Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Суюк биопсиясы (LB) тез биомедициналык тармагында популярдуулукка ээ болгон түшүнүк болуп саналат.Концепция негизинен клеткадан тышкаркы ДНКнын (ccfDNA) айлануудагы фрагменттерин аныктоого негизделген, алар негизинен ар кандай ткандарда клетка өлгөндөн кийин майда фрагменттер түрүндө бөлүнүп чыгат.Бул фрагменттердин бир аз бөлүгү чет өлкөлүк (чет өлкөлүк) ткандардан же организмдерден келип чыгат.Учурдагы ишибизде биз бул концепцияны деңиз суусун чыпкалоо жөндөмдүүлүгү менен белгилүү болгон мидияларга колдондук.Биз деңиз жээгиндеги экосистемалардын биологиялык ар түрдүүлүгү жөнүндө маалымат берүү үчүн ар кандай булактардан экологиялык ДНК фрагменттерин басып алуу үчүн мидиялардын табигый чыпка катары иштөө жөндөмүн колдонобуз.Биздин натыйжалар мидия гемолимфасында 1ден 5 кбга чейин өлчөмү ар кандай ДНК фрагменттери бар экенин көрсөтүп турат.Мылтыктын секвенирлөө ДНК фрагменттеринин көп сандагы чет элдик микробдордон экенин көрсөттү.Алардын ичинен биз бактериялардын, археялардын жана вирустардын ДНК фрагменттерин таптык, анын ичинде жээктеги деңиз экосистемаларында көп кездешүүчү ар кандай хостторду жуктуруп алган вирустар.Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөөбүз мидияларга карата колдонулган LB түшүнүгү деңиз жээгиндеги экосистемалардагы микробдук ар түрдүүлүк жөнүндө билимдин бай, бирок али изилдене элек булагы экенин көрсөтүп турат.
Климаттын өзгөрүшүнүн (CC) деңиз экосистемаларынын биологиялык ар түрдүүлүгүнө тийгизген таасири изилдөөнүн тездик менен өсүп жаткан аймагы болуп саналат.Глобалдык жылуулануу маанилүү физиологиялык стресстерди гана жаратпастан, ошондой эле деңиз организмдеринин жылуулук туруктуулугунун эволюциялык чегин түртүп, бир катар түрлөрдүн жашоо чөйрөсүнө таасирин тийгизип, аларды жагымдуу шарттарды издөөгө түртөт [1, 2].Метазоандардын биологиялык ар түрдүүлүгүнө таасирин тийгизгенден тышкары, CC хост-микробдук өз ара аракеттенүүнүн назик балансын бузат.Бул микробдук дисбактериоз деңиз экосистемалары үчүн олуттуу коркунуч туудурат, анткени ал деңиз организмдерин инфекциялык козгогучтарга көбүрөөк сезгич кылат [3, 4].SS глобалдык деңиз экосистемаларын башкаруу үчүн олуттуу көйгөй болуп саналган массалык өлүмдө маанилүү ролду ойнойт деп эсептелет [5, 6].Бул көптөгөн деңиз түрлөрүнүн экономикалык, экологиялык жана азыктык таасирин эске алганда маанилүү маселе.Бул өзгөчө полярдуу аймактарда жашаган кош капкалууларга тиешелүү, мында ККнын таасири тезирээк жана катуу болот [6, 7].Чынында, Mytilus spp сыяктуу кош капкалуу.ККнын деңиз экосистемасына тийгизген таасирин көзөмөлдөө үчүн кеңири колдонулат.Алардын ден соолугун көзөмөлдөө үчүн салыштырмалуу көп сандагы биомаркерлер иштелип чыкканы таң калыштуу эмес, көбүнчө ферменттик активдүүлүккө же клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүнө жана фагоциттик активдүүлүккө негизделген функционалдык биомаркерлерди камтыган эки баскычтуу ыкманы колдонуу менен [8].Бул ыкмалар деңиз суусунун чоң көлөмүн сиңиргенден кийин жумшак ткандарда топтолгон басымдын өзгөчө көрсөткүчтөрүнүн концентрациясын өлчөөнү да камтыйт.Бирок эки капкалуулардын жогорку чыпкалоо жөндөмдүүлүгү жана жарым ачык кан айлануу системасы суюк биопсиянын (ЛБ) концепциясын колдонуу менен жаңы гемолимфа биомаркерлерин иштеп чыгууга мүмкүнчүлүк берет, пациентти башкаруунун жөнөкөй жана минималдуу инвазивдик ыкмасы.кан үлгүлөрү [9, 10]. Дени сак адамдарда ccfDNA концентрациясы адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ар кандай патологиялардан жапа чеккен же стресске дуушар болгон бейтаптарда 5-10 эсеге көбөйүшү мүмкүн, натыйжада кыртыш бузулат. Дени сак адамдарда ccfDNA концентрациясы адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ар кандай патологиялардан жапа чеккен же стресске дуушар болгон бейтаптарда 5-10 эсеге көбөйүшү мүмкүн, натыйжада кыртыш бузулат. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), бирок мүмкүн повышаться в 5-10 раз у различной патологиясы же подвергающихся стресске, приводящему к повреждению тканей. Дени сак адамдарда cccDNA концентрациясы адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ал ар кандай патологиясы бар пациенттерде же ткандардын бузулушуна алып келген стрессте 5-10 эсеге көбөйүшү мүмкүн.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мЛ），但在患有各中，ccfDNA加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 戗可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA абдан аз (<10 нг/мл) адамдар үчүн, бирок 5-10 раз у пациентов менен ар кандай оорулар же стресстер, аны кабыл алышы мүмкүн. ccfDNA концентрациясы дени сак адамдарда адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ар кандай патологиясы же стресс менен ооруган бейтаптарда 5-10 эсеге көбөйүшү мүмкүн, натыйжада кыртыш бузулат.ccfDNA фрагменттеринин өлчөмү ар кандай, бирок, адатта, 150 200 BP чейин өзгөрөт.[12].Өзүнөн алынган ccfDNA талдоо, башкача айтканда, ccfDNA нормалдуу же өзгөртүлгөн кабыл алуучу клеткалардан, ядролук жана/же митохондриялык геномдо болгон генетикалык жана эпигенетикалык өзгөрүүлөрдү аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн, ошону менен клиниктерге конкреттүү молекулярдык-максаттуу терапияны тандоого жардам берет [13].Бирок, ccfDNA кош бойлуулук учурунда түйүлдүктүн клеткаларынан ccfDNA сыяктуу чет элдик булактардан же трансплантацияланган органдардан алынышы мүмкүн [14,15,16,17].ccfDNA ошондой эле инфекциялык агенттин (чет элдик) нуклеиндик кислоталарынын бар экендигин аныктоо үчүн маалыматтын маанилүү булагы болуп саналат, ал кан культуралары менен аныкталбаган кеңири жайылган инфекцияларды инвазивдүү эмес аныктоого мүмкүндүк берет, инфекцияланган ткандардын инвазивдүү биопсиясы [18].Акыркы изилдөөлөр чындыгында адамдын канында вирустук жана бактериялык козгогучтарды аныктоо үчүн колдонула турган бай маалымат булагы бар экенин жана адамдын плазмасында табылган ccfDNAнын 1%га жакыны чет элдиктер экенин көрсөттү [19].Бул изилдөөлөр организмдин айлануучу микробиомасынын биологиялык ар түрдүүлүгүн ccfDNA анализинин жардамы менен баалоого болорун көрсөтүп турат.Бирок, жакынкы убакка чейин бул түшүнүк адамдарда гана колдонулуп, азыраак даражада башка омурткалуу жаныбарларда колдонулуп келген [20, 21].
