Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү). Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Бир эле учурда үч слайддан турган каруселди көрсөтөт. Бир убакта үч слайд аркылуу өтүү үчүн Мурунку жана Кийинки баскычтарын колдонуңуз, же бир эле учурда үч слайд аркылуу өтүү үчүн аягындагы сыдырма баскычтарын колдонуңуз.
Өзүн өзү чогултуучу нерв органеллдери адамдын өнүгүүсүн жана ооруну моделдөө үчүн келечектүү in vitro платформаны билдирет. Бирок органоиддерде in vivo болгон байланыш жок, бул жетүүнү чектейт жана жүрүм-турумду башкарган башка схемалар менен интеграцияга жол бербейт. Бул жерде биз неонаталдык жылаңач келемиштердин соматосенсордук кортексине көчүрүлгөн адамдын сөңгөк клеткасынан алынган кортикалдык органоиддер сезүү жана мотивацияга байланыштуу схемаларга кошулган жетилген клетка түрлөрүн өнүктүрөрүн көрсөтөбүз. MRI бир нече сөңгөк клетка линияларында жана жаныбарларда трансплантациядан кийинки органоиддик өсүштү көрсөттү, ал эми бир ядролуу талдоо кортиогенездин прогрессиясын жана активдүүлүккө көз каранды транскрипция программасынын пайда болгонун аныктады. Чынында эле, трансплантацияланган кортикалдык нейрондор, алардын in vitro кесиптештерине караганда татаал морфологиялык, синаптикалык жана ички мембраналык касиеттерди көрсөтүп, Тиметей синдрому менен ооруган бейтаптарда нейрондук кемчиликтерди аныктоого мүмкүндүк берет. Анатомиялык жана функционалдык чалгындоо трансплантацияланган органеллдер таламокортикалдык жана кортикокортикалдык киргизүүлөрдү алаарын көрсөттү, ал эми нервдик активдүүлүктүн in vivo жазуулары бул киргизүүлөр адамдын клеткаларында сезүү реакцияларын жаратышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Акыр-аягы, кортикалдык органоиддер келемиштердин мээсинде аксондорду кеңейтип, алардын оптогенетикалык активдешүүсү сыйлыкка умтулган жүрүм-турумга алып келет. Ошентип, трансплантацияланган адамдын кортексиндеги нейрондор жетилет жана жүрүм-турумун көзөмөлдөгөн хозисттин схемаларына катышат. Биз бул ыкма башка ыкмалар менен аныктоо мүмкүн эмес, бейтаптын алынган клеткаларда катар-деңгээл фенотиптерин аныктоого көмөктөшөт деп күтөбүз.
Өнүгүп келе жаткан адамдын мээси өзүн-өзү уюштуруучу керемет процесс, анда клеткалар көбөйүп, дифференцияланып, миграцияланып жана туюшуу тажрыйбасы аркылуу андан ары такталган функционалдык нейрондук схемаларды түзүү үчүн туташат. Адамдын мээсинин өнүгүшүн түшүнүүдөгү негизги көйгөй, айрыкча оорунун контекстинде, мээ кыртышына жетүүнүн жоктугу. Өзүн-өзү уюштуруучу органеллдер, анын ичинде адамдын кабыгынын органоиддери (hCO; ошондой эле адамдын кортекс сферасы катары белгилүү), 2,3,4,5,6 түзө алат. Бирок, бир нече чектөөлөр нейрондук схемалардын өнүгүшүн жана иштешин түшүнүү үчүн аларды кеңири колдонууну чектейт. Атап айтканда, hCO жетилиши in vivo болгон кээ бир микрочөйрө жана сенсордук салымдардын жоктугу менен чектелгенби, белгисиз. Мындан тышкары, hCOs жүрүм-турум натыйжаларын түзө турган схемаларга интеграцияланбагандыктан, алардын генетикалык жактан татаал жана жүрүм-турумдук нейропсихиатриялык ооруларды моделдөөдөгү пайдасы азыркы учурда чектелген.
Бүтүлбөгөн тирүү мээге hCO трансплантациялоо бул чектөөлөрдү жеңе алат. Мурунку изилдөөлөр кемирүүчүлөрдүн кабыгына трансплантацияланган адамдын нейрондору аман калып, долбоорлонуп, кемирүүчүлөрдүн клеткалары менен байланыша аларын көрсөттү7,8,9,10,11,12. Бирок, бул эксперименттер, адатта, синаптикалык жана аксоналдык интеграцияны чектеши мүмкүн болгон бойго жеткен жаныбарларга жасалат. Бул жерде биз пластикалык өнүгүүнүн алгачкы этабында иммуножетишсиз келемиштердин негизги соматосенсордук кортексине (S1) hiPS клеткаларынан алынган 3D hCO трансплантацияланган трансплантация парадигмасын сүрөттөп беребиз. Трансплантацияланган hCO (t-hCO) нейрондор олуттуу жетүүгө дуушар болушат, сенсордук реакцияларды пайда кылган thalamokortic жана кортикалдык-кортикалдык киргизүүлөрдү алышат жана сыйлыкка умтулган жүрүм-турумду жүргүзүү үчүн келемиштердин мээсине аксоналдык проекцияларды кеңейтет. t-hCO узартылган жетилиши Timothy синдрому (TS), чыңалуу сезгич L-түрү CaV1.2 кальций каналынын (CACNA1C тарабынан коддолгон) мутациялар менен шартталган оор генетикалык оору менен ооруган нейрондук кемчиликтерди аныктады.
In vivo схемалардагы адамдын кортикалдык нейрондорун изилдөө үчүн, биз стереотактикалык түрдө бузулбаган 3D hCO ны төрөттөн кийинки эрте атимикалык келемиштердин S1ге көчүрдүк (төрттөн кийинки 3-7-күндөр) (сүрөт. 1a жана Fig. 1a-c кеңейтилген маалыматтар). Бул учурда, thalamokortic жана кортикокортикалдык аксоналдык проекциялар S1 innervation аягына чыга элек (шилтеме 13). Ошентип, бул ыкма эндогендик микросхемаларга таасирин азайтуу менен бирге t-hCO интеграциясын максималдаштыруу үчүн иштелип чыккан. Тирүү жаныбарларда t-hCO нун жайгашкан жерин элестетүү үчүн, биз трансплантациялоодон 2-3 ай өткөндөн кийин келемиштердин T2 салмактуу MRI мээсинин реконструкциясын жүргүздүк (сүрөт. 1b жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт 1d). t-hCO дароо байкалган жана t-hCO көлөмүнүн өлчөөлөрү белгиленген кесимдерден эсептелгендерге окшош болгон (кеңейтилген маалымат фиг. 1d,e; P> 0.05). t-hCO дароо байкалган жана t-hCO көлөмүнүн өлчөөлөрү белгиленген кесимдерден эсептелгендерге окшош болгон (кеңейтилген маалымат фиг. 1d,e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO менен аналогиялык рассчитанным үчүн фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO жонокой байкалган жана көлөмдүү t-hCO өлчөөлөр туруктуу бөлүмдөр үчүн эсептелгендерге окшош болгон (кеңейтилген маалыматтар, 1d-сүрөт, д; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO менен аналогиялык рассчитанным үчүн фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO жонокой байкалган жана көлөмдүү t-hCO өлчөөлөр туруктуу бөлүмдөр үчүн эсептелгендерге окшош болгон (кеңейтилген маалыматтар, 1d-сүрөт, д; P> 0.05).Трансплантацияланган жаныбарлардын 81% t-hCO н трансплантациядан кийин болжол менен 2 айдан кийин аныктадык (n = 72 жаныбар; hCO 10 hiPS клетка линияларынан; hiPS клетка линиялары Кошумча таблицада 1). Алардын 87% мээ кыртышында жайгашкан (1в-сүрөт). Ошол эле көчүрүлгөн келемиште бир нече убакыт чекиттеринде сериялык MRI сканерлерин жүргүзүү менен, биз 3 айдын ичинде t-hCO көлөмүнүн тогуз эсеге көбөйгөнүн таптык (сүрөт. 1d жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт 1f). Трансплантацияланган жаныбарлар трансплантациядан кийинки 12 айда жашоонун жогорку деңгээли (74%) болгон (кеңейтилген маалыматтар, 1g-сүрөт жана 2-таблица) жана ачык кыймылдаткыч же эс тутум бузулушу, глиоз же электроэнцефалограмма (ЭЭГ) табылган эмес. Маалыматтар сүрөт. 1g жана кошумча таблица 2). 1 саат жана 3е).
а, Эксперименталдык конструкциянын схемасы. hiPS клеткаларынан алынган hCO жаңы төрөлгөн жылаңач келемиштердин S1ине дифференциациянын 30-60-күнүндө көчүрүлгөн. б, трансплантациядан кийин S1 2 ай t-hCO көрсөтүү T2-салмактуу короналдык жана горизонталдуу MRI сүрөттөр. Масштаб тилкеси, 2 мм. с, ар бир hiPS клетка линиясы үчүн көрсөтүлгөн engraftment ийгилиги чендердин сандык (n = 108, тилкелердин ичиндеги сандар hIPS клетка линиясына t-hCO суммасын көрсөтөт) жана кортикалдык же subcortical жайгашкан (n = 88). г, коронардык артериянын MRI сүрөтү (сол; масштабдуу тилкеси, 3 мм) жана тиешелүү 3D көлөмдүк кайра куруу (масштаб тилкеси, 3 мм) 3 айдын ичинде t-hCO өсүшүн көрсөткөн. д, келемиштердин мээ кортексиндеги t-hCO үлгүлөрүн карап чыгуу. Масштаб тилкеси, 1 мм. е, жогорку солдон оңго көрсөтүлгөн t-hCO өкүлү immunocytochemical сүрөттөрү (дифференциялоо учурунда): PPP1R17 (4 ай), NeuN (8 ай), SOX9 жана GFAP (8 ай), PDGFRα; (8 ай), MAP2 (8 ай) жана IBA1 (8 ай). Масштаб тилкеси, 20 мкм. HNAнын биргелешип экспрессиясы адамдан келген клеткаларды көрсөтөт. g, snRNA-seq: Seurat интеграциялоодон кийин бардык жогорку сапаттагы t-hCO ядролорунун бирдиктүү коллекциясы жана проекциясы (UMAP) өлчөмдүүлүктү азайтуу сүрөтү (n = 3 t-hCO үлгүлөрү, n = 2 hiPS клетка линиялары). астроциттер, астроцит линиясынын клеткалары; cyc prog, циркуляциялык прогениторлор; GluN DL, терең глутаматергиялык нейрондор; GluN DL/SP, терең жана sublamellar glutamatergic нейрондор; GluN UL, үстүнкү катмардагы глутаматергиялык нейрондор; олигодендроциттер, олигодендроциттер; ОПК, олигодендроцит прогенитор клеткалары; RELN, реелин нейрондору. ч, Gene Ontology (GO) гендердин мөөнөттүү байытуу талдоо hCO glutamatergic нейрондор менен салыштырганда t-hCO glutamatergic нейрондордо олуттуу upregulated (түзөтүлгөн P <0.05, бүктөлгөн өзгөртүү> 2, ядролордун, жок эле дегенде, 10% билдирди). ч, Gene Ontology (GO) гендердин мөөнөттүү байытуу талдоо hCO glutamatergic нейрондор менен салыштырганда t-hCO glutamatergic нейрондордо олуттуу upregulated (түзөтүлгөн P <0.05, бүктөлгөн өзгөртүү> 2, ядролордун, жок эле дегенде, 10% билдирди). h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) генов үчүн активдүү активдүүлүк (скорректировка P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейрондук t-hCOlu sravgicheskyh нейрондук t-hCO. ч, Gene Ontology (GO) hCO glutamatergic нейрондор менен салыштырганда t-hCO glutamatergic нейрондордо олуттуу жандантуу менен гендер үчүн мөөнөттүү байытуу талдоо (түзөтүлгөн P <0.05, бүктөлгөн өзгөртүү> 2, жок дегенде 10% ядролордо сөз). h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整天0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语毌集。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０05 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гени значительно активизировались (корректирированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейрон анализи t-hCO по сравнению сравнению глутаматергических нервных терминология ГО глутаматергических нейронологических терминдер. ч, гендер кыйла жогорулатылган (түзөтүлгөн P <0.05, бүктөлгөн өзгөртүү> 2, ядролордун, жок эле дегенде, 10% билдирилген) hCO glutamatergic нейрондор менен салыштырганда t-hCO glutamatergic нейрондор Онтологиялык (GO) байытуу мөөнөтү талдоо.чекиттүү сызык 0,05 aq маанисин көрсөтөт. i, шилтеме 22 snRNA-seq бойго жеткен мотор кортекстин маалымат топтомунан энбелги берүүнү колдонуу менен t-hCOдагы GluN клеткаларынын түрлөрүнүн UMAP сүрөтү. КТ — кортикоталамус клеткалары, ET — мээден тышкаркы клеткалар, IT — ички теленцефаликалык клеткалар, NP — проекцияга жакын.
