Nährstoffakquisitioun an -verdeelung integréiert d'Fudderungssich an d'Liewensgeschichtseigenschaften vun Insekten. Fir Mängel u spezifeschen Nährstoffer a verschiddene Liewensstadien ze kompenséieren, kënnen Insekten dës Nährstoffer duerch zousätzlech Ernierung kréien, zum Beispill andeems se sech vu Wierbeldéierensekretiounen an engem Prozess ernähren, deen als Puddelen bekannt ass. D'Moustique Anopheles arabiani schéngt ënnerernährt ze sinn a brauch dofir Nährstoffer souwuel fir de Metabolismus wéi och fir d'Reproduktioun. Zil vun dëser Studie war et ze evaluéieren, ob d'Beweegung vun An. arabiensis um Kouurin fir d'Nährstoffakquisitioun d'Liewensgeschichtseigenschaften verbessert.
Vergewëssert Iech, datt et sécher ass. arabiensis gouf vum Geroch vu frëschem, 24-Stonne-, 72-Stonne- an 168-Stonne-alen Koumuscht ugezunn, a Weibercher, déi de Wirt gesicht hunn a mat Blutt gefiddert goufen (48 Stonnen no der Bluttmoolzecht), goufen an engem Y-Röhre-Olfaktometer gemooss, an d'schwanger Weibercher goufen fir den Laichtest ënnersicht. Eng kombinéiert chemesch an elektrophysiologesch Analyse gouf duerno benotzt fir bioaktiv Verbindungen am Koumuscht an alle véier Altersklassen z'identifizéieren. Synthetesch Mëschunge vu bioaktive Verbindungen goufen an Y-Röhre- a Feldversich evaluéiert. Fir Koumuscht a seng Haaptstickstoffhalteg Verbindung Harnstoff als potenziell Ergänzungsdiäte fir Malariavektoren z'ënnersichen, goufen d'Ernierungsparameter an d'Liewensgeschichtscharakteristike gemooss. Den Undeel vun de weibleche Moustiquen an d'Quantitéit u Koumuscht an Harnstoff, déi absorbéiert gouf, goufen ënnersicht. Nom Ernierung goufen d'Weibercher op Iwwerliewe, ugebonnenen Fluch a Reproduktioun ënnersicht.
Sicht no Blutt a Nährstoffer vum Wirt. A Laboratoire- a Feldstudien goufen d'Araber vum natierlechen a syntheteschen Doft vu frëschem a gereiftem Kou-Urin ugezunn. Schwanger Weibercher ware gläichgülteg zu de Reaktioune vum Kou-Urin op Laichplazen. Weibercher, déi de Wirt sichen a bluttsaugend sinn, absorbéieren aktiv Kou-Urin an Harnstoff a verdeelen dës Ressourcen no de Kompromësser am Liewenszyklus als Funktioun vum physiologeschen Zoustand fir Fluch, Iwwerliewe oder Reproduktioun.
D'Acquisitioun an d'Verdeelung vu Kou-Urin duerch Anopheles arabinis fir d'Liewenscharakteristiken ze verbesseren. Zousätzlech Fütterung vu Kou-Urin beaflosst d'Vektorkapazitéit direkt andeems se d'deeglech Iwwerliewensdauer an d'Vektordicht erhéicht, an indirekt andeems se d'Fluchaktivitéit verännert a sollt dofir a zukünftege Modeller berécksiichtegt ginn.
Nährstoffakquisitioun an -verdeelung integréiert d'Fuddersammlung an d'Liewensgeschichtscharakteristike vun Insekten [1,2,3]. Insekten kënnen Iessen auswielen a kréien a kompensatoresch Ernierung baséierend op der Verfügbarkeet vun Iessen an dem Nährstoffbedarf duerchféieren [1, 3]. D'Verdeelung vun Nährstoffer hänkt vum Liewensgeschichtsprozess of a kann zu verschiddenen Ufuerderungen un d'Qualitéit an d'Quantitéit vun der Ernährung an de verschiddene Liewensstadien vun Insekten féieren [1, 2]. Fir Mängel u spezifeschen Nährstoffer ze kompenséieren, kënnen Insekten dës Nährstoffer duerch zousätzlech Ernierung kréien, wéi zum Beispill duerch Bulli, verschidden Exkrementer a Sekretiounen vu Wierbeldéieren, a Kadaver, e Prozess deen als Puddelen bekannt ass [2]. Och wann eng Vielfalt vu Päiperleks- a Mottenarten haaptsächlech beschriwwe ginn, gëtt et och Waasserlächer bei aneren Insektenuerdnungen, an d'Attraktioun zu an d'Ernierung vun dësen Aarte vu Ressourcen kann bedeitend Auswierkungen op d'Gesondheet an aner Liewensgeschichtscharakteristiken hunn [2, 4, 5, 6], 7]. D'Malaria-Moskito Anopheles gambiae sensu lato (sl) trëtt als "ënnerernährten" Erwuessenen op [8], sou datt d'Waasserung eng wichteg Roll a senge Liewensgeschichtscharakteristike spille kann, awer dëst Verhalen ass bis elo vernoléissegt ginn. D'Benotzung vu Bewegung als Mëttel fir d'Nährstoffaufnahme an dësem wichtege Vehikel ze erhéijen verdéngt Opmierksamkeet, well dëst wichteg epidemiologesch Konsequenze kann hunn.
D'Stickstoffzufuhr bei erwuessene weibleche Anopheles-Mücken ass limitéiert wéinst niddrege Kaloriereserven, déi aus dem Larvestadium matgeholl ginn, an enger ineffizienter Notzung vum Bluttmoolzecht [9]. Déi weiblech Ann.gambiae sl kompenséiert dëst typescherweis andeems se mat zousätzleche Bluttmoolzechten ergänzen [10, 11], wouduerch méi Leit dem Risiko ausgesat sinn, d'Krankheet unzestecken an d'Mücken engem méi héije Risiko vun der Predatioun auszesetzen. Alternativ kënne Mücken zousätzlech Ernierung vu Wierbeldéierenexkreten benotzen, fir Stéckstoffverbindungen ze kréien, déi d'Adaptatioun an d'Fluchmanöverfäegkeet verbesseren, wéi vun aneren Insekten demonstréiert [2]. An dëser Hisiicht ass déi staark an däitlech Attraktioun vun enger vun de Geschwësteraarten an An. De gambesche sl-Aartkomplex, Anopheles arabinis, frëschem an alerten Kouurin [12,13,14], interessant. Anopheles arabinis ass opportunistesch a senge Wirtspräferenzen a bekannt dofir, datt se sech mat Ranner verbënnt a sech dovun ernähren. Kouurin ass eng Ressource, déi räich u Stéckstoffverbindungen ass, woubäi Harnstoff 50-95% vum gesamte Stéckstoff am frëschem Urin ausmécht [15, 16]. Wéi ... Mat Koupurin benotzen Mikroorganismen dës Ressourcen, fir d'Komplexitéit vun de Stéckstoffverbindungen bannent 24 Stonnen ze reduzéieren [15]. Mat der schneller Erhéijung vun Ammoniak, déi mat engem Réckgang vun organeschem Stéckstoff verbonnen ass, bléien alkalophil Mikroorganismen (vun deenen vill Verbindungen produzéieren, déi fir Moustiquen gëfteg sinn) [15], déi weiblech Ann.arabiensis kënne sinn, gëtt bevorzugt vun Urin ugezunn, deen 24 Stonnen oder manner al ass [13, 14].
