Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versione navigatri uteris quae CSS sustinet limitatum. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro recentiore utaris (aut Modum Compatibilitatis in Internet Explorer debilites). Praeterea, ut auxilium continuum praestemus, situm sine stylis et JavaScript monstramus.
Series trium diapositivarum simul ostendit. Utere bullis "Prior" et "Sequens" ad tres diapositivas simul movendas, vel bullis cursoribus in fine ad tres diapositivas simul movendas utere.
Organella neuralia auto-componentia in vitro suggestum promittentem repraesentant ad evolutionem humanam et morbos simulandos. Attamen organoida carent connectivitate quae in vivo existit, quae maturationem limitat et integrationem cum aliis circuitibus qui mores regunt impedit. Hic demonstramus organoida corticalia ex cellulis humanis caulis derivata, in corticem somatosensorium rattorum nudorum neonatorum transplantata, genera cellularum matura evolvere quae in circuitus sensorios et motivationis conexos integrantur. Imago resonantiae magneticae (MRI) incrementum organoidum post-transplantationem in pluribus stirpibus cellularum caulis et animalibus revelavit, dum analysis unius nuclei progressionem corticogenesis et emergentiam programmatis transcriptionis activitate dependentis revelavit. Revera, neurona corticalia transplantata proprietates morphologicas, synapticas et membranarum internarum complexiores quam eorum pares in vitro exhibent, permittens detectionem vitiorum neuronalium in aegris cum syndroma Timothei. Investigatio anatomica et functionalis demonstravit organella transplantata influxus thalamocorticales et corticocorticales accipere, et inscriptiones in vivo activitatis neuralis suggerunt hos influxus responsa sensoria in cellulis humanis generare posse. Denique, organoida corticalia axones per cerebrum rattorum extendunt, et eorum activatio optogenetica ad mores quaerendi praemium ducit. Ergo neurona corticis humani transplantata maturescunt et in circuitibus hospitis qui mores regunt participant. Exspectamus hanc methodum detectionem phaenotyporum in gradu filamentoso in cellulis a patiente derivatis, quae aliis modis detegi non possunt, faciliorem reddere.
Cerebrum humanum in evolutione est processus insignis sui ipsius ordinationis, in quo cellulae proliferant, differentiantur, migrant, et connectuntur ad circuitus neuronales functionales formandos, qui per experientiam sensoriam ulterius refinuntur. Problema clavis in intellegenda evolutione cerebri humani, praesertim in contextu morborum, est defectus accessus ad textum cerebri. Organella sui ipsius ordinantia, inter quae organoida corticis humani (hCO; etiam sphaera corticis humani nota), 2,3,4,5,6 generare possunt. Attamen, nonnullae limitationes applicationem eorum latiorem ad intellegendam evolutionem et functionem circuitum neuralum limitant. Praesertim, incertum est utrum maturatio hCO absentia quorundam inputuum microenvironmentalium et sensoriorum praesentium in vivo limitetur. Praeterea, quia hCO non integrantur in circuitus qui exitus behaviorales generare possunt, utilitas eorum in modellandis perturbationum neuropsychiatricarum genetice complexarum et behavioralium nunc limitata est.
Transplantatio hCO in cerebrum vivum integrum has limitationes superare potest. Studia priora demonstraverunt neurona humana in corticem rodentium transplantata supervivere, proicere, et cum cellulis rodentium communicare posse7,8,9,10,11,12. Attamen haec experimenta plerumque in animalibus adultis fiunt, quod integrationem synapticam et axonalem limitare potest. Hic paradigma transplantationis describimus in quo hCO tridimensionale ex cellulis hiPS derivatum in corticem somatosensorium primarium (S1) rattorum immunodeficientium in stadio primo evolutionis plasticae transplantavimus. Neurona hCO (t-hCO) transplantata maturationem substantialem subeunt, influxus thalamocorticales et cortico-corticales accipiunt qui responsa sensoria elicundunt, et projectiones axonales in cerebrum rattorum extendunt ad mores quaerendi praemia impellendos. Maturatio extensa t-hCO defectus neuronales in aegrotis cum syndroma Timothei (TS) revelavit, morbo genetico gravi causato a mutationibus in canali calcii CaV1.2 typi L-sensibili ad voltagem (a CACNA1C codificato).
Ad neurona corticalia humana in circuitibus *in vivo* investiganda, hCO 3D integram stereotactice in S1 rattorum athymicorum postnatalium primo tempore (diebus 3-7 postnataliter) transplantavimus (Fig. 1a et data ampliata Fig. 1a-c). Hoc tempore, projectiones axonales thalamocorticales et corticocorticales innervationem S1 nondum compleverunt (ref. 13). Itaque, haec methodus ad integrationem t-hCO amplificandam destinata est, dum effectum in circuitus endogenos minuitur. Ad locum t-hCO in animalibus vivis visualizandum, reconstructiones cerebri MRI T2-ponderatae rattorum 2-3 menses post transplantationem perfecimus (Fig. 1b et data ampliata, Fig. 1d). t-hCO₃ facile observata sunt et mensurae voluminis t-hCO₃ similes erant illis ex segmentis fixis calculatis (Data Extensa Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO₃ facile observata sunt et mensurae voluminis t-hCO₃ similes erant illis ex segmentis fixis calculatis (Data Extensa Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO ли аналогичны рассчитанным для иксировныер (саировныер (срезовные) ( рис 1d, e; t-hCO₃ facile observata sunt, et mensurae volumetricae t-hCO₃ similes erant illis quae pro sectionibus fixis calculatae sunt (data ampliata, Fig. 1d, e; P > 0.05).t-hCO，并且t-hCO 1d、e；P > 0.05）。t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO ли аналогичны рассчитанным для иксированных срезованных срезовныхе, ( рис 1d, e; t-hCO₃ facile observatum est, et mensurae volumetricae t-hCO₃ similes erant illis quae pro sectionibus fixis calculatae sunt (data ampliata, Fig. 1d, e; P > 0.05).t-hCO in 81% animalium transplantatorum circiter duos menses post transplantationem determinavimus (n = 72 animalia; hCO ex 10 stirpibus cellularum hiPS; stirpibus cellularum hiPS in Tabula Suppletoria 1). Ex his, 87% in cortice cerebri siti erant (Fig. 1c). Peractis seriebus MRI multis temporibus in eodem ratto transplantato, invenimus novem vicibus auctum voluminis t-hCO intra tres menses (Fig. 1d et data ampliata, Fig. 1f). Animalia transplantata altam ratam supervivendi (74%) duodecim mensibus post transplantationem habuerunt (data ampliata, Fig. 1g et Tabula Suppletoria 2), et nulla manifesta perturbatio motoria vel memoriae, gliosis, vel electroencephalogramma (EEG) inventa sunt. Data (Fig. 1g et tabula supplementaria 2). 1h–m et 3e).
a, Schema consilii experimentalis. HCO derivatum ex cellulis hiPS transplantatum est in S1 rattorum nudorum neonatorum diebus 30-60 differentiationis. b, Imagines MRI coronales et horizontales ponderatae T2 t-hCO in S1 2 mensibus post transplantationem ostendentes. Scala lineae, 2 mm. c, Quantificatio successus insertionis pro singulis stirpibus cellularum hiPS (n = 108, numeri intra lineas quantitatem t-hCO per stirpem cellularum hIPS indicant) et locum corticalem vel subcorticalem (n = 88) demonstratae. d, Imago MRI arteriae coronariae (sinistra; scala lineae, 3 mm) et reconstructio volumetrica 3D correspondens (scala lineae, 3 mm) augmentum in t-hCO per 3 menses ostendens. e, Recensio exemplarium t-hCO in cortice cerebri rattorum. Scala lineae, 1 mm. f, Imagines immunocytochemicae repraesentativae t-hCO a summo sinistro ad dextram monstratae (per differentiationem): PPP1R17 (mensium quattuor natus), NeuN (mensium octo natus), SOX9 et GFAP (mensium octo natus), PDGFRα; (mensium octo), MAP2 (mensium octo) et IBA1 (mensium octo). Scalae linea, 20 µm. Co-expressio HNA cellulas originis humanae indicat. g, snRNA-seq: Imago reductionis dimensionalitatis multiplex et projectionis unificatae (UMAP) omnium nucleorum t-hCO altae qualitatis post integrationem Seurat (n=3 exempla t-hCO, n=2 lineae cellularum hiPS). Astrocyti, cellulae lineae astrocytorum; cyc prog, progenitores circulantes; GluN DL, neurona glutamatergica profunda; GluN DL/SP, neurona glutamatergica profunda et sublamellaris; GluN UL, neurona glutamatergica strati superioris; oligodendrocyti, oligodendrocyti; OPC, cellulae progenitrices oligodendrocytorum; RELN, neurona reelina. h, analysis locupletationis terminorum per Ontologiam Geneticam (GO) genorum significanter surregulatorum (P < 0.05 adaptatum, mutatio multiplicata > 2, expressa in saltem 10% nucleorum) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum neuronibus glutamatergicis hCO. h, analysis locupletationis terminorum per Ontologiam Geneticam (GO) genorum significanter surregulatorum (P < 0.05 adaptatum, mutatio multiplicata > 2, expressa in saltem 10% nucleorum) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum neuronibus glutamatergicis hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontologiae (GO) для генов со начительной активацией (скорректированный P<0,нованный P<0,нованн> P<0,нованн P <0,нованн> P<0,нстованн ) P<0,нованн p. кспрессия по крайней ере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравненикрои лутачатениеских нейронах hCO. h, analysis locupletationis terminorum per Ontologiam Geneticam (GO) pro genis cum activatione significativa (P<0.05 adaptatum, mutatio multiplicata >2, expressio in saltem 10% nucleorum) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum neuronibus glutamatergicis hCO. h，与hCO t-hCO P <0.05，倍数变化> 2，在至少10% (GO) h hco t-hco p <0.05 > 2 10% (GO) . h, ены начительно активизировались (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, экспрессируетс 10% поруетс дер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтолизи (hCO нтолии() термина обогащения. h, gena significanter surregulata sunt (P adaptatum < 0.05, mutatio multiplicata > 2, expressa in saltem 10% nucleorum) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum neuronibus glutamatergicis hCO. Analysis ontologica (GO) termini locupletationis.Linea punctata valorem aq 0.05 indicat. i, imago UMAP cellularum GluN in t-hCO utens translatione inscriptionum ex indice corticis motorii adulti 22 snRNA-seq referentiali. CT — cellulae corticothalamicae, ET — cellulae extracerebrales, IT — cellulae telencephalicae internae, NP — proiectio prope.
