Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro recentiore utaris (vel Modum Compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut sustentationem continuam praestemus, situm sine stylis et JavaScript reddemus.
Biopsia liquida (LB) est notio quae celeriter in usu biomedico popularitatem adipiscitur. Haec notio praecipue innititur detectioni fragmentorum DNA extracellularis circulantis (ccfDNA), quae plerumque ut fragmenta parva post mortem cellularum in variis textibus emittuntur. Parva pars horum fragmentorum ex textibus vel organismis externis (peregrinis) originem ducit. In opere praesenti, hanc notionem ad mytilos, species vigiles notas propter magnam capacitatem filtrationis aquae marinae, applicuimus. Utimur facultate mytilorum ut filtra naturalia agant ad fragmenta DNA environmentalia ex variis fontibus capienda, ut informationem de biodiversitate oecosystematum marinorum litoralium praebeamus. Nostrae conclusiones ostendunt haemolympham mytilor fragmenta DNA continere quae magnitudine valde variant, ab 1 ad 5 kb. Sequentiatio per shotgun ostendit magnum numerum fragmentorum DNA originis microbialis externae esse. Inter ea, fragmenta DNA a bacteriis, archaeis, et viris invenimus, inter quae virus notum est varietatem hospitum in oecosystematibus marinis litoralibus inventis inficere. In conclusione, studium nostrum demonstrat notionem LB ad mytili applicatam fontem cognitionis de diversitate microbiali in oecosystematibus marinis litoribus repraesentare, divitem sed adhuc inexploratum.
Impetus mutationis climatis (CC) in biodiversitatem oecosystematum marinorum est campus investigationis celeriter crescens. Calefactio globalis non solum graves tensiones physiologicas efficit, sed etiam limites evolutionarios stabilitatis thermalis organismorum marinorum impellit, habitaculum multarum specierum afficiens, eas ad condiciones magis favorabiles quaerendas impellens [1, 2]. Praeter biodiversitatem metazoorum afficiendum, CC delicatum aequilibrium interactionum hospitis-microbialium perturbat. Haec dysbacteriosis microbica gravem minam oecosystematibus marinis imponit, cum organismos marinos pathogenis infectiosis magis susceptibiles reddit [3, 4]. Creditur SS magnum momentum in mortibus massis agere, quod grave problema est pro administratione oecosystematum marinorum globalium [5, 6]. Haec res magni momenti est, datis impactibus oeconomicis, oecologicis et nutritionalibus multarum specierum marinarum. Hoc praesertim verum est de bivalvis in regionibus polaribus viventibus, ubi effectus CK immediatiores et graviores sunt [6, 7]. Re vera, bivalvi ut Mytilus spp. late adhibentur ad effectus CC in oecosystemata marina monitorandos. Haud mirum est numerum satis magnum bioindicerum ad eorum valetudinem monitorandam elaboratum esse, saepe utens methodo duplici, quae bioindices functionales in activitate enzymatica vel functionibus cellularibus, ut vitalitate cellularum et activitate phagocytica, fundat [8]. Hae methodi etiam includunt mensuram concentrationis indicatorum pressionis specificorum qui in textibus mollibus accumulantur post absorptionem magnarum quantitatum aquae marinae. Attamen, magna capacitas filtrationis et systema circulatorium semi-apertum bivalvarum occasionem praebent ad novos bioindices haemolymphae evolvendos utens notione biopsiae liquidae (LB), methodo simplici et minimaliter invasiva ad curationem aegrotorum. Exempla sanguinis [9, 10]. Quamquam plura genera molecularum circulantium in LB humano inveniri possunt, haec notio imprimis innititur analysi sequentiationis DNA fragmentorum DNA extracellularis circulantis (ccfDNA) in plasma. Re vera, praesentia DNA circulantis in plasma humano nota est ab medio saeculo XX [11], sed tantum annis recentibus adventus methodorum sequentiationis altae capacitatis ad diagnosim clinicam in ccfDNA fundatam duxit. Praesentia horum fragmentorum DNA circulantium partim debetur liberationi passivae DNA genomici (nuclearis et mitochondrialis) post mortem cellulae. In individuis sanis, concentratio ccfDNA plerumque humilis est (<10 ng/mL), sed quinquies vel decies augeri potest in aegrotis qui variis pathologiis laborant vel qui stressui subiecti sunt, quod laesionem textuum efficit. In individuis sanis, concentratio ccfDNA plerumque humilis est (<10 ng/mL), sed quinquies vel decies augeri potest in aegrotis qui variis pathologiis laborant vel qui stressui subiecti sunt, quod laesionem textuum efficit. доровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у полалчног с полалии с полалии повышаться или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. In hominibus sanis, concentratio cccDNA plerumque humilis est (<10 ng/mL), sed quinquies vel decies augeri potest in aegrotis cum variis pathologiis vel sub tensione quae ad laesionem textuum ducit.ccfDNA <10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10ccfdna <10 ng/ml） 5-10онцентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов сиентов сиентов сиентов сиентов 5-10 раз у пациентов патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Concentrationes ccfDNA plerumque humiles sunt (<10 ng/ml) in individuis sanis, sed quinquies ad decies augeri possunt in aegrotis cum variis pathologiis vel stresse, quod laesionem textuum efficit.Magnitudo fragmentorum ccfDNA late variat, sed plerumque a 150 ad 200 bp variat. [12]. Analysis ccfDNA autoderivati, id est, ccfDNA ex cellulis hospitis normalibus vel transformatis, adhiberi potest ad mutationes geneticas et epigeneticas in genoma nucleari et/vel mitochondriali praesentis detegendas, ita clinicis adiuvans ad eligendas therapias specificas moleculariter directas [13]. Attamen, ccfDNA ex fontibus externis obtineri potest, ut ccfDNA ex cellulis fetalibus durante graviditate vel ex organis transplantatis [14,15,16,17]. ccfDNA etiam fons informationis magni momenti est ad praesentiam acidorum nucleicorum agentis infectiosorum (externi) detegendam, quod detectionem non invasivam infectionum diffusarum non per culturas sanguinis identificatarum permittit, biopsiam invasivam textus infecti vitando [18]. Studia recentiora revera demonstraverunt sanguinem humanum fontem informationis divitem continere quae ad pathogena viralia et bacterialia identificanda adhiberi potest, et circiter 1% ccfDNA in plasma humano inventi originis externae esse [19]. Haec studia demonstrant biodiversitatem microbiomis circulantis organismi per analysin ccfDNA aestimari posse. Attamen, usque ad recentia tempora, haec notio solum in hominibus et, minore gradu, in aliis vertebratis adhibita est [20, 21].
