Merci fir besicht Nature.com.Dir benotzt eng Browser Versioun mat limitéierter CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Stiler a JavaScript.
Weist e Karussell vun dräi Rutschen op eemol.Benotzt d'Previous an Next Knäppercher fir duerch dräi Rutschen gläichzäiteg ze réckelen, oder benotzt d'Slider Knäppercher um Enn fir duerch dräi Rutschen gläichzäiteg ze réckelen.
D'Blutt-Gehir Barrière an d'Blutt-Gehir Barrière verhënneren biotherapeutesch Agenten hir Ziler am Zentralnervensystem z'erreechen, doduerch effektiv Behandlung vun neurologesche Krankheeten ze verhënneren.Fir nei Gehirtransporter in vivo z'entdecken, hu mir eng T7 Phage Peptidbibliothéik agefouert a seriell gesammelt Blutt a Cerebrospinal Flëssegkeet (CSF) mat engem kanuléierte bewosst grousse Poolmodell vu Ratten.Spezifesch phage clones sech an CSF no véier Ronne vun Auswiel héich beräichert.Testen vun eenzelne Kandidat Peptiden huet méi wéi 1000-fach Beräicherung am CSF opgedeckt.D'Bioaktivitéit vun der Peptid-mediéierter Liwwerung am Gehir gouf bestätegt duerch eng 40% Reduktioun vum Niveau vun Amyloid-β an der cerebrospinal Flëssegkeet mat engem BACE1 Peptid-Inhibitor verbonne mat dem identifizéierten neien Transitpeptid.Dës Resultater suggeréieren datt d'Peptiden, déi duerch in vivo Phage Selektiounsmethoden identifizéiert ginn, nëtzlech Gefierer kënne sinn fir systemesch Liwwerung vu Makromolekülen am Gehir mat engem therapeuteschen Effekt.
Zentralnervensystem (CNS) geziilte Therapiefuerschung huet sech gréisstendeels op d'Identifikatioun vun optimiséierten Drogen an Agenten konzentréiert, déi CNS-geziilt Eegeschafte weisen, mat manner Effort fir d'Mechanismen z'entdecken, déi aktiv Medikament Liwwerung an d'Gehir féieren.Dëst fänkt elo un ze änneren well d'Medikamenter Liwwerung, besonnesch grouss Moleküle, en integralen Deel vun der moderner Neurowëssenschaftsmedikamententwécklung ass.D'Ëmfeld vum Zentralnervensystem ass gutt geschützt vum cerebrovaskuläre Barrièresystem, besteet aus der Blutt-Gehir Barrière (BBB) ​​an der Blutt-Gehir Barrière (BCBB)1, wat et usprochsvoll mécht Drogen an d'Gehir ze liwweren1,2.Et gëtt geschat datt bal all grouss Molekül Medikamenter a méi wéi 98% vu klenge Molekül Medikamenter aus dem Gehir eliminéiert ginn3.Dofir ass et ganz wichteg nei Gehirntransportsystemer z'identifizéieren déi effizient a spezifesch Liwwerung vun therapeutesche Medikamenter un d'ZNS 4,5 ubidden.Wéi och ëmmer, de BBB a BCSFB presentéieren och eng exzellent Geleeënheet fir Medikament Liwwerung wéi se an all Strukture vum Gehir duerch seng extensiv Vaskulatur penetréieren an anzeginn.Also sinn déi aktuell Efforte fir net-invasiv Methoden fir d'Liwwerung am Gehir ze benotzen haaptsächlech op de Mechanismus vum Rezeptor-mediéierten Transport (PMT) mat dem endogenen BBB6 Rezeptor baséiert.Trotz rezente Schlëssel Fortschrëtter benotzt den Transferrin Rezeptor Pathway7,8, ass weider Entwécklung vun neie Liwwersystemer mat verbesserten Eegeschafte erfuerderlech.Zu dësem Zweck war eist Zil d'Peptiden z'identifizéieren, déi fäeg sinn den CSF-Transport ze mediéieren, well se am Prinzip benotzt kënne fir Makromolekülen un d'ZNS ze liwweren oder nei Rezeptorweeër opzemaachen.Besonnesch spezifesch Rezeptoren an Transporter vum zerebrovaskuläre System (BBB a BSCFB) kënnen als potenziell Ziler fir déi aktiv a spezifesch Liwwerung vu biotherapeuteschen Drogen déngen.Cerebrospinal Flëssegkeet (CSF) ass e sekretorescht Produkt vum Choroid Plexus (CS) an ass am direkte Kontakt mat der interstitiell Flëss vum Gehir duerch de subarachnoid Raum a ventrikuläre Raum4.Viru kuerzem gouf gewisen datt subarachnoid cerebrospinal Flëssegkeet exzessiv an d'Interstitium vum Gehir9 diffuséiert.Mir hoffen op de parenchymale Raum mat dësem subarachnoid Inflow Tract oder direkt duerch de BBB ze kommen.Fir dëst z'erreechen, hu mir eng robust in vivo Phage Selektiounsstrategie implementéiert déi ideal Peptiden identifizéiert, déi duerch entweder vun dësen zwee verschidde Weeër transportéiert ginn.
Mir beschreiwen elo eng sequenziell in vivo Phage Display Screening Method mat CSF Sampling gekoppelt mat héijer Duerchgang Sequencing (HTS) fir initial Selektiounsronnen mat der héchster Bibliothéik Diversitéit ze iwwerwaachen.Screening gouf op bewosst Ratten mat enger permanent implantéierter grousser Cisterna (CM) Cannula gemaach fir Bluttkontaminatioun ze vermeiden.Wichteg ass, dës Approche wielt souwuel Gehir-Targeting a Peptiden mat Transportaktivitéit iwwer d'zerebrovaskulär Barrière.Mir hunn T7 Phasen benotzt wéinst hirer klenger Gréisst (~ 60 nm)10 a proposéiert datt se gëeegent sinn fir den Transport vu Vesikelen déi transzellulär Kräizung vun der Endothelial an /oder Epithel-Medulla Barrière erlaben.No véier Ronne vu Panning goufen Phage Populatiounen isoléiert, déi staark in vivo CSF-Beräicherung a cerebral Mikrovessel Associatioun weisen.Wichteg, mir konnten eis Erkenntnisser bestätegen andeems mir demonstréieren datt déi bevorzugt a chemesch synthetiséiert bescht Kandidat Peptiden fäeg sinn Proteinladung an d'Cerebrospinal Flëss ze transportéieren.Als éischt goufen d'pharmakodynamesch Effekter vun der ZNS etabléiert andeems e führend Transit-Peptid mat engem Inhibitor vum BACE1-Peptid kombinéiert gouf.Zousätzlech fir ze demonstréieren datt in vivo funktionell Screeningstrategien nei Gehirtransportpeptide als effektiv Proteincargo Carrier identifizéieren, erwaarden mir datt ähnlech funktionell Selektiouns Approche och wichteg ginn fir nei Gehirtransportweeër z'identifizéieren.
