Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert Ënnerstëtzung fir CSS.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierten Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript weisen.
Mënschlech GUT Morphogenesis etabléiert crypt-villus Fonctiounen vun 3D epithelial microarchitektur a raimlech Organisatioun. Dës eenzegaarteg Struktur ass néideg GUT homeostasis ze erhalen vun der Stammzellenfuerschung Nisch an der basal Krypta aus exogenous microbial antigens an hir metabolites schützen. Ating 3D epithelial structures is crucial for the construction of in vitro gut models.Notably, the organic mimetic gut-on-a-chip can induce spontane 3D morphogenesis of the intestinal epithelium with enhanced physiological functions and biomechanics.Here, we provide a reproducible protocol induce embedded Hybrid Chip.We beschreiwen detailléiert Methoden fir Apparat fabrication, culturing vun Caco-2 oder intestinal organoid epithelial Zellen an konventionell Astellungen wéi och op engem microfluidic Plattform, Aféierungs- vun 3D morphogenesis, an characterization vun etabléierten 3D epithelia benotzt Multiple Imaging Modalitéite .This Protokoll vun Flux erreechend regeneréiert gutatorieller fléissendem vilateral Funktioun regeneréiert d'Vitalitéit. tro morphogenesis Method beschäftegt physiologesch relevant Schéier Stress a mechanesch Motioun a verlaangt keng komplex Zell Ingenieur oder Manipulatioun, déi aner bestehend Techniken outperform kann. Mir virstellen, datt eis proposéiert Protokoll breet Implikatioune fir d'biomedizinesch Fuerschung Communautéit hunn kéint, déi eng Method 3D intestinal epithelial Schichten ze regeneréieren in vitro fir biomedizinesch an pharmazeuteschen, Applikatioun.
Experimenter weisen datt intestinal epithelial Caco-2 Zellen, déi an Darm-on-a-Chip1,2,3,4,5 oder bilayer mikrofluideschen Apparater6,7 kultivéiert sinn, spontan 3D Morphogenese in vitro erlabe kënnen ouni e kloert Verständnis vum ënnerierdesche Mechanismus. Thelial Morphogenesis in vitro, déi duerch Caco-2 a Patient-ofgeleet intestinal Organoiden bewisen gouf.Epithelzellen goufen validéiert.An dëser Etude hu mir speziell op d'Zellproduktioun a Konzentratiounsverdeelung vun engem potente Wnt-Antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), an Darm-on-a-Chip a modifizéierten Mikrofluidgeräter mat Transwell-Inserts konzentréiert, genannt "Hybrid Chip". zzled-related Protein 1, or Soggy-1) to the on-chip gut inhibits morphogenesis or disrupted the prestructured 3D epithelial layer , suggeréiert datt antagonistesch Stress während der Kultur verantwortlech ass fir intestinal morphogenesis in vitro. ment duerch aktive Spülen (zB an Darm-op-e-Chip oder Hybrid-op-e-Chip Plattformen) oder Diffusioun .Basolateral Medien (zB aus Transwell Inserts a grousse basolaterale Reservoir a Wells).
An dësem Protokoll liwwere mir eng detailléiert Method fir Darm-op-e-Chip Mikroapparaten an Transwell-insertable Hybrid Chips (Schrëtt 1-5) ze fabrizéieren fir intestinal Epithelzellen op Polydimethylsiloxan (PDMS)-baséiert poröse Membranen (Schrëtt 6A, 7A, 8, 9) oder Polyester Membranen, 7B Membranen, 9B Membranen, 9B Membranen, 9B Membranen, ed 3D Morphogenesis in vitro (Schrëtt 10). Mir identifizéiert och cellulär a molekulare Fonctiounen indikativ vun Tissu-spezifesch histogenesis an lineage-ofhängeg Zell Differenzéierung vun Multiple Imaging Modalitéite (Schrëtt 11-24). Kreatioun vun 2D monolayers, an intestinal biochemical a Reproduktioun vun der biomechanesch microenvironment.in vitro.To induce 3D morphogenesis from 2D epithelial monolayers, we removeed morphogen antagonists in both cultured Forms of the medium in the basolateral compartment of the culture. fir Morphogen-ofhängeg Epithelwachstum ze modelléieren, longitudinal Host-Mikrobiom Co-Kulturen, Pathogen Infektioun, Entzündungsverletzung, Epithelbarriär Dysfunktioun a probiotikbaséiert Therapien Beispill.Afloss.
Eise Protokoll kann nëtzlech sinn fir eng breet Palette vu Wëssenschaftler an der Basis (zB intestinal mucosal Biologie, Stammzellbiologie, an Entwécklungsbiologie) an applizéiert Fuerschung (zB preclinical Drogen Tester, Krankheet Modeller, Tissue Engineering, a Gastroenterology) breet Impakt. op Publikum verdeelt ginn, déi d'Dynamik vun der Zell-Signaliséierung studéiert während der Darmentwécklung, der Regeneratioun oder der Homeostasis .Zousätzlech ass eise Protokoll nëtzlech fir d'Infektioun ënner verschiddenen ustiechend Agenten z'ënnersichen wéi Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typebrio oder Salmonella Vihimurioler.Publikum vun Krankheet Pathologie an pathogenesis sinn och nëtzlech. D'Benotzung vun engem on-Chip GUT microphysiology System kann longitudinal Co-Kultur erlaben 10 a spéider Evaluatioun vun Host Verdeedegung, immun Äntwerte an pathogen-Zesummenhang Verletzung Reparatur am gastrointestinal (GI) TRACT 11. Aner GI Stéierungen verbonne mat leaky gut Krankheet, syndrome, poulceritis, coliacitis, syndrome. reizbar bowel Syndrom kann simuléiert ginn, wann 3D intestinal epithelial Schichten benotzt 3D intestinal epithelial Schichten vum Patient virbereet ginn, dës Krankheeten och villous atrophy, crypto verkürzende, mucosal Schued, oder behënnert epithelial Barrière. Zell Zorte, wéi Patient periphere Blutt mononuclear Zellen (PBMCs), zu Modeller mat 3D intestinal Villus-Krypta Mikroarchitekturen.Tissuespezifesch Immunzellen, 5.