In hoc scripto, potentiale LB utimur ad ccfDNA Aulacomyae atrae, speciei meridionalis quae vulgo in Insulis Kerguelen subantarcticis invenitur, insularum grege in summo planitie quae ante annos 35 miliones formata est, analysandum. Systemate experimentali in vitro utentes, invenimus fragmenta DNA in aqua marina celeriter a mytilis absorberi et in compartimentum haemolymphae intrare. Sequentiatio per shotgun demonstravit ccfDNA haemolymphae mytili fragmenta DNA suae originis et non suae originis continere, inter quae bacteria symbiotica et fragmenta DNA ex biomis typicis oecosystematum marinorum litoribus vulcanicis frigidis. ccfDNA haemolymphae etiam sequentias virales ex viris cum diversis ordinibus hospitum derivatas continet. Fragmenta DNA etiam ex animalibus multicellularibus, ut piscibus osseis, anemonibus marinis, algis et insectis, invenimus. In conclusione, studium nostrum demonstrat conceptum LB feliciter ad invertebrata marina applicari posse ad repertorium genomicum dives in oecosystematibus marinis generandum.
Adulti (55-70 mm longi) *Mytilus platensis* (*M. platensis*) et *Aulacomya atra* (*A. atra*) ex litoribus saxosis intertidalibus Portus Franciae (049°21.235 S, 070°13.490 E) collecti sunt. Alii mytili caerulei adulti (*Mytilus spp.*) a venditore commerciali (PEI Mussel King Inc., Insula Principis Eduardi, Canada) empti et in piscina aerata temperatura moderata (4°C) positi sunt, continenti 10-20 L salsamenti artificialis 32‰ (sal marinum artificiale Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Pro quolibet experimento, longitudo et pondus singularum concharum mensurata sunt.
Protocollum gratuitum et apertum huius programmatis in interreti praesto est (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Breviter, haemolympha LB ex musculis abductoribus collecta est ut descriptum est [22]. Haemolympha centrifugatione ad 1200×g per 3 minuta clarificata est, supernatans congelatum est (-20°C) usque ad usum. Ad isolationem et purificationem cfDNA, exempla (1.5-2.0 ml) liquefacta et tractata sunt utens instrumento NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) secundum instructiones fabricatoris. ccfDNA conservatum est ad -80°C usque ad ulteriorem analysin. In quibusdam experimentis, ccfDNA isolatum et purificatum est utens instrumento QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). DNA purificatum quantificatum est utens probatione PicoGreen normali. Distributio fragmentorum ccfDNA isolati per electrophoresin capillarem, bioanalysatore Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) et apparatu DNA High Sensitivity Kit utens, analysata est. Examen peractum est utens 1 µl exempli ccfDNA secundum instructiones fabricatoris.
Ad fragmenta haemolymphae ccfDNA sequenda, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) bibliothecas "shotgun" paravit utens apparatu Illumina DNA Mix apparatus Illumina MiSeq PE75. Adaptor ordinarius (BioO) adhibitus est. Fasciculi datorum crudorum ex NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 et SRR8924809) praesto sunt. Qualitas lectionis fundamentalis utens FastQC [23] aestimata est. Trimmomatic [24] ad adaptatores secandos et lectiones malae qualitatis adhibitus est. Lectiones "shotgun" cum finibus paribus FLASH in lectiones singulas longiores cum minima superpositione 20 bp iunctae sunt ad discrepantias vitandas [25]. Lectiones iunctae annotationes factae sunt cum BLASTN utens database taxonomiae NCBI bivalvi (valor e < 1e−3 et homologia 90%), et occultatio sequentiarum parvae complexitatis facta est utens DUST [26]. Lectiones iunctae annotationes factae sunt cum BLASTN utens database taxonomiae NCBI bivalvi (valor e < 1e−3 et homologia 90%), et occultatio sequentiarum parvae complexitatis facta est utens DUST [26]. единенные тения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием азы данных таксономии двустворчаовустворчаванием (оначение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с вполнено с никой Lectiones aggregatae annotatae sunt cum BLASTN utens indice taxonomiarum bivalvorum NCBI (valor e < 1e-3 et homologia 90%), et personatio sequentiarum parvae complexitatis per DUST [26] peracta est.NCBI e <1e-3 90% BLASTN PULVIS [26]ncbi <1e-3 90% pulvis [26] 掩蔽единенные тения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической аа данных давованием (оначение e<1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с овательностей сложности было выполнено [2. Lectiones aggregatae annotatae sunt cum BLASTN utens indice taxonomico bivalvorum NCBI (valor e < 1e-3 et homologia 90%), et personatio sequentiae complexitatis humilis peracta est utens DUST [26].Lectiones in duas partes divisae sunt: ​​ad series bivalvium pertinentes (hic lectiones propriae appellatae) et non pertinentes (lectiones non propriae). Duae partes separatim compositae sunt utens MEGAHIT ad contigas generandos [27]. Interea, distributio taxonomica lectionum microbiomatis alienigenarum classificata est utens Kraken2 [28] et graphice repraesentata est per diagramma circulare Krona in Galaxy [29, 30]. Optimi kmers determinati sunt esse kmers-59 ex experimentis nostris praeliminaribus. Contigia sui iuris deinde per congruentiam cum BLASTN (database NCBI bivalvorum, valor e < 1e−10 et 60% homologia) ad annotationem finalem identificata sunt. Contigia sui iuris