Deinde cytoarchitecturam et compositionem cellularem generalem t-hCO aestimavimus. Tinctura anticorporum cellularum endothelialium ratti vascularizationem cum t-hCO revelavit, dum tinctura IBA1 praesentiam microgliae ratti per totum insitum revelavit (Fig. 1f et data ampliata, Fig. 3c,d). Immunotinctura cellulas antigeno nucleari humano (HNA) positivas co-exprimentes PPP1R17 (progenitores corticales), NeuN (neurona), SOX9 et GFAP (cellulae glialibus derivatae) vel PDGFRα (progenitores oligodendrocytorum) revelavit (Figura 1f). Ad compositionem cellularem t-hCO ad resolutionem cellulae singularis studendam, sequentiationem RNA unius nuclei (snRNA-seq) post circiter octo menses differentiationis perfecimus. Filtratio in massa et remotio nucleorum ratti 21,500 mappas mononucleares humanas altae qualitatis protulit (Fig. 1g et data ampliata, Fig. 4a,b). Exempla expressionis signorum typicorum cellularum coetus classium cellularum corticalium maiorum, inter quas neurona glutamatergica profunda et superficialia, progenitores circulantes, oligodendrocyta, et stirps astrocytorum, identificaverunt (Fig. 1g, data ampliata, Fig. 4c, et Tabula Supplementaria 3). Immunotinctio pro SATB2 et CTIP2 demonstravit, quamvis subtypis corticalibus praesentibus, t-hCO stratificationem anatomicam claram non demonstravisse (data ampliata, Fig. 3a). hCO cum snRNA-seq stadio congruente classes cellularum late similes produxit, paucis exceptis, inter quas absentia oligodendrocytorum et praesentia neuronorum GABAergicorum, quae condiciones favorabiles in vitro pro cellulis progenitoribus lateralibus antea relatas reflectere possunt15 (data ampliata, Fig. 4f-i et Tabula Supplementaria 4). Analysis differentialis expressionis genorum differentias significantes in neuronibus glutamatergicis inter t-hCO et hCO ostendit (Tabula Supplementaria 5), ​​inter quas activatio gregum genorum cum maturatione neuronali consociatorum, ut signalatio synaptica, localizatio dendritica, et activitas canalis voltaggio-regulata (Figura 1h et Tabula Supplementaria 5). Proinde, neurona corticalia glutamatergica t-hCO maturationem transcriptionalem acceleratam exhibuerunt.
Ut elucidaremus utrum hae mutationes transcriptionales in t-hCO cum differentiis morphologicis inter hCO in vitro et t-hCO in vivo coniunctae essent, hCO et hCO, biocytino repletos, secundum stadium congruentes, in sectionibus acutis post 7-8 menses differentiationis reconstruximus. Neurona t-hCO significanter maiora erant, diametrum somatis 1.5 maiorem, dendritas duplo plures, et longitudinem dendriticam totalem sextuplo auctam comparata cum hCO in vitro habebant (Fig. 2b). Praeterea, densitatem spinarum dendriticarum significanter maiorem in neuronis t-hCO quam in neuronis hCO observavimus (Fig. 2c). Hoc suggerit neurona t-hCO elongationem et ramificationem dendriticam amplam subire, quae, una cum proliferatione cellularum continua, ad incrementum intensum t-hCO post transplantationem conferre possunt (Fig. 1d et Data Extensa Fig. 1f). Hoc nos ad proprietates electrophysiologicas investigandas impulit. Capacitas membranae octies maior erat (data ampliata, Fig. 8d), potentiale membranae in statu quietis magis hyperpolarizatum erat (circiter 20 mV), et iniectio currentis maiorem excitationis ratem in neuronibus t-hCO quam in neuronibus hCO induxit. in vitro (Fig. 2d), e), quod congruit cum maioribus et complexioribus notis morphologicis t-hCO. Praeterea, frequentia eventuum currentium postsynapticorum excitatoriorum spontaneorum (EPSC) significanter maior erat in neuronibus t-hCO (Fig. 2f), suggerens densitatem auctam spinarum dendriticarum observatam in neuronibus t-hCO cum excitabilitate functionali coniunctam esse. synapsi sexuali. Characterem immaturum neuronorum hCO in vitro confirmavimus neurones glutamatergicos signatos notando (data ampliata, Fig. 6a-c).
a, reconstructio tridimensionalis neuronorum hCO et t-hCO biocytino repletorum post octo menses differentiationis. b, Quantificatio proprietatum morphologicarum (n = 8 neurona hCO, n = 6 neurona t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 et ***P < 0.0001). b, Quantificatio proprietatum morphologicarum (n = 8 neurona hCO, n = 6 neurona t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 et ***P < 0.0001). б, количественная оценка орфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 ). b, quantificatio proprietatum morphologicarum (n=8 neurona hCO, n=6 neurona t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, et ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 hCO n = 6 t-hCO **P = 0.0084，*P = 0.0179 ***P < 0.0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 hCO n = 6 t-hCO **P = 0.0084，*P = 0.0179 ***P < 0.0001）。 б, количественная оценка орфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 ). b, quantificatio proprietatum morphologicarum (n=8 neurona hCO, n=6 neurona t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, et ***P<0.0001).c, reconstructio tridimensionalis ramorum dendriticorum hCO et t-hCO post octo menses differentiationis. Asterisci rubri spinas dendriticas putativas indicant. Quantificatio densitatis spinarum dendriticarum (n = 8 neuronae hCO, n = 6 neuronae t-hCO; **P = 0.0092). d, Quantificatio potentialis membranae quiescentis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; ***P < 0.0001). d, Quantificatio potentialis membranae quiescentis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; ***P < 0.0001). d, количественная оценка ембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, quantificatio potentialis membranae quiescentis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка ембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, quantificatio potentialis membranae quiescentis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; ***P < 0.0001). e, Actionis potentialis repetitivae impulsio in hCO₃ et t-hCO₃ per injectiones currentis crescentes inducta, et quantificatio maximae frequentiae impulsionis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; ***P < 0.0001). e, Actionis potentialis repetitivae impulsio in hCO₃ et t-hCO₃ per injectiones currentis crescentes inducta, et quantificatio maximae frequentiae impulsionis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, ик колиественана скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reactio potentialis actionis in hCO₃ et t-hCO₃ inducta per augmentum currentis et quantificationem maximae frequentiae accensionis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO t-hCO n = 25 hCO n = 16 t-hCO ***P < 0.0001）。 E hco t-hco n = 25 hco n = 16 t-hco *** p <0.0001） e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи каяока, и количока, и количок аксимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, repetita emissio potentialium actionis hCO₃ et t-hCO₃, inducta a copia currentis aucta et quantificatione maximae frequentiae emissionis (n = 25 neurona hCO₃, n = 16 neurona t-hCO₃; *** P < 0.0001). f, EPSCs spontaneae (sEPSCs) in neuronibus hCO et t-hCO post octo menses differentiationis, et quantificatio frequentiae eventuum synapticorum (n = 25 neurona hCO, n = 17 neurona t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSCs spontaneae (sEPSCs) in neuronibus hCO et t-hCO post octo menses differentiationis, et quantificatio frequentiae eventuum synapticorum (n = 25 neurona hCO, n = 17 neurona t-hCO; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 есяцев дифференцировки и количествененая оценка аптоенка аптоенка аптоенка аптоировки и количественная оценка аптоенка аптоенка аптоировки событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001). f, EPSCs spontaneae (sEPSCs) in neuronibus hCO et t-hCO post octo menses differentiationis et quantificationis frequentiarum eventuum synapticorum (n=25 neurona hCO, n=17 neurona t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8 hCO t-hCO EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO n = 17 t-hCO ***P < 0.0001） . f，分化8 hCO t-hCO EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO n = 25 hCO n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 есяцев дифференцировки и количествененая оценка аптоенка аптоенка аптоенка аптоировки и количественная оценка аптоенка аптоенка аптоировки событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs spontaneae (sEPSCs) in neuronibus hCO et t-hCO post octo menses differentiationis et quantificationis indicerum eventuum synapticorum (n = 25 neurona hCO, n = 17 neurona t-hCO; *** P<0.0001).Pro bf, hCO₃ et t-hCO₃ in linea 1208-2 ex eadem grege differentiationis in parallelo servata sumpta sunt. g, Analysis locupletationis genorum (examen exactum Fisher unilaterale) genorum significanter amplificatorum (P < 0.05 adaptatum, mutatio multiplicis > 2, in saltem 10% nucleorum expressa) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum neuronibus glutamatergicis hCO cum collectionibus genorum tam responsionis praecocis (ERG) quam responsionis tardivae (LRG) activitatis dependentium ex studio murino in vivo identificatis16 et LRG humanis specificis ex neuronibus in vitro17. g, Analysis locupletationis genorum (examen exactum Fisher unilaterale) genorum significanter amplificatorum (P < 0.05 adaptatum, mutatio multiplicis > 2, in saltem 10% nucleorum expressa) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum neuronibus glutamatergicis hCO cum collectionibus genorum tam responsionis praecocis (ERG) quam responsionis tardivae (LRG) activitatis dependentium ex studio murino in vivo identificatis16 et LRG humanis specificis ex neuronibus in vitro17. g, анализ обогащения набора енов (односторонний точный критерий ишера) генов со начительной акти (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, кспрессия по меньшей мере в 10% дер) в лутаматергичонкотергичонкотергичре в 10% сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы енов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в ис16,инаах in vivo; специфических для еловека LRG из нейронов in vitro17. g, analysis locupletationis genorum (probatione exacta Fisher unicauda) genorum cum activatione significativa (P<0.05 adaptatum, mutatione multiplici >2, expressio in saltem 10% nucleorum) in neuronibus glutamatergicis t-hCO comparatis cum gregibus neuronorum glutamatergicorum hCO genorum activitate dependentium tam praematurorum (ERG) quam serarum (LRG) identificatorum in muribus in vivo16 et LRG humanis specificis ex neuronibus in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t-hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10% Fisher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG) (LRG) 16 和体外神经元17 LRG。 g t-hco hco t-hco p <0.05 > 2 10% (lrg) 16 17 17 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO ли значительно активизированы по сравнению с глутаматерги ескии h (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% нализ обогащения набора енов (односторонна) раннего ответа (ERG) и позднего ены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. LRG, специфичные для еловека. Neurona glutamatergica t-hCO₃ significanter aucta sunt comparata cum neuronis glutamatergicis hCO₃ (P<0.05 adaptatum, mutatio multiplicis >2, saltem 10%). Analysis locupletationis genorum responsionis praecocis (ERG) et responsionis tardae (test exactum Fisher unicaudatum), gena dependentia activitatis responsionis (LRG) identificata in muribus in vivo16 et neuronis in vitro.17 LRG humana specifica.Linea punctata valorem P 0.05, correctum a Bonferroni, indicat. h, expressio geni GluN (pseudo-fasciculus et scalatio singulorum genorum) significanter aucta est in replicis snRNA-seq genorum LRG in neuronibus glutamatergicis t-hCO. i, immunocoloratio expressionem SCG2 in neuronibus t-hCO (superiore) et hCO (inferiori) ostendens. Sagittae albae ad cellulas SCG2+ spectant. Scala linearis, 25 µm. Data exprimuntur ut media ± deviatio standard.
