Quaedam argumenta de difficultatibus LC solvendis numquam obsoleta sunt, cum difficultates in usu LC exsistant, etiam cum technologia instrumentorum tempore proficiat. Multae sunt rationes quibus difficultates in systemate LC oriri possunt et in mala forma apicis desinunt. Cum difficultates ad formam apicis pertinentes oriuntur, brevis index causarum possibilium horum eventuum experientiam nostram solvendis difficultatibus simplificat.
Iucundum fuit hanc columnam "LC Troubleshooting" scribere et de argumentis singulis mensibus cogitare, quia quaedam argumenta numquam ex modo exeunt. Dum in campo investigationis chromatographicae quaedam argumenta vel ideae obsoletae fiunt cum ideis recentioribus et melioribus substituuntur, in campo LC Troubleshooting, ex quo primus articulus de LC Troubleshooting in hac ephemeride (LC Journal eo tempore) apparuit (cum quaedam argumenta adhuc pertinentia sint) anno 1983 (1). Per annos proximos, plures sectiones LC Troubleshooting in inclinationibus hodiernis chromatographiam liquidam (LC) afficientibus intendi (exempli gratia, comparatione relativa nostrae intellectus effectus pressionis in retentionem [2] Novi Progressus) interpretatione nostra eventuum LC et quomodo difficultates cum instrumentis LC modernis solvere. In hac parte mensis, seriem meam (3) continuo, quae mense Decembri 2021 coepit, quae in quibusdam argumentis "vitae et mortis" LC solvendi intendit — elementa quae optima sunt cuilibet solventi essentialia sunt, quantumvis aetatis sit systematis quod utimur. Argumentum principale huius seriei valde pertinet ad chartam muralem LCGC famosam "LC Troubleshooting Guide" (4). Pendens in multis laboratorium. Pro tertia parte huius seriei, elegi in quaestionibus ad formam cacuminum vel proprietates cacuminum pertinentibus intendere. Incredibile dictu, tabula muralis 44 causas potentiales diversas malae formae cacuminum enumerat! Non possumus omnes has quaestiones in uno articulo singillatim considerare, ergo in hac prima parte de hac re, in nonnullis ex iis quae saepissime video intendam. Spero iuvenes et senes usores LC consilia utilia et admonitiones de hac re gravi inventuros esse.
Me magis ac magis quaestionibus difficultatum solvendarum respondentem invenio "omnia possibilia sunt". Haec responsio facilis videri potest cum observationes difficiles interpretatione considerantur, sed saepe mihi apta est. Cum multae causae possibiles malae formae apicum, interest mentem apertam habere cum consideratur quid problema esse possit, et causas potentiales ordinare posse ut conatus nostros difficultatum solvendarum incipiamus, in illis possibilitatibus frequentissimis intendentes; hoc punctum perquam grave est.
Gradus clavis in quolibet exercitio difficultatum solvendarum — sed unus quem puto subaestimatum esse — est agnoscere problema esse quod solvendum est. Saepe agnoscere problema esse significat agnoscere id quod instrumento accidit differre ab exspectationibus nostris, quae theoria, scientia empirica et experientia formantur (5). "Forma apicis" hic memorata re vera non solum ad formam apicis refertur (symmetricam, asymmetricam, levem, levem, marginem anteriorem, caudam, etc.), sed etiam ad latitudinem. Exspectationes nostrae de forma apicis actuali simplices sunt. Theoria (6) bene confirmat expectationem libri scholastici quod, plerumque, apices chromatographici symmetrici esse debent et formae distributionis Gaussianae conformari, ut in Figura 1a demonstratur. Quod a latitudinibus apicum exspectamus est res complexior, et hanc rem in articulo futuro tractabimus. Aliae formae apicum in Figura 1 aliquas alias possibilitates ostendunt quae observari possunt — aliis verbis, aliquas vias quibus res male procedere possunt. In reliqua parte huius partis, tempus impendemus disserendo aliquas exemplis specificis condicionum quae ad has ducere possunt. genera formarum.
Interdum cacumina in chromatogrammate, ubi elutionem exspectantur, omnino non observantur. Tabula muralis supra indicat absentiam cacuminis (si exemplum revera continet analytum destinatum concentratione quae responsionem detectoris sufficientem facere debet ut supra strepitum videat) plerumque cum aliquo problemate instrumenti vel condicionibus phasis mobilis incorrectis (si omnino observantur) coniunctam esse. Cacumina, plerumque nimis "debilia"). Brevis index problematum potentialium et solutionum in hac categoria in Tabula I inveniri potest.
