарылган.Алгачкы маалыматтарды талдоо катуу көп баскычтуу чыпкалоо процедураларын камтыйт.Жарактуу 12мер кыстаруу ДНК ырааттуулугун камтыбаган окууларды чыпкалоо үчүн, окуулар башталгыч энбелгиге (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), токтотуу энбелгисине (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) жана фон кыстармасына (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGW) ырааттуулук менен тегизделди.ар бир тегиздөө31 2 карама-каршылыкка жол берген тегиздөө.Ошондуктан, баштоо жана токтотуу тегдери жок окуулар жана фон кошумчаларын камтыган окуулар, б.а., туура келбегендиктин уруксат берилген санынан ашкан тегиздөөлөр китепканадан алынып салынды.Калган окууларга келсек, башталгыч белгиден созулган жана токтотуу белгисине чейин аяктаган N-mer ДНК ырааттуулугу баштапкы окуу ырааттуулугунан чыгарылып, андан ары кайра иштетилген (мындан ары "киргизүү" деп аталат).Кыстарманы которгондон кийин, праймердин 5′ учундагы биринчи аялдама кодондон кийинки бөлүгү кошумчадан чыгарылат.Мындан тышкары, праймердин 3′ учундагы толук эмес кодондорго алып келген нуклеотиддер да алынып салынды.Фондук ырааттуулукту гана камтыган кыстармаларды алып салуу үчүн, "PAG" аминокислота үлгүсү менен башталган которулган кошумчалар да алынып салынды.Пост-трансляциялык узундугу 3 аминокислотадан аз болгон пептиддер китепканадан чыгарылды.Акырында, кыстаруу бассейниндеги ашыкчаларды алып салыңыз жана ар бир уникалдуу кыстаруунун жыштыгын аныктаңыз.Бул анализдин натыйжалары нуклеотиддердин тизмегин (киргизүүлөрдү) жана алардын (окулган) жыштыктарын камтыйт (Кошумча 1c жана 2-сүрөттөр).
Топ N-mer ДНКсынын ырааттуулугу боюнча окшоштугу боюнча: 454/Роштун спецификалык секвенирлөө каталарын (мисалы, гомополимердик кеңейтүүлөрдү секвенирлөөдөгү көйгөйлөр) жок кылуу жана анча маанилүү эмес ашыкчаларды алып салуу үчүн, мурда чыпкаланган N-mer ДНК ырааттуулугун кыстармалар (кыстармалар) окшоштуктар боюнча сорттолот.төмөнкүдөй аныкталган итеративдик алгоритмди колдонуу менен киргизүүгө (2га чейин дал келбеген негиздерге уруксат берилет): киргизүүлөр биринчи жолу жыштыгы боюнча (эң жогорудан эң төмөнгө), ал эми алар бирдей болсо, узундугу боюнча экинчи иретте (узунунан эң кыскага) иреттелишет.Ошентип, эң көп жана эң узун киргизүүлөр биринчи "топту" аныктайт.Топтук жыштык негизги жыштыкка коюлган.Андан кийин, сорттолгон тизмеде калган ар бир киргизүү жуп Needleman-Wunsch тегиздөө менен топко кошулууга аракет кылынган.Эгерде тегиздөөдөгү дал келбегендердин, киргизүүлөрдүн же жок кылуулардын саны 2 босогодон ашпаса, топко киргизүү кошулат жана жалпы топтун жыштыгы кыстаруу канчалык көп кошулганына жараша көбөйөт.Топко кошулган кыстармалар колдонулган катары белгиленет жана андан ары иштетүүдөн чыгарылат.Кыстаруу ырааттуулугун мурунтан эле бар топко кошуу мүмкүн болбосо, кыстаруу ырааттуулугу ылайыктуу кыстаруу жыштыгы менен жаңы топту түзүү үчүн колдонулат жана колдонулган катары белгиленет.Итерация ар бир киргизүү ырааттуулугу жаңы топту түзүү үчүн колдонулганда же мурунтан эле бар топко кошулганда аяктайт.Анткени, нуклеотиддерден турган топтоштурулган кыстармалар акырында пептиддик ырааттуулукка (пептиддик китепканаларга) которулат.Бул талдоонун натыйжасы катары катары менен окуулардын санын түзгөн киргизүүлөрдүн жана алардын тиешелүү жыштыктарынын жыйындысы болуп саналат (Кошумча 2-сүрөт).