Zënter 3D Epithelmikrostruktur ka fixéiert a visualiséiert ginn ouni de Sektiounsprozess, Zuschauer, déi un raimlecher Transkriptomik an High-Resolutioun oder Super-Resolutioun Imaging schaffen, kënnen an eiser Kartéierung vun der spatiotemporaler Dynamik vun Genen a Proteinen op Epithel-Nischen interesséiert sinn.Interesséiert an Technologie.Reaktioun op mikrobiell oder immun stimuli. Weider, longitudinal Host-Mikrobiom Crosstalk 10, 14 datt GUT homeostasis koordinéieren kann an der 3D intestinal mucosal Layer vun co-culturing verschidde microbial Arten etabléiert ginn, microbial Communautéiten oder fecal gubiota-on, virun allem an der fecal gubiota.an der Plattform.Dës Approche ass besonnesch attraktiv fir Publikum déi mucosal Immunologie, Gastroenterologie, mënschlech Mikrobiom, Kulturomik a klinesch Mikrobiologie studéieren, déi virdru onkultivéiert Darmmikrobiota am Labo cultivéieren.Wann eisen in vitro Morphogenese-Protokoll op skalierbare Kulturformater adaptéiert ka ginn, wéi zB multiwell 248, 9 oder 248, kontinuéierlech 9 oder 248. lateral compartments, de Protokoll kann och zu deenen, déi pharmazeuteschen, biomedizineschen Oder High-Throughput Screening- oder Validatiounsplattforme fir d'Liewensmëttelindustrie entwéckelen verbreet ginn. Als Beweis-vun-Prinzip, hu mir viru kuerzem d'Machbarkeet vun engem multiplex High-Throughput Morphogenesis System scalable zu engem 24-Well Platen-Format-on-1-Chip-Produiten bewisen. d'Validatioun vun eiser in vitro Morphogenese Method kann beschleunegt a potenziell vu ville Fuerschungslaboratoiren, Industrie oder Regierung a Reguléierungsagenturen ugeholl ginn fir d'cellulär Reprogramméierung vun der in vitro Darmmorphogenese op transkriptomesche Niveau ze verstoen fir Medikamenter oder Biotherapeutik ze testen. sis Prozess.
Eng limitéiert Zuel vu mënschlech-relevant experimentell Modeller goufen benotzt intestinal epithelial Morphogenesis ze studéieren, haaptsächlech wéinst dem Mangel vun implementable Protokoller 3D Morphogenesis in vitro induce.Tatsächlech, vill vun der aktueller Kenntnisser iwwer GUT Morphogenesis baséiert op Déier Studien (zB Zebrafish20, Mais21 oder Poulet sinn Aarbechtsmaart 21 oder Käschte,-21 sinn, awer kascht, 21 sinn). an am wichtegsten, net präziist mënschlech Entwécklung Prozesser bestëmmen. Dës Modeller sinn och ganz limitéiert an hirer Fähegkeet an engem Multi-Manéier scalable Manéier getest gin.Therefore, our protocol for regenerating 3D Tissue structures in vitro outperforms in vivo animal models as well as other traditional stateic 2D cell culture models.As earder beschriwwen, utilizing the epithelia d'Krypta-Villus Achs an Äntwert op verschidde mucosal oder immun stimuli.3D epithelial Schichten kann e Raum bidden ze studéieren wéi microbial Zellen konkurréiere raimlech niches an ökologesch Evolutioun an Äntwert op Host Faktoren ze Form (zB bannen versus baussenzege mucus Schichten, secretion vun IgA an antimicrobial peptides kënnen ze verstoen, 3D microbiotic peptides microbios, 3D erméiglechen). ta strukturéiert seng Communautéiten a synergistesch produzéiert mikrobielle Metaboliten (zB Kuerzketten Fettsäuren), déi d'zellulär Organisatioun a Stammzellnichen an de Basalkrypten formen.
Zousätzlech zu eiser Method fir 3D intestinal epithelial Strukturen ze kreéieren, ginn et e puer in vitro Methoden. Intestinal organoid culture is a state-of-the-art tissue engineering technique based on the cultivation of intestinal stamcells under specific morphogen conditions23,24,25. sed am Organoid an dofir ass d'Aféierung vu luminale Komponenten wéi mikrobiellen Zellen oder exogenen Antigene limitéiert.Zougang zu organoid Lumen kann mat engem microinjector verbessert ginn,26,27 mä dës Method ass invasiv an Aarbechtsintensiv a verlaangt spezialiséiert Wëssen Leeschtunge. Weider, traditionell organoid Kulturen erhale an hydrogel scaffolds ënner statesch Konditiounen reflektéieren net genee aktiv an vivo Biomechanik.