Андан кийин биз t-hCO нун цитоархитектурасын жана жалпы клеткалык курамын бааладык. Келемиштердин эндотелий клеткаларынын антитело боёгу t-hCO менен васкуляризацияны көрсөттү, ал эми IBA1 боёгу транспланттын боюнда келемиш микроглиясынын бар экендигин аныктады (сүрөт. 1f жана кеңейтилген маалыматтар, Fig. 3c,d). Иммуноскопто PPP1R17 (кортикалдык прогениторлор), NeuN (нейрондор), SOX9 жана GFAP (глиалдан алынган клеткалар) же PDGFRα (олигодендроциттердин прогениторлору) биргелешип экспрессиялоочу адамдын өзөктүк антигени (HNA) оң клеткалары аныкталды (Figure 1f). бир клетка токтомдо t-hCO уюлдук курамын изилдөө үчүн, биз дифференциялоонун болжол менен 8 ай өткөндөн кийин бир өзөктүү РНК секвенирлөө (snRNA-seq) аткарылган. Келемиштин өзөктөрүн жапырт чыпкалоо жана алып салуу 21500 жогорку сапаттагы адамдын мононуклеардык картасын түздү (сүрөт 1g жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт 4a,b). Типтүү клетка тибиндеги маркерлердин экспрессия үлгүлөрү негизги кортикалдык клетка класстарынын кластерлерин аныктады, анын ичинде терең жана үстүртөн глутаматергиялык нейрондор, айлануучу прогениторлор, олигодендроциттер жана астроциттердин тукуму (сүрөт. 1g, кеңейтилген маалыматтар, 4c-сүрөт жана кошумча таблица 3). SATB2 жана CTIP2 үчүн иммуноскоп кортикалдык субтиптердин бар экендигине карабастан, t-hCO так анатомиялык стратификацияны көрсөтпөгөнүн көрсөттү (кеңейтилген маалыматтар, 3а-сүрөт). этап менен дал келген snRNA-seq hCO кеңири окшош клетка класстарын өндүрдү, бир нече өзгөчөлүктөр менен, анын ичинде олигодендроциттердин жоктугу жана GABAergic нейрондорунун болушу, бул каптал прогенитор клеткалары үчүн мурда билдирилген жагымдуу in vitro шарттарды чагылдырышы мүмкүн (кеңейтилген маалыматтар, 4f-сүрөт - i жана кошумча). Дифференциалдык ген экспрессиясын талдоо t-hCO жана hCO ортосундагы глутаматергиялык нейрондордо олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү (Кошумча таблица 5), анын ичинде синаптикалык сигнализация, дендриттик локализация жана чыңалуу менен жабылган каналдын активдүүлүгү сыяктуу нейрондордун жетилиши менен байланышкан гендердин активдешүүсү (1h жана кошумча таблица 5). таблица 6). Демек, кортикалдык glutamatergic t-hCO нейрондор тездетилген транскрипция жетилишин көрсөттү.
t-hCO бул транскрипциялык өзгөрүүлөр hCO in vitro жана t-hCO in vivo ортосундагы морфологиялык айырмачылыктарга байланышы бар-жогун аныктоо үчүн, биз 7-8 ай дифференциациялангандан кийин курч бөлүмдөрдө этапка дал келген biocytin толтурулган hCO жана hCO ны калыбына келтирдик. hCO нейрондору (сүрөт 2а). t-hCO нейрондор кыйла чоң болгон, 1,5 эсе сома диаметри, эки эсе көп дендрит жана in vitro hCO (сүрөт. 2b) менен салыштырганда жалпы dendritic узундугунун жалпы алты эсеге өсүшү болгон. Мындан тышкары, биз hCO нейрондор (сүрөт. 2c) караганда t-hCO нейрондор менен dendritic омурткалардын бир кыйла жогорку тыгыздыгын байкалган. Бул t-hCO нейрондор клетканын жайылышын улантуу менен бирге, трансплантациялоодон кийин t-hCO интенсивдүү өсүшүнө салым кошо турган кеңири dendritic узартуу жана бутактанууга дуушар экенин көрсөтүп турат (Fig. 1d жана Extended Data Fig. 1f). Бул бизди электрофизиологиялык касиеттерин изилдөөгө түрткү берди. Мембрананын сыйымдуулугу сегиз эсе жогору болгон (кеңейтилген маалыматтар, 8d-сүрөт), эс алуу-мамлекеттик мембрана потенциалы көбүрөөк гиперполяризацияланган (болжол менен 20 мВ) жана учурдагы инъекция hCO нейрондоруна караганда t-hCO нейрондордо жогорку максималдуу дүүлүктүрүү ылдамдыгын жараткан. in vitro (сүрөт 2d), д), бул t-hCOнун чоңураак жана татаал морфологиялык өзгөчөлүктөрүнө шайкеш келет. Мындан тышкары, өзүнөн-өзү толкундануу postsynaptic учурдагы окуялардын жыштыгы (EPSC) t-hCO нейрондордо (сүрөт. 2f) кыйла жогору болгон, t-hCO нейрондор байкалган dendritic омурткалардын тыгыздыгы жогорулаган иш козголушу менен байланыштуу экенин көрсөтүп турат. жыныстык синапс. Биз hCO нейрондорунун жетиле элек мүнөзүн in vitro этикеткаланган glutamatergic нейрондорду жазуу менен ырастады (кеңейтилген маалыматтар, сүрөт 6a-c).
а, 8 ай дифференциялоодон кийин biocytin толтурулган hCO жана t-hCO нейрондорунун 3D реконструкциясы. б, морфологиялык өзгөчөлүктөрүн сандык аныктоо (n = 8 hCO нейрондор, n = 6 t-hCO нейрондор; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 жана *** P < 0.0001). б, морфологиялык өзгөчөлүктөрүн сандык аныктоо (n = 8 hCO нейрондор, n = 6 t-hCO нейрондор; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 жана *** P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б, морфологиялык өзгөчөлүктөрүн сандык аныктоо (n = 8 hCO нейрондор, n = 6 t-hCO нейрондор; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 жана *** P <0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0084，*1**0. 0,0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0084，*1**0. 0,0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б, морфологиялык өзгөчөлүктөрүн сандык аныктоо (n = 8 hCO нейрондор, n = 6 t-hCO нейрондор; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 жана *** P <0,0001).с, 8 ай дифференциялоодон кийин hCO жана t-hCO dendritic бутактарынын 3D реконструкциясы. Кызыл жылдызчалар болжолдуу дендриттик омурткаларды көрсөтөт. Dendritic омуртка тыгыздыгы сандык (n = 8 hCO нейрондор, н = 6 t-hCO нейрондор; ** P = 0.0092). г, эс мембрана дараметин сандык аныктоо (n = 25 hCO нейрондор, n = 16 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). г, эс мембрана дараметин сандык аныктоо (n = 25 hCO нейрондор, n = 16 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). г, эс кабыкча потенциал сандык (n = 25 hCO нейрондор, n = 16 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). г, эс кабыкча потенциал сандык (n = 25 hCO нейрондор, n = 16 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). e, hCO жана t-hCO кайталануучу аракет потенциалы учурдагы сайынууларды көбөйтүү менен индукцияланган жана максималдуу атуу ылдамдыгын аныктоо (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). e, hCO жана t-hCO кайталануучу аракет потенциалы учурдагы сайынууларды көбөйтүү менен индукцияланган жана максималдуу атуу ылдамдыгын аныктоо (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0.0001). e, hCO и t-hCO потенциалдык потенциалын жогорулатуу, тока жана количественная оценка максималдуу терс таасирин тийгизет (n = 25 нейрон hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <00, *** P <0,). д, аракет потенциалы hCO жана t-hCO учурдагы көбөйтүү жана максималдуу атуу ылдамдыгын сандык аныктоо менен шартталган (n = 25 hCO нейрондор, n = 16 t-hCO нейрондор; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电，以及最大放电，2，个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大（缈5个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала hCO и t-hCO, вызванное увеличение подачи тока, жана количественная оценка максимальный скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO0; ***1). д, hCO жана t-hCO аракет потенциалынын кайталануучу атуусу учурдагы камсыздоонун көбөйүшү жана максималдуу атуу ылдамдыгынын сандык көрсөткүчү (n = 25 hCO нейрон, n = 16 t-hCO нейрон; *** P < 0,0001). е, спонтандык EPSCs (sEPSCs) hCO жана t-hCO нейрондордо 8 ай дифференциациялоо, жана синаптикалык окуялардын жыштыгын сандык аныктоо (n = 25 hCO нейрондор, n = 17 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). е, HCO жана t-hCO нейрондордо Spontaneous EPSCs (sEPSCs) 8 ай дифференциациялоо жана синаптикалык окуялардын жыштыгын аныктоо (n = 25 hCO нейрондор, n = 17 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) hCO и t-hCO нейрондорунда 8 месяцев дифференцирлөө жана количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,00) . е, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) hCO жана t-hCO нейрондорунун 8 ай боюнча дифференциялоо жана сандык синаптикалык окуя курстары (n = 25 hCO нейрондор, n = 17 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频突触事件频率的CO 猄5神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频突触事件频率的5CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) нейрондук hCO жана t-hCO боюнча 8 месяцев дифференцирлөө жана количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,00). е, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) hCO жана t-hCO нейрондорунун 8 ай боюнча дифференциялоо жана сандык синаптикалык окуя курсу (n = 25 hCO нейрондор, n = 17 t-hCO нейрондор; *** P <0.0001).bf үчүн, 1208-2 саптагы hCO жана t-hCO параллелдүү сакталган бирдей дифференциялоо партиясынан алынган. g, Ген топтомун байытуу анализи (бир жактуу Фишердин так тести) t-hCO глутаматергиялык нейрондордо олуттуу жогорулатылган (түзөтүлгөн P <0,05, бүктөлмө өзгөрүү> 2, ядролордун кеминде 10% ы) (LRG) in vivo чычкан изилдөөсүнөн аныкталган активдүүлүккө көз каранды гендер 16 жана in vitro нейрондордон 17 адамга тиешелүү LRGs. g, Ген топтомун байытуу анализи (бир жактуу Фишердин так тести) t-hCO глутаматергиялык нейрондордо олуттуу жогорулатылган (түзөтүлгөн P <0,05, бүктөлмө өзгөрүү> 2, ядролордун кеминде 10% ы) (LRG) in vivo чычкан изилдөөсүнөн аныкталган активдүүлүккө көз каранды гендер 16 жана in vitro нейрондордон 17 адамга тиешелүү LRGs. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точ нейроный анализ Фишера) генов со значительной активации (корректировкаланган P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) глутаматергических нейрондык секциялар hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицирование в исследовании на мышах in vivo16, жана специфических мышах үчүн адам үчүн in vitro17. g, hCO glutamatergic нейрондор менен салыштырганда t-hCO glutamatergic нейрондордо олуттуу активдештирүү (түзөтүлгөн P <0,05, бүктөлмө өзгөрүү > 2, экспрессия) менен гендердин ген топтомун байытуу анализи (бир куйруктуу Фишердин так тести) жана кеч көз каранды (ERG) экөө тең эрте (ERG) гендин (ERG) эрте аныкталган активдүүлүгү. mice16 жана in vitro17 нейрондорунун адамга мүнөздүү LRGs. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特开LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单缧羾体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 庄 盻性 庛和 神经元 神经元 17 中 17 中 17 的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO менен значительно активизации по сравнению с глутаматергическими нейронам hCO (корректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (жок) (ERG) жана позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицирование в исследования на мышах in vivo16 жана нейронах in vitro17, специфичные адам. g, t-hCO glutamatergic нейрондор hCO glutamatergic нейрондор менен салыштырганда бир кыйла жогорулаган (түзөтүлгөн P <0.05, бүктөлгөн өзгөртүү > 2, жок эле дегенде, 10% Эрте жооп (ERG) жана кеч жооп ген байытуу талдоо (бир куйруктуу Фишердин так тести) жооп активдүүлүгүнө көз каранды гендер inRGs көз каранды гендер) нейрондор.17 Адамга тиешелүү LRGs.чекиттүү сызык 0,05 Bonferroni-түзөтүлгөн P маанисин көрсөтөт. ч, GluN ген экспрессиясы (псевдопакет жана ар бир гендин масштабы) t-hCO glutamatergic нейрондордо LRG гендердин snRNA-seq репликаларында олуттуу түрдө жогорулатылган. i, t-hCO (жогорку) жана hCO (төмөнкү) нейрондордо SCG2 экспрессиясын көрсөтүүчү иммуносток. Ак жебелер SCG2+ клеткаларын көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 25 мкм. Маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө катары көрсөтүлөт.