deinde per congruentiam cum BLASTN (database NCBI bivalvorum, valor e < 1e−10 et 60% homologia) ad annotationem finalem identificata sunt. атем собственные контиги ли идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчлатых ое сопоставления с BLASTN (база данных двустворчлатых ое сопоставления с BLASTN (база данных двустворчлатых ое сопоставления с BLASTN (база данных двустворчлатых ое сопоставления <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Contigia sui iuris deinde per comparationem cum BLASTN (NCBI bivalve database, valor e <1e-10 et 60% homologia) ad annotationem finalem identificata sunt.BLASTN（双壳贝类NCBI e <1e-10 60%BLASTN（双壳贝类NCBI e <1e-10 60% атем ли идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопостанне контиги для окончательной аннотации путем сопоставленBIбаз с BL BLASTNBIа л. двустворчатых моллюсков, начение e<1e-10 и гомология 60%). Auto-contigs deinde ad annotationem finalem per comparationem cum BLASTN (NCBI bivalve database, valor e <1e-10 et 60% homologia) identificati sunt. Simul, contigae gregum non-sui cum BLASTN (nt NCBI database, valor e < 1e−10 et 60% homologia) annotatae sunt. Simul, contigae gregum non-sui cum BLASTN (nt NCBI database, valor e < 1e−10 et 60% homologia) annotatae sunt. араллельно чужеродные рупповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значениео %). Simul, contigae gregum externorum cum BLASTN (NT NCBI database, valor e <1e-10 et 60% homologia) annotatae sunt.BLASTN（nt NCBI e <1e-10 60%BLASTN（nt NCBI e <1e-10 60% араллельно контиги, не относящиеся к собственной руппе, были аннотированы с помощью BLASTN (бназа данных 1. и гомология 60%). Simul, contigae gregum non-sui cum BLASTN (nt NCBI database, valor e <1e-10 et 60% homologia) annotatae sunt. BLASTX etiam in contigibus non-automaticis peracta est, utens database NCBI proteinorum nr et RefSeq (valor e < 1e−10 et 60% homologia). BLASTX etiam in contigibus non-automaticis peracta est, utens database NCBI proteinorum nr et RefSeq (valor e < 1e−10 et 60% homologia). BLASTX также л проведен на несамостоятельных контигах с использованием аз данных елка nr 1 и RefSeq NCBI (знач-10 . гомология 60%). BLASTX etiam in contigibus non-automaticis peracta est, utens databases proteinorum nr et RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 et 60% homologia).nr RefSeq NCBI BLASTX（e <1e-10 60%nr RefSeq NCBI BLASTX（e <1e-10 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием аз данных белка nr и RefSeq NCBI (значенио 60%). BLASTX etiam in contigibus non-automaticis peracta est, utens databases proteinorum nr et RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 et 60% homologia).Greges BLASTN et BLASTX contigorum non-auto-contigos finales repraesentant (vide fasciculum supplementarium).
Initiatores ad PCR adhibiti in Tabula S1 enumerantur. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ad amplificanda gena ccfDNA destinata adhibita est. Hae condiciones reactionis adhibitae sunt: ​​denaturatio ad 95°C per 3 minuta, 95°C per 1 minutum, temperatura recoctionis statuta per 1 minutum, elongatio ad 72°C per 1 minutum, 35 cycli, et denique 72°C intra 10 minuta. Producta PCR separata sunt electrophoresi in gelis agarosi (1.5%) continentibus SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ad 95 V.
Mytili (Mytilus spp.) in 500 ml aquae marinae oxygenatae (32 PSU) per 24 horas ad 4°C acclimatati sunt. DNA plasmidicum continens insertum sequentiam cDNA humani galectin-7 (numerus accessionis NCBI L07769) encodans in ampullam additum est concentratione finali 190 μg/μl. Mytili sub iisdem condicionibus incubati sine additione DNA erant exemplar. Tertium receptaculum exemplare DNA sine mytilis continebat. Ad qualitatem DNA in aqua marina monitorandam, exempla aquae marinae (20 μl; tres repetitiones) ex unoquoque receptaculo tempore indicato sumpta sunt. Ad vestigationem DNA plasmidici, mytili LB temporibus indicatis collecti et per qPCR et ddPCR analysati sunt. Propter altum contentum salis aquae marinae, portiones in aqua qualitatis PCR (1:10) dilutae sunt ante omnes probationes PCR.
PCR guttularum digitalis (ddPCR) per protocollum BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada) peracta est. Adhibe figuram temperaturae ad temperaturam optimam determinandam (Tabula S1). Guttae generatae sunt per generatorem guttarum QX200 (BioRad). ddPCR hoc modo peracta est: 95°C per 5 min, 50 cycli 95°C per 30 s et data temperatura recoctionis per 1 min et 72°C per 30 s, 4°C per 5 min et 90°C intra 5 minuta. Numerus guttarum et reactionum positivarum (numerus exemplarium/µl) per lectorem guttarum QX200 (BioRad) mensus est. Exempla cum minus quam 10,000 guttis reiecta sunt. Formae exemplaris non omni tempore quo ddPCR currebatur peracta est.
Examen PCR quantitativum (qPCR) peractum est utens Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) et primeris specificis LGALS7. Omnes PCR quantitativae peractae sunt in 20 µl utens QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR incepta est cum incubatione 15 minutorum ad 95°C, deinde 40 cycli ad 95°C per 10 secunda et ad 60°C per 60 secunda cum una collectione datorum. Curvae liquefactionis generatae sunt utens mensuris successivis ad 95°C per 5 s, 65°C per 60 s, et 97°C ad finem qPCR. Quaeque qPCR triplicata peracta est, exceptis exemplaribus moderantibus.
