Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem pro CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro renovato utaris (aut modum compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut continua sustentatio praestetur, situm sine stylis et JavaScript demonstrabimus.
Morphogenesis intestini humani proprietates cryptovillorum microarchitecturae epithelialis tridimensionalis et ordinationis spatialis constituit. Haec structura singularis requiritur ad homeostasis intestini conservandam, protegendo locum cellularum primordialium in crypta basali ab antigenis microbialibus exogenis et eorum metabolitis. Praeterea, villi intestinales et mucus secretans cellulas epitheliales functionaliter differentiatas cum claustro protectivo in superficie mucosae intestinalis exhibent. Ergo, recreatio structurarum epithelialis tridimensionalium est crucialis ad constructionem exemplorum intestini in vitro. Notandum est quod intestinum mimeticum organicum in lamella morphogenesin tridimensionalem spontaneam epithelii intestinalis cum functionibus physiologicis et biomechanica auctis inducere potest. Hic, protocollum reproducibile praebemus ad morphogenesin intestinalem in intestino robuste inducendam in lamella microfluidica necnon in lamella hybrida Transwell inclusa. Methodos detalladas describimus ad fabricationem instrumentorum, culturam cellularum epithelialis Caco-2 vel organoidum intestinalium in condicionibus conventionalibus necnon in suggestu microfluidico, inductionem morphogenesis tridimensionalis, et characterizationem epitheliorum tridimensionalium constitutorum. Utentibus multis modis imaginandi. Hoc protocollo regenerationem microarchitecturae intestini functionalis assequitur per moderationem fluxus fluidi basolateralis per quinque dies. Nostra methodus morphogenesis in vitro utitur tensione detonsa physiologice pertinente et motu mechanico nec requirit machinationem cellularem complexam nec manipulationem, quae alias technicas existentes superare potest. Praevidimus protocollum nostrum propositum implicationes latas habere posse pro communitate investigationis biomedicae, methodum praebens ad regenerandas stratas epitheliales intestinales tridimensionales in vitro ad usus biomedicos, clinicos et pharmaceuticos.
Experimenta demonstrant cellulas epitheliales intestinales Caco-2, in "gut-on-a-chip"1,2,3,4,5 vel machinis microfluidicis bistratis6,7 cultas, morphogenesin tridimensionalem spontaneam in vitro subire posse sine clara intellegentia mechanismi subiacentis. In studio nostro recenti, invenimus remotionem antagonistarum morphogenorum basolateraliter secretorum ex machinis culturae necessariam et sufficientem esse ad morphogenesin epithelialem tridimensionalem in vitro inducendam, quod demonstratum est a Caco-2 et organoidis intestinalibus a patientibus derivatis. Cellulae epitheliales validatae sunt. In hoc studio, productionem cellularum et distributionem concentrationis antagonistae Wnt potentis, Dickkopf-1 (DKK-1), in intestinis in chip (gut-on-a-chip) et instrumentis microfluidicis modificatis, quae insertiones Transwell continent, quae "Hybrid Chip" appellantur, specialiter intendimus. Demonstramus additionem antagonistarum Wnt exogenorum (velut DKK-1, repressor Wnt 1, secreted frizzled-related protein 1, vel Soggy-1) ad intestina in chip morphogenesin inhibere vel stratum epitheliale 3D praestructum perturbare, quod suggerit accentum antagonisticum per culturam morphogenesin intestinalem in vitro responsabilem esse. Ergo, modus practicus ad morphogenesin robustam in interfacie epitheliali assequendam est removere vel minimaliter conservare gradus antagonistarum Wnt in compartimento basolaterali per purgationem activam (e.g., in suggestis gut-on-a-chip vel hybrid-on-a-chip) vel diffusionem. Mediis basolateralibus (e.g., ex insertionibus Transwell in magnas reservas basolaterales in puteis).
In hoc protocollo, methodum accuratam praebemus ad fabricanda microdispositiva "gut-on-a-chip" et "hybrid chips" Transwell-inseribiles (gradus 1-5) ad colendas cellulas epitheliales intestinales in membranis porosis polydimethylsiloxano (PDMS) fundatis (gradus 6A, 7A, 8, 9) vel membranis polyestericis insertorum Transwell (gradus 6B, 7B, 8, 9) et ad inducendam morphogenesin 3D in vitro (gradus 10). Etiam notas cellulares et moleculares, quae histogenesin specificam textus et differentiationem cellularem a stirpe dependentem indicant, per applicationem multiplicium modalitatum imaginum (gradus 11-24), identificavimus. Morphogenesin inducimus utens cellulis epithelialibus intestinalibus humanis, ut Caco-2 vel organoidis intestinalibus, in duobus formis culturae cum singularibus technicis, inter quas modificationem superficiei membranarum porosarum, creationem monostratorum 2D, et reproductionem biochemicam intestinalem et microambitus biomechanici in vitro. Ad inducendam morphogenesin 3D ex monostratis epithelialibus 2D, antagonistas morphogenorum in utroque cultu removimus. formatur per fluxum medii in compartimentum basolaterale culturae. Denique, repraesentationem utilitatis strati epithelialis tridimensionalis regenerabilis praebemus, quod adhiberi potest ad imitandum incrementum epitheliale morphogen-dependens, co-culturas longitudinales hospitis-microbiomi, infectionem pathogeni, laesionem inflammatoriam, dysfunctionem claustri epithelialis, et therapiae probioticas. Exemplum. influentiae.
