Gratias tibi pro adire Nature.com.The browser version you are using has limited support for CSS.For the best experience, praecipimus ut vos utor navigatro renovato (vel modus compatibilitas in Internet Explorer averte). Interea, ut continua subsidia curent, locum sine stylis et JavaScript ostendemus.
Viscera humana morphogenesis crypto-villi lineamenta 3D epithelialis microarchitecturae et spatii localis constituit. Haec unica structura ad ventrem homeostasim conservandum requiritur, caulis cellae angulus in crypta basali ab exogenosa microbiali antigenorum eorumque metabolitis. Insuper intestinalis villorum obice et muci secernens mucos in superficie epithelialis 3 epithelialis epithelialis intestina, cellulas mucosae superficiei intestinales functiones officiate differentias in recreatione recreativa. lial structurae pendet ad constructionem in vitro viscerum exemplorum. Notabiliter, organorum mimeticorum viscera-in-a-chip spontaneam 3D morphogenesis inducere epithelium intestinorum, cum aucta functionibus physiologicis et biomechanicis aucta. Hic praebemus protocollum reproducibilem ut viscerum intestinalem morphogenesis accuratiorem in visceribus quam de chipbri bene emundato delineare quam accuratam describi. fabrica fabricatio, cultura caco-2 vel organoidei epithelialis cellularum intestinorum in fundis conventionalibus necnon in suggestu microfluidico, inductio 3D morphogenesis, et characterisation institutarum 3D epitheliarum utens multiplicibus modalibus imaginantibus. Haec protocollo regenerationem efficit uteri microarchitecturae functionis, moderandis basolateralis fluidi vitro, motu 5 d. cellam machinalis vel manipulationis, quae alias artes exsistentes praelucere potest. Propositum nostrum protocollum latos implicationes habere potuit ad investigationis biomedicas communitatem, praebens methodum ad regenerandum 3D stratis epithelialibus in vitro intestinis ad applicationes biomedicas, clinicas et pharmaceuticas.
Experimenta demonstrant cellulas intestinales epitheliales Caco-2 excultas in alvo-in-a-chip1,2,3,4,5 vel bilayer microfluidicas machinas 6,7 spontaneam 3D morphogenesis in vitro subire sine clare intellectione substratae mechanismi. In recenti studio invenimus remotionem basolateralis morphogenis 3D morphogenis in cultura morphogenis necessariam esse necessariam ad morphogenis morphogenis in vitro sine lucido subesse mechanismo. In recenti studio invenimus remotionem basolateralis morphogenis morphogenis 3D morphogenis in vitro sine manifesta cognitione vitro, quod demonstratum est a Caco-2 et organoidis intestinalibus patienti deductum.Cellulae epitheliales validae sunt. In hoc studio, speciatim feruntur in cellulam productionem et intentionem distributionis potentis Wnt antagonistae, Dickkopf-1 (DKK-1), in visceribus super-a-chip et modificatis machinis microfluidis Transwellis continentibus insertis, "Hybrid Chip". Demonstremus additionem exogenorum Wnt-I, antagonistarum (ut DKK-I) repressorum (ut DKK-1. -chip ventrem morphogenesis vetat vel stratum epithelialem praestructum 3D dissolvit, suggerens accentus in cultura intestinorum morphogenesis in vitro intestinalis responsabilis est. Ergo practicus accessus ad morphogenesis robustam ad interfaciem epithelialem adipiscenda est, ut gradus Wnt antagonistarum in basocho-hyp-hyp-hyp- oragonistas in baso-hypo-hypoconastas (vel minimum defendat. suggesta chip vel diffusio. Basolateral media (exempli gratia ex Transwell inserit in magnas receptacula basolateralis in puteis).
In hoc protocollo accuratiorem methodum praebemus ad fabricandi microdevices et astulas transwell-insertas hybridarum (graduum 1-5) ad culturam intestinalem cellulis epithelialibus polydimethylsiloxane (PDMS) substructis membranulis raris (gradibus 6A, 7A, 8, 9), vel polyesteris membranas ins. notavimus etiam cellulares et hypotheticas notas histogenesis et genere-dependentium cellularum specialium textorum differentiationem applicando multiplicem modalium imaginum (graduum 11-24). morphogenesis inducimus utentes cellularum intestinorum epithelialium humanarum, ut caco-2 vel organoidum intestinorum, in duobus culturae formatis cum technicis rationibus, cum technicis singularibus et superficialibus modificationibus technicis et productionibus monochemicis et in superficiebus technicis et intestinalibus cellulis epithelialibus, sicut caco-2 vel organoidis intestinorum biomechanicum microenvironment.in vitro. Ut inducat 3D morphogenesis ex 2D monolayers epitheliales, morphogen antagonistas in utraque exculta forma removimus, medium in basolateralis culturae defluendo. Denique repraesentationem praebemus utilitatis regenerabilis 3D epithelialis, quae ad exemplar epithelialis morpho- graphicae, quae ad exemplar co- s.mi. es, pathogen infectio, inflammatio iniuriae, impedimentum epithelialis distemperantia, ac probiotic-substructio therapiae Example.influences.