Ex vivo тилкелеринде байкалган t-hCO2дун активдүүлүгүнүн жогорулашынын негизинде, snRNA-seq in vitro hCO менен салыштырганда t-hCOдогу ген транскрипттеринин активдүүлүккө көз каранды жогорулашын аныктады. Glutamatergic t-hCO нейрондор чычкан жана адам neurons16,17 мурунку изилдөөлөр табылган кеч жооп ишин (сүрөт. 2g, h) жөнгө гендердин жогору билдирди. Мисалы, BDNF18, SCG2 жана OSTN, приматтарга мүнөздүү иш-аракетти жөнгө салуучу ген, hCO нейрондоруна салыштырмалуу t-hCO нейрондорунун экспрессиясын жогорулатты (сүрөт 2g-i). Ошентип, t-hCO нейрондор транскрипция, морфологиялык жана функциялык анализдер менен hCO нейрондоруна салыштырмалуу өркүндөтүлгөн жетилүү өзгөчөлүктөрүн көрсөтүштү.
t-hCO жетилүүнүн адамдын мээсинин өнүгүшү менен байланышын андан ары баалоо үчүн, биз түйүлдүктүн жана бойго жеткен кортикалдык клеткалардын түрлөрүн 19,20 жана жетилген 21,22, ошондой эле иштеп чыгуу учурунда кортикалдык гендин экспрессиясы23 боюнча кеңири маалыматтарды транскриптомдук салыштырууларды жүргүздүк (кеңейтилген маалыматтар, 5-сүрөт). ). мурунку иш 24 менен, глобалдык hCO жана t-hCO transcriptome жетилүү статусу дифференциациялоонун 7-8 айында in vivo өнүгүү убактысы менен кеңири шайкеш келет жана түйүлдүктүн кеч жашоосуна эң барабар (Extended Data Fig. 5a). Баса, биз t-hCO менен transcriptome жетилгендикти жашы менен салыштырганда байкалган HCO, ошондой эле synaptogenesis, astrogenesis жана myelination менен байланышкан transscriptome жандандыруу (кеңейтилген маалыматтар, Fig. 5b-d). Клетка деңгээлинде биз t-hCO бир ичке кортекс түрүнүн далилин таптык, глутаматергиялык нейрондордун кластерлери бойго жеткен L2 / 3, L5 жана L6 нейрондордун субтиптери менен дал келет (Figure 1i). Ал эми, glutamatergic t-hCO нейрондор менен түйүлдүктүн кортикалдык нейрондорунун ортосундагы кластердик кайчылаш кош бойлуулуктун ортосунда көбүрөөк чектелген (кеңейтилген маалыматтар, Figure 5e-j). t-hCO нейрондор адамдын төрөттөн кийинки neocortical нейрондор менен иш окшош экенин аныктоо үчүн, биз electrophysiological жазууларды жана адамдын L2 / 3 пирамидалык нейрондордун анатомиялык реконструкцияларды адамдын төрөттөн кийинки кортекстин курч бөлүмдөрүндө (кеңейтилген маалыматтар, сүрөт 7а) аткардык. L2 / 3 пирамидалык нейрондордун electrophysiological касиеттери t-hCO пирамидалык нейрондор окшош болгон (кеңейтилген маалыматтар, сүрөт. 7e). Morphologically, L2 / 3 клеткалары L2 / 3 клеткалары узун болсо да, жалпысынан көп бутактары камтылган жана жогорку омуртка тыгыздыгы болгон (сүрөт. 3g жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт. 7b-) болгон да, төрөттөн кийинки адам үлгүлөрүнүн L2 / 3 нейрондор, hCO караганда t-hCO көбүрөөк окшош болгон. G).
а, неонаталдык келемиштерге контролдук жана TS hiPS клетка линиялары тарабынан өндүрүлгөн hCO трансплантациялоо. б, 8 ай дифференциялоодон кийин biocytin толтурулган t-hCO нейрондорунун 3D реконструкциясы. с, орточо dendritic узундугу сандык (n = 19 башкаруу нейрондор, n = 21 TS нейрондор; ** P = 0.0041). г, 3D-калыбына келтирилген dendritic бутактары башкаруу жана TS t-hCO 8 ай айырмалоо, жана dendritic омуртка тыгыздыгы сандык (n = 16 башкаруу нейрондор, n = 21 TS нейрондор, *** P <0.0001). г, 3D-калыбына келтирилген dendritic бутактары башкаруу жана TS t-hCO 8 ай айырмалоо, жана dendritic омуртка тыгыздыгы сандык (n = 16 башкаруу нейрондор, n = 21 TS нейрондор, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля жана TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки жана количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольный нейронов, n = 21 TS нейронов, ***0 P <0,). г, 3D dendritic бутактары башкаруу жана t-hCO TS 8 ай айырмалоо жана dendritic омуртка тыгыздыгы сандык (n = 16 башкаруу нейрондор, n = 21 TS нейрондор, *** P <0.0001) боюнча кайра куруу. d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 （突棘 密度 ， 伈化神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля жана TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки жана количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольный нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0). г, 3D башкаруу dendritic бутактары жана TS t-hCO 8 ай айырмалоо жана dendritic омуртка тыгыздыгы сандык (n = 16 башкаруу нейрондор, n = 21 TS нейрондор, *** P <0.0001).Кызыл жылдызчалар болжолдуу дендриттик омурткаларды көрсөтөт. д, 8 ай дифференциялоодон кийин башкарууда стихиялык EPSCs жана TS t-hCO нейрондор. f, синаптикалык окуялардын жыштыгын жана амплитудасын кумулятивдүү сюжет жана сандык аныктоо (n = 32 башкаруу нейрондору, n = 26 TS нейрондору; ** P = 0.0076 жана P = 0.8102). g, hCO жана t-hCO менен TS жана башкаруу нейрондордун Scholl талдоо. Үзүлгөн сызыктар салыштыруу үчүн адам L2 / 3 төрөттөн кийинки пирамидалык нейрондорду көрсөтөт (n = 24 башкаруу t-hCO нейрондор, n = 21 TS t-hCO нейрондор, n = 8 башкаруу hCO нейрондор жана n = 7 TS hCO нейрондор). Маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө катары көрсөтүлөт
t-hCO адамдын кортексинин нейрондорунун морфологиялык жана функционалдуу өзгөчөлүктөрүн жогорку деңгээлде кайталоо мүмкүнчүлүгү бизди t-hCO оорунун фенотиптерин аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүнбү же жокпу, изилдөөгө түрткү берди. Биз нейрондордогу активдүүлүккө көз каранды ген транскрипциясын баштаган CaV1.2 коддоочу гендеги функциянын жогорулашынын мутацияларынан келип чыккан нейронүктүрүүнүн оор бузулушуна көңүл бурдук. Биз эң кеңири таралган алмаштырууну (p.G406R) жана үч башкарууну (сүрөт 3a) алып жүрүүчү үч TS пациентинен hCO алдык. Трансплантациялоодон кийин, биз TS нейрондорунун дендриттик морфологиясынын көзөмөлгө салыштырганда өзгөртүлгөнүн таптык (сүрөт. 3b жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт 8а, б), баштапкы дендриттердин санынын эки эсеге көбөйүшү жана дендриттик узундуктун орточо жана жалпы төмөндөшү (сүрөт. 3c жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт). Бул контролдук нейрондор менен салыштырганда, омурткалардын жыштыгы жана TS стихиялык EPSCs жогорулаган жыштыгы менен байланыштуу болгон (сүрөт. 3d-f жана кеңейтилген маалыматтар, Fig. 8g). Андан ары талдоо башкаруу менен салыштырганда t-hCO TS анормалдуу dendritic бутактануу үлгүлөрүн ачып, бирок in vitro TS hCO айырмалоонун окшош баскычында (сүрөт. 3g). Бул TS активдүүлүгүнө көз каранды дендриттик кичирейүү жөнүндөгү мурунку отчетторубузга шайкеш келет жана бул трансплантация платформасынын in vivo оорунун фенотиптерин аныктоо мүмкүнчүлүгүн баса белгилейт.
Андан кийин биз t-hCO клеткалары келемиш S1ге канчалык деңгээлде интеграцияланганын сурадык. Кемирүүчүлөрдөгү S1 ipsilateral ventral базалдык жана арткы thalamic ядролорунан, ошондой эле ipsilateral мотор жана орто соматосенсордук кабыкчалардан жана карама-каршы S1ден күчтүү синаптикалык киргизүүлөрдү алат (сүрөт 4a). Innervation үлгүсүн калыбына келтирүү үчүн, биз кутурма вирус-dG-GFP/AAV-G менен hCO жуктуруп, 3 күндөн кийин S1 келемишке HCO көчүрүлгөн. Биз трансплантациялоодон 7-14 күн өткөндөн кийин ipsilateral S1 жана ventral базалдык ганглиянын нейрондорунда тыгыз GFP экспрессиясын байкадык (сүрөт. 4b, с). Мындан тышкары, thalamic маркер netrin G1 антитело боёк t-hCO (сүрөт. 4d, е) менен thalamic учтары бар экенин аныктады. Бул афференттик проекциялар t-hCO клеткаларында синаптикалык жоопторду пайда кыла алабы же жокпу, баалоо үчүн, биз thalamokortic катмарынын курч бөлүктөрүндө адам клеткаларынан бүт клетка жазууларын жүргүздүк. келемиш S1 электрдик стимулдаштыруу, ички капсула, ак зат, t-hCO жакын жипчелери же t-hCO AMPA рецептор антагонист NBQX дуушар t-hCO нейрондордо кыска кечигүү EPSCs менен opsin-экспрессиялоочу таламикалык учтарынын оптогенетикалык активдештирүү. (Сүрөт 4f, g жана кеңейтилген маалыматтар, 9a-g-сүрөт). Бул маалыматтар t-hCO анатомиялык келемиш мээге интеграцияланган жана келемиш кабыл алуучу кыртыш тарабынан ишке жөндөмдүү экенин көрсөтүп турат.
а, кутурмага байкоо жүргүзүү экспериментинин схемалык диаграммасы. б, GFP жана t-hCO жана келемиштердин мээ кабыгынын (жогорку панелинин) ортосундагы адамга мүнөздүү STEM121 билдирүүсү. Ошондой эле келемиш Ipsilateral ventral базалдык ядросу (VB) (төмөнкү сол) жана ipsilateral S1 (төмөнкү оң) менен GFP сөз болуп саналат. Масштаб тилкеси, 50 мкм. Кызыл квадраттар мээнин сүрөттөр тартылган жерлерин билдирет. с, GFP билдирген клеткалардын саны (n = 4 келемиштер). d, e - t-hCO Netrin G1+ thalamic терминалдары. d t-hCO жана VB ядролорун камтыган короналдык бөлүмдү көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 2 мм. e t-hCO (солдо) жана VB (оң) нейрондордо Netrin G1 жана STEM121 экспрессиясын көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 50 мкм. Кызгылт сары чекит t-hCO чекти көрсөтөт. f, g, S1 келемиш (f) же ички капсула (g) менен (кызгылт көк) же жок (кара) NBQX (солдо) менен электрдик стимулдаштыруу кийин t-hCO нейрондордун учурдагы издери. NBQX менен жана ансыз EPSC амплитудалары (n = 6 S1 нейрондор, * P = 0,0119; жана n = 6 ички капсула нейрондор, ** P = 0,0022) (борбор). келемиш S1 (f) же ички капсула (g) (оң) электрдик стимулдаштыруу жооп EPSC көрсөтүү t-hCO нейрондорунун пайызы. aCSF, жасалма жүлүн суюктугу. ч, 2P сүрөттөө экспериментинин схемалык диаграммасы (солдо). t-hCO (ортодо) менен GCaMP6s экспрессиясы. Масштаб тилкеси, 100 мкм. GCaMP6s флуоресценттик убакыттын өтүшү (оңдо). i, стихиялуу активдүүлүктүн Z-баалы флуоресценция. j, мурутун стимулдаштыруу схемалык иллюстрация. k, бир сыноодо z баллдуу 2P флуоресценция траекториялары, мисал уячаларындагы нөл убактагы муруттун четтөөсүнө (сызык сызыгы) ылайыкташтырылган. l, бардык клеткалардын популяциянын орточо z-упайынын жооптору нөл убактагы мурутун четтөө менен шайкештирилген (үзүк сызык) (кызыл) же туш келди түзүлгөн убакыт белгилери (боз). м. Оптикалык белгилөө боюнча эксперименттин схемалык схемасы. n, чийки чыңалуу ийри t-hCO үлгүсүндөгү клеткадан көк лазер стимулдаштыруу же мурутун четтөө учурунда. Кызыл жебелер жарыктан келип чыккан (жогорку) же муруттун кыйшаюусунун (төмөнкү) натыйжасында пайда болгон биринчи тиктерди көрсөтөт. Боз көлөкө мурутун майышуу мезгилин көрсөтөт. o, Жарыктын чокусу толкун формалары жана мурутун четтөө жооптору. р, бир аракеттин тиштери, мисалдын клеткаларындагы мурутун четтөө менен шайкеш келет. 0 мурутун четтөөсүн көрсөтөт (сызык сызык). q, бардык фотосезгич клеткалар үчүн популяциянын орточо z-упайынын күйүү ылдамдыгы, нөл убакыттагы муруттун четтөөсүнө ылайыкталган (сызык сызык) (кызыл) же туш келди түзүлгөн убакыт белгилери (боз). r, мурутун четтөө менен олуттуу модуляцияланган фотосезгич бирдиктердин үлүшү (n = 3 келемиш) (солдо). Чокусу z-упай кечигүү (n = 3 келемиштер; n = 5 (ачык жашыл), n = 4 (кочкул жашыл) жана n = 4 (көк жашыл) чычканга n = 4 (көк) мурутун четтөө модуляция бирдиктери) (оңдо). Маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө катары көрсөтүлөт
