Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versione navigatri uteris quae CSS sustinet limitatum. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro recentiore utaris (aut Modum Compatibilitatis in Internet Explorer debilites). Praeterea, ut auxilium continuum praestemus, situm sine stylis et JavaScript monstramus.
Series trium diapositivarum simul ostendit. Utere bullis "Prior" et "Sequens" ad tres diapositivas simul movendas, vel bullis cursoribus in fine ad tres diapositivas simul movendas utere.
Claustrum haematoencephalicum et claustrum haematoencephalicum prohibent ne agentes biotherapeutici ad proposita sua in systemate nervoso centrali perveniant, ita curationem efficientem morborum neurologicorum impedientes. Ut novos transportatores cerebri in vivo inveniremus, bibliothecam peptidorum phagi T7 introduximus et sanguinem et liquorem cerebrospinalem (CSF) seriatim collegimus, utens modello magnae copiae consciae rattorum cannulato. Cloni phagi specifici valde in CSF locupletati sunt post quattuor vices selectionis. Probationes peptidum candidatorum singularum plus quam millepliciter locupletatum in CSF ostenderunt. Bioactivitas traditionis ad cerebrum per peptida mediata confirmata est reductione 40% in gradu amyloidi-β in liquore cerebrospinali utens inhibitore peptidi BACE1 coniuncto cum novo peptido transitus identificato. Haec eventa suggerunt peptida per methodos selectionis phagi in vivo identificata vehicula utilia esse posse ad traditionem systemicam macromolecularum ad cerebrum cum effectu therapeutico.
Investigatio therapiae systematis nervosi centralis (SNC) directae plerumque in medicamentis et agentibus optimis inveniendis intenta est, quae proprietates SNC-referentes exhibent, minore labore in mechanismis inveniendis qui activam medicamentorum traditionem ad cerebrum impellunt. Hoc nunc mutari incipit, cum traditio medicamentorum, praesertim molecularum magnarum, pars integralis modernae evolutionis medicamentorum neuroscientiae sit. Ambitus systematis nervosi centralis bene protegitur a systemate claustri cerebrovascularis, quod constat ex claustro haematoencephali (BHE) et claustro haematoencephali (BCBB)1, quod medicamenta ad cerebrum tradi difficile reddit1,2. Aestimatur fere omnia medicamenta moleculae magnae et plus quam 98% medicamentorum moleculae parvae e cerebro eliminari3. Quam ob rem magni momenti est nova systemata translationis cerebri identificare quae efficientem et specificam traditionem medicamentorum therapeuticorum ad SNC praebent4,5. Attamen, BHE et BCSFB etiam occasionem optimam ad medicamenta tradi offerunt, cum omnes structuras cerebri per vascula eius ampla penetrant et ingrediuntur. Itaque conatus hodierni ad methodos non invasivas traditionis ad cerebrum adhibendas plerumque in mechanismo translationis receptore-mediatae (PMT) utens receptore endogeno BBB6 nituntur. Quamquam recentiores progressus magni momenti via receptoris transferrini utentes7,8 facti sunt, ulterius progressus novorum systematum traditionis cum proprietatibus melioribus requiritur. Ad hunc finem, propositum nostrum erat peptida capaces translationem CSF mediandi identificare, cum in principio adhiberi possent ad macromoleculas ad systema nervosum centrale tradendas vel ad novas vias receptorum aperiendas. Praesertim receptores et transportatores specifici systematis cerebrovascularis (BBB et BSCFB) ut scopi potentiales pro traditione activa et specifica medicamentorum biotherapeuticorum servire possunt. Liquor cerebrospinalis (CSF) est productum secretorium plexus choroideae (CS) et in contactu directo est cum liquido interstitiali cerebri per spatium subarachnoideum et spatium ventriculare4. Nuper demonstratum est liquorem subarachnoideum cerebrospinalem excessive in interstitium cerebri9 diffundere. Speramus spatium parenchymateum per hunc tractum influxus subarachnoideum vel directe per BBB accedere. Ad hoc assequendum, validam rationem selectionis phagorum in vivo adhibuimus quae idealiter peptida per alteram harum duarum viarum distinctarum transportata identificat.
Nunc describimus methodum sequentialem in vivo phage display cum CSF sampling una cum sequentiatione altae capacitatis (HTS) ad monitorandas primas selectiones cum maxima diversitate bibliothecae peractae sunt. Examen peractum est in muribus consciis cum cannula cisternae magnae (CM) permanenter implantata ad vitandam contaminationem sanguinis. Magni momenti est quod haec methodus et cerebrum petentes et peptida cum activitate translationis trans claustra cerebrovascularia eligit. Phagos T7 propter parvam magnitudinem (~60 nm)10 adhibuimus et proposuimus eos aptos esse ad translationem vesicularum quae transitum transcellulare claustra endothelialis et/vel epithelialis-medullaris permittunt. Post quattuor momenta selectionis, populationes phagorum isolatae sunt, ostendentes fortem locupletationem in vivo CSF ​​et associationem microvasorum cerebralium. Magni momenti est quod inventiones nostras confirmare potuimus demonstrando peptida candidata optima praelata et chemice synthesizata posse onus proteini in liquorem cerebrospinalem transportare. Primo, effectus pharmacodynamici CNS constituti sunt combinando peptidum transitus principalis cum inhibitore peptidi BACE1. Praeter demonstrationem methodorum selectionis functionalis in vivo nova peptida translationis cerebri ut efficaces vectores oneris proteinici identificare posse, exspectamus similes methodos selectionis functionalis etiam magni momenti fieri in novis viis translationis cerebri identificandis.
Post gradum compactionis phagi, innixa unitatibus formantibus plaquas (PFU), bibliotheca peptidorum phagi T7 linearium 12-merorum fortuitorum cum diversitate circiter 109 designata et creata est (vide Materias et Methodos). Interest notare nos hanc bibliothecam diligenter analyzasse ante selectionem in vivo. Amplificatio PCR exemplorum bibliothecae phagi utens primeris modificatis amplicona generavit quae directe ad HTS applicabiles erant (Figura Suppletoria 1a). Ob a) errores sequentiationis HTS11, b) impulsum in qualitatem primerorum (NNK)1-12, et c) praesentiam phagi typi naturalis (wt) (inserta sceleton) in bibliotheca subsidiaria, ratio filtrationis sequentiae implementata est ad extrahendam tantum informationem sequentiae verificatam (Figura Suppletoria 1b). Hi gradus filtrationis ad omnes bibliothecas sequentiationis HTS pertinent. Pro bibliotheca normali, summa 233,868 lectionum obtenta est, quarum 39% criteria filtrationis transierunt et ad analysin bibliothecae et selectionem pro circuitibus subsequentibus adhibitae sunt (Figura Suppletoria 1c-e). Lectiones plerumque multiplices trium parium basium longitudinis erant, cum apice ad 36 nucleotida (Figura Suppletoria 1c), designum bibliothecae (NNK) 1-12 confirmantes. Notandum est circiter 11% membrorum bibliothecae insertum PAGISRELVDKL 12-dimensionalem generis naturalis (wt) continere, et fere dimidium sequentiarum (49%) insertiones vel deletiones continere. HTS bibliothecae magnam diversitatem peptidum in bibliotheca confirmavit: plus quam 81% sequentiarum peptidarum semel tantum inventae sunt et tantum 1.5% in ≥4 exemplaribus occurrerunt (Figura Suppletoria 2a). Frequentiae aminoacidorum (aa) in omnibus 12 positionibus in repertorio bene correlaverunt cum frequentiis exspectatis pro numero codonum generatorum a repertorio NKK degenerato (Figura Suppletoria 2b). Frequentia observata residuorum aa ab his insertis codificatorum bene correlavit cum frequentia calculata (r = 0.893) (Figura Suppletoria 2c). Praeparatio bibliothecarum phagocytorum ad injectionem gradus amplificationis et remotionis endotoxini comprehendit. Hoc antea demonstratum est potentia diversitatem bibliothecarum phagocytorum reducere12,13. Quapropter, bibliothecam phagocytorum in lamina amplificatam, quae remotionem endotoxini subierat, sequentiavimus et cum bibliotheca originali comparavimus ad frequentiam AA aestimandam. Correlatio fortis (r = 0.995) inter gregem originalem et gregem amplificatum et purificatum observata est (Figura Suppletoria 2d), indicans competitionem inter clonos in laminis amplificatos utens phago T7 non causasse praeiudicium magnum. Haec comparatio innititur frequentiae motivorum tripeptidi in unaquaque bibliotheca, cum diversitas bibliothecarum (~109) non plene capi possit etiam cum HTS. Analysis frequentiae aa in unaquaque positione ostendit praeiudicium parvum positionis dependentem in tribus ultimis positionibus repertorii ingressi (Figura Suppletoria 2e). In conclusione, conclusimus qualitatem et diversitatem bibliothecae acceptabiles esse et tantum mutationes minores in diversitate observatas esse propter amplificationem et praeparationem bibliothecarum phagocytorum inter plures vices selectionis.
