Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү). Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Дарыны текшерүү үчүн жүрөктүн физиологиялык чөйрөсүн так кайталай алган ишенимдүү in vitro системасына муктаждык бар. Адамдын жүрөк кыртышынын маданиятынын системаларынын чектелген болушу кардиохирургиялык дарылардын таасирин так эмес чечмелөөгө алып келди. Бул жерде биз жүрөк ткандарынын маданиятынын моделин (КТКМ) иштеп чыктык, ал электромеханикалык жүрөк кесимдерин стимулдайт жана жүрөк циклинин систолалык жана диастоликалык фазаларында физиологиялык сунууга дуушар болот. 12 күндүк маданияттан кийин бул ыкма жүрөк бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгүн жарым-жартылай жакшыртса да, алардын структуралык бүтүндүгүн толук сактаган эмес. Ошондуктан, чакан молекула скринингден кийин, биз 100 нМ трийодтиронин (T3) жана 1 мкМ дексаметазон (Декс) биздин чөйрөгө кошуу 12 күн бою бөлүмдөрдүн микроструктурасын сактап деп табылган. T3 / Dex дарылоо менен бирге, CTCM системасы 12 күн бою жаңы жүрөк кыртыштары менен бирдей денгээлде транскрипция профилдерин, жашоого жөндөмдүүлүгүн, зат алмашуу активдүүлүгүн жана структуралык бүтүндүгүн сактап калды. Мындан тышкары, маданиятта жүрөк кыртышынын ашыкча созулушу гипертрофиялык жүрөк сигналын индукциялайт, бул CTCMнин жүрөктүн созулушу менен шартталган гипертрофиялык шарттарды туурай алгандыгын далилдейт. Жыйынтыктап айтканда, CTCM узак убакыт бою маданиятта жүрөктүн физиологиясын жана патофизиологиясын моделдештирип, дары-дармектерди ишенимдүү текшерүүгө мүмкүндүк берет.
Клиникалык изилдөөгө чейин адамдын жүрөгүнүн физиологиялык чөйрөсүн так кайталай алган ишенимдүү in vitro системалары керек. Мындай системалар өзгөргөн механикалык чоюлуп, жүрөктүн кагышын жана электрофизиологиялык касиеттерин туураш керек. Жаныбарлардын моделдери, адатта, адамдын жүрөгүнө дарылардын таасирин чагылдырууда ишенимдүүлүгү чектелген жүрөк физиологиясы үчүн скрининг платформасы катары колдонулат1,2. Акыр-аягы, идеалдуу жүрөк кыртышынын маданиятынын эксперименталдык модели (КТКМ) адамдын жүрөгүнүн физиологиясын жана патофизиологиясын так чагылдырган ар кандай терапевтикалык жана фармакологиялык кийлигишүүлөр үчүн өтө сезгич жана спецификалык үлгү болуп саналат3. Мындай системанын жоктугу жүрөк жетишсиздигинин жаңы дарылоо ыкмаларын ачууну чектейт4,5 жана рыноктон чыгуунун негизги себеби катары дары-дармектердин кардиотоксикасына алып келди6.
Акыркы он жылдын ичинде сегиз жүрөк-кан тамыр эмес дарылар клиникалык колдонуудан алынып салынды, анткени алар QT аралыгын узартып, карынчалык аритмияга жана капыстан өлүмгө алып келет7. Ошентип, жүрөк-кан тамыр эффективдүүлүгүн жана уулуулугун баалоо үчүн ишенимдүү клиникага чейинки скрининг стратегияларына болгон муктаждык өсүүдө. Дары-дармек скринингинде жана уулуулугун текшерүүдө адам тарабынан пайда болгон pluripotent өзөк клеткасынан алынган кардиомиоциттердин (hiPS-CM) жакында колдонулушу бул маселени жарым-жартылай чечет. Бирок, hiPS-CMs жетиле элек мүнөзү жана жүрөк кыртышынын көп клеткалуу татаалдыгы жоктугу бул ыкманын негизги чектөөлөр болуп саналат. Акыркы изилдөөлөр бул чектөө жарым-жартылай өз алдынча жыйрылуу башталгандан кийин жүрөк кыртышынын hydrogels түзүү үчүн эрте hiPS-CM колдонуу жана убакыттын өтүшү менен бара-бара электрдик стимулдаштырууну жогорулатуу мүмкүн экенин көрсөттү. Бирок, бул hiPS-CM микроткандар бойго жеткен миокарддын жетилген электрофизиологиялык жана жыйрылышы касиеттерине ээ эмес. Мындан тышкары, адамдын жүрөк ткандары клеткадан тышкары матрицалык белоктордун белгилүү бир топтомдору менен байланышкан эндотелийдик клеткаларды, нейрондорду жана стромдук фибробласттарды камтыган ар кандай клетка типтеринин гетерогендүү аралашмасынан турган татаал түзүлүшкө ээ. бойго жеткен сүт эмүүчүлөрдүн жүрөгүндө кардиомиоцит эмес популяциялардын11,12,13 бул гетерогендүүлүгү жеке клетка түрлөрүн колдонуу менен жүрөк кыртышын моделдөө үчүн негизги тоскоолдук болуп саналат. Бул негизги чектөөлөр физиологиялык жана патологиялык шарттарда бузулбаган миокард ткандарын өстүрүү ыкмаларын иштеп чыгуунун маанилүүлүгүн баса белгилейт.
Адамдын жүрөгүнүн культураланган жука (300 мкм) бөлүктөрү адамдын бүтүн миокардынын келечектүү модели экендигин далилдеди. Бул ыкма адамдын жүрөк кыртышына окшош толук 3D көп клеткалуу системага жетүүнү камсыз кылат. Бирок, 2019-жылга чейин маданияттуу жүрөк бөлүмдөрүн колдонуу кыска (24 саат) маданияттын жашоосу менен чектелген. Бул физикалык-механикалык сунуунун жоктугу, аба-суюктук интерфейси жана жүрөк кыртышынын муктаждыктарын колдобогон жөнөкөй медианы колдонуу сыяктуу бир катар факторлорго байланыштуу. 2019-жылы бир нече изилдөө топтору механикалык факторлорду жүрөк кыртышынын маданиятынын системаларына киргизүү маданияттын өмүрүн узартып, жүрөктүн экспрессиясын жакшыртып, жүрөк патологиясын туурай аларын көрсөтүштү. Эки жарашыктуу изилдөө 17 жана 18 бир октук механикалык жүктөө маданият учурунда жүрөктүн фенотипине оң таасирин тийгизет экенин көрсөтүп турат. Бирок, бул изилдөөлөр жүрөк бөлүктөрү да изометрдик чыңалуу күчтөрү 17 же сызыктуу auxotonic жүктөө 18 менен жүктөлгөн, анткени, жүрөк циклинин динамикалык үч өлчөмдүү физикалык-механикалык жүктү колдонгон эмес. Бул кыртыштарды сунуу ыкмалары көптөгөн жүрөк гендерин басууга же анормалдуу сунуу жооптору менен байланышкан гендердин ашыкча экспрессиясына алып келген. Белгилей кетсек, Pitoulis et al. 19 күч өзгөрткүч пикир жана чыңалуу дисктерин колдонуу менен жүрөк циклин калыбына келтирүү үчүн динамикалык жүрөк тилим маданият ваннаны иштелип чыккан. Бул система жүрөк циклинин in vitro моделин тактоого мүмкүндүк берет да, методдун татаалдыгы жана төмөн өткөрүү жөндөмдүүлүгү бул системаны колдонууну чектейт. Биздин лаборатория жакында 6 күнгө чейин чочко жана адамдын жүрөк кыртышынын бөлүмдөрүнүн жашоого жөндөмдүүлүгүн сактоо үчүн электрдик стимулдаштыруу жана оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен жөнөкөйлөштүрүлгөн маданият системасын иштеп чыкты 20,21.
Учурдагы кол жазмада биз жүрөк циклинин учурунда үч өлчөмдүү жүрөк физиологиясын жана патофизиологиялык дистензияны кайталоо үчүн гуморалдык сигналдарды камтыган чочко жүрөгүнүн бөлүмдөрүн колдонуу менен жүрөк кыртышынын маданиятынын моделин (CTCM) сүрөттөйбүз. Бул CTCM дары-дармектерди клиникага чейинки тестирлөө үчүн сүт эмүүчүлөрдүн жүрөгүнүн физиологиясын/патофизиологиясын туураган рентабелдүү, орто ылдамдыктагы кардиохирургиялык системаны камсыз кылуу аркылуу клиникага чейинки дары-дармекти алдын ала айтуунун тактыгын буга чейин болуп көрбөгөндөй жогорулата алат.
Гемодинамикалык механикалык сигналдар in vitro 22,23,24 cardiomyocyte милдетин сактоо үчүн маанилүү ролду ойнойт. Учурдагы кол жазмада биз физиологиялык жыштыктарда (1,2 Гц, мүнөтүнө 72 согуу) электрдик жана механикалык стимулдаштыруу аркылуу бойго жеткен жүрөк чөйрөсүн туурай турган CTCM (Figure 1a) иштеп чыктык. Диастола учурунда ткандардын ашыкча чоюлуп кетпеши үчүн кыртыштын көлөмүн 25% көбөйтүү үчүн 3D басып чыгаруучу аппарат колдонулган (сүрөт 1б). C-PACE тутуму тарабынан индукцияланган электрдик темпи жүрөк циклин толугу менен кайра жаратуу үчүн маалымат алуу тутумун колдонуу менен систоладан 100 мс мурун баштоого убакыт берилди. Кыртыш маданият системасы ийкемдүү силикон мембрананы циклдик түрдө кеңейтүү үчүн программалануучу пневматикалык кыймылдаткычты (LB Engineering, Германия) колдонот, бул жогорку камерадагы жүрөк тилкелеринин кеңейишине алып келет. Система басымды өзгөрткүч аркылуу тышкы аба линиясына туташтырылган, бул басымды (± 1 мм рт.ст.) жана убакытты (± 1 мс) так жөнгө салууга мүмкүндүк берген (1c-сүрөт).
a Аспаптын маданият камерасынын ичиндеги көк түстө көрсөтүлгөн 7 мм колдоочу шакекчеге кыртыш бөлүмүн бекитиңиз. Маданият камерасы аба камерасынан ичке ийкемдүү силикон мембранасы менен бөлүнгөн. агып кетпеши үчүн ар бир камеранын ортосуна прокладканы кой. Аппараттын капкагында электрдик стимулдаштырууну камсыз кылган графит электроддору бар. б Чоң кыртыш аппаратынын, жетектөөчү шакекченин жана колдоочу шакекченин схемалык көрүнүшү. Кыртыш бөлүмдөрү (күрөң) аппараттын сырткы четиндеги оюкка жайгаштырылган жетектөөчү шакекче менен чоң өлчөмдөгү түзүлүшкө жайгаштырылат. Жетекчинин жардамы менен ткань акрил клей менен капталган колдоо шакекчесин жүрөк кыртышынын кесилишине кылдаттык менен коюңуз. c Программалануучу пневматикалык кыймылдаткыч (PPD) тарабынан башкарылуучу аба камерасынын басымынын функциясы катары электрдик стимулдаштыруу убактысын көрсөткөн график. Басым сенсорлорунун жардамы менен электрдик стимулдаштырууну синхрондоштуруу үчүн маалымат алуу аппараты колдонулган. Маданият камерасындагы басым белгиленген чекке жеткенде, C-PACE-EMге импульстук сигнал электрдик стимулдаштыруу үчүн жөнөтүлөт. d Инкубатордун текчесинде жайгаштырылган төрт КТМБнын сүрөтү. Бир PPDге төрт аппарат пневматикалык схема аркылуу туташтырылган жана пневматикалык чынжырдагы басымды көзөмөлдөө үчүн гемостатикалык клапанга басым датчиктер киргизилген. Ар бир аппарат алты кыртыш бөлүмүн камтыйт.
