Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versio navigatoris utens quam subsidia limitata CSS habet.Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor).Interea, ut subsidia continua conservent, locum sine stylis et JavaScript reddemus.


Super praeteritum decennium, octo medicinae non cardiovasculares ab usu clinico abstractae sunt quia inter- vallum QT causant ducens ad arrhythmias ventriculi et mortem subitam.Sic maior necessitas est certae protegendi rationes preclinicae ad aestimandam efficaciam cardiovascularem et toxicitatem.Recens usus cardiomyocytes (hiPS-CM) in medicamento protegendo et toxicitate probatus partialem solutionem huius problematis praebet, pluripotens caulis pluripotentis usus.Nihilominus, immatura natura hiPS-CMs et defectus multiplicium complexionum cardiaci textus sunt maiores limites huius methodi.Recentes studiis docuerunt hanc limitationem partim superari posse adhibitis primis coxis-CM ad hydrogelos cardiacis formandos paulo post incursus contractuum spontanearum et paulatim crescentibus electricae stimulationis in tempore.Nihilominus hae microsses hiPS-CM maturae electrophysiologicae et contractiles proprietates myocardii adultorum carent.Praeterea cardiacus humanus structuram magis implicatam habet, constans ex heterogenea mixtura diversarum cellularum generum, incluso cellulis endothelialibus, neuronibus et fibroblastis stromalibus, cum certis instrumentis extracellulares matricis inter se connexis.Haec heterogeneitas incolarum non-cardiomyocytarum 11,12,13 in corde mammali adulto maius impedimentum est ad exemplar textus cardiaci utendi speciebus singulis cellulis.Maiores hae limitationes momentum praestant methodos explicandi ad culturam myocardialem integrum sub conditionibus physiologicis et pathologicis.
Excultae tenues (300 µm) sectiones cordis humani probaverunt exemplar esse spondeum myocardii humani integri.Haec methodus accessum praebet ad systema multicellulare 3D completum, cui similis cor hominis texti est.Egregie, Pitoulis et al.Etsi haec ratio accuratiorem in vitro cycli cardiacis exemplare concedit, multiplicitas et humilis methodi applicationem huius systematis limitat.Laboratorium nostrum nuper evolvit simpliciorem culturae rationem utens electrica excitanda et optimized medium ad conservandum viability sectionum corculi porcini et cor hominis usque ad VI dies XX, XXI.

Systema lineae aereae externae coniunctae per transductorem pressionis, quae effecit ut pressionem (± 1 mmHg) et tempus (± 1 mmHg) et tempus (Fig. 1c) accurate componat.
a Documentum sectionem affigere ad annulum sustinendum 7 mm, in caeruleo ostendens, intra culturam cubiculi de fabrica.Cubiculum culturae separatur ab aere thalamo tenui membrana silicone flexibili.Pone gasket inter singulas cameras ne scillam.In operculo machinae electrodes graphitas continet quae excitationem electricam praebent.b Repraesentatio Schematica de fabrica magna texti, duce anulo et anulo sustentationis.TEXTUS sectiones (brunneis) in fabrica oversised positae sunt cum duce anulo in rimam in margine exteriore fabricae positae.Duce utens, diligenter subsidium anulum linivit cum textu acrylico tenaces super sectionem texti cardiaci.c Graph ostendens tempus stimulationis electricae ut functionem pressurae cubiculi aeris moderante actuatore pneumatico programmabili (PPD).A notitia acquisitionis fabrica usus est ad synchronise electrica excitanda utens pressionis sensoriis.Cum pressio in cultura cubiculi ad limen statutum pervenit, signum pulsus ad C-PACE-EM mittitur ad excitationem electricam trigger.d Imago quatuor CTCMs in fascia incubatori posita.Quattuor strophas uni PPD per ambitum pneumaticum connexae sunt, et pressionis sensores inseruntur valvae hemostaticae monitori pressioni in ambitu pneumatico.Quisque fabrica habet sex TEXTUS sectiones.
Uno actuatore pneumatico utentes, 4 CTCM machinas regere poteramus, quarum singulae sectiones textus sex continere possent (fig. 1d).Aestimatio textus tracti ad 80 mm Hg.Artem.ostendit extensionem sectionum textuum 25% (Fig. 2b).Motus TEXTUS aestimata est utens consuetudo camera occasus (Supplementary Figura 1).Tractus et velocitas textus cardiaci in contractione et relaxatione constantes permanserunt per 12 dies in cultura (fig. 2f).Ejusdem Sectio Cordis (fig. 2f).
Vestigia repraesentativa pressionis cubiculi aeris, pressionis cubiculi fluidi, mensurarum motus textorum confirmant pressionis cubiculi mutationes fluidi pressionis cubiculi causando debitam motum texti segmenti.b Repraesentativa vestigia centi tracti (hyacinthini) sectionum textuum correspondentium ad tractum percentum (orange).c Mensuratus motus segmenti cardiaci stat cum celeritate motus mensurato.(d) Trajectoria repraesentativa motus cyclici (linea caerulea) et velocitas (linea aurantiaca punctata) in segmento cordis.e Quantitas temporis cycli (n = 19 pecias per coetus, ex diversis porcis), tempus contractionis (n = 19 crustae per coetus), tempus relaxationis (n = 19 crustae per coetus, a diversis porcis), motus texti (n = 25).Duo haliaeetus Discipulus t-test nullam notabilem differentiam in ullo parametro ostendit. (n = 8 sectiones/ coetus e porcorum diversorum, duo cercopitheci t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). Claustra erroris medium deviationis vexillum significant.
vocatur .3a).Hoc suggerit stimulationem et simulationem cycli cardiaci mechanicam posse sectiones texturae viable bis servare, quamdiu in systemate culturae stabili stabili praecedente relatum est.Artificiosa intelligentia (AI) compage utimur ad integritatem structuralem textus quantitatis 26 , imaginem profundam discendi pipelini fundatam in troponin-T fundatam et nexum maculante 43 ad automatice quantitatem integritatis structurae ac fluorescentiae cordis pecias secundum robur localizationis.Haec methodus utitur Network Convolutionale Neural (CNN) et alta doctrinarum compage ad integritatem structuram textus cardiacis certo quantitatis modo automated et non aequo animo, sicut in reference.Praeterea, trichroma Masson inficiens signanter inferiorem recipis fibrosis manifestavit sub condicionibus MS fibrosis comparatis ad condiciones moderandas in die 12 culturae (fig. 3 c).Dum CTCM viability cordium sectionum sectionum in die 12 auxit ad planum simile cum texti cordis recentis, non signanter emendavit integritatem membrorum membrorum cordis.