Cum mytili ob altam filtrationis celeritatem noti sint, primum investigavimus num fragmenta DNA in aqua marina praesentia filtrare et retinere possent. Etiam interesse nobis erat num haec fragmenta in systemate lymphatico semi-aperto accumularentur. Hanc quaestionem experimentaliter solvimus, fatum fragmentorum DNA solubilium in piscinas mytilorum caeruleorum additorum investigando. Ad fragmentorum DNA investigationem faciliorem reddendam, DNA plasmidicum externum (non proprium) gen humanum galectin-7 continentem usi sumus. ddPCR fragmenta DNA plasmidici in aqua marina et mytilis investigat. Nostrae conclusiones ostendunt, si quantitas fragmentorum DNA in aqua marina per tempus (usque ad 7 dies) absentibus mytilibus relative constans maneret, tum in praesentia mytilorum hunc gradum fere omnino intra 8 horas evanuisse (Fig. 1a,b). Fragmenta DNA exogeni facile intra 15 minuta in liquido intravalvulari et haemolympha detecta sunt (Fig. 1c). Haec fragmenta adhuc usque ad 4 horas post expositionem detegi poterant. Haec activitas filtrandi respectu fragmentorum DNA comparabilis est activitati filtrandi bacteriorum et algarum [31]. Haec eventa suggerunt mytilos DNA alienum in suis liquidis compartimentis filtrare et accumulare posse.
Concentrationes relativae DNA plasmidi in aqua marina, praesentibus (A) vel absentibus (B) mytilorum, per ddPCR mensuratae. In A, eventus percentibus exprimuntur, marginibus quadratorum percentiles 75 et 25 repraesentantibus. Curva logarithmica aptata rubro colore ostenditur, et area griseo colore umbrosa intervallum fiduciae 95% repraesentat. In B, linea rubra medium et linea caerulea intervallum fiduciae 95% pro concentratione repraesentat. C Accumulatio DNA plasmidi in haemolympha et liquido valvulari mytilorum diversis temporibus post additionem DNA plasmidi. Eventus ut exemplaria absoluta detecta/mL (±SE) exhibentur.
Deinde, originem ccfDNA in mytilis ex stratis mytilorum in Insulis Kerguelen collectis investigavimus, insularum remotarum coetu cum limitata influentia anthropogenica. Hoc consilio, cccDNA ex haemolymphis mytilor isolatum et purificatum est methodis communiter ad purificandum cccDNA humanum adhibitis [32, 33]. Invenimus medias concentrationes ccfDNA haemolymphae in mytilis in ambitu microgrammatum humilium per ml haemolymphae esse (vide Tabulam S2, Informationes Supplementariae). Hic ambitus concentrationum multo maior est quam in hominibus sanis (nanogrammata humilia per millilitrum), sed in casibus raris, in aegris cancro, gradus ccfDNA ad aliquot microgrammata per millilitrum pervenire potest [34, 35]. Analysis distributionis magnitudinis ccfDNA haemolymphae ostendit haec fragmenta magnitudine magnopere variare, a 1000 bp ad 1000 bp usque ad 5000 bp (Fig. 2). Similia eventa consecuta sunt utens QIAamp Investigator Kit silice fundato, methodo vulgo in scientia forensi adhibita ad celeriter separandum et purificandum DNA genomicum ex exemplaribus DNA parvae concentrationis, incluso ccfDNA [36].
Electrophoregramma ccfDNA haemolymphae mytili repraesentativum. Extractum cum NucleoSnap Plasma Kit (summo) et QIAamp DNA Investigator Kit. Diagramma B violinis distributionem concentrationum ccfDNA haemolymphae (±SE) in mytilis ostendens. Lineae nigrae et rubrae quartile medianum, primum tertiumque respective repraesentant.
Circiter 1% ccfDNA in hominibus et primatibus fontem externum habet [21, 37]. Data ratione systematis circulatorii semi-aperti bivalvium, aquae marinae microbiis dives, et distributionis magnitudinis ccfDNA mytili, hypothesim fecimus ccfDNA haemolymphae mytili fortasse continere copiam divitem et diversam DNA microbialis. Ad hanc hypothesim probandam, ccfDNA haemolymphae ex exemplaribus Aulacomyae atrae ex Insulis Kerguelen collectis sequentiavimus, plus quam 10 miliones lectionum producentes, quarum 97.6% qualitatem probationis superaverunt. Lectiones deinde secundum fontes proprios et non proprios classificatae sunt, utens BLASTN et NCBI databases bivalvium (Fig. S1, Informationes Supplementariae).
In hominibus, et DNA nuclearis et mitochondrialis in sanguinem emitti potest [38]. Attamen, in hoc studio, non licuit DNA genomicum nucleare mytilorum accurate describere, cum genomum A. atrae nondum sequentiatum aut descriptum sit. Nihilominus, fragmenta ccfDNA originis nostrae identificare potuimus, bibliotheca bivalvi utentes (Fig. S2, Informationes Supplementariae). Praesentiam fragmentorum DNA originis nostrae etiam confirmavimus per amplificationem PCR directam illorum genorum A. atrae quae sequentiata sunt (Fig. 3). Similiter, cum genomum mitochondriale A. atrae in publicis databasibus praesto sit, indicia praesentiae fragmentorum ccfDNA mitochondrialis in haemolympha A. atrae inveniri possunt. Praesentia fragmentorum DNA mitochondrialis per amplificationem PCR confirmata est (Fig. 3).
Varia gena mitochondrialia in haemolympha *A. atrae* (puncta rubra – numerus inventarii: SRX5705969) et *M. platensis* (puncta caerulea – numerus inventarii: SRX5705968) per PCR amplificata praesens erant. Figura adaptata ex Breton et al., 2011 B. Amplificatio supernatantis haemolymphae ex *A. atra*. In charta FTA servatum. Utere perforatore 3 mm ad directe in tubum PCR continentem mixturam PCR addendum.