Андан кийин биз t-hCO in vivo сезимдик стимулдар менен активдештирүү мүмкүнбү деп сурадык. Биз S1 келемиштерге генетикалык коддолгон кальций көрсөткүчтөрүн GCaMP6 билдирүү менен hCO трансплантациялады. 150 күндөн кийин, биз була photometry же эки фотондук кальций сүрөттү жүзөгө ашырат (сүрөт. 4h жана кеңейтилген маалыматтар, сүрөт. 10a). Биз t-hCO клеткалары синхрондоштурулган ритмикалык активдүүлүктү көрсөткөнүн таптык (Figure 4i, Кеңири маалымат, 10б-сүрөт жана Кошумча видео 1). чокусу t-hCO иш мүнөздөө үчүн, биз анестезирленген трансплантация келемиштер клеткадан тышкары electrophysiological жазууларды аткарган (кеңейтилген маалыматтар, Fig. 10c-f). Биз MRI сүрөттөрүнөн стереотаксикалык координаттарды түздүк; Ошентип, бул жазылган бирдиктер болжолдуу адамдын нейрондорун билдирет, бирок бир гана электрофизиология келип чыккан түрдү аныктоого мүмкүндүк бербейт. Биз активдүүлүктүн синхрондуу жарылууларын байкадык (кеңейтилген маалыматтар, 10-сүрөт). Жардыруулар болжол менен 460 мс созулуп, 2 секундга жакын жымжырттык мезгили менен бөлүнгөн (кеңейтилген маалыматтар, 10d, д-сүрөт). Жеке бирдиктер орто эсеп менен ар бир жарылуу үчүн үч раунд атышты, бул ар бир жарылуу үчүн катталган бирдиктердин болжол менен 73% түзөт. Жеке бирдиктердин иш-аракеттери абдан тыгыз байланышта болгон жана бул корреляция бирдей шарттарда катталган эмделбеген жаныбарларда аныкталган бирдиктерге караганда жогору болгон (кеңейтилген маалыматтар, 10f-сүрөт). Андан ары аныкталган адамдан алынган нейрондордун спик жооп мүнөздөө үчүн, биз жарыкка сезгич катиондук канал rhodopsin 2 (hChR2) туюндурган hCO менен трансплантацияланган анестезияланган келемиштер боюнча жарык теги эксперименттерди жүргүздүк, ал аркылуу t-hCO нейрондор кыска кечигүү таануу (көк жарыкка 10 мсден аз жооп). t-hCO нейрондор кальций сүрөттөө байкалган окшош жыштыктарда стихиялуу иш жарылуу көрсөттү, ошондой эле жарык белги жок t-hCO жүзөгө electrophysiological жазуулар (кеңейтилген маалыматтар, сүрөт. 10c-g). in vitro катталган hCO тиешелүү этаптарында эч кандай стихиялуу активдүүлүк байкалган эмес. t-hCO сенсордук стимулдар менен активдештирүү мүмкүнбү же жокпу, баа берүү үчүн, биз кыскача келемиштердин муруттарын t-hCO дан алыстаттык (сүрөт. 4j, m жана кеңейтилген маалыматтар, Fig. 10h, k). Мурунку изилдөөлөр 8,10 ылайык, t-hCO клеткалардын бир бөлүгү маалыматтар кокус убакыт штамптары менен салыштырганда байкалган эмес, мурутун четтөө жооп катары жогорулаган иш көрсөттү (сүрөт. 4k-q жана кеңейтилген маалыматтар, Fig. 10h-q). Чынында эле, opto-белгиленген бирдиктердин болжол менен 54% 650 мс (сүрөт. 4r) туу чокусуна, мурутун стимулдаштыруу кийин бир кыйла жогорулаган козгоо курсун көрсөттү. Чогуу алганда, бул маалыматтар t-hCO тиешелүү функционалдык киргизүүлөрдү алат жана айлана-чөйрөнүн стимулдары менен активдештирүү мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Андан кийин биз t-hCO жүрүм-турумун көзөмөлдөө үчүн келемиштердеги схемаларды иштете алаар-албасын изилдедик. Алгач биз t-hCO нейрондорунун аксондору келемиштердин курчап турган ткандарына проектисин изилдеп көрдүк. Биз hCO'ну EYFP (hChR2-EYFP) менен бириктирилген hChR2 коддоочу лентивирус менен жуктурдук. 110 күндөн кийин, биз укма, кыймылдаткыч жана somatosensory кабыкчалары, анын ичинде, ошондой эле striatum, Hippocampus жана thalamus, анын ичинде subkortical аймактарында, анын ичинде ipsilateral кортикалдык аймактарда EYFP сөз байкалган (сүрөт. 5a). Бул эфференттүү проекциялар келемиштердин клеткаларында синаптикалык жоопторду пайда кыла алаар-албасын баалоо үчүн, биз оптикалык жактан hChR2-EYFP туюндурган t-hCO клеткаларын мээнин курч бөлүктөрүндө келемиш мээ кыртыш клеткаларын жаздыруу менен активдештирдик. Көк жарык менен t-hCO аксондорун активдештирүү NBQX тарабынан бөгөттөлгөн келемиштердин пирамидалык кортекс нейрондорундагы кыска кечигүү EPSCди жаратты (сүрөт. 5b-g). Мындан тышкары, бул жооптор тетродотоксин (TTX) тарабынан бөгөттөлүшү мүмкүн жана 4-aminopyridine (4-AP) менен калыбына келтирилиши мүмкүн, алар моносинаптикалык байланыштар менен шартталган (сүрөт 5e).
а, Аксонго байкоо жүргүзүүнүн схемалык схемасы (солдо). t-hCO EYFP туюнтмасы (оңдо). Масштаб тилкеси, 100 мкм. А1, угуу кабыгы, АКК, алдыңкы кын кабыгы, г. striatum, dorsal striatum, HPC, гиппокамп; Диафрагма, каптал септум, mPFC, орто префронталдык кортекс, пири, пириформ кабыгы, v. striatum, ventral striatum, VPM, таламустун вентропостомедиалдык ядросу, VTA, ventral tegmental аймак. Кызыл квадраттар мээнин сүрөттөр тартылган жерлерин билдирет. б, стимулдаштыруу экспериментинин схемалык схемасы. c, d, Адамда (с) EYFP+ t-hCO же келемиш (г) EYFP- клеткаларындагы көк жарык менен шартталган фототоктун (жогорку) жана чыңалуу (төмөнкү) реакциясынын мисалдары. e, f, TTX жана 4-AR (жашыл), TTX (боз) же aCSF (кара) (е) менен t-hCO аксондорунун көк жарык стимулдоосунан кийин келемиш нейрондорунун учурдагы издери, (кызгылт көк) же жок (кара) ) ) NBQX (e). g, келемиш клеткаларында көк жарык менен шартталган жооптордун кечигүү (n = 16 клетка); горизонталдуу тилкелер орточо кечиктирүүнү көрсөтөт (7,13 мс) (солдо). NBQX (n = 7 клетка; *** P < 0,0001) (орто) менен же ансыз жазылган жарыкты козгогон EPSCs амплитудасы. NBQX (n = 7 клетка; *** P < 0,0001) (орто) менен же ансыз жазылган жарыкты козгогон EPSCs амплитудасы. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с же без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 клетка; *** P < 0,0001) (борбор) менен же ансыз жазылган жарык менен шартталган EPSCs амплитудасы.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с же без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 клетка; *** P < 0,0001) (борбор) менен же ансыз жазылган жарык менен шартталган EPSCs амплитудасы.Көк жарыкка жооп берген EPSCди көрсөткөн келемиш клеткаларынын пайызы (оңдо). ч, жүрүм-турум тапшырмасынын схемалык схемасы. d0, күн 0. i. Окуунун 1-күнү (солдо) же 15-күнүндө (оңдо) үлгүлүү жаныбарлардын аткарылышы. 1-күнү (солдо) же 15-күндө (оң борбордо) аткарылган жалаптардын орточо саны (n = 150 көк жарык сыноо, n = 150 кызыл жарык сыноо; *** P < 0.0001). 1-күнү (солдо) же 15-күндө (оң борбордо) аткарылган жалаптардын орточо саны (n = 150 көк жарык сыноо, n = 150 кызыл жарык сыноо; *** P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) же ден 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с синим светом; ***P <0,0001). 1-күнү (солдо) же 15-күндө (ортодо оңдо) аткарылган жалаптардын орточо саны (n = 150 көк жарык сыноо, n = 150 кызыл жарык сыноо; *** P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) же ден 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с синим светом; ***P <0,0001). 1-күнү (солдо) же 15-күндө (ортодо оңдо) аткарылган жалаптардын орточо саны (n = 150 көк жарык сыноо, n = 150 кызыл жарык сыноо; *** P < 0.0001).1-күнү (борбордо солдо) же 15-күндө (оңдо) кызыл жана көк жарык сыноолору үчүн топтолгон жалаптар. NS, маанилүү эмес. j, k, t-hCO менен көчүрүлгөн бардык жаныбарлардын жүрүм-турум өзгөчөлүктөрү hChR2-EYFP (j) же контролдоо fluorophore (k) күнү 1 же 15 (hChR2-EYFP: n = 9 келемиштер, ** P = 0.0049; контролдоо: n = 9, P = 0.19). l, Артыкчылык баллынын эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 башкаруу; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Артыкчылык баллынын эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 башкаруу; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Артыкчылык упайынын эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 башкаруу; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Артыкчылык упайларынын эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 башкаруу; **P <0,001, ***P <0,0001).m, S1 менен t-hCO оптогенетикалык активдештирүүгө жооп катары FOS туюнтмасы. FOS туюнтмасынын сүрөттөрү (солдо), жана сандык аныктоо (n = 3 топко; * P < 0,05, ** P < 0,01 жана *** P < 0,001) (оңдо) көрсөтүлгөн. FOS туюнтмасынын сүрөттөрү (солдо), жана сандык аныктоо (n = 3 топко; * P < 0,05, ** P < 0,01 жана *** P < 0,001) (оңдо) көрсөтүлгөн. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) жана количественный определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 жана *** P <0,001) (справа). FOS туюнтма сүрөттөрү (солдо) жана сандык аныктоо (n = 3 топко; * P <0.05, ** P <0.01 жана *** P <0.001) көрсөтүлгөн (оңдо).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）（右；显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）（右； Показаны изображения экспрессии FOS (слева) жана количественный определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 жана *** P <0,001) (справа). FOS туюнтма сүрөттөрү (солдо) жана сандык аныктоо (n = 3 топко; * P <0.05, ** P <0.01 жана *** P <0.001) көрсөтүлгөн (оңдо).Масштаб тилкеси, 100 мкм. Берилиштер BLA орточо ± стандарттык ката катары көрсөтүлөт, базолатералдык миндалин, MDT, dorsomedial thalamic ядросу, PAG, periaqueductal боз.
Акыр-аягы, биз t-hCO келемиштердин жүрүм-турумун модуляциялай алабы деп сурадык. Муну текшерүү үчүн биз hChR2-EYFP-экспрессирлөөчү hCO ны S1ге көчүрдүк жана 90 күндөн кийин жарык жеткирүү үчүн оптикалык булаларды t-hCO га орноттук. Биз андан кийин келемиштерди өзгөртүлгөн операнттуу кондициялоо парадигмасы менен үйрөттүк (сүрөт 5h). Биз жаныбарларды жүрүм-турум сыноо камерасына жайгаштырдык жана туш келди 5 секунддук көк (473 нм) жана кызыл (635 нм) лазердик стимулдарды колдондук. Жаныбарлар көк жарык стимулдаштыруу учурунда жалап, бирок кызыл жарык стимулдаштыруу учурунда жаламаса, суу сыйлыгын алышты. Машыгуунун биринчи күнүндө жаныбарлар көк же кызыл жарык менен стимулдаганда жалоодо эч кандай айырмачылык көрсөткөн жок. Бирок, 15-күнү, hChR2-EYFP туюнткан hCO менен көчүрүлгөн жаныбарлар кызыл жарык стимулдаштырууга салыштырмалуу көк жарык менен стимулдаганда активдүү жалап көрсөттү. Жалоо жүрүм-турумундагы мындай өзгөрүүлөр контролдук флюорофорду туюндурган hCO менен трансплантацияланган контролдоочу жаныбарларда байкалган эмес (үйрөнүү ийгилигинин деңгээли: hChR2 89%, EYFP 0%, 5i-1 жана Кошумча видео 2). Бул маалыматтар t-hCO клеткалары сыйлык издеп жүрүм-турумун стимулдаштыруу үчүн келемиш нейрондорду жандандыруу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Бул жүрүм-турумдун өзгөрүшүнө кайсы келемиштердин t-hCO нейрондук схемалары катышышы мүмкүн экенин билүү үчүн, биз 90 мүнөттөн кийин үйрөтүлгөн жаныбарларда жана жыйналган кыртыштарда t-hCO ны оптогенетикалык жактан активдештирдик. Иммуногистохимия мотивацияланган жүрүм-турумга катышкан мээнин бир нече аймактарында активдүүлүккө көз каранды FOS протеининин экспрессиясын аныктады, анын ичинде орто префронталдык кортекс, медиал таламус жана периакведукталдык боз зат, стимулдаштырылбаган контролдук жаныбарларда же жаныбарларда чагылдырылган. күрүч. 5м). Чогуу алганда, бул маалыматтар t-hCO жүрүм-турумун айдап келемиштердин нейрондук активдүүлүгүн модуляциялай алат деп болжолдойт.