Protocollum nostrum utile potest esse latis amplis phisicis in basic (exempli gratia intestinalis mucosalis biologiae, caulis cellae biologiae, et biologiae progressus) et investigatio applicata (exempli gratia preclinical pharmacum probatio, morbus exemplandi, texti machinalis et gastroenterologiae) latum impulsum. Propter reproducibilitatem et robur nostri protocolli ad in- technicam 3D morphogenesis technicam, morphogenisis technicis, 3D morphogenesis technicam, quae morphogenesis technicam, morphogenesis technicam, 3D morphogenesis technicis, morphogenesis technicis, in vitro morphogenesis enthes. audientibus pervestigandis dynamicis cellae significationis in intestinali progressu, regeneratione vel homeostasi. Praeterea protocollum nostrum utile est ad percontandum contagionem sub variis agentibus infectiosis, ut Norovirus 8, Syndroma Respiratorii Severi Acuti Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 vel Vibrio cholerae.Audientiae morborum pathologiae et pathogenesis etiam utiles sunt. Usus systematis microphysiologiae viscerum on-chip longitudinalem co- culturam permittere potest 10 et post aestimationem exercitus defensionis, immunes responsiones et pathogenis relatas iniurias reparare in tractu gastrointestinali 11 . Aliae GI perturbationes cum rimosa ventriculi syndrome, morbi coeliaci, ulcerativi, ulcerativi, syndrome, coeliaci morbi, ulcerativi, crohndrome, coeliacis, ulcerativi morbi, ulcerativi, syndrome, morbi rimosorum, morborum, ulcerativi, crohndrome, coeliacis, ulcerativi, ulcerativi, syndrome, morbi ulcerativae, morborum ulcerativorum et ulcerativi actis detrimenti gastrointestinalis (GI) reparationis in tractu gastrointestinali reparare possunt. 3D stratis epithelialibus intestinorum praeparatis utentes 3D epitheliales intestinorum stratis patientis , hi morbi villosi atrophiam includunt , crypta abbreviatio , damnum mucosale , vel impedimentum epithelialis imminutum . Biopsy vel truncus cellulae intestinorum organoides 12 , 13. Ut melius exemplar includunt villosas atrophas , cryptas minuentes , mucosales damnum , vel impedimentum epithelialis vitiatum ), ad exempla 3D intestinorum microarchitecturas villo-cryptae continentes.texti-cellulae speciales immunes, i5.
Cum 3D microstructura epithelialis fixa et subjiciatur sine processu sectionis, visores in transcriptomica locali laborantes et alta resolutio vel imaginatio super-resolutione interesse potest in nostra institutione dynamicorum spatiotemporalium dynamicorum genesis et proteins in epithelialibus nichis.Interest in technologia. Responsio ad stimulos microbiales vel immunes. Praeterea, crosstalk longitudinalis hostiae microbiomm 10, 14 quod coordinata viscera homeostasis in 3D intestinali mucosali strato intestinali componi potest, species microbiales, communitates microbiales vel microbiota, praesertim in ventriculo-in-a-chip, cocolentes varias species microbiales.in suggestu. Hic accessus maxime gratus est audientibus studens immunologiae mucosalis, gastroenterologiae, microbiomm hominum, culturaromicorum et microbiologiae clinicae quaerunt ut excolenda prius inculta viscera microbiota in laboratory. Si in vitro morphogenesis protocollo nostro aptari potest ad formas culturae scalabiles, sicut multi bene inserti sunt in 24, 96 vel 384, bene enucleantur laminae quae in pharmacopola in laboratorio continuum excoluntur. eutical, biomedica Vel summus throughput protegendo vel sanatio suggesta ad cibum industriam. Sicut probatio principii nuper demonstravimus facundiam multiplex summus throughput morphogenesis systematis scalable ad 24-bene laminam formato. Praeterea multi organi in-a-chip productorum commercium 16, 17,18 nuper demonstravimus. ac normae regulatoriae ad reprogrammum cellularum intelligendum in vitro ventriculi morphogenesis in gradu transcriptomica ad experimenta medicamentorum vel biotherapeuticorum.
Paucitas exempla experimenta hominum pertinentia adhibita sunt ad intestinalem epithelialem morphogenesis studium, maxime propter defectum protocolli ad effectum deducendi 3D morphogenesis in vitro. Re quidem vera, multum hodiernae cognitionis circa ventrem morphogenesis innituntur studiis animalium (exempli zebrafish20, mures 21 vel gallinae 22). praecise determinant processus progressus humanos. Haec exempla etiam valde limitata sunt in facultate sua experiendi multimodo scalabili modo. Protocollum ergo nostrum ad regenerandum 3D textuum structurarum in vitro formas in exemplorum animalium vivorum necnon aliorum culturae staticarum 2D enucleatorum exempla. Ut supra dictum est, 3D epithelialibus structuris adhibitis nobis permisit nos examinare cellulas mucosas localizationis 3D in cryptas differentias vel responsiones cellulas mucosas localizationis immunitatis vel responsionis ad cryptas locales immunes examinare, sicut et alia exempla culturae 2D stabilis traditae. epitheliales stratis spatium praebere possunt ad discendum quomodo cellae microbiales contendunt ad formas spatiales technicas et evolutionem oecologicam respondentes ad factores exercitus (exempli gratia interiores versus exteriores muci strati, secretiones IgA et peptides antimicrobiales). Praeterea 3D epithelialis morphologia permittere nos potest intellegere quomodo viscerus microbiotatice structuras suas communitates et figuras et synergistas acidos (meta- schales) structuras suas et figuras et synergistas cellulas (acidotatices) et microbiotaticos formas suas et figuras cellularum synergistas (acidotatices) et microbiotaticos formas et figuras cellularum et synergistas (acidotatices), 3D morphologiam epithelialem morphologiam praeterea 3D morphologiam epithelialem permittere nos permittere potest intellegere quomodo viscera microbiotatically structuras suas communitates et synergistas (acidotaticos) formas suas et figuras cellularum synergisticorum, breves formas et synergistas cellulosas (acidaedos suos formas et figuras et synergistas breves) . caulis cellae niches in cryptis basalibus. Haec lineamenta tantum demonstrari possunt cum 3D stratis epithelialibus in vitro constituuntur.
