Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versionem navigatoris limitata CSS auxilio uteris.Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor).Praeterea, ad sustentationem permanentem, situm sine stylis et JavaScript ostendemus.
Simul labitur carousel trium ostentat.Bullae Priore et Posteriore utere ut per tres lapsus tempore moveantur, vel globulis lapsus utere in fine, ut per tres lapsus tempore moveatur.
Impedimentum sanguinis cerebri et claustrum cerebri sanguinis prohibent agentes biotherapeutici, quominus scuta in systemate nervosi centrali attingant, eoque efficacia curationem morborum neurologicorum impediunt.Ad portatores novos cerebri in vivo detegendo, bibliothecam peptidis T7 phage intulimus et serially collecti sanguinis et fluidi cerebrospinalis (CSF) utentes cannulatae consciae magnae piscinae exemplar murium.Cloones specificae phage valde locupletati sunt in CSF post quattuor orbes delectu.Expertus singularum candidatorum peptidum plusquam 1000 triplicem locupletationem in CSF manifestavit.Bioactivitas traditionis peptide mediatae ad cerebrum confirmata est per 40% reductionem in plano amyloideae in fluido cerebrospinali utente BACE1 peptide inhibitore coniuncto cum peptide novo transitu identificato.Hi eventus suggerunt peptides, quae in vivo phage selectae methodi notae sunt, utiles esse vehiculis ad systemica traditio macromolecularum ad cerebrum cum effectu therapeutico.
Systema nervosum centrale (CNS) iaculis therapiae investigationis late in identitate medicamentorum optimizedium et agentium quae exhibent proprietates CNS-targetum, minore conatu de inventis mechanismis quae activam medicamentorum partum ad cerebri pellunt.Hoc nunc incipit mutare sicut pharmaca traditio, praesertim magnas moleculas, est pars integralis evolutionis medicamentorum recentiorum neuroscientiae.Ambitus systematis nervosi centralis bene munitum est ab obice cerebrovasculari, obice (BBB) ​​sanguine et obice (BBB) ​​sanguinis (BCBB) 1 munitum, provocans ad medicamenta ad cerebrum1,2 liberandum.Existimatur fere omnia medicamenta magna moleculae et plus quam 98% parvae medicamenta moleculae e cerebro exstingui.Quam ob rem maximi momenti est ad novas rationes cerebri onerarias cognoscendas, quae efficientem et specificam medicamentorum medicinalium medicinarum CNS 4,5.Nihilominus, BBB et BCSFB etiam opportunitatem praestantem medicamentorum traditionis exhibent, cum omnes structuras cerebri per amplam vasculaturam penetrant et intrant.Sic conatus currentis utendi methodi tradendi non incursivae cerebro magnae innituntur in mechanismo transporti receptae mediatae (PMT) adhibito receptore endogenoso BBB6.Quamvis recentis clavium progressionis utens transferrin receptoris pathway 7,8, ulterior progressio novarum systematum traditionis cum melioribus proprietatibus exigitur.Ad hunc finem, propositum erat nobis notare peptides capaces onerariis mediantibus CSF, cum in principio adhiberi possent ut macromoleculas traderet ad CNS vel ad novos receptores vias aperiendas.Speciatim receptores specifici et transportatores systematis cerebrovascularis (BBB et BSCFB) possunt esse scuta potential pro liberatione medicamentorum biotherapeuticorum activae et specificae.Liquor cerebrospinalis (CSF) est productum secretorium plexi choroidis (CS) et directum contactum cum liquore interstitiali cerebri per spatium subarachnoidum et per spatium ventriculi.Nuper ostensum est liquorem subarachnoidum cerebrospinum nimis in interstitium cerebri diffundere.Speramus accedere ad spatium parenchymatis utendo hoc tractu subarachnoideo influenti vel directe per BBB.Ad hoc assequendum, delectu consiliorum in vivo phage robustum implevimus, quod specimen peptidum ab alterutro meatu distinctum transportatum identificat.
Nunc describimus sequentialem in phage vivo ostentationem protegendi methodum cum CSF sampling copulatam cum alta perputatione sequendi (HTS) ad monitorem initialem electionem circumeuntes cum summa bibliothecae diversitate.Protegendo fiebat in muribus consciis cum magna cisterna (CM) cannula insita permanenter ad contaminationem sanguinis vitandam.Importat, hic accessus eligat tum cerebrum-scopum et peptidas cum actuositate onerariis per claustrum cerebrovasculares.T7 phages ob parvitatem (~ 60 um) 10 usi sumus et idoneos esse suggesserunt vectibus vesicularum quae transcellulares endothelialis et/vel epithelial-medullae obice admittunt.Post quattuor orbes panning, incolarum phage semotus est ostendens in vivo CSF ​​opulentiam et microvessel consociationem cerebralem.Importat, inventiones nostras confirmare potuimus demonstrando praelatum et chemicum synthesim optimum candidatum peptidum posse onerariam interdum in fluidum cerebrospinum transportare.Primum, effectus pharmacodynamicus CNS constitutum est iungendo peptidem principalem cum inhibitore peptidi BACE1 .Praeter demonstrandum quod in vivo functionis protegendorum strategies nova cerebri onerariis peptides cognoscere possunt sicut dapibus onerarias efficaces, exspectamus similes functiones electiones accessus etiam fieri momenti in identitate nova cerebri onerariis meatus.
Ex plaque-formantibus unitates (PFU), post gradationem phage packaging, bibliotheca temere 12-mer linearis T7 phage peptidum cum diversitate circiter 109 designata et creata est (vide Materia et Methodus).Gravis est notare nos hanc bibliothecam ante in vivo panning diligenter enucleari.PCR amplificatio exemplorum bibliothecae phageae adhibitis primariis modificatis amplicons generatis, quae directe ad HTS applicata erant (Supplementary Fig. 1a).Ob a) HTS11 sequentes errores, b) ictum in qualitate primariorum (NNK) 1-12, et c) praesentia generis silvestrium (wt) phage (sceleton inserta) in bibliotheca sto- lica, successio eliquandi effecta est ad extrahendam solam informationem sequentiarum verificam (Supplementarium Fig. 1b).Hae colum gradus ad omnes HTS bibliothecas sequendas pertinent.Pro norma libraria, summa 233,868 legentium impetrata sunt, e quibus 39% colum indiciis transierunt et ad analysin bibliothecam adhibiti sunt et ad circumscriptiones subsequentes selectae (Figurae 1c-e).Legum praevalens multiplex 3 basium binorum longitudine cum cacumine ad 36 nucleotides (supplementum Fig. 1c), consilio bibliothecae confirmans (NNK) 1-12.Egregie, circiter 11% membra bibliothecae inclusa 12-dimensiva generis silvestrium narum PAGISRELVDKL inserta continebat, et fere dimidia pars sequentium (49%) insertas vel deletiones continebat.HTS bibliothecae bibliothecae altam diversitatem peptidum in bibliotheca confirmavit: plus quam 81% sequentium peptidarum semel tantum inventae sunt et tantum 1.5% factae sunt in exemplaribus ≥4 (supplementary Fig. 2a).Frequentiae amino acidorum (aa) omnium 12 positionum in repertorio connectuntur cum frequentiis exspectatur numerus codonum a degeneri repertorio NKK genitus (supplementum Fig. 2b).Observata frequentia residua aa his indita inserta bene connectuntur cum frequentia calculata (r = 0.893) (Fig. 2c).Praeparatio bibliothecae phage pro iniectione includit gradus amplificationis et amotionis endotoxini.Hoc prius ostensum est in potentia reducere diversitatem phage librariorum 12,13.Propterea bibliothecam endotoxin remotionem endotoxin subiisse et cum bibliotheca originali ad frequentiam AA aestimandam sequentiavimus.Fortis correlatio (r = 0,995) observata est inter piscinam originalem et piscinam ampliatam et purgatam (Fig. 2d Supplementarium), significans certamen inter clones ampliatum in laminas utens T7 phage maiorem pondus non effe.Haec comparatio in singulis bibliothecis motivis tripeptidis frequentia nititur, cum diversitas bibliothecarum (~109) plene capi non possit etiam cum HTS.Frequentia analysis aa in singulis positionibus parvae positionis dependens bias patefecit in tribus ultimis positionibus repertorii ingressus (Supplementary Fig. 2e).In fine concluditur qualitatem et diversitatem bibliothecae acceptam esse et tantum varias mutationes in diversitate minores observatas esse propter amplificationem et praeparationem bibliothecis phage inter plures delectu.