Бул макалада биз LB потенциалын Aulacomya atra ccfDNA талдоо үчүн колдонобуз, адатта субантарктикалык Кергулен аралдарында кездешүүчү түштүк түр, 35 миллион жыл мурун пайда болгон чоң платонун үстүндөгү аралдардын тобу.вулкандын атырылып чыгышы.In vitro эксперименталдык системаны колдонуу менен биз деңиз суусындагы ДНК фрагменттери мидиялар тарабынан бат эле кабыл алынып, гемолимфа бөлүмүнө кирерин таптык.Мылтыктын тизилиши мидия гемолимфасынын ccfDNAсында өзүнө таандык жана өзүнөн башка ДНК фрагменттерин, анын ичинде симбиотикалык бактерияларды жана муздак вулкандык деңиз жээгиндеги экосистемаларга мүнөздүү биомдордун ДНК фрагменттерин камтыганын көрсөттү.Гемолимф ccfDNA ошондой эле ар кандай хост диапазонундагы вирустардан алынган вирустук тизмектерди камтыйт.Сөөктүү балыктар, актиниялар, балырлар жана курт-кумурскалар сыяктуу көп клеткалуу жаныбарлардын ДНК фрагменттерин да таптык.Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөө LB концепциясын деңиз экосистемаларында бай геномдук репертуарды түзүү үчүн деңиз омурткасыздарына ийгиликтүү колдонсо болорун көрсөтүп турат.
Чоңдор (узундугу 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) жана Aulacomya atra (A. atra) Порт-о-Франстын (049°21.235 S, 070°13.490 E.) аралык аскалуу жээктеринен чогултулган.Кергулен аралдары 2018-жылдын декабрь айында. Башка бойго жеткен көк мидиялар (Mytilus spp.) коммерциялык камсыздоочудан (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард аралы, Канада) алынган жана 10–20 L 32‰ жасалма туздуу эрин камтыган температурасы көзөмөлдөнүүчү (4°C) газдалган резервуарга салынган.(жасалма деңиз тузу Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, АКШ).Ар бир эксперимент үчүн жеке кабыктардын узундугу жана салмагы өлчөнгөн.
Бул программа үчүн акысыз ачык мүмкүндүк протоколу онлайн режиминде жеткиликтүү (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Кыскача айтканда, LB гемолимфа сүрөттөлгөндөй уурдоочу булчуңдардан чогултулган [22].Гемолимфа 3 мүнөт 1200 × г центрифугалоо жолу менен тазаланды, үстүнкү зат колдонууга чейин тоңдурулган (-20°C).cfDNAны изоляциялоо жана тазалоо үчүн үлгүлөр (1,5-2,0 мл) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык NucleoSnap cfDNA комплекти (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) менен эритүү жана иштетилди.ccfDNA андан ары талдоо чейин -80 ° C сакталган.Кээ бир эксперименттерде ccfDNA QIAamp ДНК изилдөөчү комплекти (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) аркылуу изоляцияланган жана тазаланган.Тазаланган ДНК стандарттык PicoGreen анализи аркылуу сандык аныкталды.Бөлүнгөн ccfDNA фрагменттеринин бөлүштүрүлүшү Жогорку сезгичтүү ДНК комплектинин жардамы менен Agilent 2100 биоанализеринин (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) жардамы менен капиллярдык электрофорез аркылуу талданды.Анализ өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык ccfDNA үлгүсүнүн 1 мкл колдонулуп аткарылган.
Гемолимфа ccfDNA фрагменттерин секвенирлөө үчүн Génome Québec (Монреал, Квебек, Канада) Illumina MiSeq PE75 комплектинин Illumina DNA Mix комплектин колдонуу менен мылтык китепканаларын даярдады.Стандарттык адаптер (BioO) колдонулган.Чийки маалымат файлдары NCBI Sequence Read Archive'ден (SRR8924808 жана SRR8924809) жеткиликтүү.Негизги окуу сапаты FastQC [23] аркылуу бааланган.Trimmomatic [24] адаптерлерди кесүү жана сапатсыз окуу үчүн колдонулган.Учтары жупташкан мылтык окуулары дал келбөө үчүн FLASH эң аз 20 бит кайталанган узунураак жалгыз окууларга бириктирилген [25]. Бириктирилген окуулар BLASTN менен кош капкалуу NCBI Таксономиясынын маалымат базасын (e мааниси <1e−3 жана 90% гомология) колдонуу менен аннотацияланган жана татаалдыгы аз ырааттуулуктарды маскалоо DUST [26] аркылуу аткарылган. Бириктирилген окуулар BLASTN менен кош капкалуу NCBI Таксономиясынын маалымат базасын (e мааниси <1e−3 жана 90% гомология) колдонуу менен аннотацияланган жана татаалдыгы аз ырааттуулуктарды маскалоо DUST [26] аркылуу аткарылган. Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 жана 90% гомологии), а маскирование кийинчерээк [2018-жылдын 6-апрелинде] көп нерсе талап кылынган. Топтолгон окуулар NCBI кош капкалуу таксономиясынын маалымат базасын (e мааниси < 1e-3 жана 90% гомология) колдонуу менен BLASTN менен аннотацияланган жана DUST [26] аркылуу аз татаалдыктагы ырааттуулукту маскалоо аткарылган.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读合并的读合并的读合并的读）读读读低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 读数 合并 读数 使用 双掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование кийинчерээк [DU62006/2018-жылдын 2-июлунда. Топтолгон окуулар NCBI кош капкалуу таксономикалык маалымат базасын (e мааниси <1e-3 жана 90% гомология) колдонуу менен BLASTN менен аннотацияланган жана DUST [26] аркылуу аз татаалдыктагы ырааттуулукту маскалоо аткарылган.Окуулар эки топко бөлүндү: кош капкалуу ырааттуулукка байланыштуу (бул жерде өз алдынча окуулар деп аталат) жана байланышсыз (өз алдынча окулбагандар).Контигдерди түзүү үчүн MEGAHIT аркылуу эки топ өзүнчө чогултулган [27].Ошол эле учурда, келгин микробиомалардын таксономиялык бөлүштүрүлүшү Kraken2 [28] аркылуу классификацияланган жана графикалык түрдө Галактикадагы Krona тегерек диаграммасы менен көрсөтүлгөн [29, 30].