Нейрондук органоиддер адамдын өнүгүүсүн жана ооруну in vitro изилдөө үчүн келечектүү системаны билдирет, бирок алар in vivo болгон схемалардын ортосундагы байланыштардын жоктугу менен чектелет. Биз жаңы платформаны иштеп чыктык, анда биз адамдын клеткасынын өнүгүшүн жана in vivo иштешин изилдөө үчүн hCO ны иммунитети төмөндөгөн эрте төрөттөн кийинки келемиштердин S1ге трансплантациялады. Биз t-hCO28 in vitro28 байкалбаган жетилген клетка түрлөрүн иштеп чыгат жана t-hCO анатомиялык жана функционалдык жактан кемирүүчүлөрдүн мээсине интеграцияланганын көрсөттүк. Кемирүүчүлөрдүн нейрондук схемаларына t-hCO интеграциясы адамдын уюлдук активдүүлүгү менен изилденген жаныбарлардын жүрүм-турумунун ортосундагы байланышты түзүүгө мүмкүндүк берди, бул t-hCO нейрондору жүрүм-турум реакцияларын кууп чыгуу үчүн келемиштердин нейрондук активдүүлүгүн модуляциялай аларын көрсөттү.
Биз сүрөттөгөн платформа адам клеткаларын кемирүүчүлөрдүн мээсине көчүрүү боюнча мурунку изилдөөлөргө караганда бир нече артыкчылыктарга ээ. Биринчиден, биз hCO ны төрөттөн кийинки эрте келемиштердин өнүгүп жаткан кортексине көчүрдүк, бул анатомиялык жана функциялык интеграцияны жеңилдетет. Экинчиден, t-hCO MRI мониторинги бизге тирүү жаныбарлардын трансплантын абалын жана өсүшүн изилдөөгө мүмкүндүк берди, бул бизге узак мөөнөттүү көп жаныбарларды изилдөөлөрдү жүргүзүүгө жана бир нече hiPS клетка линияларынын ишенимдүүлүгүн орнотууга мүмкүндүк берди. Акыр-аягы, биз адам клеткалары үчүн азыраак кыйратуучу жана келемиштердин мээсинде адамдын кортекс нейрондорунун интеграциясына жана генерациясына көмөктөшүүчү изоляцияланган бир клетка суспензияларына караганда, бүтүн органоиддерди трансплантацияладык.
Бул платформадагы жетишкендиктерге карабастан, убактылуу, мейкиндик жана түрлөр аралык чектөөлөр адамдын нейрондук схемаларынын өнүгүүнүн алгачкы этабында трансплантациядан кийин да жогорку тактык менен калыптанышына жол бербестигин моюнга алабыз. Мисалы, t-hCO байкалган стихиялуу активдүүлүк кортикалдык өнүгүү учурунда байкалган ритмикалык активдүүлүккө окшош өнүгүү фенотипти билдиреби, же бул t-hCOдо болгон басуучу клетка түрлөрүнүн жоктугунан уламбы, так эмес. Ошо сыяктуу эле, t-hCO ламинациясынын жоктугу чынжыр байланышына30 канчалык деңгээлде таасир этээри түшүнүксүз. Келечектеги иш, мисалы, адамдын microglia, адамдын эндотелий клеткалары жана GABAergic interneurons ар кандай пропорциялары катары башка клетка түрлөрүн бириктирүүгө багытталган жыйын 6 in vitro аркылуу көрсөтүлгөн, ошондой эле нейрон интеграциясы жана кайра иштетүү өзгөртүлгөн t-hCO кандай болушу мүмкүн экенин түшүнүү. бейтаптардан алынган клеткалардагы транскрипциялык, синаптикалык жана жүрүм-турум деңгээли.
Жалпысынан, бул in vivo платформа адамдын мээсинин in vitro өнүгүүсүн жана ооруларды изилдөөнү толуктай турган күчтүү ресурсту билдирет. Бул платформа бейтаптан алынган клеткаларда жаңы фенотиптерди табууга жана жаңы терапиялык стратегияларды сынап көрүүгө мүмкүндүк берет деп күтөбүз.
Биз мурда сүрөттөлгөндөй HiPS клеткаларынан hCO2.5 түздүк. Фидер катмарларында өстүрүлгөн hiPS клеткаларынан hCO өндүрүшүн баштоо үчүн, hiPS клеткаларынын бузулбаган колониялары диспазаны (0,35 мг/мл) колдонуу менен маданий идиштерден алынып салынды жана hiPS клеткасынын маданият чөйрөсү бар идиштерди камтыган өтө төмөн тиркеме пластикалык культураларга өткөрүлүп берилди. (Корнинг) эки SMAD ингибиторлору dorsomorphine (5 мкм; P5499, Sigma-Aldrich) жана SB-431542 (10 мкм; 1614, Tocris) жана ROCK ингибиторун Y-27632 (10 мкм; S1049, Selleckchem) менен толукталган. Биринчи 5 күндүн ичинде hiPS клетка чөйрөсү күн сайын өзгөртүлүп, дорсоморфин жана SB-431542 кошулган. Алтынчы күнү суспензияда нейробазал-А (10888, Life Technologies), А витамини жок B-27 кошумчасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин жана Life Technologies (1100) камтыган нейробазалык чөйрөгө нейрон сфероиддери өткөрүлдү. эпидермалдык өсүү фактору (EGF; 20 нг мл-1; R&D системалары) жана фибробласттын өсүү фактору 2 (FGF2; 20 нг мл-1; R&D системалары) 24-күнгө чейин толукталган. 25-күндөн 42-күнгө чейин чөйрө мээден алынган нейротрофиялык фактор (BD1-0) менен толукталган. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Peprotech) орточо өзгөрүүлөр менен күн сайын. Алтынчы күнү суспензияда нейробазал-А (10888, Life Technologies), А витамини жок B-27 кошумчасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин жана Life Technologies (1100) камтыган нейробазалык чөйрөгө нейрон сфероиддери өткөрүлдү. эпидермалдык өсүү фактору (EGF; 20 нг мл-1; R&D системалары) жана фибробласттын өсүү фактору 2 (FGF2; 20 нг мл-1; R&D системалары) 24-күнгө чейин толукталган. 25-күндөн 42-күнгө чейин чөйрө мээден алынган нейротрофиялык фактор (BD1-0) менен толукталган. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Peprotech) орточо өзгөрүүлөр менен күн сайын.суспензия алтынчы күнү, нейрон сpheroids Neurobasal-A (10888, Life Technologies), витамин А жок B-27 кошумча (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин камтыган нейрон чөйрөгө өткөрүлүп берилди.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) жана кошумча эпидермалдык факторлор роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) жана фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) 24-го чейин. жана стрептомицин (1:100, Life Technologies) жана эпидермалдык өсүү фактору (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) жана фибробласттын өсүү фактору 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D системалары) 24-күнгө чейин толукталган.25 күндөн 42-күнгө чейин мээден алынган нейротрофиялык фактор (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротех) жана нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротех) ортого кошулуп, чөйрөнү күн сайын алмаштырып турду.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A2生生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养的神经培养基中弈0（1） Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 нг ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（F2（F2（F Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies（维维的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 细胞 生长 2（fg2； 1；R&D Systems）直至第24天。 На 6-й деннь суспензии нейросфери жана переведение на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Life Technologies стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) жана фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6-күнү нейросфералык суспензиялар нейробазал-А (10888, Life Technologies), А витамини жок B-27 кошумчасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин менен нейтралдаштырылган Life Technologies (10888, Life Technologies), пенициллинди камтыган кошумчага которулду. эпидермалдык өсүү фактору (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) жана фибробласттын өсүү фактору 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1 менен толукталган; R&D Systems) до 24-го дня. R&D системалары) 24-күнгө чейин.25 күндөн 42 күнгө чейин, мээден алынган нейротрофиялык фактор (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротех) жана нейротрофиялык фактор 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротех) эки күндө бир жолу маданият чөйрөсүнө кошулду. Орточо бир жолу өзгөртүү.43-күндөн баштап, hCO 4-6 күн сайын орточо өзгөрүү менен кошумчаланбаган нейробазал-А чөйрөсүндө (NM; 1088022, Thermo Fisher) сакталып турду. Фидерсиз шарттарда өстүрүлгөн hiPS клеткаларынан hCO алуу үчүн, hiPS клеткалары Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) менен 7 мүнөткө 37°Cде инкубацияланган, бир клеткаларга диссоциацияланган жана AggreWell 800 пластинкаларына капталган (34815, STEMCELL Technologies 1 × 3 клеткаларында) ROCK ингибитору Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) менен толукталган Essential 8 чөйрөсү. 24 сааттан кийин, скважиналардагы медиа дорсоморфин (2,5 мкм; P5499, Сигма-Алдрих) жана SB-431542 (10 μM; 10 μM) менен толукталган Essential 6 медиасы (A1516401, Life Technologies) камтыган медиага пипетка менен ылдый жана ылдый куюлган. , Токрида). 2 күндөн 6га чейин Essential 6 чөйрөсү күн сайын дорсоморфин жана SB-431542 кошумчасы менен алмаштырылган. Алтынчы күндөн тартып нейросфералык суспензиялар нейробазалдык чөйрөгө өткөрүлүп берилген жана жогоруда айтылгандай сакталган.
Бардык жаныбарлар жол-жоболору Стэнфорд университетинин лабораториялык жаныбарларды сактоо боюнча административдик комитети (APLAC) тарабынан бекитилген жаныбарларга кам көрүү көрсөтмөлөрүнө ылайык аткарылган. Кош бойлуу euthymic RNU (rnu / +) келемиштер сатылып алынган (Charles River Laboratories) же жайгаштырылган. Жаныбарлар 12 сааттык жарык-караңгы циклде тамак-аш жана суу менен ад libitum сакталган. Үч күндөн жети күнгө чейинки жылаңач (FOXN1–/–) чычкан күчүктөрүн кырууга чейин жетиле элек муруттарынын өсүшү менен аныкталган. Күчүктөр (эркек жана ургаачы) 2-3% изофлуран менен наркоздон өтүп, стереотаксикалык рамкага жайгаштырылды. S1 ден жогору болжол менен 2-3 мм диаметри менен баш сөөгүнүн трепанациясы dura mater бүтүндүгүн сактоо менен аткарылган. Андан кийин 30-G ийнени (болжол менен 0,3 мм) краниотомиядан тышкары, дураны тешип колдонуңуз. Андан кийин HCO жука 3×3 см парафильмге сүйкөп, ашыкча чөйрөнү алып салыңыз. 23 G, 45° ийнеге тиркелген Гамильтон шприцин колдонуп, hCO ны ийненин эң алыскы учуна акырын тартыңыз. Андан кийин шприцти стереотаксикалык түзүлүшкө туташтырылган шприц насосуна орнотуңуз. Андан кийин ийненин учун мурда жасалган 0,3 мм туурасы дура тешигинин үстүнө коюп (z = 0 мм) жана шприцти 1–2 мм (z = болжол менен –1,5 мм) ийне dura mater A. ортосунда болгонго чейин тарытуу керек. тыгыз пломба пайда болот. Андан кийин шприцти кортикалдык беттин ортосуна z = -0,5 мм көтөрүңүз жана hCO ны мүнөтүнө 1-2 мкл ылдамдыкта сайыңыз. HCO инъекциясы аяктагандан кийин, ийне мүнөтүнө 0,2-0,5 мм ылдамдыкта тартылып, тери тигилет, ал эми күчүк дароо толук айыгып кеткенге чейин жылуу ысытуучу жайга жайгаштырылат. Кээ бир жаныбарлар эки тараптуу трансплантацияланган.
Жаныбарлардын бардык процедуралары Стэнфорд университетинин APLAC тарабынан бекитилген жаныбарларга кам көрүү көрсөтмөлөрүнө ылайык аткарылган. Келемиштер (трансплантациядан кийин 60 күндөн ашык) 5% изофлуран анестезиясы менен индукцияланган жана сүрөткө тартуу учурунда 1-3% изофлуран менен анестезирленген. Визуалдаштыруу үчүн, 7 Tesla жигердүү корголгон горизонталдык скважина сканери Bruker (Bruker Corp.) Эл аралык электр компаниясынын (IECO) градиент диски, AVANCE жардамы менен ички диаметри 120 мм (600 мТ/м, 1000 Т/м/с) болгон экрандалган градиент кыстаруусу колдонулган. III, сегиз каналдуу көп катушкалуу RF жана көп ядролуу мүмкүнчүлүктөр жана аны коштогон Paravision 6.0.1 платформасы. Жазуу ички диаметри 86 мм болгон активдүү ажыратылган көлөмдүү RF катушкасын жана кабыл алуу үчүн төрт каналдуу крио-муздатылган RF катушкасын колдонуу менен жүргүзүлдү. Axial 2D Turbo-RARE (кайталоо убактысы = 2500 мс, жаңырык убактысы = 33 мс, 2 орточо) 16 кесим тартуу менен, кесимдин калыңдыгы 0,6–0,8 мм, 256 × 256 үлгүнү камтыган. Сигналдар ички диаметри 2 см болгон квадратуралык трансивердин көлөмдүү RF катушкасынын жардамы менен кабыл алынган (Rapid MR International, LLC). Акырында, 3D рендеринг жана көлөмдү талдоо үчүн орнотулган Imaris (BitPlane) беттик баалоо функцияларын колдонуңуз. Ийгиликтүү трансплантация трансплантацияланган жарым шарда үзгүлтүксүз T2-салмактуу MRI сигналынын аймактары пайда болгон трансплантация катары аныкталган. Графтты четке кагуу трансплантацияланган жарым шарда үзгүлтүксүз T2-салмактуу MRI сигналынын аймактарын чыгарбаган трансплантация катары аныкталган. Subkortical t-hCO кийинки талдоо алынып салынган.