Extractio serialis liquoris cerebrospinalis fieri potest per implantationem chirurgicam cannulae in matricem centralem (CM) murium conscientum ad faciliorem identificationem bacteriophagi T7 intravenose (iv) per BBB et/vel BCSFB iniecti (Fig. 1a-b). Duo brachia selectionis independentia (brachia A et B) in primis tribus vicibus selectionis in vivo adhibuimus (Fig. 1c). Paulatim stringentiam selectionis auximus minuendo quantitatem totalem bacteriophagi in primis tribus vicibus selectionis introductam. Pro quarto vicibus selectionis, exempla ex ramis A et B coniunximus et tres selectiones independentes additionales perfecimus. Ad proprietates in vivo particularum bacteriophagi T7 in hoc exemplo studendas, bacteriophagus typi naturalis (insertum principale PAGISRELVDKL) in mures per venam caudalem iniectus est. Recuperatio bacteriophagorum e liquore cerebrospinali et sanguine diversis temporibus demonstravit bacteriophagos icosahedricos T7 relative parvos celerem phasim eliminationis initialem e compartimento sanguinis habere (Fig. Supplementaria 3). Innixi titris administratis et volumine sanguinis murium, computavimus tantum circiter 1% ponderis bacteriophagi ex dosi administrata in sanguine detectum esse decem minutis post injectionem intravenosam. Post hoc initiale rapidum decrementum, tardior purgatio primaria mensurata est cum semivita 27.7 minutorum. Magni momenti est quod tantum paucissimi bacteriophagi e compartimento LCR recuperati sunt, quod indicat humilem fluxum migrationis bacteriophagi typi naturalis in compartimentum LCR (Figura Supplementaria 3). Mediocriter, tantum circiter 1 x 10⁻³% titrorum bacteriophagi T7 in sanguine et 4 x 10⁻VIII% bacteriophagi initialiter infusorum in liquido cerebrospinali per totum tempus collectionis (0-250 min) detecti sunt. Notandum est semivita (25.7 min) bacteriophagi typi naturalis in liquido cerebrospinali similem fuisse ei quod in sanguine observatum est. Haec data demonstrant impedimentum quod compartimentum LCR a sanguine separat integrum esse in muribus CM-cannulatis, quod selectionem in vivo bibliothecarum phagorum permittit ad identificandos clonos qui facile e sanguine in compartimentum LCR transportantur.
(a) Methodus constituta ad resampla liquoris cerebrospinalis (CSF) ex magna copia colligenda. (b) Diagramma ostendens situm cellularem claustri systematis nervosi centralis (SNC) et rationem selectionis adhibitam ad identificanda peptida quae claustrum haematoencephalicum (BHE) et claustrum haematoencephalicum transeunt. (c) Diagramma fluxus selectionis phagi in vivo. In unoquoque circuitu selectionis, phagi (identificatores animalium intra sagittas) intravenose iniecti sunt. Duo rami alternativi independentes (A, B) separatim servantur usque ad quartum circuitum selectionis. Pro circuitibus selectionis 3 et 4, quisque clonus phagi ex CSF extractus manu sequentiatus est. (d) Kinetica phagi ex sanguine (circuli rubri) et liquore cerebrospinali (triangula viridia) isolati per primum circuitum selectionis in duobus muribus cannulatis post injectionem intravenosam bibliothecae peptidorum T7 (2 x 1012 phagi/animal). Quadrata caerulea indicant mediam concentrationem initialem phagi in sanguine, calculatam ex quantitate phagi iniectae, habito in ratione voluminis sanguinis totalis. Quadrata nigra indicant punctum intersectionis lineae y extrapolatae ex concentrationibus phagi sanguinis. (e,f) Praesentatur frequentia relativa et distributio omnium possibilium motivorum tripeptidicorum imbricatorum in peptido inventorum. Numerus motivorum inventorum in 1000 lectionibus ostenditur. Motiva significanter (p < 0.001) locupletata punctis rubris notantur. (e) Diagramma dispersionis correlationis comparans frequentiam relativam motivi tripeptidi bibliothecae iniectae cum phago derivato ex sanguine ex animalibus #1.1 et #1.2. (f) Diagramma dispersionis correlationis comparans frequentias relativas motivorum tripeptidi phagi animalium #1.1 et #1.2 isolatorum in sanguine et liquido cerebrospinali. (g, h) Repraesentatio ID sequentiae phagi locupletati in sanguine (g) contra bibliothecas iniectas et phagi locupletati in CSF (h) contra sanguinem post circuitum selectionis in vivo in utroque animal. Magnitudo codicis unius litterae indicat quam saepe aminoacidum illud in illa positione occurrat. Viridis = polaris, purpureus = neutrus, caeruleus = basicus, ruber = acidicus et niger = aminoacida hydrophobica. Figura 1a, b ab Eduardo Urich designata et producta est.