Serial liquor cerebrospinalis sampling perfici potest per surgically cannulam in CM mures consciae inserendo ut faciliorem identitatem identitatis T7 phage intravenose injectae (iv) per BBB et/vel BCSFB (Fig. 1a-b).Duas inde- lectas bracchias (arma A et B) in tribus primis circumscriptionibus vivorum lectionum usi sumus (Fig. 1c).Gradatim augevimus restrictionem electionis decrescentes summam phage in tribus primis rotundis delectu.Ad quartum panning rotundum exempla e ramis A et B coniunximus et tria additamenta selecta independentia egimus.Studere de proprietatibus vivorum particulis T7 phage in hoc exemplari, phage generis silvestris (PAGISRELVDKL domino inserto) in mures per venae caudae injecta est.Recuperatio phagiorum ex fluido cerebrospinali et sanguine in diversis temporis punctis ostendit quod phages icosahedralis relative parva T7 e cellula sanguinis alvi initialem celeriorem habuere alvi (Supplementary Fig. 3).Ex titers administrato et sanguine muricae volumine, tantum circiter 1% wt computavimus.phage ex dosi administrati deprehensus est in sanguine 10 minuta post infusionem intravenam.Post hanc initialem rapidam declinationem, prima alvi demissio tardius cum dimidia vita 27,7 minuta mensurata est.Importanter, paucissimae phages e cellula CSF receptae sunt, significans humilem curriculum pro phage migrationis silvestrium in cellulam CSF (Supplem. Fig. 3).Mediocris, tantum circa 1 x 10-3% titers T7 phage in sanguine et 4 x 10-8% initio phagi infusi deprehensi sunt in fluido cerebrospinali per integram periodum sampling (0-250 min).Notabiliter vita dimidia (25.7 min) phage generis silvestris in fluido cerebrospinali similis erat cum sanguine servatur.Haec notitia demonstrant impedimentum cellulae CSF a sanguine separantem esse integrum in muribus CM-cannulatis, permittens in viva delectu bibliothecarum phage ad cognoscendas clones quae facile ex sanguine in cellulam CSF deportantur.
(a) Methodus erigendi liquorem cerebrospinalem re- sampling (CSF) ex magno lacu.b) Diagram cellularum situm systematis nervosi centralis exhibens (CNS) obice et delectu militaris usus est ad peptides cognoscendas, quae obice sanguinis cerebri (BBB) ​​et impedimentum sanguinis transierunt.(c) In vivo phage flowchart protegendi ostentationem.In singulis rotundis delectu, phages (identificatores animalis intra sagittas) intravenously injecti sunt.Duae rami independentes alternae (A, B) separatim servantur usque ad quartum rotundum electionis.Nam delectu circumeunt 3 et 4, quaelibet phage clone extracta ex CSF manually sequentia erat.(d) Kinetics phage separata a sanguine (rubri circuli) et fluidi cerebrospinalis (trianguli viridis) in primo circum electione in duobus muribus cannulatis post injectionem intravenae bibliothecae T7 peptide (2 x 1012 phages/animal).Quadrata caerulea indicant mediocrem initialem phage attentionem in sanguine, ex quantitate phage injecti computata, ratione totius voluminis sanguinis.Quadrata nigra punctum sectionis ipsius y lineae extrapolatae e concentratione sanguinis phage indicant.(e, f) Praesens frequentia relativa et distributio omnium motivorum tripeptidi possibilium imbricatorum in peptide inventa.Numerus argumentorum in 1000 lectionibus invenitur.Insigniter (p < 0.001) argumenta aucta punctis rubris notantur.(e) Correlation scatterplot comparing the relative frequent of the tripeptide motif of the injected library with blood-ecta phage from animals #1.1 and #1.2.(f) Correlatio dispersos comparans frequentia relativa motifs phagi animalis tripeptidi # 1.1 et # 1.2 abstracta in sanguine et fluido cerebrospinali.(g, h) Sequentia ID repraesentatio phage sanguine locupletata (g) versibus injectis bibliothecis et phage locupletata CSF (h) versus cruor post rotundum in vivo delectu in utroque animali.Magnitudo unius-litteris codicis indicat quotiens amino acidum in illo loco occurrit.Viridis = polaris, purpurea = neutra, caerulea = fundamentalis, rubra = acidica et nigra = acida hydrophobica amino.Figura 1a, b designata et producta est ab Eduardo Urich.