Эки фотондук кальций сүрөттөө үчүн hCO менен GCaMP6s туруктуу экспрессиялоо үчүн, hiPS клеткалары pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro менен жуктурулган, андан кийин антибиотиктерди тандоо. Кыскача айтканда, клеткалар EDTA менен диссоциацияланган жана 1 мл Essential 8 чөйрөсүндө полибрендин (5 мкг/мл) жана 15 мкл вирустун катышуусунда болжол менен 300 000 клетканын тыгыздыгында токтотулган. Андан кийин клеткалар 60 мүнөт суспензияда инкубацияланган жана ар бир скважинага 50 000 клетканын тыгыздыгы менен себилген. Кошулгандан кийин клеткалар 5-10 мкг мл-1 пуромицин менен 5-10 күн же туруктуу колониялар пайда болгонго чейин дарыланган. Курч hCO инфекциясы айрым өзгөртүүлөр менен мурда сүрөттөлгөндөй аткарылган5. Кыскача айтканда, 100 мкл нерв чөйрөсүн камтыган 1,5 мл Эппендорф микроцентрифугасынын түтүктөрүнө 30-45 hCO күн өткөрүп берүү. Андан кийин болжол менен 90 мкл чөйрө алынып, түтүккө 3-6 мкл жогорку титрлүү лентивирус (0,5 x 108ден 1,2 х 109га чейин) кошулат жана hCO 30 мүнөткө инкубаторго өткөрүлүп берилет. Андан кийин ар бир түтүккө 90–100 мкл чөйрөнү кошуп, түтүктөрдү түнү бою инкубаторго кайтарыңыз. Кийинки күнү, аз тиркеме плиталардын жаңы нерв орто үчүн hCO өткөрүп берүү. 7 күндөн кийин, hCO визуализация жана инфекциянын сапатын баалоо үчүн 24 көзөнөктүү айнек түбүнө көчүрүлдү. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE жана pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder тарабынан түзүлгөн. Lentivirus көпчүлүк эксперименттерде колдонулат, анткени ал кабыл алуучу геномго интеграцияланган жана инфекцияланган клетка линияларында кабарчы генинин экспрессиясына мүмкүндүк берет. Кутурмага байкоо жүргүзүү үчүн 30-45-күнү hCO кутурма-ΔG-eGFP жана AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмид №67528, Addgene) менен ко-инфекцияланган, 3 күн бою жакшылап жууп, S1-жылы келемиштерге трансплантацияланган жана 7 күн бою сакталган.
Иммуноцитохимия үчүн жаныбарлар анестезирленген жана PBS менен транскардиалдык түрдө перфузияланган, андан кийин 4% параформальдегид (PBSдеги PFA; Электрондук микроскопия илимдери). Мээлер 4% PFA менен 2 саатка же 4°C түнү бою фиксацияланды, 30% сахарозада PBSте 48-72 саат криоконсервацияланды жана 1:1, 30% сахарозага киргизилди: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) жана coron aμm 0 m секциясын колдонуу менен жасалган. (Leica). Калың бөлүмдөрдүн иммуногистохимиясы үчүн жаныбарларга PBS куюлуп, мээ 300–400 мкм тешиктен ажыратылып, вибратомдун (Leica) жардамы менен короналдык кесилиштерге бөлүнгөн жана бөлүмдөр 4% PFA менен 30 мүнөткө бекитилген. Андан кийин криосекциялар же калың бөлүктөрү PBS менен жууп, бөлмө температурасында 1 саатка (10% нормалдуу эшек сывороткасы (NDS) жана 0,3% Triton X-100 PBSте суюлтулган) бөгөттөлгөн жана 4°C блокировка эритмеси менен тосулган. – Инкубационнай криосекциялар түндө инкубацияланды жана калың секциялар 5 күн инкубацияланды. Негизги антителолор колдонулган: анти-NeuN (чычкан, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (келемиш, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (коён, 1:1,000; Z0334, Dako), анти-GFP, G1900, G1700; GeneTex), анти-HNA (чычкан, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (коён, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (коён, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (коён, H408:2PA); Антителолор), анти-RECA-1 (чычкан, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (коён, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (эчки, 1:500; AF3075, R&D системалары), Netrin, R1610; Системалар), анти-STEM121 (чычкан, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (чычкан, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (коён, 1:400; ABN904, Millipore) жана анти-IBA1 (goat, ab170;). Негизги антителолор колдонулган: анти-NeuN (чычкан, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (келемиш, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (коён, 1:1,000; Z0334, Dako), анти, GFP (chick, G1700; GeneTex), анти-HNA (чычкан, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (коён, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (коён, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (коён, H408:2PA); Антителолор), анти-RECA-1 (чычкан, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (коён , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (эчки, 1:500; AF3075, R&D системалары), Netrin, G011; R&D системалары), анти-STEM121 (чычкан, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (чычкан, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (коён, 1:400; ABN904, Millipore) жана анти-IBA1, ab701; abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:10PG), анти-GFAP (кроличьи, ZZ034), анти; (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200, анти-PDGFRA, anti-PDGFRA (кролик, 1:200, anti-Sc3P7) (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, R3500; нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/640N; Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Негизги антителолор колдонулган: анти-NeuN (чычкан, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (келемиш, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (коён, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (тоок, GTX170;1, GTX170); анти-HNA (чычкан, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (коён, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (коён, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (коён, H1907; At19207); анти-RECA-1 (чычкан, 1:50; ab9774, abcam), анти- SCG2 (коён, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (эчки, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (тек, R16:16) STEM121 (чычкан, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (чычкан, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (коён, 1:400; ABN904, Millipore) жана анти-IBA1 (эчки, abkam, 1:150).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D системалары），Netrin G1a（山羊（山羊6（6，1:11 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４抗1: 200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊；AF；110D,1:10 Системалар）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (чычкан, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (коён, 1:400; ABN904, Millipore) жана анти-IBA1 (эчки, 1:100; ab5076, abcam)。Негизги антителолор колдонулган: анти-NeuN (чычкан, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (келемиш, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (коён, 1:1000; Z0334, Dako). , анти-GFP (тоок, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (чычкан, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (коён, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA ( коён, C33:20, sc18; анти-PPP1R17 (коён, 1:200; HPA047819, Atlas антитело), ​​анти-RECA-1 (чычкан, 1:50; ab9774, abcam), анти- SCG2 (коён), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200, Takara, Y40410) 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) жана анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (эчки, 1:500; AF3075, R&D системалары), Netrin G1a (эчки, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (чычкан, 1:200; Takaramo, Anti-Biouse), 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (коён, 1:400; ABN904, Millipore) жана анти-IBA1 (эчки, 1:100; ab5076, abkam).Бөлүмдөр андан кийин PBS менен жууп, экинчилик антитело менен 1 саатка бөлмө температурасында (тоңдурулган бөлүмдөр) же 4°Cде түнү бою инкубацияланган (калың бөлүмдөр). Блоктоочу эритмеде 1:1000 суюлтулган Alexa Fluor экинчилик антителосу (Life Technologies) колдонулган. PBS менен жуугандан кийин, ядролор Hoechst 33258 (Life Technologies) менен көрүлгөн. Акырында, слайддар Aquamount (Polysciences) жардамы менен капталдары бар микроскопко (Fisher Scientific) жайгаштырылды жана сүрөттө Keyence флуоресценттик микроскобу (BZ-X анализатору) же Leica TCS SP8 конфокалдык микроскобу (Las-X) менен анализденди. Сүрөттөр ImageJ программасы (Фиджи) аркылуу иштетилген. t-hCO жана келемиш кортексиндеги адам нейрондорунун үлүшүн аныктоо үчүн, 387,5 мкм туурасы тик бурчтуу сүрөттөр t-hCO борборунда, келемиш кабыгынын четинде же четинде алынган. Графтык чектер кыртыштын ачыктыгынын, HNA+ ядролорунун жана/же кыртыштын автофлуоресценциясынын өзгөрүшүнө баа берүү аркылуу аныкталган. Ар бир сүрөттө NeuN+ жана HNA+ клеткаларынын жалпы саны ошол эле аймактагы NeuN+ клеткаларынын жалпы санына бөлүнгөн. Сүрөттүн тегиздигинде ядросу бар клеткалар гана саналаарын камсыз кылуу үчүн эсептөөгө Hoechst+ болгон клеткалар гана киргизилет. Статистикалык катаны азайтуу үчүн, жок дегенде 1 мм менен бөлүнгөн эки сүрөт орточо алынган.
Үлгү чогултууга бир жума калганда, сенсордук стимулдаштырууну азайтуу үчүн мурутун кесилген караңгы бөлмөгө hCO трансплантациялоочу жаныбарларды (болжол менен 8 ай дифференциялоо) коюңуз. Ядролорду изоляциялоо мурда айтылгандай, кээ бир өзгөртүүлөр менен аткарылган. Кыскача айтканда, t-hCO жана hCO жуучу-механикалык клетка лизиси жана 2 мл айнек кыртышын жаргылчакты (D8938, Sigma-Oldrich/KIMBLE) колдонуу менен жок кылынды. Андан кийин чийки ядролор 40 мкм фильтрди колдонуу менен чыпкаланган жана сахарозанын тыгыздыгынын градиентинин аткарылышынан мурун 320 гда 10 мүнөт 4 °Cде центрифугаланган. Центрифугалоо кадамынан кийин (4°Cде 20 мүнөткө 320 г) үлгүлөр 0,04% BSA/PBS ичинде 0,2 бирдик мкл-1 RNase ингибиторунун (40 u μl-1, AM2682, Ambion) кошулушу менен кайра суспензияланган жана 40 мкл фильтрден өткөрүлгөн. Андан кийин диссоциацияланган ядролор 0,02% BSA камтыган PBS-де кайрадан суспензияга алынып, Chromium Single Cell 3′ чипине жүктөлгөн (болжол менен ар бир тилкеде 8000 клетканын калыбына келиши). snRNA-seq китепканалары Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) менен даярдалган. snRNA-seq китепканалары Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) менен даярдалган. Библиотеки snRNA-seq менен приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq китепканалары Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) аркылуу даярдалган. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) snRNA-seq библиотеку. snRNA-seq китепканасы Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) менен даярдалган.Ар түрдүү үлгүлөрдөгү китепканалар NovaSeq S4 (Illumina) боюнча Admera Health тарабынан бириктирилген жана тизмеленген.
Ар бир болжолдуу өзөктүк штрих-код үчүн ген экспрессиясынын деңгээли 10x Genomics CellRanger талдоо программалык пакетинин (версия 6.1.2) жардамы менен сандык бааланган. Тактап айтканда, окуулар mkref буйругу менен түзүлгөн адамдын (GRCh38, Ensemble, версия 98) жана келемиштердин (Rnor_6.0, Ensemble, версия 100) шилтеме геномдорунун айкалышы менен дал келген жана сандык эсептөө үчүн –include-introns=TRUE буйругу менен колдонулган, интрон аймактарына түшүрүлгөн окууларды камтыйт. t-hCO үлгүлөрү үчүн адамдын өзөктөрү бардык картага түшүрүлгөн окуулардын кеминде 95% адамдын геномуна дал келүүсү боюнча консервативдүү талаптын негизинде аныкталган. Бардык кийинки анализдер R пакетин (4.1.2 версиясы) Seurat (4.1.1 версиясы)32 колдонуу менен CellRangerден чыпкаланган штрих-код массивинде аткарылды.
Кийинки талдоодо бир гана жогорку сапаттагы ядролор камтылганын камсыз кылуу үчүн ар бир үлгү үчүн итеративдик чыпкалоо процесси ишке ашырылган. Биринчиден, 1000ден аз уникалдуу гендер табылган жана жалпы митохондриялардын 20% дан ашыгы менен сапатсыз ядролор аныкталат жана алынып салынат. Кийинчерээк, чийки гендердин санынын матрицасы sctransform(vst.flavor=”v2″) функциясын колдонуу менен регуляризацияланган терс биномдук регрессия жолу менен нормалдаштырылган, ал ошондой эле демейки параметрлерди колдонуу менен 3000 эң өзгөрүлмө генди аныктаган. Өлчөмдү азайтуу жогорку өзгөрмө гендерде демейки өлчөмдөрдүн (Principal Set Component) демейки өлчөмдүү маалыматтарын колдонуу менен аткарылган. 30 (dims = 30 тизе участокторун визуалдык текшерүүнүн негизинде тандалып алынган жана бардык үлгүлөр жана ансамблдик анализдер үчүн колдонулган) Андан кийин гендерди анормалдуу төмөн (10 пайыздан төмөн медиана), анормалдуу жогорку гендик санга (идентификациялык 9 пайыздан жогору) классификациялоо үчүн итеративдик кластерлөөнүн бир нече айлампасын аткардык (резолюция = 1). төмөн сапаттагы кластерлер жана/же шектүү эгиздердин жогорку үлүшү DoubletFinder33 пакетинин жардамы менен аныкталган жогоруда.