An dëser Studie goufen no Wirt- a blutgefidderten Ans gesicht. Wärend sengem éischte Gonadotropin-Zyklus gouf arabiensis op d'Acquisitioun vu Stéckstoffverbindungen, dorënner Harnstoff, duerch Urinmëschung ënnersicht. Duerno gouf eng Serie vun Experimenter duerchgefouert fir ze evaluéieren, wéi weiblech Moustiquen dës potenziell Nährstoffressource fir verbessert Iwwerliewe, Reproduktioun a weider Nahrungssich verdeelen. Schlussendlech gouf de Geroch vu frëschem an alerten Kouurin ënnersicht fir ze bestëmmen, ob dës zouverlässeg Hiweiser fir Wirt- a blutgefiddert Ans geliwwert hunn. Bei hirer Sich no dëser potenzieller Nährstoffressource huet arabiensis chemesch Korrelatiounen hannert der observéierter differentieller Attraktivitéit entdeckt. Synthetesch Gerochsmëschunge vu flüchtege organesche Verbindungen (VOCs), déi an 24-Stonne-aalertem Urin identifizéiert goufen, goufen ënner Feldbedingungen weider evaluéiert, wouduerch d'Resultater ënner Laborbedingungen erweidert goufen an den Effekt vum Geroch vu Rëndurin op verschidde physiologesch Zoustänn demonstréiert goufen. Moustiquenattraktioun. Déi kritt Resultater bestätegen, datt An. arabiensis Stéckstoffverbindungen, déi am Wierbeldéierurin fonnt ginn, absorbéiert a verdeelt fir d'Liewensgeschichtscharakteristiken ze beaflossen. Dës Resultater ginn am Kontext vu potenziellen epidemiologesche Konsequenzen diskutéiert a wéi se fir Vektoriwwerwaachung a Kontroll benotzt kënne ginn.
Anopheles arabicans (Dongola-Stamm) gouf bei 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relativer Resistenz an engem 12:12 Stonnen Liicht:Däischter-Zyklus gehalen. D'Larve goufen a Plastikschalen (20 cm × 18 cm × 7 cm) opgezuucht, déi mat destilléiertem Waasser gefëllt waren, an hunn Tetramin® Fëschfudder (Tetra Werke, Melle, DE) kritt. D'Puppe goufen a 30 ml Becher gesammelt (Nolato Hertila, Åstorp, SE) an duerno a Bugdorm-Käfeger (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) transferéiert, fir datt d'Erwuessener kéinte kommen. Déi erwuesse Weibercher kruten eng 10% Saccharoseléisung ad libitum bis 4 Deeg nom Opkommen (dpe), duerno kruten d'Weibercher, déi de Wirt gesicht hunn, direkt virum Experiment eng Diät ugebueden, oder si goufen iwwer Nuecht mat destilléiertem Waasser virum Experiment ausgehongert, wéi hei ënnendrënner beschriwwen. D'Weibercher, déi fir Fluchröhre-Experimenter benotzt goufen, goufen nëmme 4-6 Stonnen ausgehongert. mat Waasser ad libitum. Fir bluttsaugend Moustiquen op déi nächst Bioassays virzebereeden, goufen 4 dpe Weibchen mat defibroteschem Schofsblutt (Håtunalab, Bro, SE) mat Hëllef vun engem Membran-Fidderungssystem (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK) versuergt. Vollstänneg iwwerfëllte Weibchen goufen dann an eenzel Käfeg transferéiert a kruten direkt Ernärung, wéi hei ënnendrënner beschriwwen, oder 10% Saccharose ad libitum fir 3 Deeg virun den hei ënnendrënner beschriwwenen Experimenter. Déi leschtgenannt Weibchen goufen fir Fluchröhrchen-Bioassays benotzt an an de Laboratoire transferéiert, an hunn duerno 4-6 Stonnen virum Experiment ad libitum destilléiert Waasser kritt.
Fudderassays goufen benotzt fir den Urin- a Harnstoffverbrauch bei erwuessene An.Arab Weibercher ze quantifizéieren. Weibercher, déi sech als Wirt sicht a mat Blutt gefiddert goufen, kruten eng Diät mat 1% verdënntem frëschem a gereiftem Kouurin, verschiddene Konzentratioune vun Harnstoff an zwou Kontrollen (10% Saccharose a Waasser) fir 48 Stonnen. Zousätzlech gouf Liewensmëttelfaarfstoff (1 mg ml-1 Xylolzyanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) an d'Diät bäigefüügt an an enger 4 × 4 Matrix a 250 µl Mikrozentrifugenröhrchen (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Figur 1A) geliwwert. Bis zum Rand fëllen (~300 µl). Fir Konkurrenz tëscht de Moustiquen an potenziell Auswierkunge vun der Faarf vun der Moustique ze vermeiden, setzt 10 Moustiquen an eng grouss Petrischüssel (12 cm Duerchmiesser a 6 cm Héicht; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figur 1A) an kompletter Däischtert bei 25 ± 2 cm °C an 65 ± 5% relativer Temperatur. Fiichtegkeet. Dës Experimenter goufen 5 bis 10 Mol widderholl. Nodeems se mat der Ernährung ausgesetzt waren, goufen d'Moustiquen bis zu weiderer Analyse bei -20 °C placéiert.
Sicht no Rëndurin an Harnstoff, déi vum Wirt an dem blutsaugende Weibchen Anopheles arabianus absorbéiert goufen. Am Fütterungsversuch (A) kruten d'Weibchenmücken eng Ernährung, déi aus frëschem an alerten Kouurin, verschiddene Konzentratioune vun Harnstoff, Saccharose (10%) an destilléiertem Waasser (H2O) bestoung. Wirtssichend (B) a blutgefiddert (C) Weibchen hunn méi Saccharose absorbéiert wéi all aner getest Ernährung. Bedenkt datt Wirtssichend Weibchen 72 Stonnen Kouurin manner wéi 168 Stonnen Kouurin (B) absorbéiert hunn. Den duerchschnëttleche Gesamtstickstoffgehalt (± Standardofwäichung) vum Urin ass am Inset duergestallt. Wirtssichend (D, F) a blutsaugend (E, G) Weibchen huelen Harnstoff op eng dosisofhängeg Manéier op. Duerchschnëttlech inhaléiert Volumen (D, E) mat verschiddene Buschtawennimm waren signifikant vuneneen ënnerschiddlech (Een-Wee ANOVA mat Tukey's Post-hoc Analyse; p < 0,05). Fehlerbalken representéieren de Standardfehler vum Duerchschnëtt (BE). Déi riicht gestrichelt Linn representéiert d'log-linear Regressiounslinn (F, G)
Fir absorbéiert Liewensmëttel fräizesetzen, goufen d'Moustiquen eenzel an 1,5 ml Mikrozentrifugenréier mat 230 µl destilléiertem Waasser geluecht an d'Gewief gouf mat engem Wegwerf-Stampel an engem kabellose Motor (VWR International, Lund, SE) zerstéiert, gefollegt vun Zentrifugatioun bei 10 krpm fir 10 Minutten. Den Iwwerstand (200 µl) gouf op eng 96-Wells Mikroplack (Sigma-Aldrich) transferéiert an d'Absorptioun (λ620) gouf mat engem Spektrophotometer-baséierte Mikroplacklieser (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm bestëmmt. Alternativ goufen d'Moustiquen an 1 ml destilléiertem Waasser zermalen, vun deem 900 µl an eng Kuvette fir spektrophotometresch Analyse transferéiert goufen (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Fir d'Nahrungsaufnahme ze quantifizéieren, gouf eng Standardkurve duerch seriell Verdënnung erstallt fir 0,2 µl bis 2,4 µl vun 1 mg ml-1 Xylol ze kréien. Cyanid. Duerno gouf déi optesch Dicht vu bekannte Faarfstoffkonzentratioune benotzt fir d'Quantitéit u Liewensmëttel ze bestëmmen, déi all Moustique giess huet.
D'Volumendaten goufen mat Hëllef vun enger Een-Wee-Varianzanalyse (ANOVA) analyséiert, gefollegt vun Tukey's Post-hoc-Pairwise-Vergläicher (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Linear Regressiounsanalysen hunn déi konzentratiounsofhängeg Harnstoffaufnahme beschriwwen a Äntwerten tëscht Wirtssichende a bluttsaugende Moustiquen verglach (GraphPad Prism v8.0.0 fir Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Ongeféier 20 µl Urinprouwen aus all Altersgrupp goufen op Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 Mesh, Sigma Aldrich) gebonnen an a Blechkapselen (8 mm × 5 mm) agekapselt. D'Kapsele goufen an d'Verbrennungskammer vun engem CHNS/O Analysator (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) agefouert, fir den Stickstoffgehalt a frëschem an alerten Urin no dem Protokoll vum Hiersteller ze bestëmmen. Den Gesamtstickstoff (g N l-1) gouf op Basis vu bekannte Harnstoffkonzentratiounen, déi als Standard benotzt goufen, quantifizéiert.