Phage peptidis bibliothecam in duas CM instrumentum mures (clades A et B) injecimus et phagem separatam a fluido et sanguine cerebrospinali (Figura 1d).Initialis alvi celeritas bibliothecae minus prolata comparata erat cum phage agresti typo.Medium semivivum bibliothecae injectae in utroque animali erat 24.8 minuta in sanguine, phage type ferae similis, et 38.5 minuta in CSF.Specimina phage sanguinis et cerebrospinalis fluidi ab unoquoque animali HTS subiectae sunt et omnes peptides identificatae pro brevi tripeptide motivi praesentiae resolvuntur.Motiva tripeptida electa sunt quia minimum fundamentum praebent formationis structurae et interdum interationes 14,15.Correlationem bonam invenimus in distributione motionum inter bibliothecam phagenam injectam et clones ex utriusque animalium sanguine extractos (fig. 1e).Notitia indicant compositionem bibliothecae solum marginaliter locupletatum in cellula sanguinis.Amino acidi frequentiae et consensus sequentium adhuc ad singulas positiones enucleatae sunt utens adaptatione programmatis Weblogo16.Interestingly, fortem locupletationem glycinis residua sanguine invenimus (fig. 1g).Cum sanguis cum clonibus e CSF selectis comparatus est, valida lectio et quaedam motifs desestatio observata sunt (Fig. 1f), et quaedam amino acida potiora intersint positionibus praefinitis in 12 membro (Fig. 1h).Egregie singula animalia in fluido cerebrospinali insigniter differunt, cum locupletatio glycini sanguinis in utroque animali observata est.Post strictam eliquationem sequentiarum datarum in fluido cerebrospinali animalium #1.1 et #1.2, summa 964 et 420 unice peptidum 12-merorum consecuta sunt (Supplem. Fig. 1d-e).Clones solitarii ampliati sunt et secundo circumiecto in vivo electione subiciuntur.Phage extracta e secunda circum electione HTS in singulis animali et omnibus peptidis identificatis adhibita sunt ut initus ad recognitionem motiforum programmatis ad eventum motifs tripeptidis resolvendum (fig. 2a, b, ef).Comparato primo cyclo phage ex CSF recepto, animadvertimus ulteriorem electionem et deselectionem plurium motifs in CSF in ramis A et B (Fig. 2).identificatio retis algorithmus applicabatur ad determinandum si diversa exemplaria seriei consistentis repraesentarent.Luculenta similitudo observata est inter 12-dimensionales sequentias a CSF receptas in alterna clade A (Fig. 2c, d) et cladis B (fig. 2g, h).Analysis in unoquoque genere funduntur diversae lectionis perfiles pro 12-mer peptides (supplementariae Fig. 5c,d) et incrementum in CSF/sanguinis titer rationi super tempus pro fundunt clones post secundum rotundum electionis primae circum electionis comparatae (Supplem. Fig. 5e).).
Elevatio motionum et peptidum in fluido cerebrospinali per duos gyros successivos in phage vivo functionis exhibitionis delectu.
Omnes phages cerebrospinales e primo cuiusque animalis gyro receptae (animalia #1.1 et #1.2) funduntur, ampliantur, HT-sequuntur et in unum injecta sunt (2 x 1010 phages/animal) 2 SM mures cannulatae (#1.1 → #).2.1 et 2.2, 1.2 → 2.3 et 2.4).(a, b, e, f) Correlation scatterplots compares the relative frequency of tripeptidi motifs of all CSF-derived phages in the first and second rounds selection.Frequentia relativa et distributio motionum repraesentantium omnia possibilia imbricatis tripeptidis inventae in peptides in utraque orientatione.Numerus argumentorum in 1000 lectionibus invenitur.Motifs qui signanter (p < 0.001) selectae vel excluduntur in una ex bibliothecarum collatis punctis rubris illustratae sunt.(c, d, g, h) Sequentia logo repraesentatio omnium CSF-dives 12 amino acidorum longarum sequentium in circumeuntes 2 et 1 in vivo lectionis fundata est.Magnitudo unius-litteris codicis indicat quotiens amino acidum in illo loco occurrit.Ad repraesentandum logo, frequentia CSF sequentium ex singulis animalibus extracta inter duas circumscriptiones selectas comparatur et sequentia in secundo circuitu locupletata monstrantur: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 et (h) #1.2–#2.4.Amino acida maxime ditantur in positione data in animalibus (c, d) nullis.2.1 et num.2.2 vel (g, h) in animalibus n.2.3 et n.2.4 colore monstrantur.Viridis = polaris, purpurea = neutra, caerulea = fundamentalis, rubra = acidica et nigra = acida hydrophobica amino.
Post tertiam circum electionem, sequentia peptida 124 unica (#3.1 et 3.2) identificavimus ab 332 CSF-phage clones a duobus animalibus separatae (Supplementary Fig. 6a).Consequentia LGSVS (18.7%) habuit proportionem maximam relativam, quam sequitur genus silvestrium PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), et SARGSWREIVSLS (2.2%).In quarto ultimo, duos ramos separatim electos ex tribus animalibus separatis fundimus (Fig. 1c).Ex 925 clones phage sequentiae receptae ex CSF, in quarta circumcirca invenimus 64 sequentias peptidis singulares (Fig. 6b), inter quas proportio relativa phage generis silvestris ad 0,8% delapsa est.Frequentissimae CSF clones in quarta rotunda erant LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) et RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Longitudo peptidum delecturum ob insertas nucleotide / deletiones vel praematura sistenda codones in bibliotheca primariorum, cum degeneres codons utentes pro consilio bibliothecae NNK.Praematura sistenda codons breviores peptides generant et eliguntur, quia aa argumentum prosperum continent.Longiores peptides inveniantur ex insertionibus/deletionibus in primariis bibliothecarum syntheticae.Haec loca designatae codon subsistunt extra corpus et perlegit donec novus codon sistenda amni apparet.In genere, factores locupletandi pro omnibus quattuor lectionibus circumeuntes computavimus, comparando input data cum specimen output data.Primum circum protegendorum phage typum silvestrem titers usi sumus sicut in curriculo non specifico.Interestingly, delectu phage negativa valde valida in primo cyclo CSF, sed non in sanguine (fig. 3a), quod fortasse ob diffusionem passivam probabilitatem plerorumque membrorum bibliothecae peptidis in cellula CSF vel phagi relativa tendunt ut efficacius a sanguinis flumine quam bacteriophagis retineantur vel removeantur.Tamen in secundo circuitu panning, lectio phagiorum in CSF valida in utraque clade observata est, significans priorem rotundum in phages ostentantes peptides, quae CSF uptake promovent, auctum esse (Fig. 3a).Iterum sine significativa sanguinis opulentia.Item in tertio et quarto orbes phage clones insigniter locupletati sunt in CSF.Comparantes frequentiam relativam uniuscuiusque seriei peptidis unicae inter duos ultimos orbes electionis, invenimus sequentia in quarto rotundo delectu auctiores fuisse (Fig. 3b).Summa motiva tripeptidi 931 ab omnibus extracta sunt 64 sequenciarum peptida unica utentes orientationes utriusque peptidis.Motus locupletissimi in quarto gyro diligentius examinati sunt ut per profiles ditiores per omnes orbes comparati ad bibliothecam injectam (cut-off: 10% locupletationem) (supplementarium fig. 6c).Exempla generalia electionis demonstraverunt plerasque motivas investigatorum in omnibus prioribus circumscriptionibus utriusque electionis ramorum ditasse.Aliquot tamen motiva (eg SGL, VSG, LGS GSV) praevaluerunt ab alterna clade A, aliae vero (eg FGW, RTN, WGF, NTR) in alterna clade B ditata sunt.
Validatio CSF ​​vecturae CSF-phago-dispositae peptides locupletata et peptides biotinylatae ducis cum streptavidin stipendiorum coniugatorum coniunguntur.