Protocollum nostrum utile esse potest amplae varietati scientificorum in investigationibus fundamentalibus (e.g., biologia mucosae intestinalis, biologia cellularum primordialium, et biologia evolutionis) et applicatis (e.g., probationibus medicamentorum prae-clinicis, modellis morborum, machinatione textuum, et gastroenterologia) lato effectu. Propter reproducibilitatem et robustatem protocolli nostri ad morphogenesin tridimensionalem epithelii intestinalis in vitro inducendam, praevidimus nostram strategiam technicam divulgari posse ad auditores qui dynamicam signalationis cellularis per evolutionem, regenerationem vel homeostasis intestinalis student. Praeterea, protocollum nostrum utile est ad investigandam infectionem sub variis agentibus infectiosis, ut Norovirus 8, Syndroma Respiratoria Acuta Gravis Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 vel Vibrio cholerae. Utiles etiam sunt auditores pathologiae et pathogenesis morborum. Usus systematis microphysiologiae intestini in chip (in-chip) co-culturam longitudinalem 10 et subsequentem aestimationem defensionis hospitis, responsionum immunium et reparationis laesionum pathogenarum in tractu gastrointestinali (GI) 11 permittere potest. Aliae perturbationes GI cum syndroma intestini permeabilis, morbo coeliaco, morbo Crohn, colite ulcerosa, pouchitide, vel syndroma intestini irritabilis coniunctae simulari possunt cum strata epithelialia intestinalia tridimensionalia praeparantur utens stratis epithelialibus intestinalibus tridimensionalibus aegroti; hae morbi includunt atrophiam villorum, contractionem cryptarum, laesionem mucosae, vel impedimentum epitheliale imminutum. Biopsia vel organoida intestinalia derivata ex cellulis caulis 12,13. Ad melius modelandam maiorem complexitatem ambitus morbi, lectores considerare possunt addere genera cellularum morbo pertinentia, ut cellulas mononucleares sanguinis peripherici aegroti (PBMCs), ad exempla continentia microarchitecturas tridimensionales villorum-cryptarum intestinalium. Cellulae immuniae textus-specificae, 5.
Cum microstructura epithelii tridimensionalis sine processu sectionis figi et visualizari possit, spectatores transcriptomica spatiali et imagines altae resolutionis vel super-resolutionis laborantes in nostra delineatione dynamicae spatiotemporalis genorum et proteinorum in nidis epithelialibus fortasse interesse possint. Technologia interest. Responsio ad stimulos microbiales vel immunis. Praeterea, colloquia longitudinalia inter hospitem et microbioma 10, 14 quae homeostasis intestini coordinant, in strato mucosali intestinali tridimensionali constitui possunt per co-culturam variarum specierum microbialium, communitatum microbialium vel microbiota faecalis, praesertim in intestino in chip. in suggestu. Haec methodus imprimis attractiva est auditoribus qui immunologiam mucosalem, gastroenterologiam, microbioma humanum, culturomicam et microbiologiam clinicam student et microbiota intestinalia antea non culta in laboratorio colere volunt. Si protocollum nostrum morphogenesis in vitro ad formas culturae scalabiles, ut inserta multiputeorum in laminis 24, 96 vel 384 puteorum quae compartimenta basolateralia continenter replent, protocollum etiam divulgari potest ad eos qui systemata pharmaceutica, biomedica vel validationis altae capacitatis pro industria alimentaria evolvunt. Ut probatio principii, nuper demonstravimus possibilitatem systematis morphogenesis multiplex altae capacitatis scalabilis ad formam laminae 24 puteorum. Praeterea, producta multiplicia organ-on-a-chip commercializata sunt16,17,18. Ergo, validatio methodi nostrae morphogenesis in vitro accelerari et potentialiter adoptari potest a multis laboratorium investigationis, industria vel agentibus gubernationis et regulatoriis ad intellegendam reprogrammationem cellularem morphogenesis intestinalis in vitro in gradu transcriptomico ad probanda medicamenta vel... Biotherapeutica Absorptio et transportatio candidatorum medicamentorum aestimata est utens substitutis intestini tridimensionalibus vel utens exemplaribus organorum in lamina consuetudinariis vel commercialibus ad reproducibilitatem processus morphogenesis intestini metiendam.
Numerus limitatus exemplorum experimentalium humanis pertinentium ad morphogenesin epithelii intestinalis studendam adhibitus est, praecipue propter carentiam protocollorum implementabilium ad morphogenesin tridimensionalem in vitro inducendam. Re vera, magna pars scientiae hodiernae de morphogenesi intestini in studiis animalium fundatur (e.g., zebrafish20, mures21 vel pulli22). Attamen, labore et sumptibus intensiva sunt, ethice dubia esse possunt, et, quod est maximi momenti, processus evolutionis humanae accurate non determinant. Haec exempla etiam valde limitata sunt in facultate sua probandi modo multi-viae scalabili. Ergo, nostrum protocollum ad regenerandas structuras textuum tridimensionalium in vitro exempla animalium in vivo necnon alia exempla culturae cellularum bidimensionalium statica traditionalia superat. Ut antea descriptum est, usus structurarum epitheliorum tridimensionalium nobis permisit examinare localizationem spatialem cellularum differentiatarum in axe crypto-villoso in responsione ad varia stimuli mucosalibus vel immunibus. Strata epitheliorum tridimensionalium spatium praebere possunt ad studendum quomodo cellulae microbiales certant ad formandas nichos spatiales et evolutionem oecologicam in responsione ad factores hospitis (e.g., strata muci interna versus externa, secretio). IgA et peptidum antimicrobialium). Praeterea, morphologia epithelii tridimensionalis nobis permittere potest intellegere quomodo microbiota intestinalis suas communitates structurat et synergistice metabolitas microbiales (e.g., acida pinguia catenae brevis) producit, quae ordinationem cellularem et nichos cellularum primordialium in cryptis basalibus formant. Hae proprietates demonstrari possunt tantum cum strata epithelii tridimensionalia in vitro constituuntur.
Praeter nostram methodum creandi structuras epitheliales intestinales tridimensionales, plures methodi *in vitro* exstant. Cultura organoidum intestinalium est ars artis optimae ingeniariae textuum, quae innititur culturae cellularum primordialium intestinalium sub condicionibus morphogenicis specificis23,24,25. Attamen usus exemplorum organoidum tridimensionalium ad analysin translationis vel co-culturas hospitis-microbiomatis saepe difficilis est, quia lumen intestinale intra organoidem inclusum est, et ideo introductio partium luminalium, ut cellularum microbialium vel antigenorum exogenorum, limitata est. Accessus ad lumina organoidum microinjectore utens meliorari potest,26,27, sed haec methodus invasiva et laboriosa est, et peritiam specialem requirit ad perficiendum. Praeterea, culturae organoidum traditionales in scaffoldis hydrogel sub condicionibus staticis conservatae biomechanicam activam *in vivo* accurate non reflectunt.