Bibliothecam peptidorum phagorum in duos mures instrumenti CM (clades A et B) iniecimus et phagum e liquido cerebrospinali et sanguine isolavimus (Figura 1d). Initialis celeris purgatio bibliothecae minus manifesta erat comparata cum phago typi naturalis. Medium tempus dimidiationis bibliothecae iniectae in utroque animali 24.8 minuta in sanguine erat, simile phago typi naturalis, et 38.5 minuta in liquido cerebrospinali (CSF). Exempla phagorum sanguinis et liquidi cerebrospinali ex utroque animali HTS subiecta sunt et omnia peptida identificata ad praesentiam brevis motivi tripeptidici analysata sunt. Motiva tripeptidica electa sunt quia basin minimam pro formatione structurae et interactionibus peptidico-proteinico praebent14,15. Bona correlatio in distributione motivorum inter bibliothecam phagorum iniectam et clonos e sanguine amborum animalium extractos invenimus (Figura 1e). Data indicant compositionem bibliothecae tantum marginaliter locupletatam esse in compartimento sanguinis. Frequentiae aminoacidorum et sequentiae consensuales ulterius in utroque loco analysatae sunt utens adaptatione programmatis Weblogo16. Curiose, magnam locupletationem in residuis glycini sanguinis invenimus (Fig. 1g). Cum sanguis cum clonibus e liquido cerebrospinali (CSF) selectis comparatus est, fortis selectio et quaedam deselectatio motivorum observata est (Fig. 1f), et quaedam aminoacida praeferenter in locis praefinitis in duodecim membris (Fig. 1h) praesentes erant. Notandum est singula animalia in liquido cerebrospinali significanter differre, dum locupletatio glycini sanguinis in utroque animali observata est (Fig. Supplementaria 4a-j). Post strictam filtrationem datorum sequentiae in liquido cerebrospinali animalium #1.1 et #1.2, summa 964 et 420 peptida 12-merorum singularia obtenta sunt (Fig. Supplementaria 1d-e). Cloni phagi isolati amplificati et secundo circuitu selectionis in vivo subiecti sunt. Phagi ex secundo circuitu selectionis extracti HTS in unoquoque animali subiecti sunt et omnia peptida identificata ut input ad programma recognitionis motivorum ad analysandam praesentiam motivorum tripeptidorum adhibita sunt (Fig. 2a, b, ef). Comparatione facta cum primo cyclo phagi e liquido cerebrospinali (CSF) recuperati, ulteriorem selectionem et deselectionem multorum motivorum in CSF in ramis A et B observavimus (Fig. 2). Algorithmus identificationis retium adhibitus est ad determinandum utrum diversa exempla sequentiae constantis repraesentarent. Similitudo clara observata est inter sequentias 12-dimensionales a CSF recuperatas in clade alternativa A (Fig. 2c, d) et clade B (Fig. 2g, h). Analysis aggregata in unoquoque ramo diversa perfiles selectionis pro peptidis 12-meris revelavit (Fig. Supplementaria 5c, d) et augmentum in ratione tituli CSF/sanguinis per tempus pro clonibus aggregatis post secundum circuitum selectionis comparatum cum primo circuitu selectionis (Fig. Supplementaria 5e).
Augmentatio motivorum et peptidum in liquido cerebrospinali per duas continuas vices selectionis phagi functionalis in vivo.
Omnes bacteriophagi ex liquido cerebrospinali recuperati ex primo circuitu cuiusque animalis (animalia #1.1 et #1.2) in unum congregati, amplificati, per HT sequentiati et iterum iniecti sunt (2 x 1010 bacteriophagi/animal) in duobus muribus SM cannulatis (#1.1 → #). 2.1 et 2.2, 1.2 → 2.3 et 2.4). (a,b,e,f) Diagrammata dispersionis correlationis frequentiam relativam motivorum tripeptidicorum omnium bacteriophagorum ex CSF derivatorum in primo et secundo circuitu selectionis comparantia. Frequentia relativa et distributio motivorum omnia tripeptida possibilia imbricata in peptidis in ambabus orientationibus inventa repraesentantium. Numerus motivorum in 1000 lectionibus inventorum ostenditur. Motiva quae significanter (p < 0.001) selecta vel exclusa sunt in una bibliothecarum comparatarum punctis rubris illustrantur. (c, d, g, h) Repraesentatio logo sequentiae omnium serierum 12 aminoacidarum longarum, quae in CSF divites sunt, secundum circuitus 2 et 1 selectionis in vivo. Magnitudo codicis unius litterae indicat quam saepe aminoacidum illud in illa positione occurrat. Ad logo repraesentandum, frequentia serierum CSF ex singulis animalibus inter duos circuitus selectionis extractarum comparatur et sequentiae locupletatae in secundo circuitu monstrantur: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 et (h) #1.2–#2.4. Aminoacida maxime locupletata in data positione in (c, d) animalibus numeris 2.1 et 2.2 vel (g, h) in animalibus numeris 2.3 et 2.4 colore monstrantur. Viridis = polaris, purpureus = neutrus, caeruleus = basicus, ruber = acidicus et niger = aminoacida hydrophobica.
Post tertium selectionis circuitum, 124 sequentias peptidicas singulares (#3.1 et #3.2) ex 332 clonis phagorum ex CSF reconstitutis, ex duobus animalibus isolatis, identificavimus (Figura Supplementaria 6a). Sequentia LGSVS (18.7%) maximam proportionem relativam habuit, deinde inserta typi naturalis PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), et SARGSWREIVSLS (2.2%). In quarto circuitu finali, duos ramos independenter selectos ex tribus animalibus separatis coniunximus (Figura 1c). Ex 925 clonis phagorum ex CSF recuperatis, in quarto circuitu 64 sequentias peptidicas singulares invenimus (Figura Supplementaria 6b), inter quas proportio relativa phagi typi naturalis ad 0.8% descendit. Frequentissimae clonae CSF in quarto circuitu fuerunt LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) et RLSSVDSDLSGC (3.2%). Varietas longitudinis peptidorum selectorum debetur insertionibus/deletionibus nucleotidorum vel codones terminationis praematuris in initiis bibliothecae cum codones degenerati ad designationem bibliothecae NNK adhibentur. Codones terminationis praematuri peptida breviora generant et selecti sunt quia motivum aa favorabile continent. Peptida longiora ex insertionibus/deletionibus in initiis bibliothecarum syntheticarum resultare possunt. Hoc codon terminationis designatum extra limitem locat et legit donec novus codon terminationis deorsum appareat. In genere, factores locupletationis pro omnibus quattuor circuitibus selectionis calculavimus comparando data inputata cum datis exempli productis. Pro primo circuitu examinationis, titulos phagorum typi naturalis ut referentiam non specificam adhibuimus. Curiose, selectio phagorum negativa valde valida erat in primo cyclo CSF, sed non in sanguine (Fig. 3a), quod fortasse ob probabilitatem parvam diffusionis passivae plurimorum membrorum bibliothecae peptidorum in compartimentum CSF fieri potest, vel phagi relativi efficacius retineri vel e sanguine removeri solent quam bacteriophagi. Attamen, in secundo circuitu selectionis, valida selectio phagorum in CSF in utroque clado observata est, suggerens circuitum priorem locupletatum fuisse phagis ostendentibus peptida quae absorptionem CSF promovent (Fig. 3a). Iterum, sine locupletatione sanguinis significativa. Etiam in tertio et quarto circuitibus, cloni phagorum significanter locupletati sunt in CSF. Comparantes frequentiam relativam cuiusque sequentiae peptidicae singularis inter duos ultimos circuitus selectionis, invenimus sequentias etiam magis locupletatas esse in quarto circuitu selectionis (Fig. 3b). In summa 931 motivi tripeptidici extracti sunt ex omnibus 64 sequentiis peptidicis singularibus utens utraque orientatione peptidica. Motiva maxime locupletata in quarto circuitu diligentius examinata sunt de profilibus locupletationis per omnes circuitus comparata cum bibliotheca iniecta (limes: 10% locupletationis) (Figura Suppletoria 6c). Exempla generalia selectionis demonstraverunt pleraque motiva investigata locupletata esse in omnibus circuitibus praecedentibus utriusque rami selectionis. Nihilominus, quaedam motiva (e.g. SGL, VSG, LGS GSV) praesertim ex clade alternativa A erant, dum alia (e.g. FGW, RTN, WGF, NTR) locupletata sunt in clade alternativa B.
Validatio translationis CSF peptidum phago-exhibitorum CSF-locupletatorum et peptidum ductorum biotinylatorum cum oneribus streptavidini coniugatorum.