(a) Rationes locupletandi in omnibus quattuor circulis computatis (R1-R4) fundatae in injectis (input = I) phage (PFU) titers et determinatae CSF phage titers (output = O).Locupletatio officinarum trium rotundorum ultimorum (R2-R4) computata est a comparatione cum priori circum et primo rotundo (R1) cum dato pondere.Claustra aperta sunt fluida cerebrospinalia, clausuras opaca plasma sunt.(***p<0.001, in discipulo scriptor test).b) Index peptidum copiosissimorum, secundum relativam proportionem omnibus phagiis collectis in CSF post rotundum 4 lectionis.Sex phage frequentissimae clones illustrantur colore, numero et amplificatione factores inter 3 et 4 delectu (insets).(c,d) Sex clones maxime locupletissimi, phage et phage peptide inanis bibliothecae parentum e rotundo 4 sigillatim in exemplar CSF sampling enucleatae sunt.CSF et exempla sanguinea collecta sunt in punctis indicatis.(c) Aequales copiae 6 candidatorum phage clones (2 x 1010 phages/animalium), phages vacua (#1779) (2 x 1010 phages/animalium) et phage peptide librariorum stirpis (2 x 1012 phages/animalium) Inject saltem 3 CM ad cannulatum animal separatim per venam caudam administratur.CSF pharmacokinetici cuiusque phage clone et phage peptide libraria injecta per tempus ostenditur.(d) mediocris ratio sanguinis CSF/mL super sampling tempus omnibus recuperatis ostendit.(e) Quattuor synthetica princeps peptides et unus imperium diripienda cum biotin ad streptavidin per eorum N-terminum (tetramer ostentationem) per injectionem sequitur (vena caudae iv, 10 mg streptavidin/kg).Saltem tres mures intubati (N = 3).).Specimina CSF in indicatis temporis punctis collecta et concentrationes streptavidin per CSF anti-streptavidin ELISA (nd = non detectae sunt) metiebantur.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ex test ANOVA).(f) Comparatio amino acidi seriei ditissimae phage peptide clone #2002 (purpura) cum aliis selectis phage peptide clones ex 4 rotundo delectu.fragmenta amino acidi identica et similia sunt color-coded.
Ex omnibus phagiis locupletatum in quarto circumitu (fig. 3b), sex candidatorum clones selectae sunt ad singulas analysin ulteriores in exemplo CSF ​​sampling.Aequales copiae sex phage candidatorum, phage vacua (non inserta) et prophagia librariorum peptidis in tria animalia CM cannulata injecta sunt, et pharmacokinetica in CSF (Fig. 3c) et sanguine (Supplmentaria Fig. 7) pertentata sunt injecta.Omnes phage clones temptaverunt iaculis cellulam CSF in plano 10-1000 plurium quam ad phage vacuae dicionis (#1779).Exempli gratia, clones #2020 et #2077 circiter 1000 temporibus maiores CSF titers quam phage imperium habuerunt.Profile pharmacokinetica cuiusque peptidis delecti alia est, sed omnes ea facultatem habent altam CSF homing.Constantem decrementum per tempus clones #1903 et #2011 observavimus, dum pro clonibus #2077, #2002 et #2009 incrementa per primos X minutas activam onerariam significare poterant sed verificari necesse est.Clones #2020, #2002, et #2077 ad altiora stabilita sunt, dum CSF concentratio clone #2009 lente minuitur post auctum initialem.Tunc relativum frequentiam cuiusque candidati CSF cum eius concentratione sanguine comparavimus (Fig. 3d).Correlatio medii titer cuiusque CSF candidati cum suo sanguine titer in omni sampling temporibus ostendit tres e sex candidatis insigniter ditatos esse sanguine CSF.Interestingly, clone #2077 altiorem sanguinis stabilitatem (Supplementary Figure 7).Ad confirmandas ipsas peptidas alias quam phage particulas in cellula CSF onerarias active transportandas posse, perstringimus quattuor peptidas duce derivatas cum biotino in N-termino, ubi peptides ad particulam phage iungunt.Peptides biotinylatae (nn. 2002, 2009, 2020 et 2077) cum streptavidin (SA) coniungebantur ut formas multimericae geometricae aliquantum imitantes phage.Haec forma etiam nobis permisit ut SA detectionem in sanguine et fluido cerebrospinali metiri permitteretur sicut dapibus peptides onerariae transportandae.Maxime, notitia phage saepe reproduci potuit cum peptides syntheticae in hac forma SA-conjugata administrabantur (fig. 3e).Peptides diripiendae minus initiales nuditates habebant et alvi velocius CSF cum insensibilibus intra 48 horis.Ut perspiciantur in traditione meatus harum peptidum phage clones in spatium CSF, localizationem singularum phage peptidis hits utentes immunohistochemisticam (IHC) perspicimus ad particularum phagenarum 1 horae post injectionem in vivo intravenam directe deprehendere.Egregie clones #2002, #2077, et #2009 per fortem maculam in capillariis cerebri deprehendi potuerunt, cum phage (#1779) et clone #2020 non detecta sunt.Hoc innuit peptides hae effectui in cerebro praecise per transitum BBB conferre.Praeterea accuratior analysis requiritur ad hanc hypothesim probandam, sicut etiam itineris BSCFB involvi potest.Cum amino acidi seriei ditissimorum clone (#2002) comparato cum aliis peptidis delectis, notatum est quosdam ex eis similes extensiones amino acidi habere, quae similem mechanismum transportare possunt (fig. 3f).
Ob singularem eius profile plasma et incrementa significantia in CSF super tempus, phage ostentationis clone #2077 amplius per longiorem XLVIII horarum spatium explorabatur et celeri incremento CSF ​​in societate cum Sa gradibus sustentatis observatus repetere potuit (Fig. 4a).Quoad alias phage clones notatae, #2077 valde maculatum pro capillariis cerebri et colocalizationem significantem cum nota capillaribus lectin in altiori resolutione inspectis et fortasse aliqua in spatio parenchymatis maculavit (Figura 4b).Ad investigandum num effectus pharmaceuticus peptidemediatus in CNS obtineri posset, experimentum egimus in quo versiones biotinylatae i) peptidis #2077 transitus et ii) peptidium inhibitoris BACE1 duobus diversis rationibus cum SA mixtum est.Unius compositionis modo inhibitoris BACE1 peptidis usus est, et pro altera ratione 1, pro BACE1 peptidis inhibitoris #2077 peptidis usus est.Utraque exemplaria intravenously ministrata sunt et sanguis et fluidus cerebrospinalis gradus beta-amyloideae 40 (Abeta40) supra tempus mensuratae sunt.Abeta40 mensuratum est in CSF sicut inhibitio BACE1 in cerebri parenchymate reflectit.Ut expectatur, ambo complexiones signanter sanguinis gradus Abeta40 reducuntur (Fig. 4c, d).Sed exemplaria tantum mixtura peptidis nulla continentur.2077 et inhibitor peptidis BACE1 cum SA coniugatis cum Abeta40 in fluido cerebrospinali notabilem effecit (fig. 4c).Notitia quod peptide nulla.2077 dapibus LX kDa SA in CNS transportare potest et effectus pharmacologicos cum SA-coniugatis inhibitoribus peptidis BACE1 inducit.