Бир пневматикалык кыймылдаткычты колдонуу менен биз 4 CTCM аппаратын башкара алдык, алардын ар бири 6 кыртыш бөлүмдөрүн кармай алган (сүрөт 1d). CTCMде аба камерасындагы аба басымы суюктук камерасындагы синхрондук басымга айланат жана жүрөк тилкесинин физиологиялык кеңейүүсүнө түрткү берет (2а-сүрөт жана 1-кошумча фильм). 80 мм Hg ткандардын созулушун баалоо. Art. кыртыш бөлүмдөрүнүн 25%га созулушун көрсөткөн (2б-сүрөт). Бул пайыздык сунуу нормалдуу жүрөк секциясынын жыйрылышы 17,19,25 үчүн 2,2-2,3 мкм физиологиялык саркомердин узундугуна туура келери көрсөтүлгөн. Кыртыштын кыймылы атайын камера орнотуулары менен бааланган (Кошумча 1-сүрөт). Кыртыштын кыймылынын амплитудасы жана ылдамдыгы (сүрөт 2c, г) жүрөк циклиндеги созулууга жана систола менен диастоладагы убакытка туура келген (2б-сүрөт). Жыйыруу жана эс учурунда жүрөк кыртышынын Stretch жана ылдамдыгы маданият 12 күн бою туруктуу бойдон калган (сүрөт. 2f). Маданият учурундагы жыйрылышына электрдик стимулдаштыруунун таасирин баалоо үчүн, биз көлөкөлүү алгоритмди колдонуу менен активдүү деформацияны аныктоо ыкмасын иштеп чыктык (Кошумча 2a,b-сүрөт) жана электрдик стимулдаштыруу менен жана жок деформацияларды айырмалай алдык. Жүрөктүн ошол эле бөлүмү (сүрөт 2f). Кесүүнүн кыймылдуу аймагында (R6-9) электрдик стимулдаштыруу учурундагы чыңалуу электрдик стимуляция болбогонго караганда 20% жогору болгон, бул электрдик стимулдаштыруунун жыйрылуу функциясына кошкон салымын көрсөтөт.
Аба камерасынын басымынын, суюктук камерасынын басымынын жана кыртыштын кыймылынын өлчөөлөрүнүн өкүлдөрүнүн издери камеранын басымы суюктук камерасынын басымын өзгөртүп, кыртыш кесиминин тиешелүү кыймылын пайда кылаарын тастыктайт. б пайыздык созулган (көк) пайыздык созулган (кызгылт сары) тиешелүү ткандардын бөлүмдөрүнүн өкүлү издери. c Жүрөк кесиминин өлчөнгөн кыймылы кыймылдын өлчөнгөн ылдамдыгына шайкеш келет. (г) Жүрөктүн бир кесиминдеги циклдик кыймылдын (көк сызык) жана ылдамдыктын (кызгылт сары чекиттүү сызык) репрезентативдик траекториялары. е Цикл убактысынын сандык көрсөткүчү (n = 19 ар кандай чочколордун ар бир кесимдери), жыйрылуу убактысы (n = 19 тобуна кесимдери), эс алуу убактысы (n = 19 кесим тобуна, ар кандай чочколордун), кыртыш кыймылы (n = 25). тилимдер) / ар кандай чочколордун тобу), чокусу систолалык ылдамдыгы (n = 24 (D0), 25 (D12) ар кандай чочколордун тилим / топ) жана чокусу релаксация курсу (n = 24 (D0), 25 (D12) ар кандай чочколордун тилим / топ). Эки куйруктуу Студенттин t-тест кандайдыр бир параметрде олуттуу айырманы көрсөткөн жок. f Өкүл штамм талдоо кыртыш бөлүмдөрүнүн издери (кызыл) жана жок (көк) электрдик стимулдаштыруу, ошол эле бөлүмдөн кыртыш бөлүмдөрүнүн он аймактык аймактары. Төмөнкү панелдер ар кандай секциялардан он аймакта электрдик стимуляциясы бар жана жок кыртыш бөлүмдөрүндөгү штаммдын пайыздык айырмасынын сандык көрсөткүчтөрүн көрсөтөт. (n = 8 тилим / ар кандай чочколордун тобу, Эки куйруктуу Студент t-тест жүргүзүлөт; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 тилим / ар кандай чочколордун тобу, Эки куйруктуу Студент t-тест жүргүзүлөт; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 секция/ар түрдүү чочколордун тобу, эки куйруктуу Студенттин t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p <0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p <0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 бөлүм/топ, ар кандай чочколордун, эки куйруктуу Студенттин t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Биздин мурунку статикалык биомиметикалык жүрөк кесим маданият системасында [20, 21], биз электрдик стимуляцияны колдонуу жана орто курамын оптималдаштыруу аркылуу 6 күн бою жүрөк кесимдердин жашоо жөндөмдүүлүгүн, функциясын жана структуралык бүтүндүгүн сактап калды. Бирок 10 күндөн кийин бул көрсөткүчтөр кескин кыскарган. Биз мурунку статикалык биомиметикалык маданият системасында өстүрүлгөн бөлүмдөргө кайрылабыз 20, 21 башкаруу шарттарында (Ctrl) жана биз мурда оптималдаштырылган чөйрөбүздү MC шарттары жана бир эле убакта механикалык жана электрдик стимулдаштыруу (CTCM) астында маданият катары колдонобуз. чакырды. Биринчиден, биз электрдик стимулдоосуз механикалык стимулдоо 6 күн бою ткандардын жашоо жөндөмдүүлүгүн сактоо үчүн жетишсиз экендигин аныктадык (Кошумча фиг. 3a, b). Кызыктуусу, STCMди колдонуу менен физикалык-механикалык жана электрдик стимулдаштырууну киргизүү менен, 12 күндүк жүрөк бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгү MS шарттарында жаңы жүрөк бөлүмдөрүндөй эле, бирок MTT анализи көрсөткөндөй, Ctrl шарттарында эмес (сүрөт 1). 3a). Бул механикалык стимулдаштыруу жана жүрөк циклинин симуляциясы биздин мурунку статикалык маданият системабызда билдирилгенден эки эсе көп кыртыш бөлүмдөрүн жашоого жөндөмдүү сактай аларын көрсөтүп турат. Бирок, жүрөк troponin T жана connexin 43 иммунолабелинги менен кыртыш бөлүмдөрүнүн структуралык бүтүндүгүн баалоо connexin 43 экспрессия ошол эле күнү башкаруу караганда 12 күнү MC кыртыштарда кыйла жогору экенин көрсөттү. Бирок, бирдиктүү connexin 43 туюнтмасы жана Z-дискинин түзүлүшү толук сакталган эмес (сүрөт 3b). Биз ткандардын структуралык бүтүндүгүн сандык баалоо үчүн жасалма интеллект (AI) алкагын колдонобуз26, тропонин-Т жана коннексин менен боёо43 негизинде сүрөткө негизделген терең үйрөнүү түтүгүн локализациянын күчү жагынан жүрөк тилкелеринин структуралык бүтүндүгүн жана флуоресценциясын автоматтык түрдө аныктоо үчүн колдонобуз. Бул ыкма шилтемеде сүрөттөлгөндөй, жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн автоматташтырылган жана калыс түрдө ишенимдүү сандык аныктоо үчүн Convolutional Neural Network (CNN) жана терең үйрөнүү негизин колдонот. 26. MC кыртыш статикалык башкаруу бөлүмдөрүнө салыштырмалуу күнү 0 жакшыртылган структуралык окшоштугун көрсөттү. Мындан тышкары, Массондун трихромдук боёосу маданияттын 12-күнүндөгү контролдук шарттарга салыштырмалуу MS шарттарында фиброздун бир кыйла төмөн пайызын аныктады (сүрөт 3c). CTCM 12-күнү жүрөк кыртышынын бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгүн жаңы жүрөк кыртышына окшош деңгээлге көтөрсө да, жүрөк бөлүмдөрүнүн структуралык бүтүндүгүн олуттуу түрдө жакшырта алган жок.