Ob abundantiam microbiorum in aqua marina, initio in descriptione sequentiarum DNA microbialium in haemolympha operam dedimus. Ad hoc faciendum, duabus diversis strategiis utimur. Prima strategia Kraken2, programmate classificationis sequentiarum algorithmo fundato, usus est, quod sequentias microbiales cum accuratione comparabili cum BLAST aliisque instrumentis [28] identificare potest. Plus quam 6719 lectiones originis bacterialis esse determinatae sunt, dum 124 et 64 ex archaeis et viris respective erant (Fig. 4). Fragmenta DNA bacterialia abundantissima erant Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), et Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Haec distributio cum studiis prioribus microbiomatis mytili caerulei marini congruit [39, 40]. Gammaproteobacteria classis principalis Proteobacteriarum (44%) erant, multas Vibrionales includentes (Fig. 4b). Methodus ddPCR praesentiam fragmentorum DNA Vibrio in ccfDNA haemolymphae A. atrae confirmavit (Fig. 4c) [41]. Ad plura de origine bacteriali ccfDNA obtinenda, methodus addita adhibita est (Fig. S2, Informationes Supplementariae). Hoc in casu, lectiones quae se imbricaverunt in lectiones pariatim congregatae sunt et vel propriae (bivalvae) vel non propriae originis, utens BLASTN et valore "e" 1e−3 necnon limine cum homologia >90%, classificatae sunt. Hoc in casu, lectiones quae se imbricaverunt in lectiones pariatim congregatae sunt et vel propriae (bivalvae) vel non propriae originis, utens BLASTN et valore "e" 1e−3 necnon limine cum homologia >90%, classificatae sunt. этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как тения с парными концами и были классифиц классифицироваствеироваствекароваствена (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3% ия отсечеоно In hoc casu, lectiones inter se imbricatae collectae sunt ut lectiones paria-terminatae et classificatae sunt ut nativae (bivalvae) vel non originales, utens BLASTN et valore "e" 1e-3 necnon limine cum homologia >90%.BLASTN 1e-3 e >90%flatu 1e-3 > XC% этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как тения с парными концами и классстифинния к (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием начений e BLASTN% и 1e-3ои> 90 о. Hoc in casu, lectiones inter se imbricatae collectae sunt ut lectiones pariae et classificatae ut propriae (bivalvae) vel non originales, utens valoribus e BLASTN et 1e-3 necnon limine homologiae >90%.Cum genoma *A. atrae* nondum sequentiatum sit, rationem assemblationis *de novo* programmatis assemblatoris *MEGAHIT Next Generation Sequencing* (NGS) adhibuimus. In summa, 147 188 contigs ut dependentes (bivalvi) originis identificati sunt. Hi contigs deinde cum valoribus *e* 1e-10 per BLASTN et BLASTX explosi sunt. Haec ratio nobis permisit ut 482 fragmenta non-bivalvia in ccfDNA *A. atrae* praesentia identificaremus. Plus quam dimidium (57%) horum fragmentorum DNA ex bacteriis obtenta sunt, praesertim ex symbiontibus branchialibus, inter quos symbionta sulfotrophica, et ex symbiontibus branchialibus *Solemya velum* (Fig. 5).
Abundantia relativa ad gradum typi. B Diversitas microbica duorum phylorum principalium (Firmicutes et Proteobacteria). Amplificatio repraesentativa ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenta geni 16S rRNA (caerulea) in tribus haemolymphis atrae.
In summa 482 contigorum collectorum analysata sunt. Descriptio generalis distributionis taxonomicae annotationum contigorum metagenomicorum (prokaryotarum et eukaryotarum). B Distributio accurata fragmentorum DNA bacterialium per BLASTN et BLASTX identificatorum.
Analysis Kraken2 etiam demonstravit ccfDNA mytili fragmenta DNA archaea continere, inter quae fragmenta DNA Euryarchaeotarum (65%), Crenarchaeotarum (24%), et Thaurmarchaeotarum (11%) (Fig. 6a). Praesentia fragmentorum DNA derivatorum ab Euryarchaeotis et Crenarchaeotis, antea in communitate microbiali mytilorum Californianorum inventa, non debet esse miranda [42]. Quamquam Euryarchaeota saepe cum condicionibus extremis coniungitur, nunc agnoscitur et Euryarchaeota et Crenarcheota inter prokaryotas frequentissimas in ambitu cryogenico marino esse [43, 44]. Praesentia microorganismorum methanogenicorum in mytilibus non est miranda, datis recentioribus relationibus de amplissimis effluxionibus methani ex effluxionibus fundi in Planitie Kerguelen [45] et possibili productione methani microbialis observata extra litus insularum Kerguelen [46].
Deinde attentio nostra ad lectiones ex viris DNA conversa est. Quantum scimus, hoc primum studium extra scopum contenti viralis in mytilis est. Ut expectatum est, fragmenta DNA bacteriophagorum (Caudoviralum) invenimus (Fig. 6b). Attamen, DNA virale frequentissimum ex phylo nucleocytovirorum, etiam noto ut virus DNA magnum cytoplasmicum nucleare (NCLDV), venit, quod genoma maximum omnium virorum habet. Intra hoc phylum, pleraeque sequentiae DNA ad familias Mimimidoviridae (58%) et Poxviridae (21%) pertinent, quarum hospites naturales vertebrata et arthropoda includunt, dum parva proportio harum sequentiarum DNA ad algas virologicas notas pertinet. Algas eukaryoticas marinas inficit. Sequentiae etiam ex viro Pandora obtentae sunt, viro gigante cum maxima magnitudine genomae omnium generum viralium notorum. Curiose, series hospitum qui virus infecti sunt, ut per sequentiationem ccfDNA haemolymphae determinatum est, relative magna erat (Figura S3, Informationes Supplementariae). Complectitur virus qui insecta ut Baculoviridae et Iridoviridae inficiunt, necnon virus qui amoebas, algas et vertebrata inficiunt. Invenimus etiam sequentias quae genoma Pithovirus sibericum congruunt. Pitovirus (etiam "virus zombie" appellati) primum e permafrost 30 000 annorum in Siberia isolati sunt [47]. Itaque, nostrae conclusiones congruunt cum relationibus prioribus quae ostendunt non omnes species modernas horum virus extinctas esse [48] et haec virus in remotis oecosystematibus marinis subarcticis praesentes esse posse.