Aner Approchen, déi vu verschiddene Fuerschungsgruppen benotzt ginn, benotzen prestrukturéiert 3D-Hydrogel-Scaffolds fir d'Darm-Epithelstruktur ze mimikéieren andeems se isoléiert mënschlech Darmzellen op der Gel-Uewerfläch kultivéieren. Etabléieren eng héich Aspekt Verhältnis epithelial Struktur an stroma-epithelial crosstalk vun dorënner stromal Zellen an der scaffold. Allerdéngs kann d'Natur vun prestructured scaffolds d'Display vun der spontan morphogenetic Prozess selwer verhënneren. Dës Modeller och net dynamesch luminal oder interstitial Flux, feelen der Flëssegket Zell schiefgang studéieren ënnerzegoen Funktioun rezent Funktioun an intestinal physikalesch studéieren an intestinal physesch studéieren Stress ze gewannen An. scaffolds in a microfluidic platform and patterned intestinal epithelial structures using laser-etching techniques.Mouse intestinal organoids follow etched patterns to form intestinal tubular structures, and intraluminal fluid flow can be recapitulated using a microfluidics module. miniature gut tubes with spontane morphogenetic processes.Trotz der komplexer Fabrikatioun vu verschiddene GUT Segmenter bannent der Rouer, dësem Modell feelt och luminal Flëssegket Flux a mechanesch Deformation. Zousätzlech, Modell operability kann limitéiert ginn, virun allem no der bioprinting Prozess komplett ass, perturbing experimentell Konditiounen oder Zell-ze-Zell Interaktiounen. mimic gut motility, Accessibilitéit vun onofhängegen apical an basolateral compartments, a Re-Schafe vun komplex biologesch microenvironments vun modularity.Dofir, kann eisen in vitro 3D Morphogenesis Protokoll eng komplementar Approche déi Erausfuerderunge vun bestehend Methoden ze iwwerwanne.
Eise Protokoll ass ganz op 3D Epithel Morphogenesis konzentréiert, mat nëmmen Epithelzellen an der Kultur a keng aner Aarte vun Ëmgéigend Zellen wéi mesenchymal Zellen, Endothelzellen, an Immunzellen. t-op-e-Chip an Hybrid-op-e-Chip erlaabt eis der gewellt 3D epithelial Layer ze erstallt, zousätzlech biologesch Komplexitéite wéi epithelial-mesenchymal Interaktiounen33,34, extracellular Matrixentgasung (ECM) Oflagerung 35 an, an eisem Modell, crypt-villus Fonctiounen, datt weider Stammzellenfuerschung Nisch vermëttelen an der basal Zell Nisch an der Mesblas, weiderhin an der Fibro Zell Nisch. Senchyme spillen eng Schlësselroll an der Produktioun vun ECM Proteinen a Regulatioun vun intestinal morphogenesis in vivo35,37,38.D'Zousätzlech vun mesenchymal Zellen zu eisem Modell verstäerkte de morphogenetic Prozess an Zell Uschlëss Effizienz.D'endothelial Layer (dh capillaries oder lymphatics) spillt eng wichteg Roll an der Reguléierung vun molekulare Zellen an der microviren Zell Transport an der microviren an immun vaskulären Transport an der gu9moren. Kulturkomponenten, déi tëscht Tissuemodeller verbonne kënne sinn, sinn eng Viraussetzung wann Tissuemodeller entworf sinn fir Multi-Organ Interaktiounen ze demonstréieren. Dofir, endothelial Zellen musse mat abegraff ginn fir méi genee physiologesch Features mat Organ-Niveau Resolutioun ze modelléieren.
D'Benotzung vun Hybrid Chips ass méi einfach wéi GUT-on-a-Chip, well den Apparat Setup méi einfach ass an d'Benotzung vun Transwell Inserts erlaabt fir scalable Kultur vun GUT Epithel. Wéi och ëmmer, kommerziell verfügbar Transwell Inserts mat Polyester Membranen sinn net elastesch a kënnen net peristaltesch-ähnlech Beweegunge simuléieren. d'apikale Säit.Kloer, déi statesch Eegeschaften am apikalen Kompartiment selten erlaben laangfristeg bakteriell Co-Kultur an Hybrid Chips.Während mir robust 3D Morphogenesis an Transwell Inserts kënne induzéieren wann Dir Hybridchips benotzt, kann de Mangel u physiologesch relevant Biomechanik an apikalen Flëssegkeetsfloss d'Machbarkeet vu potenziellen Applikatiounsplattformen Chip limitéieren.
Voll-Skala Rekonstruktioune vun der mënschlecher Krypta-Villus Achs an GUT-op-e-Chip an Hybrid-op-e-Chip Kulturen sinn net voll etabléiert.Since morphogenesis fänkt vun engem epithelial monolayer, 3D microarchitectures do net onbedéngt morphological Ähnlechkeet ze crypts in vivo.Although we characterised near the prolifin Lium, der Krypta an villous Regiounen waren net kloer demarcated.Obwuel méi héich ieweschte Channels op der Chip féiert zu enger Erhéijung Héicht vun der microengineered Epithel, déi maximal Héicht ass nach bis ~300-400 µm limitéiert. ~600 µm41.