Төмөн сапаттагы ядролорду алып салгандан кийин, интегралдык берилиштер топтому топтоштурулган (резолюция = 0,5) жана UMAP34 визуалдаштыруу максаттары үчүн киргизилген. Ар бир кластер үчүн маркер гендер нормалдаштырылган ген экспрессия маалыматтарынан эсептелген демейки параметрлери менен FindMarkers функциясын колдонуу менен аныкталган. Биз түйүлдүктүн жана чоңдордун кортикалдык маалымдама топтомун маркер генинин экспрессиясы 19,20,21,35 жана аннотация менен айкалыштыруу аркылуу негизги клетка класстарын аныктап, классификациялайбыз. Атап айтканда, жүгүртүүдөгү прекурсорлор MKI67 жана TOP2A туюнтмасы менен аныкталган. Прогенитордук кластерлер митоздук транскрипттердин жоктугу, кеч метафаза түйүлдүктүн кортексинде сүрөттөлгөн multipotent глиалдык прогенитордук кластерлер менен жогорку дал келүү жана EGFR жана OLIG1 экспрессиясы менен аныкталган. Биз астроцит терминин астроциттердин дифференциациясынын бир нече абалын, кеч радиалдык глиядан астроциттердин жетилишине чейин колдонобуз. Astrocyte кластерлери SLC1A3 жана AQP4 жогорку деңгээлдерин билдирет жана түйүлдүктүн радиалдык глиясынын жана/же чоңдор астроциттеринин субтиптери менен картага көрсөтүлдү. OPCs PDGFRA жана SOX10, ал эми олигодендроциттер миелиндөө маркерлерин (MOG жана MYRF) билдирет. Глутаматергиялык нейрондор нейрондук транскрипттердин (SYT1 жана SNAP25) болушу, GABAergic маркерлеринин (GAD2) жоктугу жана NEUROD6, SLC17A7, BCL11B же SATB2 билдирүүлөрү менен аныкталган. GluN нейрондор андан ары жогорку (SATB2 туюнтмасы жана BCL11B жоготуу) жана терең (BCL11B экспрессиясы) субкласстарга бөлүнгөн. Болжолдуу субплита (SP) нейрондору терең GluN маркерлеринен тышкары ST18 жана SORCS1 сыяктуу белгилүү SP18 маркерлерин билдирет. Choroid плексус сымал клеткалар TTR экспрессиясы менен аныкталган, ал эми менингеалдык клеткалар фибробласт менен байланышкан гендерди жана маалымдама маалымат топтомунун карталанган пиал/кан тамыр клеткаларын билдирген.
t-hCO жана hCO субкласстарынын ортосундагы ген экспрессиясынын дифференциалдык анализи Libra R пакетин (1.0.0 версиясы) колдонуу менен ишке ашырылган үлгүлөрдөгү жаңыдан иштелип чыккан псевдо-пакет ыкмасын колдонуу менен жүргүзүлдү. Тактап айтканда, ар бир үлгү репликациясы үчүн берилген клетка классы үчүн клеткалардагы гендердин санын кошуу жолу менен топтор үчүн edgeR журналынын ыктымалдык тесттери (3.36.0 версиясы, R пакети) аткарылган. Жылуулук картасынын визуализациясы үчүн нормалдаштырылган миллиондо (CPM) маанилер edgeR (cpm() функциясы) жана масштабдуу (орточо = 0, стандарттык четтөө = 1ге жетүү үчүн) менен эсептелет. Ген Онтологиясы (GO) кыйла жогорулатылган t-hCO GluN гендерин байытуу талдоо жүргүзүлдү (Бенджамини-Хочберг t-hCO GluN клеткаларынын 10% дан кем эмесинде көрсөтүлгөн 0,05тен кем P маанисин оңдоду жана өзгөрүүнүн 2 эседен кем эмес эсеге көбөйүшү). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 аркылуу аткарылган. Биз ToppFun колдонмосун демейки параметрлери менен колдонобуз жана GO-аннотацияланган гипергеометриялык тесттерден эсептелген Бенжамин-Хочберг тарабынан оңдолгон P-баалуулуктарын билдиребиз.
Биздин snRNA-seq кластерлерибизди негизги бир клеткалуу РНК-секв же бойго жеткен snRNA-seq19,20,21,22 шилтеме изилдөөлөрүндөгү аннотацияланган клетка кластерлери менен дал келтирүү үчүн, биз жупташкан берилиштер топтомун интеграциялоо ыкмасын колдондук. Биз Seurat'та SCTransform (v2) нормалдаштыруу иш процессин маалымат топтомдорунун ортосундагы кластердин кайталануусун интеграциялоо жана салыштыруу үчүн колдондук (жогоруда айтылгандай эле параметрлерди колдонуу менен). Эсептөөнүн натыйжалуулугу үчүн жеке маалымат топтомдору кокусунан 500гө чейин уячага же өзөккө чейин кошулган. Мурда сүрөттөлгөндөй окшош ыкманы колдонуу менен, кластердин кайталанышы шилтеме кластердин энбелгиси менен кабатталган ар бир бириктирилген кластердеги клеткалардын же ядролордун үлүшү катары аныкталган. GluNлерди андан ары классификациялоо үчүн, биз GluN клеткаларыбызга маалымдама берилиштер топтомун энбелгилерин ыйгаруу үчүн Seurat's TransferData иш агымын GluN топтомунун маалыматтары үчүн колдондук.
t-hCO жана hCO үлгүлөрүнүн глобалдык транскриптомунун жетилүү абалына баа берүү үчүн биз жасалма жапырт үлгүлөрүбүздү адамдын мээсинин өнүгүшүн камтыган чоң РНК ырааттуулугунан турган BrainSpan/psychENCODE23 менен салыштырдык. Кортикалдык үлгүлөрдөн 10 жумадан кийин жана кийинчерээк, мурун BrainSpan кортикалдык үлгүлөрүндө активдүү деп аныкталган 5567 гендерде (биздин маалыматтарыбыз менен) (кубдук моделди колдонуу менен жаш менен түшүндүрүлгөн өнүгүү дисперсиясында 50% дан жогору деп аныкталган) PCA үлгүсү нормалдаштырылган ген экспрессия матрицасында PCA жүргүздүк. Мындан тышкары, биз мурда сүрөттөлгөндөй терс эмес матрицалык факторизацияны колдонуу менен нейронүктүрүүнүн негизги транскриптомдук кол тамгалары менен байланышкан гендерди алдык. Терс эмес матрицаны факторизациялоо процедурасын колдонуу менен эсептелген үлгү салмактары 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. Zhu et al.38 сүрөттөгөн беш колдун ар бири үчүн кеңейтилген маалыматтар менен 5b. Дагы, активдүүлүккө көз каранды транскрипциялык маркерлер мурда жарыяланган изилдөөлөрдөн алынган. Атап айтканда, ERG жана LRG 3-таблицадан Hrvatin et al.16 визуалдык стимулдоодон кийин чычкандын көрүү кортексинин snRNA-seq коллекциясы менен аныкталган глутаматергиялык нейрондордо бир кыйла жогорулатылган. Адам менен байытылган LRGs KCl менен активдештирилген адамдын түйүлдүктүн мээ маданияттарынан алынган жана стимуляциядан кийин 6 сааттан кийин жыйналган жана чыпкаланган гендер кемирүүчүлөрдө эмес, адамдарда кыйла жогорулаган (Кошумча таблица 4). Бул ген топтомдорун колдонуу менен ген топтомун байытуунун анализи бир тараптуу Фишердин так тестинин жардамы менен аткарылган.
isoflurane менен келемиштерди Anesthetize, мээлерди алып салуу жана муздак (болжол менен 4 ° C) кычкылтектелген (95% O2 жана 5% CO2) сахароза эритмесин камтыган бөлүмдөр үчүн: 234 мМ сахароза, 11 мМ глюкоза, 26 мМ NaHCO3, 25M .K25m. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 жана 0,5 mM CaCl2 (болжол менен 310 мОсм). t-hCO камтыган келемиш мээнин короналдык бөлүмдөрү (300–400 мкм) мурда39 сүрөттөлгөндөй Leica VT1200 vibratome аркылуу жасалган. Андан кийин бөлүмдөр 10 мМ глюкоза, 26 мМ NaHCO3, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 мМ CaCl26mOl (2 мМ CaCl26mOl) даярдалган aCSF камтыган үзгүлтүксүз бөлмө температурасында кычкылтектөө менен секциялык камерага өткөрүлдү. жазуудан 45 мүнөт мурун. Бөлүмдөр тынымсыз aCSF (95% O2 жана 5% CO2 флакон) менен куюлган чөмүлгөн камерада жазылган. Бардык маалыматтар бөлмө температурасында жазылган. t-hCO нейрондор 127 мМ калий глюконаты, 8 мМ NaCl, 4 мМ магний ATP, 0,3 мМ натрий GTP, 10 мМ HEPES жана 0,6 мМ HEPES камтыган эритме менен толтурулган боросиликат айнек пипетка менен аяктады, ички 0,6, pOH2 менен жөнгө салынды, KOH2. (290 мОсм). Калыбына келтирүү үчүн жазуу эритмесине биоцитин (0,2%) кошулган.
Маалыматтар MultiClamp 700B күчөткүчүнүн (Молекулярдык түзмөктөр) жана Digidata 1550B цифралоочусунун (Молекулярдык түзмөктөр) жардамы менен алынган, 2 кГц жыштыкта ​​төмөн өткөргүчтүү чыпкаланган, 20 кГцде санариптештирилген жана Clampfit (Молекулярдык түзмөктөр), Origin (OriginPro) аркылуу талданган. 2021b, OriginLab). жана ыңгайлаштырылган MATLAB функциялары (Mathworks). Туташуунун потенциалы JPCalc менен эсептелген жана жазуулар -14 мВ эсептелген мааниге туураланган. IV операция -250дөн 750 пАга чейинки 10-25 pA кадамдардагы учурдагы кадамдардын сериясынан турат.
Таламус, ак зат жана S1 afferents, мурда айтылгандай, hCO нейрондордун жамаачы-кыскыч жазуусу учурунда thalamokortic тилкелерде электрдик стимулдаштырылган. Кыскача айтканда, мээ 10 ° бурч менен кыйшайган 3D басып чыгаруу үстөлүнө жайгаштырылган жана мээнин алдыңкы бөлүгү 35 ° бурч менен кесилген. Мээ андан кийин кесилген бетине жабыштырылып, thalamokortic чыгып турган аксондорду сактап, кесилген. Биполярдык вольфрам электроддору (0,5 MΩ) экинчи микроманипуляторго орнотулуп, ар бир клетканын төрт аймагын (ички капсула, ак зат, S1 жана hCO) стимулдаштыруу үчүн стратегиялык жактан жайгаштырылган. 0,03-0,1 Гц 300 мкА фазалык стимулдоодон кийин синаптикалык жоопторду жазыңыз.
hChR2 экспрессиялоочу hCO нейрондору 480 нмде активдештирилди жана LED (Prizmatix) тарабынан түзүлгөн жарык импульстары клеткалардын жанында hChR2 экспрессиясын жаздыруу үчүн ×40 объектисинде (0,9 НА; Olympus) колдонулду. Жарыктанган талаа диаметри болжол менен 0,5 мм жана жалпы кубаттуулугу 10-20 мВт. Импульстун туурасы 10 мс деп коюлду, бул жүрүм-турумду үйрөнүү экспериментинин жүрүшүндө берилген импульске туура келет. Ар кандай стимулдаштыруу жыштыктары колдонулган, 1ден 20 Гцге чейин, бирок сандык аныктоо үчүн сериянын биринчи импульсу гана колдонулган. Поезддердин ортосундагы интервалдар синаптикалык ингибитордук же жеңилдетүүчү жолдорго таасирин азайтуу үчүн, адатта, 30 секунддан ашат. hChR2 жооп моносинаптикалык экенин текшерүү үчүн, биз EPSC реакция жоголуп чейин ваннага TTX (1 μM) колдонулат, андан кийин 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) колдонулат. Эреже катары, жооп бир нече мүнөттүн ичинде кайтарылып берилет, LED күйгүзүү жана EPSC генерациясынын ортосунда бир аз узагыраак кечигүү. NBQX (10 μM) жооп AMPA кабылдагычтар менен шартталган же жокпу, текшерүү үчүн колдонулган.
Sharp hCO бөлүмдөрү мурда сүрөттөлгөндөй түзүлгөн. Кыскача айтканда, hCO бөлүктөрү 4% агарозага киргизилип, 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 жана d-lucos (M) кесилген клеткаларга өткөрүлдү. Leica VT1200 вибраторунун жардамы менен бөлмө температурасында 200–300 мкм жана бөлмө температурасында ASFде сакталат. Андан кийин, түз SliceScope микроскопунун (Scientifica) астында hCO бөлүмдөрүндө бүт клеткалардын патч-лагердик жазуусу жүргүзүлдү. Бөлүмдөр aCSF (95% O2 жана 5% CO2) менен перфузияланган жана клетка сигналдары бөлмө температурасында жазылган. hCO нейрондор 127 мМ калий глюконаты, 8 мМ NaCl, 4 мМ магний ATP, 0,3 мМ натрий GTP, 10 мМ HEPES жана 0,6 мМ EGTA камтыган эритме менен толтурулган боросиликатты айнек пипеткасын колдонуу менен колдонулган. 290). Калыбына келтирүү максатында ички эритмеге 0,2% Биоцитин кошуңуз.