Aliae rationes a pluribus gregibus investigationis adhibitae scaffolds hydrogel tridimensionales praestructas adhibent ad structuram epithelii intestinalis imitandam per culturam cellularum intestinalium humanarum isolatarum in superficie gel. Scaffolds hydrogel fabrica utens formis tridimensionaliter impressis, micro-fresatis, vel lithographice fabricatis. Haec methodus ordinationem auto-organizatam cellularum epithelii isolatarum in vitro cum gradientibus morphogeni physiologice pertinentibus ostendit, structuram epithelii altae proportionis aspectus et diaphoniam stroma-epitelii constituens includendo cellulas stromales in scaffold. Tamen, natura scaffoldorum praestructorum ostentationem processus morphogenetici spontanei ipsius impedire potest. Haec exempla etiam fluxum luminalem vel interstitialem dynamicum non praebent, carentes tensione fluidi quam cellulae intestinales egent ad morphogenesin subeundam et functionem physiologicam adipiscendam. Aliud studium recens scaffolds hydrogel in suggestu microfluidico usus est et structuras epithelii intestinalis exemplaribus utens technicis laser-etching designavit. Organoida intestinalia murina exemplaria incisa sequuntur ad structuras tubulares intestinales formandas, et fluxus fluidi intraluminalis recapitulari potest utens modulo microfluidico. Tamen, hoc exemplum neque... Processus morphogeneticos spontaneos exhibet nec motus mechanobiologicos intestini includit. Technicae impressionis tridimensionalis ab eodem grege potuerunt tubos intestinales miniaturas cum processibus morphogeneticis spontaneis creare. Quamvis fabricatione complexa segmentorum intestini diversorum intra tubum, hoc exemplar etiam fluxu fluidi luminalis et deformatione mechanica caret. Praeterea, operabilitas exemplaris limitata esse potest, praesertim postquam processus bioimpressionis completus est, condiciones experimentales vel interactiones inter cellulas perturbans. Loco eius, protocollum nostrum propositum morphogenesin intestini spontaneam, tensionem tonsionis physiologice pertinentem, biomechanicam quae motilitatem intestini imitatur, accessibilitatem compartimentorum apicalium et basolateralium independentium, et recreationem microambituum biologicorum complexorum modularitatis praebet. Ergo, protocollum nostrum morphogenesis tridimensionalis in vitro accessum complementarium ad superandas difficultates methodorum existentium praebere potest.
Protocollum nostrum omnino in morphogenesin epithelialem tridimensionalem intendit, cum solis cellulis epithelialibus in cultura et nullis aliis generibus cellularum circumdanterum, ut cellulis mesenchymalibus, cellulis endothelialibus, et cellulis immunibus. Ut antea descriptum est, nucleus protocolli nostri est inductio morphogenesis epithelialis per remotionem inhibitorum morphogeni secretorum in latere basolaterali medii introducti. Dum robusta modularitas intestini in chip et hybridi in chip nostri nobis permittit recreare stratum epitheliale tridimensionale undulantem, complexitates biologicae additionales, ut interactiones epitheliales-mesenchymales33,34, depositio Matricis extracellularis (ECM)35 et, in nostro exemplo, proprietates crypto-villorum quae nichos cellularum primordialium in cryptis basalibus significant, adhuc ulterius considerandae sunt. Cellulae stromales (e.g., fibroblastae) in mesenchyme partes claves agunt in productione proteinorum ECM et regulatione morphogenesis intestinalis in vivo35,37,38. Additio cellularum mesenchymalium ad nostrum exemplum processum morphogeneticum auxit. et efficacia adhaesionis cellularum. Stratum endotheliale (id est, vasa capillaria vel lymphatica) partes magnas agit in regulando translatione moleculari39 et adlectione cellularum immunium40 in microambitu intestini. Praeterea, componentes vasculaturae quae inter exempla textuum connecti possunt necessaria sunt cum exempla textuum designantur ad demonstrandas interactiones multi-organa. Ergo, cellulae endotheliales fortasse includi debent ad modelandas proprietates physiologicas accuratiores cum resolutione ad gradum organi. Cellulae immuniae a patientibus derivatae etiam essentiales sunt ad exhibendas responsa immunia innata, praesentationem antigeni, interpolationem immunitatis adaptivam innatam, et immunitatem specificam textuum in contextu imitationis morbi intestinalis.
Usus fragmentorum hybridorum simplicior est quam "gut-on-a-chip", quia dispositio instrumenti simplicior est et usus insertorum Transwell culturam epithelii intestini scalabilem permittit. Attamen, inserta Transwell in commercio cum membranis polyestericis non sunt elastica nec motus peristalticos simulare possunt. Praeterea, compartimentum apicale inserti Transwell in fragmento hybrido positi immobilis mansit sine ullo tensu scissorio in latere apicali. Patet proprietates staticas in compartimento apicali raro co-culturam bacterialem diuturnam in fragmentis hybridis permittunt. Dum morphogenesin tridimensionalem in insertis Transwell robuste inducere possumus cum fragmenta hybrida utimur, inopia biomechanicae physiologice pertinentis et fluxus fluidi apicalis facultatem suggestuum fragmentorum hybridorum pro applicationibus potentialibus limitare potest.