(a) Iniectio Clonalis (2 10 phages/animal) T7 phage exhibens longum tempus profiles pharmacokineticae CSF peptidis #2077 (RLSSVDSDLSGC) et phage imperium injectum (#1779) saltem tres mures CM-intubatus.(b) Microscopica confocal imago repraesentativa microvessels corticalis in phago-injecta muribus (2 10 10 phagi/animalis) ostendens contrariam partem peptidis # 2077 et vasorum (lectinarum).Clones hae phage 3 muribus administratae sunt, et per 1 horam ante perfusionem laborare permittuntur.Cerebrum dissectum et inquinatum elementis polyclonis FITC intitulatis contra capsidem T7 phage.Decem minuta ante perfusionem et fixationem subsequentem, DyLight594-intitulata lectin intravenously administrabatur.Imagines fluentes exhibentes lectin maculantem (rubrum) lateris luminalis microvessellorum et phagiorum (viridis) in lumine capillarium et perivasculares textus cerebri.Scala talea respondet 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 peptidium inhibitorium solum vel in compositione cum transitu biotinylated peptide #2077 copulata est cum streptavidin quam sequitur intravenosa iniectio trium saltem cannulatorum CM muribus (10 mg streptavidin/kg).BACE1 peptidium inhibitoris mediatae reductionis in Aβ40 mensuratum est ab Aβ1-40 ELISA in sanguine (rubrum) et fluidum cerebrospinum (orange) temporibus indicatis.Ad meliorem evidentiam, linea punctata ducitur in grapho ad libram 100%.(c) Recipis reductionem in Aβ40 in sanguine (triangula rubra) et fluidum cerebrospinum ( triangula aurantiaca ) in muribus tractata cum streptavidin conjugata ad transitum peptidis # 2077 et BACE1 peptidium inhibitorium in a 3:1 ratione.(d) Recipis reductionem sanguinis Aβ40 (circuli rubri) et fluidi cerebrospinalis (aurei circuli) mures cum streptavidino iuncto cum tantum peptide inhibitoriae BACE1 tractatae.Aβ intentio in dicione erat 420 pg/ml (declinationis vexillum = 101 pg/ml).
Phage ostentatio in pluribus locis investigationis biomedicae feliciter applicata est.Haec methodus adhibita est in diversitate vascularium vivo studiis 18,19 ac studiis nisl vasa cerebri 20,21,22,23,24,25,26.In hoc studio applicationem methodi huius selectionis extendimus non solum ad identitatem directam vasorum cerebralium peptidum, sed etiam ad candidatorum inventionem cum proprietatibus actuosis onerariis ut transitus cerebri sanguinis obice.Nunc demonstramus progressum delectu procedendi vivo in CM mures intubati et eius potentiam demonstramus ut peptides cum CSF homing proprietates cognoscant.Utens T7 phage bibliothecam 12-merorum peptidum temere exhibens, demonstrare potuimus T7 phage satis parva (circiter 60 um diametro) 10 ad claustrum sanguinis cerebri accommodari, inde directe transitum sanguinis-cerebri claustrum vel plexum choroidum.Animadvertimus CSF messem ex muribus CM cannulatis bene moderatam esse in methodo protegendi functionis vivorum, et phage extractum non solum ad vasculaturam ligatum, sed etiam per obice cerebri vectorem functum esse.Praeterea, simul colligendo sanguinem et applicando HTS ad CSF et phages sanguineas derivatas, confirmavimus electionem nostram CSF non commoveri per sanguinem locupletationis vel congrui ad dilatationem inter circum electiones.Autem, sanguis cellula est pars delectu procedendi, quia capax phages CSF camera attingere debet superesse et in sanguinis circulatione satis diu ditant se in cerebro.Ut certiora seriei notitias ex rudi HTS datae elicias, Filtra ad effectum deducenda aptamus ad errores speciales sequendos in analysi workflui.Incorporando parametros cinematicos in methodum protegendi, celeris pharmacokineticas silvestrium generis T7 phages (t½ ~ 28 min) in sanguine 24, 27, 28 inserentes, eorumque etiam vitam in fluido cerebrospinali (t½ ~ 26 min) per minutias determinavimus.Quamvis similes profiles pharmacokineticae in sanguine et CSF, tantum 0.001% de retentione sanguinis phage in CSF deprehendi potuerunt, indicato ima background mobilitatem generis silvestris T7 phage trans obice sanguinis.Hoc opus momentum primi rotundi electionis effert cum strategiis in vivis perscrutationem utens, praesertim ad systemata phage quae e circulatione celeriter purgatae sunt, sicut paucae clones ad cellulam CNS attingere possunt.Ita, primo circum, redactio in bibliothecam diversitatem valde magnam erat, cum modo paucae clones tandem in hoc exemplari arctissimo CSF ​​collectae sunt.Hoc consilio in vivo panning compluribus gradibus delectu comprehendit ut activae cumulus in cellula CSF, clone superstes in cellula sanguinis, et celeri remotio clonum T7 phage a sanguine intra primum 10 minuta (Fig. 1d et accessiones Fig. 4M).).Ita, post primum rotundum, clones variae phage in CSF notatae sunt, quamquam eadem piscina initialis pro singulis animalibus adhibita est.Hoc innuit multipliciter stricte lectionis gradus ad fontem bibliothecarum cum magna multitudine bibliothecae membrorum resultare in notabili diminutione in diversitate.Ideo temere eventus fiet pars integralis processus lectionis initialis, multum influens exitum.Verisimile est multas clones in bibliotheca originali simillimos CSF locupletandi propensionem habuisse.Tamen, etiam sub iisdem condicionibus experimentalibus, selectio proventuum variari potest ob paucitatem singularum clone in initio piscinae.