Fir den Effekt vun der Ernährung op d'Iwwerliewe vu Weibchen, déi Wirt sichen a bluttsaugen, ze bewäerten, goufen d'Moustiquen eenzel a grouss Petrischalen (12 cm Duerchmiesser a 6 cm Héicht; Semadeni) mat engem mat Netz bedeckte Lach am Deckel (3 cm Duerchmiesser) fir Belëftung a Liewensmëttelversuergung geluecht. D'Ernährung gouf direkt no 4 dpe zur Verfügung gestallt an huet 1% verdënnte frëschen an alerten Kouurin, véier Konzentratioune vun Harnstoff an zwou Kontrollen, 10% Saccharose a Waasser abegraff. All Ernährung gouf op en Zänntampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) pipettéiert, deen an eng 5 ml Sprëtz (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE) agefouert gouf, de Kolben erausgeholl an op eng Petrischalen geluecht (Figur 1).1A). Ännert Är Ernährung all Dag. Halt de Laboratoire wéi uewe beschriwwen. Iwwerliewend Moustiquen goufen zweemol am Dag gezielt, während dout Moustiquen ewechgehäit goufen, bis déi lescht Moustique gestuerwen ass (n = 40 pro Behandlung). D'Iwwerliewe vu Moustiquen, déi mat verschiddenen Ernährungen gefiddert goufen, gouf statistesch analyséiert mat Kaplan-Meyer Iwwerliewenskurven a Log-Rank Tester. fir d'Iwwerliewensverdeelung tëscht Diäten ze vergläichen (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Eng speziell Moustique-Fléimille baséiert op Attisano et al.[17], gemaach aus 5 mm décke klore Acrylplacken (10 cm breet x 10 cm laang x 10 cm héich) ouni viischt an hënnescht Placken (Fig. 3: uewen). Eng Schwenkmontage mat engem vertikale Rouer aus enger Gaschromatographiesail (0,25 mm bannenzegen Duerchmiesser; 7,5 cm laang) mat Enden, déi op eng Insektennadel gepecht sinn, déi tëscht engem Puer Neodymmagnete mat 9 cm Auserneen hänkt. En horizontalt Rouer aus dem selwechte Material (6,5 cm laang) huet dat vertikalt Rouer halbéiert fir en ugebonnenen Aarm an en Aarm ze bilden, deen e klengt Stéck Aluminiumfolie als Liichtënnerbriechungssignal gedroen huet.
24-Stonne-verhongerte Weibchen kruten déi uewe genannte Ernährung fir 30 Minutte virum Fesselen. Voll gefidderte Weibchenmücken goufen dann individuell fir 2-3 Minutten op Äis narkotiséiert a mat Bienenwachs un Insektennadelen (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) befestegt an dann un d'Äerm vun den horizontalen Réier gebonnen. Fléiemillen. D'Ëmdréiunge pro Fluch goufen vun engem speziell gebauten Datenlogger opgeholl, duerno mat der PC-Lab 2000™ Software (v4.01; Velleman, Gavere, BE) gespäichert an ugewisen. D'Fluchmillen gouf an engem klimatreguléierte Raum placéiert (12 Stonnen:12 Stonnen, Liicht:Däischter, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RF).
Fir d'Muster vun der Fluchaktivitéit ze visualiséieren, goufen déi total geflunn Distanz (m) an déi total Zuel vun den hannereneen Fluchaktivitéiten pro Stonn iwwer eng Period vun 24 Stonnen berechent. Zousätzlech goufen déi duerchschnëttlech Distanzen, déi vun eenzelne Fraen geflunn goufen, tëscht de Behandlungen verglach an mat Hëllef vun enger One-Way-ANOVA an der Post-hoc-Analyse vun Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) analyséiert, wou déi duerchschnëttlech Distanz als ofhängeg Variabel ugesi gouf, während d'Behandlung en onofhängege Faktor ass. Zousätzlech gëtt déi duerchschnëttlech Zuel vun de Ronnen a Schrëtt vun 10 Minutten berechent.
Fir den Effekt vun der Ernährung op d'Reproduktiounsleistung vun An.arabiensis ze evaluéieren, goufen sechs Weibchen (4 dpe) no der Bluttsammlung direkt an Bugdorm-Käfeger (30 cm × 30 cm × 30 cm) transferéiert an duerno fir 48 Stonnen déi experimentell Ernährung wéi uewe beschriwwen zur Verfügung gestallt. D'Ernährung gouf dann ewechgeholl an Laichbecher (30 ml; Nolato Hertila), gefëllt mat 20 ml destilléiertem Waasser, goufen um drëtten Dag fir 48 Stonnen zur Verfügung gestallt, all 24 Stonnen ausgetosch. Widderhuelt all Ernährungsschema 20-50 Mol. D'Eeër goufen fir all experimentellen Käfeg gezielt an opgeholl. Ënnerprouwe vun Eeër goufen benotzt fir d'Variatioun vun der mëttlerer Gréisst a Längt vun den eenzelnen Eeër (n ≥ 200 pro Ernährung) mat engem Dialux-20 Mikroskop (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) mat enger Leica Kamera (DFC) 320 R2 ze evaluéieren; Leica Microsystems Ltd., DE). Déi reschtlech Eeër goufen 24 Stonnen an engem klimatiséierte Raum ënner Standardzuuchtbedingungen gehalen, an eng Ënnerprouf vu kierzlech opgedauchten Larven aus dem 1. Instar (n ≥ 200 pro Diät) gouf gemooss, wéi uewe beschriwwen. D'Zuel vun den Eeër an d'Gréisst vun den Eeër a Larven goufen tëscht de Behandlungen a mat Hëllef vun enger One-Way-ANOVA an der Post-hoc-Analyse vun Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) verglach.
Flüchteg Substanzen aus frëschem (1 Stonn no der Proufnahme), 24 Stonnen, 72 Stonnen an 168 Stonnen alen Urin goufen aus Prouwe gesammelt, déi vu Zebu-Ranner, Arsi-Rassen gesammelt goufen. Aus Komfortgrënn goufen d'Urinprouwe fréi moies gesammelt, während d'Kéi nach am Stall waren. Urinprouwe goufe vun 10 Persoune gesammelt an 100-200 ml vun all Prouf goufen an individuell Polyamid-Backbeutel (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) an 3-l Polyamid mat Deckel a Vinylchlorid-Plastikfässer transferéiert. Flüchteg Substanzen aus all Rëndurinprouf goufen entweder direkt (frësch) oder no der Reifung bei Raumtemperatur fir 24 Stonnen, 72 Stonnen an 168 Stonnen gesammelt, d.h. all Urinprouf war representativ fir all Altersgrupp.
Fir d'Sammlung vu flüchtege Stoffer aus dem Kappraum gouf e zougemaachte System benotzt, fir e mat Aktivkuel gefilterte Gasstroum (100 ml min-1) duerch e Polyamidbeutel fir 2,5 Stonnen an d'Adsorptiounssail ze zirkuléieren, andeems eng Membran-Vakuumpompel (KNF Neuberger, Freiburg, DE) benotzt gouf. Als Kontroll gouf d'Sammlung vum Kappraum aus engem eidele Polyamidbeutel duerchgefouert. D'Adsorptiounssail war aus Teflon-Schläich (5,5 cm x 3 mm bannenzegen Duerchmiesser) gemaach, déi 35 mg Porapak Q (50/80 Mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) tëscht Glaswollproppen enthalen hunn. Virum Gebrauch gouf d'Sail mat 1 ml nei destilléiertem n-Hexan (Merck, Darmstadt, DE) an 1 ml Pentan (99,0% reint Léisungsmëttel GC-Qualitéit, Sigma Aldrich) gespullt. Déi adsorbéiert flüchteg Stoffer goufen mat 400 μl Pentan eluéiert. D'Sammlunge vum Kappraum goufen zesummegefaasst an dann bei -20°C gelagert, bis se fir weider Analysen benotzt goufen.