Aus engem Imaging Siicht, in situ Super-Resolutioun Imaging vun 3D microarchitectures kann op den Darm op engem Chip limitéiert ginn, well déi néideg schaffen Distanz vun der Objektiv Lens zu der epithelial Layer ass op der Uerdnung vun e puer Millimeter. Fir dëse Problem ze iwwerwanne, kann e fernen Objektiv néideg sinn. duerch Layer Mikrofabrizatioun vum Darm op engem Chip implizéiert permanent Adhäsioun tëscht all Schicht, et ass extrem Erausfuerderung fir déi iewescht Schicht opzemaachen oder ze läschen fir d'Uewerflächenstruktur vun der Epithelschicht z'ënnersichen.
D'Hydrophobizitéit vu PDMS ass e limitéierende Faktor bei mikrofluidbaséierte Studien, déi sech mat hydrophobe klenge Molekülen beschäftegen, well PDMS esou hydrophobe Molekülen net spezifesch adsorbéiere kann. Alternativen zu PDMS kënne mat anere polymeresche Materialien berécksiichtegt ginn. Sorptioun vu hydrophobesche Molekülen.
Schlussendlech ass eis Method net gutt charakteriséiert a punkto e High-Throughput-Screening oder "one-size-fits-all" User-frëndlech experimentell Plattform.Den aktuelle Protokoll erfuerdert eng Sprëtzpompel pro Mikroapparat, déi Plaz an engem CO2-Inkubator ophëlt a grouss-Skala Experimenter verhënnert. ous Inserts déi kontinuéierlech Ergänzung an Entfernung vu basolaterale Medien erlaben).
Fir 3D Morphogenesis vum mënschlechen intestinalen Epithel in vitro z'induzéieren, hu mir e mikrofluidic Chip intestinal Apparat mat zwee parallel microchannels an engem elastesche porous Membran an tëscht engem lumen-capillary Interface ze schafen. béid Plattformen, morphogenesis vu verschiddene mënschlech intestinal epithelial Zellen kann duerch Applikatioun Directional Manipulatioun vun Flux bewisen ginn Morphogen antagonists aus der basolateral compartment ze läschen.Déi ganz experimentell Prozedur (Dorënner 1) besteet aus fënnef Deeler: (ech) microfabrication vun der GUT Chip oder Transwell insertable Hybrid-1 Chip (intestinal Virbereedung 1-5 Virbereedung); Caco-2 Zellen) oder mënschlech Darmorganoiden;Këschte 2-5), (iii) Kultur vun intestinal epithelial Zellen op intestinal Chips oder Hybrid Chips (Schrëtt 6-9), (iv) Aféierungs- vun 3D morphogenesis in vitro (Schrëtt 10) an (v)) der 3D epithelial microstructure (Schrëtt 11-24) ze karakteriséieren. duerch d'Vergläiche vun der Epithel Morphogenese mat raimlechen, temporäre, bedingende oder prozedurale Kontrollen.
Mir hunn zwou verschidde Kulturplattformen benotzt: Darm-op-e-Chip mat riichter Kanäl oder net-linear verwéckelt Kanäl, oder Hybridchips mat Transwell (TW) Inserts an engem mikrofluideschen Apparat, fabrizéiert wéi an der Box 1 beschriwwen, a Schrëtt 1 -5. intestinal organoids) a Kultur Prozedur an dësem Protokoll benotzt."In vitro Morphogenesis" weist d'allgemeng Schrëtt an deem Caco-2 oder organoid-ofgeleet Epithelzellen op en intestinal Chip kultivéiert ginn oder op Transwell Inserts vun engem Hybrid Chip, gefollegt vun Aféierungs- vun 3D Morphogenesis an d'Bildung vun enger charakteriséierter Applikatioun vun Epithelial Applikatioun ënner anerem charakteriséiert Applikatioun Schrëtt ënner. Stinal epithelial Schichten kann benotzt ginn, zum Beispill, an Zell Differenzéierung Charakteriséierung, GUT Physiologie Studien, Etablissement vun Host-microbiome Ökosystemer, a Krankheet modeling. cus secreted from mucosal surfaces.Fluorescent images in Gut Physiology show mucus made by staining for sialic acid and N-acetylglucosamine rests using fluorescent wheat germ agglutinin.The two overlapping images in "Host-Microbe Co-Cultures" show representative host-microbiome in the co-culture of the co-culture of the co-culture of the co-culture. fluorescent Protein (GFP) mat microengineered 3D Caco-2 epithelial Zellen. D'Recht Panel weist d'Lokalisatioun vun GFP E. coli co-cultured mat 3D Caco-2 epithelial Zellen, gefollegt vun immunofluorescence staining mat F-actin (rout) an nuclei (blue guleaky). Genen (zB Lipopolysaccharid, LPS) an Immunzellen (zB PBMC;gréng).Caco-2 Zellen goufen kultivéiert fir eng 3D Epithelschicht ze etabléieren.Scale Bar, 50 µm.Biller an ënnen Zeil: "Differenzéierung vun Zellen" adaptéiert mat Erlaabnis vun Referenz.2.Oxford University Press;Reproduzéiert mat Erlaabnis vum Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" mat Erlaabnes vum Ref.3 adaptéiert.NAS;"Disease Modeling" mat Erlaabnis vun Referenz ugepasst.5.NAS.