Denique, exploravimus num fragmenta DNA ex aliis animalibus multicellularibus invenire possemus. In summa, 482 contigs externi per BLASTN et BLASTX cum bibliothecis nt, nr et RefSeq (genomicis et proteinicis) identificati sunt. Nostrae conclusiones ostendunt inter fragmenta externa ccfDNA animalium multicellularum DNA ossium osseorum praevalere (Fig. 5). Fragmenta DNA ex insectis et aliis speciebus etiam inventa sunt. Pars relative magna fragmentorum DNA nondum identificata est, fortasse propter subrepraesentationem magni numeri specierum marinarum in databasibus genomicis comparatis cum speciebus terrestribus [49].
In hoc scripto, notionem LB (Low Line) ad mytilos applicamus, argumentantes sequentiationem haemolymphae ccfDNA perspicuitatem in compositionem oecosystematum marinorum litorum praebere posse. Praesertim invenimus 1) haemolympham mytilor continere concentrationes relative altas (microgrammatum) fragmentorum DNA circulantium relative magnorum (~1-5 kb); 2) haec fragmenta DNA esse et independentia et non independentia; 3) Inter fontes externos horum fragmentorum DNA, invenimus DNA bacteriale, archaeale et virale, necnon DNA aliorum animalium multicellularum; 4) Accumulationem horum fragmentorum ccfDNA externorum in haemolympha celeriter fieri et ad actionem filtrationis internae mytilorum conferre. In conclusione, studium nostrum demonstrat notionem LB, quae hactenus praecipue in campo biomedicinae adhibita est, fontem cognitionis divitem sed inexploratum includere, qui ad melius intellegendam interactionem inter species vigilantes et ambitum earum adhiberi potest.
Praeter primates, isolatio ccfDNA in mammalibus, inter mures, canes, feles et equi, relata est [50, 51, 52]. Attamen, quantum scimus, studium nostrum primum est quod detectionem et sequentiationem ccfDNA in speciebus marinis cum systemate circulationis apertae refert. Haec proprietas anatomica et facultas filtrandi mytilorum, saltem ex parte, diversas magnitudines fragmentorum DNA circulantium comparatorum cum aliis speciebus explicare potest. In hominibus, pleraque fragmenta DNA in sanguine circulantia sunt fragmenta parva, magnitudine a 150 ad 200 bp variantes, cum culmine maximo 167 bp [34, 53]. Pars parva sed significativa fragmentorum DNA inter 300 et 500 bp magnitudine est, et circiter 5% longiora sunt quam 900 bp [54]. Huius distributionis magnitudinis causa est quod fons principalis ccfDNA in plasma ex morte cellulari oritur, sive ob necrosis cellularum haematopoieticarum circulantium in individuis sanis, sive ob apoptosin cellularum tumoris in aegris cancro laborantibus (quod DNA tumoris circulans appellatur, ctDNA). Distributio magnitudinis ccfDNA haemolymphae, quam in mytilis invenimus, a 1000 ad 5000 bp variabat, quod suggerit ccfDNA mytili originem diversam habere. Haec hypothesis logica est, cum mytili systema vasculare semi-apertum habeant et in ambitu aquatico marino vivant, ubi altae concentrationes DNA genomici microbici continentur. Re vera, experimenta nostra laboratorio DNA exogeno utens demonstraverunt mytilos fragmenta DNA in aqua marina accumulare; saltem post paucas horas post absorptionem cellularem degradantur et/vel liberantur et/vel in variis ordinationibus conservantur. Data raritate cellularum (tam prokaryoticarum quam eukaryoticarum), usus compartimentorum intravalvularium quantitatem ccfDNA ex fontibus propriis necnon ex fontibus externis minuet. Consideratis momenti immunitatis innatae bivalvium et magno numero phagocytorum circulantium, porro hypothesim fecimus etiam ccfDNA externum locupletari in phagocytis circulantibus qui DNA externum accumulant post ingestionem microorganismorum et/vel reliquiarum cellularum. Summa summarum, nostrae investigationes ostendunt ccfDNA haemolymphae bivalvis repositorium unicum informationis molecularis esse et earum statum ut species sentinellae confirmare.
Data nostra indicant sequentiationem et analysin fragmentorum ccfDNA haemolymphae e bacteriis derivatorum informationes claves de flora bacteriali hospitis et bacteriis in oecosystemate marino circumstanti praesentibus praebere posse. Technicae sequentiationis iaculatae sequentias bacterii commensalis *A. atra gill* revelaverunt, quae praetermissae fuissent si methodi identificationis 16S rRNA conventionales adhibitae essent, partim ob errorem bibliothecae referentialis. Re vera, usus noster datorum LB e *M. platensis* in eodem strato mytilorum apud Kerguelen collectorum demonstravit compositionem symbiontum bacterialium branchiis associatorum eandem esse pro ambabus speciebus mytilorum (Fig. S4, Informationes Supplementariae). Haec similitudo duorum mytilorum genetice diversorum compositionem communitatum bacterialium in depositis frigidis, sulfuratis et vulcanicis Kerguelen reflectere potest [55, 56, 57, 58]. Altiores gradus microorganismorum sulfur reducentium bene descripti sunt cum mytili ex regionibus litoralibus bioturbatis colliguntur [59], ut litus Portus Galliae. Alia possibilitas est ut flora mytilorum commensalis transmissione horizontali afficiatur [60, 61]. Plura investigationes necessariae sunt ad correlationem inter ambitum marinum, superficiem fundi marini, et compositionem bacteriorum symbioticorum in mytilibus determinandam. Hae investigationes adhuc peraguntur.