(a) Rationes locupletationis in omnibus quattuor circuitibus (R1-R4) computatae, secundum titros phagorum (PFU) iniectos (input = I) et titros phagorum CSF determinatos (output = O). Factores locupletationis pro tribus circuitibus ultimis (R2-R4) computati sunt per comparationem cum circuitu praecedente et primo circuitu (R1) cum datis ponderis. Virgae apertae liquorem cerebrospinalem significant, virgae umbrosae plasmam significant. (***p<0.001, secundum test-t Studentis). (b) Index peptidum phagorum abundantissimorum, ordinatus secundum proportionem relativam ad omnia phaga in CSF collecta post circuitum 4 selectionis. Sex cloni phagorum frequentissimi colore, numeratione et factoribus locupletationis inter circuitus 3 et 4 selectionis insigniti sunt (insertiones). (c,d) Sex cloni phagorum locupletissimi, bibliothecae peptidorum phagorum vacuae et parentales ex circuitu 4 singillatim in exemplo sampling CSF analysati sunt. Exempla liquoris cerebrospinalis (LCS) et sanguinis temporibus indicatis collecta sunt. (c) Aequales quantitates sex clonorum phagocytorum candidatorum (2 x 1010 phagocytorum/animalium), phagocytorum vacuorum (#1779) (2 x 1010 phagocytorum/animalium) et bibliothecarum peptidorum phagocytorum stock (2 x 1012 phagocytorum/animalium). Iniecta saltem 3 CM animali cannulato separatim per venam caudalem administrantur. Pharmacokinetica LCS cuiusque cloni phagi et bibliothecae peptidorum phagocytorum iniecti per tempus ostenditur. (d) Rationem LCS/sanguinem mediam pro omnibus phagis/mL recuperatis per tempus collectionis ostendit. (e) Quattuor peptida synthetica ductoria et unum exemplar moderatum cum biotino ad streptavidinum per terminum N-terminalem (tetramer display) coniuncta sunt, deinde iniectio (vena caudalis iv, 10 mg streptavidini/kg). Saltem tres mures intubati (N = 3). Exempla CSF temporibus indicatis collecta sunt et concentrationes streptavidini per ELISA CSF anti-streptavidini mensuratae sunt (nd = non detectum). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, secundum probationem ANOVA). (f) Comparatio sequentiae aminoacidorum cloni peptidi phagici locupletissimi #2002 (purpurei) cum aliis clonibus peptidi phagici selectis ex quarto circuitu selectionis. Fragmenta aminoacidorum identica et similia coloribus distincta sunt.
Ex omnibus phagis locupletatis in quarto circuitu (Fig. 3b), sex cloni candidati ad ulteriorem analysin singularem in exemplo sampling CSF selecti sunt. Aequales quantitates bibliothecarum sex phagorum candidatorum, phagorum vacuorum (sine inserto) et peptidorum prophagorum in tria animalia CM cannulata iniectae sunt, et pharmacocinetica in experimentis CSF (Fig. 3c) et sanguinis (Fig. Supplementaria 7) determinata est. Omnes cloni phagorum probati compartimentum CSF ad gradum 10-1000 vicibus altiore quam phagi controlis vacui (#1779) petierunt. Exempli gratia, cloni #2020 et #2077 titros CSF circiter 1000 vicibus altiores quam phagi controlis habuerunt. Profilum pharmacocineticum cuiusque peptidi selecti differt, sed omnes magnam facultatem CSF homing habent. Decrementum constantem per tempus pro clonibus #1903 et #2011 observavimus, dum pro clonibus #2077, #2002 et #2009 incrementum per primos decem minutas translationem activam indicare potest, sed verificandum est. Cloni #2020, #2002, et #2077 ad altos gradus stabilizati sunt, dum concentratio CSF ​​cloni #2009 post incrementum initiale lente decrevit. Deinde frequentiam relativam cuiusque candidati CSF cum concentratione sanguinis comparavimus (Fig. 3d). Correlatio tituli medii cuiusque candidati CSF cum titulo sanguinis omnibus temporibus sampling ostendit tres ex sex candidatis significanter locupletatos esse in CSF sanguinis. Interesse est quod clonus #2077 maiorem stabilitatem sanguinis demonstravit (Figura Suppletoria 7). Ut confirmaremus ipsa peptida posse active transportare merces praeter particulas phagi in compartimentum CSF, quattuor peptida ductoria derivatizata cum biotino ad N-terminum, ubi peptida particulae phagi adhaerent, synthetizavimus. Peptida biotinylata (numeris 2002, 2009, 2020 et 2077) cum streptavidino (SA) coniugata sunt ut formae multimericae geometriam phagi quodammodo imitantes obtinerentur. Hoc formatum etiam nobis permisit ut expositionem SA in sanguine et liquido cerebrospinali tamquam peptida proteica onus transportantia metiremur. Magni momenti est quod data phagica saepe reproduci poterant cum peptida synthetica hoc formato SA-coniugato administrata sunt (Fig. 3e). Peptida confusa minorem expositionem initialem et celeriorem purgationem in liquido cerebrospinali (CSF) cum gradibus intra 48 horas non detectabilibus habuerunt. Ut perspicientiam in vias traditionis horum clonorum peptidi phagi in spatium CSF adipisceremur, localizationem singularum peptidorum phagi per immunohistochemiam (IHC) analyzavimus ut particulas phagicas directe una hora post injectionem intravenosam in vivo detegeremus. Notandum est clones #2002, #2077, et #2009 per tinctionem fortem in capillaribus cerebri detegi potuisse, dum phagus moderator (#1779) et clonus #2020 non detecti sunt (Figura Suppletoria 8). Hoc suggerit haec peptida ad effectum in cerebrum conferre praecise per transitum per BBB. Ulterior analysis accurata requiritur ad hanc hypothesin probandam, cum via BSCFB etiam implicata esse possit. Cum sequentia aminoacidorum cloni maxime locupletati (#2002) cum aliis peptidis selectis comparatur, notatum est nonnulla eorum similes extensiones aminoacidorum habere, quod similem mechanismum translationis indicare potest (Figura 3f).
Ob singularem plasmatis formam et significantem augmentum in liquido cerebrospinali (CSF) per tempus, clonus phage display #2077 per longius spatium 48 horarum ulterius exploratus est et potuit reproducere rapidum augmentum in CSF observatum in coniunctione cum gradibus SA sustentis (Fig. 4a). De aliis clonis phagi identificatis, #2077 fortiter tinctus est pro capillaribus cerebri et significantem colocalizationem cum lectino indicatore capillari ostendit cum inspectus est resolutione altiore et fortasse aliquam tinctionem in spatio parenchymati (Figura 4b). Ad investigandum num effectus pharmacologici peptido-mediati in systemate nervoso centrali obtineri possent, experimentum perfecimus in quo versiones biotinylatae i) peptidi transitus #2077 et ii) peptidi inhibitoris BACE1 cum SA duabus rationibus diversis mixtae sunt. Pro una combinatione solum inhibitorem peptidi BACE1 usi sumus et pro altera rationem 1:3 inhibitoris peptidi BACE1 ad peptidum #2077 usi sumus. Ambae exempla per venam administrata sunt, et gradus beta-amyloidi peptidi 40 (Abeta40) in sanguine et liquido cerebrospinali per tempus mensurati sunt. Abeta40 in liquido cerebrospinali mensuratus est, quia inhibitionem BACE1 in parenchyma cerebri reflectit. Ut expectatum est, ambo complexus gradus Abeta40 in sanguine significanter minuerunt (Fig. 4c, d). Attamen, sola exempla mixturam peptidi numeri 2077 et inhibitoris peptidi BACE1 cum SA coniugati continentes significantem decrementum Abeta40 in liquido cerebrospinali effecerunt (Fig. 4c). Data ostendunt peptidum numeri 2077 posse proteinum SA 60 kDa in systema nervosum centrale transportare et etiam effectus pharmacologicos cum inhibitoribus SA-coniugatis peptidi BACE1 inducere.