Baséierend op Plaque-bildend Eenheeten (PFU), no der Phage Verpackungsschrëtt, gouf eng Bibliothéik vun zoufälleg 12-mer linear T7 Phage Peptiden mat enger Diversitéit vun ongeféier 109 entworf a erstallt (kuckt Materialien a Methoden).Et ass wichteg ze notéieren datt mir dës Bibliothéik virsiichteg analyséiert hunn ier in vivo Panning.PCR Verstäerkung vun Phage Bibliothéik Echantillon benotzt modifizéiert primers generéiert amplicons datt direkt applicabel op HTS waren (Ergänzlech Lalumi 1a).Wéinst engem) HTS11 sequencing Feeler, b) Impakt op d'Qualitéit vun primers (NNK) 1-12, an c) d'Präsenz vun Wild-Typ (wt) phage (Skelett Inserts) an der Standby Bibliothéik, war eng Sequenz Filter Prozedur ëmgesat nëmmen verifizéiert Sequenz Informatiounen Extrait (Ergänzlech Fig. 1b).Dës Filterschrëtt gëllen fir all HTS Sequenzéierungsbibliothéiken.Fir d'Standardbibliothéik goufen insgesamt 233.868 Liesunge kritt, vun deenen 39% d'Filterkriterien passéiert hunn a fir d'Bibliothéiksanalyse a Selektioun fir spéider Ronnen benotzt goufen (Ergänzungsbild 1c-e).D'Liesen waren haaptsächlech Multiple vun 3 Base Puer an Längt mat engem Héichpunkt bei 36 Nukleotiden (Ergänzlech Lalumi 1c), confirméiert der Bibliothéik Design (NNK) 1-12.Notamment enthalen ongeféier 11% vun de Bibliothéikmemberen en 12-dimensionalen Wild-Typ (wt) Réckgrat PAGISRELVDKL Insert, a bal d'Halschent vun de Sequenzen (49%) enthalen Insertiounen oder Läschen.D'HTS vun der Bibliothéik Bibliothéik bestätegt déi héich Diversitéit vun peptides an der Bibliothéik: méi wéi 81% vun peptide Haaptrei goufen nëmmen eemol fonnt an nëmmen 1,5% geschitt an ≥4 Exemplare (Ergänzlech Lalumi 2a).D'Frequenzen vun Aminosäuren (aa) op all 12 Positiounen am Repertoire korreléiert gutt mat den Frequenzen, déi erwaart gi fir d'Zuel vun de Codonen, déi vum degeneréierten NKK Repertoire generéiert ginn (Ergänzlech Fig. 2b).Déi observéiert Frequenz vun aa Reschter, déi vun dësen Inserts kodéiert sinn, korreléiert gutt mat der berechent Frequenz (r = 0,893) (Ergänzlech Fig. 2c).D'Virbereedung vu Phagebibliothéike fir d'Injektioun enthält d'Schrëtt vun der Amplifikatioun an der Entfernung vum Endotoxin.Dëst gouf virdru gewisen fir potenziell d'Diversitéit vun de Phagebibliothéiken ze reduzéieren12,13.Dofir, sequented mir eng Plack-amplified phage Bibliothéik datt Endotoxin Ewechhuele weiderentwéckelt an et mat der Original Bibliothéik Verglach d'Frequenz vun AA ze schätzen.Eng staark Korrelatioun (r = 0.995) war tëscht dem Original Pool an der verstäerkter a gereinegt Pool observéiert (Ergänzlech Lalumi 2d), wat beweist, datt Konkurrenz tëscht Klonen amplifizéiert op Placke mat T7 Phage net grouss Bias verursaacht huet.Dëse Verglach baséiert op der Frequenz vun Tripeptid Motiver an all Bibliothéik, well d'Diversitéit vun de Bibliothéiken (~ 109) kann net voll ageholl ginn och mat HTS.Frequenz Analyse vun aa op all Positioun réischt eng kleng Positioun-ofhängeg Viraussetzung an de leschten dräi Positiounen vun der koum Repertoire (Ergänzlech Lalumi 2e).Als Conclusioun hu mir ofgeschloss datt d'Qualitéit an d'Diversitéit vun der Bibliothéik akzeptabel waren an nëmme kleng Ännerungen an der Diversitéit observéiert goufen wéinst der Amplifikatioun an der Preparatioun vu Phagebibliothéiken tëscht e puer Ronnen vun der Auswiel.
Serial cerebrospinal flësseg Sampling kann duerch chirurgesch Implantatioun vun enger Kanül an de CM vu bewosst Ratten gemaach ginn, fir d'Identifikatioun vun T7 Phage intravenös (iv) iwwer de BBB an /oder BCSFB (Fig. 1a-b) ze erliichteren.Mir benotzt zwee onofhängeg Auswiel Waffen (Waffen A a B) an den éischten dräi Ronnen vun VIVO Auswiel (Figebam. 1c).Mir hunn d'Stringenz vun der Selektioun graduell erhéicht andeems de Gesamtbetrag vun der Phage, déi an den éischten dräi Selektiounsronnen agefouert gouf, reduzéiert gëtt.Fir déi véiert Ronn Panning hu mir Proben aus de Branchen A a B kombinéiert an dräi zousätzlech onofhängeg Selektioune gemaach.Fir d'in vivo Eegeschafte vun T7 Phage Partikelen an dësem Modell ze studéieren, gouf Wild-Typ Phage (PAGISRELVDKL Master Insert) a Ratten iwwer d'Schwanzven injizéiert.Erhuelung vun phages aus cerebrospinal Flëssegket a Blutt op verschidden Zäit Punkten gewisen, datt relativ kleng T7 icosahedral phages eng rapid initial Clearance Phase aus dem Blutt compartment haten (Ergänzlech Fig. 3).Baséierend op den verwalteten Titer an dem Bluttvolumen vun de Ratten, hu mir berechent datt nëmmen ongeféier 1% wt.Phage vun der verwalteter Dosis gouf 10 Minutte no der intravenöser Injektioun am Blutt festgestallt.No dësem initialen schnelle Réckgang gouf e méi luesen primäre Clearance mat enger Hallefzäit vun 27,7 Minutten gemooss.Wichteg ass, datt nëmme ganz wéineg Phasen aus dem CSF-Kompartiment erëmfonnt goufen, wat en nidderegen Hannergrond fir d'Wild-Typ Phage Migratioun an d'CSF-Kompartiment besot (Ergänzlech Fig. 3).Am Duerchschnëtt sinn nëmmen ongeféier 1 x 10-3% Titer vun T7 Phage am Blutt a 4 x 10-8% vun ursprénglech infuséierter Phasen an der cerebrospinal Flëss iwwer déi ganz Probeperiod (0-250 min) festgestallt.Notamment war d'Hallefzäit (25,7 min) vun der Wild-Typ Phage a cerebrospinal Flëssegkeet ähnlech wéi déi am Blutt observéiert.Dës Donnéeën weisen datt d'Barriär, déi d'CSF-Kompartiment aus dem Blutt trennt, intakt ass an CM-kanuléierte Ratten, wat in vivo Selektioun vu Phagebibliothéiken erlaabt Klonen z'identifizéieren, déi einfach aus dem Blutt an d'CSF-Kompartiment transportéiert ginn.