Béid Darm-op-Chip an Hybrid Chips goufen mat PDMS Repliken fabrizéiert, déi aus Siliziumformen duerch mëll Lithographie1,44 ofgebaut goufen a mat SU-8 geformt goufen. riichtaus microchannels, huet zu engem komplex GUT-op-e-Chip (Extended Data Fig. 1b) entwéckelt, datt e Pair vun kromme microchannels ëmfaasst Erhéijung Flëssegket Openthaltserlaabnes Zäit, net-linear Flux Musteren, a multiaxial Deformatioun vun cultured Zellen (Fig. 2a-f) gut-Chip, gut-Chip méi komplex muss biomechanics, gut-Chip gin. Sen.Mir hunn bewisen, datt de convoluted Gut-Chip och staark 3D Morphogenesis an engem ähnlechen Zäit Frame mat engem ähnleche Grad vun epithelial Wuesstem am Verglach zu der Original Gut-Chip induces, onofhängeg vun der cultured Zell Typ. Dofir, 3D Morphogenesis ze induce, linear a komplex op-Chip GUT-Modeller sinn austauscht SUPD Charakteristiken mat negativen SUV-Curpien Muster mat Silconi-Moll-Silcond Muster auswiesselen. nom Ausbau (Fig.2a). Fir den Darm op engem Chip ze fabrizéieren, gouf d'preparéiert iewescht PDMS-Schicht sequenziell mat engem porösen PDMS-Film gebonnen an dann mat der ënneschter PDMS-Schicht ausgeriicht duerch irreversibel Bindung mat engem Corona-Behandlung (Fig. 2b-f). 2h an erweiderten Donnéeën Fig.
eng, Schematesch Illustratioun vun der Preparatioun vun PDMS Deeler aus SU-8 Musteren Silicon molds.The uncured PDMS Léisung gouf op engem Silicon Ofdréck gegoss (lénks), cured bei 60 ° C (Mëtt) an demold (riets). D'demolted PDMS gouf a Stécker geschnidde a gebotzt fir weider benotzen.b, Photograph vun der ieweschter Layer vun silconi benotzt, Foto vun der ieweschter MS ze preparéieren. mold used to fabricate the PDMS porous membrane.d, A series of photographs of the ober and lower PDMS komponenter and the assembled on-chip intestinal device.e, Schematic of the alignment of the ober, membrane, and lower PDMS komponenter. um chambers.g, Setup vun GUT-on-a-Chip fir microfluidic Zell Kultur. D'fabrizéierten GUT op engem Chip assembléiert mat engem Silicone Tube a Sprëtz war op engem Coverslip geluecht.Den Chip Apparat war op den Deckel vun engem 150 mm Petri Schossel fir Veraarbechtung.The Bindemittel gëtt benotzt fir d'Silikon Snapshot vun Hybrid Chips an Hybrid-Snapshot Tube benotzt an Hybrid-Chips Transgene Stoffer an Hybrid-Snapshot Tube zouzemaachen. erts onofhängeg ze Kultur 2D monolayers vun intestinal epithelial Zellen virbereet goufen an der Hybrid Chip agebaut intestinal 3D morphogenesis ze induce. D'Mëttel gëtt duerch microchannels ënnert der Zell Layer etabléiert op der Transwell Insert etabléiert. Skala Bar, 1 cm.h Reprinted mat Erlaabnis vun Referenz.4.Elsevier.
An dësem Protokoll, goufen d'Caco-2 Zell Linn an intestinal organoids als epithelial Quellen (Figebam. 3a) benotzt. Béid Zorte vun Zellen sech cultured onofhängeg (Box 2 an Box 5) a benotzt der ECM-Beschichtete microchannels vun op-Chip GUT oder Transwell inserts.When Zellen sinn confluent 95%sk-Kultur, (Cabet-Zell Kultur) en Duerchgäng 10 an 50) an T-flasks sinn recoltéiert dissociated Zell suspensions vun trypsinization Flesseggassystem (Këscht 2) ze preparéieren. Mënsch intestinal organoids aus intestinal biopsies oder chirurgesch resections sech zu Matrigel scaffold Kuppel an 24-gutt Placke cultured der strukturell microenvironment als Wachstum, Noggin essentiel, Morphon an Noggin enthalen. Faktore virbereet wéi an der Box 3 beschriwwen goufen all aneren Dag ergänzt bis d'Organoiden op ~500 µm Duerchmiesser gewuess sinn. Voll ugebaut Organoide gi gesammelt an an eenzel Zellen dissoziéiert fir op Darm oder Transwell Inserts op engem Chip (Box 5) ze säen. ), lesion Site (zB lesion versus net-lesioned Beräich) an gastrointestinal Plaz am TRACT (zB Duodenum, jejunum, ileum, cecum, Colon, oder rectum). Mir bidden eng optimiséiert Protokoll an Box 5 fir culturing colonic organoids (coloids) datt typesch méi héich Konzentratioune vun morphogens wéi kleng intestinal verlaangen.