Praeter nostram methodum creandi 3D intestinorum epithelialium structurae plures in vitro modos sunt. Organoidis cultura intestinalis est status artificii texti-artificialis in cultura caulis intestinalis e colendis cellulis sub certis morphogenis conditionibus 23, 24, 25. Usus tamen 3D organoideorum exemplorum est quia in analysi seu microbiomo-mico intestina inclusus est, ideoque saepe coaevus intestinalis cellulis colendis sub certis conditionibus morphogenis morphogenis inclusus est. introductio partium luminarium ut cellae microbiales vel antigenorum exogenarum circumscriptae sunt.Accessus ad lumens organoides emendari potest utens microinjectore, 26,27 sed haec methodus intensiva est et intensiva et scientia ad faciendam specialitatem requirit. Praeterea culturas organoides traditionales in scaffolds hydrogel sub condicionibus stabilibus conservatas non accurate in biomechanicis vivo active reflectunt.
Aliae accessus adhibitae a pluribus coetibus inquisitionis usui praestructis scaffolds 3D hydrogelis ad imitandum ventrem epithelialem structuram per culturam solitariam humanam intestinorum cellas in superficie gel. Scaffolds hydrogeli fabricare utentes 3D-typis, micro moltis, vel lithographice fictis. Haec methodus ostendit auto-ordinatam dispositionem rationis epitheliologicae vitrologicae cum cellulis epithelialgenis in modum epithelialgen- maticum, dispositio morpholicae epithelialgene in speciebus epitheliologicis cellulis vitreis, epithelialgen- maticis, in speciebus epitheliologicis cellulis vitreorum, epithelialgenis morphologicis, in speciebus epitheliologicis cellularum vitreorum graduum epithelialgenarum, ad formas formas lithographicas vel lithographicas formatas 3D impressas, micro molas lithographicas imitandas ostendit. structura et crosstalk stroma-epithelis, inclusis cellulis stromalibus in scaffold. Sed natura scaffolds praestructorum in ipso processu morphogenetico spontaneo ostensionem impedire potest. Haec etiam exempla dynamica luminalis vel interstitialis non praebent, carens liquore tondendis accentus qui intestinalibus cellulis morphogenesis ad subeundum morphogenesis et recenti studiorum physiologico suggestu adhibito. structurae epitheliales utentes artes laser-etching. Mus organoides intestinorum sequantur exemplaria ad formandum intestinales structuras tubulares et fluidum intraluminalem recapitulari possunt utentes microfluidicas modulorum. Hoc tamen exemplum nec processuum morphogeneticum spontaneum exhibet nec ventrem mechanobiologicum motus.3D technologiae cum minimis artificiis morphogeneticis. pite complexa fabricatione diversorum segmentorum intra tubum, hoc exemplar etiam fluidi luminalis fluxus ac deformatione mechanica caret. Praeter, exemplar operabilitatis limitari potest, praesertim postquam processus bioprinting perfectus est, conditiones experimentales vel cellulae-ad-cellulas interationes perturbans. Protocollum vero propositum praebet spontaneum ventrem morphogenesis, physiologice ad tondendas accentus, mobilitas, comparte- chanicas tondendas accentus, mobilitas, compartificationes morphogenesis protocolli nostri in vitro 3D morphogenesis accessum complementum praebere potest ad provocationes methodorum exsistentium superandarum.
Protocollum nostrum totum in 3D epithelialem morphogenesis tendit, cum cellulis tantum epithelialibus in cultura et nullis aliis speciebus cellularum circumiacentium sicut cellae mesenchymales, cellulae endotheliales et cellulae immunes. Ut supra dictum est, nucleus protocolli nostri inductio epithelialis morphogenesis subtrahendo morphogenis basibus inhibitoribus-lateris modula- culi secreti ad medium. p et hybrid-in-a-chp nos permittit recreare stratum undulatum 3D epithelialem, adiectis biologicis complexitatibus sicut interationes epithelial-mesenchymales 33, 34, extracellulares Matrix (ECM) depositionis 35 et, in nostro exemplari lineas cryptas quae cellulis cellulis in cryptis basalibus important) manent in cryptis basalibus ( productionis in mesenchyme- stropharum) cellularum mesenchymalium cellularum in cryptarum mesenchymalium productio in cellulis mesenchymalibus (Cm. proteins et moderatio morphogenesis intestinalis in vivo35,37,38. Additio cellularum mesenchymalium ad exemplar nostrum auxit processum morphogeneticum et ad effectum adhaesionis cellulae. Iaculum endotheliale (id est, capillaria vel lymphatica) magni ponderis partes agit in onerariis hypotheticis et immunis cellularum supplementorum 40 in viscerum microenvironum. - Organum interationes. Ideo cellae endotheliales includi possunt ad formas accuratiores physiologicas cum resolutione organi-gradus. Cellulae immunes patienti sunt etiam necessariae ad innatas responsiones immunes, antigenium praesentationem, innatae crucis adaptivam immunem, ac telam specialem immunitatem in contextu morbi intestinorum imitando.