a Bar grapho indicat quantitatem MTT viability recentis cordis crustae (D0) vel cordis schedulae culturae per 12 dies vel in cultura stataria (D12 Ctrl) vel in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) pecias / globi e diversis porcis, uno modo ANOVA experimento conficitur, comparatur cum D12 Ctrl 0.000 #### p < 0.000 0.000 #### p 0.000). a Bar grapho indicat quantitatem MTT viability recentis cordis crustae (D0) vel cordis culturae peciarum per 12 dies vel in cultura stataria (D12 Ctrl) vel in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) pecias / coetus e diversis porcis, uno modo ANOVA experimento <0.0001 #### ptrl01 comparatus cum DP <0.0001 , comparatus cum ANOVA test <0.0001 ### ptrl01 comparatus est.histogrammum ostendit quantitatem viability sectionum cordis novarum MTT (D0) vel cultura cordis sectiones per 12 dies vel culturae statalis (D12 MC) vel CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 imperium). ) ), 12 (D12 MC) sectiones / coetus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio peragitur;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). a (D12 Ctrl) CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) (D0) 12 MTT )，来自不同猪的12 (D12 MC) /组，进行单向ANOVA 测试；与D0 #### p < 0.0001，与D12 Ctrl **p < 0.01)。 a (D12 Ctrl) CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) (D0) 12 (D12 MC) /组，进行单向ANOVA D0 #### p < 0.0001，与D12 Ctrl **p。)histogrammum ostendens quantitatem MTT viability in sectionibus cordis recentibus (D0) vel sectionibus cordis excultis per 12 dies in cultura stataria (D12 MC) vel CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 imperium)), 12 (D12 MC) sectiones / coetus e diversis porcis, uno modo ANOVA test;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 comparari D0, **p < 0.01 comparari D12 Ctrl).b Troponin-T (viridis), connexinum 43 (rubrum) et DAPI (hyacinthinum) in sectionibus cordis recentibus segregatis (D0) vel sectionibus cordis excultis sub conditionibus statis (Ctrl) vel CTCM conditionibus (MC) per 12 dies) imaginum immunofluorescentiae repraesentativae (scale blank = 100 µm). Quantitas integritatis structurae texti cardiaci per intelligentiam artificialem (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sectionum/congregationum e diversis porcis, uno modo ANOVA experimento peracto, #### p < 0.0001 vs. cum D0 et **** p < 0.0001 cum D12 Ctrl comparato). c Repraesentativae imagines (sinistrae) et quantitatis cordis sectiones cum trichromo Massonis maculatae (scale uncoated = 500 µm) (n = 10 sectiones/ globi e diversis porcis, uno modo ANOVA test peracto, #### p < 0 .0001 cum D0 et *** p < 0.001 comparati cum D12 Ctrl). c Repraesentativae imagines (reliquiae) et quantitatis cordis sectiones maculatae trichromatis Masson (blank = 500 µm) (n = 10 sectiones/ globi, singulae ex diverso porco, uno modo analysi dissidentes probatae ; ### # p < 0.0001 cum D0, *** p < 0.001 comparati D12 Ctrl).Claustra erroris medium deviationis vexillum significant.
Hypothesis nos addendo parvas moleculas ad culturam medium, cardiomyocytam integritatem emendari posse, ac fibrosis evolutionem reducere in cultura CTC.Hae parvae moleculae in culturas hiPSC-CM antea adhibitae sunt ad maturationem cardiomyocytarum augendo sarcomae longitudinis, T-tubuli, et velocitatis conductionis.Ideo probavimus utrum inclusio unius vel coniunctio ex istis parvis moleculis integritatem membrorum cordis emendare posset.Pro initiali protegendo, dosis singulorum compositorum delectus est secundum collectiones quae vulgo in exemplaribus culturae cellulis adhibitae sunt (1 μM Dex27, 100 nM T327, et 2.5 µM SB31).Post 12 dies culturae, coniunctio T3 et Dex consecuta est in optimal cardiomyocyte structurae integritate ac minimis fibrosis retexere (figurae 4 et 5).Praeter has intentiones duplices vel duplices T3 et Dex productas effeminatis effectibus comparatis normalibus concentrionibus (supplementary Fig. 6a, b).
Post initialem protegendorum comparatio capitis 4 culturae condicionum (Figura 4a): Ctrl: sectiones cordis excultae in nostra cultura supra descripta statice utentes medium nostrum optimized;20.21 TD: T3 et Ctrl s Mercurii Dex addatur;Interestingly, accessio T3 et Dex ad culturas transwellendas (TD) non provenit in notabili emendatione in viability ad condiciones Ctrl comparatae, significans munus magnum excitationis mechanicae in sectionibus cordis viabilitatis servandis.
Experimentalis schema depingens quattuor conditionibus culturae adhibitis aestimandis effectibus stimulationis mechanicae et T3/Dex suppletionis in medium per 12 dies. b Bar graphus ostendit quantitatem viability 12 dierum post culturam in omnibus 4 culturae conditionibus (Ctrl, TD, MC, MT) comparatis recentibus cordis pecias (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) crustae/coebus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio comparatur <01, ##<#**001 <01, ## <# **001 p<01, p . ad D12 Ctrl). b Bar graphus ostendit quantitatem viability 12 dierum post culturam in omnibus 4 culturae conditionibus (Ctrl, TD, MC, MT) comparatis recentibus cordis pecias (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) crustae/coebus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio comparatur <01, ##<#**001 <01, ## <# **001 p<01, p . ad D12 accidit). b истограмма показывает количественную оценку жизнеспособности ерез 12 дней после культикированиу во во иваниу во ния (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и/D12 MT) . свиней, проводится односторонний тест ANOVA;####p <0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p< 0,01 по сравнению). b Har graphus ostendit quantitatem viability ad 12 dies post culturam in omnibus 4 culturae conditionibus (coram, TD, MC, MT) comparatis recentibus cordis sectionibus (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, D12 MT), 12 (D12 MC) sectiones/ coetus e porcis diversis, uno modo ANOVA test, unum modo ANOVA < 0.0 # # # # p < . collatis ad D12 Ctrl). b 4 Ctrl、TD、MC MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) /组，进行单向ANOVA ####p <0.0001，### p < 0.001 D0 **p < 0.01 D12控制）。b 4 12 (D12 MC). b истограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению ср (свежамим0 ср(свежами0и) (свежами0 со) (свежами0и MT) ), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA;####p <0,0001, ##<, с сре/группа; авнению с контролем D12). b Histogrammum ostendens omnes 4 culturae conditiones (control, TD, MC et MT) recentibus cor sectionibus comparatas (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), e diversis porcis 12 (D12 MC) sectiones / coetus, una via ANOVA test, ####<p<0.0001, vs. ###0, **p<0.01 vs. c Histogrammum ostendit quantitatem glucosi fluxi 12 dierum post-culturae sub omnibus conditionibus culturae 4 (cogere, TD, MC et MT) comparatis sectionibus cordis recentibus (D0) (n = 6 sectionibus/coetibus e diversis porcis, uno modo ANOVA experimento peractis, ###p < 0.001 cum D0 et *** p < 0.001 comparari D12 Ctrl). f Heatmap sarcomerei genesis sectiones cordis excultas sub singulis conditionibus culturae.Claustra erroris medium deviationis vexillum significant.