Оптималдуу кмерлер биздин алдын ала эксперименттерибизден kmer-59 болуп аныкталды. Андан соң өз алдынча контигдер акыркы аннотация үчүн BLASTN (эки капталдуу NCBI маалымат базасы, e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) менен тегиздөө аркылуу аныкталган. Андан соң өз алдынча контигдер акыркы аннотация үчүн BLASTN (эки капталдуу NCBI маалымат базасы, e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) менен тегиздөө аркылуу аныкталган. Затем собственные контиги були идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Кийинчерээк өз алдынча контигдер акыркы аннотация үчүн BLASTN (NCBI кош капкалуу маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен дал келүү аркылуу аныкталган.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем були идентификациялоону собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Андан кийин BLASTN (NCBI эки капкалуу маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен дал келүү аркылуу акыркы аннотация үчүн өз алдынча контигдер аныкталган. Параллелдүү, өз алдынча топтун контигдери BLASTN менен аннотацияланган (nt NCBI маалымат базасы, e мааниси <1e−10 жана 60% гомология). Параллелдүү, өз алдынча топтун контигдери BLASTN менен аннотацияланган (nt NCBI маалымат базасы, e мааниси <1e−10 жана 60% гомология). Параллельно чужеродные групповые контиги жана аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллелдүү, чет элдик топ контигдери BLASTN (NT NCBI базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен аннотацияланган.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重非参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重非参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллелдүү, өз алдынча эмес топ контигдери BLASTN менен аннотацияланган (nt NCBI маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология). BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq протеининин NCBI маалымат базаларын (e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) колдонуу менен өз алдынча контигтерде жүргүзүлгөн. BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq протеининин NCBI маалымат базаларын (e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) колдонуу менен өз алдынча контигтерде жүргүзүлгөн. BLASTX ошондой эле проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr жана RefSeq NCBI (значение e <1e-10 жана гомология 60%). BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq NCBI протеиндик маалымат базаларын (e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) колдонуу менен өзүн-өзү эмес контигтерде аткарылган.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr жана RefSeq NCBI (значение e <1e-10 жана гомология 60%). BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq NCBI протеин маалымат базаларын (e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) колдонуу менен өзүн-өзү эмес контигтерде аткарылган.BLASTN жана BLASTX өз алдынча контигдердин бассейндери акыркы контигдерди билдирет (Кошумча файлды караңыз).
ПТР үчүн колдонулган праймерлер S1 таблицада келтирилген.Taq ДНК полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA максаттуу гендерди күчөтүү үчүн колдонулган.Реакциянын төмөнкү шарттары колдонулду: 95°С 3 мүнөт, 95°С 1 мүнөт, 1 мүнөткө күйгүзүү температурасы, 72°C 1 мүнөткө узартуу, 35 цикл жана акырында 72°С 10 мүнөт ичинде..ПТР продуктулары SYBRTM Коопсуз ДНК Гель тагы (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) камтыган агароздук гелдерде (1,5%) 95 В деги электрофорез менен бөлүнгөн.
Мидиялар (Mytilus spp.) 500 мл кычкылтектүү деңиз суусуна (32 PSU) 24 саат бою 4°C температурада көнүп калышты.Флаконго 190 мкг/мкл акыркы концентрациясында адамдын галектин-7 cDNA ырааттуулугун коддоочу кошумчаны камтыган плазмиддик ДНК (NCBI кошулуу номери L07769) кошулду.ДНК кошулбастан бирдей шарттарда инкубацияланган мидиялар көзөмөлгө алынган.Үчүнчү контролдоочу цистернада мидиясыз ДНК болгон.Деңиз суусунун ДНКсынын сапатын көзөмөлдөө үчүн, көрсөтүлгөн убакытта ар бир резервуардан деңиз суусунун үлгүлөрү (20 мкл; үч кайталоо) алынган.Плазмиддик ДНКга байкоо жүргүзүү үчүн LB мидиялары көрсөтүлгөн убакта жыйналып, qPCR жана ddPCR менен анализденди.Деңиз суусунун тузунун жогорку курамына байланыштуу, аликвоттар бардык ПТР анализдеринин алдында ПТР сапаттагы сууда (1:10) суюлтулган.
Санариптик тамчы ПТР (ddPCR) BioRad QX200 протоколун колдонуу менен аткарылган (Миссиссауга, Онтарио, Канада).Оптималдуу температураны аныктоо үчүн температура профилин колдонуңуз (таблица S1).Тамчылар QX200 тамчы генераторун (BioRad) колдонуу менен түзүлгөн.ddPCR төмөнкүдөй жүргүзүлдү: 95°C 5 мүнөт, 50 цикл 95°C 30 с жана берилген күйдүрүү температурасы 1 мүнөт жана 72°C 30 с, 4°C 5 мүнөт жана 90°C 5 мүнөт ичинде.Тамчылардын саны жана оң реакциялар (көчүрмөлөрдүн саны/мкл) QX200 тамчы окугучтун (BioRad) жардамы менен өлчөнгөн.10 000 тамчыдан аз болгон үлгүлөр четке кагылды.Үлгү башкаруу ddPCR иштетилген сайын аткарылган эмес.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) жана LGALS7 спецификалык праймерлери менен аткарылган.Бардык сандык ПТРлер QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) аркылуу 20 мклде аткарылган.qPCR 95°C температурада 15 мүнөттүк инкубациялоо менен, андан кийин 95°C температурада 10 секундага жана 60°C температурада 60 секундага бир маалымат чогултуу менен 40 цикл менен башталды.Эрүү ийри 95 ° C 5 сек, 65 ° C 60 сек жана qPCR аягында 97 ° C ырааттуу өлчөөлөр аркылуу түзүлгөн.Ар бир qPCR контролдук үлгүлөрдү кошпогондо, үч нускада аткарылган.