(a) Eng Method opsetzen fir d'Zerebrospinalflëssegkeet (CSF) aus engem grousse Pool nei ze probéieren.(b) Diagramm weist d'zellulär Lag vun der Zentralnervensystem (CNS) Barrière an d'Selektiounsstrategie déi benotzt gëtt fir Peptiden z'identifizéieren déi d'Blutt-Gehir Barrière (BBB) ​​an d'Blutt-Gehir Barrière iwwerschreiden.(c) In vivo Phage Display Screening Flowchart.An all Ronn vun der Selektioun goufen Phasen (Déierenidentifizéierer bannent de Pfeile) intravenös injizéiert.Zwou onofhängeg alternativ Filialen (A, B) ginn getrennt bis zur 4. Auswielronn gehal.Fir Selektiounsronnen 3 a 4 gouf all Phageklon aus CSF extrahéiert manuell sequentéiert.(d) Kinetik vu Phage isoléiert vu Blutt (roude Kreeser) a Cerebrospinal Flëssegkeet (gréng Dräieck) während der éischter Ronn vun der Selektioun an zwee kanuléierte Ratten no intravenöser Injektioun vun der T7 Peptidbibliothéik (2 x 1012 Phasen / Déier).Blo Quadrate weisen op déi duerchschnëttlech initial Konzentratioun vu Phage am Blutt, berechent aus der Quantitéit vun injizéierter Phage, andeems de Gesamt Bluttvolumen berücksichtegt gëtt.Déi schwaarz Quadrate weisen de Punkt vun der Kräizung vun der y Linn extrapoléiert aus Bluttphage Konzentratioune.(e, f) Presentéieren déi relativ Frequenz an Verdeelung vun all méiglech iwwerlappend tripeptide Motiver am peptide fonnt.D'Zuel vun de Motiver fonnt an 1000 Liesungen gëtt gewisen.Bedeitend (p <0,001) beräichert Motiver si mat roude Punkte markéiert.(e) Korrelatioun Scatterplot vergläicht d'relativ Frequenz vum Tripeptidmotiv vun der injizéierter Bibliothéik mat Blutt-ofgeleete Phage vun Déieren #1.1 an #1.2.(f) Korrelatioun Scatterplot vergläicht déi relativ Frequenzen vun Déierphage Tripeptidmotiver #1.1 an #1.2 isoléiert am Blutt a cerebrospinal Flëssegkeet.(g, h) Sequenz ID Representatioun vu Phage beräichert am Blutt (g) versus injizéiert Bibliothéiken a Phage beräichert an CSF (h) versus Blutt no enger Ronn vun in vivo Selektioun a béid Déieren.D'Gréisst vum Code vun engem Buschtawen weist un wéi dacks dës Aminosaier op där Positioun geschitt.Gréng = polar, violett = neutral, blo = Basis, rout = sauer a schwaarz = hydrophobe Aminosäuren.Figur 1a, b war entworf a produzéiert vum Eduard Urich.
Mir injizéiert eng Phage Peptidbibliothéik an zwee CM Instrument Ratten (Clade A a B) an isoléiert Phage aus Cerebrospinal Flëssegkeet a Blutt (Figur 1d).Déi initial rapid Clearance vun der Bibliothéik war manner ausgeschwat am Verglach zum Wild-Typ Phage.Déi duerchschnëttlech Hallefzäit vun der injizéierter Bibliothéik bei béiden Déieren war 24,8 Minutten am Blutt, ähnlech wéi Wild-Typ Phage, an 38,5 Minutten am CSF.Blutt a cerebrospinal Flëssegket Phage Echantillon vun all Déier goufen HTS ënnerworf an all identifizéiert peptides sech fir d'Präsenz vun engem kuerzen tripeptide Motiv analyséiert.Tripeptid Motiver goufen gewielt well se eng minimal Basis fir Strukturbildung a Peptid-Protein Interaktiounen ubidden14,15.Mir hunn eng gutt Korrelatioun an der Verdeelung vu Motiver tëscht der injizéierter Phagebibliothéik a Klonen aus dem Blutt vu béiden Déieren extrahéiert (Fig. 1e).D'Daten weisen datt d'Zesummesetzung vun der Bibliothéik nëmme marginal am Bluttraum beräichert ass.Aminosaier Frequenzen a Konsenssequenzen goufen op all Positioun weider analyséiert mat enger Adaptatioun vun der Weblogo16 Software.Interessanterweis hu mir eng staark Beräicherung vu Bluttglycinreschter fonnt (Fig. 1g).Wann Blutt war Verglach mat clones aus CSF ausgewielt, staark Auswiel an e puer deselection vun Motiver observéiert goufen (Lalumi 1f), a bestëmmte Aminosaier Saieren sech preferentially präsent op virbestëmmten Positiounen am 12-Member (Lalumi 1h).Notamment ënnerscheede eenzel Déieren wesentlech an der cerebrospinal Flëssegkeet, wärend d'Bluttglycinberäicherung a béide Déieren observéiert gouf (Ergänzlech Fig. 4a-j).No strenger Filterung vun Sequenzdaten an der cerebrospinal Flëssegkeet vun Déieren #1.1 an #1.2, goufen insgesamt 964 an 420 eenzegaarteg 12-mer Peptiden kritt (Ergänzlech Fig. 1d-e).Déi isoléiert Phageklone goufen amplifizéiert an enger zweeter Ronn vun der in vivo Selektioun ënnerworf.Phage aus der zweeter Ronn vun Auswiel ofgebaut goufen HTS an all Déier ënnerworf an all identifizéiert peptides sech als Input zu engem Motiv Unerkennung Programm benotzt d'Optriede vun tripeptide Motiver ze analyséieren (Lalumi 2a, b, ef).Am Verglach zum éischten Zyklus vun der Phage, déi aus CSF erholl gouf, hu mir weider Selektioun an Deselektioun vu ville Motiver an CSF an de Branchen A a B observéiert (Fig. 2).En Netzwierk Identifikatioun Algorithmus gouf applizéiert fir ze bestëmmen ob se verschidde Mustere vu konsequent Sequenz representéiert hunn.Eng kloer Ähnlechkeet gouf tëscht den 12-zweedimensional Sequenzen observéiert, déi vun CSF an alternativ Clade A (Lalumi 2c, d) a Clade B (Lalumi 2g, h) erholl goufen.D'pooled Analyse an all Branche verroden verschidden Auswiel Profiler fir 12-mer peptides (Ergänzlech Lalumi. 5c, d) an eng Erhéijung vun der CSF /Blutt Titer Verhältnis iwwer Zäit fir zesummegefaasst clones no der zweeter Ronn vun Auswiel am Verglach zu der éischter Ronn vun Auswiel (Ergänzlech Lalumi 5e).).
Beräicherung vu Motiver a Peptiden an der cerebrospinaler Flëssegkeet duerch zwee successive Ronnen vun der in vivo funktioneller Phage Display Selektioun.
All cerebrospinal Flëssegket phages aus der éischter Ronn vun all Déier erëmfonnt (Déieren #1.1 an #1.2) goufen zesummegefaasst, amplifizéiert, HT-Sequenz an reinjized zesummen (2 x 1010 phages / Déier) 2 SM cannulated Ratten (#1.1 → #).2.1 an 2.2, 1.2 → 2.3 an 2.4).(a, b, e, f) Korrelatioun scatterplots déi relativ Frequenz vun tripeptide Motiver vun all CSF-ofgeleet phages an der éischter an zweeter Auswiel Ronn vergläichen.Relativ Frequenz a Verdeelung vu Motiver representéieren all méiglech iwwerlappend Tripeptiden, déi a Peptiden a béid Orientéierungen fonnt goufen.D'Zuel vun de Motiver fonnt an 1000 Liesungen gëtt gewisen.Motiver déi bedeitend (p <0,001) an enger vun de vergläichte Bibliothéiken ausgewielt oder ausgeschloss goufen, gi mat roude Punkte markéiert.(c, d, g, h) Sequenz Logo Representatioun vun all CSF-räiche 12 Aminosaier laang Sequenzen baséiert op Ronnen 2 an 1 vun in vivo Auswiel.D'Gréisst vum Code vun engem Buschtawen weist un wéi dacks dës Aminosaier op där Positioun geschitt.Fir de Logo ze representéieren, gëtt d'Frequenz vun den CSF-Sequenzen, déi aus eenzel Déieren tëscht zwou Selektiounsronnen extrahéiert ginn, verglach an déi beräichert Sequenzen an der zweeter Ronn ginn gewisen: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 an (h) #1.2–#2.4.Déi meescht beräichert Aminosäuren op enger bestëmmter Positioun an (c, d) Déieren Nr.2.1 an Nr.2.2 oder (g, h) bei Déieren Nr.2,3 an Nr.2.4 sinn a Faarf gewisen.Gréng = polar, violett = neutral, blo = Basis, rout = sauer a schwaarz = hydrophobe Aminosäuren.