Dependentia metabolica in transitum ab acido pingue ad glycolysin oxidationis notam est dedifferentiationis cardiomyocytae.Immaturi cardiomyocytae praesertim glucosi ad productionem ATP utuntur et mitochondria hypoplastic cum paucis cristae5,32 habent.Glucosa utilitas analyses ostendit sub MC et MT conditiones, utendo glucoso similem esse cum fibris 0 in die (Figura 4c).Quamquam exempla CtrlTab in glucosa utendo recenti textui comparata notabile incrementum demonstraverunt.Praeterea analysin contentionem demonstravit eliquatio gradus eaedem mansisse ac in recenti textu cordis per 12 dies sub conditionibus MT et MS (fig. 4d).
Ad altiorem ictum CTCM et T3/Dex in resolvendo in global transcriptionali landscape texti segmenti cardiaci, RNAseq in segmentis cardiacis ab omnibus quattuor diversis culturae conditionibus (supplementaria data 1).Interestingly, MT sectiones transcriptionales similes esse recenti pectoris texti, cum sola 16 differentialiter ex genesis 13,642 expressa.Tamen, ut antea demonstravimus, Ctrl crustae 1229 schedae differentialiter expressae sunt genesis post 10-12 dies in cultura (Fig. 4e).Haec notitia confirmata sunt per qRT-PCR cordis et genesis fibroblast (Supplementarium Fig. 7a-c).Interestingly, Ctrl sectiones demonstraverunt downregulationem genesis cardiaci et cycli cellae et activationem programmatum inflammationis gene.Haec data suggerunt dedifferentiationem, quae post diuturnum tempus culturam solet evenire, sub conditionibus MT omnino attenuari (Supplem. Fig. 8a, b).Diligens studium sarcomerei genes ostendit solum sub MT conditiones esse gena sarcomere descriptam (Fig. 4f) et alveum Ion (Fig. 9) conservatum, a suppressione sub Ctrl, TD et MC conservatum esse conditiones.Haec notitia demonstrant cum stimulatione mechanica et humorali (T3/Dex), segmenti cordis transcriptum similes recentibus pectoris pecias post 12 dies in cultura manere posse.

a Repraesentativa immunofluorescens imagines troponin-T (viridis), connexis 43 (rubrum), et DAPI (blue) in sectionibus cordis recentibus abstractis (D0) vel per 12 dies excultis in omnibus quatuor cordis sectione culturae conditionibus (scala bar = 100 µm).). Intelligentiae artificialis quantitas cordis texti integritatis structuralis (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) crustae/ coetus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio perficitur, #### p < 0.0001 comparati D0 et *p < 0,05, vel **** p < 0.0001 cum D12 Ctrl). Intelligentiae artificialis quantitas cordis texti integritatis structuralis (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) crustae/coetus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio exercetur, #### p < 0.0001 comparati D0 et *p < 0,05, vel **** p < 0.0001 cum D12 Ctrl). Quantitas structuralis integritatis cordis texti utens intellegentiae artificialis (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sectiones / coetus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio peractae, #### p < 0.0001 comparati D0 et *p < 0,05 vel **** p < 0.0001 ad D12 Ctrl).n = 7（D0 D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA #### p < 0.0001 D0 *p <0.05 ****p < 0.0001 与D12 Ctrln = 7 （d0 d12 ctrl） （5 d12 td 、 d12 mc d12 mt） ######### p < 0.0001 D0 *p < 0.0001 D0 *p <0.Quantitas integritatis structurae texti cardiaci utens intellegentiae artificialis in diversis porcis (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sectionibus/coetibus) uno modo ANOVA examinis;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 comparati D0 et *p < 0,05 vel **** p < 0.0001 D12 Ctrl comparati). b Repraesentativae imagines et quanti- ficatio pro pecias cordis labe maculatae Massoni trichromatis (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC), 9 (D12 MT) crustae / globus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio, efficitur, ###<p < 0.0001 comparati <D0, D0, Ctrl. b Repraesentativae imagines et quanti- ficatio pro pecias cordis labe maculatae Massoni trichromatis (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC), 9 (D12 MT) crustae / globus e diversis porcis, uno modo ANOVA probatio, efficitur, ###<p < 0.0001 comparati <D0, D0, Ctrl. b епрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромнб (крастанн краситанб ейка = 500 км) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняестся одностороне одностороне; нению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Repraesentativae imagines et quantitatis cordis sectiones trichromatis Massonis labe maculatae (scala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sectiones / globi e diversis porcis, uno modo ANOVA perpetrati, #### p < 0.0001 vs. D0 et ***p < 0.0001 vs. D0 et *** p < 0.0001 vs. b Masson =D µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001 D0 ***p < 0.001，或**** p < 0.0001 D12 Ctrl b masson = 500 µm） n = 10 d0 d12 accidit d12 td d12 mc） 9 d12 mt 切片 # 0.0001 D0 ***p < 0.001，或****p < 0.0001 D12 Ctrl b епрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромкам асмтная = асмтна = асмтна (асмтна) = (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / руппы, один- способ ANOVA; ###<##p < 0,0001 по июрапп, один- способ ANOVA;###<##p < 0,0001 по ию сраине. по сравнению с D12 Ctrl). b Repraesentativae imagines et quanti- ficatio sectionum cordis cum trichromate Massoni (scalarum bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sectiones e porcorum diversarum globi, una ANOVA methodo, #### p < 0.0001 cum D0, ***p < 0.0001 D0, ***p < 0.0001 comparati D0, ***p < 0.0001 vel D0, ***p < 0.0001 comparati sunt.Claustra erroris medium deviationis vexillum significant.
Demum, facultas CTC ad hypertrophiam cordis mimica hypertrophia aestimata est augendo protentum cardiac.In CTM, apicem aeris cubiculi pressio aucta ab 80 mmHg ad 80 mmHg.Artem.(Normal proten) ad CXL Mmhg es.(Fig. 6a).Hoc correspondet 32% incremento extensionis (Fig. 6b), quod antea ostensum est ut recipis tractus correspondentes sectionibus cordis requisitis ad sarcomerum longitudinis similem cum hypertrophia consequendam.Tractus et velocitas textus cardiaci in contractione et relaxatione constantes permanserunt in sex diebus culturae (fig. 6c).TEXTUS cardiacis ex MT conditionibus ordinariis tractus (MT (Normal)) vel ultra sex dies condiciones (MT (OS)) subiecta est.Iam post quattuor dies in cultura, biomarkis hypertrophicus NT-ProBNP signanter in medio sub MT (OS) condiciones MT (normales) conditiones comparatas elevatur (Fig. 7a).Praeterea, post sex dies culturae, magnitudo cellae in MT (OS) (Fig. 7b) insigniter aucta comparata cum sectionibus cordis MT (normalis).Praeterea NFATC4 translocatio nuclearis signanter aucta est in texturis extentis (Fig. 7c).Hi eventus ostendunt progressivum progressionis pathologicae retractationis post hyperdistensionem et conceptum sustinentes CTCM fabrica posse adhiberi ut suggestum ad studium extensionis cordis hypertrophiae inductae significationis.