Маалыматтар Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) тарабынан MultiClamp 700B күчөткүч (Молекулярдык түзмөктөр) жана Digidata 1550B цифралоочу (Молекулярдык түзмөктөр) аркылуу алынды, 2 кГц чыпкалоодон өткөн төмөн өткөрүмдүүлүк, 20 кГц жыштыкта ​​санариптештирүү жана Clamp10 үчүн анализдөө (версиясы). түзмөктөр) жана ыңгайлаштырылган MATLAB функциялары (MATLAB 2019b, Mathworks). Туташуу потенциалы JPCalc менен эсептелген жана жазуулар -14 мВ эсептелген түйүн потенциалына туураланган. IV операция -50дөн 250 пАга чейинки 5-10 pA кадамдардагы учурдагы кадамдардын сериясынан турат.
Кысылган нейрондорду морфологиялык реконструкциялоо үчүн ички эритмеге 0,2% биоцитин (Сигма-Олдрих) кошулган. Клеткалар хакердик чабуулдан кийин 15 мүнөттөн кем эмес мөөнөткө даярдалат. Андан соң пипетка 1-2 мүнөткө акырындык менен тартылып, катталган кабыкча толук жабылганга чейин тартылат. Бөлүмдүн физиологиялык процедурасынан кийин бөлүмдөр түнү бою 4°C температурада 4% PFA менен бекитилип, PBS X3 менен жууп, 1:1000 стрептавидин менен конъюгацияланган DyLight 549 же DyLight 405 (Vector Labs) менен суюлтулган. Биоцитин менен толтурулган клеткалар (2%; Сигма-Олдрих) бөлмө температурасында 2 саат бою патч клапанды жазуу учурунда маркировкаланган. Андан кийин бөлүмдөр Aquamount (Thermo Scientific) жардамы менен микроскопиялык слайддарга орнотулуп, эртеси күнү Leica TCS SP8 конфокалдык микроскопунда сандык апертурасы ×40 1,3, чоңойтуусу ×0,9–1,0, xy менен майга чөмүлүүчү объективди колдонуу менен визуализацияланды. Үлгү алуу ылдамдыгы микрон үчүн болжол менен 7 пикселди түзөт. 1 мкм аралыкта Z-стектери сериялык түрдө алынган жана ар бир нейрондун дендритикалык дарагын бүтүндөй жабуу үчүн z-стек мозаикасы жана Leica негизиндеги авто тигүү аткарылган. Андан кийин нейрондор neuTube 40 интерфейсинин жардамы менен жарым кол менен көзөмөлдөнүп, SWC файлдары түзүлдү. Андан кийин файлдар SimpleNeuriteTracer41 Fiji плагинине жүктөлгөн (ImageJ, версия 2.1.0; NIH).
Стэнфорд университетинин институттук кароо кеңеши тарабынан бекитилген протоколго ылайык адамдын кортикалдык кыртыштары маалымдалган макулдук менен алынган. Адамдын төрөттөн кийинки ткандарынын эки үлгүсү (3 жана 18 жаштагы) рефрактердик эпилепсияга операциянын алкагында маңдай кабыгынын (орто фронталдык гирус) резекциясы аркылуу алынган. Резекциядан кийин ткандарды муздай муздак NMDG-aCSFде жыйноо: 92 мМ NMDG, 2,5 мМ KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 мМ NaHCO3, 20 мМ HEPES, 25 мМ глюкоза, 2 мМба5, 3 мМ натрий пируваты, 0,5 мМ CaCl2 4H2O жана 10 мМ MgSO4 7H2O. Концентрацияланган туз кислотасы менен рН 7,3-7,4 чейин титрленет. Кыртыштар 30 мүнөттүн ичинде лабораторияга жеткирилип, жогоруда айтылган жол-жоболор боюнча короналдык секциялар алынды.
Жаныбарлардын бардык процедуралары Стэнфорд университетинин APLAC тарабынан бекитилген жаныбарларга кам көрүү көрсөтмөлөрүнө ылайык аткарылган. Келемиштер (трансплантациядан кийин 140 күндөн ашык) 5% изофлуран анестезиясы менен индукцияланган жана операция учурунда 1-3% изофлуран менен анестезияланган. Жаныбарлар стереотаксикалык рамкага (Kopf) жайгаштырылып, туруктуу бошогон бупренорфин (SR) тери астына сайылган. Баш сөөк ачылып, тазаланып, 3-5 сөөк бурамасы салынат. t-hCO максаттуу үчүн, биз MRI сүрөттөрүнөн стереотаксикалык координаттарды түздүк. Кызыккан жерде бурр тешик бургуланган жана жипчелер (диаметри 400 мкм, NA 0,48, Дорик) hCO2 бетинен 100 мкм ылдый түшүрүлүп, баш сөөккө UV нуру менен айыккан стоматологиялык цемент (Relyx) менен бекемделген.
Була фотометрикалык жазуулар мурда сүрөттөлгөндөй аткарылган42. Спонтандык активдүүлүктү жазуу үчүн келемиштер таза капаска жайгаштырылды жана оптикалык оптикалык фотометрикалык маалыматтарды алуу системасына туташтырылган диаметри 400 мкм була-оптикалык патч кабели (Дорик) имплантацияланган оптикалык була кабелине туташтырылды. Кыймыл аракетин 10 мүнөткө созулган жазуу учурунда жаныбарлар клетканы изилдөөгө эркин болушкан. Ойготулган активдүүлүктү эсепке алуу үчүн келемиштер (трансплантациядан кийин 140 күндөн ашык) индукция үчүн 5% изофлуран жана тейлөө үчүн 1-3% изофлуран менен анестезияланган. стереотактикалык алкагында (Kopf) жаныбарды жайгаштыруу жана t-hCO карама-каршы жагында муруттары болжол менен 2 см кыркылган жана piezoelectric кыймылдаткыч (PI) менен байланышкан тор аркылуу өтүп жатат. 400 мкм була-оптикалык патч кабели (Дорик) имплантацияланган булага туташтырылган жана маалыматтарды алуу тутумуна туташтырылган. Андан кийин t-hCO карама-каршы тарабындагы мурутчалар 20 мүнөттүк жазуу мезгилинин ичинде пьезоэлектрдик диск аркылуу туш келди убакта 50 жолу (20 Гц 2 мм, ар бир көрсөтүү үчүн 2 сек) бурулду. Ыңгайлаштырылган MATLAB коду менен четтөө убактысын көзөмөлдөө үчүн Arduino MATLAB колдоо пакетин колдонуңуз. Окуялар транзистордук-транзистордук логикалык (TTL) импульстарын колдонуу менен маалыматтарды алуу программалык камсыздоосуна синхрондоштурулат.
Келемиштер (трансплантациядан кийин 140 күндөн ашык) 5% изофлуран анестезиясы менен индукцияланган жана операция учурунда 1-3% изофлуран менен анестезияланган. Жаныбарлар стереотаксикалык рамкага (Kopf) жайгаштырылып, бупренорфин СР жана дексаметазон тери астына сайылган. Баш сөөк ачылып, тазаланып, 3-5 сөөк бурамасы салынат. t-hCO максаттуу үчүн, биз MRI сүрөттөрүнөн стереотаксикалык координаттарды түздүк. А тегерек craniotomy (болжол менен 1 см диаметри) көчүрүлгөн HCO түздөн-түз үстүнөн жогорку ылдамдыктагы бургулоо менен аткарылган. Сөөк мүмкүн болушунча ичке болгондон кийин, бирок бүт сөөктү бургулоодон мурун, негизги t-hCO ачып берүү үчүн калган бүтүн жамбаш дискти алып салуу үчүн кычкачты колдонуңуз. Краниотомия стерилдүү туз менен толтурулуп, баш сөөккө UV нуру менен айыктырылган стоматологиялык цемент (Реликс) менен каптал жана атайын баш төөнөгүч бекитилди.
Эки фотондук сүрөт Nikon LWD (×16, 0,8 NA) объектиси менен Bruker мультифотондук микроскоптун жардамы менен аткарылган. GCaMP6 сүрөттөө 920 нмде 1,4x бир z-тегиздик чоңойтуу жана 8x орточо 7,5 кадр/сек менен аткарылган. Келемиштер 5% изофлуран анестезиясы менен индукцияланган жана 1-3% изофлуран менен сакталган. Келемиштер атайын жасалган баш арматурага жайгаштырылып, линзанын астына жайгаштырылды. Мотор активдүүлүгүнүн 3 мүнөттүк фондук жазуусу алынды. Жазуунун 20 мүнөтүнүн ичинде пикопрайзердин жардамы менен 50 пуф (ар бир презентация 100 мс узундукта) туш келди түрдө t-hCO каршысындагы мурутчага жеткирилди. Ыңгайлаштырылган MATLAB коду менен жарылуу убактысын көзөмөлдөө үчүн Arduino MATLAB колдоо пакетин колдонуңуз. TTL импульстарын колдонуп, маалыматтарды алуу программасы (PrairieView 5.5) менен окуяларды синхрондоштуруу. Талдоо үчүн сүрөттөр Фиджиде башталган MoCo программасында аффиндик коррекцияны колдонуу менен xy кыймылы үчүн коррекцияланган. CNMF-E43 аркылуу айрым клеткалардан флуоресценттик издерди алуу. Флуоресценция ар бир кызыккан аймак үчүн алынып, dF/F ийри сызыктарына айландырылып, андан кийин z-упайларына айландырылды.
Келемиштер (трансплантациядан кийин 140 күндөн ашык) 5% изофлуран анестезиясы менен индукцияланган жана операция учурунда 1-3% изофлуран менен анестезияланган. Жаныбарлар стереотаксикалык рамкага (Kopf) жайгаштырылып, бупренорфин СР жана дексаметазон тери астына сайылган. t-hCO карама-каршы тарабындагы муруттар болжол менен 2 см кесип жана пьезоэлектрдик кыймылдаткычка туташтырылган тор аркылуу сайылган. Баш сөөк ачыкка чыгып, тазаланат. Баш сөөккө дат баспас болоттон жасалган бурамасы бекитилет. t-hCO максаттуу үчүн, биз MRI сүрөттөрүнөн стереотаксикалык координаттарды түздүк. t-hCO эле жогору жогорку ылдамдыктагы бургулоо менен тегерек craniotomy (болжол менен 1 см диаметри) жүзөгө ашырат. Сөөк мүмкүн болушунча ичке болгондон кийин, бирок бүт сөөктү бургулоодон мурун, негизги t-hCO ачып берүү үчүн калган бүтүн жамбаш дискти алып салуу үчүн кычкачты колдонуңуз. Жеке клеткалар 32-канал же 64-канал жогорку тыгыздыктагы кремний зонддору (Кембридж Neurotech) жерге бурамалар менен негизделген жана RHD күчөткүчтөр (Intan) менен алдын ала күчөтүү аркылуу жазылган. Стерилдүү туз менен толтурулган craniotomy аркылуу максаттуу сайтка электроддорду түшүрүү үчүн манипуляторду колдонушат. Маалыматтарды чогултуу Open Ephys маалыматтарды алуу тутумун колдонуу менен 30 кГц жыштыкта ​​аткарылды. Жазуу 10дон ашык каналда жогорку корреляцияланган ритмикалык стихиялуу активдүүлүктү байкаганыбызда гана уланды, бул электроддор трансплантацияда (эки фотондук кальций сүрөттөө маалыматтарынын негизинде) жайгашканын көрсөтүп турат. Мотор активдүүлүгүнүн 10 мүнөттүк фондук жазуусу алынган. Андан кийин t-hCO карама-каршы тарабындагы мурутчалар 20 мүнөттүк жазуу мезгилинин ичинде пьезоэлектрдик диск аркылуу туш келди убакта 50 жолу (20 Гц 2 мм, ар бир көрсөтүү үчүн 2 сек) бурулду. Arduino үчүн MATLAB колдоо пакетин (MATLAB 2019b) колдонуу менен, ыңгайлаштырылган MATLAB коду менен четтөө убактысын көзөмөлдөө. Окуяларды маалымат алуу программасы менен синхрондоштуруу үчүн TTL импульстарын колдонуңуз.
Оптикалык белгилөө эксперименттери үчүн 473 нм лазерге (Омикрон) туташтырылган 200 мкм оптикалык патч шнур (Дорик) краниотомияга коюлган 200 мкм оптикалык булага туташтырылган. Буга чейин дароо секирүү күчүн 20 мВтка тууралаңыз. Стерилдүү туз менен толтурулган craniotomy аркылуу максаттуу сайтка электроддорду түшүрүү үчүн манипуляторду колдонушат. Жазуунун башталышында 473 нм жарыктын он импульсу (жыштыгы 2 Гц, импульстун узактыгы 10 мс) чыгарылды. Фотосезгич клеткалар сыноолордун 70% же андан көп бөлүгүндө жарыктын 10 мс ичинде кескин реакция көрсөткөн клеткалар катары аныкталган.