Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчи версиясы CSS үчүн чектелген колдоого ээ. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, колдоо үзгүлтүксүз болушу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Кешик кремнезем бөлүкчөлөрү macroporous particles.These бөлүкчөлөр N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) жана N-phenylmaleimide даярдоо үчүн стирол менен кайтарым кошуу фрагментациялык чынжыр өткөрүп берүү (RAFT) полимерлөө жолу менен алынган кээ бир өзгөртүүлөр менен sol-гел ыкмасы менен даярдалган N-phenylmaleimide of polymerrown-Na-phenylmaleimidere) даярдоо. болот колонкалары (100 × 1,8 мм id) суспензия таңгактоосу менен таңгакталган. Беш пептидден турган пептиддик аралашманын бааланган PMP колоннасынын бөлүнүшү (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг жана Chromat-Ile-Gly-Ser-Arg, chromat-Arg, chromat-Arg) жылы (HAS). Оптималдуу элюциялык шарттарда пептиддик аралашманын теориялык пластинкасынын саны 280,000 табак/м²ге жетет. Иштелип чыккан мамычанын бөлүү көрсөткүчтөрүн коммерциялык Ascentis Express RP-Amide мамычасы менен салыштырганда, PMP мамычасынын бөлүү натыйжалуулугу коммерциялык колонкадан бөлүү эффективдүүлүгү жана резолюциялоо жагынан жогору экени байкалды.
Акыркы жылдарда биофармацевтика өнөр жайы рыноктун үлүшүнүн олуттуу өсүшү менен кеңейип жаткан дүйнөлүк рынокко айланды. Биофармацевтикалык өнөр жайдын1,2,3 жарылуучу өсүшү менен пептиддердин жана протеиндердин анализи абдан талап кылынат. Максаттуу пептидден тышкары, пептиддердин синтези учурунда бир нече аралашмалар пайда болот, ошондуктан пептиддердин хромпографиялык анализин талап кылат. дене суюктуктарындагы, ткандарындагы жана клеткаларындагы протеиндердин санын аныктоо бир үлгүдөгү потенциалдуу аныкталган түрлөрдүн көптүгүнө байланыштуу өтө татаал маселе. Масс-спектрометрия пептиддик жана протеиндик секвенирлөөнүн эффективдүү инструменти болсо да, эгерде мындай үлгүлөр масс-спектрометрге бир өтүү менен киргизилсе, бөлүү идеалдуу болбойт. белгилүү бир убакытта масс-спектрометрге кирген литтер4,5,6.Мындан тышкары, суюк фазаны бөлүү учурунда талдоочулар тар аймактарга топтолушу мүмкүн, ошону менен бул аналитиктер топтолуп, MS аныктоо сезгичтиги жакшырат. Суюк хроматография (LC) акыркы он жылда бир топ алдыга жылды жана протеомикалык анализде популярдуу ыкма болуп калды,88,9170.
Тескери фазалуу суюк хроматография (RP-LC) стационардык фаза катары октадецил-модификацияланган кремнеземди (ODS) колдонуу менен пептиддик аралашмаларды тазалоо жана бөлүү үчүн кеңири колдонулат11,12,13. Бирок, RP стационардык фазалары пептиддер менен протеиндердин канааттандырарлык бөлүнүшүн камсыз кыла албайт, алардын комплекстүү түзүлүшүнө жана стационардык14 үчүн атайын иштелип чыккан. Бул аналиттиктер менен өз ара аракеттенүү жана аларды кармап туруу үчүн полярдуу жана полярдуу эмес бөлүктөргө ээ пептиддерди жана белокторду талдоо талап кылынат16. Мультимодалдык өз ара аракеттенүүнү камсыз кылган аралаш режимдеги хроматография пептиддерди, белокторду жана башка татаал аралашмаларды бөлүү үчүн RP-LCге альтернатива боло алат. 17,18,19,20,21. Аралаш режимдеги стационардык фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярдык интеркалация/RPLC) полярдуу жана полярдуу эмес топтордун катышуусуна байланыштуу пептиддик жана белок бөлүү үчүн ылайыктуу. полярдуу жана полярдуу эмес талдоочу заттар үчүн кубаттуулук жана уникалдуу тандалмачылык, анткени бөлүү талдануучу зат менен стационардык фазанын өз ара аракетинен көз каранды.Multimodal өз ара 29, 30, 31, 32.Recently, Zhang et al.30 додецил менен аяктаган полиамин стационардык фазасын даярдап, углеводороддорду, антидепрессанттарды, флавоноиддерди, нуклеозиддерди, эстрогендерди жана башка бир нече аналиттерди ийгиликтүү ажыратты. Полярдык интеркалатордо полярдуу жана полярдуу эмес топтор бар, ошондуктан ал пептиддерди жана гидрофобдук жана гидрофобдуу, гидрофобдуу, гидрофобдуу колоннага ээ болгон протеиндерди бөлүү үчүн колдонулушу мүмкүн. C18 мамычалары) Ascentis Express RP-Amide колонналары соода аты менен коммерциялык жактан жеткиликтүү, бирок бул мамычалар амин 33 анализи үчүн гана колдонулат.