Longitudo et concentratio ccfDNA haemolymphae, facilitas purificationis, et qualitas alta ad celerem sequentiationem "shotgun" permittendam sunt inter multa commoda usus ccfDNA mytili ad biodiversitatem in oecosystematibus maritimis litoralibus aestimandam. Haec methodus praecipue efficax est ad communitates virales (viromata) in dato oecosystemate describendas [62, 63]. Dissimiles bacteriis, archaeis, et eukaryotis, genomata viralia gena phylogenetice conservata, ut sequentiae 16S, non continent. Nostrae conclusiones indicant biopsias liquidas ex speciebus indicatoribus, ut mytili, adhiberi posse ad identificandos numeros relative magnos fragmentorum viralium ccfDNA, quae hospites, qui typice oecosystemata marina litoralia inhabitant, inficere nota sunt. Hoc includit virus, qui protozoa, arthropoda, insecta, plantas, et virus bacteriales (e.g., bacteriophaga) inficere nota sunt. Similis distributio inventa est cum viroma ccfDNA haemolymphae mytilorum caeruleorum (M. platensis) in eodem strato mytilor apud Kerguelen collectorum examinavimus (Tabula S2, Informationes Supplementariae). Sequentiatio ccfDNA per "shotgun" sane nova methodus momentum capiens in studio viromatum hominum vel aliarum specierum est [21, 37, 64]. Haec methodus praecipue utilis est ad virus DNA duplicis filamenti investigandos, cum nullum gen singulare inter omnia virus DNA duplicis filamenti conservetur, classem virorum Baltimorae latissimam et diversam repraesentans [65]. Quamquam pleraque horum virorum inclassificata manent et virus ex parte omnino ignota mundi viralis includere possint [66], invenimus viromata et ordines hospitum mytilorum A. atrae et M. platensis inter duas species cadere, similiter (vide figuram S3, informationes additionales). Haec similitudo non est miranda, cum defectum selectivitatis in absorptione DNA in ambitu praesentis reflectere possit. Studia futura RNA purificata utentes nunc necessaria sunt ad viroma RNA describendum.
In studio nostro, processum accuratissimum adhibuimus, ex opere Kowarski et collegarum [37] adaptatum, qui deletionem bipartitam lectionum aggregatarum et contigorum ante et post aggregationem ccfDNA nativae adhibuerunt, quod magnam proportionem lectionum non mappatarum effecit. Quapropter, non excludere possumus aliquas ex his lectionibus non mappatis propriam originem habere posse, praesertim quia genoma referentiale pro hac specie mytili non habemus. Hoc processu etiam usi sumus quia de chimaeris inter lectiones proprias et non proprias et longitudinibus lectionum ab Illumina MiSeq PE75 generatis solliciti eramus. Alia causa plurimarum lectionum incognitarum est quod multae ex microbis marinis, praesertim in regionibus remotis ut Kerguelen, non annotatae sunt. Illumina MiSeq PE75 usi sumus, assumendo longitudines fragmentorum ccfDNA similes ccfDNA humanae. Pro studiis futuris, datis nostris resultatis ostendentibus ccfDNA haemolymphae lectiones longiores habere quam homines et/vel mammalia, commendamus ut suggestum sequentiationis aptius fragmentis ccfDNA longioribus utamur. Haec praxis multo faciliorem reddet identificationem plurium indicum ad analysin profundiorem. Obtinendo completam sequentiam genomatis nuclearis A. atra, quae nunc non praesto est, etiam discriminationem ccfDNA ex fontibus propriis et non propriis magnopere facilitabit. Cum investigatio nostra in possibilitate applicandi conceptum biopsiae liquidae ad mytilos intenta sit, speramus, cum hoc conceptum in investigationibus futuris adhibeatur, nova instrumenta et canales excogitatos iri ad potentiam huius methodi ad diversitatem microbialem mytilorum in oecosystemate marino studendam augendam.
Ut bioindice clinico non invasivo, gradus elevati ccfDNA in plasma humano cum variis morbis, laesione textuum, et condicionibus stressis coniunguntur [67,68,69]. Haec augmentatio cum emissione fragmentorum DNA suae originis post laesionem textuum coniungitur. Hanc quaestionem tractavimus utentes stresse caloris acuto, in quo mytili breviter temperaturae 30°C expositi sunt. Hanc analysin in tribus generibus mytilorum diversis in tribus experimentis independentibus perfecimus. Nihilominus, nullam mutationem in gradibus ccfDNA post stressem caloris acutum invenimus (vide Figuram S5, informationes additionales). Haec inventio fortasse explicat, saltem ex parte, quod mytili systema circulatorium semi-apertum habent et magnas quantitates DNA alieni propter actionem filtrationis magnam accumulant. Ex altera parte, mytili, sicut multi invertebrati, fortasse resistunt magis laesioni textuum stress inductae, ita limitantes emissionem ccfDNA in haemolympha sua [70, 71].