Ut supra dictum est, quaestio de quanta dilatatio apicis toleranda sit antequam attendamus et eam corrigere conemur, res est complexa quam in articulo futuro tractabo. Mea experientia est dilatationem apicis significantem saepe cum mutatione significativa in forma apicis coniungi, et caudam apicis frequentiorem esse quam prae-apicis vel divisionem. Tamen, apicis nominaliter symmetricis etiam dilatantur, quod paucis de causis diversis causari potest:
Hae singulae quaestiones iam in prioribus editionibus "Solutionis Difficultatum LC" fusius tractatae sunt, et lectores his argumentis studentes ad hos articulos priores referre possunt ut de causis principalibus et solutionibus potentialibus harum difficultatum informationes habeant. Plura de hoc.
Caudatio apicis, frons apicis, et fissio omnes a phaenomenis chemicis vel physicis causari possunt, et index solutionum potentialium horum problematum late variat, prout cum problemate chemico an physico agitur. Saepe, comparando varios apices in chromatogrammate, indicia magni momenti de causa invenire potes. Si omnes apices in chromatogrammate similes formas exhibent, causa verisimiliter non physica est. Si tantum unus vel pauci apices afficiuntur, sed reliqui bene apparent, causa verisimiliter chemica est.
Causae chemicae dispersionis apicis nimis intricatae sunt ut hic breviter disseri possint. Lectori studioso ad recentem editionem "LC Troubleshooting" remittitur pro disputatione profundiore (10). Attamen, res facilis tentanda est massam analyti iniecti reducere et videre num forma apicis melior fiat. Si ita est, tunc hoc bonum indicium est problema esse "massae nimiae". Hoc in casu, methodus ad iniectionem parvarum massarum analyti limitanda est, vel condiciones chromatographicae mutandae sunt ut bonae formae apicis obtineri possint etiam cum maioribus massis iniectis.
Multae quoque causae physicae potentiales pro caudatione apicis sunt. Lectores qui disputationem accuratam de possibilitatibus cupiunt, ad aliam editionem recentem "LC Troubleshooting" (11) remittunt. Una ex causis physicis frequentioribus caudationis apicis est nexus debilis in puncto inter iniectorem et detectorem (12). Exemplum extremum in Figura 1d ostenditur, in laboratorio meo ante aliquot hebdomades obtenta. Hoc in casu, systema cum nova valvula injectionis construximus, quam antea non utebamur, et ansam injectionis parvi voluminis cum ferrule, quod in capillare chalybeo inoxidabili formatum erat, instituimus. Post aliquas experimenta initialia de solutione difficultatum, intelleximus profunditatem portus in statore valvulae injectionis multo altiorem esse quam assueti eramus, quod magnum volumen mortuum in fundo portus effecit. Hoc problema facile solvitur substituendo ansam injectionis alio tubo; ferrulam ad positionem rectam aptare possumus ut volumen mortuum in fundo portus eliminemus.
Frontes cacuminum, sicut in Figura 1e monstrantur, etiam a problematis physicis vel chemicis causari possunt. Causa physica communis marginis anterioris est stratum particularum columnae non bene compactum esse, vel particulae tempore reorganizatae esse. Sicut cum cauda cacuminum ab hoc phaenomeno physico causata, optima via ad hoc corrigendum est columnam reponere et pergere. Fundamentaliter, formae cacuminum marginis anterioris cum origine chemica saepe oriuntur ex iis quae condicionibus retentionis "non linearibus" appellamus. Sub condicionibus idealibus (linearibus), quantitas analyti a phase stationaria retenta (ergo, factor retentionis) lineariter relata est ad concentrationem analyti in columna. Chromatographice, hoc significat, cum massa analyti in columnam iniecta crescit, cacumen altiorem fieri, sed non latiorem. Haec relatio rumpitur cum modus retentionis non linearis est, et cacumina non solum altiora sed etiam latiora fiunt cum plus massae iniicitur. Praeterea, formae non lineares formam cacuminum chromatographicorum determinant, resultantes in marginibus anterioribus vel posterioribus. Sicut cum onere massae quod caudam cacuminum causat (10), cacumen... Ductio a retentione non lineari causata etiam per reductionem massae analyti iniectae diagnosticari potest. Si forma apicis melior fit, methodus modificanda est ne qualitas injectionis quae marginem principalem efficit excedat, vel condiciones chromatographicae mutandae sunt ut hoc comportamentum minuatur.
Interdum observamus quod cacumen "divisum" videtur, ut in Figura 1f demonstratur. Primum gradum in hac difficultate solvenda est determinare utrum forma cacuminis partiali coelutioni obnoxia sit (id est, praesentiae duorum compositorum distinctorum sed arcte eluentium). Si revera duo analyta diversa prope eluunt, tunc res est de eorum resolutione emendanda (exempli gratia, per augendam selectivitatem, retentionem, vel numerum laminarum), et cacumina "divisa" apparentia ad functionem physicam pertinent. Efficacia nihil ad ipsam columnam pertinet. Saepe, indicium gravissimum ad hanc decisionem est utrum omnes cacumina in chromatogrammate formas divisas exhibeant, an tantum unam vel duas. Si tantum una vel duae sunt, probabiliter quaestio coelutionis est; si omnes cacumina divisa sunt, probabiliter quaestio physica est, probabiliter ad ipsam columnam pertinens.