Учурдагы изилдөөдө, полярдык камтылган стационардык фаза (N-фенилмалеимид камтылган полистирол) даярдалган жана HSAнын пептиддерин жана трипсинди бөлүү үчүн бааланган. Стационардык фаза төмөнкү стратегияны колдонуу менен даярдалган. Кеңири кремний диоксиди бөлүкчөлөрү биздин мурунку басылмада берилген процедурага ылайык даярдалган, кээ бир модификацияланган полиэтилендик фазалар (ПЭТГ) пропорционалдык процедуралар. ), TMOS, суу уксус кислотасы чоң тешикче өлчөмү менен кремнезем бөлүкчөлөрүн даярдоо үчүн жөндөлдү. Экинчиден, жаңы лиганд, фенилмалеймид-метил винил изоцианат синтезделди жана полярдык орнотулган стационардык фазаны даярдоо үчүн кремний диоксиди бөлүкчөлөрүн алуу үчүн колдонулду. Натыйжада стационардык фазага mm0 01 колонкасыз пакеттелген. ing scheme.The мамычанын таңгактоо колонна ичинде бир тектүү керебеттин пайда болушун камсыз кылуу үчүн механикалык титирөө менен жардамдашат. Беш пептидден турган пептиддик аралашмалардын пакеттелген колонка бөлүктөрүн баалоо;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) жана Trypsin дайджест адамдын сывороткасы альбумин (HAS). HSA пептиддик аралашмасы жана трипсин дайджест жакшы токтому менен бөлүнүшү байкалган. Ascentis Express RP-Amide мамычасына караганда натыйжалуураак болгон PMP тилкесинде пептиддер менен протеиндер жакшы чечилип, эффективдүү экени байкалды.
PEG (полиэтиленгликол), карбамид, уксус кислотасы, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлорсилан (TMCS), трипсин, адамдын сывороткасы альбумин (HSA), аммоний хлориди, мочевина, гексан-метилдисилазан (HMDS), метакрил, СтЭТХМ4, Ст. Бензойл пероксиди (BPO), HPLC класстагы ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол жана ацетон Сигма-Олдрихтен (Сент-Луис, МО, АКШ) сатып алынган.
Карбамид (8 г), полиэтиленгликол (8 г) жана 8 мл 0,01 Н уксус кислотасы аралашмасы 10 мүнөт аралаштырылды, андан кийин муздай муздак шарттарда ага 24 мл TMOS кошулду. Реакция аралашмасы 40°C температурада 6 саат ысытылды, андан кийин 120°C болоттон 8 саатка чейин ысытылды. калдык материал 70°C температурада 12 саат кургатылган. Кургатылган жумшак масса меште жылмакай майдаланган жана 12 саат бою 550°Cде кальциленген. Үч партия даярдалган жана бөлүкчөлөрдүн өлчөмү, тешикчелердин өлчөмү жана бетинин аянты боюнча кайра жаралуу мүмкүнчүлүгүн текшерүү үчүн мүнөздөлгөн.
Кремний диоксиди бөлүкчөлөрүн алдын ала синтезделген фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) менен беттик модификациялоо, андан кийин стирол менен радиалдык полимерлөө жолу менен полярдык топту камтыган кошулма даярдалды.Агрегаттар жана полистирол чынжырлары үчүн стационардык фаза. Даярдоо процесси төмөндө сүрөттөлөт.
N-фенилмалеймид (200 мг) жана метил винил изоцианат (100 мг) кургак толуолдо эритип, 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) фенилмалеймид-метил винилполимер аралашмасын даярдоо үчүн реакция колбасына кошулду. саат, чыпкаланган жана духовкада 40°С 3 саат кургатылган.