Vestigia repraesentativa pressionis cubiculi aeris, pressionis cubiculi fluidi, mensurarum motus textorum confirmant pressionis cubiculi mutationes fluidi pressionis cubiculi causando debitam motum texti segmenti.b Proten Repraesentativas recipis et extendas curvas rate pro normaliter porrectas (orange) et sectiones texturas (blue) extendentes.c Bar graphi ostendens cyclum tempus (n = 19 pecias per coetus, ex diversis porcis), contractio temporis (n = 18-19 crustae per coetus, ex diversis porcis), relaxatio temporis (n = 19 pecias per coetus, ex diversis porcis) ) amplitudo motus texti (n = 14 crustae/ globi, ex porcis diversis), apicem systole velocitatis (n = 14 pecias// coetus, e diversis (n = 14) segmentis/ coetus, ex diversis (n = 14) pecias/ coetus, e diversis (n = 14 crustae/ coetus, ex diversis porcis), apicem velocitatis systolicae (n = 14 pecias/" coetus, e diversis (n = 14) pecias/ coetus, e diversis (n = 14 crustae/" coetus, ex diversis porci ) e diversis porcis ) Discipulus bilinguis biformis nullam differentiam in quolibet parametri ostendit significantem, significans hos parametros constantes per 6 dies culturae cum praetensione mansisse.Claustra erroris medium deviationis vexillum significant.
a Bar graphi quantitatis NT-ProBNP concentratio in cultura instrumentorum a cordis pecias excultas sub MT protentu normali (Norm) vel condiciones (n = 4 (D2 MTNorm) 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, et D4 MTOS) crustae/ coetus e porcorum diversorum, duo-modo ANOVA comparatur ad tractum normalem. a Bar graphi quantitatis NT-ProBNP concentratio in cultura instrumentorum ex cordis pecias excultas sub MT protentu normali (Norm) vel condiciones (OS) excedentes (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4 MTOS) crustae/ coetus e diversis porcis, Duo-modo ANOVA comparantur ad tractum normalem <0.Histogrammum quantitatis NT-ProBNP retrahitur in cultura medii a cordis squamulis excultis sub conditionibus normalium MT tractum (norm) vel superextentum (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, et D4).MTOS) crustae / coetus e diversis porcis, analyses duo factores variationis conficiuntur;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ad normalem tractum comparari). a (Norm) (OS) NT-ProBNP n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）。 Quantificatio intentionis NT-ProBNP in corde squamorum excultae sub MT protentu normali (Norm) vel conditiones (n = 4 (D2 MTNorm) 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) e diversis /组，可以双向方方发发动, cum normali extensione comparata, p < 0.01).histogrammum quantitatis NT-ProBNP concentuum in corde pecias excultas sub conditionibus normalium MT tractum (norm) vel superextentum (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) et D4 MTOS) crustae/ coetus e porcis diversis, analysi duo modo dissidentes;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ad normalem tractum comparari). b Repraesentativae imagines pro pecia cordis maculata troponin-T et WGA (sinistra) et quantitatis cellae quantitatis (dextrae) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellulae/ coetus e 10 diversis segmentis e diversis porcis, Discipulus t-test peragitur, **** p < 0.0001 ad tractum normalem comparatum). b Repraesentativae imagines pro segmentis cordis tinctis troponin-T et WGA (sinistra) et quantitatis cellae quantitatis (recte) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellulae/ coetus e 10 diversis segmentis e diversis porcis, Two- caudatus Discipulus t-test exercetur, **** p < 0.0001 ad tractum normalem comparatum). b епрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и (слева) и колиествеленого крааена (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- пироводится нахтьтовиней, два- пиркроводится нахтьтовиней, два- пироводится нахтьтовиней; p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Repraesentativae imagines sectionum cordis maculata troponin-T et AZP (sinistra) et quantitatis cellae quantitatis (recte) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellulae/ coetus e 10 diversis sectionibus e diversis porcis, biformi discipulorum t-test fiebat; **** p < 0.0001 ad contentionem normalem comparatus). b -T WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t ****p < 0.0001）。 b Repraesentativae imagines cordis crustae calcarein-T et WGA maculatae (sinistrae) et magnitudinum cellularum (rectum) (n = 330 (D6 MTOS), 369 e 10 diversis segmentis (D6 MTNorm)) Cellae/组，两方法有尾学生t test；conparatae cum normali extensione，**** p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Repraesentativae imagines cordis sectiones troponin-T et AZP maculatae (sinistrae) et quantitatis quantitatis cellulae (rectum) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) e 10 diversis sectionibus e diversis porcis) Cellulae/ coetus, criterium biformi studentis t;****p < 0.0001 ad normalem contentionem comparari). c Repraesentativae imagines in diem 0 et diem 6 MTOS cor sculi immunolabiles pro troponin-T et NFATC4 et quantitas translocationis NFATC4 ad nucleos CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) crustae/ coetus e porcis diversis, Duobus Discipulus t-test peragitur; * p < 0.05). c Repraesentativae imagines in diem 0 et diem 6 MTOS cor scissurae cor immunolabiles pro troponin-T et NFATC4 et quantitas translocationis NFATC4 ad nucleos CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pecias/globus e porcorum diversorum , Discipulus t-test per duos cercopithecos conficitur * p < 0,05). c репрезентативные изовражения длязов Сердца 0 и Срезов Сердца 0 и дней mtos, иля тропонина, т иля треечччсввеная оценк А транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = IV (D0), III (D6 MTOS) Срезов / Групний от от свиней, от от от от от свиней t критерий стьюдента, * p <0,05). c Repraesentativae imagines pro sectionibus cordis in 0 et 6 diebus MTOS, immunolabiles pro troponin-T et NFATC4, et quantitas translocationis NFATC4 in nucleo cellularum cavernarum (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pecias/globus e porcis diversis) duo caudati studentis t-test perfecerunt;*p < 0.05). c -T NFATC4 0 6 MTOS NFATC4 CM n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) /组, t *p < 0.05)。 c Repraesentativarum imagines calcanin-T et NFATC4 0天和第6天MTOS crustae cordis immunolae, et NFATC4 e diversis NFATC4 CM cellae nuclei quantitatis (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) /组, et *p < 0,05). c епрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-ена и NFA транслокации NFATC4 в дра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- востатый t-критерий Сть; c Repraesentativarum imagines MTOS cordis pecias ad diem 0 et 6 pro troponin-T et NFATC4 immunolabeling et quantitas translocationis NFATC4 in nucleo CM a diversis porcis (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pecias/globus, duo cercopitheci t -criterion studentium * p < 0.05).Claustra erroris medium ± vexillum digredior repraesentant.
Investigatio cardiovascularis translationalis requirit exempla cellularum quae accurate ambitum cardiaci exprimunt.In hoc studio, machina CTC evoluta est et insignita quae ultrathinas cordis sectiones movet.Systema CTCM physiologice synchronised stimulationis electromechanicae includit et T3 et Dex fluidum locupletandum.Cum sectiones cordis porcinae his factoribus patebant, eorum viability, integritas structuralis, actio metabolicae et expressio transcriptionalis manebat eadem ac in recenti cordis textu post dies 12 culturae.Praeterea nimia extensio textus cardiaci potest hypertrophiam cordis causari per hyperextensionem.Super, hi proventus munus criticum sustinent condiciones culturae physiologicae in phaenotypo normali cardiacae servando et suggestum medicamento protegendo praebent.