Ob activitatem auctam t-hCO in segmentis *ex vivo* observatam, snRNA-seq ostendit augmentum transcriptionum genorum, quae ab activitate dependent, in t-hCO comparato cum hCO *in vitro*. Neurona glutamatergica t-hCO altiora gradus genorum, quae activitatem responsus serotini regulant, expresserunt (Fig. 2g,h), qui in studiis prioribus in neuronis muribus et humanis inventi sunt16,17. Exempli gratia, BDNF18, SCG2, et OSTN, gen activitatem regulans primatibus specificum, expressionem auctam in neuronis t-hCO comparatis cum neuronis hCO demonstraverunt (Fig. 2g-i). Ita, neurona t-hCO proprietates maturationis auctas, comparatis cum neuronis hCO, per analyses transcriptionales, morphologicas, et functionales exhibuerunt.
Ad ulterius aestimandam associationem maturationis t-hCO cum evolutione cerebri humani, comparationes transcriptomicas cellularum corticalium fetalium et adultarum19,20 et adultorum21,22 necnon amplas notitias de expressione genorum corticalium23 per evolutionem perfecimus (notitias extensas, Fig. 5). Cum opere priore24, status maturationis transcriptomae hCO et t-hCO globalis post 7-8 menses differentiationis late congruens est cum tempore evolutionis in vivo et maxime aequivalet vitae fetali tardae (Notitias Extensas, Fig. 5a). Notandum est nos observasse maturitatem transcriptomae auctam in t-hCO comparatam cum hCO aetate congruente, necnon activationem transcriptomae cum synaptogenesi, astrogenesi, et myelinatione associatam (notitias extensas, Fig. 5b-d). In gradu cellulari, indicia subtypi corticis tenuioris in t-hCO invenimus, cum gregibus neuronorum glutamatergicorum cum subtypis neuronum adultorum L2/3, L5, et L6 tegentium (Figura 1i). Contra, superpositio fasciculorum inter neurona glutamatergica t-hCO et neurona corticales fetales in media graviditate limitata erat (data ampliata, Figura 5e-j). Ad determinandum utrum neurona t-hCO functione similes sint neuronis neocorticalibus humanis postnatalis, inscriptiones electrophysiologicas et reconstructiones anatomicas neuronorum pyramidalium L2/3 humanorum in sectionibus acutis corticis postnatalis humani perfecimus (data ampliata, Fig. 7a). Proprietates electrophysiologicae neuronorum pyramidalium L2/3 similes erant illis neuronorum pyramidalium t-hCO (data ampliata, Fig. 7e). Morphologice, neurona L2/3 ex exemplaribus humanis postnatalis similiora erant t-hCO quam hCO, quamquam cellulae L2/3 longiores erant, plures ramos in toto continebant, et densitatem spinarum maiorem habebant (Fig. 3g et data ampliata, Fig. 7b-).G).
a, transplantatio hCO producti a stirpibus cellularum hiPS moderantibus et TS in rattos neonatos. b, reconstructio tridimensionalis neuronorum t-hCO biocytino repletorum post octo menses differentiationis. c, quantificatio longitudinis dendriticae mediae (n = 19 neurona moderantia, n = 21 neurona TS; **P = 0.0041). d, rami dendritici tridimensionaliter reconstructi ex neuronis controlli et TS t-hCO3 post octo menses differentiationis, et quantificatio densitatis spinae dendriticae (n = 16 neurona controlli, n = 21 neurona TS, ***P < 0.0001). d, rami dendritici tridimensionaliter reconstructi ex neuronis controlli et TS t-hCO3 post octo menses differentiationis, et quantificatio densitatis spinae dendriticae (n = 16 neurona controlli, n = 21 neurona TS, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO ерез 8 есяцев дифференцировки и количествена оличествена поличествена поличествена поличествена поличествена поличествена поличествена повки и количествена количествев дендритных ипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstructio tridimensionalis ramorum dendriticorum ex neuronis controlli et t-hCO3 TS post octo menses differentiationis et quantificationis densitatis spinae dendriticae (n=16 neurona controlli, n=21 neurona TS, ***P<0.0001). d，分化8 TS t-hCO 3D n = 16 n = 21 ***P < 0.0001）。 d 8 ty t-hco 3d n = 16 n = 21 ty *** p <0.0001 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO ерез 8 есяцев дифференцировки и колиественная ественная дендритных ипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstructio tridimensionalis ramorum dendriticorum moderantium et TS t-hCO₂ post octo menses differentiationis et quantificatio densitatis spinae dendriticae (n=16 neurona moderantia, n=21 neurona TS, ***P<0.0001).Asterisci rubri spinas dendriticas putativas indicant. e, EPSCs spontaneae in neuronibus t-hCO control et TS post 8 menses differentiationis. f, diagramma frequentiae cumulativae et quantificatio frequentiae et amplitudinis eventuum synapticorum (n=32 neurona control, n=26 neurona TS; **P=0.0076 et P=0.8102). g, analysis Scholl neuronorum TS et control in hCO et t-hCO. Lineae punctatae neurona pyramidalia postnatalia humana L2/3 ad comparationem ostendunt (n=24 neurona t-hCO control, n=21 neurona t-hCO TS, n=8 neurona hCO control, et n=7 neurona hCO TS). Data exprimuntur ut media ± deviatio standard.
Facultas t-hCO ad replicandas proprietates morphologicas et functionales neuronorum corticis humani in alto gradu nos impulit ad explorandum num t-hCO adhiberi posset ad detegendos phaenotypos morborum. In TS operam dedimus, morbum neurodevelopmental gravem causatum a mutationibus amplificationis functionis in gene CaV1.2 codificante, quod transcriptionem genorum activitate dependentem in neuronis initiat. HCO a tribus aegrotis TS portantibus substitutionem frequentissimam (p.G406R) et tribus controlibus obtinuimus (Fig. 3a). Post transplantationem, invenimus morphologiam dendriticam in neuronibus TS mutatam esse comparatam cum controlibus (Fig. 3b et data ampliata, Fig. 8a,b), cum incremento duplo in numero dendritarum primarum et incremento generali in decremento medio et generali in longitudine dendritica (Fig. 3c et data ampliata, Fig. 8c). Hoc cum densitate spinarum aucta et frequentia aucta EPSCorum spontaneorum in TS comparata cum neuronibus controlibus coniunctum erat (Fig. 3d-f et data ampliata, Fig. 8g). Ulterior analysis exemplaria ramificationis dendriticae abnormalis in t-hCO TS comparatis cum testibus ostendit, sed non in TS hCO in vitro in simili statu differentiationis (Fig. 3g). Hoc congruit cum prioribus relationibus nostris de contractione dendritica dependente ab activitate in TS et facultatem huius suggestus transplantationis ad detegendos phaenotypos morborum in vivo illustrat.
Deinde quaesivimus quo usque cellulae t-hCO functione in S1 rattorum integratae sint. S1 in muribus fortes influxus synapticos a nucleis basalibus ventralibus ipsilateralibus et posterioribus thalamicis, necnon a corticibus motoriis ipsilateralibus et secundariis somatosensoriis, et a S1 contralaterali accipit (Fig. 4a). Ad exemplar innervationis restituendum, hCO viruso rabiei-dG-GFP/AAV-G infecimus et hCO in rattum S1 tribus diebus post transplantavimus. Expressionem GFP densam in neuronibus ganglionorum basalium S1 ipsilateralium et ventralium 7-14 diebus post transplantationem observavimus (Fig. 4b, c). Praeterea, tinctio anticorporum indicatoris thalamici netrin G1 praesentiam terminationum thalamicarum in t-hCO revelavit (Fig. 4d, e). Ad aestimandum utrum hae projectiones afferentes responsa synaptica in cellulis t-hCO elicere possent, inscriptiones cellularum integrarum ex cellulis humanis in sectionibus acutis strati thalamocorticalis perfecimus. Stimulatio electrica S1 murini, capsulae internae, materiae albae, fibrarum prope t-hCO vel activatio optogenetica terminationum thalamicarum opsin exprimentium in t-hCO EPSCs brevis latentiae in neuronibus t-hCO antagonistae receptoris AMPA NBQX expositis induxit. (Fig. 4f, g et data extensa, Fig. 9a-g). Haec data demonstrant t-hCO anatomice in cerebrum murinum integratum esse et a textu hospitis murini activari posse.
a, Schema experimenti vestigationis rabies. b, GFP et expressio STEM121 humano-specifica inter t-hCO et corticem cerebri muridi (pars superior). Etiam ostenditur expressio GFP in nucleo basali ventrali ipsilaterali (VB) muridi (inferiore sinistra) et S1 ipsilaterali (inferiore dextra). Scalae linea, 50 µm. Quadrata rubra areas cerebri repraesentant ubi imagines captae sunt. c, Quantificatio cellularum GFP exprimentium (n = 4 mures). d, e — Netrin G1+ terminales thalamici in t-hCO. d ostendit sectionem coronalem continentem nucleos t-hCO et VB. Scalae linea, 2 mm. e ostendit expressionem Netrin G1 et STEM121 in neuronibus t-hCO (sinistra) et VB (dextra). Scalae linea, 50 µm. Linea punctata aurantiaca indicat limitem t-hCO. f, g, Vestigia currentia neuronorum t-hCO post stimulationem electricam in S1 ratti (f) vel capsula interna (g), cum (purpureo) vel sine (nigro) NBQX (sinistra). Amplitudes EPSC cum et sine NBQX (n = 6 neurona S1, *P = 0.0119; et n = 6 neurona capsulae internae, **P = 0.0022) (medium). Percentatio neuronorum t-hCO ostendentium EPSC in responsione ad stimulationem electricam S1 (f) vel capsulae internae (g) ratti (dextra). aCSF, liquor cerebrospinalis artificialis. h, diagramma schematicum experimenti imaginandi 2P (sinistra). Expressio GCaMP6s in t-hCO (media). Scala, 100 µm. Intervallum temporis fluorescentiae GCaMP6s (dextra). i, Z-score activitatis spontaneae fluorescentiae. j, illustratio schematica stimulationis mystacis. k, trajectoriae fluorescentiae 2P z-score in uno experimento, congruentes cum deviatione whisker tempore zero (linea interrupta) in cellulis exempli. l, responsa z-score media populationis omnium cellularum congruentia cum deviatione whisker tempore zero (linea interrupta) (rubra) vel signis temporalibus fortuito generatis (cinereis). m. Diagramma schematicum experimenti de notatione optica. n, Curvae tensionis crudae ex cellula t-hCO3 exemplo durante stimulatione laser caerulea vel deflexione whisker. Sagittae rubrae indicant primas aculeas causatas a luce (summum) vel causatas a deflexione whisker (imum). Umbra cinerea indicat periodos deflexionis whisker. o, Undae lucis maximae et responsa deflexionis whisker. p, aculei unius conatus, congruentes cum deviatione whisker in cellulis exempli. 0 indicat deviationem whisker (linea interrupta). q, celeritas accendendi z-score media populationis pro omnibus cellulis photosensibilibus, congruens cum deviatione whisker tempore zero (linea interrupta) (rubra) vel signis temporalibus fortuito generatis (cinereis). r, Proportio unitatum photosensitivarum significanter modulatarum deviatione vibrissarum (n = 3 mures) (sinistra). Latentia maxima z-score (n = 3 mures; n = 5 (viridis dilutus), n = 4 (viridis obscurus), et n = 4 (cyanus) unitates modulationis deflectionis vibrissarum per murem) (dextra). Data exprimuntur ut media ± deviatio standard.