No der drëtter Ronn vun Auswiel, identifizéiert mir 124 eenzegaarteg peptide Haaptrei (# 3.1 an # 3.2) aus 332 CSF-rekonstituéiert phage clones aus zwee Déieren isoléiert (Ergänzlech Lalumi 6a).D'Sequenz LGSVS (18,7%) hat den héchste relativen Undeel, gefollegt vun de Wild-Typ Inserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), an SARGSWREIVSLS (2,2%).An der leschter véierter Ronn hu mir zwee onofhängeg ausgewielte Branchen aus dräi getrennten Déieren zesummegefaasst (Fig. 1c).Vun den 925 sequentéierten Phage-Klonen, déi aus CSF erholl goufen, hu mir an der véierter Ronn 64 eenzegaartege Peptid-Sequenzen fonnt (Ergänzlech Fig. 6b), dorënner de relativen Undeel vu Wild-Typ Phage op 0,8% gefall.Déi heefegst CSF Klonen an der véierter Ronn waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) an RLSSVDSDLSGC (3,2%).%)).D'Längtberäich vun de gewielte Peptiden ass wéinst Nukleotid-Insertiounen / Läschen oder virzäitegen Stopcodonen an de Bibliothéiksprimer wann Dir degeneréierte Codonen fir NNK-Bibliothéikdesign benotzt.Virzäiteg Stopcodonen generéieren méi kuerz Peptiden a gi gewielt well se dat favorabelt aa Motiv enthalen.Méi laang Peptiden kënnen aus Insertiounen / Läschen an de Primer vun de syntheteschen Bibliothéiken entstoen.Dëst positionéiert den entworfene Stopcodon ausserhalb vum Frame a liest et bis en neie Stopcodon downstream erscheint.Am Allgemengen hu mir Beräicherungsfaktoren fir all véier Selektiounsronnen berechent andeems d'Inputdaten mat de Probeoutputdaten vergläicht.Fir déi éischt Ronn vum Duerchmusterung hu mir Wild-Typ Phage Titer als net spezifesch Hannergrondreferenz benotzt.Interessanterweis war negativ Phage Selektioun ganz staark am éischte CSF Zyklus, awer net am Blutt (Figebam. 3a), wat wéinst der gerénger Wahrscheinlechkeet vun der passiver Diffusioun vun de meeschte Membere vun der Peptidbibliothéik an de CSF-Kompartiment oder relativ Phasen éischter méi effizient behalen oder aus dem Bluttkrees geläscht ginn wéi Bakteriophagen.Allerdéngs, an der zweeter Ronn vun panning, staark Auswiel vun phages zu CSF war an béide clades observéiert, suggeréiert, datt déi viregter Ronn an phages beräichert war Peptiden weisen datt CSF upaken förderen (Figebam. 3a).Nees, ouni bedeitend Bluttberäicherung.Och an der drëtter a véierter Ronn goufen d'Phagklonen wesentlech an der CSF beräichert.D'relativ Frequenz vun all eenzegaarteg peptide Haaptrei tëscht de leschten zwou Ronne vun Auswiel vergläichen, hu mir fonnt, datt d'Sequenzen nach méi an der véierter Ronn vun Auswiel beräichert goufen (Lalumi 3b).Insgesamt 931 Tripeptid Motiver goufen aus all 64 eenzegaartege Peptid Sequenzen extrahéiert mat béide Peptid Orientatiounen.Déi meescht beräichert Motiver an der véierter Ronn goufen méi enk fir hir Beräicherung Profiler iwwer all Ronnen iwwerpréift am Verglach zu der Sprëtz Bibliothéik (Ausschnëtter: 10% Beräicherung) (Ergänzlech Fig. 6c).Allgemeng Mustere vun der Selektioun weisen datt déi meescht vun de studéierte Motiver an alle fréiere Ronne vu béide Selektiounszweige beräichert goufen.Wéi och ëmmer, e puer Motiver (zB SGL, VSG, LGS GSV) ware virun allem aus der alternativer Clade A, während anerer (zB FGW, RTN, WGF, NTR) an alternativ Clade B beräichert goufen.
Validatioun vum CSF Transport vu CSF-beräicherten Phage-afgezeechente Peptiden a biotinyléierte Leaderpeptide konjugéiert mat Streptavidin Notzlaascht.
(a) Beräicherungsverhältnisser berechent an alle véier Ronnen (R1-R4) baséiert op injizéierten (Input = I) Phage (PFU) Titer a bestëmmte CSF Phage Titer (Output = O).Beräicherungsfaktoren fir déi lescht dräi Ronnen (R2-R4) goufen am Verglach mat der viregter Ronn an der éischter Ronn (R1) mat Gewiichtsdaten berechent.Open Bars si cerebrospinal Flëssegkeet, schaarf Bars si Plasma.(***p<0.001, baséiert op Student's t-Test).(b) Lëscht vun de meescht reichend Phage-Peptiden, klasséiert no hirem relativen Undeel zu all Phasen, déi an CSF gesammelt goufen no der Ronn 4 vun der Selektioun.Déi sechs heefegste Phageklone ginn a Faarf markéiert, nummeréiert an hir Beräicherungsfaktoren tëscht Ronnen 3 a 4 vun der Selektioun (Insets).(c, d) Déi sechs meescht beräichert phage clones, eidel phage an parental phage peptide Bibliothéiken aus Ronn 4 sech individuell an engem CSF probéieren Modell analyséiert.CSF a Blutt Echantillon goufen um uginn Zäitpunkte gesammelt.(c) Gläich Quantitéiten vun 6 Kandidat phage clones (2 x 1010 phages / Déieren), eidel phages (# 1779) (2 x 1010 phages / Déieren) an Stock phage peptide Bibliothéiken (2 x 1012 phages / Déieren) Sprëtz op d'mannst 3 CM gëtt getrennt duerch d'Déier verwalt ginn.D'CSF Pharmakokinetik vun all injizéierten Phage Klon a Phage Peptidbibliothéik iwwer Zäit gëtt gewisen.(d) weist den duerchschnëttleche CSF /Bluttverhältnis fir all erholl Phasen /ml iwwer d'Proufzäit.(e) Véier syntheteschen Leader Peptiden an eng verréckte Kontroll ware mat Biotin zu Streptavidin duerch hiren N-Terminus (Tetramer Display) verbonne mat der Injektioun (Schwäifven iv, 10 mg Streptavidin / kg).Op d'mannst dräi intubéiert Ratten (N = 3).).CSF Echantillon goufen um uginn Zäitpunkte gesammelt an Streptavidin Konzentratioune sech duerch CSF Anti-Streptavidin ELISA gemooss (nd = net festgestallt).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, baséiert op ANOVA Test).(f) Verglach vun der Aminosaier Sequenz vun de meeschte beräichert Phage Peptid Klon #2002 (violett) mat anere ausgewielt Phage Peptid Klonen aus der 4. Ronn vun Auswiel.Identesch an ähnlech Aminosäurefragmenter si faarweg kodéiert.