a, Workflow fir d'Induktioun vun der GUT Morphogenesis am GUT Chip.Caco-2 Mënsch intestinal epithelium an intestinal organoids sinn an dësem Protokoll benotzt 3D morphogenesis ze demonstréieren. D'isoléiert epithelial Zellen goufen an der preparéiert GUT-op-e-Chip Apparat (Chip Virbereedung) gesaat (Chip Virbereedung). Eemol Zellen befestegt ginn an der PD gesaat (Membraan PD Dag) gesaat. 0 (D0), apical (AP) Flux initiéiert an erhale fir déi éischt 2 Deeg (Flux, AP, D0-D2). Basolateral (BL) Flux gëtt och zesumme mat cyclic Stretching Motioune (Stretch, Flux, AP an BL) initiéiert wann eng komplett 2D Monolayer geformt ass.Darm 3D Morphogenesis vun spontanerous Kultur, 5 Deeg morphogenesis Darm (5 Deeg morphogenesis). Géigesaz Biller weisen representativ Morphologie vun Caco-2 Zellen op all experimentell Schrëtt oder Zäit Punkt (Bar graph, 100 µm). Véier schematesch Diagrammer déi entspriechend Kaskaden vun GUT Morphogenesis illustréieren (uewen riets). D'gebuerene Pfeiler am schematic representéieren d'Richtung vun Flëssegket flow.b, SEM Bild weist der Uewerfläch topology vun der Uewerfläch Caco-2 Magnéit Beräich (in Héichpunkt vun der etabléierter Cacoum-2 Magnified Beräich). gestiermt Këscht) weist der regeneréiert microvilli op der 3D Caco-2 Layer (riets).c, Horizontal frontal Vue vun etabléierten Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rout) a kontinuéierlech Biischt Grenz Membranen Label F-actin (gréng) an Kären (blo) Immunofluorescence konfokalesch Zellen op der mëttlerer Plaz vun intestinlial visualization vun Zellen vun der mëttelfristeg Zellen vun epistinlial Chips Ariichten. Brennwäit fir all confocal Vue.d, Zäit Laf vun morphological Ännerungen an organoids cultured op engem Chip kritt duerch Phase Kontrast microscopy op Deeg 3, 7, 9, 11, an 13. D'Inset (uewen riets) weist d'héich Vergréisserung vun der geliwwert image.e, DIC photomicrograph vun organoid 3D epithelium geholl op Dag slice op Dag fluorescéiert, fluorescion geholl Biller am Darm markéiert. Stammzellen (LGR5;Magenta), Goblet Zellen (MUC2; gréng), F-Actin (gro) an Kären (Cyan) ugebaut op GUT Chips fir 3 Deeg, respektiv (lénks) an 13-Dag (Mëtt) Organoids op der epithelial Layer. Gesinn och erweidert Donnéeën Figur 3, déi Highlights LGR5 Signalisatioun vun der MUC2D'Signalisatioun vun der Epicerie vun MUC2D (D) organoid epithelium etabléiert am GUT op engem Chip vun staining der Plasma Membran mat CellMask Dye (riets) op Dag 13 vun culture.Scale Bar ass 50 μm wann net anescht uginn.b Reprinted mat Erlaabnis vun Referenz.2.Oxford University Press;c Adaptéiert mat Erlaabnis vun Referenz.2.Oxford University Press;e an f adaptéiert mat Erlaabnis duerch Referenz.12 Ënner Creative Commons License CC BY 4.0.
Am Darm op engem Chip, ass et néideg der hydrophobic Uewerfläch vun der PDMS porous Membran fir erfollegräich ECM coating ze änneren. Ee, microfluidic Kultur vun organoid epithelium verlaangt chemesch-baséiert Uewerfläch funktionalization efficace Oflagerung vun ECM Proteinen duerch sequenziell Uwendung vun polyethyleneimine (PEI) a glutaraldehyde zu PDMS microchannels ze erreechen. Idic Zellkultur fänkt un andeems nëmmen de Medium an den ieweschten Mikrokanal perfuséiert bis d'Zellen e komplette Monolayer bilden, während den ënneschten Mikrokanal statesch Konditioune behält.
Transwell Kulturen erfuerderen och ECM Beschichtung virum Zellsieden;allerdéngs, Transwell Kulturen verlaangen net komplex pretreatment Schrëtt der Uewerfläch vun porösen Inserts ze aktivéieren. Fir wuessen Caco-2 Zellen op Transwell Inserts, ECM Beschichtung op porösen Inserts beschleunegt d'Befestigung vun dissoziéierten Caco-2 Zellen (<1 Stonn) a enk Kräizung Barrière Formatioun (<1-2 Deeg op TransTowell secculated organoid Kulturen, isoléiert organoids op TransTowell sec organoids). Beschichtete Inserts, befestegt op d'Membranoberfläche (<3 h) a behalen bis d'Organoiden e komplette Monolayer mat Barrière Integritéit bilden.
In vitro 3D morphogenesis kann duerch Applikatioun Flëssegket Flux op de basolateral Aspekt vun enger etabléierter epithelial Layer initiéiert ginn. Am GUT op engem Chip, epithelial morphogenesis ugefaang wann d'Mëttelen an der ieweschter an ënneschten microchannels perfused war (Fig. 3a). Wéi virdru beschriwwen, ass et kritesch Flëssegket Flux an der kontinuéierlecher Inferior inferior comporgen (morphogen) rehibitor Richtung aféieren. Fir genuch Nährstoffer a Serum un Zellen ze bidden, déi op poröse Membranen gebonnen sinn a luminale Schéierstress generéieren, applizéiere mir typesch Dual Flow am Darm op engem Chip. An Hybrid Chips goufen Transwell Inserts mat Epithel-Monoschichten agebaut an d'Hybridchips. Dunn gouf d'Medium ënner der basolateraler Säit vun der poröser Transwell-Initiatioun vun der 5. basolateral Flux a béid Kulturplattformen.