Reconstructiones plenae scalae axis cryptovillorum humanorum in culturis "gut-on-a-chip" et "hybrid-on-a-chip" nondum plene stabilitae sunt. Cum morphogenesis ex monostrato epitheliali incipiat, microarchitecturae tridimensionales (3D) non necessario similitudinem morphologicam cryptis in vivo praebent. Quamquam multitudinem cellularum proliferantium prope dominium cryptae basale in epithelio tridimensionali micromachinato descripsimus, regiones cryptae et villorum non clare delimitatae sunt. Quamquam canales superiores altiores in chip ad altitudinem auctam epithelii micromachinati ducunt, altitudo maxima adhuc ad ~300-400 µm limitatur. Profunditas actualis cryptarum intestinalium humanarum in intestinis tenui et crasso est ~135 µm et ~400 µm respective, et altitudo villorum intestini tenuis est ~600 µm (41).
Ex prospectu imaginum, imago in situ super-resolutionis microarchitecturarum tridimensionalium fortasse ad intestinum in lamella limitatur, cum distantia operandi necessaria a lente obiectiva ad stratum epitheliale paucorum millimetrorum sit. Ad hoc problema superandum, obiectivum longinquum fortasse requiritur. Praeterea, sectiones tenues ad praeparationem speciminis imaginum faciendas facere difficile est propter magnam elasticitatem PDMS. Insuper, cum microfabricatio strato per stratum intestini in lamella adhaesionem permanentem inter singula strata involvat, difficillimum est stratum superius aperire vel removere ad structuram superficialem strati epithelialis examinandam. Exempli gratia, per usum microscopii electronici scandentis (SEM).
Hydrophobicitas PDMS factor limitans fuit in studiis microfluidicis fundatis de moleculis parvis hydrophobicis, cum PDMS tales moleculas hydrophobicas non specifice adsorbere possit. Alternativae PDMS cum aliis materiis polymericis considerari possunt. Aliter, modificatio superficialis PDMS (e.g., obductio materiis lipophilicis 42 vel poly(ethylenoglycolo) 43 ) considerari potest ad adsorptionem molecularum hydrophobicarum minuendam.
Denique, methodus nostra non bene descripta est quoad praebendam examinationem magnae capacitatis vel suggestum experimentale "omnibus aptum" facile utendum. Protocollum hodiernum requirit antliam syringeticam per microdispositivum, quae spatium in incubatore CO2 occupat et experimenta magnae scalae impedit. Haec limitatio insigniter emendari potest per scalabilitatem formatorum culturae innovativorum (e.g., insertiones porosae 24-putorum, 96-putorum, vel 384-putorum quae continuam supplementationem et remotionem mediorum basolateralium permittunt).
Ad morphogenesin tridimensionalem epithelii intestinalis humani in vitro inducendam, instrumento intestinali microfluidico cum duobus microcanalibus parallelis et membrana elastica porosa interposito usi sumus, ut interfaciem luminis-capillaris crearemus. Etiam usum instrumenti microfluidici unius canalis (microfluidici hybridi) demonstramus, qui fluxum basolateralem continuum sub stratis epithelialibus polarizatis in insertis Transwell cultis praebet. In utroque suggestu, morphogenesis variarum cellularum epithelialis intestinalis humanarum demonstrari potest per manipulationem directionalem fluxus ad removendos antagonistas morphogenorum e compartimento basolaterali. Tota ratio experimentalis (Figura 1) quinque partibus constat: (i) microfabricatio microfluidici intestinalis vel microfluidici hybridi Transwell inserendi (gradus 1-5; Capsa 1), (ii) praeparatio cellularum epithelialis intestinalis (cellularum Caco-2) vel organoidum intestinalium humanorum; (capsae 2-5), (iii) cultura cellularum epithelialis intestinalis in fragmentis intestinalibus vel fragmentis hybridis (gradus 6-9), (iv) inductio morphogenesis tridimensionalis in vitro (gradus 10) et (v)) ad microstructuram epithelialem tridimensionalem describendam (gradus 11-24). Denique, grex moderatorius idoneus (de quo infra fusius disseritur) designatus est ad efficaciam morphogenesis in vitro validandam comparando morphogenesis epithelialis cum moderationibus spatialibus, temporalibus, conditionalibus vel proceduralibus.
Duabus diversis systematibus culturae usi sumus: "gut-on-a-chip" cum canalibus rectis vel canalibus non linearibus convolutis, vel "microfluid chip" continentibus insertis Transwell (TW) in instrumento microfluidico, fabricatis ut in Capsa 1 describitur, et gradibus 1-5. "Fabricatio Instrumenti" gradus principales in fabricatione microfluidi singularis vel microfluidi hybridi ostendit. "Cultura Cellularum Epithelialis Intestinalis Humanarum" fontem cellularum (Caco-2 vel organoida intestinalia humana) et processum culturae in hoc protocollo adhibitum explicat. "Morphogenesis in vitro" gradus generales ostendit quibus cellulae epitheliales Caco-2 vel organoidibus derivatae in microfluido intestinali vel in insertis Transwell microfluidi hybridi coluntur, deinde inductio morphogenesis 3D et formatio structurae epithelialis descriptae sequitur. Numerus gradus programmatis vel numerus capsae sub unaquaque sagitta ostendit. Applicatio exempla praebet quomodo strata epithelialia intestinalia constituta adhiberi possint, exempli gratia, in characterizatione differentiationis cellularum, studiis physiologiae intestini, constitutione oecosystematum microbiomatis hospitis, et modellatione morborum. Imagines immunofluorescentiae in "Cell..." "Differentiatio" nucleos, F-actinum et MUC2 in strato epitheliali 3D Caco-2 in fragmento intestini generato expressos ostendens. Signatio MUC2 in cellulis caliciformibus et muco a superficiebus mucosalibus secreto praesens est. Imagines fluorescentes in "Gut Physiology" mucum productum per tinctionem acidi sialici et residuorum N-acetylglucosamini utens agglutinino fluorescenti germinis tritici ostendunt. Duae imagines superpositae in "Host-Microbe Co-Cultures" co-culturas hospitis-microbiomi repraesentativas in intestino in fragmento ostendunt. Pars sinistra co-culturam E. coli exprimentis proteinum fluorescens viride (GFP) cum cellulis epithelialibus 3D Caco-2 micromachinatis ostendit. Pars dextra localizationem GFP E. coli co-cultae cum cellulis epithelialibus 3D Caco-2, secuta tinctione immunofluorescenti cum F-actino (rubro) et nucleis (caeruleis) ostendit. Modellatio morbi intestinum sanum contra permeabile in fragmentis inflammationis intestini sub provocatione physiologica cum antigenis bacterialibus (e.g., lipopolysaccharido, ...) illustrat. LPS) et cellulae immunes (e.g., PBMC; viridis). Cellulae Caco-2 cultae sunt ad stratum epitheliale tridimensionale constituendum. Scalae linea, 50 µm. Imagines in ordine imo: "Differentiatio cellularum" adaptata cum permissione ex referencia. 2. Oxford University Press; Reproducta cum permissione ex Ref. 5. NAS; "Co-cultura hospitis-microbi" adaptata cum permissione ex ref. 3. NAS; "Modelado morborum" adaptata cum permissione ex referencia. 5. NAS.