Кургатылган кремний диоксиди бөлүкчөлөрү (2 г) кургак толуолдо (100 мл) дисперсацияланды, 500 мл тегерек түбү бар колбада 10 мүнөт бою аралаштырылды жана sonicated. PMCP (10 мг) толуолдо эриди жана тамчылатуучу воронка аркылуу реакциялык колбага кошулду. Аралашма 1 саат бою чыпкаланып, чыпкаланган жана 8°C муздаткыч менен жууп, 8°C чайкалып, кайра сүзгөнгө чейин 8°C чайкалып, кайра сүзүлгөн. 60°C температурада 3 саат. Андан соң, PMCP менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү (100 г) толуолдо (200 мл) эриди жана 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) катализатор катары 100 мкл дибутилтин дилураттын катышуусунда кошулду. 3 саат.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) жана TEMPO-PMCP-тиркелген кремнезем бөлүкчөлөрү (1,5 г) толуолдо дисперсацияланды жана азот менен тазаланды. Стиролдун полимеризациясы 100°C температурада 12 саат бою жүргүзүлдү. Натыйжадагы продукт 100°C температурада 12 саат бою жуулду. мен 1-сүрөттө көрсөтүлгөн.
Үлгүлөр 10-3 Torr.The салыштырмалуу басымда adsorbed N2 саны аз 10-3 Torr.The суммасы калдык басым алуу үчүн 1 саат 393 K дегазацияланган жылаңач жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жалпы тешикчелердин көлөмүн аныктоо үчүн колдонулган. ried үлгүлөрү (жылаңач кремний жана лиганд-байланыштуу кремний бөлүкчөлөрү) жабышчаак көмүртек лентасын колдонуу менен алюминий мамычасына жайгаштырылды. Алтын Q150T чачыраткыч каптоочуну колдонуу менен үлгүлөргө капталган жана 5 нм Au катмары samples.This төмөн чыңалууларды колдонуу менен процесстин натыйжалуулугун жакшыртат жана майда чыңалууларды жакшыртат. Элементтик талдоо үчүн 1112 элементтик анализатор колдонулган. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмүн бөлүштүрүүнү алуу үчүн Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 бөлүкчөлөрдүн өлчөмү анализатору колдонулган. Жылаңач кремний бөлүкчөлөрү жана лиганд-байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү (ар бири 5 мг) 5 мл изопропанолго таркатылып, опропанол үчүн майдаланган жана майдаланган. Mastersizer. Термогравиметрикалык анализ 30дан 800 °Cге чейинки температура диапазонунда мүнөтүнө 5 °C ылдамдыкта жүргүзүлдү.
Өлчөмдөрүндөгү (100 × 1,8 мм id) айнек менен капталган дат баспас болоттон жасалган кууш көздүү мамычалар шламды таңгактоо ыкмасын колдонуу менен таңгакталган.31. Дат баспас болоттон жасалган колонка (айнек менен капталган, 100 × 1,8 мм id) 1 мкм фритти камтыган чыгуучу фитинги менен суспензия пакерине туташтырылды (Alltech Deerfield, IL, АКШ). 150 мг суспензия менен стационардык фазалык суспензияны даярдаңыз жана аны 1 2 мг стационардык фазага жөнөтүңүз. шламды эриткич катары, ошондой эле кыймылдаткыч эриткич катары. 10 мүнөткө 100 МП, 15 мүнөткө 80 МП жана 30 мүнөткө 60 МП басымды колдонуу менен колонканы ырааттуу түрдө толтуруңуз. Таңгактоо учурунда эки GC колонка чайкагычы (Alltech, Deerfield, USA) менен механикалык титирөө колдонулган. мамычанын ичинде кандайдыр бир бузулууларды болтурбоо үчүн акырын басымды басыңыз. Колонканы шламды таңгактоо блогунан ажыратып, анын иштешин текшерүү үчүн киришке жана LC системасына башка фитингди туташтырыңыз.
LC насосу (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (АКШ) C14 W.05), 50 нЛ инъекциялык цикл, мембрана дегазатору (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капилляр терезеси атайын µLC аппаратынын детектору (UV-2075) курулган жана айнектин кыска тилкесин туташтырган. Таңгакталгандан кийин капиллярлар (50 мкм id 365 жана редукциялоочу капиллярлар (50 мкм) калыбына келтирүүчү бирикменин 1/16" розеткасына орнотулду. Маалыматтарды чогултуу жана хроматографиялык иштетүү Multichro 2000 программалык камсыздоонун жардамы менен ишке ашты. 254 аналитикалык тестирлөө үчүн Chromatographic нм менен анализден өттү. (Нортхэмптон, MA).