Штангалык графикте жаңы жүрөк тилкелеринин (D0) же жүрөк кесимдери культурасынын 12 күн бою статикалык культурада (D12 Ctrl) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) культурасынын MTT жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчтөрү көрсөтүлгөн, ANOVAg бир жол менен аткарылган сыноо бир жол менен айырмаланат; ####p <0,0001 D0 менен салыштырганда жана **p <0,01 D12 Ctrl менен салыштырганда). Штангалык диаграмма статикалык культурада (D12 Ctrl) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 күн бою жаңы жүрөк кесимдерин (D0) же жүрөк кесимдерин культурасынын 12 күн бою жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчүн көрсөтөт. ####p <0,0001 D0 менен салыштырганда жана **p <0,01 D12 Ctrl менен салыштырганда).гистограмма статикалык культурада (D12 контролдоо) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контролдоо). ) ), 12 (D12 MC) 12 күн бою MTT жаңы жүрөк бөлүмдөрүнүн (D0) же жүрөк бөлүмдөрүнүн маданиятынын сандык көрсөткүчүн көрсөтөт.####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 D0 менен салыштырганда жана **p <0,01 D12 Ctrl менен салыштырганда). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/组，卛运测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.001D C，与1D相比，**p。)12 күн бою статикалык культурада (D12 контролдоо) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контролдоо)) , 12 (D12 MC) бөлүмдөрүндө/топто 12 күн бою өстүрүлгөн жаңы жүрөк бөлүмдөрүндө (D0) же жүрөк бөлүмдөрүндө MTT жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчтөрүн көрсөткөн гистограмма, ар кандай ANOVA жолдорунан алынган тест;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001, D0 менен салыштырганда, **p <0,01, D12 Ctrl менен салыштырганда).b Troponin-T (жашыл), коннексин 43 (кызыл) жана DAPI (көк) жаңы бөлүнгөн жүрөк бөлүмдөрүндө (D0) же статикалык шарттарда (Ctrl) же CTCM шарттарында (MC) 12 күн бою өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрүндө репрезентативдик иммунофлуоресценттик сүрөттөр (бош шкала = 100 мкм). Жүрөк кыртышынын түзүмдүк бүтүндүгүн жасалма интеллект сандык аныктоо (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочконун кесиндилери/топ, бир тараптуу ANOVA сыноо жүргүзүлөт; ####p <0.0001 салыштырганда D0 жана ****0 C1.0 салыштырганда). Жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект сандык аныктоо (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун ар бири кесимдер/топ, бир тараптуу ANOVA сыноо жүргүзүлөт; ####p <0.0001 салыштырганда D0 жана D0.0 ****p <01 салыштырганда). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA < с#0#0; с #0#0 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун бөлүктөрү/группалары, бир жактуу ANOVA тести аткарылган; ####p <0.0001, D0 жана D0.0.0 менен салыштырылган).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочконун тилимдери/топтору, бир тараптуу ANOVA тести #0#0.#0;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун тилимдери/топтору, бир тараптуу ANOVA#01;#0#0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; #0#0#p <0 vs D#0#p1. < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн сандык аныктоо үчүн жасалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бөлүмдөрү / ар кандай чочколордун ар бири, бир тараптуу ANOVA тести; ####p<0.0001 vs .D0 Салыштыруу үчүн C0.010). c Өкүл сүрөттөрү (солдо) жана сандык аныктоо (оң) Массондун трихром тагы менен боёлгон жүрөк тилкелери үчүн (масштаб жылаңач = 500 мкм) (n = 10 тилим/топ ар башка чочко, бир тараптуу ANOVA тест жүргүзүлөт; ####p < 0,0001 салыштырганда D0 жана ***p <1 менен салыштырганда D0. Ctrl). c Өкүл сүрөттөрү (солдо) жана сандык аныктоо (оң) Массондун трихром тагы менен боёлгон жүрөк тилкелери үчүн (масштаб жылаңач = 500 мкм) (n = 10 тилим/топ ар кандай чочко, бир тараптуу ANOVA тест жүргүзүлөт; #### p < 0.0001 салыштырганда D0 жана ***01 менен салыштырганда. Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выпностний тест ANO# #; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). с Өкүл сүрөттөрү (солдо) жана жүрөк бөлүмдөрүнүн сандык (оң) Массондун трихром тагы менен боёлгон (капталбаган шкала = 500 мкм) (n = 10 бөлүктөрү / ар кандай чочколордун тобу, бир тараптуу ANOVA сыноо аткарылган; #### p <0 .0001 салыштырганда D0 жана ***1 салыштырганда C0.10). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=m =（右）（裸=尺0Ｚ 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ，每组来自不同的猪， Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺庺度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 # # p # 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньовой свиньи, потеснические протестических протестических специальности) анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). с Өкүл сүрөттөрү (солдо) жана жүрөк бөлүмдөрүнүн сандык (оң) Массондун трихром тагы (бош = 500 мкм) менен боёлгон (n = 10 бөлүм/топ, ар бир башка чочко, дисперсия бир жактуу талдоо менен сыналган ;### # p <0.0001 салыштырганда C1.0, ***p <1.0 салыштырганда).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Биз маданият чөйрөсүнө чакан молекулаларды кошуу менен кардиомиоциттердин бүтүндүгүн жакшыртса жана CTCM маданиятында фиброздун өнүгүшүн азайтууга болот деп божомолдодук. Ошондуктан биз баш аламандык факторлордун аздыгынан улам биздин статикалык башкаруу маданияттарыбыз20,21 колдонуу менен кичинекей молекулалар үчүн скрининг. Бул экран үчүн Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) жана SB431542 (SB) тандалган. Бул кичинекей молекулалар мурда sarcomere узундугун, T-түтүкчөлөрүн жана өткөрүү ылдамдыгын жогорулатуу менен кардиомиоциттердин жетилишине түрткү берүү үчүн hiPSC-CM маданияттарында колдонулган. Мындан тышкары, Dex (глюкокортикоид) жана SB да сезгенүүнү басат 29,30. Ошондуктан, биз бир же бул кичинекей молекулалардын айкалышы киргизүү жүрөк бөлүмдөрүнүн структуралык бүтүндүгүн жакшыртат, жокпу, сыналган. Алгачкы скрининг үчүн ар бир кошулманын дозасы көбүнчө клетка маданиятынын моделдеринде колдонулган концентрациялардын негизинде тандалып алынган (1 μM Dex27, 100 nM T327 жана 2.5 μM SB31). 12 күндүк маданияттан кийин, T3 жана Dex айкалышы оптималдуу кардиомиоциттердин структуралык бүтүндүгүн жана минималдуу фиброздук ремоделизациясын алып келди (Кошумча 4 жана 5-сүрөттөр). Мындан тышкары, бул T3 жана Dex концентрацияларын эки же эки эсе колдонуу кадимки концентрацияларга салыштырмалуу зыяндуу таасирлерди жараткан (Кошумча 6a, b сүрөт).
Баштапкы скринингден кийин, биз 4 маданият шартын башма-баш салыштырып көрдүк (Figure 4a): Ctrl: биздин оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен мурда сүрөттөлгөн статикалык маданиятыбызда өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрү; 20.21 TD: Шаршемби күнү T3 жана Ctrl s Added Dex; MC: биздин мурда оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен CTCMде өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрү; жана MT: T3 жана Dex менен CTCM ортого кошулду. 12 күндүк өстүрүүдөн кийин, MS жана MT кыртыштарынын жашоо жөндөмдүүлүгү MTT анализи менен бааланган жаңы кыртыштардагыдай эле калган (сүрөт 4b). Кызыктуусу, T3 жана Dexтин трансвелл культураларына (TD) кошулушу Ctrl шарттарына салыштырмалуу жашоо жөндөмдүүлүгүн олуттуу жакшыртууга алып келген жок, бул жүрөк бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгүн сактоодо механикалык стимулдаштыруунун маанилүү ролун көрсөтүп турат.
механикалык стимулдаштыруунун жана T3/Dex кошумчаларынын 12 күн бою чөйрөгө таасирин баалоо үчүн колдонулган төрт маданият шарттарын чагылдырган эксперименталдык дизайн диаграммасы. b Тилкелүү графикте культурадан 12 күн өткөндөн кийинки 4 культура шартында (Ctrl, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк тилкелерине (D0) салыштырмалуу жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчтөрү көрсөтүлгөн (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC) сыноо ANOVAg бир жолудан айырмаланган; ####p <0,0001, ###p <0,001 D0 жана **p <0,01 салыштырганда D12 Ctrl). b Тилкелүү графикте культурадан 12 күн өткөндөн кийинки 4 культура шартында (Ctrl, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк тилкелерине (D0) салыштырмалуу жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчтөрү көрсөтүлгөн (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC) сыноо ANOVAg бир жолудан айырмаланган; ####p <0,0001, ###p <0,001 D0 менен салыштырганда жана **p <0,01 D12 ctrl менен салыштырганда). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18) (D0, 18), TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 сравнению D2). b Тилкеде культурадан кийинки 12 күн ичинде бардык 4 культура шарттарында (контролдоо, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк бөлүктөрүнө (D0) салыштырмалуу жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчтөрү көрсөтүлгөн (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC, жана D12 MT), 12 (D12 MC) piways, piways бирден сыналышы; ####p <0,0001, ###p <0,001 vs. D0 жана **p <0,01 D12 Ctrl менен салыштырганда). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12Dl)) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001；####p < 0.0001；#0.0.0.相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). б Гистограмма бардык 4 маданият шарттарын (башкаруу, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк бөлүмдөрүнө салыштырганда (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), ар кандай чочко 12 (D12 MC) бөлүмдөрдүн / топтун, бир тараптуу ANOVA сыноо #0 #0, #0; ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. контролдоо D12). c Штангалык диаграммада культурадан 12 күн өткөндөн кийин 4 маданияттын бардык шарттарында (Ctrl, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырганда глюкоза агымынын сандык көрсөткүчү көрсөтүлгөн (n = 6 тилим/ар түрдүү чочколордун тобу, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт; ###p <0.001, D1ге салыштырмалуу ***p <0. Ctrl). c Штангалык диаграммада культурадан 12 күн өткөндөн кийин 4 маданияттын бардык шарттарында (Ctrl, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырганда глюкоза агымынын сандык көрсөткүчү көрсөтүлгөн (n = 6 тилим/ар түрдүү чочколордун тобу, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт; ###p <0.001, D1ге салыштырмалуу ***p <0. Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезовые отпуск) Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). с Гистограмма глюкоза агымынын 12 күндөн кийин маданияттын бардык 4 шарттарында (контролдоо, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк бөлүмдөрүнө (D0) салыштырмалуу сандык көрсөткүчтөрүн көрсөтөт (n = 6 бөлүктөрү / ар кандай чочколордун тобу, бир тараптуу ANOVA тести аткарылган; ###p <0.001 салыштырганда D0 жана ***0 C1 үчүн). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比1）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0 丛##01，相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 切片， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n =/ односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). с Гистограмма глюкоза агымынын 12 күндөн кийин маданияттан кийинки бардык 4 маданият шарттары үчүн (контролдоо, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк бөлүмдөрүнө (D0) салыштырмалуу сандык көрсөткүчтөрүн көрсөткөн гистограмма (n = 6 бөлүм/топ, ар кандай чочколордун, бир жактуу ANOVA тесттери аткарылды, ###p <0.001, D1 салыштырганда D0, ***p <0. (контроль).г Штаммды талдоо участоктору жаңы (көк), күн 12 MC (жашыл) жана күн 12 MT (кызыл) кыртыштар он аймактык кыртыш бөлүм пункттарында (n = 4 тилим / топ, бир тараптуу ANOVA сыноо; топтордун ортосунда эч кандай олуттуу айырма жок). 10-12 күн бою статикалык шарттарда (Ctrl) же MT шарттарында (MT) өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрүнө салыштырмалуу жаңы жүрөк бөлүмдөрүндө (D0) дифференциалдуу экспрессияланган гендерди көрсөткөн вулкан сюжети. f Маданияттын ар бир шартында өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрү үчүн саркомер гендердин жылуулук картасы. Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Май кислотасынын кычкылдануусунан гликолизге өтүүдө метаболизмдик көз карандылык кардиомиоциттердин дифференциациясынын өзгөчөлүгү болуп саналат. Жетиле элек кардиомиоциттер биринчи кезекте ATP өндүрүү үчүн глюкозаны колдонушат жана бир нече криста5,32 менен гипопластикалык митохондрияга ээ. Глюкозаны колдонуу анализдери MC жана MT шарттарында глюкозаны колдонуу 0 күндүк кыртыштарга окшош экенин көрсөттү (Figure 4c). Бирок, Ctrl үлгүлөрү жаңы кыртыштарга салыштырмалуу глюкозаны колдонуунун олуттуу өсүшүн көрсөттү. Бул CTCM жана T3/Dex айкалышы ткандардын жашоо жөндөмдүүлүгүн жогорулатат жана 12 күндүк маданияттуу жүрөк бөлүмдөрүнүн зат алмашуу фенотипти сактап турганын көрсөтүп турат. Мындан тышкары, штаммды талдоо штаммдын деңгээли MT жана MS шарттарында 12 күн бою жаңы жүрөк кыртышындагыдай бойдон калганын көрсөттү (сүрөт 4d).