Plures factores ad meliorem partem conducunt ad efficiendum et superstes cardiomyocytarum.Harum factorum notissima se referunt ad interactiones intercellulares, (2) stimulationes electromechanicae, (3) factores humorales, et (4) subiecta metabolicae.Physiologicae cellae-ad-cellulae interactiones implicatae requirunt retiacula tria dimensiva multiplicium cellularum generum extracellularium matricis suffultae.Tales commercii cellulares multiplices difficiles sunt ad renovandum in vitro per co- culturam singularum generum cellularum, sed facile effici potest utens natura sectionum cordis organotypicarum.
Mechanica tractum et electrica stimulatio cardiomyocytarum critica sunt ad cardiacum phenotypum conservandum 33, 34,35.Dum stimulatio mechanica pro condicione et maturatione hiPSC-CM late adhibita est, plura studia elegantia nuper in cultura cordis segmentorum mechanica excitatione utentes oneratione uniaxiali sunt conati.Haec studia ostendunt onerationem mechanicam uniaxialem 2D effectum positivum habere in phaenotypo cordis in cultura.In his studiis, sectiones cordis vel distrahentes isometricis viribus 17, oneratisque auxotonicis linearibus fuerunt, vel cycli cardiaci recreati sunt utentes vi feedback transducentis et tensionis impellentes.Nihilominus hi modi textus uniaxiali utuntur sine optimizatione environmental extensionem, unde in suppressione plurium generum cardiacorum vel genesis superexpressio cum responsionibus abnormalibus tracti coniungitur.Hic CTC descriptus praebet stimulum 3D electromechanicum, qui cycli cardiaci naturalis imitatur secundum cyclum temporis et tractum physiologicum (25% tractum, 40% systolen, 60% diastole, et 72 per minutias verberat).Etsi haec sola excitatio mechanica tria dimensiva non sufficit ad integritatem textus conservandam, coniunctio humoralis et mechanica stimulationis utens T3/Dex requiritur ut textus viability, munus, et integritas satis servet.
Factores humorales magni ponderis partes agunt in phaenotypo adulti cordis modulando.Hoc in studiis HiPS-CM extulit in quibus T3 et Dex instrumentis culturae adiuncti sunt ad maturationem cellulam accelerandam.T3 influere possit amino acida, saccharum et calcium trans membranas cellularum 36 .Praeterea T3 promovet expressionem MHC-α et MHC-β et downregulationem, promovens formationem myofabri celeris vellicae in cardiomyocytis maturis comparatis cum myofibrils foetus CM vellicatio tardis.T3 defectus in aegris hypothyroideis resultat in amissione vinculorum myofibrillarorum et in rate reducta toni evolutionis 37 .Dex in receptoribus glucocorticoideis agit et ostensum est ad contractionem myocardialem augendam in cordibus sparsis perfusus;38 Haec emendatio ad effectum calcii depositi ingressu (SOCE) 39,40.Praeterea Dex receptoribus suis ligat, causans responsionem intracellularem latam, quae functionem immunem et inflammationem supprimit.
Eventus nostri indicant physicam excitationem mechanicam (MS) altiore culturae exhibito Ctrl comparato melioratam, sed viability, structuram integritatem et cordis expressionem per 12 dies in cultura neglexisse.Comparatus Ctrl, additamento T3 et Dex ad CTCM (MT) culturas viability emendavit et conservavit similes transcriptiones profile, structurae integritas, ac metabolicae actionis cum recenti cordis textu per 12 dies.Praeterea, moderante gradu extensionis texti, exemplar hypertrophiae cardiaci hyperextensiones effecerunt utens STM creatum est, illustrans versatilem systematis StCM.Animadvertendum est, quamvis cardiacam retexere et fibrosis plerumque integra organa involvere, quorum cellulae circulationes congruentes cytokinos ac phagocytosis et alia factores retexere possunt, cordis sectiones adhuc processus fibrotici in responsione ad accentus et trauma imitantur.in myofibroblasts.Hoc exemplum in segmento cardiacis antea aestimatum est.Animadvertendum est CTCM parametros posse modulari mutatione pressionis/electricae amplitudinis et frequentiae ad simulandas multas conditiones sicut tachycardia, bradycardia et subsidia circulatoria mechanica (cor expositae mechanicae).Hoc facit systema medium throughput pro medicamento temptationis.Facultas CTCM ad exemplar hypertrophiae nimiae inductae cardiacis viam sternit probandi hanc systema personali illico.Demum, praesens studium demonstrat extensum mechanicum et excitationem humoralem esse criticam ad culturam texturae cardiaci sectiones conservandam.
Etsi data hic proposita suadeant CCM esse valde promissum tribunal ad exemplar integrum myocardii, haec methodus culturae aliquas limitationes habet.Praecipua limitatio culturae CTCM est quod imponat continuas passiones dynamicas mechanicas in crustae, quae praecludit facultatem contractionum actuose monitor cardiaci in singulis cyclis.Praeterea, ob parvitatem sectionum cardiacarum (7 mm), facultas aestimandi munus systolicum extra systemata culturae utendi vi sensoriis traditis limitatur.In praesenti manuscripto, hanc limitationem ex parte superamus aestimando intentionem opticam tamquam signum contractilis functionis.Attamen haec limitatio ulteriorem laborem requiret et in futurum dirigi potest rationibus inducendis ad vigilantiam optical functionis crustae cordis in cultura, sicut destinata optica utentes calcii et colores sensitivos.Alia limitatio CTCM est quod exemplar operandi accentus physiologicam non manipulare (preload et postload).In CTCM, pressio in partes contrarias adducta est ut 25% physiologicum tractum in diastole (pleno tractum) et systole (longitudo contractionis in stimulatione electrica) in fibris amplissimis exprimeret.Haec limitatio in futurum CTC amovenda designa- tione congrua pressionis in cardiacis ab utraque parte et applicando accuratam pressionum voluminum relationes quae in cordis penetralibus occurrunt.
In hoc manuscripto elaboratum retexere relatum est limitatum ad signa hypertrophica hypertrophica mimicus.Hoc ergo exemplum adiuvare potest ad studium extensionis significationis hypertrophicae sine necessitate factorum humoralium vel neuralis (quae in hac systemate non sunt).Praeterea studiis opus est ad multiplicationem CTC augendam, exempli gratia, colendi cum cellulis immunibus, plasma humoralium factores circumeuntes, et innervatio cum co-culturatio cum cellulis neuronalibus possibilitates morborum cum CTCM formandi emendabit.