Мидиялар жогорку фильтрация ылдамдыгы менен белгилүү болгондуктан, биз адегенде алар деңиз суусунда болгон ДНК фрагменттерин чыпкалап, сактап кала аларын изилдедик.Бул фрагменттердин жарым-жартылай ачык лимфа системасында топтолбогону да бизди кызыктырды.Биз бул маселени көк мидия цистерналарына кошулган эрүүчү ДНК фрагменттеринин тагдырына байкоо жүргүзүү менен эксперименталдык түрдө чечтик.ДНК фрагменттерине байкоо жүргүзүүнү жеңилдетүү үчүн биз адамдын галектин-7 генин камтыган чет элдик (өзү эмес) плазмиддик ДНКны колдондук.ddPCR деңиз сууларында жана мидияларда плазмиддик ДНК фрагменттерин издейт.Биздин натыйжалар көрсөткөндөй, эгерде мидиялар жок болгон учурда убакыттын өтүшү менен (7 күнгө чейин) деңиз суусунун курамындагы ДНК фрагменттеринин саны салыштырмалуу туруктуу бойдон калса, мидиялар болгон учурда бул деңгээл 8 сааттын ичинде дээрлик толугу менен жоголуп кеткен (1а,б-сүрөт).Экзогендик ДНКнын фрагменттери 15 мүнөттүн ичинде интравалвулярдык суюктукта жана гемолимфада оңой табылган (сүрөт 1c).Бул фрагменттерди экспозициядан кийин дагы 4 саатка чейин аныктоого болот.ДНК фрагменттерине карата бул чыпкалоо активдүүлүгү бактериялардын жана балырлардын чыпкалоо активдүүлүгүнө окшош [31].Бул жыйынтыктар мидиялар чыпкалап, суюктук бөлүмдөрүндө бөтөн ДНКны топтой аларын көрсөтүп турат.
ddPCR менен өлчөнгөн мидия бар (A) же жок (B) деңиз суусунда плазмиддик ДНКнын салыштырмалуу концентрациясы.А-да жыйынтыктар 75 жана 25-проценттильди билдирген кутучалардын чек аралары менен пайыздар менен көрсөтүлөт.Орнотулган логарифмдик ийри сызык кызыл түс менен көрсөтүлүп, боз түстө көлөкөланган аймак 95% ишеним аралыгын билдирет.B-де кызыл сызык орточо маанини, ал эми көк сызык концентрация үчүн 95% ишеним аралыгын билдирет.С Плазмиддик ДНКнын плазмиддик ДНК кошулгандан кийин ар кандай мезгилде мидиялардын гемолимфасында жана клапан суюктугунда топтолушу.Натыйжалар аныкталган абсолюттук көчүрмөлөр/мл (±SE) катары көрсөтүлөт.
Андан кийин, биз антропогендик таасири чектелген алыскы аралдардын тобу болгон Кергулен аралдарында мидия төшөктөрүнөн чогултулган мидияларда ccfDNA келип чыгышын изилдедик.Бул максатта мидия гемолимфаларынан cccDNA изоляцияланган жана адамдын cccDNAсын тазалоо үчүн кеңири колдонулган ыкмалар менен тазаланган [32, 33].Мидиялардагы орточо гемолимфа ccfDNA концентрациялары мл гемолимфа диапазонунда төмөн микрограммда экенин аныктадык (S2 таблицасын караңыз, Кошумча маалымат).Бул концентрация диапазону дени сак адамдарга караганда алда канча чоң (миллитрге төмөн нанограмма), бирок сейрек учурларда рак менен ооруган бейтаптарда ccfDNA деңгээли миллилитрге бир нече микрограммга жетиши мүмкүн [34, 35].Гемолимфтик ccfDNAнын өлчөмдүк бөлүштүрүлүшүн талдоо бул фрагменттердин өлчөмү боюнча 1000 биттен 1000 битке чейин ар кандай экенин көрсөттү.5000 битке чейин (2-сүрөт).Окшош натыйжалар кремний диоксидиге негизделген QIAamp Investigator Kit аркылуу алынды, бул ыкма криминалистикалык илимде геномдук ДНКны аз концентрациялуу ДНК үлгүлөрүнөн, анын ичинде ccfDNA [36] менен тез бөлүп алуу жана тазалоо үчүн колдонулат.
Мидия гемолимфасынын ccfDNA өкүлү электрофореграммасы.NucleoSnap Plasma Kit (жогорку) жана QIAamp ДНК изилдөөчү комплекти менен алынган.B Мидияларда гемолимфа ccfDNA концентрациясынын (±SE) бөлүштүрүлүшүн көрсөткөн скрипка сюжети.Кара жана кызыл сызыктар тиешелүүлүгүнө жараша медиананы жана биринчи жана үчүнчү квартилди билдирет.
Адамдардагы жана приматтардагы ccfDNAнын болжол менен 1% чет элдик булакка ээ [21, 37].
Адамдарда ядролук да, митохондриялык ДНК да канга чыгышы мүмкүн [38].Бирок, бул изилдөөдө мидиялардын ядролук геномдук ДНКсын майда-чүйдөсүнө чейин сүрөттөп берүү мүмкүн болгон жок, анткени A. atra геному секвенирленбеген же сүрөттөлгөн эмес.Бирок, биз эки капкалуу китепкананы колдонуу менен өзүбүздүн бир катар ccfDNA фрагменттерин аныктай алдык (сүрөт S2, Кошумча маалымат).Биз ошондой эле секвенирленген ошол A. atra гендерин багытталган ПТР күчөтүү жолу менен өзүбүздүн ДНК фрагменттеринин бар экендигин тастыктадык (3-сүрөт).Ошо сыяктуу эле, A. atraнын митохондриялык геному коомдук маалымат базаларында бар экенин эске алсак, A. atra гемолимфасында митохондриялык ccfDNA фрагменттеринин бар экендигине далилдерди табууга болот.Митохондриялык ДНК фрагменттеринин болушу ПЦР күчөтүү жолу менен тастыкталган (3-сүрөт).
Ар кандай митохондриялык гендер A. atra (кызыл чекиттер – запас номери: SRX5705969) жана M. platensis (көк чекиттер – запас номери: SRX5705968) гемолимфасында ПЦР менен күчөгөн.Сүрөт Breton et al., 2011 ылайыкташтырылган. B FTA кагазында сакталган A. atraдан алынган гемолимфа супернатантын күчөтүү.ПТР аралашмасын камтыган ПТР түтүкчөсүнө түздөн-түз кошуу үчүн 3 мм пуансонду колдонуңуз.