CTCM жана T3 / Dexтин кардиологиялык кесим кыртышынын глобалдык транскрипциялык пейзажына жалпы таасирин талдоо үчүн, биз RNAseqти төрт түрдүү маданияттын бардык шарттарынан жүрөк тилкелеринде аткардык (Кошумча маалыматтар 1). Кызыктуусу, MT бөлүмдөрү 13,642 гендин ичинен 16 гана дифференциалдуу түрдө жаңы жүрөк кыртышына транскрипциялык окшоштуктарды көрсөттү. Бирок, биз мурда көрсөткөндөй, Ctrl кесимдери маданиятта 10-12 күндөн кийин 1229 дифференциалдуу экспрессияланган гендерди көрсөттү (сүрөт 4e). Бул маалыматтар жүрөк жана фибробласт гендердин qRT-PCR менен тастыкталган (Кошумча сүрөт 7a-c). Кызыктуусу, Ctrl бөлүмдөрү жүрөк жана клетка циклинин гендеринин төмөндөшүн жана сезгенүү гендик программаларын активдештирген. Бул маалыматтар, адатта, узак мөөнөттүү өстүрүүдөн кийин пайда болгон дедифференциялоо MT шарттарында толугу менен начарлайт (Кошумча 8a, b сүрөт). Саркомер гендерин кылдат изилдөө MT шарттарында гана саркомерди (4f-сүрөт) жана ион каналын (кошумча 9-сүрөт) коддоочу гендер сакталып, аларды Ctrl, TD жана MC шарттарында басуудан коргой турганын көрсөттү. Бул маалыматтар механикалык жана гуморалдык стимулдаштыруунун (T3/Dex) айкалышы менен жүрөк кесиминин транскриптому маданиятта 12 күндөн кийин жаңы жүрөк тилкелерине окшош бойдон кала аларын көрсөтүп турат.
Бул транскрипциялык жыйынтыктар жүрөк бөлүмдөрүндөгү кардиомиоциттердин структуралык бүтүндүгү MT шарттарында 12 күн бою сакталып калгандыгы менен тастыкталат, бул бузулбаган жана локализацияланган коннексин 43 (сүрөт 5а) тарабынан көрсөтүлгөн. Мындан тышкары, MT шарттарда жүрөк бөлүмдөрүндө фиброз Ctrl жана жаңы жүрөк бөлүмдөрүнө окшош (сүрөт. 5b) салыштырмалуу бир топ кыскарган. Бул маалыматтар механикалык стимулдаштыруу жана T3 / Dex дарылоо айкалышы натыйжалуу маданияты жүрөк бөлүмдөрүндө жүрөк түзүмүн сактап экенин көрсөтүп турат.
а тропонин-Т (жашыл), коннексин 43 (кызыл) жана DAPI (көк) репрезентативдик иммунофлуоресценция сүрөттөрү жаңы обочолонгон жүрөк бөлүмдөрүндө (D0) же 12 күн бою бардык төрт жүрөк бөлүмүнүн маданият шарттарында өстүрүлгөн (шкала тилкеси = 100 мкм). ). Жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект сандык баалоо (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) ар кандай чочколордун кесиндилери / тобу, бир тараптуу ANOVA тести өткөрүлөт; ####p <0.0001 менен салыштырганда, D <0.0****0, D12 Ctrl менен салыштырганда 0,0001). Жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект сандык аныктоо (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) ар кандай чочколордун кесиндилери/топ, бир тараптуу ANOVA тест жүргүзүлөт; #### p < 0.0001 салыштырганда D <0 ****0, же <0.0.0. D12 Ctrl менен салыштырганда 0,0001). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведенный A# ##NOVA; 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасалма интеллект (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) ар кандай чочколордун бөлүктөрү/группасынын жардамы менен жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн сандык аныктоо, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлгөн; #### p <0.0001 жана D <0.0001 салыштырганда * 0.00 же *p <****0. D12 Ctrl менен салыштырганда 0,0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*5 減p <0.）切片0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12） mc 缉 缉人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和撌*p < 0,05p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。бир жактуу ANOVA сыноо менен ар кандай чочко (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) бөлүмдөр / топ) жасалма интеллект колдонуу менен жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн сандык аныктоо;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 D0 жана *p < 0,05 же ****p < 0,0001 салыштырмалуу D12 Ctrl). б Массондун трихромдук боёгу менен боёлгон жүрөк тилкелеринин өкүлчүлүгүнүн сүрөттөрү жана сандык көрсөткүчү (Масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), 9 (D12 MT) ар кандай чочколордун кесимдери/топтору, #NOVA, бир жолу сыноодон өткөрүлдү; D0 менен салыштырганда 0,0001 жана ***p <0,001, же D12 Ctrl менен салыштырганда ****p <0,0001). б Массондун трихромдук боёгу менен боёлгон жүрөк тилкелеринин өкүлчүлүгүнүн сүрөттөрү жана сандык көрсөткүчү (Масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), 9 (D12 MT) ар кандай чочколордун кесимдери/топтору, #NOVA, бир жолу сыноодон өткөрүлдү; D0 менен салыштырганда 0,0001 жана ***p <0,001, же D12 Ctrl менен салыштырганда ****p <0,0001). б Репрезентативные изображения жана количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT разг12), 9 с рупх () свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). б Өкүл сүрөттөрү жана жүрөк бөлүмдөрүнүн сандык Массондун трихромдук боёк менен боёлгон (масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), 9 (D12 MT) ар кандай чочколордун бөлүмдөрү/тобу, бир тараптуу ANOVA жана аткарылган ##00. ***p <0,001 же ****p <0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）1（D10（2D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差）0#p#0#p.与D0 相比，***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 （（0dn = 500（0dn d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 өткөндүтүдүъ edin haber yararlanine切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素斆##p 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 б Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 от MT) способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). б Өкүл сүрөттөрү жана Массондун trichrome менен боёлгон жүрөк бөлүмдөрүнүн сандык (масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), 9 (D12 MT) ар кандай чочколордун / топтун бөлүмдөрү, бир ANOVA ыкмасы; ###0 салыштырганда; ##0, *** <#0. D12 Ctrl менен салыштырганда 0,001 же ****p < 0,0001).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Акыр-аягы, жүрөк гипертрофия туурап CTCM жөндөмдүүлүгү жүрөк кыртышынын созулуп жогорулатуу менен бааланган. CTCMде аба камерасынын эң жогорку басымы 80 ммHg дан 80 mmHg ге чейин жогорулады. Art. (нормалдуу созуу) 140 мм рт.ст. (6а-сүрөт). Бул сунуунун 32% га көбөйүшүнө туура келет (сүрөт 6б), ал мурун гипертрофиядагыдай саркомердин узундугуна жетүү үчүн жүрөк бөлүмдөрү үчүн талап кылынган тиешелүү пайыздык чоюу катары көрсөтүлгөн. Жүрөк кыртышынын жыйрылуу жана эс алуу учурундагы созулушу жана ылдамдыгы маданияттын алты күн бою туруктуу бойдон калган (сүрөт 6c). MT шарттарынан жүрөк кыртыштары алты күн бою нормалдуу сунуп (MT (Нормал)) же ашыкча шарттарга (MT (OS)) дуушар болгон. Маданиятта төрт күндөн кийин, гипертрофиялык биомаркер NT-ProBNP MT (нормалдуу) шарттарга салыштырмалуу MT (OS) шарттарында чөйрөдө кыйла жогорулаган (сүрөт 7a). Мындан тышкары, алты күн өстүрүү кийин, MT (OS) клетка өлчөмү (сүрөт. 7b) олуттуу MT жүрөк (нормалдуу) бөлүмдөрүнө салыштырмалуу көбөйгөн. Мындан тышкары, NFATC4 өзөктүк көчүрүү кыйла overstretched кыртыштарда көбөйгөн (сүрөт. 7c). Бул жыйынтыктар гипердистенсиядан кийин патологиялык ремоделизациянын прогрессивдүү өнүгүшүн көрсөтүп турат жана CTCM аппараты созулган жүрөк гипертрофиясынын сигналын изилдөө үчүн платформа катары колдонулушу мүмкүн деген түшүнүктү колдойт.