Usus astuli hybridorum rectior est quam visceribus in-chp, quia simplicior est machinatio et usus Transwell interserit ad scalabilem culturam ventriculi epithelium permittit. Sed commercium Transwell in promptu insertis membranis polyesteris non elasticis et peristaltico-similis motus simulare non potest. Ceterum visio apicalis in transmarinis partibus apicis in transwellum collocata nulla insita. Proprietates statice in cellula apicali raro efficiunt longum tempus bacterialem co- culturam in assulis hybridis. Cum robuste 3D morphogenesis in Transwell inducere possumus, cum astularum hybridarum usus, defectus physiologice biomechanici et fluidi apicalis fluxus facultatem limitare potest applicationes applicationum domentorum hybridorum potentiarum.
Reconstructiones cryptae-villi humani axis plenae in visceribus et spumae et culturae hybridis in spumae culturae non plene stabilitae sunt. Cum morphogenesis ab epitheliali monolayo incipit, 3D microarchitecturae morphologicae similitudinem cum cryptis in vivo. Regiones villœ non plane demarcantur. Quamvis superiores canales superiores in spumam ducere ad altitudinem epithelii microengineered auctam, maxima adhuc altitudo ad ~300-400 µm terminatur. Ipsa profunditas cryptarum intestinorum in parvis et magnis intestinis humana est ~135 µm et 400 µm, respective, et altitudo parva intestinorum ~ 600m µ41.
Ex imagine imaginatio, in situ super-solutione, imaginatio 3D microarchitecturarum ad ventrem in spumam limitari potest, quandoquidem requiritur operatio distantiae ab objecto lens ad epithelialem stratum paucis millimetris est. Ad hoc problema, objectum longinquum requiri potest. Praeterea faciens tenues sectiones, quia imaginatio speciminis praeparatio- nis praeparatio- bata- bricatio magis pro- bat- bata- s- s- s- s- s- s- s- s- s- s-r- ticas magis laicis magis provocare. Viscera super spumam adhaesionem permanentem inter utramque tabulam involvit, valde provocat ad aperiendum vel removendum stratum superiorem ad examinandam structuram superficiei tabulato epithelialis. Exempli gratia, adhibito microscopio electronico inspecto (SEM).
Hydrophobicitas PDMS limitans factor in studiis microfluidicicis fundatis in moleculis hydrophobicis tractandis fuit, cum PDMS non specificare huiusmodi moleculas hydrophobicas adsorbere potest. Alternativa ad PDMS considerari possunt cum aliis materiis polymericis. Vel modificatio superficiei PDMS (ex. gr. 43, extenuando cum lipophilicis materiis 42 vel polymicis ad PDMS considerari potest. phobic moleculis.
Denique methodus nostra non bene characterista est in terminis providendi summus throughput protegendi vel "one-size-fits-all" user-amici experimentalis suggestus. Protocollum hodiernum requirit clysterem sentinam per microdevice, quae spatium in CO2 incubatorem occupat et experimenta permagna impedit. Haec limitatio signanter emendari potest per scalam 24 formarum culturae novarum, 96--salbilitas culturae novarum (eg, repletio vel permissio culturae novarum, 384--s. mediae basolateralis).
Ad 3D morphogenesis intestinalis epithelii in vitro humano, machinam microfluidicam intestinalem continentem duo microchannels parallelos et raram elasticam membranam in medio ad interfaciendum lumen-capillarem creandum demonstravimus. Etiam usum unius canali microfluidici machinae (hybridis chip), quae continuum basimorpholateralem fluxum sub polari transwellum insitum praebet. variae cellae epitheliales intestinae humanae demonstrari possunt applicando manipulationem directionalem fluere ad removendum morphogen antagonistae e cellula basolateralis. Tota processus experimentalis (Figura 1) constat quinque partibus: (i) microfabricatio ventriculi corpulentiae vel transwellum insertabile corulum hybridum (gradus 1-5; box-2), (ii) praeparatio cellularum intestinorum (C. figurae 1);pyxides 2-5), (iii) cultura cellularum intestinorum epithelialium in assulis intestinalibus vel assulis hybridis (gradibus 6-9), (iv) inductio 3D morphogenesis in vitro (gradum 10) et (v) ) ad microform 3D epithelialem microform (gradus 11-24). ing epithelial morphogenesis ad spatialem, temporalem, conditionalem, vel procedendi moderamina.