(a) Iniectio clonalis (2 × 10⁶ phagi/animal) phagi T7 ostendens perfiles pharmacocineticos longi temporis peptidi CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) et phagi moderatoris non iniecti (#1779) in saltem tribus muribus CM-intubatis. (b) Imago microscopica confocalis microvasorum corticalium repraesentativorum in muribus phago iniectis (2 × 10⁶ phagi/animal) ostendens contratinctionem peptidi #2077 et vasorum (lectini). Hi cloni phagi tribus muribus administrati sunt et per horam unam ante perfusionem circulare permissi sunt. Cerebra sectionata et tincta sunt anticorporibus polyclonalibus FITC-signatis contra capsidam phagi T7. Decem minutis ante perfusionem et subsequentem fixationem, lectinum DyLight594-signatum per venam administratum est. Imagines fluorescentes tinctionem lectini (rubram) partis luminalis microvasorum et phagorum (viridem) in lumine capillarium et textus cerebri perivascularis ostendentes. Scala 10 µm respondet. (c, d) Peptidum inhibitorium BACE1 biotinylatum, solum vel in combinatione cum peptido transitorio biotinylato #2077, cum streptavidino copulatum est, deinde iniectio intravenosa saltem trium murum CM cannulatorum (10 mg streptavidini/kg) facta est. Reductio in Aβ40, ab inhibitore peptidi BACE1 mediata, per ELISA Aβ1-40 in sanguine (rubro) et liquido cerebrospinali (aurantiaco) temporibus indicatis mensurata est. Pro clariorem claritatem, linea punctata in graphio scala 100% ducta est. (c) Percentatio reductionis Aβ40 in sanguine (triangula rubra) et liquido cerebrospinali (triangula aurantiaca) in muribus streptavidino coniuncto cum peptido transitionis #2077 et peptido inhibitorio BACE1 in proportione 3:1 tractatis. (d) Percentatio reductionis Aβ40 in sanguine (circuli rubri) et liquido cerebrospinali (circuli aurantiaci) muribus streptavidino cum peptido inhibitorio BACE1 tantum copulato tractatis. Concentratio Aβ in exemplo erat 420 pg/ml (deviatio standard = 101 pg/ml).
Methodus phage display in multis investigationis biomedicae campis feliciter adhibita est17. Haec methodus ad studia diversitatis vascularis *in vivo*18,19 necnon ad studia vasa cerebralia spectantia20,21,22,23,24,25,26 adhibita est. In hoc studio, applicationem huius methodi selectionis non solum ad identificationem directam peptidum vasa cerebralia spectantium extendimus, sed etiam ad inventionem candidatorum cum proprietatibus translationis activae ad transeundum claustra haematoencephali. Nunc describimus evolutionem processus selectionis *in vivo* in muribus CM intubatis et potentiam eius ad identificanda peptida cum proprietatibus reditus in liquido cerebrospinali (CSF) demonstramus. Usi phago T7 ostendente bibliothecam peptidum fortuitorum 12-merorum, demonstrare potuimus phagum T7 satis parvum esse (circiter 60 nm in diametro)10 ut claustra haematoencephali adaptetur, ita directe claustra haematoencephali vel plexus choroideae transeundo. Observavimus collectionem LCR e muribus CM cannulatis methodum examinationis functionalis in vivo bene moderatam esse, et phagum extractum non solum vasis adhaerere, sed etiam ut transportatorem trans claustra haematoencephali fungi. Praeterea, simul sanguinem colligendo et HTS LCR et phagis sanguine derivatis applicando, confirmavimus electionem nostram LCR non a locupletatione sanguinis aut aptitudine ad expansionem inter vices selectionis affectam esse. Attamen, compartimentum sanguinis pars processus selectionis est, cum phagi compartimentum LCR attingendi capaces satis diu in sanguine supervivere et circulare debent ut se in cerebro locupletent. Ut informationes sequentiae certas ex datis HTS crudis extraheremus, filtra ad errores sequentiationis specificos suggestuum in fluxu analysis accommodata inseruimus. Parametros cineticos in methodum examinationis incorporando, pharmacocineticam rapidam phagocytorum T7 typi naturalis (t½ ~ 28 min) in sanguine confirmavimus [24, 27, 28] et etiam vitam dimidiatam eorum in liquido cerebrospinali (t½ ~ 26 min) per minutum determinavimus. Quamquam similes sunt pharmacocineticae formae in sanguine et liquido cerebrospinali (CSF), tantum 0.001% concentrationis bacteriophagi in sanguine in CSF detegi potuit, quod mobilitatem parvam bacteriophagi T7 typi naturalis trans claustra haematoencephali indicat. Hoc opus momentum primi circuitus selectionis illustrat cum in vivo strategiis selectionis adhibentur, praesertim pro systematibus bacteriophagi quae celeriter e circulatione purgantur, cum pauci cloni ad compartimentum systematis nervosi centralis (CNS) pervenire possint. Itaque, in primo circuitu, reductio diversitatis bibliothecae magna erat, cum tantum numerus limitatus clonorum tandem in hoc strictissimo modello CSF ​​collecti sint. Haec strategia selectionis in vivo plures gradus selectionis comprehendit, ut accumulationem activam in compartimento CSF, superviventiam clonorum in compartimento sanguinis, et rapidam remotionem clonorum bacteriophagi T7 e sanguine intra primos 10 minutas (Fig. 1d et Fig. Supplementaria 4M). Itaque, post primum circuitum, diversi cloni bacteriophagi in CSF identificati sunt, quamquam eadem prima copia pro singulis animalibus adhibita est. Hoc suggerit multiplices gradus selectionis strictae pro bibliothecis fontibus cum magno numero membrorum bibliothecae significantem diversitatis reductionem efficere. Ergo, eventus fortuiti partem integralem processus selectionis initialis fient, exitum magnopere influentes. Probabile est multos clones in bibliotheca originali simillimam propensionem ad locupletationem CSF habuisse. Attamen, etiam sub eisdem condicionibus experimentalibus, exitus selectionis differre possunt propter parvum numerum cuiusque clonis in grege initiali.