Аба камерасынын басымынын, суюктук камерасынын басымынын жана кыртыштын кыймылынын өлчөөлөрүнүн өкүлдөрүнүн издери камеранын басымы суюктук камерасынын басымын өзгөртүп, кыртыш кесиминин тиешелүү кыймылын пайда кылаарын тастыктайт. б Адатта чоюлган (кызгылт сары) жана ашкере созулган (көк) кыртыш бөлүмдөрү үчүн өкүлчүлүк пайыздык жана созуу ылдамдыгы ийри сызыктары. c Цикл убактысын көрсөткөн тилке (n = 19 ар кандай чочколордун кесимдери), жыйрылуу убактысы (n = 18-19 ар бир топко, ар кандай чочколордун), релаксация убактысы (n = 19 кесим ар бир топко, ар кандай чочколордун) ), ткандардын кыймылынын амплитудасы (n = 14, ар кандай кесимдер/группалар), (N = 14 тилим / топ, ар кандай чочко) жана чокусу эс курсу (n = 14 (D0), 15 (D6) ) бөлүмдөрү / топтору) ар кандай чочко), эки куйруктуу Студенттин t-тест эч кандай параметр эч кандай олуттуу айырманы көрсөттү, бул параметрлер маданияттын overvolt күн 6 ичинде туруктуу бойдон калганын көрсөтүп турат. Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
MT нормалдуу созулган (Норм) же ашыкча созулган (OS) шарттарында өстүрүлгөн (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm жана D4 MTOS) жүрөк кесиминен маданият чөйрөсүндөгү NT-ProBNP концентрациясынын штрих диаграммасынын сандык көрсөткүчү, эки түрдүү ANO01 жолудан аткарылган. кадимки созулганга салыштырмалуу). MT нормалдуу созулган (Норм) же ашыкча созулган (OS) шарттарында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm жана D4 MTOS) кесимден/топто өстүрүлгөн жүрөк кесиминен маданият чөйрөсүндөгү NT-ProBNP концентрациясын штрих-график сандык аныктоо, эки жол менен аткарылат A**p; Кадимки созулганга салыштырмалуу 0,01).Кадимки MT сунуу (норма) же ашыкча созуу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm жана D4).MTOS) шартында өстүрүлгөн жүрөк кесиминен маданият чөйрөсүндөгү NT-ProBNP концентрациясынын сандык гистограммасы, эки түрдүү пикторлордун диапазондору;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **п <0,01 кадимки созулганга салыштырмалуу). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01 MT нормалдуу созулган (Норм) же ашкере созулган (OS) шарттарында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ар түрдүүчө өстүрүлгөн жүрөк тилкелериндеги NT-ProBNP концентрациясынын сандык көрсөткүчү.猪的切片/组，可以双向方方发发动;гистограмма NT-ProBNP концентрацияларынын нормалдуу MT сунуу (норма) же ашыкча созуу (OS) шарттарында өстүрүлгөн жүрөк тилкелериндеги сандык көрсөткүчү (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) жана D4 MTOS) ар кандай чочколордун кесимдери/тобу, эки тараптуу талдоо;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **п <0,01 кадимки созулганга салыштырмалуу). б troponin-T жана WGA (солдо) жана клетка өлчөмүн өлчөө (оң) менен боёлгон жүрөк тилкелери үчүн өкүлү сүрөттөрү (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеткалар / ар кандай чочколордун 10 ар кандай кесимден тобу, Эки куйруктуу Студенттик t-test ****p 01 салыштырмалуу нормалдуу аткарылган. б troponin-T жана WGA (солдо) жана клетка өлчөмүн өлчөө (оң) менен боёлгон жүрөк тилкелери үчүн өкүлү сүрөттөрү (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ар кандай чочколордун 10 ар кандай кесимден клеткалар / топ, Эки куйруктуу Студенттин t-01 салыштырганда нормалдуу аткарылган ****0. созуу). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) жана количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). б troponin-T жана AZP (солдо) жана клетка өлчөмүн өлчөө (оң) менен боёлгон жүрөк бөлүмдөрүнүн өкүлү сүрөттөрү (н = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеткалар / ар кандай чочколордун 10 ар кандай бөлүмдөрүнүн, эки куйруктуу Студенттин t-тест ****01 салыштырганда аткарылган <01 ); б MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学检验；与正常拉伸相比，****p <0,0001）。 б Калкареин-T жана WGA (солдо) жана клетканын өлчөмү (оң) менен боёлгон жүрөк кесимдердин репрезентативдик сүрөттөрү (n = 330 (D6 MTOS), 10 түрдүү кесимден 369 (D6 MTNorm)) Cells/组，两方组，两方组，两方泾par test созулуп, ****p <0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) жана количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) двусторонние критерий Стьюдента; б troponin-T жана AZP (солдо) менен боёлгон жүрөк бөлүмдөрүнүн өкүлү сүрөттөрү жана клетка өлчөмүн (оңдо) сандык аныктоо (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ар кандай чочколордун 10 ар кандай бөлүмдөрдөн) Клеткалар / топ, эки куйруктуу Студенттик критерийи; ****p <0,0001 кадимки штаммга салыштырмалуу). с өкүлү сүрөттөр күнү 0 жана күн 6 MTOS жүрөк тилкелери үчүн immunolabeled troponin-T жана NFATC4 жана NFATC4 CMs ядролоруна көчүрүү сандык аныктоо (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ар кандай чочколордун кесиндилери / топтун, Эки-куйрукту Студенттер аткарылган * t
Котормо жүрөк-кан тамыр изилдөө так жүрөк чөйрөсүн кайра уюлдук моделдерин талап кылат. Бул изилдөөдө CTCM аппараты иштелип чыккан жана жүрөктүн өтө ичке бөлүктөрүн стимулдайт. CTCM системасы физиологиялык синхрондуу электромеханикалык стимулдаштырууну жана T3 жана Dex суюктуктарын байытууну камтыйт. Чочконун жүрөк бөлүмдөрү бул факторлорго дуушар болгондо, алардын жашоо жөндөмдүүлүгү, структуралык бүтүндүгү, зат алмашуу активдүүлүгү жана транскрипциялык экспрессиясы 12 күндөн кийин маданияттын жаңы жүрөк кыртышындагыдай эле калган. Мындан тышкары, жүрөк кыртышынын ашыкча чоюлуп, гиперэкстензия менен шартталган жүрөктүн гипертрофиясын алып келиши мүмкүн. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар жүрөктүн нормалдуу фенотипти сактоодо физиологиялык маданият шарттарынын маанилүү ролун колдойт жана дары-дармектерди текшерүү үчүн аянтчаны камсыз кылат.
Кардиомиоциттердин иштеши жана жашоосу үчүн оптималдуу шарттарды түзүүгө көптөгөн факторлор көмөктөшөт. Бул факторлордун эң көрүнүктүүлөрү (1) клетка аралык өз ара аракеттенүү, (2) электромеханикалык стимул, (3) гуморалдык факторлор жана (4) метаболизмдик субстраттарга байланыштуу. Физиологиялык клеткадан клеткага өз ара аракеттенүү клеткадан тышкаркы матрица тарабынан колдоого алынган бир нече клетка типтеринин татаал үч өлчөмдүү тармактарын талап кылат. Мындай татаал клеткалык өз ара аракеттенүүлөрдү in vitro шартында клетканын айрым түрлөрүн биргелешип өстүрүү жолу менен калыбына келтирүү кыйын, бирок жүрөк бөлүмдөрүнүн органотиптик табиятын колдонуу менен оңой жетүүгө болот.
Кардиомиоциттердин механикалык сунуусу жана электрдик стимуляциясы жүрөктүн фенотибин сактоо үчүн маанилүү болуп саналат33,34,35. Механикалык стимулдаштыруу hiPSC-CM кондициялоо жана жетилүү үчүн кеңири колдонулуп келгени менен, бир нече көрктүү изилдөөлөр жакында бир огунан жүктөөнүн жардамы менен маданиятта жүрөк тилкелерин механикалык стимулдаштырууга аракет кылышкан. Бул изилдөөлөр көрсөткөндөй, 2D uniaxial механикалык жүктөө маданият учурунда жүрөктүн фенотипине оң таасирин тийгизет. Бул изилдөөлөрдө жүрөктүн бөлүктөрү же изометрдик чыңалуу күчтөрү менен17, сызыктуу ауксотоникалык жүктөм менен18 жүктөлгөн же жүрөк цикли күч өзгөрткүчүнүн пикири жана чыңалуу дисктери аркылуу кайра түзүлгөн. Бирок, бул ыкмалар айлана-чөйрөнү оптималдаштыруусуз бир октуу кыртыштын созулушун колдонушат, натыйжада көптөгөн жүрөк гендери басылышы же анормалдуу созуу реакциялары менен байланышкан гендердин ашыкча экспрессиясы. Бул жерде сүрөттөлгөн CTCM цикл убактысы жана физиологиялык сунуу (25% сунуу, 40% систола, 60% диастола жана мүнөтүнө 72 согуу) боюнча табигый жүрөк циклин туураган 3D электромеханикалык стимул менен камсыз кылат. Бул үч өлчөмдүү механикалык стимулдоо ткандардын бүтүндүгүн сактоо үчүн жетиштүү болбосо да, ткандардын жашоо жөндөмдүүлүгүн, функциясын жана бүтүндүгүн адекваттуу сактоо үчүн T3/Dex аркылуу гуморалдык жана механикалык стимулдаштыруунун айкалышы талап кылынат.
Гуморалдык факторлор чоңдордун жүрөк фенотипинин модуляциясында маанилүү роль ойнойт. Бул HiPS-CM изилдөөлөрүндө баса белгиленди, анда T3 жана Dex клетканын жетилишин тездетүү үчүн маданий медиага кошулган. T3 аминокислоталардын, канттардын жана кальцийдин клетка мембраналары аркылуу ташылышына таасир этиши мүмкүн36. Мындан тышкары, T3 түйүлдүк CM жай тармал myofibrils салыштырмалуу жетилген кардиомиоциттердин тез Twitch myofibrils пайда болушуна өбөлгө, MHC-α туюнтма жана MHC-β downregulation өбөлгө түзөт. Гипотиреоз менен ооруган бейтаптарда T3 жетишсиздиги миофибриллярдык тилкелердин жоголушуна жана тондун өнүгүү ылдамдыгынын төмөндөшүнө алып келет37. Декс глюкокортикоиддик рецепторлорго таасир этет жана обочолонгон перфузиялуу жүрөктөрдүн миокарддын жыйрылышын жогорулатат; 38 бул жакшыртуу кальций кени менен шартталган киришине (SOCE) 39,40 таасири менен байланыштуу деп эсептелет. Мындан тышкары, Dex анын рецепторлору менен байланышып, иммундук функцияны жана сезгенүүнү30 басуучу кеңири клетка ичиндеги жоопту пайда кылат.