Verhalensreaktiounen vun An, déi sech dem Wirt sichen an dem Blutt iessen. Flüchteg Extrakter aus dem Headspace, déi aus frëschem, 24-Stonne-, 72-Stonne- an 168-Stonne-Urin gesammelt goufen, goufen op flüchteg Extrakter vun Arabidopsis-Mücken analyséiert mat engem riichte Glasröhrchen-Olfaktometer [18]. D'Experimenter goufen während ZT 13-15 duerchgefouert, der Héichpunktperiod vun der Heemsichaktivitéit vun An. Arab [19]. En Olfaktometer aus Glasröhrchen (80 cm × 9,5 cm bannenzeg) gouf mat 3 ± 1 lx roudem Liicht vun uewen beliicht. Holzkuel gefilterten a befeuchteten Loftstroum (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relativ Fiichtegkeet) ass de Bioassay mat 30 cm s-1 passéiert. D'Loft gëtt duerch eng Serie vun Edelstahl-Netzwierker geleet, wouduerch e laminare Stroum an eng eenheetlech Fiederstruktur entsteet. Dental Tampon-Spender (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), deen un enger 5 cm Spiral um Wandende vum Olfaktometer hänkt, mat Stimulatorwiessel all 5 Minutten. Fir d'Analyse goufen 10 μl vun all Headspace-Extrakt, verdënnt 1:10, als Stimulus benotzt. Eng gläich Quantitéit Pentan gouf als Kontroll benotzt. Individuell Wirtssichend oder blutsaugend Moustiquen goufen 2-3 Stonnen virum Ufank vum Experiment an individuell Fräiloossungskäfeg placéiert. De Fräiloossungskäfeg gouf op der Wandsäit vum Olfaktometer placéiert, an d'Moustiquen kruten 1 Minutt Zäit sech unzepassen, an duerno gouf d'Päiperleksventil vum Käfeg opgemaach fir fräizesetzen. D'Attraktioun un d'Behandlung oder d'Kontroll gouf als den Undeel vun de Moustiquen analyséiert, déi bannent 5 Minutte no der Fräiloossung a Kontakt mat der Quell koumen. All Headspace-flüchtegen Extrakt a Kontroll goufen op d'mannst 30 Mol replizéiert, an fir d'Effekter vun engem eenzegen Dag ze vermeiden, gouf déiselwecht Zuel vun Behandlungen a Kontrollen un all Experimentdag getest. Sichantworten vum Wirt an dem Bluttgefidderten Ans. Arabesch versus Headspace-Sets goufen mat nominaler logistescher Regressioun analyséiert, gefollegt vu paarweise Vergläicher fir ongerueden Verhältnisser (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institut Inc.).
D'Laichreaktioun vun der An. Headspace-Extrakter aus frëschem a gereiftem Kou-Urin goufen a Bugdorm-Käfege (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) analyséiert. Plastikbecher (30 mL; Nolato Hertila), gefëllt mat 20 mL destilléiertem Waasser, hunn de Laichsubstrat geliwwert a goufen an géigeniwwerleeënden Ecker vum Käfeg placéiert, 24 cm vuneneen ewech. D'Behandlungsbecher goufen mat 10 μl vun all Headspace-Extrakt an enger Verdënnung vun 1:10 ugepasst. Eng gläich Quantitéit Pentan gouf benotzt fir de Kontrollbecher unzepassen. Behandlungs- a Kontrollbecher goufen tëscht all Experiment ausgetosch fir Positiounseffekter ze kontrolléieren. Zéng blutgefiddert Weibercher goufen an experimentell Käfege bei ZT 9-11 fräigelooss an d'Eeër an de Becher goufen 24 Stonnen méi spéit gezielt. D'Formel fir de Laichindex ze berechnen ass: (d'Zuel vun den Eeër, déi an der Behandlungsbecher geluecht goufen - d'Zuel vun den Eeër, déi an der Kontrollbecher geluecht goufen)/(d'Gesamtzuel vun den Eeër). All Behandlung gouf 8 Mol widderholl.
Gaschromatographesch an Elektronenantennemusterdetektioun (GC-EAD) Analyse vu weiblechen An.arabiensis gouf wéi virdru beschriwwen duerchgefouert [20]. Kuerz gesot, frësch flüchteg Headspace Extrakter goufen getrennt mat engem Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) ausgestatteten mat enger HP-5 Kolonn (30 m × 0,25 mm i.d., 0,25 μm Filmdicke, Agilent Technologies). an alternd Urin. Waasserstoff gouf als mobil Phas mat enger duerchschnëttlecher linearer Duerchflussquote vu 45 cm s-1 benotzt. All Prouf (2 μl) gouf fir 30 Sekonnen am Splitless-Modus mat enger Inlettemperatur vun 225 °C injizéiert. D'GC-Uewentemperatur gouf vu 35 °C (3 Minutte Halt) op 300 °C (10 Minutte Halt) bei 10 °C min-1 programméiert. Am GC-Ofwaassersplitter goufen 4 psi Stéckstoff bäigefüügt an 1:1 an engem Gerstel 3D/2 Low Dead Volume Cross (Gerstel, Mülheim, DE) tëscht dem Flammioniséierungsdetektor an dem EAD gespléckt. De GC-Ofwaasserkapillar fir EAD gouf duerch eng Gerstel ODP-2 Transferleitung, déi d'GC-Uewentemperatur plus 5 °C verfollegt, an e Glasröhrchen (10 cm × 8 mm) geleet, wou et mat Kuelestoffgefilterter, befeuchteter Loft (1,5 l min-1) gemëscht gouf. D'Antenn gouf placéiert 0,5 cm vum Ausgang vum Rouer ewech. All eenzel Moustique huet ee Widdersproch ausgemaach, a fir Wirtssichend Moustiquen goufen op d'mannst dräi Widdersproch mat Urinprouwen vun all Alter duerchgefouert.
Identifikatioun vu bioaktive Verbindungen an Headspace-Sammlungen vu frëschem a gereiftem Rëndurin mat Hëllef vun engem kombinéierte GC- a Massespektrometer (GC-MS; 6890 GC an 5975 MS; Agilent Technologies) fir Antennreaktiounen an der GC-EAD-Analyse auszeléisen, déi am Elektronen-Impact-Ioniséierungsmodus bei 70 eV funktionéiert. De GC war mat enger HP-5MS UI-beschichteter, geschmolzener Siliziumdioxid-Kapillarkolonn (60 m × 0,25 mm bannenzegen Duerchmiesser, 0,25 μm Filmdicke) ausgestatt, déi Helium als mobil Phase mat enger duerchschnëttlecher linearer Duerchflussrate vun 35 cm s-1 benotzt huet. Eng 2 μl Prouf gouf mat de selwechten Injektorastellungen an Uewentemperatur wéi fir d'GC-EAD-Analyse injizéiert. D'Verbindunge goufen op Basis vun hirer Retentiounszäit (Kovát-Index) a Massespektren am Verglach mat der personaliséierter Bibliothéik an der NIST14-Bibliothéik (Agilent) identifizéiert. Identifizéiert Verbindungen goufen duerch d'Injektioun vun authentesche Standarden bestätegt (Zousätzlech Datei 1: Tabelle S2). Fir d'Quantifizéierung gouf Heptylacetat (10 ng, 99,8% chemesch Rengheet, Aldrich) gouf als externen Standard injizéiert.
Evaluatioun vun der Effizienz vun enger synthetescher Gerochsmëschung, déi aus bioaktive Verbindungen besteet, déi a frëschem an agelafenem Urin identifizéiert goufen, fir Wirtssichend an blutsaugend Ans.arabiensis unzezéien, mat dem selwechten Olfaktometer a Protokoll wéi uewen. Synthetesch Mëschunge hunn d'Zesummesetzung an d'Proportioune vu Verbindungen a gemëschte flüchtege Headspace-Extrakter vu frëschem, 24-Stonne-, 48-Stonne-, 72-Stonne- an 168-Stonne-aalen Urin imitéiert (Figur 5D-G; Zousätzlech Datei 1: Tabelle S2). Fir d'Analyse benotzt 10 μl vun enger 1:100 Verdënnung vun der vollsynthetescher Mëschung, mat enger Gesamtfräisetzungsquote vun ongeféier 140-2400 ng h-1, fir d'Attraktivitéit fir Wirts- a blutsaugend Moustiquen ze bewäerten. Duerno gëtt den Test op komplette Mëschunge duerchgefouert, bei deenen subtraktiv Mëschunge vun eenzelne Verbindungen aus der kompletter Mëschung ewechgeholl ginn. Sichantworten vum Wirt an dem blutgefidderten Ans. Arab vs. synthetesch a subtraktiv Mëschunge goufen mat nominaler logistescher Regressioun analyséiert, gefollegt vu paarweise Vergläicher fir ongerueden Verhältnisser. (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institut Inc.).