Motif Generation: Уникалдуу пептиддердин тизмесинин негизинде төмөндө көрсөтүлгөндөй бардык мүмкүн болгон аминокислота үлгүлөрүн (аа) камтыган китепкана түзүлдү.Ар бир мүмкүн болгон узундугу 3 үлгүсү пептидден алынган жана анын тескери үлгүсү бардык үлгүлөрдү (трипептиддер) камтыган жалпы мотив китепканасы менен кошо кошулган.Абдан кайталануучу мотивдердин китепканалары ырааттуулук менен тизилип, ашыкча нерселер алынып салынды.Андан кийин, мотив китепканасындагы ар бир трипептид үчүн биз эсептөө куралдарын колдонуу менен анын китепканада болушун текшердик.Бул учурда, табылган мотив трипептидди камтыган пептиддин жыштыгы кошулуп, мотивдер китепканасындагы мотивге дайындалат («мотивдердин саны»).Мотивдерди түзүүнүн натыйжасы трипептиддердин (мотивдердин) бардык көрүнүштөрүн жана алардын тиешелүү маанилерин камтыган эки өлчөмдүү массив болуп саналат, алар окуулар чыпкаланганда, топтоштурулганда жана которулганда тиешелүү мотивге алып келген ырааттуу окуулардын саны.Жогоруда майда-чүйдөсүнө чейин сүрөттөлгөн метрикалар.
Мотивдердин санын жана тиешелүү чачырандыларды нормалдаштыруу: Ар бир үлгү үчүн мотивдердин саны нормалдаштырылган
мында ni - i темасын камтыган окуулардын саны.Ошентип, vi үлгүдөгү i мотивин камтыган окуулардын (же пептиддердин) пайыздык жыштыгын билдирет.Мотивдердин нормалдашпаган саны үчүн P-маанилери Фишердин так тестинин жардамы менен эсептелген.Мотивдердин санынын коррелограммаларына келсек, Спирмандын корреляциялары Р менен мотивдердин нормалдаштырылган санын колдонуу менен эсептелген.
Пептиддик китепкананын ар бир позициясында аминокислоталардын мазмунун визуалдаштыруу үчүн 32, 33 веб-лограммдары (http://weblogo.threeplusone.com) түзүлгөн.Биринчиден, 12-мер пептиддин ар бир абалындагы аминокислоталардын мазмуну 20×12 матрицасында сакталат.Андан кийин, ар бир позицияда бирдей салыштырмалуу аминокислота мазмунун камтыган 1000 пептиддердин топтому fasta-sequence форматында түзүлөт жана ар бир позицияда салыштырмалуу аминокислотанын мазмунунун графикалык көрүнүшүн түзүүчү 3-веб-логотипке киргизүү катары берилет.берилген пептиддик китепкана үчүн.Көп өлчөмдүү берилиштер топтомун визуализациялоо үчүн жылуулук карталары R ичинде иштелип чыккан куралдын жардамы менен түзүлдү (biosHeatmap, R пакети али чыгарыла элек).Жылуулук карталарында берилген дендрограммалар Уорддун иерархиялык кластерлөө ыкмасы менен Евклиддик аралык метрикасы менен эсептелген.Мотивдик баллдык маалыматтарды статистикалык талдоо үчүн, нормаланбаган балл үчүн P маанилери Фишердин так тестинин жардамы менен эсептелген.Башка маалымат топтомдору үчүн P-маанилери Студенттин t-тестинин же ANOVAнын жардамы менен R менен эсептелген.
Тандалган фаг клондору жана салмалары жок фагтар куйрук тамыры аркылуу тамырга сайылган (300 мкл PBSте 2 × 1010 фаг/жаныбар).Перфузияга жана андан кийинки фиксацияга он мүнөт калганда, ошол эле жаныбарларга 100 мкл DyLight594 менен белгиленген лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177) тамырга сайылган.Фаг инъекциясынан 60 мүнөт өткөндөн кийин келемиштерге 50 мл PBS, андан кийин 50 мл 4% PFA/PBS жүрөк аркылуу перфузияланган.Мээ үлгүлөрү кошумча түнү 4% PFA/PBSга бекитилип, 30% сахарозага түнү 4°Cде малынган.Үлгүлөр OCT аралашмасында тоңдурулган.Тоңдурулган үлгүлөрдүн иммуногистохимиялык анализи бөлмө температурасында 30 мкм криосекцияларда 1% BSA менен бөгөттөлгөн жана 4 °Cде T7 фагына (Novus NB 600-376A) каршы поликлоналдык FITC белгиленген антителолор менен инкубацияланган.Түн ичинде инкубациялоо.Акыр-аягы, бөлүмдөр PBS менен 3 жолу жууп, конфокалдык лазер микроскоп (Leica TCS SP5) менен каралат.
Минималдуу тазалыгы 98% болгон бардык пептиддер GenScript USA тарабынан синтезделип, биотинилденген жана лиофилдештирилген.Биотин N-терминуста кошумча үч глицин спасер аркылуу байланышат.Масс-спектрометрияны колдонуу менен бардык пептиддерди текшериңиз.