Deinde quaesivimus num t-hCO stimulis sensoriis in vivo activari posset. HCO, indicatores calcii genetice codificatos GCaMP6 exprimentes, in mures S1 transplantavimus. Post dies 150, photometriam fibrae vel imaginem calcii biphotonicam perfecimus (Figura 4h et data ampliata, Figura 10a). Invenimus cellulas t-hCO activitatem rhythmicam synchronizatam exhibere (Figura 4i, Data Ampliata, Figura 10b et Video Supplementarius 1). Ad maximam activitatem t-hCO describendam, inscriptiones electrophysiologicas extracellulares in muribus transplantatis anesthetizatis perfecimus (data ampliata, Figura 10c-f). Coordinatas stereotaxicas ex imaginibus MRI generavimus; ergo, hae unitates inscriptiones neuronas humanas putativas repraesentant, quamquam electrophysiologia sola speciem originis determinare non permittit. Eruptiones activitatis synchronizatas observavimus (data ampliata, Figura 10d). Impetus circiter 460 ms duraverunt et silentiis circiter 2 secundis inter se distabant (data ampliata, Fig. 10d, e). Singulae unitates mediocriter circiter tres ictus per impetum emiserunt, quod circiter 73% unitatum per impetum registratarum constituit. Actiones singularum unitatum valde correlatae erant, et hae correlationes altiores erant quam illae unitatum in animalibus non vaccinatis sub iisdem condicionibus registratarum (data ampliata, Fig. 10f). Ut responsa aculeorum neuronorum humanorum derivatorum identificatorum ulterius describeremus, experimenta notationis lucis in muribus anesthetizatis, quibus hCO₂ transplantatum est, canalem cationicum photosensibilem rhodopsinum 2 (hChR2) exprimentem, perfecimus, per quem neuroni t-hCO₂ recognitionem brevem latentiam (minus quam 10 ms) in responsione ad stimulos lucis caeruleae patiuntur (Fig. 4m-o). Neurona t-hCO eruptiones activitatis spontaneae exhibuerunt frequentiis similibus illis quae in imaginibus calcii observantur, necnon registrationibus electrophysiologicis in t-hCO absente notatione lucis peractis (data ampliata, Fig. 10c-g). Nulla activitas spontanea observata est in stadiis correspondentibus hCO in vitro registratis. Ad diiudicandum utrum t-hCO stimulis sensoriis activari posset, vibrissas muris breviter a t-hCO defleximus (Fig. 4j,m et data ampliata, Fig. 10h,k). Secundum studia priora8,10, pars cellularum t-hCO activitatem auctam in responsione ad deflectionem vibrissarum ostendit, quod non observatum est cum data cum signis temporalibus fortuitis comparata sunt (Fig. 4k-q et data ampliata, Fig. 10h-q). Re vera, circiter 54% singularum unitatum opto-signatarum ratem excitationis significanter auctam post stimulationem vibrissarum ostenderunt, culmen ad circiter 650 ms attingentes (Fig. 4r). Haec data simul sumpta suggerunt t-hCO congruentes inputationes functionales accipere et a stimulis environmentalibus activari posse.
Deinde investigavimus num t-hCO circuitus in muribus excitare posset ad mores moderandos. Primum investigavimus num axones neuronorum t-hCO in tela circumjacentia muribus proiciantur. HCO lentiviro hChR2 cum EYFP coniuncto (hChR2-EYFP) infecimus. Post dies 110, expressionem EYFP in regionibus corticalibus ipsilateralibus, inter quas cortices auditivum, motorium et somatosensorium, necnon in regionibus subcorticalibus, inter quas striatum, hippocampum et thalamus, observavimus (Fig. 5a). Ut aestimaremus num hae projectiones efferentes responsa synaptica in cellulis muribus elicere possent, cellulas t-hCO hChR2-EYFP exprimentes optice activavimus, cellulas corticis cerebri muribus in sectionibus acutis cerebri inscriptione faciendo. Activatio axonum t-hCO luce caerulea EPSCs brevem latentiam in neuronibus corticis pyramidalis muribus induxit, quae ab NBQX obstructae sunt (Fig. 5b-g). Praeterea, hae responsiones a tetrodotoxino (TTX) impediri et a 4-aminopyridino (4-AP) restitui possunt, quod suggerit eas a conexionibus monosynapticis causatas esse (Fig. 5e).
a, Schema axonum vestigationis (sinistra). Expressio t-hCO₃ EYFP (dextra). Scala, 100 µm. A1, cortex auditivus, ACC, cortex cingulatus anterior, d. striatum, striatum dorsale, HPC, hippocampus; Diaphragma, septum laterale, mPFC, cortex praefrontalis medialis, piri, cortex piriforme, v. striatum, striatum ventrale, VPM, nucleus ventropostomedialis thalami, VTA, regio tegmentalis ventralis. Quadrata rubra areas cerebri repraesentant ubi imagines captae sunt. b, Schema experimenti stimulationis. c, d, Exempla responsionis photocurrentis (summum) et voltagii (imum) a luce caerulea inducti in cellulis humanis (c) EYFP+ t-hCO₃ vel ratti (d) EYFP-. e, f, Vestigia currentia neuronorum rattorum post stimulationem axonum t-hCO luce caerulea cum TTX et 4-AR (viridi), TTX (cinereo) vel aCSF (nigro) (e), cum (violaceo) vel sine (nigro)) ) NBQX (e). g, Latentia responsionum luce caerulea in cellulis rattorum inductarum (n = 16 cellulae); virgae horizontales latentiam mediam (7.13 ms) (sinistra) indicant. Amplitudo EPSCorum lumine evocatorum, cum vel sine NBQX notatarum (n = 7 cellulae; ***P < 0.0001) (medium). Amplitudo EPSCorum lumine evocatorum, cum vel sine NBQX notatarum (n = 7 cellulae; ***P < 0.0001) (medium). плитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Amplitudo EPSCorum lumine inductorum, cum vel sine NBQX notatarum (n = 7 cellulae; ***P < 0.0001) (centrum).NBQX EPSC n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。NBQX EPSC n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 плитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Amplitudo EPSCorum lumine inductorum, cum vel sine NBQX notatarum (n = 7 cellulae; ***P < 0.0001) (centrum).Percentatio cellularum murinarum EPSCs ostendentium quae luci caeruleae respondent (dextra). h, Diagramma schematicum muneris behavioralis. d0, dies 0. i. Actio animalium exemplarium die 1 (sinistra) vel die 15 (dextra) exercitationis. Numerus medius lambendorum peractarum die 1 (sinistra) vel die 15 (dextra in medio) (n = 150 experimenta lucis caeruleae, n = 150 experimenta lucis rubrae; ***P < 0.0001). Numerus medius lambendorum peractarum die 1 (sinistra) vel die 15 (dextra in medio) (n = 150 experimenta lucis caeruleae, n = 150 experimenta lucis rubrae; ***P < 0.0001). реднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 n. испытаний с красным светом; Numerus medius lambendorum peractarum die 1 (sinistra) vel die 15 (media dextra) (n = 150 experimenta lucis caeruleae, n = 150 experimenta lucis rubrae; ***P < 0.0001).1 天（左）或第15 n = 150 n = 150 次红光试验；***P < 0.0001）。1 15 n = 150 n = 150 次红光试验；***P < 0.001 реднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 n. испытаний с красным светом; Numerus medius lambendorum peractarum die 1 (sinistra) vel die 15 (media dextra) (n = 150 experimenta lucis caeruleae, n = 150 experimenta lucis rubrae; ***P < 0.0001).Lambendorum cumulativarum probationum lucis rubrae et caeruleae die 1 (medio sinistro) vel die 15 (dextra). NS, non significans. j,k, Characteres morum omnium animalium transplantatorum cum t-hCO exprimente hChR2-EYFP (j) vel fluorophoro moderatorio (k) die 1 vel 15 (hChR2-EYFP: n = 9 mures, ** P = 0.0049; moderator: n = 9, P = 0.1497). l, Evolutio praeferentiae puncti (n = 9 hChR2, n = 9 controlli; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Evolutio praeferentiae puncti (n = 9 hChR2, n = 9 controlli; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolutio praeferentiae puncti (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolutio praeferentiarum punctorum (n = 9 hChR2, n = 9 subiecti; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, expressio FOS in responsione ad activationem optogeneticam t-hCO in S1. Imagines expressionis FOS (sinistra) et quantificationis (n = 3 per gregem; *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0.001) (dextra) monstrantur. Imagines expressionis FOS (sinistra) et quantificationis (n = 3 per gregem; *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0.001) (dextra) monstrantur. оказаны изображения кспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на руппр0,001) P (0,05, *** P <0,00; Imagines expressionis FOS (sinistra) et quantificationis (n = 3 per gregem; *P<0.05, **P<0.01, et ***P<0.001) monstrantur (dextra).FOS n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 ***P < 0.001）（右）的图像。FOS n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 ***P < 0.001）（右）的图像。 оказаны изображения кспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на руппр0,001) P (0,05, *** P <0,00; Imagines expressionis FOS (sinistra) et quantificationis (n = 3 per gregem; *P<0.05, **P<0.01, et ***P<0.001) monstrantur (dextra).Scala, 100 µm. Data exprimuntur ut media ± errore normali BLA, tonsillae basolateralis, MDT, nuclei thalamici dorsomedialis, PAG, grisei periaqueductalis.