Биздин натыйжалар физикалык механикалык стимулдаштыруу (MS) Ctrl салыштырмалуу жалпы маданият көрсөткүчтөрүн жакшырды, бирок маданият 12 күндүн ичинде жашоого жөндөмдүүлүгүн, структуралык бүтүндүгүн жана жүрөк экспрессиясын сактап кала алган жок экенин көрсөтүп турат. Ctrl менен салыштырганда, CTCM (MT) маданияттарына T3 жана Dex кошуу 12 күн бою жаңы жүрөк кыртыштары менен окшош транскрипция профилдерин, структуралык бүтүндүгүн жана метаболизм активдүүлүгүн жакшыртты. Мындан тышкары, кыртыштын чоюу даражасын көзөмөлдөө менен, STCM тутумунун ар тараптуулугун көрсөтүүчү гиперэкстензия менен шартталган жүрөк гипертрофиясынын модели түзүлдү. Белгилей кетчү нерсе, жүрөктүн ремоделизациясы жана фиброз, адатта, кан айлануучу клеткалары тиешелүү цитокиндерди, ошондой эле фагоцитозду жана башка ремоделизациялоочу факторлорду камсыз кыла алган бүтүн органдарды камтыса да, жүрөктүн бөлүмдөрү стресске жана травмага жооп катары фиброз процессин туурай алат. миофибробласттарга кирет. Бул мурун бул кардиологиялык кесим моделинде бааланган. Белгилей кетсек, CTCM параметрлери тахикардия, брадикардия жана механикалык кан айланууну колдоо (механикалык жүксүз жүрөк) сыяктуу көптөгөн шарттарды симуляциялоо үчүн басымды/электрдик амплитуданы жана жыштыкты өзгөртүү жолу менен модуляцияланышы мүмкүн. Бул системаны дары-дармекти текшерүү үчүн орточо өткөрүү жөндөмдүүлүгүнө ээ кылат. CTCMнин ашыкча стресстен келип чыккан жүрөк гипертрофиясын моделдөө жөндөмү бул системаны жекече терапия үчүн сыноого жол ачат. Жыйынтыктап айтканда, бул изилдөө механикалык сунуу жана гуморалдык стимулдаштыруу жүрөк кыртышынын бөлүмдөрүнүн маданиятын сактоо үчүн абдан маанилүү экенин көрсөтүп турат.
Бул жерде берилген маалыматтар CTCM бузулбаган миокардды моделдөө үчүн абдан келечектүү платформа экенин көрсөтүп турат да, бул маданият ыкмасы кээ бир чектөөлөр бар. CTCM маданиятынын негизги чектөөсү, ал кесимдерге үзгүлтүксүз динамикалык механикалык стресстерди киргизет, бул ар бир цикл учурунда жүрөк тилкесинин жыйрылышына активдүү мониторинг жүргүзүү мүмкүнчүлүгүн жокко чыгарат. Мындан тышкары, жүрөк бөлүмдөрүнүн (7 мм) кичинекей өлчөмүнө байланыштуу, салттуу күч сенсорлорун колдонуу менен маданият системаларынан тышкары систолалык функцияны баалоо мүмкүнчүлүгү чектелген. Учурдагы кол жазмада биз оптикалык чыңалууну жыйрылуу функциясынын көрсөткүчү катары баалоо менен бул чектөөнү жарым-жартылай жеңебиз. Бирок, бул чектөө мындан аркы иштерди талап кылат жана келечекте, мисалы, кальций жана чыңалуу сезгич боёкторду колдонуу менен оптикалык карта түзүү сыяктуу маданиятта жүрөк тилкелеринин иштешине оптикалык мониторинг жүргүзүү ыкмаларын киргизүү менен чечилиши мүмкүн. CTCM дагы бир чектөө жумушчу модели физиологиялык стресс (алдын ала жана кийин жүктөө) манипуляциялоо эмес. CTCMде басым 25% физиологиялык сунууну диастолада (толук сунуу) жана систолада (электрдик стимулдоо учурундагы жыйрылуу узундугу) өтө чоң ткандарда кайра жаратуу үчүн карама-каршы багыттар боюнча индукцияланган. Бул чектөө келечектеги CTCM конструкцияларында эки тараптан жүрөк кыртышына адекваттуу басым жасоо жана жүрөк камераларында пайда болгон басым-көлөм мамилелерин колдонуу менен алынып салынышы керек.
Бул кол жазмада билдирилген ашыкча созулган кайра куруу гипертрофиялык гиперстрейч сигналдарын имитациялоо менен чектелет. Ошентип, бул модель гуморалдык же нервдик факторлорго муктаж болбостон (бул системада жок) созулган гипертрофиялык сигнализацияны изилдөөгө жардам берет. КТКМдин көптүгүн жогорулатуу үчүн кошумча изилдөөлөр керек, мисалы, иммундук клеткалар менен биргелешип өстүрүү, циркуляциядагы плазманын гуморалдык факторлору жана нейрондук клеткалар менен бирге өстүрүү учурунда иннервация CTCM менен ооруну моделдөөнүн мүмкүнчүлүктөрүн жакшыртат.
Бул изилдөөдө он үч чочко колдонулган. Бардык жаныбарлар жол-жоболору институттук көрсөтмөлөргө ылайык аткарылган жана Louisville институттук жаныбарларды сактоо жана пайдалануу боюнча комитети тарабынан бекитилген. Аорта аркасы кысып, жүрөккө 1 л стерилдүү кардиоплегия куюлган (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, рН 4 чейин.); жүрөктөр муздак муздак кардиоплегиялык эритмеде муздун үстүндө лабораторияга жеткирилгенге чейин сакталган, ал адатта <10 мүнөт. жүрөктөр муздак муздак кардиоплегиялык эритмеде муздун үстүндө лабораторияга жеткирилгенге чейин сакталган, ал адатта <10 мүнөт. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. жүрөктөр муздак муздак кардиоплегиялык эритмеде муз үстүндө лабораторияга жеткирилгенге чейин сакталган, бул адатта <10 мүнөттү талап кылат.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Лабораторияга муз үстүндө ташыганга чейин жүрөктөрдү муз кардиоплегиясында сактаңыз, адатта <10 мин.
CTCM аппараты SolidWorks компьютердик дизайн (CAD) программасында иштелип чыккан. Маданият камералары, бөлгүчтөр жана аба камералары CNC тунук акрил пластиктен жасалган. Диаметри 7 мм болгон резервдик шакек борборундагы жогорку тыгыздыктагы полиэтиленден (HDPE) жасалган жана астындагы медианы жабуу үчүн колдонулган силикон о-шакекчесин жайгаштыруу үчүн о-шакек оюгу бар. Ичке кремний диоксиди мембранасы маданият камерасын бөлүүчү плитадан бөлүп турат. Силикон мембранасы 0,02 ″ калың силикон барактан лазер менен кесилген жана катуулугу 35А. Төмөнкү жана үстүнкү силикон прокладкалары 1/16 ″ калың силикон барактан лазер менен кесилген жана катуулугу 50А. 316L дат баспас болоттон жасалган бурамалар жана канат гайкалар блокту бекитүү жана герметикалык пломбаны түзүү үчүн колдонулат.
Атайын басма схемасы (PCB) C-PACE-EM системасы менен бириктирүү үчүн иштелип чыккан. ПХБдагы швейцариялык машина туташтыргыч розеткалары графит электроддоруна күмүш жалатылган жез зымдар жана электроддорго буратылган коло 0-60 бурамалар аркылуу туташтырылган. Басылып чыккан схема 3D принтеринин капкагына жайгаштырылат.
CTCM аппараты жүрөк циклине окшош башкарылуучу кан айлануу басымын түзгөн программалануучу пневматикалык кыймылдаткыч (PPD) тарабынан башкарылат. Аба камерасынын ичиндеги басымдын жогорулашы менен ийкемдүү силикон мембранасы кыртыштын астындагы чөйрөнү мажбурлап, жогору карай кеңейет. Андан кийин ткандын аймагы диастола учурунда жүрөктүн физиологиялык кеңейүүсүнө окшошуп, суюктукту бул чыгаруу менен чоюлат. Релаксациянын туу чокусунда графит электроддор аркылуу электрдик стимуляция жасалды, бул аба камерасындагы басымды төмөндөтүп, кыртыш бөлүмдөрүнүн кысылышын шарттады. Түтүктүн ичинде аба системасындагы басымды аныктоо үчүн басым сенсору бар гемостатикалык клапан бар. Басым сенсору тарабынан сезилген басым ноутбукка туташтырылган маалымат жыйноочуга колдонулат. Бул газ камерасынын ичиндеги басымды үзгүлтүксүз көзөмөлдөөгө мүмкүндүк берет. Камерадагы максималдуу басымга жеткенде (стандарттык 80 мм Hg, 140 mmHg OS), маалымат алуу аппаратына C-PACE-EM системасына 2 мс үчүн эки фазалуу чыңалуу сигналын түзүү үчүн сигнал жөнөтүү буйругу берилди, 4 В.
Жүрөк бөлүмдөрү алынган жана 6 скважинадагы маданият шарттары төмөнкүдөй аткарылган: жыйналган жүрөктөрдү өткөрүп берүүчү идиштен муздак (4° С) кардиоплегия камтыган легенге өткөрүңүз. Сол карынша стерилдүү бычак менен изоляцияланып, 1-2 см3 өлчөмүндө кесилген. Бул ткань блоктору кыртыштын тирөөчтөрүнө кыртыш клей менен бекитилип, Тирод эритмеси жана үзгүлтүксүз кычкылтектүү (3 г/л 2,3-бутандион монооксими (BDM), 140 mM NaCl (8,18 г) . ), (6 mM K40m) камтыган титирөөчү микротомдук кыртыш ваннасына жайгаштырылды. D-глюкоза (1,86 г), 10 мм HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М эритме), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М эритме), 1 л ddH2O чейин). Дирилдөөчү микротом 80 Гц жыштыгында, горизонталдык термелүү амплитудасы 2 мм жана 0,03 мм/с алдын ала ылдамдыкта 300 мкм калың кесимдерди кесүүгө коюлган. Эритмени муздатуу үчүн кыртыш ваннасы муз менен курчалган жана температура 4°Сде сакталган. Микротомдук ваннадан кыртыштын секцияларын муздун үстүндө үзгүлтүксүз кычкылтектелген Тирод эритмеси бар инкубациялоочу ваннага бир культура табакчасы үчүн жетиштүү бөлүмдөр алынганга чейин өткөрүңүз. Трансвелл культуралары үчүн кыртыш бөлүмдөрү стерилдүү 6 мм кеңдиктеги полиуретан таянычтарга бекитилип, 6 мл оптималдаштырылган чөйрөгө (199 орто, 1x ITS кошумчасы, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-щелочтук жана 2Х антибиотик-грибокко каршы) жайгаштырылды. Электрдик стимулдаштыруу (10 V, жыштыгы 1,2 Гц) C-Pace аркылуу кыртыш бөлүмдөрүнө колдонулган. TD шарттары үчүн, жаңы T3 жана Dex 100 нМ жана 1 μM ар бир орто өзгөртүү боюнча кошулган. Орто суткасына 3 жолу алмаштыруу алдында кычкылтек менен каныккан. Ткань бөлүмдөрү инкубатордо 37°C жана 5% СО2 менен өстүрүлдү.