Formae in liquido cerebrospinali (CSF) locupletatae ab illis in sanguine differunt. Curiose, primam mutationem ad peptida glycino dives in sanguine singulorum animalium notavimus. (Figura 1g, Figurae Suppletoriae 4e, 4f). Bacillum peptida glycino continentem stabiliorem esse potest et minus probabile est ut e circulatione removeatur. Attamen, haec peptida glycino dives in exemplaribus liquidi cerebrospinalis non detecta sunt, quod suggerit bibliothecas curatas per duos gradus selectionis diversos processisse: unum in sanguine et alterum in liquido cerebrospinali accumulari permissum. Cloni CSF locupletati, ex quarto circuitu selectionis resultantes, diligenter probati sunt. Fere omnes cloni singillatim probati confirmati sunt CSF locupletati esse comparati cum baculo inanis. Unus peptidus ictus (#2077) accuratius examinatus est. Longiorem semivitae plasmatis ostendit comparatus aliis ictubus (Figura 3d et Figura Suppletoria 7), et, quod interest, hoc peptidum residuum cysteini in extremo C-terminali continebat. Nuper demonstratum est additionem cysteini ad peptida proprietates pharmacokineticas eorum emendare posse per ligam cum albumina 29. Hoc adhuc ignotum est pro peptido #2077 et ulteriore studio eget. Quaedam peptida dependentiam valentiae in locupletatione CSF ostenderunt (data non exhibita), quae fortasse cum geometria superficiali capsidis T7 exhibita coniuncta est. Systema T7 quod usi sumus 5-15 copias cuiusque peptidi per particulam phagi ostendit. IHC in clonis phagi candidatis principalibus peracta est, qui intravenose in corticem cerebri murium iniecti sunt (Figura Supplementaria 8). Data ostenderunt saltem tres clonos (No. 2002, No. 2009 et No. 2077) cum BBB interagisse. Restat determinandum utrum haec interactio BBB accumulationem CSF an motum horum clonorum directe ad BCSFB efficiat. Magni momenti est quod demonstramus peptida selecta capacitatem translationis CSF retinere cum synthesizata et oneri proteinico ligata sunt. Ligatio peptidorum biotinylatorum N-terminalium cum SA essentialiter repetit eventus cum suis clonis phagicis respectivis in sanguine et liquido cerebrospinali obtentos (Fig. 3e). Denique demonstramus peptidum principale #2077 posse actionem cerebralem inhibitoris peptidi biotinylati BACE1 coniugati cum SA promovere, effectus pharmacodynamicos pronunciatos in systemate nervoso centrali causando per reductionem graduum Abeta40 in liquido cerebrospinali (CSF) significanter (Fig. 4). Nullos homologos in database identificare potuimus per investigationem homologiae sequentiae peptidicae omnium ictuum peractam. Interest notare magnitudinem bibliothecae T7 esse circiter 109, dum magnitudo bibliothecae theoretica pro 12-meris est 4 x 1015. Ideo, tantum parvam fractionem spatii diversitatis bibliothecae peptidicae 12-meris delegimus, quod significare potest peptida magis optimizata identificari posse per aestimationem spatii sequentiae adiacentis horum ictuum identificatorum. Hypothetice, una ex causis cur nullos homologos naturales horum peptidorum invenimus fortasse deselectio per evolutionem ad impediendum introitum effrenatum quorundam motivorum peptidicorum in cerebrum.
Haec omnia, quae in summa sumpta sunt, fundamentum praebent operi futuro ad systemata translationis claustri cerebrovascularis in vivo accuratius identificanda et describenda. Fundamentum huius methodi innititur consilio selectionis functionalis, quod non solum clonos cum proprietatibus ligationis vasorum cerebralium identificat, sed etiam gradum criticum includit, in quo cloni prosperi activitatem intrinsecam habent ad claustra biologica in vivo in compartimentum systematis nervosi centralis transeunda. Propositum est elucidare mechanismum translationis horum peptidorum et praeferentiam eorum ad ligationem cum microvasculis specificis regionis cerebri. Hoc ad inventionem novarum viarum translationis BBB et receptorum ducere potest. Exspectamus ut peptida identificata directe ad receptoria cerebrovascularia vel ad ligandas circulantes per BBB vel BCSFB transportatas ligare possint. Vectores peptidici cum activitate translationis CSF in hoc opere inventi ulterius investigabuntur. Nunc investigamus specificitatem cerebri horum peptidorum pro facultate eorum transeundi BBB et/vel BCSFB. Haec nova peptida instrumenta perutilia erunt ad potentialem inventionem novorum receptorum vel viarum et ad evolutionem novarum suggestuum valde efficacium ad tradendum macromoleculas, sicut biologica, ad cerebrum.
Cisternam magnam (CM) cannulare secundum modificationem methodi antea descriptae. Mures Wistar anesthetizati (200-350 g) in apparatu stereotaxico impositi sunt et incisio mediana super cutem capitis rasam et aseptice praeparatam facta est ad cranium exponendum. Duo foramina in area fasciae superioris terebra et cochleas fixatrices in foraminibus fige. Foramen additum in crista occipitali laterali terebratum est ad directionem stereotacticam cannulae chalybis inoxidabilis in CM. Cementum dentale circa cannulam applica et cochleis firma. Post photocurationem et indurationem cementi, vulnus cutis sutura supramid 4/0 clausum est. Collocatio recta cannulae confirmatur per spontaneam effusionem liquidi cerebrospinalis (CSF). Murem ex apparatu stereotaxico remove, curam postoperativam congruentem et moderationem doloris accipi, et eum saltem per unam hebdomadam convalescere sine donec signa sanguinis in liquido cerebrospinali observentur. Muri Wistar (Crl:WI/Han) ex regione Carolo Flumine (Gallia) empti sunt. Omnes mures sub condicionibus specificis a pathogenis liberis servati sunt. Omnia experimenta animalium ab Officio Veterinario Urbis Basileae, Helvetiae, probata sunt et secundum Licentiam Animalium Numero 2474 (Aestimatio Transportationis Cerebri Activae per Mensuram Graduum Candidatorum Therapeuticorum in Liquore Cerebrospinali et Cerebro Muris) peracta sunt.
Ratta leniter conscia maneat, cannula CM in manu habens. Daturam e cannula remove et decem µl liquidi cerebrospinalis sponte fluentis collige. Quoniam patentia cannulae tandem compromissa est, sola exempla liquidi cerebrospinalis clara, sine ullo signo contaminationis sanguinis aut discolorationis, in hoc studio inclusa sunt. Simul, circiter decem ad viginti μl sanguinis ex parva incisione ad apicem caudae in tubos cum heparino (Sigma-Aldrich) sumpta sunt. Liquor cerebrospinalis (LCS) et sanguis variis temporibus post iniectionem intravenosam bacteriobacterii T7 collecti sunt. Circiter quinque ad decem μl liquidi abiecti sunt antequam singula exempla LCS collecta sunt, quod volumini mortuo catheteris respondet.
Bibliothecae generatae sunt utens vectore T7Select 10-3b sicut descriptum est in manuali systematis T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Breviter, insertum DNA 12-mer fortuitum hoc modo synthesizatum est:
Codon NNK adhibitus est ad vitandas duplices codones terminationis et superexpressionem aminoacidorum in inserto. N est proportio aequimolaris manu mixta cuiusque nucleotidi, et K est proportio aequimolaris manu mixta nucleotidorum adenini et cytosini. Regiones simplex catenatae in DNA bicatenatum conversae sunt per incubationem ulteriorem cum dNTP (Novagen) et enzymo Klenow (New England Biolabs) in solutione tampone Klenow (New England Biolabs) per tres horas ad 37°C. Post reactionem, DNA bicatenatum recuperatum est per praecipitationem EtOH. DNA resultans digestum est cum enzymis restrictionis EcoRI et HindIII (ambobus a Roche). Insertum scissum et purificatum (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) deinde ligatum est intra quadrum in vectorem T7 prae-scissum post aminoacidum 348 geni capsidis 10B. Reactiones ligationis incubatae sunt ad 16°C per 18 horas ante involucrum in vitro. In vitro, phagorum compactio peracta est secundum instructiones cum apparatu clonationis T7Select 10-3b (Novagen) suppeditatas, et solutio compactionis semel ad lysis amplificata est utens Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lysata centrifugata, titrata et ad -80° C congelata sunt ut solutio glycerini.
Amplificatio per PCR directam regionum variabilium phagi amplificatarum in liquore vel patina utens primeriis fusionis proprietariis 454/Roche-amplicon. Primer fusionis anterioris continet sequentias regionem variabilem (NNK) 12 (specificas formae), Adaptorem Titanii GS FLX A, et sequentiam clavem bibliothecae quattuor basium (TCAG) (Figura Supplementaria 1a):
Primer fusionis reversae etiam biotinum continet globulis captatoriis adnexum et Adaptorem GS FLX Titanium B, qui ad amplificationem clonalem per PCR emulsionis requiritur:
Amplicona deinde pyrosequentiationi 454/Roche secundum protocollum 454 GS-FLX Titanium subiecta sunt. Ad sequentiationem manualem Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA phagi T7 per PCR amplificatum et cum sequentibus paribus primeriorum sequentiatum est:
Inserta ex singulis plaquis amplificationi PCR subiecta sunt utens Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (secundum instructiones fabricatoris). Initium calidum (10 min ad 95°C) et 35 cyclos boost (50 s ad 95°C, 1 min ad 50°C, et 1 min ad 72°C) perage.