Деңиз суусунун курамындагы микробдордун көптүгүн эске алып, биз алгач гемолимфадагы микробдук ДНК ырааттуулугун мүнөздөөгө көңүл бурдук.Бул үчүн биз эки башка стратегияны колдонобуз.Биринчи стратегияда Kraken2 колдонулган, алгоритмге негизделген ырааттуулукту классификациялоо программасы микробдук тизмектерди BLAST жана башка инструменттер менен салыштырылуучу тактык менен аныктай алат [28].6719дан ашык окуу бактериялык деп аныкталган, ал эми 124 жана 64 архея жана вирустардан болгон (4-сүрөт).Эң көп бактериялык ДНК фрагменттери Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) жана Bacteriidetes (17%) болгон (4а-сүрөт).Бул бөлүштүрүү деңиз көк мидия микробиомасынын мурунку изилдөөлөрүнө шайкеш келет [39, 40].Гаммапротеобактериялар протеобактериялардын негизги классы болгон (44%), анын ичинде көптөгөн Vibrionales (сүрөт 4б).ddPCR ыкмасы A. atra гемолимфанын ccfDNAсында Vibrio ДНК фрагменттеринин бар экендигин тастыктады (сүрөт 4c) [41].ccfDNA бактериялык келип чыгышы жөнүндө көбүрөөк маалымат алуу үчүн, кошумча ыкма кабыл алынган (сүрөт. S2, Кошумча маалымат). Бул учурда, кабатталган окуулар жупташкан окуулар катары чогултулуп, BLASTN жана e мааниси 1e−3 жана >90% гомология менен кесүү аркылуу өз алдынча (эки капкалуу) же өзүнөн өзү келип чыккан деп классификацияланган. Бул учурда, кабатталган окуулар жупташкан окуулар катары чогултулуп, BLASTN жана e мааниси 1e−3 жана >90% гомология менен кесүү аркылуу өз алдынча (эки капкалуу) же өзүнөн өзү келип чыккан деп классификацияланган. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и был классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) же чужие по происхождению с использованием BLASTN жана значения с гомей 190-%. Бул учурда, бири-бирин кайталаган окуулар жупташкан окуулар катары чогултулуп, BLASTN жана e мааниси 1e-3 жана >90% гомология менен кесүү аркылуу жергиликтүү (эки капкалуу) же оригиналдуу эмес деп классификацияланган.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值0%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 嚄用 嚄甌和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами жана классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) же несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN ологи и 19%. Бул учурда, бири-бирин кайталаган окуулар жупташкан окуулар катары чогултулуп, e BLASTN жана 1e-3 маанилери жана гомология босогосу >90% колдонуу менен өздүк (эки капталдуу) же оригиналдуу эмес деп классификацияланды.A. atra геному али секвенирлене элек болгондуктан, биз MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ассемблеринин де novo чогултуу стратегиясын колдондук.Бардыгы болуп 147 188 контиг көз каранды (кош капталдуу) катары аныкталган.Бул контигтер андан кийин BLASTN жана BLASTX аркылуу 1e-10 электрондук маанилери менен жардырылды.Бул стратегия бизге A. atra ccfDNAда бар 482 эки капталдуу эмес фрагменттерди аныктоого мүмкүндүк берди.Бул ДНК фрагменттеринин жарымынан көбү (57%) бактериялардан, негизинен гиль симбионттарынан, анын ичинде сульфотрофтук симбионттардан жана гиль симбионттарынан Solemya velum алынган (5-сүрөт).
Тип деңгээлинде салыштырмалуу молчулук.B Эки негизги филанын микробдук ар түрдүүлүгү (Firmicutes жана Proteobacteria).ddPCR C Vibrio spp өкүлү күчөтүү.A. Үч атра гемолимфадагы 16S рРНК генинин фрагменттери (көк).
Жалпысынан чогултулган 482 контиг анализден өттү.Метагеномдук контиг аннотацияларынын таксономиялык бөлүштүрүлүшүнүн жалпы профили (прокариоттор жана эукариоттор).B BLASTN жана BLASTX тарабынан аныкталган бактериялык ДНК фрагменттеринин деталдуу бөлүштүрүлүшү.
Kraken2 анализи ошондой эле мидия ccfDNA археалдык ДНК фрагменттерин, анын ичинде Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) жана Thaurmarcheota (11%) ДНК фрагменттерин камтыганын көрсөттү (сүрөт 6a).Калифорниялык мидиялардын микробдук коомчулугунда мурда табылган Euryarchaeota жана Crenarchaeotaдан алынган ДНК фрагменттеринин болушу таң калыштуу эмес [42].Euryarchaeota көбүнчө экстремалдык шарттар менен байланыштуу болсо да, азыр Euryarchaeota жана Crenarcheota экөө тең деңиздеги криогендик чөйрөдө эң кеңири таралган прокариоттордун катарына кирет [43, 44].Кергулен платосунда [45] түбүнөн агып чыккан метандын көлөмдүү агып чыгышы жана Кергулен аралдарынын [46] жээгинде байкалган микробдук метандын болушу мүмкүн болгон акыркы отчетторду эске алганда, мидияларда метаногендик микроорганизмдердин болушу таң калыштуу эмес.
Андан кийин биздин көңүл ДНК вирустарынын окууларына бурулду.Биздин билишибизче, бул мидиялардын вирусунун мазмунун максаттуу эмес биринчи изилдөө.Күтүлгөндөй, биз бактериофагдардын (Caudovirales) ДНК фрагменттерин таптык (сүрөт 6б).Бирок, эң кеңири таралган вирустук ДНК нуклеоцитовирустардын филунан, ошондой эле ядролук цитоплазмалык чоң ДНК вирусу (NCLDV) деп аталган, бардык вирустардын эң чоң геномуна ээ.Бул филумдун ичинде ДНК тизмегинин көбү Mimimidoviridae (58%) жана Poxviridae (21%) үй-бүлөлөрүнө таандык, алардын табигый ээлери омурткалуулар менен муунак буттууларды камтыйт, ал эми бул ДНК тизмегинин бир аз бөлүгү белгилүү вирусологиялык балырларга таандык.Деңиз эукариот балырларын жугат.Тартиптер ошондой эле белгилүү вирустук тукумдардын ичинен эң чоң геномдук чоң вирус болгон Pandora вирусунан алынган.Кызыктуусу, гемолимфтик ccfDNA ырааттуулугу менен аныкталган вирус жуктурганы белгилүү болгон хосттордун диапазону салыштырмалуу чоң болгон (Figure S3, Кошумча маалымат).Ага Baculoviridae жана Iridoviridae сыяктуу курт-кумурскаларды жугузуучу вирустар, ошондой эле амеба, балыр жана омурткалуу жаныбарларды жугузуучу вирустар кирет.Биз ошондой эле Pithovirus sibericum геномуна дал келген тизмектерди таптык.Питовирустар («зомби вирустары» деп да белгилүү) биринчи жолу Сибирдеги 30 000 жылдык түбөлүк тоңдон бөлүнүп алынган [47].Ошентип, биздин натыйжалар бул вирустардын бардык заманбап түрлөрү жок эмес экенин көрсөткөн мурунку отчеттор менен дал келет [48] жана бул вирустар алыскы субарктикалык деңиз экосистемаларында болушу мүмкүн.