ARGUMENTUM IN DATUM CSF differunt ab his in sanguine.Interestingly notavimus primam mutationem versus peptides glycino-ditas in sanguine singulorum animalium.(Fig. 1g, Accessiones fig. 4e, 4f).Phage cum peptidum glycinum firmior et minus probabilis e circulatione sumi potest.Sed hae peptides glycineo-dives non detectae sunt in exemplis cerebrospinalibus fluidis, suggerentes bibliothecas curatas per duos diversos gradus selectos perrexisse: unum in sanguine et alterum in fluidum cerebrospinum coacervare permissum.Csf-ditatis clones ex quarto rotunda lectio prolixe probata sunt.Fere omnes clones singillatim probati confirmati sunt locupletari in CSF ad blank imperium phage comparatum.Una peptide hit (#2077) fusius examinata est.Plasma vitae dimidiae longioris cum aliis hits (Figura 3d et Figurae additae 7) ostendit, et interestingly hoc peptidium residuum cysteinum ad C-terminum continebat.Nuper ostensum est additionem cysteini ad peptidum posse proprietates pharmacokineticas emendare, ligando ad albumin 29 .Haec nunc pro peptide #2077 ignota est et studium ulteriorem requirit.Nonnulli peptides declaraverunt dependentiam in CSF locupletationis (notitiae non ostensae), quae referri possunt ad geometriam superficiei capsidis ostensam.In T7 ratione usi sumus exemplaribus singulis peptidi per phage particulam 5-15 ostendimus.IHC fiebat in candidato phage clonae plumbeae intravenously in cortex cerebri mures inclusi (Fig. 8).Notitia ostendit quod cum BBB saltem tres clones (No. 2002, No. 2009 et No. 2077) inter se occurrunt.Restat ut statuendum sit utrum commercium hoc BBB proveniat in cumulum CSF vel motus harum clonum directe ad BCSFB.Adipiscing, ostendimus electos peptides suas CSF onerariam facultatem retinere cum summatim et ligatum ad dapibus mercium.Binding of N-terminal peptides biotinylated ad SA essentialiter repetit eventus consecutus cum propria phage clones in sanguine et fluido cerebrospinali (fig. 3e).Denique ostendimus plumbum peptidum #2077 posse promovere actionem cerebri inhibitoris biotinylati peptidis BACE1 coniugati ad SA, causando effectus pharmacodynamicos pronuntiatos in CNS, signanter minuendo Abeta40 gradus in CSF (Fig. 4).Non potuimus cognoscere aliquas homologas in datorum faciendo per sequelam peptida sequela homologia inquisitionis omnium hit.Magni momenti est notare quantitatem bibliothecae T7 proxime 109, dum theoretical library size for 12-mers is 4 x 1015. Propterea nos tantum decerpimus parvam fractionem diversitatis spatium bibliothecae 12-mer peptidis, quod significare potest quod plus optimized peptides identificari potest per aestimans spatium sequentium adjacentium horum hits identificatorum.Hypothetice, una e causis cur non invenimus aliquas homologas ex his peptides naturales, in evolutione deselectionis esse potest, ne immoderata quorundam motuum in cerebri viscus peptidis.
Simul sumpti, nostri eventus fundamentum praebent operis futuri ad cognoscendum et notandum rationes onerarias cerebrovasculares obice vivo subtilius.Fundamentum fundamentalis huius methodi fundatur in electione functionis militaris quae non solum clones identificat cum proprietatibus ligaturae cerebri vascularibus, sed etiam includit gradum criticum in quo felicia clones intrinsecam habent actionem ad claustra biologica vivo in CNS cellula transeundi.est elucidare mechanismum vecturae harum peptidum earumque praeponendi ad microvasculaturam specificam ad regionem cerebri elucidandam.Hoc induci potest ad inveniendas semitas novas pro receptoribus BBB et translationibus.Exspectamus peptides identificatos posse directe ligare receptoribus cerebrovascularibus vel ligandis circulationibus per BBB vel BCSFB transportatis.Vectorium peptide cum CSF activitatem onerariam in hoc opere repertam ulterius investigabitur.In praesenti inquisitione sumus cerebri specificitatem harum peptidum pro facultate BBB et/vel BCSFB transire.Novae hae peptides instrumenta validissima erunt pro potentia inventionis novorum receptorum vel viarum et ad novas suggestas maxime efficaces excolendas ad macromoleculas tradendas, sicut biologicas, ad cerebrum.
Cannulate cisterna magna (CM) modificatione utens methodi suprascripti.Anesthetized Wistar mures (200-350 g) in apparatu stereotaxico insidebant et incisio mediana super rasam et aseptically cutem paravit ut cranium patefaceret.Terebra duo foramina in area cinguli superioris, et pones cochleis in cavernis figendis.Additamentum perforatum terebratum in crista occipitali laterali ob cannulam ferri cannulam stereotacticam ductu inactae in CM.Affer dentalem caementum circa cannulam et cum cochleis securam.Post cicatricem photographicam et caementa obdurationem, vulnus cutis cum 4/0 supramedia sutura clausa est.Propria collocatio cannulae confirmatur ab lacus spontaneo fluidi cerebrospini (CSF).Rat e apparatu stereotaxic removere, postoperativam curam et dolorem opportunam procurationem accipias, et permitte eam recuperare per unam saltem hebdomadam donec signa sanguinis in fluido cerebrospinali observantur.Wistar mures (Crl:WI/Han) a Carolo Riverio impetrati sunt.Omnes mures sub certis condicionibus pathogen-liberis conservatae sunt.Omnia experimenta animalis ab Officio Veterinario Civitatis Basiliensis, Helvetiae approbata sunt, et secundum licentiam Animalium N. 2474 facta sunt (Assessio Active Brain Transport per Graduum Therapeuticorum Candidatorum in Cerebrospinali Fluidi et Cerebri de Rat mensurando).
Leniter custodi rat conscium cum CM cannula in manu.Datura ex cannula remove et collige 10 µl sponte fluens liquorem cerebrospinum.Cum patency cannulae ultimo aedilis fuit, solum perspicua exemplaria fluidi cerebrospinales nullis testimoniis sanguinis contaminationis vel discolorationis in hoc studio inclusae sunt.Parallela, circa 10-20 µl sanguinis e parva incisione ad extremum caudae in fistulas cum heparin desumpta (Sigma-Aldrich).CSF et sanguis variis temporibus collectis punctis post injectionem intravenosam T7 phage.Proxime 5-10 µl liquoris deponitur antequam unumquodque specimen CSF collectum est, quod cadaveri catheteri respondet.
Librarii T7Select 10-3b vectore utentes generati sunt in T7Select systema manuali (Novagen, Rosenberg et al., Innovationes 6, 1-6, 1996).Breviter, temere 12-mer DNA inserta in sequenti forma perstringitur:
In NNK codon adhibitum est vitare duplex codons sistendum et amino acidi overexpressionis in inserta.N est ratio aequimolari utriusque nucleotide manually mixta, et K est ratio aequimolari adenini et cytosini nucleotidis manually mixta.Singulae regiones destitutae ad duplicem destitutus DNA conversae sunt ab ulteriori incubatione cum dNTP (Novagen) et Klenow enzyme (Nova Anglia Biolabs) in quiddam Klenow (Nova Anglia Biolabs) pro 3 horis ante 37°C.Post reactionem, DNA duplex subductis ab EtOH praecipitatione recepta est.Proveniens DNA cum restrictione enzymes EcoRI et HindIII (ambo ex Roche) digesta est.Conglutinata et purgata (QIAquick, Qiagen) inserta (Ligationes T4, Biolabs Novae Angliae) in compage pre-conglutinata T7 vectoris post amino acido 348 generum 10B capsidis erat ligatum.Ligation reactiones incubatae sunt 16° C. per 18 horas ante quam in vitro packaging.Phage fasciculus in vitro fiebat secundum instructiones cum ornamentis exquisitis T7Select 10-3b (Novagen) et solutionis packaging olim amplificata est lysis utens Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysatae centrifugae, titratae et concretae ad -80° C. ut truncus solutionis glyceroli.