Адамдын сывороткасынан альбумин, лиофилизацияланган порошок, ≥ 96% (агароза гелинин электрофорези) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) жана 0,2 М аммоний бикарбонаты (1 мл) менен аралаштырылган. Эритме 10 мүнөт аралаштырылып, андан кийин 7°C 3°C суу менен куюлган ваннада кармалат. 0,1% TFA.Filter эритмесин жана 4 °C төмөн сактоо.
Пептиддик аралашмаларды жана HSA трипсин дайджесттерин бөлүү PMP мамычаларында өзүнчө бааланды. HSAнын пептиддик аралашмасынын жана трипсин дайджестинин PMP мамычасынын бөлүнүшүн текшериңиз жана натыйжаларды Ascentis Express RP-Amide мамычасына салыштырыңыз. Теориялык плитанын номери төмөнкүдөй эсептелет:
Жылаңач кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрүнүн SEM сүрөттөрү сүрөттө көрсөтүлгөн.Жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнүн 2 .SEM сүрөттөрү (A, B) биздин мурунку изилдөөлөрүбүздөн айырмаланып, бул бөлүкчөлөр шар формасында экенин көрсөтүп турат, анда бөлүкчөлөр узун же туура эмес симметрияга ээ. ca бөлүкчөлөр.
Жылаңач кремнезем бөлүкчөлөрүнүн (A, B) жана лиганд-байланыштуу кремний бөлүкчөлөрүнүн (C, D) сканерлөөчү электрондук микроскоптун сүрөттөрү.
жылаңач кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн көлөмү 3 (A) сүрөттө көрсөтүлгөн. Көлөмгө негизделген бөлүкчөлөрдүн көлөмү бөлүштүрүүнүн ийри сызыгы химиялык модификациялоодон кийин кремнезем бөлүкчөлөрүнүн көлөмү көбөйгөнүн көрсөттү (сүрөт. 3A). Кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн бөлүштүрүү маалыматтары учурдагы изилдөөдөн жана мурунку бөлүкчөлөрдүн көлөмүн салыштырганда T (A). PMP 3,36 мкм, биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу ad(0,5) мааниси 3,05 мкм (полистирол менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү) 34. Бул партия PEG, мочевина, TMOS жана уксус кислотасынын ар кандай катышына байланыштуу биздин мурунку изилдөөгө салыштырмалуу тар бөлүкчөлөрдүн өлчөмүнө ээ болгон. кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн фазасын биз мурда изилдегенбиз. Бул кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн стирол менен беттик функционализациясы кремнеземдин бетине полистирол катмарын (0,97 мкм) гана салганын билдирет, ал эми PMP фазасында катмардын калыңдыгы 1,38 мкм болгон.
Жылаңач кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүн бөлүштүрүү (A) жана тешикчелердин өлчөмүн бөлүштүрүү (B).
Учурдагы изилдөөнүн кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмү, тешикчелеринин көлөмү жана бетинин аянты 1(B) таблицада келтирилген. Жылаңач кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремний бөлүкчөлөрүнүн PSD профилдери 3(B)-сүрөттө көрсөтүлгөн. Натыйжалар биздин мурунку изилдөөбүз менен салыштырууга болот. 1(В) таблицада көрсөтүлгөндөй, химиялык модификациядан кийин тешикчелердин өлчөмү 69га азаят, ал эми ийри сызыктын өзгөрүшү 3(B)-сүрөттө көрсөтүлгөн. Ошо сыяктуу эле, кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин көлөмү химиялык модификациядан кийин 0,67ден 0,58 см3/г чейин азайган. Мурунку изилденген бөлүкчөлөрдүн спецификалык бетинин аянты 16 м2ге чейин азайган. (124 м2/г). 1(В) таблицада көрсөтүлгөндөй, кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн бетинин аянты (м2/г) химиялык модификациядан кийин 116 м2/гдан 105 м2/г чейин азайган.