Vun all beräichert phages an der véierter Ronn (Lalumi 3b), sechs Kandidat clones sech fir weider individuell Analyse am CSF probéieren Modell ausgewielt.Gläich Quantitéite vu sechs Kandidat phage, eidel phage (keng Insert) a prophage peptide Bibliothéiken goufen an dräi cannulated CM Déieren injizéiert, an pharmacokinetics sech an CSF (Lalumi 3c) a Blutt (Ergänzlech Lalumi 7) assays bestëmmt.All Phage Klonen getest gezielt d'CSF Kompartiment op engem Niveau 10-1000 Mol méi héich wéi dee vun der eidel Kontrollphage (#1779).Zum Beispill, Klonen #2020 an #2077 haten ongeféier 1000 Mol méi héich CSF Titer wéi Kontrollphage.D'pharmakokinetesch Profil vun all ausgewielt Peptid ass anescht, mä all vun hinnen hunn eng héich CSF homing Fäegkeet.Mir hunn eng konstant Ofsenkung mat der Zäit fir Klonen #1903 an #2011 observéiert, wärend fir Klonen #2077, #2002 an #2009 eng Erhéijung während den éischten 10 Minutten den aktiven Transport uginn, awer muss verifizéiert ginn.Klonen #2020, #2002, an #2077 stabiliséiert sech op héijen Niveauen, wärend d'CSF Konzentratioun vum Klon #2009 no der initialer Erhéijung lues erofgaang ass.Mir verglach dann d'relativ Frequenz vun all CSF Kandidat mat sengem Blutt Konzentratioun (Lalumi 3d).D'Korrelatioun vum mëttleren Titer vun all CSF Kandidat mat sengem Blutttiter bei all Probenzäit huet gewisen datt dräi vun de sechs Kandidaten am Blutt CSF wesentlech beräichert goufen.Interessanterweis huet de Klon #2077 méi héich Bluttstabilitéit gewisen (Ergänzungsbild 7).Fir ze bestätegen datt d'Peptiden selwer fäeg sinn aktiv aner Fracht wéi Phagepartikelen an d'CSF-Kompartiment ze transportéieren, hu mir véier Leader-Peptiden synthetiséiert, derivatiséiert mat Biotin um N-Terminus, wou d'Peptiden un de Phage-Partikel befestigen.Biotinyléiert Peptiden (Nr. 2002, 2009, 2020 an 2077) goufen mat Streptavidin (SA) konjugéiert fir multimeresch Formen ze kréien, déi d'Phaggeometrie e bësse mimikéieren.Dëst Format huet eis och erlaabt d'SA Belaaschtung am Blutt a cerebrospinal Flëssegkeet als cargo-transportéierend Proteinpeptide ze moossen.Wichteg ass, datt Phage Daten dacks reproduzéiert kënne ginn wann synthetesch Peptiden an dësem SA-konjugéierten Format verwalt goufen (Fig. 3e).Déi verréckte Peptiden haten manner initial Belaaschtung a méi séier CSF Clearance mat ondetektéierbaren Niveauen bannent 48 Stonnen.Fir Abléck an d'Liwwerweeër vun dëse Peptid Phage Klonen an de CSF Raum ze kréien, analyséiert mir d'Lokaliséierung vun eenzelne Phage Peptid Hits mat Immunhistochemie (IHC) fir direkt Phage Partikel 1 Stonn no intravenöser Injektioun in vivo z'entdecken.Notamment, Klonen #2002, #2077, an #2009 konnte festgestallt ginn duerch staark Färzen a Gehirskapillaren, wärend Kontrollphage (#1779) a Klon #2020 net festgestallt goufen (Ergänzungsbild 8).Dëst hindeit datt dës Peptiden zum Effekt op d'Gehir präzis bäidroen andeems se de BBB iwwerschreiden.Weider detailléiert Analyse ass erfuerderlech fir dës Hypothese ze testen, well de BSCFB Wee kann och involvéiert sinn.Wann Dir d'Aminosaier Sequenz vum am meeschte beräicherten Klon (#2002) mat anere ausgewielte Peptiden vergläicht, gouf festgestallt datt e puer vun hinnen ähnlech Aminosaierverlängerungen hunn, wat en ähnlechen Transportmechanismus uginn (Fig. 3f).
Wéinst sengem eenzegaartege Plasmaprofil a wesentlecher Erhéijung vun der CSF iwwer Zäit, gouf de Phage Display Klon #2077 weider iwwer eng méi laang 48-Stonne Period exploréiert a konnt déi séier Erhéijung vun der CSF observéiert an Associatioun mat nohaltege SA Niveauen (Fig. 4a) reproduzéieren.Wat aner identifizéiert Phage Klonen ugeet, #2077 staark fir Gehirskapillaren gefierft a bedeitend Kolokaliséierung mat Kapillarmarker Lektin gewisen wann se bei méi héijer Opléisung a méiglecherweis e bësse Färzen am parenchymale Raum gekuckt ginn (Figure 4b).Fir z'ënnersichen ob peptid-mediéiert pharmakologesch Effekter an der ZNS kritt kënne ginn, hu mir en Experiment gemaach an deem biotinyléierte Versioune vun i) dem #2077 Transitpeptid an ii) dem BACE1 Inhibitor Peptid mat SA an zwee verschiddene Verhältnisser gemëscht goufen.Fir eng Kombinatioun hu mir nëmmen de BACE1 Peptid Inhibitor benotzt a fir déi aner hu mir en 1:3 Verhältnis vum BACE1 Peptid Inhibitor zum #2077 Peptid benotzt.Béid Echantillon goufen intravenously verwalt a Blutt an cerebrospinal Flëssegket Niveauen vun Beta-Amyloid peptide 40 (Abeta40) sech iwwer Zäit gemooss.Abeta40 gouf am CSF gemooss well et BACE1 Hemmung am Gehirparenchym reflektéiert.Wéi erwaart, reduzéiert béid Komplexe wesentlech Bluttniveauen vun Abeta40 (Fig. 4c, d).Wéi och ëmmer, nëmmen Proben enthalen eng Mëschung aus Peptid Nr.2077 an en Inhibitor vum BACE1-Peptid konjugéiert zu SA verursaacht eng bedeitend Ofsenkung vun Abeta40 an der cerebrospinal Flëssegkeet (Fig. 4c).D'Donnéeë weisen datt Peptid Nr.2077 ass fäeg de 60 kDa SA Protein an d'ZNS ze transportéieren an induzéiert och pharmakologesch Effekter mat SA-konjugéierten Inhibitoren vum BACE1 Peptid.
(a) Klonal Injektioun (2 × 10 Phasen / Déier) vun T7 Phage déi laangfristeg pharmakokinetesch Profiler vum CSF Peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) an oninjizéierter Kontrollphage (#1779) an op d'mannst dräi CM-intubéiert Ratten weist.(b) Konfokalt mikroskopescht Bild vu representativen kortikale Mikrogefässer a Phage-injizéierte Ratten (2 × 10 10 Phasen / Déier) weist d'Kontrastaining vum Peptid #2077 a Gefässer (Lectin).Dës Phage Klonen goufen op 3 Ratten verwalt an erlaabt fir 1 Stonn virun der Perfusioun zirkuléieren.Gehirer goufen opgedeelt a gefierft mat polyklonalen FITC-markéierten Antikörper géint den T7 Phage Capsid.Zéng Minutte virum Perfusioun a spéider Fixatioun gouf DyLight594-markéiert Lektin intravenös verwalt.Fluoreszent Biller déi Lektinfärbung (rout) vun der luminaler Säit vu Mikrogefässer a Phasen (gréng) am Lumen vu Kapillaren a perivaskuläre Gehirngewebe weisen.D'Skalabar entsprécht 10 µm.(c, d) Biotinyléiert BACE1 inhibitoresch Peptid eleng oder a Kombinatioun mat biotinyléierten Transitpeptid #2077 gouf mat Streptavidin gekoppelt, gefollegt vun der intravenöser Injektioun vun op d'mannst dräi canuléiert CM Ratten (10 mg Streptavidin / kg).BACE1 Peptid-Inhibitor-vermittelte Reduktioun vun Aβ40 gouf duerch Aβ1-40 ELISA am Blutt (rout) a cerebrospinal Flëssegkeet (orange) op den uginnen Zäitpunkte gemooss.Fir besser Kloerheet gëtt eng gestippte Linn op der Grafik op enger Skala vun 100% gezeechent.(c) Prozentsaz Reduktioun vun Aβ40 am Blutt (rout Dräieck) a cerebrospinal Flëssegkeet (orange Dräieck) bei Ratten behandelt mat Streptavidin konjugéiert zu Transit Peptid #2077 an BACE1 inhibitory Peptid an engem 3: 1 Verhältnis.(d) Prozentsaz Reduktioun am Blutt Aβ40 (roude Kreeser) a cerebrospinal Flëssegkeet (orange Kreeser) vu Ratten, déi mat Streptavidin behandelt ginn, nëmmen un engem BACE1 hemmende Peptid gekoppelt.D'Aβ Konzentratioun an der Kontroll war 420 pg /ml (Standardabweichung = 101 pg /ml).