Tam fragmenta "gut-on-a-chip" quam fragmenta hybrida fabricata sunt ex exemplaribus PDMS quae ex formis siliconis per lithographiam mollem1,44 deformatae et cum SU-8 depictae sunt. Designatio microcanalum in unoquoque fragmento determinatur considerando hydrodynamicam, ut tensionem tonsionis et pressionem hydrodynamicam1,4,12. Designatio originalis "gut-on-a-chip" (Data Extensa Fig. 1a), quae ex duobus microcanalibus rectis parallelis iuxtapositis constabat, in complexum "gut-on-a-chip" evoluta est (Data Extensa Fig. 1b) quod par microcanalum curvatorum includit ad inducendum tempus residentiae fluidi auctum, exemplaria fluxus non linearia, et deformationem multiaxialem cellularum cultarum (Fig. 2a-f)12. Cum biomechanica intestini complexior recreanda est, complexa "gut-on-a-chip" eligi possunt. Demonstravimus fragmentum intestini convolutum etiam morphogenesin 3D fortiter inducere in simili temporis spatio cum simili gradu accretionis epithelialis comparato cum originali. Intestinum-Fragmentum, cuiuscumque generis cellulae cultae. Ergo, ad morphogenesin tridimensionalem inducendam, designia intestini linearia et complexa in fragmento intercambiabilia sunt. Exemplaria PDMS in formis siliconis cum exemplaribus SU-8 curata lineamenta negativa post deformationem praebuerunt (Figura 2a). Ad intestinum in fragmento fabricandum, stratum superius PDMS praeparatum successive ad pelliculam PDMS porosam iunctum est et deinde cum strato inferiore PDMS per iuncturam irreversibilem utens tractatore coronae alignata est (Figura 2b-f). Ad fragmenta hybrida fabricanda, exemplaria PDMS curata ad laminas vitreas iuncta sunt ad creanda instrumenta microfluidica canalis singularis quae insertiones Transwell accommodare possent (Figura 2h et Data Extensa Figura 2). Processus iunctionis perficitur tractando superficies exemplaris PDMS et vitri plasma oxygenii vel tractatione coronae. Post sterilisationem instrumenti microfabricati tubo siliconis affixi, apparatus paratus erat ad morphogenesin tridimensionalem epithelii intestinalis perficiendam (Figura 2g).
a, Schema illustrationis praeparationis partium PDMS ex formis siliconis SU-8 ornatis. Solutio PDMS non curata in formam siliconis (sinistra) infusa est, ad 60°C curata (media) et deformata (dextra). PDMS deformatum in partes sectum et ad usum ulteriorem purgatum est. b, Photographia formae siliconis ad stratum superius PDMS praeparandum adhibitae. c, Photographia formae siliconis ad membranam porosam PDMS fabricandam adhibitae. d, Series photographarum partium PDMS superioris et inferioris et instrumenti intestinalis in chip compositi. e, Schema ordinationis partium PDMS superioris, membranae et inferioris. Quodque stratum irreversibiliter per tractationem plasmatis vel coronae coniungitur. f, Schema instrumenti "gut-on-a-chip" fabricati cum microcanalibus convolutis superimpositis et cameris vacui. g, Apparatus "gut-on-a-chip" ad culturam cellularum microfluidicarum. Intestinum in chip fabricatum, cum tubo siliconis et syringe compositum, in lamella tegminis positum est. Instrumentum chip positum est. In operculo patinae Petri 150 mm ad processum. Ligamen ad claudendum tubum siliconis adhibetur. h, Imagines visuales fabricationis fragmenti hybridi et morphogenesis 3D utens fragmentis hybridis. Inserta Transwell separatim praeparata ad colenda monostrata 2D cellularum epithelialis intestinalis in fragmentum hybridum inserta sunt ad morphogenesin 3D intestinalem inducendam. Medium per microcanales sub strato cellulari in inserto Transwell constituto perfunditur. Scalae linea, 1 cm. h Reimpressus cum permissione ex referentia. 4. Elsevier.
In hoc protocollo, linea cellularum Caco-2 et organoida intestinalia ut fontes epitheliales adhibita sunt (Fig. 3a). Ambo genera cellularum separatim culta sunt (Arca 2 et Arca 5) et ad seminandum microcanales ECM-obductas intestini in chip vel insertorum Transwell adhibitae sunt. Cum cellulae confluentes sunt (>95% opertio in ampullis), cellulae Caco-2 regulariter cultae (inter passus 10 et 50) in ampullis T colliguntur ad suspensiones cellularum dissociatas per fluidum trypsinizationis praeparandas (arca 2). Organoida intestinalia humana ex biopsiis intestinalibus vel resectionibus chirurgicis in fornicibus Matrigel scaffold in laminis 24-puteorum culta sunt ad microambitum structuralem sustentandum. Medium continens morphogena essentialia (ut Wnt, R-spondin, et Noggin) et factores crescentiae praeparatos ut in Arca 3 descriptum est, alternis diebus suppletum est donec organoida ad ~500 µm in diametro creverunt. Organoida plene adulta colliguntur et in cellulas singulas dissociantur ad seminandum in... Inserta intestini vel Transwell in fragmento microscopico (Arca 5). Ut antea rettulimus, distingui potest secundum genus morbi12,13 (e.g., colitis ulcerosa, morbus Crohn, cancer colorectalis, vel donator normalis), locum laesionis (e.g., laesio contra aream non laesam) et locum gastrointestinalem in tractu (e.g., duodenum, ieiunum, ileum, caecum, colon, vel rectum). Protocollum optimum in Arca 5 praebemus ad colenda organoida colonica (coloida) quae typice maiores concentrationes morphogenorum requirunt quam organoida intestini tenuis.