Duas tabulata culturae varias adhibemus: gut-in-frachiam rectis canalibus vel canalibus nonlinearibus convolutis, vel astulas hybridas continentes Transwellum (TW) inserit machinam microfluidicam, quam in Box 1 descripserat, et gradus 1 -5. Fabricatio fabricatio ostendit principales gradus in uno chip vel hybrida facto vel cellula humana. processus in hoc protocollo usus est." In vitro morphogenesis" ostendit altiores gradus in quibus Caco-2 vel cellulae epitheliales organoidales excultae sunt in chip intestinali vel in Transwell insertis de spumae hybridarum, sequitur inductio 3D morphogenesis et formatio epithelialis structurae propriae. Propositum numerus vel cistae intestinorum exempla proponitur, exempli gratia infra unumquemque intestinorum sagittarum. cellula differentiatio characterisation, studia physiologia viscera, instauratio oecosystematis hospitii microbiomi, et morbi exemplaring. Immunofluorescentiae imagines in "Celli differentiatione" ostendens nuclei, F-actin et MUC2 expressum in 3D Caco-2 strato epitheliali generato in ventriculo chip.MUC2 signans adest in cyathis cellis et physiologiae mucosae e mucosicae superficiei secretae. Acidum et N acetylglucosamine residua utentes fluorescentium satum agglutinin. Duae imbricatae imagines in "Host-Microbe Co-culturae" repraesentativum exercitum microbiomum co-culturis in ventre super chip. Sinistra tabula ostendit co-culturam E. coli exprimens dapibus viridis fluorescentis (GFP) cum epitheliculis 3D caco-D. 2-D. Caco-2 cellae epitheliales, quae secutae sunt immunofluorescentiae maculas cum F-actin (rubente) et nuclei (hyacinthini). Morbus exemplar sanum illustrat versus rimosas viscerum in viscerum inflammatione astularum sub provocatione physiologica cum antigenis bacterial (eg, lipopolysaccharide, LPS) et cellulis immunibus (eg, PBMC;viridi).Caco-2 cellulae excultae sunt ad 3D stratum epithelialem constituendum. Scala bar, 50 µm. Imagines in imo ordine: "Cellarum differentiae" cum permissione a reference.Oxford University Press;Reproducted with permission from Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-culture" permissu a ref.3 accommodata.NAS;"Morbus Modeling" cum permissione a reference.5.NAS.
Utraque viscera-on-chip et astulae hybridarum fabricatae sunt per PDMS replicas quae e formis siliconum molli lithographia1,44 destructae sunt et cum SU-8.Statuta microchannels in quolibet spumae formata sunt, considerando hydrodynamicas ut tondendas accentus et hydrodynamicas pressurae 1,4,12. Viscera originalis micro-in-a-chip directa 1a fig. -on-a- chip (Fig. 2a-f) (Fig. 2a-f) 12. Cum duo microchanni curvati includuntur ad tempus residentiae fluidum augendum, fluunt exemplaria nonlinearia, et multiaxiales deformatio cellularum excultarum (Fig. 2a-f) 12. Cum magis intricatae viscerum biomechanici recreari necesse est, intricata viscera-in-a-vulsa eligenda esse. similis gradus incrementi epithelialis comparatus cum originali Gut-Chip, cuiuscumque generis cellulae excultae. Ideo ad 3D morphogenesis, lineares et multiplices in-chip ventriculi designationes convertuntur.PDMS replicationes in formas siliconum cum SU-8 formas curatas praebent negativas notas destruendo (Fig.2a) Venter in spumam fabricare, stratum superius PDMS paratum consequenter cum cinematographico PDMS perforato connexum est ac deinde cum inferiore PDMS inrevocabili compage per tractatorem coronae utens affixum (Fig. 2b-f). Ad astulas hybridas fabricandas, replicas PDMS curatas conjunctas vitreis lapsibus ad fabricandas singulas alvei microfluidicas (Fig. 2b-f). processus perficitur tractando superficies imaginis PDMS et vitri cum oxygenio plasmatis vel coronae curationis. Post sterilizationem machinae microfabricatae tubo siliconis adnexae, machina quae 3D morphogenesis epithelii intestinalis perficienda parata erat (Figura 2g).
a, Schematica illustratio partium PDMS praeparationis e SU-8 ortae Pii formse. Solutio incurata PDMS in formam siliconam (reliquit), curata 60 °C (medii) et destructa (recte). Destructa PDMS in frusta incisa est et ad ulteriorem usum.b, Photograph de siliconis forma adhibita ad fabricandum PDMS de membranae superioris tabulae PDMS. partes superiores et inferiores PDMS et in intestinali fabrica convenerunt. e, Schematica alignment superioris, membranae et inferioris PDMS components. Quaelibet iacuit irreversibiliter religata plasma vel corona treatment.f, Schematica fabricae ventriculi in-chip fabrica cum superimpositis microchannels convolutis et vacuo e cultura guttulis-congregatorum in culturae culturae. fistula silicone et syringe in operculali posita est. Chip fabrica in operculo 150 mm Petri disco ad dispensandum posita est. Ligans adhibetur ad tubulum siliconem claudendum.h, Visual snapshots de chip fabricatione hybrid et 3D morphogenesis utens hybridorum chips. Transwell inserit paratus independenter ad culturam 2D ​​monolayers intestinales epithesinales 3D monolayers intestinales epithesinales 3D monolayres intestinales epithesinales 3D morphogenesis ins. Medium conficitur per microchannels sub strato cellularum in Transwell inserta.Scale talea, 1 cm.h Reprinted with permission from reference.4.ALIUS.