Direct PCR amplificatio phage regionum variabilium in sorbitione vel lamina ampliata utens primariorum proprietariorum 454/Roche-amplicon fusionis.Fusio anterior primarius continet sequentia in regione variabili (NNK) 12 (template-specifica), GS FLX Titanium Adapter A, et quattuor basi bibliothecae clavem sequentiam (TCAG) (Figura suppletiva 1a);
Fusio prima inversa etiam continet biotin adnexum globulis capiendis et GS FLX Titanium Adaptorem B requisitum ad amplificationem clonalis in emulsione PCR:
Amplicons ergo subiiciebantur 454/Roche pyrosequens secundum protocollum Titanium 454 GS-FLX.Ad manualem Sanger sequencingum (Acta Biosystematum Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA per PCR ampliatum est et cum sequentibus imis primariis sequentia;
Inserta e singulis tabulis subiecta erant amplificationi PCR utens Roche Fast Start DNA Ornamentum Polymerase (iuxta instructiones fabricantis).Praestare initium calidum (10 min in 95°C) et 35 cyclos boost (50 s in 95°C, 1 min in 50°C, et 1 min ad 72 °C).
Phage ex bibliothecis, phage agrestis, phage e CSF et sanguine erepta, vel singulae clones ampliatae sunt in Escherichia coli BL5615 in TB sorbitionis (Sigma Aldrich) vel in 500 cm2 acetabula (Thermo Scientific) pro 4 h ante 37°C.Phage e laminis lotis extractae sunt cum Tris-EDTA quiddam (Fluka Analyticum) vel tabulas cum apicibus sterilibus pipettis colligendo.Phage a cultura supernatantis vel extractionis quiddam separatum cum glycollo polyethylene (PEG 8000) praecipitatio (Promega) et in quiddam Tris-EDTA resuspensum est.
Phage ampliata subiciebatur endotoxini circumitionibus 2—3 remotionis utens globuli endotoxin remotionis (Miltenyi Biotec) ante iniectionem intravenae (500 μl/animal).Primo circum, 2×1012 phages introductae sunt;in secundo, 2× 1010 phages;in tertia et quarta lectio circumeunt, 2×109 phages per animal.Phage contenta in CSF et exemplis sanguinis collectis in puncto temporis indicato determinatum est tabula computatione secundum instructiones fabrica (T7Select systema manuale).Phage lectio fiebat ab injectione intravenae librariorum in venae caudae vel ex re-injectione phage extracti ex CSF ex priori delectu rotunda, et messes subsequentes fiebant ad 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, et 240 min respective CSF et exempla sanguinis.In summa quattuor gyrorum pannificatio vivorum deducta est, in quibus duo rami selecti seorsim repositi sunt et enucleati per tres primos orbes delectu sunt.Omnes phage insertae ex CSF duobus primis rotundis electionis extractae sunt subiectae 454/Roche pyrosequencing, cum omnes clones ex CSF ultimis duobus rotundis electionis extrahendi sunt manually sequentiae.Omnes sanguinis phagimata e primo circuitu selectae etiam 454/Roche pyrosequenti subiecta sunt.Ad injectionem phage clonum, phagiorum selectarum ampliati sunt in E. coli (BL5615) in 500 cm2 laminarum 37°C pro 4 horis.Singillatim electae et manually clones in TB medio propagatae sunt.Post phage extractionem, purificationem et amotionem endotoxini (ut supra dictum est), 2×1010 phagi/animal 300 µl in unam venam caudae intravenously sunt injectae.
Praecedens et qualita eliquatio sequentis notitiae.Rudis 454/Roche data est ex forma binarii fluminis in forma (sff) conversa ad Pearson humanam formam readabilem (fasta) programmatum venditoris utens.Praeterea processus nucleotidis sequentiae fiebat utens programmatum proprietariorum C et scriptorum (involucrum programmatum resolutum) de quibus infra.Analysis primariae notitiae multi-states eliquandi rationes strictas includit.Ut eliquare legit quae validam 12mer inserendam DNA sequentiam non continebat, sequentiter perscripta erant ut titulus incipere (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), siste titulus (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) et background inserta (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utentes global Needleman-Wunsch test.alignment permittens usque ad 2 repugnantia per alignment31.Propterea legit sine initio et scopo tags ac legit in quibus background insertae sunt, id est, alignments quae licitum numerum mismatched excedunt, e bibliotheca remota sunt.Quod ad reliquas leges attinet, sequentia N-mer DNA ab initio notae protensa et ante terminationem notam ab originali recitata serie excisa et ulterius processit (infra postea ad "insert" refertur.Post translationem insertae, pars post primam terminationem codon in 5′ fine primi ab inserta removetur.Praeterea nucleotides ducentes ad codones imperfectos in 3° primi fine sublati sunt.Ad inserta excludenda quae tantum sequentia background, translata interserit incipientes ab exemplo amino acido "PAG" etiam remoto.Peptides cum post-translationali longitudine minus 3 amino acida a librario remota sunt.Demum, redundantiam in lacunam insertam removere ac frequentiam singularum singulorum inseruisse determinare.Eventus huius analysin includuntur indicem sequentiarum nucleotidum (insertarum) earumque frequentiarum (figurarum supplementarum 1c et 2).
Group N-mer DNA inserta per sequentiam similitudinem: 454/Roche-specificae errores sequendi (ut problemata cum extensionibus homopolymarum sequendo) et leviora redundantia removenda, prius percolantur N-mer DNA series insertas (inserts) a similitudine digestae.insertiones (usque ad 2 bases non-aequantes permissae) utentes algorithmus iterativas definiuntur sic: insertiones primo frequentia (summae ad infimas) digestae sunt, et si eaedem sunt, secundario per longitudinem (longissima ad brevissimam)).Sic insertiones frequentissimae et longissimae primum « coetus » definiunt.Coetus frequentia frequentiae clavis est.Tum singulae insertio reliquae in indice digesto conati sunt ut globi alignment a paris Needleman-Wunsch adderentur.Si numerus mismatches, insertiones vel deletiones in noctis limen non excedit, insertio globi additur, et altior frequentia augetur quo saepe insertio addita est.Insertae globo additae signatae sunt usus et ab ulteriore processu exclusus.Si series inserta coetui iam exsistenti addi non potest, sequentia inserta ad novum coetum creandum adhibita frequentia inserta et uti notata est.Iteratio terminatur, cum singulae seriei insertionis vel novum coetum formare adhibita vel in coetus iam exsistente comprehendi possunt.Post omnes, inserta nucleotidum globorum constantium, tandem in sequentia peptida translati sunt (bibliothecae peptidis).Effectus huius analyseos est copia insertionum earumque frequentiarum correspondentium quae numerum legit consecutivorum (supplementary Fig. 2).
ARGUMENTUM Generationis: Ex indice peptidum singularium, bibliotheca creata est continens omnia exemplaria amino possibilia (aa) ut infra ostendetur.Singula exemplaria longitudinis possibilis 3 e peptide extracta et inversa forma addita est una cum bibliotheca communi motiva continens omnia exemplaria (tripeptides).Bibliothecae argumentationes valde repetitae sequebantur et additae erant.Deinde, pro quolibet tripeptide in bibliotheca motiva, pro praesentia sua in bibliotheca instrumentorum computationum utentes repressimus.Hoc in casu, frequentia peptidis continens argumentum tripeptidum invenientis additur et attribuitur argumentum in bibliotheca motiva ("numeri motifs").Effectus generationis motivi est duplex ordo dimensivus continens omnes eventus tripeptides (motifs) et eorum valores, qui numerus sequentium perlegit consequentes in motu congruenti cum legentes percolantur, glomerantur et transferuntur.Metrica de quibus supra.