Denique, quaesivimus num t-hCO mores rattorum moderari posset. Ad hoc explorandum, hCO hChR2-EYFP exprimentem in S1 transplantavimus, et post dies nonaginta, fibras opticas in t-hCO ad lucem tradendam implantavimus. Deinde rattos paradigmate conditioning operanti modificato (Fig. 5h) exercuimus. Animalia in camera probationis morum collocavimus et stimulos laser caeruleos (473 nm) et rubros (635 nm) quinque secundorum temere adhibuimus. Animalia praemium aquae accipiebant si durante stimulatione lucis caeruleae lambebant, sed durante stimulatione lucis rubrae non lambebant. Primo die exercitationis, animalia nullam differentiam in lambendo ostenderunt cum luce caerulea vel rubra stimulata sunt. Attamen, die quinto decimo, animalia cum hCO hChR2-EYFP exprimente transplantata lambendo activiorem demonstraverunt cum luce caerulea stimulata comparata cum stimulatione lucis rubrae. Hae mutationes in moribus lambiendis non observatae sunt in animalibus comparationis, quibus hCO fluorophorum comparationis exprimens transplantatum est (ratio successus discendi: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 et Video Supplementarius 2). Haec data suggerunt cellulas t-hCO neuronas murinas excitare posse ad mores quaerendos praemii stimulandos. Ut inveniremus quos circuitus neuronales t-hCO murinos in his mutationibus morum implicatos esse possent, optogenetice t-hCO in animalibus exercitatis activavimus et tela post 90 minuta collegimus. Immunohistochemia expressionem proteini FOS activitate dependentis in pluribus regionibus cerebri in moribus motivatis implicatis, incluso cortice praefrontali mediali, thalamo mediali, et materia grisea periaqueductali, revelavit, quae vel in animalibus comparationis non stimulatis vel in animalibus expressa est. oryza. 5m). Haec data simul sumpta suggerunt t-hCO activitatem neuronalem murinam modulare posse ad mores impellendos.
Organoida neuralia systema promittens ad evolutionem humanam et morbos in vitro investigandos repraesentant, sed ob defectum nexuum inter circuitus qui in vivo existunt, limitantur. Novam suggestum elaboravimus in quo hCO in S1 rattorum immunodepressi postnatalem incipientium transplantavimus ad evolutionem et functionem cellularum humanarum in vivo studendum. Demonstravimus t-hCO genera cellularum maturarum in vitro non observata evolvere et t-hCO anatomice et functionaliter in cerebrum rodentium integratum esse. Integratio t-hCO in circuitus neurales rodentium nobis permisit nexum inter actionem cellularem humanam et mores animalium investigatos stabilire, ostendens neurones t-hCO actionem neuronalem rattorum modulare posse ad responsa morum impellenda.
Ratio quam describimus plura commoda habet prae prioribus investigationibus de transplantatione cellularum humanarum in cerebra rodentium. Primo, hCO₂ in corticem crescentem rattorum postnatalium primorum transplantavimus, quod integrationem anatomicam et functionalem facilitare potest. Secundo, monitorium MRI t-hCO₂ nobis permisit ut situm et incrementum transplantati in animalibus vivis studeremus, quod nobis permisit ut studia multi-animalia diuturna perficeremus et fidelitatem plurium stirpium cellularum hiPS stabiliremus. Denique, organoida integra, potius quam suspensiones cellularum singularum isolatas, transplantavimus, quae minus destructivae cellulis humanis sunt et integrationem et generationem neuronorum corticis humani in cerebris rattorum promovere possunt.
Agnoscimus, quamvis progressus in hac re facti sint, restrictiones temporales, spatiales, et inter species formationem circuituum neuralum humanorum magna fidelitate impedire, etiam post transplantationem in primo stadio evolutionis. Exempli gratia, non liquet utrum activitas spontanea in t-hCO observata phaenotypum evolutionalem repraesentet similem activitati rhythmicae observatae per evolutionem corticalem, an ob absentiam generum cellularum suppressivorum praesentium in t-hCO. Similiter, non liquet quo usque absentia laminationis in t-hCO connectivitatem catenae afficiat30. Opera futura in integratione aliorum generum cellularum, ut microgliae humanae, cellularum endothelialum humanarum, et proportionum variarum interneuronum GABAergicorum, ut demonstratum est per assembly 6 in vitro, necnon in intellectu quomodo integratio et processus neuralis fieri possint in gradibus transcriptionalibus, synapticis, et behavioraliter mutatis t-hCO in cellulis a aegrotis obtentis.
Summa summarum, haec suggestus *in vivo* validum instrumentum praebet quod progressionem cerebri humani *in vitro* et investigationem morborum complere potest. Praevidimus hanc suggestum nobis permittere ut novos phenotypes filamentos in cellulis a patientibus derivatis, quae aliter difficilia essent, detegamus et novas rationes therapeuticas experiri possimus.
Ex cellulis HiPS, sicut antea descriptum est, hCO2.5 generavimus. Ad productionem hCO2 ex cellulis hiPS in stratis nutrientibus cultis incipiendam, coloniae integrae cellularum hiPS ex patellis culturae, dispasi utentes (0.35 mg/mL), remotae sunt et in culturas plasticas adhaesionis humilis translatae, quae patellas cum medio culturae cellularum hiPS (Corning) continentes, duobus inhibitoribus SMAD, dorsomorphino (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) et SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) et inhibitore ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem, supplemento acceperunt. Per primos quinque dies, medium cellularum hiPS quotidie mutatum est et dorsomorphinum ac SB-431542 addita sunt. Die sexto in suspensione, sphaeroides neurales in medium neurale translati sunt, continentem neurobasalem-A (10888, Life Technologies), supplementum B-27 sine vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillinum et streptomycinum (1:100, Life Technologies), et supplemento factore epidermali crescentis (EGF; 20 ng ml⁻¹; R&D Systems) et factore fibroblasti crescentis 2 (FGF2; 20 ng ml⁻¹; R&D Systems) usque ad diem vicesimum quartum. A die vicesimo quinto ad diem quadragesimum secundum, medium supplemento factore neurotrophico cerebro-derivato (BDNF; 20 ng ml⁻¹, Peprotech) et neurotrophino 3 (NT3; 20 ng ml⁻¹; Peprotech) dato, medii mutationibus alternis diebus factis. Die sexto in suspensione, sphaeroides neurales in medium neurale translati sunt, continentem neurobasalem-A (10888, Life Technologies), supplementum B-27 sine vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillinum et streptomycinum (1:100, Life Technologies), et supplemento factore epidermali crescentis (EGF; 20 ng ml⁻¹; R&D Systems) et factore fibroblasti crescentis 2 (FGF2; 20 ng ml⁻¹; R&D Systems) usque ad diem vicesimum quartum. A die vicesimo quinto ad diem quadragesimum secundum, medium supplemento factore neurotrophico cerebro-derivato (BDNF; 20 ng ml⁻¹, Peprotech) et neurotrophino 3 (NT3; 20 ng ml⁻¹; Peprotech) dato, medii mutationibus alternis diebus factis.Die sexto in suspensione, sphaeroides neurales in medium neurale continentem Neurobasal-A (10888, Life Technologies), supplementum B-27 sine vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), et penicillinum translati sunt.и стрептомицин (1:100, Vitae Technologiae) и дополнены эпидермальным актором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и 2 (актором ростао ростао роста (EGF; 20 нг/мл; нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. et streptomycinum (1:100, Life Technologies) et supplemento factore epidermali crescentis (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) et factore fibroblasti crescentis 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) usque ad diem vicesimum quartum.A diebus vicesimo quinto ad quadragesimum secundum, factor neurotrophicus e cerebro derivatus (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) et neurotrophinum 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) medio additi sunt, medio alternis diebus mutato.6 neurobasal-A（10888，Vita Technologies）、不含维生素A B-27 补充剂（1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第246 neurobasal-a 10888 Vita Technologies） a b-27 12587 Vita Technologies Glutamax 1: 100 Vita TechNOGIS 1 20 ng ml-1 r & d Systems） 2 fgf2 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至第24天。 а 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, есна (12587, Vita Technologiae), GlutaMax (1:100, Vitae Technologiae), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Vitae Technologiae) с добавлениемстализованный стрептомицин (1:100, Vitae Technologiae) с добавлениемстализованный стрептомицин (1:100, Vitae Technologiae) с добавлениемстализованный стрептомицин (1:100, Vitae Technologiae) с добавлением стализованный (EGF; 20 нг л-1; R&D Systems) и актора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг л-1) 1; Die sexto, suspensiones neurosphaerarum ad supplementum translatae sunt continens neurobasalem-A (10888, Life Technologies), supplementum B-27 sine vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycinum penicillino-neutralizatum (1:100, Life Technologies) supplementatum cum factore crescentiae epidermalis (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) et factore crescentiae fibroblastarum 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) до 24-го дня. Systema R&D) usque ad diem vicesimum quartum.A diebus vicesimo quinto ad quadragesimum secundum, factor neurotrophicus e cerebro derivatus (BDNF; 20 ng ml⁻¹, Peprotech) et factor neurotrophicus 3 (NT3; 20 ng ml⁻¹, Peprotech) medio culturae alternis diebus additi sunt. Medium semel mutandum.A die 43 incipiens, hCO in medio neurobasali-A non supplementato (NM; 1088022, Thermo Fisher) conservatum est, medii mutatione singulis 4-6 diebus facta. Ad hCO ex cellulis hiPS sub condicionibus sine nutritore cultas obtinendum, cellulae hiPS cum Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ad 37°C per 7 minuta incubatae sunt, in cellulas singulas dissociatae, et in laminis AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) densitate 3 × 10⁶ cellularum singularum per puteum in medio Essential 8 supplementato inhibitore ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) sparsae sunt. Post horas XXIV, media in putelis pipetta sursum deorsumque in media continentia media Essential 6 (A1516401, Life Technologies) supplementata dorsomorphino (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) et SB-431542 (10 μM; 1614) immissa sunt. (Tocrida, ...). A diebus II ad VI, medium Essential 6 quotidie dorsomorphino et supplemento SB-431542 substitutum est. A die sexto, suspensiones neurosphaerarum in medium neurobasale translatae et ut supra descriptum est conservatae sunt.
Omnes curationes in animalibus peractae sunt secundum normas curae animalium a Commissione Administrativa Curae Animalium Laboratorii Universitatis Stanfordiensis (APLAC) probatas. Mures euthymici RNU (rnu/+) gravidi empti sunt (Charles River Laboratories) vel in domiciliis habitaverunt. Animalia in cyclo lucis et tenebrarum duodecim horarum, cibo et aqua ad libitum, servata sunt. Catuli muri nudi (FOXN1–/–) aetatis trium ad septem dierum per incrementum vibrissarum immaturarum ante mactationem identificati sunt. Catuli (mares et feminae) isoflurano 2-3% anesthetizati et in quadro stereotaxico positi sunt. Trepanatio cranii diametro circiter 2-3 mm supra S1 peracta est, servata integritate durae matris. Deinde acu 30-G (circiter 0.3 mm) paulo extra craniotomiam adhibita est ad duram matris perforandam. Tum HCO3 ad tenuem parafilm 3×3 cm applica et superfluum medium remove. Syringa Hamiltoniana, acum 23 G, 45°, affixa, hCO₂ leniter in extremum distalissimum acus trahe. Deinde syringam in antliam syringae, quae instrumento stereotaxico coniungitur, colloca. Tum cuspidem acus super foramen puncturatum 0.3 mm latum in dura matre (z = 0 mm) prius factum pone et syringam 1-2 mm (z = circiter –1.5 mm) coarta donec acus inter duram matrem A sit, densum sigillum formatur. Tum syringam ad centrum superficiei corticalis, ad z = -0.5 mm, attolle et hCO₂ ratione 1-2 µl per minutum iniice. Post injectionem hCO₂, acus ratione 0.2-0.5 mm per minutum retrahitur, cutis sutur, et catulus statim in pulvinar calidum ponitur donec plena convalescat. Quaedam animalia bilateraliter transplantata sunt.