In hoc protocollo, lineae cellae Caco-2 et organoides intestinorum pro epithelialibus fontibus adhibiti sunt (Fig. 3a). Utraque genera cellularum independenter excultae (Box 2 et Box 5) et usus ad seminandum microchannels ECM iactaret in ventrem vel Transwellum insertas. Cum cellae confluentes (>95% coverage in ampullis) in cellulis 10-sematis sunt excultae ("95% in locis et lagunculis excultis) assueti sunt ad seminandum eCM iactata microchannels viscerum seu Transwellum insertas. Cum cellae confluentes (>95% coverage in ampullis) in cellulis 10-caco (suctatis) exculti sunt, ad culturam eculeos (mactores 10% caco-cocass) in locis excultis. suspensiones cellulae sociatae per fluidum trypsinizationem (arca II.) Organoides intestinorum ab intestinalibus biopsiis vel resectionibus chirurgicis exculti in Matrigeli catasta in 24-bene plateis ad fabricam microenvironmentam sustinendam exculti sunt. Medium continens essentialia morphogens (ut Wnt, R-spondin, et Noggin) µm in factores diametri ad factores diametri ad singulas fabricandas microenvironment. . Organoida plene adulta in singulas cellulas colligentur et dissociantur ad se- rendum in ventrem vel Transwellum in spumam (Box 5). Ut supra retulimus, distingui potest secundum genus morbi genus 12, 13 (ex. gr. ulcerativi colitis, morbus Crohn, cancri colorectalis vel donatoris normali), situs laesio (ex.g., laesio versus in area non-lesionedum, eg. vel rectum). Providemus optimized protocollum in Box 5 ad excolendum organoidum colonicum (coloidorum) quae altiores concentrationes morphogentium quam parva organoides intestinorum exigunt.
a, Workflow for the induction of gut morphogenesis in the gut chip.Caco-2 human intestinal epithelium and intestinal organoids are used in this protocol to demonstrate 3D morphogenesis.The isolated epithelial cells were seeded in the prepared gut-on-a-chip device (chip preparation).Once cells are seeded (seeded) and attached (attached) to the PDMS porous membrane on day 0 (D0), apical (AP) flow is initiated and maintained for the first 2 days (flow, AP, D0-D2).Basolateral (BL) flow is also initiated along with cyclic stretching motions (stretch, flow, AP and BL) when a complete 2D monolayer is formed.Intestinal 3D morphogenesis occurred spontaneously after 5 days of microfluidic culture (morphogenesis, D5).Phase contrast images show representative morphology of Caco-2 cells at each experimental step or time point (bar graph, 100 µm).Four schematic diagrams illustrating the corresponding cascades of gut morphogenesis (top right).The dashed arrows in the schematic represent the direction of fluid flow.b, SEM image showing the surface topology of the established 3D Caco-2 epithelium (left).The inset highlighting the magnified area (white dashed box) shows the regenerated microvilli on the 3D Caco-2 layer (right).c, Horizontal frontal view of established Caco-2 3D, claudin (ZO-1, red) and continuous brush border membranes labeled F-actin (green) and nuclei (blue) Immunofluorescence confocal visualization of epithelial cells on intestinal chips.Arrows pointing to the middle schematic indicate the location of the focal plane for each confocal view.d, Time course of morphological changes in organoids cultured on a chip obtained by phase contrast microscopy on days 3, 7, 9, 11, and 13.The inset (top right) shows the high magnification of the provided image.e, DIC photomicrograph of organoid 3D epithelium established in the gut on slice taken on day 7.f, Overlaid immunofluorescence images showing markers for stem cells (LGR5;magenta), cellulae scyphi (MUC2; viridis), F-actin (griseo) et nuclei (cyan) creverunt in viscera astulae per 3 dies, respective (reliquit) et 13 dies (medii) organoides in strato epitheliali. Vide etiam Data Figura III extensa, quae elucidat LGR5 significans sine MUC2 significans. Fluorescens imagines in epitheliali organo (rectae) organoidei in organoideo super 3- membrana plasma cum CellMask fuco in die 13 culturae. Scala talea est 50 µm nisi aliter dictum est.b Reprinted with permission from reference.2.Oxford University Press;c Cum permissione adaptata ex Reference.2.Oxford University Press;e et f cum licentia accommodata per reference. 12 Sub Communia Creative Licentiati CC BY 4.0.
In viscera super spumam, oportet ut hydrophobici superficiei PDMS porosae membranae ad effectum ECM coating modificaretur. In hoc protocollo duos diversos modos applicamus ad hydrophobicitatem membranarum PDMS mitigandam. Ad colendas cellulas Caco-2, sola curatio superficiei UV/ozonis satis erat ad hydrophobicitatem membranae superficiei PDMS reducendam, cellularum PDMS et culturae PDMS redigendas. Epithelium eget superficiem chemicam-fundatam ad functionisationem efficientis depositionis ECM servo, consequenter applicando polyethyleneimine (PEI) et glutaraldehyde ad microchannels PDMS. Post superficiem modificationis, servo ECM depositae sunt ad superficiem officiatis PDMS operiendam et postea in organoidum organoidum separatum introductae. Postquam cellulae superiores in cellae perfusionis, culturae superiorum, in culturae superiorum, cellulae superiores sunt positae ad superficiem PDMS operiendam et deinde in organoidem microcanalem solitariam introductae. Postquam cellulae in cellulae superiores culturae perfusionis, in culturae superiorum, cellulae superiores in culturae micro-canaliculae. microchannel inferior autem condiciones statas conservat. Haec optimized methodus activationis superficiei et ECM efficiens dat affectum epithelii organoidei ad 3D morphogenesis in superficie PDMS inducere.
Transwellum etiam culturas ECM vestitum ante cellam seminis exigunt;attamen Transwell culturae non requirunt vestigia implicata praetractationis ad excitandum superficies raris insertas. Nam crescens Caco-2 cellas Transwell insertas, ECM tunica raris insertis accelerat affectum dissociatarum cellularum Caco-2 (<1 hora) et arta juncturas obice formationis (<1-2 dies). Ad culturam organoida in Transwell inserit, organoides sparsis membranis sparsis inhaeret, membranis (<1-) membranis (<1-hora) dissociatarum cellularum (<1 horarum) affixum (<1-2 dies). perfectus monolayer cum obice integritatis . Transwell cultus in 24-bene plateis sine usu astularum hybridis.