Cacumina divisa, quae ad proprietates physicas ipsius columnae pertinent, plerumque ob fritas ingressus vel exitus partim obstructas, vel ob ordinationem particularum in columna, oriuntur, quae permittunt phasim mobilem celerius fluere quam phasim mobilem in quibusdam partibus formationis canalis columnae in aliis regionibus (11). Frita partim obstructa interdum purgari potest invertendo fluxum per columnam; tamen, mea experientia, haec plerumque solutio brevis temporis potius quam longa est. Hoc saepe fatale est cum columnis modernis si particulae intra columnam recombinant. Hoc loco, optimum est columnam reponere et pergere.
Cacumen in Figura 1g, etiam ex exemplo recenti in laboratorio meo, plerumque indicat signum tam altum esse ut finem summum ambitus responsionis attigisse. Detectoribus opticis absorptionis (UV-vis hoc in casu), cum concentratio analyti valde alta est, analytum maximam partem lucis per cellam fluxus detectoris transeuntis absorbet, relinquens lucem perpaucam ad detegendum. Sub his condicionibus, signum electricum a photodetectore graviter afficitur a variis fontibus strepitus, ut luce aberrante et "currente obscuro", quod signum aspectu valde "nebulosum" et a concentratione analyti independens reddit. Cum hoc accidit, problema saepe facile solvi potest per reductionem voluminis injectionis analyti — reductionem voluminis injectionis, dilutionem speciminis, vel utrumque.
In schola chromatographica, signum detectoris (id est, axem y in chromatogrammate) ut indicatorem concentrationis analyti in exemplo utimur. Itaque mirum videtur chromatogramma cum signo infra zero videre, cum interpretatio simplex sit hoc concentrationem analyti negativam indicare – quod scilicet physice fieri non potest. Mea experientia, cacumina negativa saepissime observantur cum detectoribus opticis absorptionis (e.g., UV-vis) utuntur.
Hoc in casu, cacumen negativum simpliciter significat moleculas e columna eluentes minus lucis absorbere quam ipsa phasis mobilis statim ante et post cacumen. Hoc fieri potest, exempli gratia, cum longitudines undarum detectionis relative humiles (<230 nm) et additiva phasis mobilis quae maximam partem lucis his longitudinibus undarum absorbent adhibentur. Talia additiva possunt esse componentes solventes phasis mobilis ut methanolum vel componentes tampones ut acetatum vel formiatum. Re vera cacumina negativa uti possumus ad curvam calibrationis praeparandam et accuratam informationem quantitativam obtinendam, ergo nulla causa fundamentalis est ea per se vitare (haec methodus interdum "detectio UV indirecta" appellatur) (13). Attamen, si revera cacumina negativa omnino vitare volumus, in casu detectionis absorptionis, optima solutio est uti longitudine undae detectionis diversa ut analytum plus quam phasis mobilis absorbeat, vel compositionem phasis mobilis mutare ut minus lucis quam analytae absorbeant.
Cacumina negativa etiam apparere possunt cum detectio indicis refractionis (RI) adhibetur, cum index refractionis componentium praeter analytum in exemplo, ut matrix solventis, differt ab indice refractionis phasis mobilis. Hoc etiam fit cum detectione UV-vis, sed hic effectus solet attenuari respectu detectionis RI. In utroque casu, cacumina negativa minui possunt compositionem matricis exempli cum ea phasis mobilis propius comparando.
In parte tertia de argumento fundamentali investigationis difficultatum LC, casus tractavi in ​​quibus forma cacuminis observata a forma cacuminis exspectata vel normali differt. Efficax investigatio talium difficultatum incipit cum cognitione formarum cacuminis exspectatarum (fundatae in theoria vel experientia priore cum methodis existentibus), ergo deviationes ab his expectationibus manifestae sunt. Problemata formae cacuminis multas causas potentiales habent (nimis lata, cauda, ​​margo anterior, etc.). In hac parte, aliquas causas quas saepissime video accurate disputo. Haec cognoscere bonum locum praebet ad incipiendum investigationem difficultatum, sed non omnes possibilitates comprehendit. Lectores qui indicem causarum et solutionum profundiorem cupiunt, tabulam muralem "LC Troubleshooting Guide" LCGC consulere possunt.
(4) Tabula muralis "LCGC Ductor ad Difficultates Solvendas". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, *Analysis Datorum et Processus Signorum in Chromatographia* (Elsevier, Novi Eboraci, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF et Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.