Phage Display gouf erfollegräich a verschiddene Beräicher vun der biomedizinescher Fuerschung applizéiert17.Dës Method gouf benotzt fir in vivo vaskulär Diversitéitsstudien18,19 souwéi Studien déi zerebrale Schëffer zielen20,21,22,23,24,25,26.An dëser Studie hu mir d'Applikatioun vun dëser Selektiounsmethod verlängert net nëmmen op d'direkt Identifikatioun vu Peptiden, déi zerebrale Gefässer zielen, awer och op d'Entdeckung vu Kandidaten mat aktive Transporteigenschaften fir d'Blutt-Gehir Barrière ze iwwerschreiden.Mir beschreiwen elo d'Entwécklung vun enger in vivo Selektiounsprozedur an CM intubéierte Ratten a weisen säi Potenzial fir Peptiden mat CSF Homing Eegeschaften z'identifizéieren.Mat der T7 Phage déi eng Bibliothéik vun 12-mer zoufälleg Peptiden weist, konnte mir beweisen datt den T7 Phage kleng genuch ass (ongeféier 60 nm Duerchmiesser)10 fir un d'Blutt-Gehir Barrière ugepasst ze ginn, an doduerch direkt d'Blutt-Gehir Barrière oder de Choroid Plexus iwwerschreiden.Mir beobachtet datt d'CSF Ernte vu kanuléierte CM Ratten eng gutt kontrolléiert in vivo funktionell Duerchmusterungsmethod war, an datt déi extrahéiert Phage net nëmmen un d'Vaskulatur gebonnen ass, mee och als Transporter iwwer d'Blutt-Gehir Barrière funktionéiert.Ausserdeem, andeems mir gläichzäiteg Blutt sammelen an HTS op CSF ​​a Blutt ofgeleet Phasen applizéieren, hu mir bestätegt datt eis Wiel vu CSF net vu Bluttberäicherung oder Fitness fir Expansioun tëscht Auswielronnen beaflosst gouf.Wéi och ëmmer, d'Bluttkompartiment ass Deel vun der Selektiounsprozedur, well Phasen, déi fäeg sinn d'CSF-Kompartiment z'erreechen, mussen iwwerliewen a laang genuch am Bluttkrees zirkuléieren fir sech am Gehir ze beräicheren.Fir zouverlässeg Sequenzinformatioun aus rauen HTS-Daten ze extrahieren, hu mir Filtere implementéiert, déi op plattformspezifesch Sequenzéierungsfehler am Analyse Workflow ugepasst sinn.Andeems mir kinetesch Parameteren an d'Screeningsmethod integréieren, bestätegt mir d'rapid Pharmakokinetik vu Wild-Typ T7 Phasen (t½ ~ 28 min) am Blutt24, 27, 28 an hunn och hir Hallefzäit an der cerebrospinal Flëssegkeet (t½ ~ 26 min) pro Minutt bestëmmt.Trotz ähnlechen pharmakokinetesch Profiler am Blutt a CSF, konnt nëmmen 0,001% vun der Bluttkonzentratioun vu Phage am CSF festgestallt ginn, wat op niddereg Hannergrond Mobilitéit vu Wild-T7 Phage iwwer d'Blutt-Gehir Barrière bezeechent.Dës Aarbecht beliicht d'Wichtegkeet vun der éischter Ronn vun der Selektioun wann Dir in vivo Panningstrategien benotzt, besonnesch fir Phagesystemer, déi séier aus der Zirkulatioun geläscht ginn, well wéineg Klonen fäeg sinn d'ZNS-Kompartiment z'erreechen.Also, an der éischter Ronn, war d'Reduktioun vun der Bibliothéik Diversitéit ganz grouss, well nëmmen eng limitéiert Zuel vu Klonen schliisslech an dësem ganz strikte CSF Modell gesammelt goufen.Dës zu VIVO Panning Strategie abegraff verschidde Auswiel Schrëtt wéi aktiv Heefung am CSF compartment, Klon Iwwerliewe am Blutt compartment, a rapid Entfernung vun T7 phage clones aus dem Blutt bannent den éischten 10 Minutten (Figebam. 1d an Zousaz Lalumi 4M).).Also, no der éischter Ronn, goufen verschidde Phage Klonen an CSF identifizéiert, obwuel déiselwecht initial Pool fir eenzel Déieren benotzt gouf.Dëst hindeit datt verschidde strikt Selektiounsschrëtt fir Quellbibliothéike mat enger grousser Zuel vu Bibliothéikmemberen zu enger wesentlecher Reduktioun vun der Diversitéit resultéieren.Dofir wäerten zoufälleg Eventer en integralen Deel vum initialen Selektiounsprozess ginn, wat d'Resultat staark beaflosst.Et ass wahrscheinlech datt vill vun de Klonen an der ursprénglecher Bibliothéik eng ganz ähnlech CSF-Beräicherungspropensitéit haten.Wéi och ëmmer, och ënner déiselwecht experimentell Bedéngungen, kënnen d'Selektiounsresultater ënnerscheeden wéinst der klenger Zuel vun all bestëmmte Klon am initialen Pool.