Terdecim porci in hoc studio adhibiti sunt.Omnes rationes animalis factae sunt secundum normas institutionales et ab Universitate Louisville Institutionis Animalis Curae et Usus Committee approbatae sunt.Arcus aortae coagmentatus erat et cor perfusus 1 L cardioplegia sterilium (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH usque ad 7.4); corda in glacie-frigida solutione cardioplegic conservata sunt donec ad labrum glaciei quod fieri solet <10 min. corda in glacie-frigida solutione cardioplegic conservata sunt donec ad labrum glaciei quod fieri solet <10 min. сердца ранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льнорию на льдена ти льдена ортировки corda in glacie-frigida solutione cardioplegic reposita erant donec onerariam ad officinam in glacie, quae plerumque <10 min.<10分钟。<10分钟。 ержите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 ин. Corda custodi in cardioplegia glaciei usque ad officinam in glacie, plerumque <10 min.
Instrumentum CTCM explicatum est in programmate solidiWorks consilio computatrum-auxilio (CAD) programmatis.Cubicula culturae, divisorium et cubicula aeris fiunt ex materia plastica acrylica CNC patet.Circulus 7mm diametri dorsi altae densitatis polyethylenae (HDPE) in centro factus est et sulcus o-anulus ad siliconem o-anulum ad media sub signandum adhibita accommodat.Tenuis membrana silica culturam cubiculi a lamina separatione separat.Membrana siliconis laser ex 0.02″ crassa silicone scheda secatur et duritiem 35A habet.Fundum et summum gasketes silicones sunt laser exsecti ex 1/16″ schedae siliconis crassae et duritiem 50A habent.316L Cochleae chalybeis immaculatae et nuces alae adhibentur ad clauum figendum et sigillum airtight creandum.
Dedicatum tabulae ambitus typis (PCB) destinatum ad systema C-PACE-EM integrandum.Machina Helvetica connector bases in PCB connectitur cum electrodes graphite per fila aeris patella et aenea 0-60 cochleis in electrodes conlatis.Tabula circuli impressa posita est in tegumento 3D typographi.
Instrumentum CTCM regitur per actuatorem pneumaticum programmabilem (PPD) qui pressuram circulatoriam moderatam creat similem cycli cardiaci.Cum pressio intra aethereum thalamum crescit, membrana silicone flexibilis sursum dilatatur, medium sub situ texti cogens.Area TEXTUS tunc erit extensio per hoc fluidum expulsionem, imitans expansionem cordis physiologicam in diastole.Ad apicem relaxationis stimulatio electrica per electrodes graphites applicata est, quae pressionem in aethere camera redegit et sectionum textuum contractionem effecit.Fistula intus est valvae hemostaticae cum sensore pressione ad pressionem aeris in systemate deprehendendo.Pressio sensoris pressionis sentientis applicatur ad collectorem laptop connexum.Hoc permittit continuam vigilantiam pressionis intra cubiculum gasi.Cum maxima pressione cubiculi perventum est (vexillum 80 mmHg, 140 mmHg OS), notitia acquisitionis machinam iussit mittere signum systematis C-PACE-EM ad signum voltage biphasici generandi pro 2 ms, ad 4 V statutum.
Cordis sectiones consecutae sunt et condiciones culturae in 6 puteis peractae sunt hoc modo: Messatum corda transferre ab translatione vasis in alveo frigoris (4° C.) cardioplegia.Ventriculus sinistrus cum lamina sterili semotus et in frusta 1—2 cm3 incisus.TEXTUS TEXTUS TEXTUS Stipitibus adnexis adminiculis cum texti adhaesivo appositis et in balinei texti microtomi vibrato continens solutionem Tyrodi et continenter oxygenatam (3 g/L 2,3-butanedionem monooximem (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucosum (1.86 g), 10 mM 1 M MgCl2 . Cl2 (1.8 ml 1 M solutio), usque ad 1 L ddH2O).Microtome vibrans incisum erat 300 µm pecias crassas in frequentia 80 Hz, vibrationis amplitudinis horizontalis 2 mm, ac rate antecedens 0.03 mm/s.TEXTUS balnei glaciei circumdatus est ut solutionem refrigeraret et siccus ad 4°C conservaretur.Transferre sectiones textus a loto microtomi ad incubationem balnei continentis solutionem Tyrode oxygenatae in glacie usque ad unam laminam culturae satis sectiones obtinentur.Ad culturas transwellendas, sectiones texturae sterilibus 6 mm latae subsidiis polyurethanis affixae sunt et in 6 ml medii optimizedis (199 mediae, 1x supplementi eius, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF alkalini et 2X antibiotico-antifungali).Electrica excitatio (10 V, frequentia 1.2 Hz) ad sectiones textus per C-Pace applicata est.Conditiones enim TD, recentes T3 et Dex in C nM et 1 μM additae sunt in utraque media mutatione.Medium satiatur oxygeni priusquam 3 vicibus in die repositum est.TEXTUS sectiones in incubatore excultae sunt 37°C et 5% CO2.
Ad culturas CTC, sectiones textorum positae sunt in more 3D typographo factae in catino Petri continens solutionem Tyrode mutationis.Cogitatus ordinatur ad augendam 25% areae anuli sustinentis magnitudinem segmenti cordis.Hoc fit ut sectiones cordis post translationem solutionis Tyrodi ad medium et in diastole non tendant.Utens gluten histoacrylico, sectiones 300 µm crassae in fulcro anulo 7 mm diametro figebantur.Post sectiones textuum ad anuli sustentationem applicata, sectiones textorum excessus abscinde et sectiones texturas adnexas in balneum Tyrodi solutionis glaciei (4°C) reducere, donec satis sectiones ad unam machinam paratae sint.Totum tempus processui omnium machinorum 2 horas non excedere debet.Post sectiones textuum sex cum subsidiis annulis affixae erant, machina CTC convenerunt.Cubiculum culturae CCM praerepletum est cum medio 21 ml pre-oxygenatum.Sectiones telae ad culturam camerae transferre et quaslibet bullas aereas cum pipette diligenter removere.TEXTUS deinde in foveam dirigitur et leniter in locum deprimitur.Denique pileum electrode pone in fabrica et fabrica ad incubatorem transfer.Coniunge tum CTC cum tubo aereo et systemate C-PACE-EM.Actus pneumaticus aperit et plectrum aerem aperit ctcm.Systema C-PACE-EM conformatum ad liberandum 4 V in 1.2 Hz in biphasico gressu pro 2 ms.Medium bis in die mutatum est et electrodes semel in die mutati sunt ad vitandam graphitarum collectionem in electrodes.Si opus est, sectiones textus possunt e puteis culturae suae amoveri, ut bullas aereas quaslibet sub eas labefactatas expellant.Pro conditionibus curationis MT, T3/Dex addita est nova mediae cuiusque mutationis cum 100 nM T3 et 1 μM Dex.Cogitationes CTC in incubatore excultae sunt 37°C et 5% CO2.