In vitro 3D morphogenesis initiari potest applicando fluxum fluidum ad rationem basolateralis epithelialis stabiliti. In ventre in spumam, epithelialis morphogenesis incepit cum medium perfusum in microchannels superiores et inferiores (Fig. 3a). Ut supra dictum est, criticum est inducere liquorem in inhibitoribus continuis et cellulae secreti ad nutrimentum continuarum et cellularum secretarum ad nutrimentum morpho- s. Cellulae in raris membranis ligatae et luminalem tondendam accentus generant, typice duplicem fluxum ventriculi in chip. In assulis hybridis, Transwell insertas epitheliales monolayores continentes in xxxiii hybridorum inserti sunt. Deinde medium sub basolateral parte transwellum porosum insertum per microchannel.
Notae morphologicae microengineered 3D epitheliales enucleari possunt applicando varias imaginandi modales, inter phase antistitis microscopiae, differentialis interventus microscopii, SEM, vel immunofluorescens microscopii confocal (figurae 3 et 4). Phase antithesis seu DIC imaginationis facile fieri potest quovis tempore in cultura epi- scoporum 3D ad monitorium figurae et protrusionis diametri. et pellicula polyester, tum viscera-in-a- chip et rotula hybridorum suggestuum reale tempus praebere possunt in situ imaginandi sine necessitate sectionis vel disconvenientiae artificii. Cum immunofluorescentiae imaginatio (figurae 1, 3c, f et 4b, c), cellulae typice fixae cum 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) et 2% (PFA), sequitur Triton. Secundum genus cellae, variae fixativae, permeabiliores, et agentium interclusiones adhiberi possunt. Primae elementorum, quae cellulae vel regionis dependens, cellae vel regionis figentes, cellulis immobilibus in situ super spumam efferendis adhibentur, secuturae elementorum cum fuco calculi vel nuclei (eg, 4′, 6-labelidino-2, phenylene). luorescens substructio viva imaginatio etiam fieri potest in situ ad productionem muci deprehendendam (Fig.1, "Cella differentiatio" et "Gut physiologia"), temere deductio cellularum microbialium (fig. 1, "co-culture Host-microbe"), cellularum immunium cooptatio (Fig. 1, Morbus Exemplar) seu Venustates 3D epithelialis morphologiae (Fig. 3c, f et 4b, c). Cum in strato superiore uteri in ref. 2, morphologia epithelialis 3D sicut et microvilli in apicali penicillo per SEM (Fig. 3b) subjici possunt. Expressio differentiationis venalicium aestimari potest per faciendo quantitatis PCR5 vel simplicis cellae RNA sequencing. Hoc in casu, 3D stratae cellularum epithelialium in ventrem ramentorum vel astularum genepsicarum inveterati sunt et metiuntur ab usu analysi moleculares.
a, Workflow ad inductionem morphogenesis intestinalis in chip hybrid.Caco-2 et organoides intestinorum in hoc protocollo adhibentur ad demonstrandum 3D morphogenesis in chip hybrid suggestu. Dissociatae cellae epitheliales in Transwell insertis praeparatae (TW prep, vide figuram infra). Olim cellae seminatae sunt conditiones in cellulis transversis culturae (TWis culturae culturae insertis) sparsae. ) Post 7 dies, unum Transwellum insertum continens 2D monolayrum cellularum epithelialium integratum est in spumam hybridalem ad introducendam fluxum basolateralis (fluvii, BL), quae demum ad generationem 3D epithelialis (morphogenesis) .Phase antithesis micrographae morphologicae notae organi humani epithelialis gradatim derivatae a puncto temporis adscendentes (C10 schismatici experimentales in strato normali ascendentes (C10) schismatici schismatici e puncto normali ascendentes (C10, experientiae schismatici e puncto temporis donatoris (C10) . al configuration pro unoquoque pass.b, astulae hybridicae (schismaticae sinistrae) ducere potest ad 3D morphogenesis cellularum epithelialium organoidearum cum microscopio confocali summo-descendentium sententiarum diversarum Z positionum (superiorem, mediam et inferiorem;vide schismaticum rectum et punctatum respondentem).manifestavit notas morphologicas. F-actin (cyan), nuclei (grisei).c, Fluorescens micrographorum confocalorum (3D sententia rectangulorum) cellularum epithelialium organoid-arum in Transwell stabili stabili (TW; inset intra capsam albam allisam) versus hybridarum (maximam sententiam iecit) comparans 2D versus 3D morphologiam, 2D. 2D et 3D features.Scale talea, 100 µm.c Reprinted with permission from reference.4.ALIUS.
Imperium praeparari potest ex eisdem cellulis culturae (Caco-2 vel organoideis epithelialibus intestinorum cellulis) in duos dimensivas monolayores sub condicionibus culturae statice conventionalis. Notabiliter deperditio nutrimenti provenire potest ob limitatam capacitatem microchannels (i.e. ~4 µL in summo canali antequam in originali ventriculi designo.