Стационардык фазанын элементардык анализинин натыйжалары 2-таблицада көрсөтүлгөн. Учурдагы стационардык фазанын көмүртек жүктөөсү 6,35%ды түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүздөгү көмүртек жүктөөсүнөн төмөн (полистирол менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү, тиешелүүлүгүнө жараша 7,93%35 жана 10,21%) 42. Себеби, учурдагы стационардык фазадагы көмүртек жүктөөсү аз. стирол, фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) жана 4-гидрокси-ТЕМПО сыяктуу кээ бир полярдык лиганддар колдонулган.Азоттун стационардык фазасынын пайызы 2,21%ды түзөт, ал эми азоттун салмагы боюнча 0,1735 жана 0,85% салыштырганда мурунку изилдөөлөрдөгү фазага салыштырмалуу жогору. phenylmaleimide.Ошондой эле, (4) жана (5) азыктарынын көмүртек жүктөөлөр тиешелүүлүгүнө жараша 2,7% жана 2,9% түздү, ал эми акыркы продуктунун көмүртек жүктөөсү (6) 6,35% ды түздү, таблица 2. Салмагын жоготуу PMP стационардык фазасы менен текшерилди, ал эми TGA ийри сызыгы TGA 8 менен макулдашууну көрсөтөт. көмүртек жүктөө (6,35%), анткени лиганддарда C гана эмес, ошондой эле N, O жана H бар.
Фенилмалеймиддин-метилвинилизоцианат лигандынын кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн беттик модификациясы үчүн тандалып алынган, анткени ал полярдуу фенилмалеймид топторуна жана винилизоцианат топторуна ээ. Винил изоцианат топтору тирүү радикалдык полимеризация аркылуу стирол менен андан ары реакцияга кирет. Экинчи себеби, стационардык аналитикалык жана электростанциялык өз ара күчтүү өз ара аракеттенүү менен топту киргизүү. фаза, анткени фенилмалеймид бөлүгү нормалдуу рНда виртуалдык зарядга ээ эмес. Стационардык фазанын полярдуулугун стиролдун оптималдуу саны жана эркин радикалдык полимеризациянын реакция убактысы менен башкарууга болот. Реакциянын акыркы баскычы (эркин радикалдык полимеризация) критикалык болуп саналат жана стационардык фазанын полярдуулугун өзгөртө алат. реакция убактысы стационардык фазага көмүр жүктөөсүн көбөйттү жана тескерисинче. стиролдун ар кандай концентрациясы менен даярдалган SPs ар кандай көмүртек жүктөмүнө ээ. Кайрадан, бул стационардык фазаларды дат баспас болоттон жасалган мамычаларга жүктөңүз жана алардын хроматографиялык көрсөткүчтөрүн текшериңиз (тандоочулук, чечкиндүүлүк, N мааниси ж.
Беш пептиддик аралашмалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) ошондой эле мобилдик фазаны колдонуу менен PMP тилкесин колдонуу менен бааланган;60/40 (v/v) ацетонитрил/суу (0,1% TFA) агымы 80 мкл/мин. Оптималдуу эритүү шарттарында ар бир колонкадагы теориялык плитанын саны (N) (100 × 1,8 мм идентификациялык) 20,000 ± 100 (200,000 ± 100) түзөт жана Pch/m²T үчүн үч тилке үчүн Pch/m² маанилерин берет. роматограммалар 5А-сүрөттө көрсөтүлгөн. PMP мамычасында жогорку агым ылдамдыгы (700 мкл/мин), беш пептиддер бир мүнөттүн ичинде элюцияланган, N маанилери абдан жакшы, ар бир мамыча үчүн 13,500 ± 330 (100 × 1,8 мм id), 135,000 ге (135,000 мкл) туура келет. 00 × 1,8 мм id) кайра жаралуу мүмкүнчүлүгүн текшерүү үчүн PMP стационардык фазасынын үч түрдүү лоттору менен таңгакталган. Ар бир колонка үчүн аналиттин концентрациясы оптималдуу элюция шарттарынын жана теориялык пластинкалардын N санын жана ошол эле сыноо аралашмасын ар бир тилкеде бөлүү үчүн кармоо убактысынын жардамы менен жазылган. PMP мамычалары үчүн кайра жаралуу маалыматтары PMP 4 тилкесинде кайра жаралуу маалыматтары PMP 4 тилкесинде кайталануу мүмкүнчүлүгү абдан төмөн көрсөтүлгөн. 3-таблица.