D'Motiver, déi am CSF beräichert sinn, ënnerscheede sech vun deenen am Blutt.Interessanterweis hu mir déi éischt Verréckelung Richtung Glycin-räiche Peptiden am Blutt vun eenzel Déieren bemierkt.(Fig. 1g, Ergänzungsbild 4e, 4f).Phage mat Glycin-Peptiden kënne méi stabil sinn a manner wahrscheinlech aus der Zirkulatioun geholl ginn.Wéi och ëmmer, dës glycinräich Peptiden goufen net an de Cerebrospinal Flëssegproben festgestallt, wat suggeréiert datt déi curéiert Bibliothéiken duerch zwee verschidde Selektiounsschrëtt gaange sinn: een am Blutt an eng aner erlaabt an der Cerebrospinal Flëss ze accumuléieren.CSF-beräichert Klonen, déi aus der véierter Ronn vun der Auswiel entstinn, goufen extensiv getest.Bal all eenzel getest Klone goufen bestätegt an CSF beräichert ze ginn am Verglach mat eidel Kontrollphage.Ee Peptidhit (#2077) gouf méi detailléiert iwwerpréift.Et huet e méi laang Plasma Hallefzäit am Verglach mat aneren Hits gewisen (Figur 3d an Ergänzungsbild 7), an interessant huet dëst Peptid e Cysteinresid um C-Terminus enthale.Et gouf viru kuerzem gewisen datt d'Zousatz vu Cystein zu Peptiden hir pharmakokinetesch Eegeschaften kann verbesseren andeems se un Albumin 29 binden.Dëst ass de Moment onbekannt fir Peptid #2077 a erfuerdert weider Studie.E puer Peptiden hunn eng Valenzabhängegkeet bei der CSF-Beräicherung gewisen (Donnéeën net gewisen), déi mat der ugewisen Uewerflächegeometrie vum T7-Kapsid verbonne sinn.Den T7 System, dee mir benotzt hunn, huet 5-15 Exemplare vun all Peptid pro Phagepartikel gewisen.IHC gouf op Kandidat Lead Phage Klonen injizéiert intravenös an de cerebral cortex vu Ratten injizéiert (Ergänzlech Fig. 8).D'Daten weisen datt op d'mannst dräi Klonen (Nr. 2002, Nr. 2009 an Nr. 2077) mat der BBB interagéiert hunn.Et bleift ze bestëmmen ob dës BBB Interaktioun zu der Akkumulation vu CSF oder der Bewegung vun dëse Klonen direkt op de BCSFB resultéiert.Wichteg ass, mir weisen datt déi ausgewielte Peptiden hir CSF Transportkapazitéit behalen wann se synthetiséiert an un d'Proteincargo gebonnen sinn.Bindung vun N-terminal biotinyléierte Peptiden zu SA widderhëlt am Wesentlechen d'Resultater, déi mat hire jeweilege Phage-Klonen am Blutt a cerebrospinal Flëssegkeet kritt goufen (Fig. 3e).Endlech weisen mir datt Lead Peptid #2077 fäeg ass d'Gehireraktioun vun engem biotinyléierte Peptid-Inhibitor vu BACE1 konjugéiert zu SA ze förderen, wat ausgeschwat pharmakodynamesch Effekter an der ZNS verursaacht andeems Abeta40 Niveauen an CSF wesentlech reduzéieren (Fig. 4).Mir konnten keng Homologen an der Datebank identifizéieren andeems se eng Peptidsekvens Homologie Sich vun all Hits ausféieren.Et ass wichteg ze notéieren datt d'Gréisst vun der T7-Bibliothéik ongeféier 109 ass, während d'theoretesch Bibliothéikgréisst fir 12-Mer 4 x 1015 ass. Dofir hu mir nëmmen e klengen Deel vun der Diversitéitsraum vun der 12-Mer-Peptidbibliothéik ausgewielt, wat bedeit datt méi optimiséiert Peptiden kënnen duerch identifizéierten Hitsequenzen vun dësen identifizéierten Sequenzen identifizéiert ginn.Hypothetesch kann ee vun de Grënn firwat mir keng natierlech Homologe vun dëse Peptiden fonnt hunn, Deselektioun während der Evolutioun sinn fir den onkontrolléierten Entrée vu bestëmmte Peptidmotiven an d'Gehir ze verhënneren.
Zesummegefaasst ginn eis Resultater eng Basis fir zukünfteg Aarbecht fir d'Transportsystemer vun der zerebrovaskulärer Barrière in vivo méi am Detail ze identifizéieren an ze charakteriséieren.D'Basis Setup vun dëser Method baséiert op enger funktioneller Selektiounsstrategie déi net nëmmen Klonen mat zerebrale vaskuläre Bindungseigenschaften identifizéiert, awer och e kritesche Schrëtt enthält, an deem erfollegräich Klonen intrinsesch Aktivitéit hunn fir biologesch Barrièren in vivo an d'ZNS-Kompartiment ze Kräiz.ass de Mechanismus vum Transport vun dëse Peptiden ze klären an hir Präferenz fir d'Bindung un d'Mikrovaskulatur spezifesch fir d'Gehirregioun.Dëst kann zu der Entdeckung vun neie Weeër fir den Transport vun der BBB an Rezeptoren féieren.Mir erwaarden datt déi identifizéiert Peptiden direkt un cerebrovaskuläre Rezeptoren oder op zirkuléierend Liganden, déi duerch de BBB oder BCSFB transportéiert ginn, binde kënnen.D'Peptidvektore mat CSF Transportaktivitéit, déi an dëser Aarbecht entdeckt goufen, wäerte weider ënnersicht ginn.Mir ënnersichen de Moment d'Gehir Spezifizitéit vun dëse Peptiden fir hir Fäegkeet fir de BBB an / oder BCSFB ze iwwerschreiden.Dës nei Peptiden wäerten extrem wäertvoll Tools fir d'potenziell Entdeckung vun neie Rezeptoren oder Weeër a fir d'Entwécklung vun neien héich effiziente Plattforme fir d'Liwwerung vu Makromolekülen, wéi Biologesch, am Gehir.
Cannulate déi grouss Cisterna (CM) mat enger Ännerung vun der virdru beschriwwener Method.Anästhetiséiert Wistar Ratten (200-350 g) goufen op engem stereotaxesche Apparat montéiert an e mediane Schnëtt gouf iwwer de raséierten an aseptesch preparéierten Kopfhaut gemaach fir de Schädel ze exponéieren.Drill zwee Lächer an der Géigend vun der ieweschter Sash a befestegt d'Befestigungsschrauwen an de Lächer.En zousätzlecht Lach gouf an der lateraler occipital Kamm fir stereotaktesch Leedung vun enger Edelstahl-Kanule an de CM gebohrt.Fëllt Zänn Zement ronderëm d'Kanule a befestegt mat Schrauwen.No der Fotohärung an Zementhärtung gouf d'Hautwonnung mat 4/0 supramid Suture zougemaach.Déi korrekt Plazéierung vun der Kanüle gëtt bestätegt duerch spontan Leckage vu Cerebrospinal Flëss (CSF).Huelt d'Rat aus dem stereotaxesche Apparat, kritt entspriechend postoperativ Betreiung a Schmerzmanagement, a léisst et op d'mannst eng Woch erholen, bis Unzeeche vu Blutt an der cerebrospinal Flëss observéiert ginn.Wistar Ratten (Crl:WI/Han) goufen vum Charles River (Frankräich) kritt.All Ratten goufen ënner spezifesche Pathogen-gratis Konditioune gehal.All Déierexperimenter goufen vum Veterinärbüro vun der Stad Basel, der Schwäiz, guttgeheescht a goufen am Aklang mat der Animal License No 2474 (Bewäertung vum Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat) gemaach.
Halt sanft d'Rat bewosst mat der CM Cannula an der Hand.Huelt Datura aus der Kanül a sammelt 10 μl spontan fléissend zerebrospinal Flëssegkeet.Zënter datt d'Patenz vun der Kanule schlussendlech kompromittéiert gouf, goufen nëmmen kloer zerebrospinal Flëssegproben ouni Beweis vu Bluttverschmotzung oder Verfärbung an dëser Etude abegraff.Parallel gouf ongeféier 10-20 μl Blutt aus engem klenge Schnëtt um Tipp vum Schwanz a Réier mat Heparin (Sigma-Aldrich) geholl.CSF a Blutt goufen op verschidden Zäitpunkte no intravenöser Injektioun vun T7 Phage gesammelt.Ongeféier 5-10 μl Flëssegkeet gouf verworf ier all CSF Probe gesammelt gouf, wat dem doudege Volumen vum Katheter entsprécht.
Bibliothéike goufen generéiert mat der T7Select 10-3b Vektor wéi am T7Select System Handbuch beschriwwen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kuerz gesot, eng zoufälleg 12-Mer DNA Insert gouf am folgende Format synthetiséiert:
Den NNK Codon gouf benotzt fir duebel Stopcodonen an Aminosaier Iwwerexpressioun am Insert ze vermeiden.N ass e manuell gemëschten equimolare Verhältnis vun all Nukleotid, a K ass e manuell gemëschten equimolare Verhältnis vun Adenin an Zytosin Nukleotiden.Eenzelsträifend Regioune goufen duerch weider Inkubatioun mat dNTP (Novagen) a Klenow-Enzym (New England Biolabs) an Klenow-Puffer (New England Biolabs) fir 3 Stonnen bei 37 ° C an duebelstrengend DNA ëmgewandelt.No der Reaktioun gouf duebelstrengeg DNA duerch EtOH Nidderschlag erëmfonnt.Déi doraus resultéierend DNA gouf mat Restriktioun Enzymen EcoRI an HindIII verdaut (béid vu Roche).De gesplécktem a gereinegt (QIAquick, Qiagen) Insert (T4 Ligase, New England Biolabs) gouf dann am Frame an e Pre-geklomm T7 Vecteur no Aminosaier 348 vum 10B Capsid Gen ligéiert.Ligation Reaktioune sech bei 16 ° C fir 18 Stonnen virum In vitro Verpakung incubated.Phage Verpackung in vitro gouf no den Instruktioune mat dem T7Select 10-3b Klonen Kit (Novagen) geliwwert an d'Verpackungsléisung gouf eemol op Lysis mat Escherichia coli (BLT5615, Novagen) verstäerkt.D'Lysate goufen centrifugéiert, titréiert a gefruer bei -80 ° C. als Stammléisung vu Glycerol.