Omnes curationes in animalibus secundum normas curae animalium ab Universitate Stanfordiensi (APLAC) probatas peractae sunt. Muribus (plus quam 60 diebus post transplantationem) anaesthesia 5% isoflurano inductis et anaesthesizatis 1-3% isoflurano per imaginationem. Ad visualizationem, scanner horizontalis foraminis active munitus 7 Teslae a Bruker (Bruker Corp.) cum impulsu gradiente International Electric Company (IECO), inserto gradiente munito diametro interno 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) adhibitum est utens AVANCE.III, facultatibus RF multi-spiralibus octo canalibus et multi-nucleis, et comitante suggestu Paravision 6.0.1. Registratio peracta est utens spira RF volumetrica active secouplata diametro interno 86 mm et spira RF quattuor canalibus cryo-refrigerata ad receptionem tantum. Turbo-RARE axialis bidimensionalis (tempus repetitionis = 2500 ms, tempus echo = 33 ms, 2 mediae) cum 16 captionibus segmentorum, crassitudine segmenti 0.6–0.8 mm, continens 256 × 256 exempla. Signa accepta sunt utens bobina volumetrica RF transceptoris quadratici cum diametro interno 2 cm (Rapid MR International, LLC). Denique, utere functionibus aestimationis superficiei Imaris (BitPlane) incorporatis ad reddendum 3D et analysin voluminis. Transplantatio prospera definita est ut ea in qua areae signi MRI continui ponderati T2 in hemisphaerio transplantato formatae sunt. Reiectio transplanti definita est ut transplantatio quae areas signi MRI continui ponderati T2 in hemisphaerio transplantato non produxit. t-hCO subcorticalis ab analysi subsequenti exclusa est.
Ad GCaMP6s in hCO stabile exprimendas ad delineationem calcii biphotonicam, cellulae hiPS infectae sunt cum pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, deinde antibiotica selecta sunt. Breviter, cellulae cum EDTA dissociatae et suspensae sunt in 1 ml medii Essential 8 ad densitatem circiter 300,000 cellularum in praesentia polybreni (5 μg/ml) et 15 μl virus. Deinde cellulae in suspensione incubatae sunt per 60 minuta et seminatae ad densitatem 50,000 cellularum per puteum. Post confluentiam, cellulae tractatae sunt cum 5-10 μg ml-1 puromycini per 5-10 dies vel donec coloniae stabiles apparuerunt. Infectio acuta hCO peracta est ut antea descripta5 cum quibusdam modificationibus. Breviter, transfer hCO diebus 30-45 in tubos microcentrifugae Eppendorf 1.5 ml continentes 100 µl medii nervosi. Deinde circiter 90 µl medii removentur, 3-6 µl lentivirorum alti tituli (a 0.5 x 10⁶ ad 1.2 x 10⁶) in tubum additur, et hCO₃ in incubatorem per 30 minuta transfertur. Tum 90-100 µl medii in singulos tubos adde et tubuli in incubatorem per noctem repone. Postero die, hCO₃ in medium nervorum recens in laminis humilis nexus transfertur. Post 7 dies, hCO₃ in laminas fundo vitreo 24 puteorum translatum est ad visualizationem et aestimationem qualitatis infectionis. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE et pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE a VectorBuilder generati sunt. Lentivirus in plurimis experimentis adhibetur quia in genoma hospitis integratum est, permittens expressionem geni nuntiatoris in stirpibus cellularum infectis. Ad observationem rabiem, diebus 30-45, hCO cum rabies-ΔG-eGFP et AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmidum #67528, Addgene) simul infectum est, per tres dies diligenter lotum, et in rattos in S1 transplantatum et in vivo per 7-14 dies conservatum.
Ad immunocytochemiam, animalia anesthetizata et transcardialiter PBS perfusa sunt, deinde paraformaldehydo 4% (PFA in PBS; Electron Microscopy Sciences). Cerebra in PFA 4% per duas horas vel per noctem ad 4°C fixa sunt, in saccharosa 30% in PBS per 48-72 horas cryopreservata, et in saccharosa 30%:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) in proportione 1:1 inclusa, et sectiones coronales ad 30 µm cryostato (Leica) utens factae sunt. Ad immunohistochemiam sectionum crassarum, animalia PBS perfusa sunt, et cerebrum dissectum et coronaliter sectum est ad 300-400 µm utens vibratomo (Leica) et sectiones PFA 4% per 30 minuta fixae sunt. Deinde cryosectiones vel sectiones crassae PBS ablutae, per unam horam ad temperaturam ambientem (10% sero asinino normali (NDS) et 0.3% Triton X-100 in PBS diluto) obstructae et solutione obstructiva ad 4°C obstructae sunt. – Incubatio Cryosectiones per noctem incubatae sunt et sectiones crassae per quinque dies incubatae. Anticorpora primaria adhibita fuerunt: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (mus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepus, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (pullus, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepus, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepus, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepus, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50); ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepus, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepus, 1:400; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam). Anticorpora primaria adhibita fuerunt: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (mus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepus, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (pullus, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepus, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepus, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepus, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50); ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepus, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepus, 1:400; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam). спользовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, . (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; G (кролик, 1:200; sc-338, анта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB. (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Primaria anticorpora adhibita erant: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (mus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepus, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pullus, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepus, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepus, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepus, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ...). ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepus, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrinum G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepus, 1:400; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abkam).NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819， Atlas RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）,1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:1000;NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1; 200；sc-338， Sancta Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819， Atlas RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems.Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepus, 1:400; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam).Primaria anticorpora adhibita fuerunt: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (mus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepus, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pullus, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepus, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepus, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepus, 1:200; HPA047819, Atlas anticorpus), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepus), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти -STEM121 (мышь, 1:200; abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepus, 1:400; ABN904, Millipore), et anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abkam).Sectiones deinde PBS ablutae et cum anticorpore secundario per horam unam temperatura ambiente (sectiones congelatae) vel per noctem ad 4°C (sectiones crassae) incubatae sunt. Anticorpus secundarium Alexa Fluor (Life Technologies) dilutum 1:1000 in solutione obstruente adhibitum est. Post ablutionem PBS, nuclei Hoechst 33258 (Life Technologies) visualizati sunt. Denique laminae in microscopio cum laminis vitreis (Fisher Scientific) utens Aquamount (Polysciences) positae sunt et in microscopio fluorescenti Keyence (BZ-X analyzer) vel microscopio confocali Leica TCS SP8 (Las-X) in imagine analysatae sunt. Imagines programmate ImageJ (Fiji) processae sunt. Ad quantificandam proportionem neuronorum humanorum in t-hCO et cortice murino, imagines rectangulares 387.5 μm latae in centro t-hCO, ad vel prope marginem corticis murini, captae sunt. Margines insitionis determinati sunt per aestimationem mutationum in pelluciditate textus, nucleorum HNA+, et/vel praesentiae autofluorescentiae textus. In unaquaque imagine, numerus totalis cellularum NeuN+ et HNA+ divisus est per numerum totalem cellularum NeuN+ in eadem area. Ut solum cellulae cum nucleis in plano imaginis numerentur, solum cellulae quae etiam Hoechst+ sunt in calculo includuntur. Duae imagines saltem 1 mm separatae media computatae sunt ad errorem statisticum reducendum.
Una hebdomade ante collectionem speciminis, animalia transplantata cum hCO₃ (fere octo mensibus differentiationis) in conclavi obscuro collocanda sunt, vibris tonsis ad stimulationem sensoriam minuendam. Nucleorum isolatio peracta est ut antea descriptum est, cum quibusdam modificationibus. Breviter, t-hCO₃ et hCO₃ deleta sunt per lysis cellularum detergente-mechanicam et trituram textuum vitreorum 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Nuclei crudi deinde percolati sunt utens filtro 40 µm et centrifugati ad 320 g per 10 minuta ad 4°C antequam gradientum densitatis saccharosi perficeretur. Post gradum centrifugationis (320 g per 20 min ad 4°C), specimina resuspensa sunt in 0.04% BSA/PBS cum additione 0.2 unitatum inhibitoris RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) et per filtrum fluxus 40 µm transmissa. Nuclei dissociati deinde in PBS continenti 0.02% BSA resuspensi et in frustulum Chromium Single Cell 3′ impositi sunt (recuperatio aestimata 8,000 cellularum per lineam). Bibliothecae snRNA-seq cum Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) paratae sunt. Bibliothecae snRNA-seq cum Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) paratae sunt. иблиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Bibliotheca & Gel Bead Kit v3 (10x Genomica). Bibliothecae snRNA-seq paratae sunt utens Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) snRNA-seq Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) иблиотеку snRNA-seq отовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Bibliotheca & Gel Bead Kit v3 (10x Genomica). Bibliotheca snRNA-seq parata est utens Chromium Single Cell 3′ GEM, Bibliotheca et Kit Gel Bead v3 (10x Genomics).Bibliothecae ex variis exemplaribus a societate Admera Health in NovaSeq S4 (Illumina) collectae et sequentiatae sunt.
Gradus expressionis genorum pro singulis codicibus nuclearibus putativis quantificati sunt utens fasciculo programmatis analytici 10x Genomics CellRanger (versione 6.1.2). Speciatim, lectiones comparatae sunt cum combinatione genomatum referentialium humanorum (GRCh38, Ensemble, versione 98) et rattorum (Rnor_6.0, Ensemble, versione 100) creatorum cum mandato "mkref" et utens "count" cum mandato "-include-introns=TRUE" ad quantitationem includendas, lectiones ad regiones intronum mappatas. Pro exemplaribus t-hCO, nuclei humani identificati sunt secundum requisitum conservativum ut saltem 95% omnium lectionum mappatarum genoma humano congruant. Omnes analyses subsequentes peractae sunt in serie codicum linearum filtrata e CellRanger producta, utens fasciculo R (versione 4.1.2) Seurat (versione 4.1.1)32.