a, Ordo operis ad inductionem morphogenesis intestini in fragmento intestini. Epithelium intestinale humanum Caco-2 et organoida intestinalia in hoc protocollo adhibentur ad morphogenesin tridimensionalem demonstrandam. Cellulae epitheliales isolatae in instrumento "gut-on-a-chip" praeparato seminatae sunt (praeparatio fragmenti). Postquam cellulae seminatae et membranae porosae PDMS die 0 (D0) adhaerentes sunt, fluxus apicalis (AP) initiatur et per primos duos dies conservatur (fluxus, AP, D0-D2). Fluxus basolateralis (BL) etiam initiatur una cum motibus cyclicis extensionis (extensio, fluxus, AP et BL) cum monostratum bidimensionale completum formatur. Morphogenesis 3D intestinalis sponte post 5 dies culturae microfluidicae (morphogenesis, D5) evenit. Imagines contrastus phasium morphologiam repraesentativam cellularum Caco-2 in quolibet gradu experimentali vel puncto temporis ostendunt (graphum columnarium, 100 µm). Quattuor diagrammata schematica cascadas correspondentes morphogenesis intestini illustrantia (summum dextram). Sagittae punctatae. In schemate directionem fluxus fluidi repraesentatur. b, Imago SEM topologiam superficialem epithelii tridimensionalis Caco-2 constituti ostendens (sinistra). Insertio aream amplificatam (quadratum album punctatum) illustrans microvillos regeneratos in strato tridimensionali Caco-2 (dextra) ostendit. c, Prospectus frontalis horizontalis membranarum Caco-2 tridimensionalis constitutarum, claudini (ZO-1, rubrae) et marginis penicilli continui F-actin (viridis) et nucleorum (caerulearum) designatarum. Visualizatio confocalis immunofluorescentia cellularum epithelialium in fragmentis intestinalibus. Sagittae ad schema medium spectantes locum plani focalis pro singulis prospectibus confocalibus indicant. d, Cursus temporalis mutationum morphologicarum in organoidis in fragmento cultis, per microscopiam contrastus phasium diebus 3, 7, 9, 11, et 13 obtentus. Insertio (summa dextra) magnam amplificationem imaginis provisae ostendit. e, Photomicrographia DIC epithelii tridimensionalis organoidis in intestino constituti in segmento die 7 capto. f, Superpositum. Imagines immunofluorescentiae ostendentes indices cellularum primordialium (LGR5; purpureo), cellularum caliciformium (MUC2; viridi), F-actini (cinereo) et nucleorum (cyano) in fragmentis intestini per 3 dies respective (sinistra) et organoidum 13 dierum (medium) in strato epitheliali cultorum. Vide etiam Figuram 3 Data Extensa, quae signalationem LGR5 sine signalatione MUC2 illustrat. Imagines fluorescentiae microstructuram epithelialem (dextram) epithelii organoidis 3D in intestino in fragmento constituti per tinctionem membranae plasmaticae cum tinctura CellMask (dextram) die 13 culturae ostendentes. Scala est 50 μm nisi aliter dictum est. b Reimpressum cum permissione ex referentia. 2. Oxford University Press; c Adaptatum cum permissione ex Referentia. 2. Oxford University Press; e et f adaptata cum permissione ex referentia. 12 Sub Licentia Creative Commons CC BY 4.0.
In intestino in lamella, necesse est superficiem hydrophobicam membranae porosae PDMS modificare ad prosperam obductionem ECM. In hoc protocollo, duas methodos diversas adhibemus ad hydrophobicitatem membranarum PDMS modificandam. Ad cellulas Caco-2 colendas, activatio superficialis per curationem UV/ozoni sola sufficiebat ad hydrophobicitatem superficiei PDMS reducendam, ECM obducendam et cellulas Caco-2 membranae PDMS adnectendas. Attamen, cultura microfluidica epithelii organoidi functionalizationem superficialem chemicam requirit ad depositionem efficientem proteinorum ECM assequendam per applicationem sequentialem polyethylenimini (PEI) et glutaraldehydi microcanalibus PDMS. Post modificationem superficialem, proteina ECM deposita sunt ad superficiem PDMS functionalizatam obtegendam et deinde in epithelium organoidi isolatum introducta. Postquam cellulae adnectuntur, cultura cellularum microfluidica incipit perfundendo solum medium in microcanal superiorem donec cellulae monostratum completum forment, dum microcanal inferior condiciones staticas servat. Haec methodus optimizata ad activationem superficialem et obductionem ECM adnecttionem organoidum permittit. epithelium ad morphogenesin tridimensionalem in superficie PDMS inducendam.
Culturae Transwell etiam tegumentum ECM requirunt ante seminationem cellularum; tamen culturae Transwell non requirunt gradus praeparationis complexos ad superficiem insertorum porosorum activandam. Ad cellulas Caco-2 in insertis Transwell crescendas, tegumentum ECM in insertis porosis adhaesionem cellularum Caco-2 dissociatarum (<1 hora) et formationem claustrae iuncturae strictae (<1-2 dies) accelerat. Ad organoida in insertis Transwell colenda, organoida isolata in insertis ECM tectis seminantur, superficiei membranae adhaerent (<3 h) et conservantur donec organoida monostratum completum cum integritate claustrae forment. Culturae Transwell in laminis 24 puteorum sine usu fragmentorum hybridorum perficiuntur.