Акыр-аягы, биз башка көп клеткалуу жаныбарлардын ДНК фрагменттерин таба аларыбызды текшерип көрдүк.NT, nr жана RefSeq китепканалары (геномдук жана белок) менен BLASTN жана BLASTX тарабынан жалпысынан 482 чет өлкөлүк контиг аныкталган.Биздин натыйжалар көп клеткалуу жаныбарлардын ccfDNAсынын бөтөн фрагменттеринин арасында сөөк сөөктөрүнүн ДНКсы басымдуулук кылаарын көрсөттү (5-сүрөт).Курт-кумурскалардын жана башка түрлөрдүн ДНК сыныктары да табылган.ДНК фрагменттеринин салыштырмалуу чоң бөлүгү аныкталган эмес, бул жер үстүндөгү түрлөргө салыштырмалуу геномдук маалымат базаларында деңиз түрлөрүнүн көп сандагы аз көрсөтүлүшүнө байланыштуу [49].
Бул макалада биз LB концепциясын мидияларга карата колдонобуз жана гемолимфтик ccfDNA секвенциясы деңиз жээгиндеги экосистемалардын курамына түшүнүк бере алат деп ырастадык.Атап айтканда, биз 1) мидия гемолимфасында салыштырмалуу чоң (~1-5 кб) айлануучу ДНК фрагменттеринин салыштырмалуу жогорку концентрациялары (микрограмма деңгээли) бар экендигин аныктадык;2) бул ДНК фрагменттери көз карандысыз да, көз каранды эмес да 3) Бул ДНК фрагменттеринин чет өлкөлүк булактарынын арасынан бактериялык, археалдык жана вирустук ДНКларды, ошондой эле башка көп клеткалуу жаныбарлардын ДНКсын таптык;4) Бул бөтөн ccfDNA фрагменттеринин гемолимфада топтолушу тез жүрүп, мидиялардын ички чыпкалоочу активдүүлүгүнө өбөлгө түзөт.Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөөбүз көрсөткөндөй, буга чейин негизинен биомедицина тармагында колдонулуп келген LB концепциясы бай, бирок изилденбеген билим булагын коддойт, аны күзөтчү түрлөрдүн жана алардын айлана-чөйрөсүнүн ортосундагы өз ара аракеттенүүнү жакшыраак түшүнүү үчүн колдонсо болот.
Приматтардан тышкары, ccfDNA изоляциясы сүт эмүүчүлөрдүн, анын ичинде чычкандардын, иттердин, мышыктардын жана жылкылардын [50, 51, 52].Бирок, биздин маалыматыбыз боюнча, биздин изилдөөбүз ачык циркуляция системасы менен деңиз түрлөрүндө ccfDNAнын табылышын жана секвенирлөөнүн биринчи жолу болуп саналат.Мидиялардын бул анатомиялык өзгөчөлүгү жана чыпкалоо жөндөмү, жок эле дегенде, жарым-жартылай, башка түрлөргө салыштырмалуу айлануудагы ДНК фрагменттеринин ар кандай өлчөмдөгү өзгөчөлүктөрүн түшүндүрүшү мүмкүн.Адамдарда канда айлануучу ДНК фрагменттеринин көбү 150дөн 200 битке чейинки өлчөмдөгү кичинекей фрагменттерден турат.максималдуу чокусу 167 bp [34, 53].ДНК фрагменттеринин кичинекей, бирок олуттуу бөлүгүнүн өлчөмү 300 жана 500 бит ортосунда жана 5%га жакыны 900 биттен узунураак.[54].Бул өлчөмдө бөлүштүрүүнүн себеби, плазмадагы ccfDNAнын негизги булагы клетка өлүмүнүн натыйжасында же дени сак адамдарда айлануучу гемопоэтикалык клеткалардын некрозунан улам же рак менен ооруган бейтаптардагы шишик клеткаларынын апоптозунан улам пайда болот (айлануучу шишик ДНКсы катары белгилүү)., ctDNA).Мидияларда табылган гемолимфикалык ccfDNAнын көлөмүнүн бөлүштүрүлүшү 1000ден 5000 BPге чейин өзгөрүп, мидия ccfDNA башка теги бар экенин көрсөтүп турат.Бул логикалык гипотеза, анткени мидиялар жарым-жартылай ачык кан тамыр системасына ээ жана микробдук геномдук ДНКнын жогорку концентрациясын камтыган деңиз суу чөйрөсүндө жашашат.Чынында, экзогендик ДНКны колдонуу менен биздин лабораториялык эксперименттер мидиялар ДНК фрагменттерин деңиз суусуна топтой турганын көрсөттү, жок дегенде бир нече сааттан кийин алар клеткалык кабыл алынгандан кийин бузулат жана/же чыгарылган жана/же ар кандай уюмдарда сакталат.Клеткалардын (прокариоттук жана эукариоттук да) сейрек болушун эске алуу менен, интравалвулярдык бөлүмдөрдү колдонуу өздүк булактардан, ошондой эле чет элдик булактардан алынган ccfDNAнын көлөмүн азайтат.Кош капкалуу тубаса иммунитеттин маанилүүлүгүн жана айлануучу фагоциттердин көптүгүн эске алып, биз андан ары бөтөн ccfDNA да микроорганизмдерди жана/же клеткалык калдыктарды жутканда бөтөн ДНКны топтогон циркуляциядагы фагоциттерде байыйт деген гипотеза жасадык.Чогуу алганда, биздин натыйжалар кош капкалуу гемолимфа ccfDNA молекулярдык маалыматтын уникалдуу репозиторийи экенин жана алардын күзөтчү түр катары статусун бекемдей турганын көрсөтүп турат.
Биздин маалыматтар бактериядан алынган гемолимфа ccfDNA фрагменттерин секвенирлөө жана талдоо хозяин бактериялык флора жана курчап турган деңиз экосистемасындагы бактериялар жөнүндө негизги маалыматты бере аларын көрсөтүп турат.Атышуу секвенирлөө ыкмалары A. atra gill комменсал бактерияларынын ырааттуулугун ачып берди, эгерде кадимки 16S рРНКны идентификациялоо ыкмалары колдонулганда, жарым-жартылай маалымдама китепканасынын бурмалоосунан улам, өткөрүп жиберилет.Чынында, биздин Кергулендеги бир эле мидия катмарында M. platensisден чогултулган LB маалыматтарын колдонуу гиль менен байланышкан бактериялык симбионттордун курамы мидия түрлөрү үчүн бирдей экенин көрсөттү (сүрөт S4, Кошумча маалымат).Генетикалык жактан бири-биринен айырмаланган эки мидианын мындай окшоштугу Кергулендин муздак, күкүрттүү жана жанар тоо кендериндеги бактериялык жамааттардын курамын чагылдырышы мүмкүн [55, 56, 57, 58].Порт-о-Франс жээгиндеги биотурбаттуу жээк аймактарынан [59] мидияларды жыйноодо күкүрттү азайтуучу микроорганизмдердин жогорку деңгээлдери жакшы сүрөттөлгөн.Дагы бир ыктымалдуулук, горизонталдык трансмиссиянын комменсалдык мидия флорасына таасир этиши мүмкүн [60, 61].Деңиз чөйрөсү, деңиз түбүнүн бети жана мидиялардагы симбиоздук бактериялардын курамынын ортосундагы байланышты аныктоо үчүн көбүрөөк изилдөө керек.Учурда бул изилдөөлөр уланууда.