Mollis processus lithographiae in cubiculum puro peragi debet. Quaelibet enim iacuit in spuma (stratorum superiorum et inferiorum et membranarum) et astularum hybridarum, variae imagines photographicae adhibitae sunt et in lagana silicon separatae fabricatae sunt, quia altitudines microchannels diversae erant. Scopuli altitudines microchannels superioris et inferioris ventriculi in spumam sunt 500 µm et 200 µm.
Pone laganum siliconis 3 pollicis in phiala cum acetone. Leniter bractea volutare pro 30 secundis, deinde laganum aerem exsiccare. Translatio laganum ad laminam cum IPA, deinde laminam pro 30 minuto ad purgandum.
Solutio piranha (mixtura hydrogenii peroxidi et acidi sulphurici contracti, 1:3 (vol/vol)) optione adhiberi potest ad remotionem residuorum organicarum e superficie lagani pii.
Piranha solutio maxime mordax est et caloris gignit. Additional salus cautiones necessariae sunt. Pro vasto dispositione, permitte solutionem refrigerandi et transferendi ad vas vastum mundum, siccum. Utere vasis secundis et proprie label vastis vasis. Placere sequere facilitatem securitatis normas accuratiores procedendi.
Laganum dehydrato ponendo super 200 °C lamminam calidam pro 10 min. Post siccitatem laganum quinquies in aere ad refrigerandum concussa est.
Funde ~10 g photoresistae SU-8 2100 in centrum lagani pii purgati. Forcipe utere ut photoresist aequaliter in laganum diffundas.Occasione laganum super 65°C laganum calidum pone ut photoresist minus glutinosum et facilius ad diffundendum. Laganum directe in laminam calidam noli collocare.
SU-8 aequaliter distributum erat in laganum ad currendo telas coating. Progressio advenientis rotationis SU-8 pro 5-10 ad propagandum ad 500 rpm ad accelerationem 100 rpm/s. Pone summa spin pro 200 µm crassitudine exemplaria ad 1,500 rpm, vel 250 µm crassitiem (faciens 500 µm altitudinis gradus infra "s. rpm/s 30 seconds ad 1,200 rpm.
Praecipua nent celeritas aptari potest secundum crassitudinem scopo SU-8 in exemplo lagani Pii.
Ad fabricandum SU-8 exemplaria 500 µm altitudinis pro strato superiori ventriculi super spumam, subtemen tunicae et mollis coquens gradus huius arcae (gradus 7 et 8), continue iterabantur (cf. gradum 9) ad duos ordines 250 µm stratos grossos SU-8 producere, quae in 12 huius capsulae UV detectione iacuisse et coniungi possunt, stratum 500 µm altum efficiunt.
Mollis lagana SU-8 coquenda, diligenter uncta ponendo in patina calida 65 °C pro 5 min, tunc vertas occasum ad 95 °C et incubant addito 40 min.
Ad consequendam 500 μm altitudinem exemplaris SU-8 in microchannel superiore, gradus 7 et 8 repete ad duo 250 µm crassitudines SU-8 stratis generandi.
Usura UV Mask Aligner, lucernam testam fac iuxta mandata fabricantis ad tempus expositionis lagani computandum. (expositio temporis, ms) = (expositio dosis, mJ/cm2)/(lucerna potentia, mW/cm2).
Post tempus expositionis determinandum, photomascum pone super larva possessoris UV larvae aligner et pone photomascum in SU-8 laganum obductis.
Pone superficiem photographicam impressam directe in SU-8 latere lagani Pii obductis ad dispersionem UV extenuandam.
SU-8 exponere laganum linitum et verticaliter photomascum ad 260 mJ/cm2 luminis UV ad tempus expositionis praefiniti (vide gradum 10 huius capsulae).
Post UV detectionem, SU-8 uncta uncta silicon-65°C pro 5 min et 95°C coquebantur pro 15 min in unaquaque lamina caldaria ad formas altitudinis 200 μm. Extende post-coquantum temporis 95°C ad 30 min ad exemplaria fabricanda altitudine 500 µm.
Elit in disco vitreo infunditur, et laganum elixum in catino ponitur. Volumen SU-8 elit variari potest secundum magnitudinem vitrei. Fac uti satis SU-8 elit ut omnino remotum SU-8. Exempli gratia, cum 150 mm diametro vitreo utens cum capacitate 1 L, utere ~ 300 mL de SU-8 elit. Formam evolutionis per 25 minutas interdum leves gyrationis evolvere.
Inusserunt forma evoluta cum ~10 mL elit recentis quem sequitur IPA spargit solutionem fistulae utens.
Pone laganum in plasmate mundiore et dolori plasma (gas atmosphaericum, pressionem scopum 1 10−5 Torr, potentia 125 W) pro 1.5 min.
Pone laganum in vacuo desiccatorem cum vitreo intus. Wafers et labitur iuxta latus collocari possunt. Si vacuum desiccator in plures ordines per laminam dividitur, pone labitur in cubiculo inferiore et lagana in cubiculario superiori. Drop 100 μL trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) lapsus et solutionem vitream applica.
Ligula phialas congelatas Caco-2s cellas in balneum aquae 37°C transferre, cellas dilapsas ad T75 vasculum continens 15 mL 37°C medium Caco-2 praecalidum.
Ut cellulis Caco-2 ad ~90% confluentiam transeamus, primum Caco-2 medium calidum, PBS, et 0,25% trypsin/1 mM EDTA in aqua balnei 37°C.
Aspirate medium per aspirationem vacuum. Cellae lava bis cum 5 mL calidarum PBS repetendo vacuum aspirationem et novas PBS addendo.