Fir ze bewäerten, ob Kouurin als Wirthabitat fir Malaria-Muckuen dénge kéint, gouf frëschen an alen Kouurin, wéi uewe beschriwwen gesammelt, a Waasser a maschege 3-L-Eemeren (100 ml) placéiert an a Wirtsköderfalle gesat. (BG-HDT Versioun; BioGents, Regensburg, DE). Zéng Fallen, déi 50 m vuneneen op enger Weid placéiert goufen, 400 m vun der Duerfgemeinschaft ewech (Silay, Äthiopien, 5°53´24´´N, 37°29´24´´O) a ouni Ranner, op permanente Brutplazen an Dierfer. Fënnef Fallen goufen erhëtzt fir d'Präsenz vun engem Wirt ze simuléieren, während fënnef Fallen net erhëtzt goufen. All Behandlungsplaz gëtt all Nuecht fir insgesamt fënnef Nuechte rotéiert. D'Zuel vun de Mouquitoen, déi a Fallen agefaange goufen, déi mat Urin vu verschiddenen Alter geködert goufen, gouf mat enger logistescher Regressioun mat enger Beta-Binomialverdeelung verglach (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
An engem malariaendem Duerf bei der Stad Maki, an der Regioun Oromia, Äthiopien (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figur 6A). D'Studie gouf tëscht Mëtt August a Mëtt September virum jäerleche Sprëtzen mat Reschter dobannen duerchgefouert, zesumme mat enger laanger Reenzäit. Fënnef Puer Haiser (20–50 m vuneneen) um Rand vum Duerf goufen fir d'Studie ausgewielt (Fig. 6A). D'Kriterien, déi fir d'Auswiel vun den Haiser benotzt goufen, waren: keng Déieren am Haus erlaabt, kee Kachen dobannen (Brennholz oder Holzkuel zéien) war erlaabt (op d'mannst während der Testperiod), an Haiser mat maximal zwee Awunner, déi ouni Insektiziden schlofen. ënnert dem behandelte Moskitonetz. Déi ethesch Genehmegung gouf vum Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) vun der Fakultéit fir Naturwëssenschaften (CNS-IRB), Addis Abeba Universitéit, am Aklang mat de Richtlinne vun der Deklaratioun vun Helsinki vun der World Medical Association accordéiert. D'Zoustëmmung vun all Stotchef gouf mat der Hëllef vum Gesondheetsberodungspersonal kritt. De ganze Prozess gëtt vun de lokalen Verwaltungen op Distrikt- a Wardniveau ("Kebele") ënnerstëtzt. Den experimentellen Design ass engem 2 × 2 laténgesche Quadratdesign gefollegt, bei deem synthetesch Mëschungen a Kontrollen an der éischter Nuecht a gepaarte Haiser zougewisen an an der nächster experimenteller Nuecht tëscht den Haiser gewiesselt goufen. Dëse Prozess gouf zéngmol widderholl. Zousätzlech, fir d'Moskitoaktivitéit an ausgewählten Haiser ze schätzen, goufen d'CDC-Fallen agestallt fir fënnef Nuechten hannereneen um Ufank, an der Mëtt an um Enn vum Feldversuch zur selwechter Zäit vum Dag ze lafen.
Eng synthetesch Mëschung mat sechs bioaktive Verbindungen gouf an Heptan (97,0% Léisungsmëttel GC-Qualitéit, Sigma Aldrich) opgeléist a mat 140 ng h-1 mat engem Kotteng-Doch-Spender fräigesat [20]. Den Doch-Spender huet et erlaabt, all Verbindungen a konstante Proportiounen während dem 12-Stonne-Experiment fräizesetzen. Heptan gouf als Kontroll benotzt. D'Fläsch gouf nieft dem Entrée vun der Liichtfalle vun de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) opgehaangen (John W. Hock Company, Gainesville, FL, US; Figur 6A). D'Fallen goufen 0,8 - 1 m iwwer dem Buedem, no beim Fouss vum Bett, opgehaangen, an e Fräiwëllegen huet ënner engem onbehandelte Moskitonetz geschlof an tëscht 18:00 an 06:30 Auer operéiert. Moskitoen, déi no Geschlecht a physiologeschem Status agefaange goufen (ongefiddert, gefiddert, hallef schwanger a schwanger [21], goufen duerno mat enger Polymerasekettenreaktioun (PCR) Analyse getest, fir d'Aart z'identifizéieren, déi morphologesch als A. gambiae sl identifizéiert gouf. Membere vum Komplex [23]. An An der Feldstudie gouf d'Fall-Trapping vu gepaarte Haiser mat engem nominalen logistesche Fit-Modell analyséiert, wou d'Attraktioun déi ofhängeg Variabel war an d'Behandlung (synthetesch Mëschung vs. Kontroll) den fixen Effekt war (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Hei melden mir d'χ2- an d'p-Wäerter aus dem Likelihood Ratio Test.
Evaluéiert ob et sécher ass. arabiensis konnt Urin, seng Haaptstéckstoffquell, Harnstoff, duerch direkt Fütterung kréien, bannent 48 Stonnen no der Administratioun fir 4 Deeg no (dpe) Wirtssichend a blutgefütterte Weibchenfütterungsversich (Fig. 1A). Souwuel Wirtssichend wéi och blutsaugend Weibchen hunn däitlech méi Saccharose absorbéiert wéi all aner Diät oder Waasser (F(5.426) = 20,15, p < 0,0001 an F(5.299) = 56,00, p < 0,0001, respektiv; Fig. 1B,C). Ausserdeem hunn Wirtssichend Weibchen no 72 Stonnen manner am Urin giess am Verglach mat Urin no 168 Stonnen (Fig. 1B). Wann hinnen eng Diät mat Harnstoff ugebueden gouf, hunn Wirtssichend Weibchen eng däitlech méi grouss Quantitéit un Harnstoff mat 2,69 mM absorbéiert am Verglach mat all anere Konzentratiounen a Waasser, während se net vun 10% Saccharose z'ënnerscheeden sinn (F(10.813)). = 15,72, p < 0,0001; Figur 1D). Dëst stoung am Géigesaz zu der Äntwert vu blutgefütterte Weibercher, déi typescherweis däitlech méi Harnstoffhalteg Diäten ewéi Waasser absorbéiert hunn, obwuel däitlech manner wéi 10% Saccharose (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figur 1).1E). Ausserdeem, beim Verglach tëscht den zwou physiologeschen Zoustänn, hunn phlebotomiséiert Weibercher méi Harnstoff absorbéiert ewéi Weibercher, déi de Wirt gesicht hunn, bei de niddregsten Konzentratiounen, an dës Weibercher hunn ähnlech Quantitéiten un Harnstoff bei méi héije Konzentratiounen absorbéiert (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Wärend d'Zufuhr aus enger Harnstoffhalteger Diät optimal Wäerter ze hunn schéngt (Fig. 1D,E), konnten Weibercher an deenen zwou physiologeschen Zoustänn d'Quantitéit un Harnstoff, déi iwwer de ganze Beräich vun den Harnstoffkonzentratiounen absorbéiert gouf, loglinear moduléieren (Fig. 1F,G). Ähnlech schéngen d'Moustiquen hir Stickstoffopnam ze kontrolléieren, andeems se d'Quantitéit un absorbéiertem Urin reguléieren, well d'Quantitéit u Stickstoff am Urin sech an der absorbéierter Quantitéit reflektéiert (Figur 1B, C an B Asätz).