Ut solum nuclei summae qualitatis in analysi subsequenti includerentur, processus iterativus filtrationis pro singulis speciminibus adhibitus est. Primo, nuclei inferioris qualitatis cum minus quam mille genis singularibus inventis et plus quam viginti centesimis mitochondriorum omnium identificantur et removentur. Deinde, matrix numeri genorum cruda per regressionem binomialem negativam regularizatam normalizata est, functione sctransform(vst.flavor="v2") utens, quae etiam 3000 gena variabilissima utens parametris praedefinitis identificavit. Reductio dimensionum in genis variabilibus superioribus per Analysin Principalium Componentium (PCA) cum parametris praedefinitis peracta est, dimensione dataset 30 utens (dims = 30 electus est secundum inspectionem visualem locorum genu et pro omnibus exemplis et analysibus collectionis usus est). Deinde plures circuitus iterativi coacervationis (resolutio = 1) perfecimus ad gena classificanda secundum numerum genorum abnormaliter humilem (medianam infra percentilem 10), numerum genorum mitochondrialium abnormaliter altum (medianam supra percentilem 95) ad cellulas putativas qualitatis inferioris identificandas et removendas. Coetus et/vel proportionem altam geminorum suspectorum utens fasciculo DoubletFinder33 identificati (punctum medium DoubletFinder supra percentilem 95). Exempla t-hCO (n=3) et exempla hCO (n=3) separatim integrata sunt utens functione IntegrateData cum parametris supradictis. Deinde... Alia series filtrationis qualitativae datorum integratorum, ut supra descriptum est, peracta est.
Post remotionem nucleorum inferioris qualitatis, congeries datorum integrata in greges (resolutione = 0.5) et ad usum visualizationis UMAP34 inclusa est. Gena indicatoria pro quolibet grege determinata sunt utens functione FindMarkers cum parametris praedefinitis ex datis expressionis genorum normalibus calculatis. Classes cellularum maiores identificamus et classificamus combinando congeries datorum corticalium referentialium fetalium et adultorum cum expressione genorum indicatoriorum 19,20,21,35 et annotatione. Praesertim, precursores circulantes identificati sunt per expressionem MKI67 et TOP2A. Greges progenitorum definiti sunt absentia transcriptionum mitoticarum, magna congruentia cum gregibus progenitorum glialium multipotentium descriptis in cortice fetali metaphasi tarda, et expressione EGFR et OLIG1. Vocabulum "astrocytus" utimur ad complures status differentiationis astrocytorum comprehendendos, a glia radiali tarda ad maturationem astrocytorum. Greges astrocytorum altos gradus SLC1A3 et AQP4 exprimunt et demonstratum est eos cum subtypis gliae radialis fetalis et/vel astrocytorum adultorum congruere. Cellulae optocytariae plexus (OPCs) PDGFRA et SOX10 exprimunt, dum oligodendrocyti indices myelinationis (MOG et MYRF) exprimunt. Neurona glutamatergica praesentia transcriptorum neuronalium (SYT1 et SNAP25), absentia indicum GABAergicorum (GAD2), et expressione NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, vel SATB2 identificata sunt. Neurona GluN ulterius in subclasses superiores (expressio SATB2 et amissio BCL11B) et profundas (expressio BCL11B) divisa sunt. Neurona sublaminae (SP) putativa indices SP18 notos, ut ST18 et SORCS1, praeter indices GluN profundos, exprimunt. Cellulae plexus choroideae similes per expressionem TTR identificatae sunt, et cellulae meningeae similes gena fibroblastis associata expresserunt et cellulas piales/vasculares copiae datorum referentialis mappaverunt.
Analysis differentialis expressionis genorum inter subclasses t-hCO et hCO peracta est utens methodo pseudo-batch nuper evoluta, in exemplaribus reproducta, utens fasciculo Libra R (versione 1.0.0) implementata. Speciatim, probationes log-likelihood edgeR (versione 3.36.0, fasciculo R) pro gregibus peractae sunt, summando numerum genorum in cellulis pro data classe cellularum pro qualibet replicatione exempli. Ad visualizationem mappae caloris, valores normalizati per million (CPM) computantur utens edgeR (functione cpm()) et ad magnitudinem adducuntur (ad medium = 0, deviationem standard = 1 assequendum). Analysis locupletationis Gene Ontology (GO) genorum GluN t-hCO significanter auctarum peracta est (valor P correctus a Benjamini-Hochberg minus quam 0.05 expressus in saltem 10% cellularum GluN t-hCO et augmento mutationis saltem duplo), peracta utens ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Applicatione ToppFun cum parametris praedefinitis utimur et valores P correctos a Benjamini-Hochberg, ex probationibus hypergeometricis adnotationibus GO computatos, referimus.
Ut greges nostros snRNA-seq cum gregibus cellularum annotatis ex studiis referentialibus RNA-seq primariorum unicellularium vel snRNA-seq adultorum 19,20,21,22 coniungamus, methodum integrationis parium datorum adhibuimus. Fluxum laboris normalizationis SCTransform (v2) in Seurat adhibuimus ad superpositiones gregum inter greges datorum integrandas et comparandas (eisdem parametris ut supra utentes). Singulae collectiones datorum temere in subsets divisæ sunt usque ad 500 cellulas vel nucleos per gregem originalem propter efficientiam computationalem. Simili methodo ut antea descripta, superpositio gregum definita est ut proportio cellularum vel nucleorum in quoque grege aggregato quae cum inscriptione gregis referentialis se tegebant. Ad GluNs ulterius classificandas, fluxum laboris TransferData Seurat pro datis subset GluN adhibuimus ad inscriptiones gregis referentialis cellulis nostris GluN assignandas.
Ad statum maturationis transcriptomi globalis exemplorum t-hCO et hCO aestimandum, exempla nostra pseudo-bulk cum BrainSpan/psychENCODE23 comparavimus, quod ex magna sequentia RNA constat, quae evolutionem cerebri humani complectitur. Analysis PCA (Analysis Cronica Post-Expressionem) in matrice expressionis genorum secundum exemplaria normalizata ex exemplis corticalibus decem hebdomades post conceptionem et postea, in 5567 genis (una cum nostris datis) quae antea ut activa in exemplis corticalibus BrainSpan identificata sunt (definita ut maior quam 50% in variantia evolutionis explicata per aetatem utens modello cubico)38 perfecimus. Praeterea, genes cum maioribus signis transcriptomis neuroevolutionis associatas derivavimus, utens factorizatione matricis non negativa, ut antea descriptum est. Pondera exemplorum calculata utens ratione factorizationis matricis non negativae in Figuris 5b cum datis expansis pro singulis quinque signis a Zhu et al. descriptis38 depinguntur. Iterum, indices transcriptionales ab activitate dependentes ex studiis antea editis derivati ​​sunt. Praesertim, ERG et LRG significanter auctae sunt in neuronibus glutamatergicis, per collectionem snRNA-seq corticis visualis muris post stimulationem visualem ex Tabula Supplementi 3 (Hrvatin et al.16) identificatis. LRG humanis locupletatae ex culturis cerebri humani fetalis KCl-activatis obtentae et 6 horis post stimulationem collectae sunt, et gena filtrata significanter aucta sunt in hominibus sed non in muribus (Tabula Supplementi 4). Analysis locupletationis gregis genorum utens his gregibus genorum peracta est utens probatione exacta Fisher unidirectionali.
Muribus isoflurano anesthetizandum, cerebra removenda sunt et in frigida (circiter 4°C) solutione oxygenata (95% O2 et 5% CO2) saccharosi collocanda sunt. Sectiones continentes: 234 mM saccharosum, 11 mM glucosum, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 et 0.5 mM CaCl2 (circiter 310 mOsm). Sectiones coronales cerebri muri (300–400 µm) t-hCO continentes vibratomo Leica VT1200 factae sunt, ut antea descriptum est39. Sectiones deinde in cameram sectionum cum oxygenatione continua temperaturae ambientis translatae sunt, continentem aCSF praeparatum ex: 10 mM glucoso, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 et 126 mM NaCl (298 mOsm), saltem 45 minutis ante notationem. Sectiones in camera immersa notatae sunt, ubi continue perfusae sunt aCSF (phiala 95% O2 et 5% CO2). Omnia data temperatura ambiente notata sunt. Neurona t-hCO terminata sunt pipetta vitrea borosilicata, solutione repleta continenti 127 mM gluconatem kalii, 8 mM NaCl, 4 mM magnesii ATP, 0.3 mM natrii GTP, 10 mM HEPES, et 0.6 mM EGTA, pH 7.2, solutione interna KOH (290 mOsm) accommodata. Ad recuperandum, biocytinum (0.2%) solutioni registrationis additum est.
Data acquisita sunt per amplificatorem MultiClamp 700B (Molecular Devices) et digitalizatorem Digidata 1550B (Molecular Devices), filtratione infra 2 kHz peracta, digitalizatione per 20 kHz facta, et analysi per Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). et functionibus MATLAB propriis consuetudinariis (Mathworks). Potentiale iuncturae per JPCalc calculatum est et inscriptiones ad valorem calculatum -14 mV accommodatae sunt. Operatio IV constat ex serie graduum currentis in gradibus 10-25 pA, a -250 ad 750 pA.
Thalamus, materia alba, et afferentia S1 in segmentis thalamocorticalibus electrice stimulata sunt durante inscriptione neuronorum hCO per patch-clamp, ut antea descriptum est. Breviter, cerebrum in mensa impressionis tridimensionalis ad angulum 10° inclinata positum est, et pars anterior cerebri ad angulum 35° secta est. Deinde cerebrum superficiei sectae adglutinatum et sectum est, axones thalamocorticales prominentes servatis. Electroda bipolaria tungsteni (0.5 MΩ) in secundo micromanipulatore imposita et strategice posita sunt ad quattuor regiones per cellulam (capsulam internam, materiam albam, S1 et hCO) stimulandas. Responsiones synapticas post stimulationem phasicam 300 µA ad 0.03–0.1 Hz nota.
Neurona hCO hChR2 exprimentia ad longitudinem undarum 480 nm activata sunt, et impulsus lucis a lucerna LED (Prizmatix) generati per obiectivum ×40 (0.9 NA; Olympus) applicati sunt ad expressionem hChR2 prope cellulas notandam. Diameter campi illuminati est circiter 0.5 mm et potentia totalis est 10-20 mW. Latitudo impulsus ad 10 ms constituta est, quae impulsui dato per experimentum discendi behavioralis respondet. Variae frequentiae stimulationis adhibitae sunt, ab 1 ad 20 Hz, sed solum primus impulsus seriei ad quantificationem adhibitus est. Intervalla inter series plerumque longiora sunt quam 30 s ad effectum in vias synapticas inhibitorias vel facilitantes minuendum. Ad explorandum num responsio hChR2 monosynaptica esset, TTX (1 μM) balneo applicuimus donec reactio EPSC evanesceret, et deinde 4-aminopyridinum (4-AP; 100 μM) applicuimus. Typice, responsio intra pauca minuta redit, cum mora paulo longiore inter accensionem lucis LED et generationem EPSC. NBQX (10 μM) adhibitum est ad explorandum utrum responsum a receptoribus AMPA impelleretur.