Morphogenesis tridimensionalis in vitro initiari potest per applicationem fluxus fluidi ad aspectum basolateralem strati epithelialis iam constituti. In intestino in lamella, morphogenesis epithelialis coepit cum medium in microcanales superiores et inferiores perfusum est (Fig. 3a). Ut antea descriptum est, essentiale est fluxum fluidi in compartimento inferiore (basolaterali) introducere ad continuam remotionem inhibitorum morphogeni secretorum directionalium. Ut nutrimenta et serum sufficientes cellulis membranis porosis adhaerentibus praebeantur et tensionem luminis scissionis generetur, typice fluxum duplicem in intestino in lamella applicamus. In lamellis hybridis, inserta Transwell continentia monostrata epithelialia in lamellas hybridas inserta sunt. Deinde, medium sub latere basolaterali inserti Transwell porosi per microcanalem applicatum est. Morphogenesis intestinalis 3-5 diebus post initium fluxus basolateralis in ambabus platformis culturae facta est.
Proprietates morphologicae stratorum epitheliorum tridimensionalium micro-ingeniatarum per varias rationes imaginum, inter quas microscopia contrastus phasis, microscopia contrastus interferentiae differentialis (DIC), SEM, vel microscopia confocalis immunofluorescentiae (Figurae 3 et 4), analyzari possunt. Imago contrastus phasis vel DIC facile quovis tempore culturae perfici potest ad formam et protrusionem stratorum epitheliorum tridimensionalium monitorandam. Propter perspicuitatem opticam PDMS et pellicularum polyestericarum, et systemata "gut-on-a-chip" et systemata "hybrid chip" imagines in situ in tempore reali praebere possunt sine necessitate sectionis vel disassemblationis instrumenti. Cum imagines immunofluorescentiae perficiuntur (Figurae 1, 3c, f et 4b, c), cellulae typice fixantur cum 4% (pondus/vol) paraformaldehydo (PFA), deinde cum Triton X-100 et 2% (pondus/vol) albumine serico bovino (BSA), ordine. Secundum genus cellulae, fixativa, permeabilia, et agentes obstruentes diversa adhiberi possunt. Primaria... Anticorpora quae cellulas vel regiones a stirpe pendentes designant, ad cellulas in situ immobilizatas in lamella illustrandas adhibentur, deinde anticorpora secundaria una cum tinctura contraria quae vel nucleum (e.g., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indolum, DAPI) vel F-actin (e.g., phalloidinum fluorescentialiter notatum) designat. Imagines vivae fluorescentiae etiam in situ fieri possunt ad productionem muci detegendam (Fig. 1, "Differentiatio cellularum" et "Physiologia intestini"), colonizationem fortuitam cellularum microbialium (Fig. 1, "Co-cultura hospitis-microbi"), adlectionem cellularum immunium (Fig. 1, 'Modellatio Morborum') vel lineamenta morphologiae epithelialis tridimensionalis (Fig. 3c,f et 4b,c). Cum intestinum in lamella modificatur ad stratum superius a strato microcanalis inferiore separandum, ut in ref. describitur. Ut in Fig. 2 demonstratur, morphologia epithelialis tridimensionalis necnon microvilli in margine apicali penicilli per SEM visualizari possunt (Fig. 3b). Expressio signorum differentiationis aestimari potest per PCR5 quantitativam vel sequentiationem RNA singularum cellularum. Hoc in casu, strata tridimensionalia cellularum epithelialium in fragmentis intestini vel fragmentis hybridis cultarum per trypsinizationem colliguntur et deinde ad analysin molecularem vel geneticam adhibentur.
a, Ordo operis ad inductionem morphogenesis intestinalis in fragmento hybrido. Caco-2 et organoida intestinalia in hoc protocollo adhibentur ad morphogenesin tridimensionalem in suggestu fragmenti hybridi demonstrandam. Cellulae epitheliales dissociatae in insertis Transwell praeparatis (praeparatio TW; vide figuram infra) seminatae sunt. Postquam cellulae seminatae (seminatae) et membranis polyestericis in insertis Transwell adnexae sunt, omnes cellulae sub condicionibus staticis cultae sunt (cultura TW). Post 7 dies, unum insertum Transwell continens monostratum bidimensionale cellularum epithelialium in fragmentum hybridum integratum est ad fluxum basolateralem introducendum (Fluxus, BL), qui tandem ad generationem strati epithelialis tridimensionalis (morphogenesis) duxit. Micrographa contrastus phasium notas morphologicas cellularum epithelialium organi humani derivatarum ex colon ascendente donatoris normalis (linea C103) in quolibet gradu experimentali vel puncto temporis ostendentes. Schemata in stratis superioribus configurationem experimentalem pro quolibet gradu illustrant. b, Fragmenta hybrida (schema sinistrum) ad morphogenesin tridimensionalem cellularum epithelialium organoidarum cum prospectibus microscopiae confocalis desuper ducere possunt. Captae in diversis positionibus Z (superiore, medio et inferiore; vide schema dextram et lineas punctatas correspondentes). Notas morphologicas manifestas ostenderunt. F-actin (cyanus), nucleus (cinereus). c, Micrographa confocales fluorescentes (visus angulatus 3D) cellularum epithelialium organoidum derivatarum in Transwell statico (TW; inserta intra arcam albam punctatam) contra frustum hybridum (maxima imago plena) morphologiam 2D ​​et 3D respective comparantes. Par visuum transversalium verticalium 2D (inserta in angulo dextro superiore; "XZ") etiam notas 2D et 3D ostendit. Scala, 100 µm. c Reimpressus cum permissione ex referentia. 4. Elsevier.
Testimonia praeparari possunt per culturam earundem cellularum (Caco-2 vel cellularum epithelialium organoidum intestinalium) in monostrata bidimensionalia sub condicionibus culturae staticis conventionalibus. Notandum est depletionem nutrimentorum fieri posse propter capacitatem voluminis limitatam microcanalum (e.g., ~4 µL in canali superiore in consilio originali gut-chip). Ergo, morphologia epithelialis ante et post applicationem fluxus basolateralis etiam comparari potest.