Fir d'Auswierkunge vun Urin an Harnstoff op d'Iwwerliewe vu Wirtsichende a blutsaugende Moustiquen ze evaluéieren, kruten d'Weibercher Urin vun alle véier Altersgruppen (frësch, 24 Stonnen, 72 Stonnen an 168 Stonnen no der Oflagerung) an eng Rei vun Harnstoffkonzentratiounen, souwéi destilléiert Waasser an 10% Saccharose hunn als Kontroll gedéngt (Figur 2A). Dës Iwwerliewensanalyse huet gewisen, datt d'Ernährung en signifikanten Afloss op d'Gesamtiwwerliewe bei Wirtsichende Weibercher hat (Urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) a blutsaugende Weibercher (Urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figur 2D,E). An all den Experimenter haten d'Weibercher, déi eng Diät aus Urin, Harnstoff a Waasser kruten, däitlech méi niddreg Iwwerliewensquoten am Verglach mat de Weibercher, déi eng Saccharose-Diät kruten (Figur 2B-E). Weibercher, déi sech op de Wirt gesat hunn, hunn ënnerschiddlech Iwwerliewensquoten opgewisen, woubäi déi, déi 72 Stonnen alen Urin (p = 0,016) kruten, déi niddregst Iwwerliewenswahrscheinlechkeet haten (Fig. 2B). Ausserdeem hunn Weibercher, déi sech op de Wirt gesat hunn, an déi 135 mM Harnstoff kruten, méi laang iwwerlieft wéi Kontrollpersounen aus Waasser (p < 0,04) (Fig. 2C). Am Verglach mat Waasser hunn d'Fraen, déi mat frëschem Urin a 24-Stonne-Urin kruten, méi laang iwwerlieft (p = 0,001 a p = 0,012; Figur 2D), während d'Fraen, déi mat 72-Stonne-Urin kruten, méi laang iwwerlieft hunn wéi déi, déi mat kuerzem frëschem Urin a 24-Stonne-gealtertem Urin kruten (p < 0,0001 a p = 0,013; Figur 2D). Wann d'Weibercher mat Blutt 135 mM Harnstoff kruten, hunn... huet méi laang iwwerlieft wéi all aner Konzentratioune vun Harnstoff a Waasser (p < 0,013; Figur 2E).
Iwwerliewe vun der Wiertsmücke an der blutsaugender Weibchen Anopheles arabinis, déi sech mat Kouurin an Harnstoff ernähren. Am Bioassay (A) kruten d'Weibchenmücken eng Ernährung, déi aus frëschem a gereiftem Kouurin, verschiddene Konzentratioune vun Harnstoff, Saccharose (10%) an destilléiertem Waasser (H2O) bestoung. D'Iwwerliewe vun de Wiertssichende (B, C) a blutsaugenden (D, E) Mücken gouf all 12 Stonnen opgeholl, bis all Weibchen, déi sech mat Urin (B, D) an Harnstoff (C, E) ernähren, an d'Kontrollmücken, Saccharose a Waasser, dout waren.
Déi total Distanz an d'Zuel vun de Ronnen, déi am Fluchmillentest iwwer eng 24-Stonne-Period bestëmmt goufen, hunn sech tëscht Wirtssichende a bluttsaugende Moustiquen ënnerscheed, déi am Allgemengen manner Fluchaktivitéit gewisen hunn (Fig. 3). Wirtssichend Moustiquen, déi frëschen an alen Urin oder Saccharose a Waasser geliwwert hunn, hunn ënnerschiddlech Fluchmuster gewisen (Fig. 3), woubäi d'Weibercher, déi sech mat frëschem Urin erniert hunn, méi aktiv um Sonnenopgang waren, während déi, déi 24- an 168-Stonne-al Moustiquen gefiddert hunn, ënnerschiddlech Fluchmuster gewisen hunn a sech haaptsächlech deeglech beschäftegen. Weiblech Moustiquen, déi Saccharose oder 72-Stonne-Urin geliwwert hunn, hunn während der ganzer 24-Stonne-Period Aktivitéit gewisen, während d'Weibercher, déi Waasser geliwwert hunn, an der Mëtt vun der Period méi aktiv waren. Moustiquen, déi mat Saccharose gefiddert goufen, hunn déi héchst Aktivitéitsniveauen spéit an der Nuecht a fréi moies gewisen, während déi, déi 72-Stonne-alen Urin konsuméiert hunn, e stännege Réckgang vun der Aktivitéit iwwer 24 Stonnen erlieft hunn (Figur 3).
Fluchleistung vun engem jeeër-sichende bluttsaugenden Weiberchen vun der Anopheles arabinis, dat sech mat Kou-Urin an Harnstoff erniert. Am Fluchmillentest goufen weiblech Moustiquen, déi sech mat frëschem a gereiftem Kou-Urin erniert hunn, verschidde Konzentratioune vun Harnstoff, Saccharose (10%) an destilléiertem Waasser (H2O), un horizontal, fräi rotéierend Äerm (uewen) gebonnen. Fir Wirtsichend (lénks) a bluttsaugend (riets) Weibercher goufen déi total Distanz an d'Zuel vun de Flich pro Stonn fir all Diät iwwer eng Period vun 24 Stonnen opgeholl (donkel: gro; hell: wäiss). Duerchschnëttlech Distanz an duerchschnëttlech Zuel vun den Attacken ginn riets vum zirkadianen Aktivitéitsdiagramm ugewisen. Fehlerbalken representéieren de Standardfehler vum Duerchschnëtt. Statistesch Analyse kuckt den Text.
Am Allgemengen huet d'Gesamtfluchaktivitéit vu Weibchen, déi Wirt sichen, engem Muster verfollegt, dat ähnlech wéi d'Fluchdistanz iwwer eng Period vun 24 Stonnen ass. Déi duerchschnëttlech Fluchdistanz gouf signifikant vun der ageholler Ernährung beaflosst (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), an Weibchen, déi Wirt sichen, déi 72 Stonnen Urin ageholl hunn, sinn däitlech méi laang geflunn am Verglach mat all anere Ernährungen (p < 0,0001), an d'Mécken, déi mat Saccharose gefiddert goufen, sinn méi laang geflunn wéi Mécken, déi mat frëschem (p = 0,022) a mat 24 Stonnen alen Urin (p = 0,022) gefiddert goufen. Am Géigesaz zum Fluchaktivitéitsmuster, dat vun der Urin-Ernährung beschriwwe gëtt, hunn d'Weibchen, déi mat Harnstoff gefiddert goufen, déi mat Harnstoff gefiddert goufen, eng persistent Fluchaktivitéit iwwer eng Period vun 24 Stonnen gewisen, mat engem Héichpunkt an der zweeter Hallschent vun der donkeler Phas (Fig. 3). Och wann d'Aktivitéitsmuster ähnlech waren, hunn d'Weibchen, déi mat Harnstoff gefiddert goufen, déi duerch Harnstoff gefiddert goufen, déi duerchschnëttlech Fluchdistanz signifikant erhéicht, ofhängeg vun der absorbéierter Konzentratioun (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Weibercher, déi Wirtssichend goufen, déi mat enger bestëmmter Harnstoffkonzentratioun gefiddert goufen, sinn méi laang geflunn wéi Weibercher, déi entweder Waasser oder Saccharose kruten (p < 0,03).
Déi allgemeng Fluchaktivitéit vun de bluttsaugende Moustiquen war stabil an huet iwwer 24 Stonnen iwwer all Diäten erhale bliwwen, mat enger erhéichter Urinaktivitéit an der zweeter Hallschent vun der donkeler Period fir Weibercher, déi mat Waasser gefiddert goufen, souwéi fir Weibercher, déi frësch a 24 Stonnen al gefiddert goufen (Bild 3). Wärend d'Urin-Diät déi duerchschnëttlech Fluchdistanz bei bluttgefidderte Weibercher signifikant beaflosst huet (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), huet d'Harnstoff-Diät dat net mat aneren Urin- a Kontrolldiäten (frësch, p = 0,0091; 72 Stonnen, p = 0,0022; 168 Stonnen, p = 0,001; Saccharose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036) gemaach.