Ad trajectorias cordis crustae extentae obtinendas, ratio specialis camerae amplificata est.A camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iaponia) adhibitus est cum zoomo Navitar 7000 18-108mm lens tortor (Navitar, San Francisco, CA).Visualisatio facta est in cella temperie post reposito medio recenti medio.Camera ad 51° angulum sistitur et in visu per 30 tabulas secundae commemoratur.Primum, fons apertus programmatio (MUSCLEMOTION43) adhibita est cum Image-J ad motum cordis crustae quantitare.Persona adhibita MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) creata est ad regiones commodas definiendas ad pecias cordis pulsandas ad strepitum vitandum.Personae manually divisae ad omnes imagines in serie replo applicantur et ad obturaculum-in MUSCLEMOTION transierunt.Motus musculi mediocris intensio elementa in singulis artubus utitur ad eius motum relativum quantitatis artus.Data scripti sunt, percolantur et ad tempus cycli quantitare solebant et per cyclum cardiacum extensum perpendere.Scriptum video fuisse post-processum utens primi ordinis nulla-phase digitales colum.Ut texti tractum quantitare (cacumen-ad-apicum), analysin cacumen-ad-cacum fiebat ad distinguendum inter cacumina et canalia in signo memorato.Praeterea detrending conficitur utens 6 ordo polynomialis ad signum callitudinis tollendae.Programma codice in MATLAB elaboratum est ad motum textus globalis determinandam, tempus cycli, tempus relaxationis, tempus contractionis (Codice Programma supplementarium 44).
Ad analysin intendens, utens eisdem videos ad taxationem tractum mechanicum creatum, primum duas imagines motuum cacumina repraesentantes (summum (superiorem) et infimum (inferum) puncta motus) secundum programmatum MUSCLEMOTIONUM texuimus.Nos igitur regiones texturae divisae et formam algorithmi frondium texti segmentatis applicavimus (supplementary Fig. 2a).TEXTUS segmentatus tunc in decem subsurfaces divisus erat, et accentus in unaquaque superficie computabatur sequente aequatione: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, ubi Sup et Sdown sunt distantiae figurae a summis umbris et imis fabricae, respective (Fig. .2b).
Cordis sectiones in 4% paraformaldehyde fixae sunt pro 48 horis.Fibrae fixae in 10% et 20% sucrosae pro 1 h dehydratae sunt, deinde 30% sucrosae pernoctare.Sectiones tunc infixae sunt in optima compositione temperaturae sectione (OCT composita) et sensim in balneum isopentane/siccum glaciei concretum.Copia OCT cuneos emensus in -80 °C usque ad separationem.Praeparatae sunt labitur in sectiones cum 8 µm crassitudine.
OCT a sectionibus cordis removere, calefacere labitur in scandalum calefactivum ad 95 °C pro 5 min.Adde 1 ml PBS singulis labi et incubare pro 30 minutis ad cella temperiem, deinde sectiones permeare, Triton-X in PBS 0.1%% imponendo pro 15 minutis ad locus temperatus.Ad elementorum non specialium corpora ne ad sample ligandum, solutionem 1 ml 3% BSA ad labitur et incubant per 1 horae cella temperiei.Tunc remotum est BSA et labitur cum PBS ablutum est.Singula exempla cum pincello.Primaria elementorum (diluted 1:200 in 1% BSA) (connexio 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) et troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) super 90 minuta addita sunt, deinde secundaria (diluted 1:200 in 1% BSA) contra mus Alexa Fluor 488, #A. 6391) additis 90 minutae lotae 3 temporibus cum PBS Ad distinguendum scopum maculas a background, tantum anticorpus secundarium usus est ut imperium, denique DAPI labes nuclearis addita est et lapsus in vectashield (Vector Laboratories) positi et clavo nitorem signati. -x magnificatio) et Keyence microscopii cum 40x magnificatione.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ad 5 μg/ml in PBS adhibita est pro WGA tinguere et ad sectiones fixas per 30 minuta ad cella temperie applicata.Labes tunc lavabantur cum PBS et Sudan nigra addita singulis labi et per 30 minuta incubata.Labes deinde lavatae sunt cum PBS et vectashield medium embedding adiunctum est.Slides subjiciuntur in microscopio Keyence ad 40x magnificationem.
OCT remotum est ab exemplis ut supra dictum est.OCT amoto, immergunt solutionem lapsus in Bouin pernoctare.Labes tunc aqua decoctae pro 1 hora lavatae sunt et deinde in solutione acidi fuchsin Bibrich aloe per 10 minutas positae sunt.Tunc labitur cum aqua destillata abluta est et in solutione 5% phosphomolybdeni/5% acidi phosphotungstici per 10 minutas posita sunt.Sine lotis, protinus in solutionem aniline blue 15 minuta labitur.Tunc labitur aqua decocta abluta et in solutione acidi acetici 1% ad 2 minuta posita.Labitur siccata in 200 N ethanol et transfertur ad xylene.Labes maculatae subjiciuntur utentes microscopii Keyence cum objecto 10x.Recipis area fibrosis erat quanta usus programmatis Keyence Analyser.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), catalogue number V13154, secundum protocollum fabricae cum aliquibus modificationibus.Speciatim ferrum chirurgicum cum diametro 6 mm adhibebatur ut in analysi MTT quantitatis textus uniformis curaretur.Tela sigillatim in cisterna bracteae 12-bene bracteae quae MTT substratae secundum protocollum fabricae erant, patellae erant.Sectiones incubantur 37° C. per 3 horas et textus viva metabolisis MTT subiecta est ut compositum purpureum formatum formaret.Repone solutionem MTT cum 1 ml DMSO et incubare 37 °C pro 15 minuta ad extrahendam purpuram formazan sectiones cordis ex corde.Exemplaria diluta sunt 1:10 in DMSO in 96-patellae fundo bene perspicuo et colore purpureo intensio mensurato 570 um utens lamina Cytationi lectoris (BioTek).Lectiones ad pondus uniuscuiusque segmenti cordis ordinatae sunt.
Cordis segmentum media repositum est cum instrumentis continentibus 1 μCi/ml [5-3H]-glucosum (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pro glucose utendo primordium sicut ante dictum est.Post 4 horas incubationis, adde medium 100 µl ad tubum microcentrifugium apertum continens 100 µl 0.2 N HCl.Tum tubus in tubo scintillationis positus, continens 500 μl ipsius dH2O ad evaporationem [3H]2O per 72 horas ad 37°C.Tum microcentrifugium e tubo scintillationis remove et fluidum 10 ml scintillationis adde.Comites scintillationis fiebant utentes Tri-Carb 2900TR scintillationis liquidae analysris (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Glucosa utilitas tunc ratione habita ratione [5-3H] - glucose specificae operationis, aequilibrii incompleti et curriculi, dilutio [5-3H], ut glucosi distenta, et efficientiae scintillationis contrariae.Notitia ad sectiones cordis in mole normalized.