CTCM культуралары үчүн кыртыш бөлүмдөрү модификацияланган Тироддун эритмеси камтылган Петри табакчасында атайын жасалган 3D принтерге жайгаштырылды. Аппарат жүрөктүн кесиминин өлчөмүн колдоо шакекчесинин аянтынын 25% га көбөйтүү үчүн иштелип чыккан. Бул Тирод эритмесинен чөйрөгө өткөндөн кийин жана диастола учурунда жүрөктүн бөлүмдөрү созулуп кетпеши үчүн жасалат. Гистоакрилдик клейди колдонуу менен калыңдыгы 300 мкм болгон секциялар диаметри 7 мм болгон таяныч шакекчеге бекитилди. Кыртыштын бөлүктөрүн таяныч шакекчеге бекиткенден кийин, ашыкча кыртыш бөлүктөрүн кесип жана тиркелген ткандардын бөлүктөрүн кайра муз үстүндөгү Тирод эритмеси ваннасына (4°C) бир аппарат үчүн жетиштүү бөлүмдөр даярдалганга чейин салыңыз. Бардык түзмөктөр үчүн жалпы иштетүү убактысы 2 сааттан ашпашы керек. 6 кыртыш бөлүмдөрү алардын колдоо шакекчелери менен бекитилгенден кийин, CTCM аппараты чогултулган. CTCM маданият камерасы 21 мл алдын ала кычкылтектелген чөйрө менен алдын ала толтурулган. Кыртыш бөлүмдөрүн маданият камерасына өткөрүп, аба көбүктөрүн пипетка менен кылдаттык менен алып салыңыз. Андан кийин кыртыш бөлүмү тешикке киргизилип, акырын ордуна басылган. Акырында, электроддун капкагын аппаратка коюп, аппаратты инкубаторго өткөрүңүз. Андан кийин CTCMди аба түтүгүнө жана C-PACE-EM тутумуна туташтырыңыз. Пневматикалык кыймылдаткыч ачылат жана аба клапаны CTCMди ачат. C-PACE-EM системасы эки фазалуу темпте 2 мс учурунда 1,2 Гцте 4 В жеткирүү үчүн конфигурацияланган. Электроддордо графит топтолуп калбашы үчүн чөйрөнү суткасына эки жолу, ал эми электроддорду күнүнө бир жолу алмаштырып турушту. Зарыл болсо, кыртыш бөлүмдөрү алардын астына түшүп калышы мүмкүн болгон аба көбүктөрүн чыгаруу үчүн алардын маданий кудуктарынан алынып салынышы мүмкүн. MT дарылоо шарттары үчүн, T3/Dex 100 нМ T3 жана 1 μM Dex менен ар бир орточо өзгөртүү менен жаңы кошулду. CTCM аппараттары инкубатордо 37°C жана 5% СО2 менен өстүрүлгөн.
Жүрөк тилкелеринин созулган траекторияларын алуу үчүн атайын камера системасы иштелип чыккан. SLR камерасы (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) Navitar Zoom 7000 18-108 мм макро линза менен колдонулган (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния). Визуализация чөйрөнү жаңы чөйрөгө алмаштыргандан кийин бөлмө температурасында аткарылды. Камера 51° бурчта жайгашкан жана видео секундасына 30 кадр менен жазылат. Биринчиден, ачык булактуу программалык камсыздоо (MUSCLEMOTION43) жүрөк тилкелеринин кыймылынын санын аныктоо үчүн Image-J менен колдонулган. Маска MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АКШ) аркылуу ызы-чуу болбош үчүн жүрөк кесимдерин согуу үчүн кызыккан аймактарды аныктоо үчүн түзүлгөн. Кол менен сегменттелген маскалар бардык сүрөттөргө кадр ырааттуулугунда колдонулат жана андан кийин MUSCLEMOTION плагинине өткөрүлөт. Muscle Motion анын кыймылынын маалымдама алкагына салыштырмалуу санын аныктоо үчүн ар бир кадрдагы пикселдердин орточо интенсивдүүлүгүн колдонот. Маалыматтар жазылган, чыпкаланган жана цикл убактысын эсептөө жана жүрөк циклинин учурунда кыртыштын созулушун баалоо үчүн колдонулган. Жазылган видео биринчи даражадагы нөл фазалуу санарип чыпкасынын жардамы менен кайра иштетилген. Кыртыштын созулушун (чокудан чокуга) сандык баалоо үчүн жазылган сигналдагы чокуларды жана ылдыйларды айырмалоо үчүн чокудан чокуга анализ жүргүзүлдү. Кошумчалай кетсек, детрендинг сигналдын дрейфин жок кылуу үчүн 6-даражадагы полиномияны колдонуу менен жүргүзүлөт. Программа коду MATLABда кыртыштын глобалдык кыймылын, цикл убактысын, релаксация убактысын жана жыйрылуу убактысын аныктоо үчүн иштелип чыккан (Кошумча программалык код 44).
Штаммды талдоо үчүн, механикалык созулган баалоо үчүн түзүлгөн ошол эле видеолорду колдонуу менен, биз алгач MUSCLEMOTION программасына ылайык кыймылдын чокуларын (эң жогорку (жогорку) жана эң төмөнкү (төмөнкү) кыймыл чекиттери) чагылдырган эки сүрөттү байкадык. Андан кийин биз кыртыш аймактарын сегменттерге бөлдүк жана сегменттелген кыртыштарга көлөкөлөө алгоритминин түрүн колдондук (Кошумча 2а сүрөт). Андан кийин сегменттелген кыртыш он жер астына бөлүнгөн жана ар бир беттеги стресс төмөнкү теңдеменин жардамы менен эсептелген: Штамм = (Sup-Sdown)/Sdown, мында Sup жана Sdown - тиешелүүлүгүнө жараша кездеменин үстүнкү жана астыңкы көлөкөлөрүнөн форманын аралыктары (Кошумча сүрөт .2b).
Жүрөк бөлүмдөрү 4% параформальдегидде 48 саатка бекитилди. Туруктуу ткандар 10% жана 20% сахарозада 1 саат, андан кийин 30% сахарозада түн ичинде суусуздандырылды. Андан кийин бөлүмдөр оптималдуу кесүүчү температура кошулмасына (OCT кошулмасына) салынып, акырындык менен изопентан/кургак муз ваннасында тоңдурулган. OCT кыстаруу блокторун -80 °Cде бөлүнгөнгө чейин сактаңыз. Слайддар 8 мкм калыңдыгы менен бөлүктөр катары даярдалган.
Жүрөк бөлүмдөрүнөн OCT алып салуу үчүн, слайддарды жылытуу блогунда 95 °C 5 мүнөткө ысытуу. Ар бир слайдга 1 мл PBS кошуу жана бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубациялоо, андан кийин бөлмө температурасында 15 мүнөт PBS ичинде 0,1% Тритон-X коюу менен бөлүмдөрдү өткөрөт. Спецификалык эмес антителолордун үлгү менен байланышуусуна жол бербөө үчүн слайддарга 1 мл 3% BSA эритмесин кошуп, бөлмө температурасында 1 саат инкубациялоо керек. Андан кийин BSA алынып салынды жана слайддар PBS менен жуулду. Ар бир үлгүнү карандаш менен белгилеңиз. Негизги антителолор (1% BSAда 1:200 суюлтулган) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) жана troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 мүнөттөн ашык убакыттан кийин кошулган. 1% BSA) чычканга каршы Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), коёнго каршы Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) кошумча 90 мүнөт PBS менен 3 жолу жуулат боёк кошулду жана слайддар векташилдке (Vector Laboratories) жайгаштырылды жана тырмак боёгу -x чоңойтуу) жана 40x чоңойтуу менен Keyence микроскобу менен жабылды.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS ичинде 5 мкг/мл WGA боёо үчүн колдонулган жана бөлмө температурасында 30 мүнөт бою туруктуу бөлүктөргө колдонулган. Андан кийин слайддар PBS менен жуулуп, ар бир слайдга судан карасы кошулуп, 30 мүнөт инкубацияланды. Андан кийин слайддар PBS менен жуулду жана vectashheld кыстаруу чөйрөсү кошулду. Слайддар Keyence микроскопунда 40 эсе чоңойтууда көрүлгөн.
OCT жогоруда сүрөттөлгөндөй үлгүлөрдөн алынып салынды. OCTти алып салгандан кийин, слайддарды түнү бою Буиндин эритмеси менен чөмтүрүңүз. Андан кийин слайддар дистилденген суу менен 1 саат чайкалып, андан кийин 10 мүнөткө Bibrich алоэ кислотасынын фуксин эритмесинде жайгаштырылды. Андан кийин слайддар дистилденген суу менен жууп, 5% фосфомолибден/5% фосфотунгсти кислотасынын эритмесинде 10 мүнөткө жайгаштырылды. Чайбай туруп, слайддарды анилин көк эритмесинин ичине 15 мүнөткө өткөрүңүз. Андан кийин слайддарды дистилденген суу менен жууп, 1% уксус кислотасынын эритмесинде 2 мүнөткө коюшту. Слайддар 200 Н этанолдо кургатылган жана ксилолго которулган. Боялган слайддар 10x объективдүү Keyence микроскопунун жардамы менен көрүлгөн. Фиброз аянтынын пайызы Keyence Analyzer программалык камсыздоосу аркылуу сандык аныкталды.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталог номери V13154, кээ бир өзгөртүүлөр менен өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык. Атап айтканда, 6 мм диаметри менен хирургиялык сокку MTT талдоо учурунда бирдиктүү ткандардын өлчөмүн камсыз кылуу үчүн колдонулган. Кыртыштар өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык MTT субстраты камтыган 12 скважиналуу пластинанын скважиналарына жекече капталган. Бөлүмдөр 37°С температурада 3 саат бою инкубацияланат жана тирүү кыртыш MTT субстратын метаболизмге алып, кызгылт көк формазан кошулмасын пайда кылат. МТТ эритмени 1 мл DMSO менен алмаштырып, жүрөк бөлүмдөрүнөн кызгылт көк формазанды бөлүп алуу үчүн 15 мүнөт 37 °C температурада инкубациялаңыз. Үлгүлөр DMSOда 1:10 96 көзөнөктүү тунук ылдый плиталарда суюлтулган жана кызгылт көк түстүн интенсивдүүлүгү 570 нмде Cytation пластина окугучунун (BioTek) жардамы менен өлчөнгөн. Окуулар жүрөктүн ар бир кесиминин салмагына нормалдаштырылган.