D'Auswierkunge vun der Urin- an Harnstoffernierung op d'Reproduktiounsparameter goufen a Bioassays vum Eileeën evaluéiert (Figur 4A) a goufen no der Unzuel vun den Eeër, déi vun all Weibchen geluecht goufen, der Gréisst vun den Eeër an den nei ausgeschluppte Larven am éischten Instar ënnersicht. D'Zuel vun den Eeër, déi geluecht goufen. Urin-gefidderte arabesch Weibchen hunn no der Ernährung variéiert (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Weibchen, déi 24 Stonnen Urin- a Bluttmolzecht kritt hunn, hunn däitlech méi Eeër geluecht wéi Weibchen, déi aner Urin-Diäten kruten, a ware ähnlech wéi déi, déi Saccharose kritt hunn (Fig. 4B). Och d'Gréisst vun den Eeër, déi vun Urin-gefidderte Weibchen geluecht goufen, huet no der Ernährung variéiert (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), woubäi 24 Stonnen Urin- a Saccharose-gefidderte Weibchen däitlech méi grouss Eeër geluecht hunn wéi Waasser-gefidderte Weibchen, während d'Eeër vu Weibchen, déi 168 Stonnen Urin kritt hunn, däitlech méi kleng waren (Fig. 4C). Zousätzlech huet d'Urin-Ernährung d'Larvegréisst däitlech beaflosst. (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), mat däitlech méi groussen Larven, déi aus Eeër erauskoumen, déi vu 24- an 72-Stonne-alen, uringefidderte Weibchen geluecht goufen, wéi aus Eeër, déi vu Larven vun Eeër geluecht goufen. Waassergefidderte Weibchen an 168-Stonne-alen, uringefidderte Weibchen (Figur 4D).
Reproduktiounsleistung vu weibleche Moustiquen vun der Aart Anopheles arabinis, déi sech mat Kou-Urin an Harnstoff ernähren. Bluttgefidderte weiblech Moustiquen kruten 48 Stonnen, ier se a Bioassays placéiert goufen an Eeërleeësubstrater kritt goufen (A). D'Zuel vun den Eeër (B, E), d'Gréisst vun den Eeër (C, F) an d'Gréisst vun de Larven (D, G) goufe wesentlech vun der geliwwerter Ernährung beaflosst (Kou-Urin: BD; Harnstoff: EG). D'Moyenne fir all Parameter, déi mat verschiddene Buschtawennimm gemooss goufen, ware wesentlech vuneneen ënnerschiddlech (Een-Wee-ANOVA mat Tukey's Post-hoc-Analyse; p < 0,05). D'Feelerbalken representéieren de Standardfehler vum Moyennewäert.
Als déi wichtegst Stéckstoffkomponent vum Urin huet Harnstoff, wann et als Ernährung u blutgefidderte Weibchen zur Verfügung gestallt gouf, d'Reproduktiounsparameter an alle Studien signifikant beaflosst. D'Zuel vun den Eeër, déi vu Weibchen, déi Harnstoff gefiddert goufen, no engem Bluttmoolzecht geluecht goufen, ofhängeg vun der Harnstoffkonzentratioun (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), hunn Weibchen, déi Harnstoffkonzentratioune tëscht 134 µM an 1,34 mM gefiddert goufen, méi Eeër geluecht (Figur 4E). Weibchen, déi mat Harnstoffkonzentratioune vun 134 µM oder méi gefiddert goufen, hunn méi grouss Eeër geluecht wéi Weibchen, déi mat Waasser gefiddert goufen (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figur 4F), an d'Larvegréisst, obwuel se vun ähnlechen Harnstoffkonzentratioune bei de Mammen beaflosst gouf (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), war méi variabel (Fig. 4G).
Gesamtattraktioun zu Wirtssichenden Rënd-Urin-flüchtege Kappraum-Extrakten. Den Arabiensis, deen am Glasröhrchen-Olfaktometer (Fig. 5A) bewäert gouf, war signifikant vum Urinalter beaflosst (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). Post-hoc-Analyse huet gewisen, datt de Geroch vu muerdegem Urin no 24 Stonnen zu signifikant méi héije Attraktivitéitsniveauen gefouert huet am Verglach mat all anere Behandlungen (72 Stonnen: p = 0,0060, 168 Stonnen: p = 0,012, Pentan: p = 0,00070), ausser dem Geroch vu frëschem Urin (p = 0,13; Figur 5B). Och wann d'Gesamtattraktioun vu bluttsaugende Moustiquen zum Uringeroch net signifikant anescht war (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), goufen dës Weibercher als signifikant méi attraktiv fir flüchteg Kappraum-Extrakter fonnt am Verglach mat 72 Stonnen alen Urin am Verglach mat Kontrollen (p = 0,0066; Figur 5C).
Verhalensreaktiounen op natierlech an synthetesch Kou-Urin-Geroch bei der Sich no Wirt- a blutgefütterten Anopheles arabianus. Schema vum Glasröhrchen-Olfaktometer (A). Attraktioun vu flüchtege Headspace-Extrakter aus frëschem a gereiftem Kou-Urin op Wirt- (B) a blutsaugende (C) Moustiquen. Fannt d'Tentaklerreaktioun vum Lord An. Headspace-Extrakter, déi aus frëschem (D), 24-Stonne- (E), 72-Stonne- (F) an 168-Stonne- (G) gereiftem Kou-Urin isoléiert goufen, ginn gewisen. Elektronenantennendetektiounsspuren (EAD) weisen Spannungsännerungen als Äntwert op bioaktiv Verbindungen am Headspace, déi vum Gaschromatograph eluéiert an duerch e Flammioniséierungsdetektor (FID) detektéiert goufen. D'Skala-Balke representéiert d'Äntwertamplitude (mV) géint d'Retentiounszäit (s). D'Eegeschafte an d'Fräisetzungsraten (µg h-1) vun de biologesch aktive Verbindungen ginn gewisen. En eenzegen Asterisk (*) weist eng konsequent Äntwert mat gerénger Amplitude un. Duebel Asterisken (**) weisen net reproduzéierbar Äntwerten un. Fannt den Wirt (H) an Déi bluttsaugend (I) An.arabiensis huet ënnerschiddlech Attraktivitéiten zu synthetesche Mëschunge vu frëschem a gereiftem Koupurin. Déi duerchschnëttlech Proportioune vu Moustiquen, déi vun ënnerschiddleche Buschtawennimm ugezunn goufen, ware signifikant vuneneen ënnerschiddlech (Een-Wee-ANOVA mat Tukey senger Post-hoc-Analyse; p < 0,05). D'Feelerbalken representéieren de Standardfehler vun der Skala.
Weibchen Ann.arabiensis, 72 Stonnen an 120 Stonnen nom Bluttmoolzecht, wärend dem Laichen, gouf keng Präferenz fir flüchteg Headspace-Extrakter aus frëschem an alerten Kouurin am Verglach mat Pentan-Kontrollgruppen gewisen (χ2 = 3,07, p > 0,05; Zousätzlech Datei 1: Abb. S1).
Fir weiblech Ann.arabiensis hunn GC-EAD- an GC-MS-Analysen aacht, sechs, dräi an dräi bioaktiv Verbindungen identifizéiert (Figur 5D-G). Obwuel Ënnerscheeder an der Zuel vun de Verbindungen, déi elektrophysiologesch Reaktiounen ausgeléist hunn, observéiert goufen, waren déi meescht vun dëse Verbindungen an all flüchtege Headspace-Extrakt präsent, deen aus frëschem an alerten Urin gesammelt gouf. Dofir goufen fir all Extrakt nëmme Verbindungen, déi eng physiologesch Reaktioun vun de weiblechen Antennen iwwer dem Schwellwäert produzéiert hunn, an déi weider Analysen abegraff.
Déi total Fräisetzungsquote vu flüchtege bioaktive Verbindungen an der Headspace-Sammlung ass vun 29 µg h-1 a frëschem Urin op 242 µg h-1 an 168 Stonnen alen Urin geklommen, haaptsächlech wéinst der Erhéijung vu p-Cresol a m-Formaldehyd-Phenol souwéi Phenol. Am Géigesaz dozou sinn d'Fräisetzungsquoten vun anere Verbindungen, wéi 2-Cyclohexen-1-on an Dekanal, mat zunehmendem Urinalter erofgaang, wat mat der observéierter Ofsenkung vun der Signalintensitéit (Heefegkeet) am Chromatogramm (Fig. 5D)-G lénkse Panel) a physiologesche Reaktiounen op dës Verbindungen (Fig. 5D-G rietse Panel) korreléiert huet.
Am Allgemengen hat déi synthetesch Mëschung e ähnlecht natierlecht Verhältnis vu bioaktive Verbindungen, déi a flüchtege Extrakter vu frëschem an alen Urin-Kopfraum identifizéiert goufen (Fig. 5D-G) a schéngt kee wesentlechen Appel bei der Sich no engem Wirt (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) oder bluttsaugende Moustiquen (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Fig. 5I) ausgeléist ze hunn. Wéi och ëmmer, post-hoc Pairweise Vergläicher tëscht de Behandlungen hunn gewisen, datt Wirtssichend Moustiquen am Verglach mat Pentan-Kontrollgruppen däitlech attraktiv fir déi synthetesch Mëschung aus 24 Stonnen alen Urin waren (p = 0,0086; Figur 5H).