Post TEXTUS homogenizationis in Trizol, RNA a sectionibus cordis segregatus est utens Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 secundum protocollum fabricae.Praeparatio bibliothecae RNAsec, sequen- tio et analysis facta est hoc modo:
1 μg RNA in sample adhibita est ut materia incipiens ad bibliothecam RNA apparandam.Sequencing libraries generati sunt in NEBNext UltraTM RNA Library Praeparatio Kit ad Illumina (NEB, USA) sequentes commendationes fabricantis, et index codicibus additae sunt ad sequentia attributa pro singulis sample.Breviter, mRNA mundata est e tota RNA utens globulis magneticis cum oligonucleotide adnexis.Fragmentum fit per cationes divalentes ad caliditatem caliditatis in NEBNext Primo Strand Synthesis Reactionis Buffer (5X).Primum filum cDNA est summatim utens temere hexamer primers et M-MuLV transpositis transcriptas (RNase H-).Secundum litus cDNA est tunc summatim utens DNA polymerase I et RNase H. Reliquae imminentes ad fines retusos per actionem exonuclease/polymerasis convertuntur.Post adenylationem 3′ finis fragmenti DNA, adaptor NEBNext cum ansa derepta compages ei adnexa est ad hybridizationem praeparandam.Nam lectio cDNA fragmentorum praelata longitudine 150-200 bp.fragmenta bibliothecae ad XP systema AMPure adhibito (Beckman Coulter, Beverly, USA).Tum, 3 μl USUFRUCTUARIUS Enzyme (NEB, USA) magnitudine electae cDNA cum adaptatore adhibitum est per 15 minuta ad 37°C, ac deinde per 5 minuta ad 95°C ante PCR.PCR deinde adhibitis Phusion Archi-Fidelitatis DNA polymerasibus, universalibus PCR primariis, et Indice (X) primariis.Demum, PCR producta (AMPure XP systema) purificata est et bibliotheca qualis in systemate Agilente Bioanalyzer 2100 aestimata est.In bibliotheca cDNA tunc sequentia novaseq usus erat.Rudis imaginum imaginum ab Illumina conversus est ad rudis legit utens CASAVA Base Calling.Rudis notitia reponitur in FASTQ(fq) format files quae sequentia legunt et basi qualitates respondentes.HISAT2 eligere ut percolantur sequences inserere legit ad genoma Sscrofa11.1 referentia.In genere, HISAT2 sustinet genomas cuiuslibet magnitudinis, inter genomas maiores quam 4 miliarda bases, et valores defectus pluribus parametris ponuntur.Splicing legit ex RNA Seq data efficaciter aligned utens HISAT2, ratio celerrime in promptu habetur, eadem vel melius accuratione quam alia quavis methodo.
Copia transcriptorum expressio generum directe reflectit.Genera expressionis gradus per copiam transcriptorum (comitem sequentium) cum genome vel exons associati aestimantur.Numerus legit proportionalis est generum expressionis gradus, gene longitudinis et sequelae profunditatis.FPKM (fragmenta in mille basium paria transcriptorum per miliones basium paria) calculata sunt et P-valores expressionis differentialis in sarcina DESeq2 utentes determinatae sunt.Tunc falsam inventionis ratem (FDR) computavimus pro quolibet valore P utendi methodo9 Benjamini-Hochberg fundatae in R-functioni "p.adjust".
RNA a sectionibus cordis segregatus conversa est ad cDNA ad intentionem 200 ng/µl utens superScriptum IV Vilo Magistri e Thermo commiscens (Thermo, cat. no. 11756050).Quantitatis RT-PCR fiebat utens an Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-plateae reactionis perspicuae (Thermo, cat. no. 4483319) et adhaesiva optica microamp (Thermo, cat. no. 4311971).Reactio mixtura ex 5 µl Taqman Fast Provectus Magister misce (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer et 3.5 µl H2O per bene mixta.Vexillum qPCR cyclos currebant et CT valores mensi sunt utens Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR instrumenti (384-bene moduli; product # A28135).Taqman primers empti sunt a Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss0100950348_mH), GATA1 (Ss0100950348_m1), CYGB u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Valores CT omnium exemplarium normales sunt ad generum domesticam GAPDH.
Media emissio NT-ProBNP aestimata est utens ornamentum ProBNP (sus) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) secundum protocollum fabricae.Breviter 250 µl singulorum specimen et regulam singulis bene duplicatis additae sunt.Statim, addito sample, singulis bene 50 µl Assay Reagenti A adde.Leniter excutite laminam et signaculum sigilli.Tunc tabulae 37°C pro 1 hora incubatae sunt.Tunc solutionem aspirate et puteos 4 vicibus abluere cum solutione 350 µl 1X lava, incubant solutionem lavacri pro 1-2 minuta singulis diebus.Deinde adde 100 µl de Assay Reagenti B per bene et signaculum cum lamina obsignato.Tabula sensim agitata et incubata 37°C per 30 minuta.Aspira solutionem et puteos lavare 5 vicibus cum 350 µl solutione 1X lava.90 µl solutionis subiectae cuique bene ac bracteae signare adde.Incubant laminam apud 37°C pro 10-20 minuta.Singulis bene solutionem adde 50 µl.Patella statim mensurata est utens bractea Cytation (BioTek) lectori ad 450 um.
Potestas analyses factae sunt ad eligendam quantitates coetus quibus providebit >80% potestatem deprehendendi 10% absolutam mutationem in parametro cum 5% Type I errorum rate. Potestas analyses factae sunt ad eligendam quantitates coetus quibus providebit >80% potestatem deprehendendi 10% absolutam mutationem in parametro cum 5% Type I errorum rate. нализ ощности был выполнен для выбора размеров рупп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружаенипенаружаинитео% оности для обнаружаинипенаружаинитееспеат >80% мощности для обнаружаенитенаружаините. араметра с 5% частотой ошибок типа I. Analysis potestas facta est ut magnitudinum coetus eligeret quae praeberet >80% potestatem ad deprehendere 10% absolutam moduli mutationem cum 5% Type I errorum rate.> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы_2я> LXXX% Мощности дло длсолюуения X% длсолютее дымо енения параметров и V% частооо Ошибок типа I. Analysis potentia facta est ad eligendam quantitatem globi quae provideret >80% potestatem ad detegendam 10% absolutam moduli mutationem et 5% typus I erroris rate.TEXTUS sectiones ante experimentum passim selectae sunt.Omnes analyses erant condiciones caecae et exemplaria tantum decocta sunt postquam omnia enucleata sunt.GraphPad Prisma programmatis (San Diego, CA) adhibitus est ad omnes analyses statisticas perficiendas. Pro omnibus statisticis, p-valoribus, valoribus significantibus <0.05. Omnes enim statisticae, p-valores significantes aestimatae sunt in valoribus <0.05. ля всей статистики p-значения считались начимыми при начениях <0.05. Omnes enim statisticae, p-valores significantes aestimatae sunt in valoribus <0.05.p <0.05p <0.05 ля всей статистики p-значения считались начимыми при начениях <0.05. Omnes enim statisticae, p-valores significantes aestimatae sunt in valoribus <0.05.Duo cercopitheci studentis test fiebat in notitia cum sola 2 comparationibus.Uno modo vel altero ANOVA inter plures circulos significationem determinare solebat.Cum post hoc probationes faciendo, correctio Tukey ad rationes multiplices comparativas applicata est.RNAsec notitia speciales statisticas habet considerationes cum FDR computando et p.adjuste descriptos in sectione Methodorum.
Pro maiori investigatione de consilio, naturam Research Report abstractam cum hoc articulo coniunctam videre.