Жүрөктүн кесиндилери 1 мкСи/мл [5-3Н]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, АКШ) камтыган медиа менен алмаштырылды, мурда сүрөттөлгөндөй глюкозаны колдонуу анализи үчүн. 4 саат инкубациялоодон кийин, 100 мкл 0,2 Н HCl камтыган ачык микроцентрифуга түтүкчөсүнө 100 мкл чөйрөнү кошуңуз. Андан кийин түтүктү 500 мкл dH2O камтыган сцинтилляциялык түтүккө салып, 37°C температурада 72 саат бою [3H]2O бууланды. Андан соң микроцентрифуга түтүгүн сцинтилляциялык түтүкчөдөн чыгарып, ага 10 мл сцинтилляция суюктугун кошуңуз. Сцинтилляцияны эсептөө Tri-Carb 2900TR суюк сцинтилляциялык анализатордун (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, АКШ) жардамы менен аткарылган. Андан кийин глюкозаны колдонуу [5-3Н]-глюкозанын өзгөчө активдүүлүгүн, толук эмес тең салмактуулукту жана фонду, [5-3H]-энбелгисиз глюкозаны суюлтууну жана сцинтилляцияны эсептегичтин эффективдүүлүгүн эске алуу менен эсептелген. Маалыматтар жүрөктүн бөлүмдөрүнүн массасына нормалдаштырылган.
Trizolдо ткандарды гомогенизациялоодон кийин, РНК өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 аркылуу жүрөк бөлүмдөрүнөн бөлүнүп алынган. RNAsec китепканасын даярдоо, секвенирлөө жана маалыматтарды талдоо төмөнкүдөй аткарылды:
РНК китепканасын даярдоо үчүн баштапкы материал катары ар бир үлгүгө 1 мкг РНК колдонулган. Өндүрүүчүнүн сунуштарынан кийин Illumina (NEB, АКШ) үчүн NEBNext UltraTM РНК китепканасын даярдоо комплекти аркылуу секвенирлөө китепканалары түзүлдү жана ар бир үлгү үчүн атрибут ырааттуулугуна индекс коддору кошулду. Кыскача айтканда, мРНК поли-Т олигонуклеотиддери менен туташтырылган магниттик мончоктордун жардамы менен жалпы РНКдан тазаланган. Фрагментация NEBNext First Strand Synthesis Reaction Reaction Buffer (5X) ичинде жогорку температурада эки валенттүү катиондорду колдонуу менен жүргүзүлөт. Биринчи катар cDNA кокус гексамердик праймерлер жана M-MuLV тескери транскриптаза (RNase H-) аркылуу синтезделген. Экинчи катар cDNA андан кийин ДНК-полимераза I жана RNase H аркылуу синтезделет. Калган ашыкчалар экзонуклеаза/полимераза активдүүлүгү менен туюк учтарга айланат. ДНК фрагментинин 3′ учу аденилдештирилгенден кийин, аны гибриддештирүү үчүн даярдоо үчүн ага чач кычкачынын илмек түзүлүшү менен NEBNext адаптери тиркелет. 150-200 bp артыкчылыктуу узундуктагы cDNA фрагменттерин тандоо үчүн. китепкана фрагменттери AMPure XP тутумунун жардамы менен тазаланган (Бекман Култер, Беверли, АКШ). Андан кийин, адаптер менен байланган өлчөмү боюнча тандалган cDNA менен 3 мкл USER Enzyme (NEB, АКШ) ПТРге чейин 37°Cде 15 мүнөт, андан кийин 95°Cде 5 мүнөт колдонулган. Андан кийин ПТР Phusion High-Fidelity ДНК полимеразасы, универсалдуу ПТР праймерлери жана Индекс (X) праймерлери менен аткарылган. Акырында, ПТР өнүмдөрү тазаланган (AMPure XP системасы) жана китепкананын сапаты Agilent Bioanalyzer 2100 тутумунда бааланган. Андан кийин cDNA китепканасы Novaseq секвенеринин жардамы менен тизилди. Illumina'дан чийки сүрөт файлдары CASAVA Base Calling аркылуу чийки окууга айландырылган. Чийки маалыматтар окуу ырааттуулугун жана тиешелүү базалык сапаттарды камтыган FASTQ(fq) форматындагы файлдарда сакталат. Чыпкаланган секвенирлөө окууларын Sscrofa11.1 шилтеме геномуна дал келтирүү үчүн HISAT2 тандаңыз. Жалпысынан алганда, HISAT2 ар кандай өлчөмдөгү геномдорду, анын ичинде 4 миллиард базадан чоңураак геномдорду колдойт жана демейки маанилер көпчүлүк параметрлер үчүн коюлган. RNA Seq маалыматтарынан кошумча окууларды HISAT2, азыркы учурда жеткиликтүү болгон эң ылдам система, башка ыкмаларга караганда бирдей же жакшыраак тактык менен эффективдүү тегиздөө мүмкүн.
Транскрипттердин көптүгү гендин экспрессия деңгээлин түздөн-түз чагылдырат. Ген экспрессиясынын деңгээли геном же экзондор менен байланышкан транскрипттердин көптүгү (секвенирлөө саны) менен бааланат. Окулгандардын саны гендин экспрессия деңгээлине, гендин узундугуна жана секвенирлөө тереңдигине пропорционалдуу. FPKM (миллион базалык жупка тизилген транскрипттин миң базалык жупуна фрагменттер) эсептелген жана DESeq2 пакетинин жардамы менен дифференциалдык туюнтуунун P-маанилери аныкталган. Андан кийин биз орнотулган R-функциясынын “p.adjust” негизинде Бенжамин-Хочберг методун9 колдонуп, ар бир P мааниси үчүн жалган ачылыш ылдамдыгын (FDR) эсептеп чыктык.
Жүрөк бөлүмдөрүнөн бөлүнүп алынган РНК Thermo (Thermo, кат. № 11756050) SuperScript IV Vilo Master аралашмасын колдонуу менен 200 нг/мкл концентрациясында cDNAга айландырылды. Сандык RT-PCR Колдонмо Biosystems Endura Plate Microamp 384 көзөнөктүү тунук реакция плитасын (Термо, кат. № 4483319) жана микроамп оптикалык клей (Thermo, кат. № 4311971) колдонуу менен аткарылган. Реакция аралашмасы 5 мкл Taqman Fast Advanced Master миксинен (Thermo, cat № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer жана 3,5 мкл H2O ар бир скважинага аралашкан. Стандарттык qPCR циклдери иштетилип, КТ маанилери Applied Biosystems Quantstudio 5 реалдуу убакыттагы ПТР аспабы (384 скважиналуу модул; продукт № A28135) менен өлчөнгөн. Такман праймерлери Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (S816N), RGL1 (S816m), сатып алынган (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA21 (Ss04323794_m1) бардык үлгүлөр үй чарба ген GAPDH нормалдаштырылган.
NT-ProBNP медиа-релизинин баасы өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык NT-ProBNP комплекти (чочко) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) менен бааланган. Кыскача айтканда, ар бир үлгүдөн жана стандарттан 250 мкл ар бир скважинага эки нускада кошулган. Үлгүнү кошкондон кийин дароо ар бир скважинага 50 мкл анализ реагент A кошуңуз. Пластинканы акырын силкип, герметик менен жабыңыз. Андан кийин таблеткалар 37°С температурада 1 саатка инкубацияланган. Андан кийин эритмени соруңуз жана скважиналарды 350 мкл 1X жуу эритмеси менен 4 жолу жууп, ар бир жолу 1-2 мүнөт жуугуч эритмени инкубациялаңыз. Андан кийин ар бир скважинага 100 мкл Анализ реагенти В кошуп, пластиналык герметик менен жабыңыз. Планшет акырын чайкалып, 37°C температурада 30 мүнөткө инкубацияланган. Эритмени соруңуз жана скважиналарды 5 жолу 350 мкл 1X жуу эритмеси менен жууңуз. Ар бир кудукка 90 мкл субстрат эритмесин кошуп, пластинканы бекитиңиз. Пластина 37°С температурада 10-20 мүнөт инкубацияланат. Ар бир кудукка 50 мкл Stop Solution кошуңуз. Пластина дароо 450 нмде орнотулган Cytation (BioTek) пластина окугучунун жардамы менен өлчөнгөн.
5% түрү I ката ылдамдыгы менен параметрдин 10% абсолюттук өзгөрүшүн аныктоо үчүн> 80% кубаттуулукту камсыз кыла турган топтун өлчөмдөрүн тандоо үчүн кубаттуулукту талдоо жүргүзүлдү. 5% түрү I ката ылдамдыгы менен параметрдин 10% абсолюттук өзгөрүшүн аныктоо үчүн> 80% кубаттуулукту камсыз кыла турган топтун өлчөмдөрүн тандоо үчүн кубаттуулукту талдоо жүргүзүлдү. Анализ мощности выполнен для выбора размеров группа, которые обеспечат >80% мощности үчүн обнаружения 10% абсолюттук изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Power талдоо 5% түрү I ката чен менен 10% абсолюттук параметр өзгөрүшүн аныктоо үчүн> 80% бийликти камсыз кыла турган топ өлчөмдөрүн тандоо үчүн жүргүзүлдү.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности үчүн обнаружения 10% абсолютного изменения параметров жана 5% частоты ошибок типа I. 10% абсолюттук параметр өзгөртүү жана 5% түрү I ката курсун аныктоо үчүн> 80% бийликти камсыз кыла турган топ өлчөмүн тандоо үчүн күч талдоо жүргүзүлдү.Ткань бөлүмдөрү эксперимент алдында туш келди тандалып алынган. Бардык анализдер сокур абалда болгон жана үлгүлөр бардык маалыматтар талдангандан кийин гана чечмеленди. GraphPad Prism программасы (Сан-Диего, Калифорния) бардык статистикалык анализдерди жүргүзүү үчүн колдонулган. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-баалуулуктар <0.05 маанисинде маанилүү деп эсептелген. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-маанилери <0,05 маанисинде маанилүү деп эсептелген. Для всей статистики p-значения считались значимими при значениях <0,05. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-маанилери <0,05 маанисинде маанилүү деп эсептелген.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимими при значениях <0,05. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-маанилери <0,05 маанисинде маанилүү деп эсептелген.Эки куйруктуу Студенттин t-сынагы маалыматтарга 2 гана салыштыруу менен аткарылган. Бир тараптуу же эки тараптуу ANOVA бир нече топтордун ортосундагы маанилүүлүгүн аныктоо үчүн колдонулган. Пост-хок тесттерин аткарууда Тукейдин оңдоосу бир нече салыштырууларды эсепке алуу үчүн колдонулган. RNAsec маалыматтары Методдор бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй FDR жана p.adjust эсептөөдө өзгөчө статистикалык ойлорго ээ.
Изилдөө дизайны боюнча көбүрөөк маалымат алуу үчүн, бул макалага шилтемеленген Табиятты изилдөө отчетунун абстракттуулугун караңыз.
Посттун убактысы: 28-сентябрь 2022