PMP тилкесинде (B) жана Ascentis Express RP-Amide тилкесинде (A) пептиддик аралашманы бөлүү;мобилдик фазасы 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP мамычасынын өлчөмдөрү (100 × 1,8 мм ID);Аналитикалык Кошулмалардын элюциялык тартиби: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Леу-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) жана 5 (лейцин) кислотасы энкефалин)).
PMP мамычасы (100 × 1,8 мм id) адамдын сывороткасынын альбумининин трипттик дайджесттерин жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда бөлүү үчүн бааланган. 6-сүрөттөгү хроматограмма үлгү жакшы бөлүнгөнүн жана чечимдин абдан жакшы экенин көрсөтүп турат. HSA дайджесттери 100 μL/FACE/min агымынын ылдамдыгы менен анализденген. .Хроматограммада көрсөтүлгөндөй (6-сүрөт), HSA сиңирүү 17 пептидге туура келген 17 чокуга бөлүнгөн. HSA дайджестиндеги ар бир чокунун бөлүнүү эффективдүүлүгү эсептелген жана баалуулуктар 5-таблицада берилген.
HSA бир триптикалык дайджест (100 × 1,8 мм id) PMP тилкесинде бөлүнгөн;агымынын ылдамдыгы (100 мкл/мин), мобилдик фаза 60/40 ацетонитрил/суу 0,1% TFA менен.
Мында L - мамычанын узундугу, η - мобилдик фазанын илешкектүүлүгү, ΔP - мамычанын арткы басымы, ал эми u - мобилдик фазанын сызыктуу ылдамдыгы. PMP мамычасынын өткөргүчтүгү 2,5 × 10-14 м2, агымынын ылдамдыгы 25 мкЛ/мин жана 60/40 мкЛ/мин, жана суу 60/40 v/v AC01 мамыча үчүн пайдаланылган. id) биздин мурунку изилдөөбүзгө окшош болгон Ref.34. Үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен капталган мамычанын өткөрүмдүүлүгү: 1,3 мкм бөлүкчөлөр үчүн 1,7 × 10-15, 1,7 мкм бөлүкчөлөр үчүн 3,1 × 10-15, 5,2 × 10-15 м бөлүкчөлөр үчүн жана 2,2 × 10-15 сек. 5 мкм бөлүкчөлөр 43.Ошондуктан, PMP фазасынын өткөргүчтүгү 5 мкм өзөктүү кабык бөлүкчөлөрүнө окшош.
мында Wx - хлороформ менен таңгакталган колонканын салмагы, Wy - метанол менен таңгакталган колонканын салмагы, ал эми ρ - эриткичтин тыгыздыгы. Метанолдун (ρ = 0,7866) жана хлороформдун (ρ = 1,484) тыгыздыгы. SILICA-18101 тин жалпы көзөнөктүүлүгү. 4 жана C18-карбамид мамычалары 31, биз мурда изилдеп, тиешелүүлүгүнө жараша, 0,63 жана 0,55 болгон. Бул карбамид лиганддарынын болушу стационардык фазасынын өткөргүчтүгүн азайтат дегенди билдирет. Башка жагынан алганда, PMP мамычасынын жалпы көзөнөктүүлүгү (100 × 1,8 мм, PMP идентификаторуна караганда P1 мамычасынын төмөнкү P1 id. -байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү, анткени C18 тибиндеги стационардык фазаларда C18 лиганддары кремнезем бөлүкчөлөрүнө сызыктуу чынжырчалар катары кошулат, ал эми полистирол тибиндеги стационардык фазаларда анын айланасында салыштырмалуу калың полимер катмары пайда болот. Типтүү экспериментте мамычанын көзөнөктүүлүгү төмөнкүчө эсептелет:
7A,B сүрөтүндө PMP тилкеси (100 × 1,8 мм id) жана Ascentis Express RP-Amide тилкеси (100 × 1,8 мм id) бирдей элелюция шарттарында (б.а. 60/40 ACN/H2O жана 0,1% TFA) көрсөтүлгөн.) van Deemter участогу.Тандалган пептиддик аралашмалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 μL даярдалган/ Эки тилке үчүн минималдуу агымдын ылдамдыгы 800 мкЛ/мин. Express RP-Amide тилкеси тиешелүүлүгүнө жараша 2,6 мкм жана 3,9 мкм болгон. HETP маанилери PMP мамычасынын (100 × 1,8 мм id) бөлүү натыйжалуулугу коммерциялык Ascentis Express RP-Amide мамычасына (100 × 1,8 мм id) караганда алда канча жакшыраак экенин көрсөтүп турат (100 × 1,8 мм . биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу олуттуу эмес. Ascentis Express RP-Amide мамычасына салыштырмалуу PMP мамычасынын (100 × 1,8 мм id) жогорку бөлүү эффективдүүлүгү бөлүкчөлөрдүн формасын, өлчөмүн жана учурдагы жумушта колдонулган мамычаны таңгактоо процедураларын жакшыртууга негизделген34.