Ad hodiernum diem, analysis DNA biodiversitatis in oecosystematibus aquaticis praecipue in metabarcoding DNA environmental (eDNA) intenta est. Attamen, haec methodus plerumque limitata est in analysi biodiversitatis cum primers adhibentur. Usus sequentiationis shotgun limitationes PCR et selectionem praejudicatam primerorum circumvenit. Ita, quodammodo, nostra methodus propior est methodo sequentiationis eDNA Shotgun altae capacitatis nuper adhibitae, quae DNA fragmentatum directe sequentiare et fere omnes organismos analysare potest [72, 73]. Attamen, nonnullae res fundamentales sunt quae LB a methodis eDNA consuetis distinguunt. Scilicet, differentia principalis inter eDNA et LB est usus hospitum filtrationis naturalium. Usus specierum marinarum, ut spongiae et bivalvae (Dreisseina spp.), ut filtrum naturale ad eDNA studendum relatus est [74, 75]. Attamen, studium Dreissenae biopsias textuum usus est e quibus DNA extractum est. Analysis ccfDNA ex LB non requirit biopsiam textuum, apparatum specializatum et interdum sumptuosum, nec logisticam cum eDNA vel biopsia textuum coniunctam. Re vera, nuper nuntiavimus ccfDNA ex LB conservari et analyzari posse cum auxilio FTA sine catena frigoris servanda, quod magnum impedimentum est investigationibus in regionibus remotis [76]. Extractio ccfDNA ex biopsiis liquidis etiam simplex est et DNA altae qualitatis praebet ad sequentiationem rapidam et analysin PCR. Hoc magnum commodum est datis quibusdam limitationibus technicis cum analysi eDNA coniunctis [77]. Simplicitas et sumptus humilis methodi exemplificationis etiam aptissima est programmatibus monitorii diuturnis. Praeter facultatem filtrationis magnam, alia nota proprietas bivalvarum est compositio chemica mucopolysaccharidi muci eorum, quae absorptionem virorum promovet [78, 79]. Hoc bivalvas facit filtrum naturale ideale ad biodiversitatem et impulsum mutationis climatis in dato oecosystemate aquatico describendum. Quamquam praesentia fragmentorum DNA ab hospite derivatorum videri potest ut limitatio methodi comparata cum eDNA, sumptus coniunctus cum habendo tali ccfDNA nativo comparato cum eDNA simul intelligibilis est propter magnam copiam informationis praesto studiis sanitatis hospitis offset. Hoc includit praesentiam sequentiarum viralium in genoma hospitis integratarum. Hoc praecipue magni momenti est pro mytilis, data praesentia retrovirus leucaemicorum horizontaliter transmissorum in bivalvis [80, 81]. Aliud commodum LB prae eDNA est quod activitatem phagocyticam cellularum sanguinis circulantium in haemolympha, quae microorganismos (et eorum genoma) absorbet, utitur. Phagocytosis est functio principalis cellularum sanguinis in bivalvis [82]. Denique, methodus utitur magna capacitate filtratoria mytilorum (mediocris 1.5 l/h aquae marinae) et circulatione biduana, quae mixturam diversorum stratorum aquae marinae augent, permittens capturam eDNA heterologae. [83, 84]. Ergo, analysis ccfDNA mytilor est via interesting datis impactibus nutritionalibus, oeconomicis et environmentalibus mytilorum. Similiter analysi LB collecti ab hominibus, haec methodus etiam aperit possibilitatem mensurandi mutationes geneticas et epigeneticas in DNA hospitis in responsione ad substantias exogenas. Exempli gratia, technologiae sequentiationis tertiae generationis cogitari possunt ad analysin methylationis per totum genoma in ccfDNA nativo perficiendam utens sequentiatione nanoporum. Hic processus facilior fieri debet eo quod longitudo fragmentorum ccfDNA mytili idealiter compatibilis est cum suggestis sequentiationis longae lectionis quae permittunt analysin methylationis DNA per totum genoma ex uno cursu sequentiationis sine necessitate transformationum chemicarum.85,86] Haec possibilitas est interesting, cum demonstratum sit exemplaria methylationis DNA responsum ad accentum environmentalem reflectere et per multas generationes persistere. Ergo, perspicacitatem pretiosam praebere potest in mechanismos subiacentes qui responsum post expositionem ad mutationem climatis vel polluentes gubernant [87]. Attamen, usus LB non est sine limitationibus. Superfluum est dicere, hoc requirit praesentiam specierum indicatricum in oecosystemate. Ut supra dictum est, usus LB ad aestimandam biodiversitatem oecosystematis dati etiam requirit rigorosum ductum bioinformaticum qui in rationem ducit praesentiam fragmentorum DNA ex fonte. Aliud problema magnum est disponibilitas genomatum referentialium pro speciebus marinis. Speratur ut incepta qualia sunt Proiectum Genomatum Mammalium Marinorum et nuper institutum proiectum Fish10k [88] talem analysin in futuro faciliorem reddant. Applicatio notionis LB ad organismos marinos percolatores etiam congruit cum recentissimis progressibus in technologia sequentiationis, eam aptam reddens ad evolutionem biosignatorum multi-ohmicorum ad informationes importantes de salute habitaculorum marinorum in responsione ad accentus ambientales praebendas.
Data de sequentiatione genomatis in Archivo Lectionum Sequentiarum NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sub Bioprojectis SRR8924808 deposita sunt.
Brierley AS, Kingsford MJ. *Impactus mutationis climatis in vitam marinam et oecosystemata.* Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Considera effectus coniunctos mutationis climatis aliorumque factorum localium stressoriorum in ambitum marinum. General Scientific Environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Calendas Martias. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tolerantia caloris imminuta sub condicionibus repetitionis stressis caloris magnam mortalitatem aestivam mytilorum caeruleorum explicat. Relatio scientifica 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Mutationes recentes in frequentia, causis et extensione mortuum animalium. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Multiplices pathogens non-species speciales molem mortalitatis Pinnae nobilis causare possunt. Vitae. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. *De potentiali effectu mutationis climatis in morbos zoonoticos Arcticos.* Int J Circumpolar Health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mytili caerulei (Mytilus edulis spp.) ut organismi signales in monitorio pollutionis litoralis: recensio. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integratio biopsiae liquidae in curatione cancri. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maturatio biopsiae liquidae: Permittit DNA tumoris circulationem. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Acida nucleica in plasma humano. Acta conventuum subsidiariorum Societatis Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Novum munus DNA sine cellulis ut signum moleculare ad curationem cancri. Quantificatio analysis biomolaris. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia liquida in clinicam intrat – quaestiones implementationis et provocationes futurae. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW et alii. DNA fetalis in plasmate et sero materno adest. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Studium cursus graviditatis eiusque complicationum utens RNA extracellulari circulante in sanguine mulierum durante graviditate. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsia liquida: DNA sine cellulis donatoris ad laesiones allogeneicas in rene transplantato detegendas adhibetur. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Ioannes FC, Lo YM. Innovationes in diagnostica prenatali: sequentiatio genomi plasmatis materni. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Celeris detectio pathogenorum cum metagenomica novae generationis sequentiationis humorum corporis infectorum. Nat Medicine. 2021;27:115-24.