Streptavidin (Sigma S0677) DMSO/incubat менен 5-10% биотинилденген пептид, биотинилденген BACE1 ингибитор пептидинин 5 эсе эквимолярдуу ашыкчасы менен же биотинилденген BACE1 ингибитор пептидинин жана BACE1 ингибитор пептидинин айкалышы (3:1 катышы) менен аралаштырылган.Инъекциядан мурун бөлмө температурасында 1 саат.Стрептавидин менен конъюгацияланган пептиддер мээ көңдөйү бар келемиштердин куйрук веналарынын бирине 10 мг/кг дозада венага сайылган.
Стрептавидин-пептиддик комплекстердин концентрациясы ELISA тарабынан бааланган.Nunc Maxisorp микротитр плиталары (Sigma) 1,5 мкг / мл чычкан анти-стрептавидин антитело (Thermo, MA1-20011) менен 4 ° C боюнча түнү капталган.Бөгөттөөдөн кийин (бөгөттөө буфери: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) бөлмө температурасында 2 саатка пластинканы 0,05% Tween-20/PBS (жуу буфери) менен жууп, 3 секундага чейин скважиналарга куюп, скважиналарга куюп салыңыз. 1:10 000, CSF 1:115).Андан кийин табак түнү бою 4°Cде аныктоочу антитело менен инкубацияланган (1 мкг/мл, антистрептавидин-HRP, Novus NB120-7239).Үч жуугуч кадамдан кийин стрептавидин TMB субстрат эритмесинде (Рош) 20 мүнөткө чейин инкубациялоо аркылуу аныкталган.1M H2SO4 менен түстүн өнүгүшүн токтоткондон кийин, 450 нмде абсорбенцияны өлчөңүз.
Стрептавидин-пептид-BACE1 ингибитор комплексинин функциясы өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык Aβ(1-40) ELISA тарабынан бааланган (Wako, 294-64701).Кыскача айтканда, CSF үлгүлөрү стандарттык эриткичте (1:23) суюлтулган жана BNT77 басып алуу антителосу менен капталган 96 көзөнөктүү пластиналарда 4°C түнү менен инкубацияланган.Беш жуу кадамынан кийин, HRP-конъюгацияланган BA27 антитело кошулуп, 2 саат 4°C температурада инкубацияланды, андан кийин беш жуу кадамы жасалды.Aβ(1–40) бөлмө температурасында 30 мүнөткө TMB эритмесинде инкубациялоо жолу менен аныкталган.Түстүн өнүгүүсү токтотуу эритмеси менен токтотулгандан кийин, абсорбенцияны 450 нмде өлчөңүз.Плазма үлгүлөрү Aβ (1-40) ELISA чейин катуу фазалык экстракцияга дуушар болгон.Плазма 0,2% DEA (Сигма) 96 скважиналык пластинкаларга кошулуп, бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубацияланды.SPE плиталарын (Oasis, 186000679) суу жана 100% метанол менен ырааттуу жуугандан кийин, плазма үлгүлөрү SPE плиталарына кошулуп, бардык суюктуктар алынып салынды.Үлгүлөр жуулган (адегенде 5% метанол, андан кийин 30% метанол менен) жана 2% NH4OH/90% метанол менен элюталанган.Элюатты 55°Cде 99 мүнөт туруктуу N2 агымында кургаткандан кийин, үлгүлөр стандарттуу эриткичтерде кыскартылган жана Aβ(1–40) жогоруда айтылгандай ченелген.
Бул макаланы кантип келтирсе болот: Urich, E. et al.In vivo аныкталган транзиттик пептиддерди колдонуу менен жүктү мээге жеткирүү.илим.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB жана Moos T. Максаттуу терапияны колдонуу менен мээге макромолекулярдык дары жеткирүү.Neurochemistry Journal 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. жана Martinez-Martinez, P. кан-мээ тоскоолдук аркылуу пептиддик жана белок дары жеткирүү.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, В.М. Кан-мээ тоскоолдуку: мээнин дары-дармектерин өнүктүрүүдөгү тоскоолдук.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, KE, Дункан, JA, Stopa, EG, жана Берд, A. жакшыртылган дары жеткирүү жана choroid plexus-CSF жолу аркылуу мээге багытталган келечеги.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, WM Биофармацевтиканы молекулярдык троян аттары менен модернизациялоо.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, кан-мээ тоскоолдук аркылуу WM кабылдагыч ортомчу пептиддик транспорт.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. жана башкалар.Моноваленттүү молекулярдык челноктордун жардамы менен мээге киришин жана терапиялык антителолордун эффективдүүлүгүн жогорулатуу.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н жана башкалар.Трансферрин рецепторунун (TfR) транспорту TfR антителолорунун жакындык варианттарынын мээнин кабыл алынышын аныктайт.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).