Normalizationem numeri motivi et respondentis scatterplots: numerus motiviis pro singulis specimen est usus normalized
in quo ni is numerus legitur in quo argumento continentur i.Thus, vi represents the percentage frequency of reads (vel peptides) continens argumentum i in sample.P-valores numero motivi non normalizati computatae sunt experimentum exactum piscatoris.Quoad correlogramma numerorum motiva, correlationes Spearman computatae sunt numero normalizatarum motivarum cum R.
Argumentum amino acida ut in singulis positionibus in bibliotheca peptide, logogrammata interretialem 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) creata sunt.Primum, contentum amino acidorum in singulis positione 12-merorum peptidis in 20×12 matrice reponitur.Deinde copia 1000 peptidum continens contentum acidum idem relativum amino ad singulas positiones in forma fasta-sequentis generatur et proviso ut initus ad interretialem 3, quae graphice repraesentationem amino acidi contenti in utraque positione generat.pro librario dato peptide.Ad multidimensionales datastas visualizandas, mappae caloris utentes instrumento interne elaborato in R (biosHeatmap, adhuc R sarcina dimissi sunt).Dendrogrammi in mappis calefactis adhibiti sunt calculata utendi methodo hierarchica Wardorum racemorum cum spatio metrico Euclidea.Pro statistica analysi motif scoring data, P valores scoring pro unnormalized calculi adhibitis test exactorum Piscatoris computabantur.P-valores pro aliis datasetis computatae sunt in R utens discipulorum t-test vel ANOVA.
Phage clones et phages sine insertis injectae sunt intravenously per venae caudae (2×1010 phages/animal in 300 µl PBS).Decem minuta ante perfusionem et fixationem subsequentem, eadem animalia intravenously cum 100 µl de DyLight594-intitulata lectin injecta sunt (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuta post phage iniectionem, mures per cor perfunduntur cum 50 ml PBS, quem sequitur 50 ml 4% PFA/PBS.Cerebrum exempla additae sunt pernoctare in 4% PFA/PBS et madefactum in 30% sucoso pernoctare in 4°C.Exemplaria mico constringuntur in OCT mixtura.Analysis immunohistochemica congelatarum exemplorum facta est in cella temperie in 30 µm cryosectionum 1% BSA obsessarum, et incubatis elementis polyclonis FITC-intitulatis contra T7 phage (Novus NB 600-376A) in 4°C.Incubare cod.Denique sectiones 3 vicibus cum PBS ablutae sunt et microscopio confocal laser (Leica TCS SP5) examinatae sunt.
Omnes peptides cum minimae puritatis 98% a GenScript USA synthetae sunt, biotinylatae et lyophilatae.Biotin ligatur per glycinum triplum addito in N-termino.Compesce omnes peptides spectrometriae utentes.
Streptavidinum (Sigma S0677) mixtum est cum excessu aequimolari 5-plici peptidis biotinylated, biotinylati BACE1 peptidis inhibitoriae, vel aggregatio (3:1 ratio) peptidis inhibitoriae BACE1 biotinylatae et BACE1 peptidium inhibitorium in 5-10% DMSO/incubatum in PBS.Locus temperatus ante horam I iniectio.Streptavidin-conjugata peptides intravenously in dose 10 mg/kg in unam e venae caudae mures cum cavitate cerebri injectae sunt.
Restrictio complexorum streptavidin-peptidorum ab ELISA aestimata est.Nunc Maxisorp laminae microtiter (Sigma) obductae sunt pernoctare 4°C cum 1.5 μg/ml mus anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-2011).Post interclusionem (obturans quiddam: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatinam, 1% BSA) ad locus temperatus per 2 horas, laminam lava cum 0.05% Twen-20/PBS (lava quiddam) pro 3 Secundo, exempla CSF et plasma adiecta sunt puteis interclusione diluti 1:115.Patella tunc pernoctare in 4°C incubabat cum anticorpore detecto (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Post tres gradus lavationis, streptavidin ab incubatione in TMB solutione substrata (Roche) deprehensa est, usque ad 20 min.Postquam color evolutionis cum 1M H2SO4 intermisit, metire absortionem in 450 um.
Munus complexi inhibitoris streptavidin-peptidi-BACE1 ab Aβ(1-40) ELISA secundum protocollum fabricatoris aestimatum est (Wako, 294-64701).Breviter, CSF exemplaria in regula diluentes diluta sunt (1:23) et incubata pernoctare in 4°C in 96-platulis bene obductis cum antibody BNT77 sumptis.Post quinque gradus lavacro, anticorpus HRP-conjugatum BA27 additur et incubatur per 2 horas ad 4° C., deinde quinque gradibus lavacro.Aβ (1-40) deprehensus est ab incubatione in TMB solutione pro 30 minutis cubiculi temperie.Post color progressionem solutionem stop obstructa est, metire absorbance ad 450 um.Exempla plasma solido periodo extractionis ante Aβ(1-40) ELISA subiecta sunt.Plasma ad 0.2% DEA (Sigma) in 96-bene laminas et incubatis cella temperie per 30 minuta addita est.Postquam laminas SPE (Oasis, 186000679) successive lavavit, cum aqua et methanolum%, exempla plasma SPE lamellis additae sunt et omnis liquor remotus est.Exempla abluti sunt (primum cum 5% methanolum, deinde 30% methanolum) et eluta 2% NH4OH/90% methanolum.Exsiccata eluate ad 55°C pro 99 min in constanti N2 currenti, exemplaria in diluentium vexillum et Aβ (1-40) mensurata sunt, ut supra dictum est.
Quomodo hoc articulum citemus: Urich, E. et al.Partus mercium ad cerebri usus peptides transitus quae in vivo notantur.de scientia.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB et Moos T. Denuntiatio medicamentorum macromolecularium cerebri adhibitis therapiis iaculis.Acta Neurochemistica 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., et Martinez-Martinez, P. Traditio peptidis et interdum medicamentorum per obice sanguineum cerebrum.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Sanguinis cerebrum obice: a bottleneck in cerebro medicamento development.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, Byrd, A. Prospectus melioris medicamentorum partus et nisi ad cerebrum per plexum choroidum-CSF pervium.Pharmaceutical Research 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisatio biopharmaceutica cum equis Trojanis hypotheticis ad partum cerebri.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediatus peptide transvehendo trans sanguine-cerebri claustrum.Endocr. Apoc. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Incrementa cerebri penetrationem et efficaciam elementorum therapeuticorum utentium pectinarum monovalentium hypotheticorum.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrin receptor (TfR) onerariis determinat motum cerebri affinitatis variantes TfR elementorum.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).