Sectiones acutae hCO₃ sicut antea descriptum est creatae sunt. Breviter, sectiones hCO₃ in agarose 4% inclusae et in cellulas continentes 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ et 10 mM d-(+)-glucosum translatae sunt. Sectiones ad 200–300 µm temperatura ambiente vibratore Leica VT1200 sectatae et in ASF temperatura ambiente conservatae sunt. Deinde, inscriptio patch-camp cellularum integrarum in sectionibus hCO₃ sub microscopio directo SliceScope (Scientifica) peracta est. Sectiones cum aCSF (95% O₂ et 5% CO₂) perfusae sunt et signa cellularum temperatura ambiente notata sunt. Neurona hCO₃ applicata sunt per pipettam vitream borosilicatam, solutione repleta continenti 127 mM gluconatem kalii, 8 mM NaCl, 4 mM magnesii ATP, 0.3 mM natrii GTP, 10 mM HEPES, et 0.6 mM EGTA, pH internum 7,2, KOH (osmolaritas 290) accommodatum. Ad recuperationem, 0.2% Biocytini solutioni internae adde.
Data acquisita sunt per Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) utens amplificatore MultiClamp 700B (Molecular Devices) et digitalizante Digidata 1550B (Molecular Devices), filtratione infra fluxum ad 2 kHz peracta, digitalizatione ad 20 kHz subiecta, et analysi per Clampfit (versionem 10.6) ad analysin, instrumenta molecularia) et functionibus MATLAB propriis (MATLAB 2019b, Mathworks). Potentiale iunctionis per JPCalc calculatum est et inscriptiones ad potentiale iunctionis calculatum -14 mV accommodatae sunt. Operatio IV constat ex serie graduum currentis in passibus 5-10 pA ab -50 ad 250 pA.
Ad reconstructionem morphologicam neuronorum compressorum, biocytinum 0.2% (Sigma-Aldrich) solutioni internae additum est. Cellulae post incisionem saltem per XV minuta praeparantur. Deinde pipetta lente per 1-2 minuta trahitur donec membrana registrata omnino obsignata sit. Secundum procedendi rationem physiologicam sectionum, sectiones per noctem ad 4°C in 4% PFA fixae sunt, cum PBS X3 lavatae, et cum DyLight 549 vel DyLight 405 (Vector Labs) streptavidino-coniugato 1:1000 dilutae sunt. Cellulae biocytino (2%; Sigma-Aldrich) repletae durante inscriptione patch clamp ad temperaturam ambientem per duas horas notatae sunt. Sectiones deinde in laminis microscopicis utens Aquamount (Thermo Scientific) impositae sunt et die sequenti in microscopio confocali Leica TCS SP8 utens obiectivo immersionis in oleo cum apertura numerica ×40 1.3, amplificatione ×0.9-1.0, xy visualizatae sunt. Frequentia sampling est circiter septem elementa pixella per micronem. Acervi Z intervallis 1 µm serialiter capti sunt, et mosaica acervi Z necnon sutura automatica Leica peracta sunt ut totam arborem dendriticam cuiusque neuronis tegerent. Neurona deinde semi-manuali modo per interfaciem neuTube 40 observata sunt et fasciculi SWC generati sunt. Fasciculi deinde in extensionem SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versio 2.1.0; NIH) immissi sunt.
Textus corticalis humanus consensu informato obtentus est secundum protocollum a Consilio Revisionis Institutionalis Universitatis Stanfordiensis approbatum. Duo exempla textus humani postpartum (tres et duodeviginti annorum) per resectionem corticis frontalis (gyri frontalis medii) obtenta sunt, ut pars chirurgiae pro epilepsia refractaria. Post resectionem, textus in NMDG-aCSF glaciali colligendum est, continente: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucosum, 2 mM thiourea, 5 mM natrii ascorbatum, 3 mM natrii pyruvatum, 0.5 mM CaCl24H2O et 10 mM MgSO47H2O. Titrandum ad pH 7.3-7.4 cum acido hydrochlorico concentrato. Textus intra triginta minuta ad laboratorium translati sunt et sectiones coronales secundum modum supra descriptum captae sunt.
Omnes curationes in animalibus secundum normas curae animalium ab Universitate Stanfordiensi (APLAC) probatas peractae sunt. Muribus (plus quam 140 diebus post transplantationem) anaesthesia 5% isoflurano inductum et intraoperative isoflurano 1-3% anesthetizatum est. Animalia in quadro stereotaxico (Kopf) posita sunt et buprenorphinum liberationis sustinae (SR) subcutanee iniectum est. Cranium expositum, purgatum est, et 3-5 cochleae osseae insertae sunt. Ad t-hCO2 dirigendum, coordinatas stereotaxicas ex imaginibus MRI generavimus. Foramen laminare in loco interessato perforatum est et fibrae (400 µm diametro, NA 0.48, Doric) 100 µm infra superficiem hCO2 demissae et cranio cemento dentali UV-curabili (Relyx) fixae sunt.
Inscriptiones photometricae fibrarum sicut antea descriptum est42 peractae sunt. Ad actionem spontaneam notandam, mures in cavea munda positi sunt et funiculus fibrae opticae 400 µm diametro (Doric), systemati acquisitionis datorum photometricorum fibrarum opticarum conexus, funiculo fibrae opticae implantato conexus est. Per decem minutarum inscriptionem actionis motoriae, animalia libere caveam explorare potuerunt. Ad actionem evocatam notandam, mures (plus quam 140 dies post transplantationem) 5% isoflurano ad inductionem et 1-3% isoflurano ad sustentationem anesthetizati sunt. Animal in quadro stereotactico (Kopf) collocatur et vibrissae in latere opposito t-hCO ad circiter 2 cm tondentur et per reticulum actuatori piezoelectrico (PI) conexum ducuntur. Funiculus fibrae opticae 400 µm (Doric) fibrae implantatae et systemati acquisitionis datorum conexus est. Vibrissae in latere opposito t-hCO₃ deinde quinquies (2 mm ad 20 Hz, 2 s per praesentationem) temporibus fortuitis ab impulsore piezoelectrico per spatium inscriptionis 20 minutorum deflectae sunt. Utere Arduino MATLAB Support Package ad tempus deflectionis cum codice MATLAB proprio moderandum. Eventa cum programmate acquisitionis datorum synchronizantur utens impulsibus logicae transistoris-transistoris (TTL).
Muribus (plus quam 140 diebus post transplantationem) anaesthesia isoflurano 5% inducta et intraoperative isoflurano 1-3% anesthetizata sunt. Animalia in quadro stereotaxico (Kopf) posita sunt, et buprenorphinum SR ac dexamethasonum subcutane iniecta sunt. Cranium expositum, purgatum est, et 3-5 cochleae osseae inseruntur. Ad t-hCO petendum, coordinatas stereotaxicas ex imaginibus MRI generavimus. Craniotomia circularis (circiter 1 cm in diametro) terebra celerrima directe super hCO transplantatum peracta est. Ubi os quam tenuissimum est, sed antequam per totum os terebretur, forcipe utendo discus pelvicus intactus reliquus removeatur ut t-hCO subiacens reveletur. Craniotomia solutione salina sterili repleta est, et tegmen vitreum et clavus capitis specialis cranio cemento dentali UV-curato (Relyx) adfixa sunt.
Imago biphotonica peracta est microscopio multiphotonico Bruker cum obiectivo Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Imago GCaMP6 peracta est ad 920 nm cum magnificatione 1.4x in plano z singulari et 8x media 7.5 fps. Muribus inductis est anesthesia isoflurano 5% et isoflurano 1-3% sustentatis. Muribus in apparatu capitis ad usum fabricato positis et sub lente collocatis. Registratio activitatis motoriae per 3 minuta obtenta est. Per 20 minuta registrationis, 50 inflationes (quaeque praesentatio 100 ms longa) temere ad pulvinum mystacis e regione t-hCO₂ immissae sunt, utens picospricer. Utere Arduino MATLAB Support Package ad tempus eruptionis moderandum cum codice MATLAB proprio. Eventa cum programmate acquisitionis datorum (PrairieView 5.5) utens pulsibus TTL synchroniza. Ad analysin, imagines correctae sunt pro motu xy utens correctione affine in programmate MoCo in Vitiis incepto. Extractio vestigiorum fluorescentium ex singulis cellulis utens CNMF-E43. Fluorescentia pro singulis regionibus desideratis extracta est, in curvas dF/F conversa, et deinde in z-scores conversa.
Muribus (plus quam 140 diebus post transplantationem) anaesthesia isoflurano 5% inducta et intraoperative isoflurano 1-3% anesthetizata sunt. Animalia in quadro stereotaxico (Kopf) posita sunt et buprenorphinum SR ac dexamethasonum subcutanee iniecta sunt. Vibrissae in latere opposito t-hCO ad circiter 2 cm sectae et per reticulum actuatori piezoelectrico connexum inductae sunt. Cranium expositum et purgatum est. Cochlea chalybis inoxidabilis cranio adfixa est. Ad t-hCO dirigendum, coordinatas stereotaxicas ex imaginibus MRI generavimus. Craniotomiam circularem (circiter 1 cm in diametro) cum terebra celerrima paulo supra t-hCO perage. Ubi os quam tenuissimum est, sed antequam totum os terebres, forcipe utere ad discum pelvicum integrum reliquum removendum ut t-hCO subiacens reveletur. Singulae cellulae per specilla siliconis altae densitatis 32 vel 64 canalium (Cambridge Neurotech) notatae sunt, cochleis ad terram connexis et amplificatoribus RHD (Intan) prae-amplificatis. Manipulatore adhibito, electroda ad locum destinatum per craniotomiam, quae solutione salina sterili repleta est, demittuntur. Collectio datorum frequentia 30 kHz peracta est, systemate acquisitionis datorum Open Ephys utens. Notatio tantum continuata est cum actionem spontaneam rhythmicam valde correlatam in plus quam 10 canalibus deprehendimus, quod suggerit electroda in insitione locata esse (ex datis imaginum calcii duorum photonorum fundata). Notatio decem minutorum actionis motoriae in cursu secundario obtenta est. Vibrissae in latere opposito t-hCO3 deinde 50 vicibus (2 mm ad 20 Hz, 2 s per praesentationem) temporibus fortuitis per impulsorem piezoelectricum per periodum notationis 20 minutorum deflectae sunt. Utente MATLAB Support Package pro Arduino (MATLAB 2019b), tempus deflectionis codice MATLAB proprio moderare. Impulsibus TTL utere ad eventa cum programmate acquisitionis datorum synchronizanda.
Ad experimenta signationis opticae, funiculus opticus 200 µm (Doric), cum lasere 473 nm (Omicron) coniunctus, cum fibra optica 200 µm super craniotomiam posita coniunctus est. Statim ante hoc, potentiam jumper ad 20 mW adapta. Manipulatore utere ad electrodos ad locum destinatum per craniotomiam, quae solutione salina sterili repleta est, demittendos. Initio inscriptionis, decem impulsus lucis 473 nm (frequentia 2 Hz, duratio impulsus 10 ms) emissi sunt. Cellulae photosensibiles definitae sunt ut cellulae quae responsum aculeatum intra 10 ms lucis in 70% vel plus experimentorum exhibuerunt.