D'morphologesch Feature vu mikroengineeréierten 3D Epithelschichten kënnen analyséiert ginn andeems Dir verschidde Bildungsmodalitéite benotzt, dorënner Phasekontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, SEM oder Immunfluoreszenz Konfokalmikroskopie (Figuren 3 a 4). optesch Transparenz vu PDMS a Polyester Filmer, souwuel d'Gutt-on-a-Chip an d'Hybrid Chip Plattforme kënnen Echtzäit in situ Imaging ouni de Besoin fir Sektioun oder Demontage vum Apparat ubidden. % (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), in order.Ofhängeg vun der Zelltyp, verschidde Fixativer, Permeabiliséierer a Spärmëttel kënne benotzt ginn.Primary antibodies targeting lineage-dependent cell or region markers are used to highlight cells immobilized in situ on the chip, followed by Secondary antibodies along with a, 2-Phenylene) Indole, DAPI) oder F-actin (zB, fluorescently markéiert phalloidin). Fluorescence-baséiert liewen Imaging kann och an situ gesuergt ginn mucus Produktioun z'entdecken (Figebam.1, "Zelldifferenzéierung" an "Darm Physiologie"), zoufälleg Kolonisatioun vu mikrobiellen Zellen (Fig. 1, "Host-Mikrobe Co-Kultur"), d'Rekrutéierung vun Immunzellen (Fig. 1, 'Krankheetmodelléierung') oder d'Konturen vun der 3D Epithelmorphologie (Fig. der ieweschter Layer vun der ënneschter microchannel Layer, wéi am Ref beschriwwen. Wéi am Lalumi gewisen. 2, der 3D epithelial morphology souwéi der microvilli op der apical Biischt Grenz kann duerch SEM visualiséiert ginn (Lalumi 3b). Den Ausdrock vun Differenzéierungsmarker kann duerch leeschtungsfäheg quantitative PCR5 oder Single-Zell Layer vun 3D Zell wuessen RNA an dësem Fall, guunct 3D wuessen. Chips oder Hybrid Chips ginn duerch Trypsiniséierung gesammelt an duerno fir molekulare oder genetesch Analyse benotzt.
a, Workflow fir d'Induktioun vun intestinal morphogenesis an engem Hybrid Chip.Caco-2 an intestinal organoids sinn an dësem Protokoll benotzt 3D morphogenesis an engem Hybrid Chip platform ze demonstréieren. Dissociated epithelial Zellen goufen an préparéierten Transwell Inserts gesaat (TW preparéieren; kuckt ënnendrënner Figur ). Eemol all Zellen goufen an polyester membranes befestegt an transseded Zellen an Polyester Kulturen befestegt. ënner statesch Konditiounen (TW Kultur). No 7 Deeg, eng eenzeg Transwell Insert mat engem 2D monolayer vun epithelial Zellen war an engem Hybrid Chip integréiert engem basolateral Flux (Flow, BL), déi schlussendlech zu der Generatioun vun enger 3D epithelial Layer (morphogenesis) gefouert. op bei all experimentell Schrëtt oder Zäit Punkt. D'schematics an der ieweschter Schichten illustréiert d'experimentell Configuratioun fir all step.b, Hybrid Chips (lénks schematic) kann zu 3D morphogenesis vun organoid epithelial Zellen mat Top-down confocal microscopy Vue geholl op verschiddene Z Positiounen (Uewer, Mëtt, an ënneschten;kuckt richteg schematesch an entspriechend Punktlinnen).gewisen offensichtlech morphological Charakteristiken.F-actin (Cyan), Kär (gro).c, Fluorescence confocal micrographs (3D Wénkel gekäppt Vue) vun organoid-ofgeleet epithelial Zellen cultured zu statesch Transwell (TW; inset bannent wäiss gestiermt Këscht) versus Hybrid Chip (gréisste voll Schoss) vergläicht respektiv 32D Morphologie Kräiz-Schnëtt vun 2D Morphology, respektiv 2D Morphology. (inset an der oberer rechter Ecke; "XZ") weisen och 2D an 3D Features.Scale Bar, 100 µm.c Reprinted with Erlaabnis from reference.4.Elsevier.
Kontrollen kënne virbereet ginn andeems d'selwescht Zellen (Caco-2 oder intestinal organoid Epithelzellen) an zweedimensional Monoschichten ënner konventionelle statesche Kulturbedéngungen kultivéiert ginn. Notabel, Nährstoffverarmung kann opgrond vun der limitéierter Volumenkapazitéit vun de Mikrokanälen entstoen (dh ~ 4 µL am Topkanal op der ursprénglecher Darm-Chip-Design, an no der epilateraler Darm-Chip-Design kann och vergläicht ginn). .
De mëlle Lithographieprozess soll an engem proppere Raum duerchgefouert ginn. Fir all Schicht um Chip (Uewer- an Ënnerschichten a Membranen) an Hybridchips goufen verschidde Fotomasken benotzt a fabrizéiert op getrennten Siliziumwaferen, well d'Héichte vun de Mikrokanälen ënnerschiddlech waren. ass 200 µm.
Place eng 3-Zoll Silicon wafer an engem Plat mat acetone.Gently Wirbelen der Plack fir 30 Sekonnen, dann Loft dréchen der wafer.Transfer der wafer op eng Plack mat IPA, dann spin der Plack fir 30 s ze botzen.
Eng Piranha-Léisung (Mëschung aus Waasserstoffperoxid a konzentréierter Schwefelsäure, 1:3 (Vol/Vol)) kann optional benotzt ginn fir d'Entfernung vun organesche Reschter vun der Siliziumwafer Uewerfläch ze maximéieren.
Piranha Léisung ass extrem ätzend a generéiert Hëtzt. Zousätzlech Sécherheetsmoossnamen sinn néideg. Fir Offallentsuergung, erlaabt d'Léisung ze killen an an e propperen, dréchenen Offallcontainer ze transferéieren. Sekundärbehälter benotzen a richteg Offallbehälter ze markéieren. Follegt w.e.g. d'Sécherheetsrichtlinne vun der Ariichtung fir méi detailléiert Prozeduren.