(A) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O ичинде PMP мамычасы (100 × 1,8 мм id) аркылуу алынган ван Димтердин графиги (HETP менен мобилдик фаза сызыктуу ылдамдыгы).(B) ван Димтер графиги (HETP, мобилдик фаза сызыктуу ылдамдыгына каршы) Экспресс RP-01де RP101де алынган. 0/40 ACN/H2O 0,1% TFA менен.
Полярдык камтылган полистирол стационардык фазасы даярдалган жана синтетикалык пептиддик аралашмаларды жана адамдын сывороткасынын альбумининин (HAS) трипсин дайджесттерин жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда бөлүү үчүн бааланган. Пептиддик аралашмалар үчүн PMP мамычаларынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү бөлүү эффективдүүлүгү жана чечүүчүлүгү боюнча эң сонун. ca бөлүкчөлөрү, стационардык фазанын башкарылуучу синтези жана комплекстүү мамычаларды таңгактоо. Жогорку бөлүү эффективдүүлүгүнөн тышкары, жогорку агымдын ылдамдыгында колонканын арткы басымынын төмөн болушу бул стационардык фазанын дагы бир артыкчылыгы болуп саналат. PMP мамычалары жакшы репродукцияны көрсөтөт жана ар кандай протеиндердин пептиддик аралашмаларын жана трипсинди сиңирүүсүн талдоо үчүн колдонсо болот. hromatography.Келечекте, PMP мамычалар да белокторду жана моноклоналдык антителолорду бөлүү үчүн бааланат.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Reversed фазалык хроматография аркылуу пептиддик бөлүү системалары боюнча изилдөө I Бөлүм: Колонналарды мүнөздөмө протоколун иштеп чыгуу.J.Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Жугуштуу ооруларды дарылоо үчүн иштелип чыккан жакшыртылган активдүү пептиддер.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана базар. дары ачылыш.15 (1-2) бүгүн, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2010. (1010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Advanced суюк хроматография-массалык спектрометрия кеңири максаттуу метаболомиканы жана протеомиканы киргизүүгө мүмкүндүк берет.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Дары-дармектерди иштеп чыгууда UHPLCтин ролу.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Тез бөлүнүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Ультра жогорку натыйжалуу суюк хроматографияны дарыларды иштеп чыгууда колдонуу.Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolithic macroporous hydrogels enteroviruses.Chemical.Britain.J натыйжалуу тазалоо үчүн суудагы май жогорку ички фаза эмульсиялар даярдалган.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Суюк хроматографиянын протеомикада ролу.Хроматография.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Терапевтикалык пептиддердин жана протеиндердин тескери фазалуу суюк хроматографиялык бөлүктөрүндө пайда болгон тенденциялар: теория жана колдонмолор.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН баалуулуктарын колдонуу менен RP-RP-HPLC тутумунун жардамы менен пептиддердин эки өлчөмдүү бөлүнүшү.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. C18 суб-2 мкм толук жана үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен таңгакталган жогорку натыйжалуу хроматографиялык колонналардын массалык өткөрүп мүнөздөмөлөрү жана кинетикалык көрсөткүчтөрү изилденген.J.Сентябрь Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Өсүмдүк биоактивдүү пептиддерин изоляциялоо, идентификациялоо жана валидациялоодогу акыркы тенденциялар жана аналитикалык кыйынчылыктар.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-02 (s00216015).
Mueller, JB et al. The proteomic пейзаждын жашоо падышалыгы. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Preparative суюк хроматографиясы менен терапиялык пептиддерди ылдый иштетүү. Молекула (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралаш режимдеги хроматография жана аны биополимерлерге колдонуу.Хроматография.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y.& Sun, Y. Аралаш режимдеги белок хроматографиясы үчүн лиганддар: принцип, мүнөздөмө жана дизайн.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).