Bacilli bacteriobacterii ex bibliothecis, bacteriobacterii generis naturalis, bacteriobacterii e liquido cerebrospinali (CSF) et sanguine recuperati, vel cloni singuli, amplificati sunt in *Escherichia coli* BL5615 in liquore tuberculoso (Sigma Aldrich) vel in patellis 500 cm2 (Thermo Scientific) per 4 horas ad 37°C. Bacilli bacteriobacterii ex laminis extracti sunt abluendo eas cum solutione Tris-EDTA (Fluka Analytical) vel colligendo maculas cum apicibus pipettarum sterilibus. Bacilli ex supernatante culturae vel solutione extractionis cum uno circuitu praecipitationis polyethylene glycolis (PEG 8000) (Promega) isolati et in solutione Tris-EDTA resuspensi sunt.
Bacillum bacteriobacterium amplificatum, ante injectionem intravenosam (IV) (500 μl/animal), bis vel ter endotoxini remoti per globulos ad endotoxini removendos utens (Miltenyi Biotec) subiectum est. In primo circuitu, bis vel ter 10¹² bacteriobacteria introducta sunt; in secundo, bis vel ter 10¹⁵ bacteriobacteria; in tertio et quarto circuitibus selectionis, bis vel ter 10¹⁶ bacteriobacteria per animal. Contentum bacteriobacteriorum in liquido cerebrospinali (LCS) et sanguinis, temporibus indicatis collectis, determinatum est per numerationem macularum secundum instructiones fabricatoris (manuale systematis T7Select). Selectio bacteriobacteriorum per injectionem intravenosam bibliothecarum purificatarum in venam caudalem vel per re-injectionem bacteriobacteriorum e LCS ex circuitu selectionis priori extractorum peracta est, et collectiones subsequentes post 10, 30, 60, 90, 120, 180, et 240 minuta respective, bacteriobacteriae CSF et sanguinis, peractae sunt. In summa, quattuor circuitibus selectionis *in vivo* peracti sunt, in quibus duo rami selecti separatim conservati et per tres primos circuitus selectionis analysati sunt. Omnes inserta bacteriophagi ex liquido cerebrospinali (CSF) ex primis duobus circuitibus selectionis extracta pyrosequentiationi 454/Roche subiecta sunt, dum omnes cloni ex CSF ex ultimis duobus circuitibus selectionis extracti manu sequentiati sunt. Omnes bacteriophagi sanguinis ex primo circuitu selectionis etiam pyrosequentiationi 454/Roche subiecti sunt. Ad iniectionem clonorum bacteriophagi, bacteriophagi selecti in *E. coli* (BL5615) in laminis 500 cm2 ad 37°C per 4 horas amplificati sunt. Cloni singillatim selecti et manu sequentiati in medio TB propagati sunt. Post extractionem bacteriophagi, purificationem et remotionem endotoxini (ut supra descriptum est), 2×1010 bacteriophagi/animal in 300 μl per venam caudalem intravenose iniecti sunt.
Praeprocessus et filtratio qualitativa datorum sequentiae. Data cruda 454/Roche ex formato binario mappae fluxus normae (sff) in formam Pearson ab hominibus legibilem (fasta) conversa sunt, programmate venditoris utens. Processus ulterius sequentiae nucleotidicae peractus est programmatibus et scriptis C proprietariis (fasciculo programmatis non edito) ut infra describitur. Analysis datorum primariorum includit strictas proceduras filtrationis multi-stadiales. Ad lectiones quae non continebant validam sequentiam DNA insertae 12merorum excludendas, lectiones sequentiali ordine ordinatae sunt ad initium notae (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), finem notae (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) et insertionem secundariam (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utens probatione globali Needleman-Wunsch. Ordinatio permittens usque ad duas discrepantias per ordinationem31. Ergo, lectiones sine initiis et finibus notae et lectiones insertiones secundarias continentes, id est, ordinationes quae numerum permissum discrepantiarum excedunt, ex bibliotheca remotae sunt. Quod ad reliquas lectiones attinet, sequentia DNA N-mer ab initio extensa et ante signum finis desinens a sequentia lectionis originalis excisa et ulterius processa est (deinceps "insertio" appellata). Post translationem inserti, pars post primum codonum finis ad finem 5′ primerii ab inserto remota est. Praeterea, nucleotida ad codones incompletos ad finem 3′ primerii ducentia etiam remota sunt. Ad inserta excludenda solum sequentias secundarias continentia, inserta translata incipientia cum exemplo aminoacidorum "PAG" etiam remota sunt. Peptida cum longitudine post-translationis minus quam 3 aminoacida e bibliotheca remota sunt. Denique, redundantia in grege insertorum remota est et frequentia cuiusque inserti singularis determinata est. Resultata huius analysis indicem sequentiarum nucleotidorum (insertorum) et frequentiarum earum (lectionum) comprehendunt (Figurae Supplementariae 1c et 2).
Insertiones DNA N-merorum secundum similitudinem sequentiae congregantur: Ad errores sequentiae 454/Roche-specificos eliminandos (ut problemata cum extensionibus homopolymerorum sequentiae) et redundantias minus importantes removendas, insertiones sequentiae DNA N-merorum (insertiones) antea filtratae secundum similitudinem ordinantur. Insertiones (usque ad 2 bases non congruentes permissae) algorithmo iterativo utentes, ut sequitur definito: insertiones primum secundum frequentiam (a maxima ad minimam) ordinantur, et si eaedem sunt, secundum ordinationem secundariam secundum longitudinem (a longissima ad brevissimam). Ita insertiones frequentissimae et longissimae primum "gregem" definiunt. Frequentia gregis ad frequentiam clavem statuitur. Deinde, quaeque insertio in indice ordinato relicta gregi addi conata est per ordinationem Needleman-Wunsch binariam. Si numerus incongruentium, insertionum, vel deletionum in ordinatione limen 2 non excedit, insertio gregi additur, et frequentia gregis generalis augetur quoties insertio addita est. Insertiones gregi additae ut usae notantur et ab ulteriore processu excluduntur. Si sequentia insertionis non potest addi ad gregem iam existentem, sequentia insertionis adhibetur ad novum gregem cum frequentia insertionis appropriata creandum et ut usata notandum. Iteratio finitur cum quaeque sequentia insertionis vel ad novum gregem formandum adhibita est vel in grege iam existente includi potest. Postremo, insertiones congregatae ex nucleotidis constantes tandem in sequentias peptidicas (bibliothecae peptidicas) vertuntur. Ex hac analysi eventus est series insertionum et earum frequentiae correspondentes quae numerum lectionum continuarum constituunt (Figura Supplementaria 2).
Generatio Motivorum: Ex indice peptidorum singularium, bibliotheca creata est omnia possibilia exempla aminoacidorum (aa) continens, ut infra demonstratur. Quaeque possibilis forma longitudinis 3 ex peptido extracta est et eius inversa forma addita est una cum communi bibliotheca motivorum omnia exempla (tripeptida) continente. Bibliothecae motivorum valde repetitivorum sequentiatae sunt et redundantia remota. Deinde, pro quolibet tripeptido in bibliotheca motivorum, praesentiam eius in bibliotheca instrumentis computationalibus probavimus. Hoc in casu, frequentia peptidi tripeptidum motivum inventum continentis additur et motivo in bibliotheca motivorum assignatur ("numerus motivorum"). Resultatum generationis motivorum est series bidimensionalis continens omnes occurrentias tripeptidorum (motivorum) et valores eorum respectivos, qui sunt numerus lectionum sequentiarum quae motivum correspondens efficiunt cum lectiones filtrantur, congregantur et translatae sunt. Metrica ut supra fusius descripta sunt.