Dehydréiert d'Wafelen andeems se se op enger 200 ° C Heizplack fir 10 min setzen.
Pour ~ 10 g vun photoresist SU-8 2100 op d'Mëtt vun der gebotzt Silicon wafer.Use Pinzette fir de photoresist gläichméisseg op der wafer ze verdeelen. Occasiounsautoen der wafer op eng 65 ° C waarm Plack ze maachen de photoresist manner klebrig a méi einfach ze verbreeden.Place de wafer net direkt op der waarmer Plack.
SU-8 war gläichméisseg op der wafer verdeelt duerch Lafen Spin Coating.Programm eng erakommen Rotatioun vun der SU-8 fir 5-10 s zu propagéieren bei 500 rpm bei enger Beschleunegung vun 100 rpm / s.Set den Haapt spin fir 200 µm deck Muster op 1,500 rpm décke bei 1,500 rpm 50 oder erreechen 500m Héicht déi iewescht Schicht vum Darm um Chip; kuckt "Kritesch Schrëtt" hei ënnen) op eng Beschleunegung vun 300 RPM / s 30 Sekonnen bei 1.200 RPM gesat.
D'Haaptspingeschwindegkeet kann no der Zildicke vum SU-8 Muster op der Siliziumwafer ugepasst ginn.
Fir SU-8 Mustere vu 500 µm Héicht fir déi iewescht Schicht vum Darm um Chip ze fabrizéieren, goufen d'Spinbeschichtung a mëll Bake Schrëtt vun dëser Box (Schrëtt 7 an 8) sequenziell widderholl (kuckt Schrëtt 9) fir zwou Schichten vun 250 µm ze produzéieren. m héich.
Soft baken d'SU-8 Beschichtete Waferen andeems d'Waferen virsiichteg op enger waarmer Plack bei 65 ° C fir 5 min plazéiert, da schalt d'Astellung op 95 ° C an inkubéiert fir eng zousätzlech 40 min.
Fir eng 500 μm Héicht vum SU-8 Muster am ieweschten Mikrokanal z'erreechen, widderhuelen d'Schrëtt 7 an 8 fir zwee 250 μm décke SU-8 Schichten ze generéieren.
Benotzt den UV Mask Aligner, maacht e Lampetest no den Instruktioune vum Hiersteller fir d'Beliichtungszäit vun der Wafer ze berechnen.(Beliichtungszäit, ms) = (Beliichtungsdosis, mJ/cm2)/(Lampekraaft, mW/cm2).
No der Bestëmmung vun der Beliichtungszäit, setzt d'Fotomask op de Maskhalter vum UV Mask Aligner a setzt d'Fotomask op den SU-8 Beschichtete Wafer.
Setzt déi gedréckte Uewerfläch vun der Fotomask direkt op der SU-8 Beschichtete Säit vun der Siliziumwafer fir d'UV-Dispersioun ze minimiséieren.
Exposéiert den SU-8 Beschichtete Wafer a Photomask vertikal op 260 mJ / cm2 UV Liicht fir déi virbestëmmte Beliichtungszäit (kuckt Schrëtt 10 vun dëser Këscht).
No UV Belaaschtung goufen SU-8-beschichtete Siliziumwafere bei 65 ° C fir 5 min an 95 ° C fir 15 min op all Hotplate gebak fir Mustere mat enger Héicht vun 200 μm ze fabrizéieren.
Den Entwéckler gëtt an e Glas Plat gegoss, an de gebakene Wafer gëtt an de Plat gesat. De Volume vum SU-8 Entwéckler ka variéieren jee no der Gréisst vun der Glasplack. Vergewëssert Iech datt Dir genuch SU-8 Entwéckler benotzt fir onexponéiert SU-8 komplett ze läschen. Rotatioun.
Spülen déi entwéckelt Schimmel mat ~ 10 ml frëschen Entwéckler gefollegt vun IPA andeems Dir d'Léisung mat enger Pipette sprëtzt.
Plaz de Wafer an e Plasmareiniger an aussetzt dem Sauerstoffplasma (atmosphäresche Gas, Zildrock 1 × 10−5 Torr, Kraaft 125 W) fir 1,5 min.
Place de wafer an engem Vakuum Desiccator mat engem Glas Rutsch bannen.Wafers a Rutschen kënnen niewentenee gesat ginn.Wann de Vakuum Desiccator duerch eng Plack a verschidde Schichten ënnerdeelt ass, setzen d'Rutschen an der ënneschter Chamber an d'Waferen an der ieweschter Chamber.Drop 100 μL Trichloro(1H, fluorocylane an slide) Vakuum fir Silaniséierung.
Thaw e Fläsch mat gefruerenen Caco-2 Zellen an engem 37 ° C Waasserbad, transferéiert dann déi opgedaucht Zellen an eng T75 Kolben mat 15 mL 37 ° C virgewiermt Caco-2 Medium.
Fir Caco-2 Zellen bei ~ 90% Konfluenz ze passéieren, éischt waarm Caco-2 Medium, PBS, an 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA an engem 37 ° C Waasserbad.
Aspiréiert d'Mëttel duerch Vakuum Aspiratioun. Wash Zellen zweemol mat 5 mL waarm PBS vun Widderhuelung Vakuum Aspiratioun a frësch PBS dobäi.