Processus lithographiae mollis in conclavi mundo puro peragendus est. Pro singulis stratis in lamella (stratis superioribus et inferioribus et membranis) et lamellae hybridae, diversae photopersonae adhibitae et in separatis laminis silicii fabricatae sunt, quia altitudines microcanalum diversae erant. Altitudines destinatae microcanalum superiorum et inferiorum intestini in lamella sunt 500 µm et 200 µm respective. Altitudo destinata canalis lamellae hybridae est 200 µm.
Laminam siliconis trium unciarum in patella cum acetono pone. Laminam leniter per triginta secunda agita, deinde laminam aere sicca. Laminam in laminam cum IPA transfer, deinde laminam per triginta secunda rota ut purgetur.
Solutio piranhae (mixtura hydrogenii peroxidi et acidi sulfurici concentrati, 1:3 (vol/vol)) ad optione adhiberi potest ad residua organica e superficie laminae silicii quam maxime removenda.
Solutio Piranhae est maxime corrosiva et calorem generat. Cautelae salutis additae necessariae sunt. Ad vastorum abjectionem, solutionem refrigerari sine et in vas purgamentorum mundum et siccum transfer. Vasa secundaria utere et vasa purgamentorum rite nota. Quaeso, praecepta salutis officinae pro proceduris uberioribus sequere.
Oblatas exsiccare per decem minutas in lamina calida 200°C ponendo. Post exsiccationem, oblata quinquies in aere agitata est ut refrigeraretur.
Infunde ~10 g photoresist SU-8 2100 in medium laminae siliconis purgatae. Forceps adhibe ut photoresist aequaliter per laminam distribuatur. Interdum laminam in lamina calida 65°C pone ut photoresist minus viscosum et facilius distribuatur. Noli laminam directe in laminam calidam ponere.
SU-8 aequaliter in lamella distributa est per rotationem inductam (spin coating). Rotationem incidentem SU-8 per 5-10 secundas programma ut propaget ad 500 rpm cum acceleratione 100 rpm/s. Rotationem principalem ad structuram crassitudinis 200 µm ad 1500 rpm constitue, vel crassitudinem 250 µm consequere (altitudinem 500 µm pro strato superiore intestini in lamella faciens; vide "Gradus criticos" infra) ad accelerationem 300 rpm/s 30 secundas ad 1200 rpm constitue.
Celeritas rotationis principalis secundum crassitudinem destinatam formae SU-8 in lamina silicii aptari potest.
Ad exempla SU-8 500 µm alta pro strato superiori intestini in lamella fabricanda, gradus "spin coating" et "soft bake" huius Arcae (gradus 7 et 8) continuiter iterati sunt (vide gradum 9) ad duo strata SU-8 250 µm crassa producenda, quae stratis superimponi et per expositionem UV in gradu 12 huius arcae coniungi possunt, stratum 500 µm altum efficientes.
Crustulas SU-8 obductas molliter coque, crustulas in lamina calida ad 65°C per 5 min diligenter ponendo, deinde ad 95°C muta et per 40 min amplius incuba.
Ad altitudinem 500 μm exemplaris SU-8 in microcanale superiore consequendam, gradus 7 et 8 itera ut duo strata SU-8 250 μm crassa generentur.
Utente UV Mask Aligner, probationem lampadis secundum instructiones fabricatoris perage ut tempus expositionis crustulae calcules. (tempus expositionis, ms) = (dosis expositionis, mJ/cm2)/(potentia lampadis, mW/cm2).
Postquam tempus expositionis determinatum est, photolarvam in tenenti larvae ordinatoris larvae UV pone et photolarvam in laminam SU-8 obductam pone.
Superficiem impressam photolarvae directe in latere SU-8 obducto lamellae siliconis pone ut dispersio UV quam minima sit.
Laminam SU-8 obductam et photolarvam verticaliter luci UV 260 mJ/cm2 per tempus expositionis praefinitum expone (vide gradum 10 huius arcae).
Post expositionem UV, crustae siliconis SU-8 obductae in utraque lamina calida ad 65°C per 5 minuta et ad 95°C per 15 minuta coctae sunt ad figuras cum altitudine 200 µm fabricandas. Tempus post-coctionem ad 95°C ad 30 minuta extende ad figuras cum altitudine 500 µm fabricandas.
Revelator in patinam vitream infunditur, et crustula cocta in patinam ponitur. Volumen revelatoris SU-8 variari potest secundum magnitudinem laminae vitreae. Fac ut satis revelatoris SU-8 adhibeas ad SU-8 non expositum omnino removendum. Exempli gratia, cum patina vitrea 150 mm diametro et capacitate 1 L uteris, ~300 mL revelatoris SU-8 adhibe. Formam per 25 minuta revela, interdum leni rotatione.
Formam evolutam cum ~10 mL evolutoris recentis ablue, deinde IPA solutionem pipetta aspergendo.
Laminam in purgatore plasmatis pone et plasmati oxygenii (gasi atmosphaerico, pressio desiderata 1 × 10⁻⁵ Torr, potentia 125 W) per 1.5 minuta expone.
Laminam in exsiccatore vacuo cum lamina vitrea intus pone. Laminae et laminae iuxta se poni possunt. Si exsiccator vacuus in plura strata per laminam divisus est, laminas in camera inferiore et laminas in camera superiore pone. Centum μL solutionis trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silani in laminam vitream stilla et vacuum ad silanizationem adhibe.
Fialam cellularum Caco-2 congelatarum in balneo aquae 37°C liquefac, deinde cellulas liquefactas in lagenam T75 continentem 15 mL medii Caco-2 praecalefacti 37°C transfer.
Ad cellulas Caco-2 ad confluentiam ~90% transmittendas, primum medium Caco-2, PBS, et 0.25% trypsin/1 mM EDTA in balneo aquae 37°C calefac.
Medium per aspirationem vacui aspira. Cellulas bis cum 5 mL PBS tepidi lava, aspirationem vacui repetendo et PBS recens addendo.