Бул ыкма өзгөчө белгилүү экосистемадагы вирустук жамааттарды (виромдорду) мүнөздөө үчүн натыйжалуу [62, 63].Бактериялардан, археялардан жана эукариоттордон айырмаланып, вирустук геномдор 16S ырааттуулугу сыяктуу филогенетикалык жактан сакталган гендерди камтыбайт.Буга протозойлорду, муунак буттууларды, курт-кумурскаларды, өсүмдүктөрдү жана бактериялык вирустарды (мисалы, бактериофагдарды) жугузуучу вирустар кирет.ccfDNA секвенирлөө чындыгында адамдын же башка түрлөрдүн вирусун изилдөөдө жаңы ыкма болуп саналат [21, 37, 64].окшош (S3 сүрөтүн караңыз, кошумча маалымат).Бул окшоштук таң калыштуу эмес, анткени ал айлана-чөйрөдө ДНКны кабыл алууда селективдүүлүктүн жоктугун чагылдырышы мүмкүн.Тазаланган РНКны колдонуу менен келечектеги изилдөөлөр учурда РНК вирусун мүнөздөш үчүн зарыл.
Биздин изилдөөбүздө биз Коварски менен кесиптештердин [37] иштерине ылайыкташтырылган өтө катаал трубопроводду колдондук, алар жергиликтүү ccfDNAны чогултканга чейин жана кийин бириктирилген окууларды жана контигдерди эки баскычтуу өчүрүүнү колдонушту, натыйжада карталанбаган окуулардын жогорку үлүшү пайда болду.Ошондуктан, биз бул карталанбаган окуулардын кээ бирлери дагы эле өздөрүнүн келип чыгышы мүмкүн экенин жокко чыгара албайбыз, биринчи кезекте, бизде бул мидия түрүнө шилтеме геному жок.Биз ошондой эле бул түтүктү колдондук, анткени биз өз алдынча жана өз алдынча окуулардын ортосундагы химералар жана Illumina MiSeq PE75 тарабынан түзүлгөн окуу узундугу жөнүндө тынчсызданганбыз.Карталанбаган окуулардын көпчүлүгүнүн дагы бир себеби, деңиз микробдорунун көбү, айрыкча Кергулен сыяктуу алыскы аймактарда аннотацияланбаганы.Биз Illumina MiSeq PE75 колдондук, ccfDNA фрагментинин узундугу адамдын ccfDNAсына окшош.Келечектеги изилдөөлөр үчүн, гемолимфа ccfDNA адамдарга жана/же сүт эмүүчүлөргө караганда көбүрөөк окууга ээ экенин көрсөткөн биздин натыйжаларды эске алуу менен, биз узунураак ccfDNA фрагменттери үчүн ылайыктуу секвенирлөө платформасын колдонууну сунуштайбыз.Бул практика тереңирээк талдоо үчүн көбүрөөк көрсөткүчтөрдү аныктоону бир топ жеңилдетет.Учурда жеткиликсиз толук A. atra өзөктүк геномунун ырааттуулугун алуу да ccfDNAны өз алдынча жана өзүнөн өзү эмес булактардан басмырлоону бир топ жеңилдетет.Биздин изилдөөбүз суюк биопсиянын концепциясын мидияларга колдонуу мүмкүнчүлүгүнө багытталгандыгын эске алып, бул концепция келечектеги изилдөөлөрдө колдонулуп жаткандыктан, мидиялардын микробдук ар түрдүүлүгүн изилдөө үчүн бул ыкманын потенциалын жогорулатуу үчүн жаңы инструменттер жана түтүкчөлөр иштелип чыгат деп үмүттөнөбүз.деңиз экосистемасы.
Инвазивдүү эмес клиникалык биомаркер катары, адамдын плазмадагы ccfDNA деңгээли ар кандай оорулар, кыртыштын бузулушу жана стресс шарттары менен байланышкан [67,68,69].Бул көбөйүү кыртыш бузулгандан кийин өзүнүн келип чыккан ДНК фрагменттерин чыгаруу менен байланышкан.Биз бул маселени курч ысыктык стресстин жардамы менен чечтик, анда мидиялар кыска мөөнөткө 30 °C температурага дуушар болушат.Бул анализди үч көз карандысыз экспериментте үч түрдүү мидия түрүнө жасадык.Бирок, биз курч жылуулук стресстен кийин ccfDNA деңгээлинде эч кандай өзгөрүүнү тапкан жокпуз (S5 сүрөтүн караңыз, кошумча маалымат).Бул ачылыш жарым-жартылай болсо да мидиялардын жарым-жартылай ачык кан айлануу системасына ээ экенин жана фильтрлөөчү жогорку активдүүлүгүнөн улам көп сандагы чет элдик ДНКны топтошорун түшүндүрүшү мүмкүн.Башка жагынан алганда, мидия, көптөгөн омурткасыздар сыяктуу, стресстен келип чыккан кыртыштын бузулушуна туруктуураак болушу мүмкүн, ошону менен алардын гемолимфасында ccfDNAнын чыгарылышын чектейт [70, 71].