Normalizatio numeri motivorum et diagrammatum dispersionis correspondentium: Numerus motivorum pro quolibet exemplo normalizatus est utens
Ubi *ni* est numerus lectionum thema *i* continentium. Ita *vi* repraesentat frequentiam percentualem lectionum (vel peptidum) motivum *i* continentium in exemplo. Valores *P* pro numero motivorum non normalizato computati sunt utens probatione exacta Fisheri. De correlogrammatibus numeri motivorum, correlationes Spearman computatae sunt utens numero motivorum normalizato cum *R*.
Ad visualizandum contentum aminoacidorum in singulis positionibus bibliothecae peptidorum, logogrammata interretialia 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) creata sunt. Primo, contentum aminoacidorum in singulis positionibus peptidi 12-meri in matrice 20×12 reponitur. Deinde, series 1000 peptidorum, eadem relativa contenta aminoacidorum in singulis positionibus continentium, in formato fasta-sequence generatur et ut input ad web-logo 3 praebetur, quod repraesentationem graphicam relativae contentae aminoacidorum in singulis positionibus pro data bibliotheca peptidorum generat. Ad visualizandas collectiones datorum multidimensionales, mappae caloris creatae sunt utens instrumento interne evoluto in R (biosHeatmap, fasciculus R nondum editus). Dendrogrammata in mappis caloris exhibita calculata sunt utens methodo Ward hierarchicae coacervationis cum metrica distantiae Euclideae. Ad analysin statisticam datorum aestimationis motivorum, valores P pro aestimatione non normalizata calculati sunt utens probatione exacta Fisheri. Valores P pro aliis collectionibus datorum in R per t-test Studentis vel ANOVA computati sunt.
Cloni phagi selecti et phagi sine insertis per venam caudalem intravenose iniecti sunt (2×1010 phagi/animal in 300 μl PBS). Decem minutis ante perfusionem et subsequentem fixationem, eadem animalia intravenose iniecta sunt cum 100 μl lectini DyLight594-signati (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minutis post injectionem phagi, ratti per cor perfusi sunt cum 50 ml PBS deinde 50 ml 4% PFA/PBS. Exempla cerebri praeterea per noctem in 4% PFA/PBS fixa sunt et per noctem in 30% saccharosa ad 4°C macerata. Exempla celeriter in mixtura OCT congelantur. Analysis immunohistochemica exemplorum congelatorum peracta est temperatura ambiente in cryosectionibus 30 µm, obstructis 1% BSA et incubatis cum anticorporibus polyclonalibus FITC-signatis contra phagum T7 (Novus NB 600-376A) ad 4°C. Incubantur per noctem. Denique, sectiones ter lavatae sunt PBS et examinatae microscopio laserico confocali (Leica TCS SP5).
Omnia peptida puritate minima 98% a GenScript USA synthesizata, biotinylata et lyophilizata sunt. Biotinum per triplicem glycinam interpositorium ad N-terminum ligatur. Omnia peptida spectrometria massae examina.
Streptavidinum (Sigma S0677) cum excessu aequimolari quintuplo peptidi biotinylati, peptidi inhibitorii BACE1 biotinylati, vel combinationis (proportio 3:1) peptidi inhibitorii BACE1 biotinylati et peptidi inhibitorii BACE1 in 5-10% DMSO/incubato in PBS mixtum est. Hora una ad temperaturam ambientem ante injectionem. Peptida streptavidino-coniugata intravenose iniecta sunt dosi 10 mg/kg in unam ex venis caudalium rattorum cum cavitate cerebri.
Concentratio complexorum streptavidini-peptidi per ELISA aestimata est. Laminae microtitulares Nunc Maxisorp (Sigma) per noctem ad 4°C cum anticorpore murino anti-streptavidini 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011) obductae sunt. Post obstructionem (solutione obstructionis: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatina, 1% BSA) ad temperaturam ambientem per duas horas, lamina cum 0.05% Tween-20/PBS (solutione lavationis) per tres secundas lavata est. Exempla CSF et plasmatis puteis cum solutione obstructionis diluta (plasma 1:10,000, CSF 1:115) addita sunt. Deinde lamina per noctem ad 4°C cum anticorpore detectionis (1 μg/ml, anti-streptavidini-HRP, Novus NB120-7239) incubata est. Post tria ablutio, streptavidinum detectum est per incubationem in solutione substrati TMB (Roche) usque ad viginti minuta. Postquam evolutio coloris cum 1M H2SO4 sistatur, absorptionem ad 450 nm metire.
Functio complexus streptavidini-peptidi-inhibitoris BACE1 per ELISA Aβ(1-40) secundum protocollum fabricatoris (Wako, 294-64701) aestimata est. Breviter, exempla CSF in diluente normali (1:23) diluta sunt et per noctem ad 4°C in laminis 96 puteorum anticorpore captatorio BNT77 obductis incubata sunt. Post quinque gradus lavacri, anticorpus BA27 HRP-coniugatum additum est et per duas horas ad 4°C incubatum est, deinde quinque gradus lavacri. Aβ(1-40) detecta est incubatione in solutione TMB per 30 minuta ad temperaturam ambientem. Postquam evolutio coloris solutione sistenti interclusa est, absorptionem ad 450 nm metire. Exempla plasmatis extractioni phasis solidae ante ELISA Aβ(1-40) subiecta sunt. Plasma ad 0.2% DEA (Sigma) in laminis 96 puteorum additum est et ad temperaturam ambientem per 30 minuta incubatum est. Postquam laminae SPE (Oasis, 186000679) aqua et methanolo centum centesimis successive lavatae sunt, exempla plasmatis laminis SPE addita sunt et omnis liquor sublatus est. Exempla lavata sunt (primum cum methanolo quinque centesimis, deinde cum methanolo triginta centesimis) et cum NH4OH duo centesimis et methanolo nongentis centesimis eluta. Postquam eluatum ad 55°C per 99 min sub currente N2 constanti siccatum est, exempla in diluentibus normalibus redacta sunt et Aβ(1–40) mensuratum est ut supra descriptum est.
Quomodo hunc articulum citare: Urich, E. et al. Deferendi onus ad cerebrum utens peptidis transitoriis in vivo identificatis. *The Science*. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB et Moos T. *De traditione medicamentorum macromolecularium ad cerebrum per therapiam directam*. Acta Neurochemiae 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., et Martinez-Martinez, P. *De traditione medicamentorum peptidicorum et proteinicorum trans claustra haematoencephalica.* Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM. Claustrum haematoencephalicum: impedimentum in evolutione medicamentorum cerebralium. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, et Byrd, A. Spes ad meliorem administrationem medicamentorum et directionem ad cerebrum per viam plexus choroideae-CSF. *Pharmaceutical Research* 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM. *Modernatio biopharmaceuticorum cum equis Troianis molecularibus ad cerebrum traditionem.* Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM, transportatio peptidorum trans claustra haematoencephalica a receptore mediata. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Penetrationem cerebri et efficaciam anticorporum therapeuticorum augere utens vectibus molecularibus monovalentibus. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transportatio receptoris transferrini (TfR) absorptionem cerebralem variantium affinitatis anticorporum TfR determinat. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).