Fir d'Roll vun eenzelne Komponenten a synthetesche Mëschunge vun 24 Stonnen alem Urin ze evaluéieren, goufen sechs subtraktiv Mëschunge géint komplett Mëschungen am Y-Tube-Assay evaluéiert, bei deem eenzel Verbindungen ewechgeholl goufen. Fir Wirtssichend Moustiquen hat d'Subtraktioun vun eenzelne Verbindungen aus der kompletter Mëschung en signifikanten Effekt op d'Verhalensreaktiounen (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Zousätzlech Datei 1: Figur S2A), all subtraktiv Mëschunge ware méi attraktiv wéi voll gemëscht. Am Géigesaz dozou huet d'Ewechhuele vun eenzelne Verbindungen aus der voll synthetescher Mëschung d'Verhalensreaktioune vu bluttsaugende Moustiquen net beaflosst (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), mat Ausnam vun Dekanal, wat zu méi niddrege Niveauen am Verglach zum komplette Gemësch Attraction gefouert huet (p = 0,022; Zousätzlech Datei 1: Figur S2B).
An engem malariaendem Duerf an Äthiopien gouf d'Effizienz vun enger synthetescher Mëschung aus 24-Stonne Koupurin fir Moustiquen ënner Feldbedingungen unzezéien, iwwer zéng Nuechten evaluéiert (Fig. 6A). Am Ganzen goufen 4.861 Moustiquen gefaangen an identifizéiert, dovun 45,7% Anthropus.gambiae sl, 18,9% Anopheles pharoensis an 35,4% Culex spp. (Zousätzlech Datei 1: Tabelle S1). Anopheles arabinis ass dat eenzegt Member vum An.Gambian Spezieskomplex, dat duerch PCR-Analyse identifizéiert gouf. Am Duerchschnëtt goufen 320 Moustiquen pro Nuecht gefaangen, an där Zäit hunn Fallen mat synthetesche Mëschungsköder méi Moustiquen gefaangen wéi gepaarte Fallen ouni Mëschung (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Fallen ouni Köder goufen un all fënnef Kontrollnuechten um Ufank, an der Mëtt an um Enn vum Versuch opgestallt. Ähnlech Zuelen u Moustiquen goufen an all Puer vun ... gefaangen. Fallen, wat op kee Viruerteel tëscht Haiser (χ²(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) an kee Populatiounsréckgang während dem Studienzäitraum hiweist. Am Verglach mat Kontrollfalle war d'Zuel vun de Moustiquen, déi an de Fallen mat der synthetescher Mëschung gefaange goufen, däitlech erhéicht: Wirtssich (χ²(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), kierzlech Bluttnahrung (χ²(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) a Schwangerschaft (χ²(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Zousätzlech Datei 1: Tabelle S1). Dëst spigelt sech och an der Gesamtzuel vun de gefaange Moustiquen erëm: Wirtssich > blutsaugend > schwanger > hallefschwanger > männlech.
Feldevaluatioun vun der Effizienz vun enger 24-Stonne synthetescher Koupurin-Gerochsmëschung. Feldversich goufen am Süd-Zentral-Äthiopien (Kaart), no bei der Stad Maki (Insert), duerchgefouert, mat enger Liichtfalle vun de Centers for Disease Control (CDC) (riets) a gepaarte Ställ, mat engem laténgesche Quadratdesign (Loftfoto) (A). Synthetesch Gerochsköder-CDC-Fotofallen zéien a fänken weiblech Anopheles arabesken (B) un, awer net Anopheles farroes (C), op eng aner Manéier, e physiologesch zoustandsofhängegen Effekt. Zousätzlech hunn dës Fallen däitlech méi grouss Zuelen vun de Wirt-Culex-Mücken agefaangen. (D) Am Verglach mat der Kontroll. D'Balken lénks representéieren den duerchschnëttleche Selektiounsindex vu Mücken, déi a Puer vu Gerochsköder- (gréng) a Kontroll- (oppe) Fallen gefaange goufen (N = 10), während d'Balken riets den duerchschnëttleche Selektiounsindex a Puer vu Kontrollfallen (oppe; N = 5) representéieren. ).Asterisken weisen statistesch Signifikanzniveauen un (*p = 0,01 an ***p < 0,0001)
Déi dräi Aarte goufen ënnerschiddlech a Fallen mat synthetesche Mëschunge gefaangen. Bei der Sich no engem Wirt (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), Bluttzufuhr (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) a Schwangerschaft (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) gouf eng .arabiensis an der Fall gefaangen, wouduerch déi synthetesch Mëschung fräigesat gouf (Fig. 6B), während d'Quantitéit vun An net ënnerschiddlech war. Pharoensis a verschiddene physiologeschen Zoustänn goufen fonnt (Fig. 6C). Fir Culex gouf nëmmen eng bedeitend Erhéijung vun der Zuel vu Moustiquen, déi Wirt sichen, a Fallen fonnt, déi mat der synthetescher Mëschung geködert waren (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), am Verglach mat Kontrollfallen.
Köderfalle fir Wirtsmücken, déi baussent potenziellen Wirtsmücken tëscht Brutplazen a ländleche Gemeinschaften an Äthiopien placéiert waren, goufen benotzt fir ze evaluéieren, ob Malariamücken de Geroch vu Kouurin als Signal fir de Wirtshabitat benotzen. Wann et keng Signaler fir de Wirt gouf, wann et Hëtzt gouf, a mat oder ouni de Geroch vu Kouurin, goufen keng Mücken agefaangen (Zousätzlech Datei 1: Figur S3). Wéi och ëmmer, bei héijer Temperatur a Kouurin goufen d'weiblech Malariamücken ugezunn a gefaangen, obwuel a klenge Zuelen, onofhängeg vum Urinalter (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Zousätzlech Datei 1: Figur S3). Am Géigesaz dozou hunn d'Waasserkontrollen keng Malariamücken bei héijen Temperaturen agefaangen (Zousätzlech Datei 1: Figur S3).
Malaria-Mücken kréien a verdeelen stickstoffhalteg Verbindungen duerch kompensatoresch Ernierung vu Kou-Urin (dh Pëtzen), fir d'Liewensgeschichtseigenschaften ze verbesseren, ähnlech wéi aner Insekten [2, 4, 24, 25, 26]. Kou-Urin ass eng liicht verfügbar erneierbar Ressource, déi enk mat Rouplaze fir Malaria-Vektoren verbonnen ass, wéi z. B. Véiställ a grouss Vegetatioun no bei ländleche Haiser a Laichplazen. Weiblech Mücken lokaliséieren dës Ressource duerch Geroch a kënnen d'Opnam vu stickstoffhaltege Verbindungen am Urin reguléieren, dorënner Harnstoff, déi wichtegst stickstoffhalteg Komponent am Urin [15, 16]. Ofhängeg vum physiologeschen Zoustand vun der weiblecher Mück ginn Nährstoffer am Urin zougewisen, fir d'Fluchaktivitéit an d'Iwwerliewe vu Wirt-sichende weibleche Mücken, souwéi d'Iwwerliewens- a Reproduktiounseigenschaften vu blutgefidderte Persounen während dem éischte gonadotropen Zyklus ze verbesseren. Dofir spillt d'Urinmëschung eng wichteg Ernärungsroll fir Malaria-Vektoren, déi zou sinn, wéi ënnerernährt Erwuessener [8], well et weibleche Mücken d'Fäegkeet gëtt, wichteg stickstoffhalteg Verbindungen ze kréien, andeems se sech un enger gerénger Risiko-Ernierung bedeelegen. Dës Erkenntnis huet bedeitend epidemiologesch Konsequenzen, well d'Weibercher hir Liewensdauer erhéijen. Erwaardung, Aktivitéit a reproduktive Leeschtung, déi all d'Vektorkapazitéit beaflossen. Ausserdeem kéint dëst Verhalen d'Zil vu zukünftege Vektormanagementprogrammer sinn.