Бүгүнкү күнгө чейин, суу экосистемасындагы биологиялык ар түрдүүлүктүн ДНК анализи негизинен экологиялык ДНК (eDNA) метабаркоддоштурууга багытталган.Бирок, бул ыкма, адатта, праймерлер колдонулганда биологиялык ар түрдүүлүктү талдоодо чектелген.Мылтыктын секвенирлөөсүн колдонуу ПТРдин чектөөлөрүн жана праймер топтомдорун бир жактуу тандоону айланып өтөт.Ошентип, кандайдыр бир мааниде биздин метод жакында колдонулган жогорку өтүмдүү eDNA Shotgun секвенирлөө ыкмасына жакыныраак, ал фрагменттелген ДНКны түз тизмектеп, дээрлик бардык организмдерди талдай алат [72, 73].Бирок, LBди стандарттуу eDNA ыкмаларынан айырмалаган бир катар негизги маселелер бар.Албетте, eDNA жана LB ортосундагы негизги айырма табигый чыпкалоо хосттордун пайдалануу болуп саналат.Губкалар жана кош капкалуулар (Dresseina spp.) сыяктуу деңиз түрлөрүнүн eDNAны изилдөө үчүн табигый чыпка катары колдонулушу билдирилген [74, 75].Бирок Драйсенанын изилдөөсүндө ДНК алынган кыртыштын биопсиясы колдонулган.LB тартып ccfDNA талдоо кыртыш биопсиясы, атайын жана кээде кымбат жабдууларды жана eDNA же кыртыш биопсиясы менен байланышкан логистиканы талап кылбайт.Чындыгында, биз жакында LBден алынган ccfDNA муздак чынжырды сактабастан FTA колдоосу менен сакталып, анализделиши мүмкүн деп билдирдик, бул алыскы аймактарда изилдөө үчүн чоң көйгөй [76].Суюк биопсиялардан ccfDNA алуу да жөнөкөй жана мылтыктын секвенирлөө жана ПТР анализи үчүн жогорку сапаттагы ДНКны камсыз кылат.Бул eDNA анализине байланыштуу кээ бир техникалык чектөөлөрдү эске алганда чоң артыкчылык болуп саналат [77].Тандоо ыкмасынын жөнөкөйлүгү жана арзандыгы, ошондой эле узак мөөнөттүү мониторинг программалары үчүн өзгөчө ылайыктуу.Кош капкалуулардын жогорку чыпкалоо жөндөмдүүлүгүнөн тышкары, дагы бир белгилүү өзгөчөлүгү, алардын былжырынын химиялык мукополисахариддик курамы, бул вирустардын сиңишине өбөлгө түзөт [78, 79].Бул эки капкалууларды биологиялык ар түрдүүлүктү жана берилген суу экосистемасындагы климаттын өзгөрүшүнүн таасирин мүнөздөө үчүн идеалдуу табигый чыпка кылат.Хост-алынган ДНК фрагменттеринин болушу эДНКга салыштырмалуу методдун чектөөсү катары каралышы мүмкүн болсо да, eDNA менен салыштырганда мындай жергиликтүү ccfDNAга ээ болуу менен байланышкан чыгым, саламаттыкты сактоо боюнча изилдөөлөр үчүн жеткиликтүү маалыматтын чоң көлөмү үчүн бир эле учурда түшүнүктүү.офсет хост.Бул кожоюндун геномуна интеграцияланган вирустук тизмектердин болушун камтыйт.Бул мидиялар үчүн өзгөчө мааниге ээ, анткени кош капкалуу лейкоздук ретровирустар горизонталдык түрдө таралган [80, 81].LBдин eDNAга караганда дагы бир артыкчылыгы - ал микроорганизмдерди (жана алардын геномдорун) жутуп алган гемолимфадагы айлануучу кан клеткаларынын фагоцитардык активдүүлүгүн пайдаланат.Фагоцитоз – кош капкалуу кан клеткаларынын негизги функциясы [82].Акыр-аягы, ыкма гетерологдук eDNA басып алууга мүмкүндүк берген, деңиз суусунун ар кандай катмарларынын аралашуусун жогорулатуу мидия жогорку чыпкалоо жөндөмдүүлүгүн (деңиз суусу орточо 1,5 л/са) жана эки күндүк айлануу артыкчылыктарын колдонот.[83, 84].Ошентип, мидия ccfDNA анализи мидиялардын тамактануу, экономикалык жана экологиялык таасирин эске алуу менен кызыктуу жол болуп саналат.Адамдардан чогултулган LB анализине окшош, бул ыкма экзогендик заттарга жооп катары кабыл алуучу ДНКдагы генетикалык жана эпигенетикалык өзгөрүүлөрдү өлчөө мүмкүнчүлүгүн ачат.Мидия ccfDNA фрагменттеринин узундугу химиялык трансформацияларга муктаж болбостон, геном боюнча кеңири ДНК метилденүү анализин жүргүзүүгө мүмкүндүк берген узак окуу платформалары менен идеалдуу түрдө шайкеш келиши бул процесске көмөктөшүшү керек.Бирок, LB колдонуу чектөөсүз эмес.Бул экосистемада индикатордук түрлөрдүн болушун талап кылат деп айтуунун кереги жок.Дагы бир негизги көйгөй - деңиз түрлөрү үчүн шилтеме геномдорунун болушу.
Геномдун секвенирлөө маалыматтары NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 астында сакталган.
Brierley AS, Kingsford MJ Климаттын өзгөрүшүнүн деңиз жашоосуна жана экосистемасына тийгизген таасири.Коул Биология.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ж.б.Климаттын өзгөрүшүнүн жана башка жергиликтүү стресстердин деңиз чөйрөсүнө болгон биргелешкен таасирин карап көрөлү.жалпы илимий чөйрө.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, ж.б.).Биринчи марттын илими.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Кайталануучу ысык стресс шарттарында жылуулукка чыдамдуулуктун төмөндөшү көк мидиялардын жайкы өлүмүнүн жогорку деңгээлин түшүндүрөт.Илимий баяндама 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Жаныбарлардын өлүмүнүн жыштыгынын, себептеринин жана масштабындагы акыркы өзгөрүүлөр.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Бир нече түргө тиешелүү эмес козгогучтар Pinna nobilisтин массалык өлүмүнө себеп болушу мүмкүн.Жашоо.2020;10:238.
Брэдли М, Коуттс СДж, Дженкинс Е, О'Хара Т.М.Арктикалык зооноздук ооруларга климаттын өзгөрүшүнүн потенциалдуу таасири.Int J Circumpolar Health.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Көк мидиялар (Mytilus edulis spp.) Жээктин булганышын көзөмөлдөөдө сигналдык организмдер катары: карап чыгуу.Мар Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Рак дарылоодо суюк биопсиянын интеграциясы.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, ж.б.Суюк биопсиянын жетилиши: шишик ДНКсынын айланышына мүмкүндүк берет.Nat Rev Рак.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Адамдын плазмасындагы нуклеиндик кислоталар.Soc Biol туунду ишканаларынын чогулушунун протоколу.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. ракты дарылоо үчүн молекулярдык маркер катары клеткасыз ДНКнын жаңы ролу.Биомолярдык анализдин квантификациясы.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Суюк биопсиясы клиникага кирет - ишке ашыруу маселелери жана келечектеги кыйынчылыктар.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент Ил, Редман СВ жана башкалар.Түйүлдүктүн ДНКсы эненин плазмасында жана сары суусунда болот.Лансет.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Кош бойлуулук учурунда аялдардын канында айлануучу клеткадан тышкары РНКны колдонуу менен кош бойлуулуктун жүрүшүн жана анын кыйынчылыктарын изилдөө.Допедиатрия.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Суюктук биопсиясы: донордук клеткасыз ДНК бөйрөк трансплантындагы аллогендик жараларды аныктоо үчүн колдонулат.Нат Аян Нефрол.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Пренаталдык диагностикадагы инновациялар: эненин плазмасынын геномунун секвенциясы.Анна MD.2016;67:419-32.
Гу В, Денг Х, Ли М, Суку Ю.Д., Аревало С, Страйк Д, ж.б.Инфекцияланган дене суюктуктарынын кийинки муундагы метагеномикалык секвенциясы менен патогенди тез аныктоо.Nat Medicine.2021;27:115-24.