Direkt PCR Amplifikatioun vu Phage Variabel Regiounen amplifizéiert a Bouillon oder Plack mat propriétaire 454/Roche-Amplicon Fusiounsprimer.De Forward Fusiounsprimer enthält Sequenzen, déi d'Variabel Regioun (NNK) 12 (Schablounspezifesch), GS FLX Titanium Adapter A flankéieren, an eng véier-Basis Bibliothéik Schlësselsequenz (TCAG) (Ergänzungsbild 1a):
De Réckfusiounsprimer enthält och Biotin befestegt fir Perlen ze fangen an den GS FLX Titanium Adapter B erfuerderlech fir klonal Amplifikatioun wärend Emulsioun PCR:
D'Amplicone goufen duerno 454/Roche Pyrosequencing no dem 454 GS-FLX Titanium Protokoll ënnerworf.Fir manuell Sanger Sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 Phage DNA gouf duerch PCR amplifizéiert a mat de folgende Primer Pairen sequenzéiert:
Inserts vun eenzelne Plaques goufen PCR Verstäerkung ënnerworf mat der Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (no d'Instruktioune vum Hiersteller).Maacht e waarme Start (10 min bei 95 °C) an 35 Boost-Zyklen (50 s bei 95 °C, 1 min bei 50 °C, an 1 min bei 72 °C).
Phage aus Bibliothéiken, Wild-Typ Phage, Phage gerett aus CSF a Blutt, oder eenzel Klonen goufen am Escherichia coli BL5615 am TB Bouillon (Sigma Aldrich) oder an 500 cm2 Platen (Thermo Scientific) fir 4 h bei 37 ° C verstäerkt.Phage goufen aus de Placke extrahéiert andeems d'Placke mat Tris-EDTA Puffer (Fluka Analytical) gespullt goufen oder d'Placke mat sterile Pipette Tipps sammelen.Phage goufen aus Kultursupernatant oder Extraktiounsbuffer mat enger Ronn vu Polyethylenglycol (PEG 8000) Nidderschlag (Promega) isoléiert an an Tris-EDTA Puffer resuspendéiert.
Déi amplifizéiert Phage gouf 2-3 Ronnen vun Endotoxin-Entfernung ënnerworf mat Endotoxin-Entfernungspärelen (Miltenyi Biotec) virun der intravenöser (IV) Injektioun (500 μl / Déier).An der éischter Ronn goufen 2 × 1012 Phasen agefouert;an der zweeter, 2 × 1010 Phasen;an der drëtter a véierter Auswiel Ronn, 2 × 109 phages pro Déier.Phage Inhalt an CSF a Blutt Echantillon um uginn Zäitpunkte gesammelt gouf duerch Plaque zielen no den Hiersteller d'Instruktioune (T7Select System Handbuch) bestëmmt.Phage Selektioun gouf duerch intravenös Injektioun vu gereinegte Bibliothéiken an de Schwanzvene gemaach oder duerch Re-Injektioun vu Phage extrahéiert aus CSF aus der viregter Selektiounsronn, a spéider Ernte goufen op 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, an 240 min.Insgesamt véier Ronnen vun in vivo Panning goufen duerchgefouert, an deenen déi zwee ausgewielte Filialen getrennt gespäichert an analyséiert goufen während den éischten dräi Ronnen vun der Selektioun.All Phage-Inserts, déi aus CSF aus den éischten zwou Ronnen vun der Selektioun extrahéiert goufen, goufen 454/Roche Pyrosequencing ënnerworf, während all Klonen, déi aus CSF aus de leschten zwou Selektiounsronnen extrahéiert goufen, manuell sequentéiert goufen.All Bluttphasen aus der éischter Ronn vun der Selektioun goufen och 454/Roche Pyrosequencing ënnerworf.Fir Sprëtz vun phage clones, ausgewielt phages sech am E. coli (BL5615) op 500 cm2 Placke bei 37 ° C fir 4 Stonnen amplified.Individuell ausgewielt a manuell sequentéiert Klone goufen an TB Medium propagéiert.No Phage Extraktioun, Offäll an Entfernung vun endotoxin (wéi uewen beschriwwen), 2 × 1010 phages / Déier an 300 μl goufen intravenously an engem Schwäif Venen injizéiert.
Virveraarbechtung a qualitativ Filterung vun Sequenzdaten.Raw 454/Roche Daten goufe vun engem binäre Standard Streamkaartformat (sff) an e Pearson mënschlecht liesbare Format (fasta) ëmgewandelt mat Verkeefer Software.Weider Veraarbechtung vun der Nukleotid Sequenz gouf mat propriétaire C Programmer a Skripte (net verëffentlecht Software Package) wéi hei ënnen beschriwwen.D'Analyse vu primären Donnéeën enthält strikt Multi-Stage Filterprozeduren.Fir Liesungen auszefilteren déi keng gëlteg 12mer Insert DNA Sequenz enthalen hunn, goufen d'Liesen sequenziell ausgeriicht fir Startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), Stop Label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) an Hannergrond Insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mam globalen Needleman-Wunsch Test.Ausriichtung erlaabt bis zu 2 Inkonsistenz pro Ausriichtung31.Dofir goufen Liesungen ouni Start- a Stop-Tags a Liesen déi Hannergrondinserts enthalen, dh Ausriichtungen, déi d'zoulässlech Unzuel vun de Mëssstänn iwwerschreiden, aus der Bibliothéik geläscht.Wat déi verbleiwen Liesungen ugeet, ass d'N-mer DNA Sequenz, déi sech vun der Startmark verlängert a virum Stopmark ofgeschloss huet, aus der ursprénglecher Liessequenz ausgeschnidden a weider veraarbecht ginn (nodréiglech als "Insert" bezeechent).No der Iwwersetzung vum Insert gëtt den Deel nom éischte Stopcodon um 5′ Enn vum Primer aus dem Insert geläscht.Zousätzlech goufen Nukleotiden, déi zu onkompletten Codonen um 3 'Enn vum Primer féieren, och geläscht.Fir Inserts auszeschléissen, déi nëmmen Hannergrondsequenzen enthalen, goufen iwwersat Inserts, déi mam Aminosaiermuster "PAG" ufänken, och geläscht.Peptiden mat enger post-translational Längt vu manner wéi 3 Aminosäuren goufen aus der Bibliothéik geläscht.Endlech redundanz am Insert Pool ewechzehuelen a bestëmmen d'Frequenz vun all eenzegaartegen Insert.D'Resultater vun dëser Analyse enthalen eng Lëscht vun Nukleotidsekvensen (Inserts) an hir (liesen) Frequenzen (Ergänzungsfiguren 1c an 2).
Grupp N-mer DNA Inserts duerch Sequenz Ähnlechkeet: Fir 454 / Roche-spezifesch Sequenzéierungsfehler ze eliminéieren (wéi Probleemer mat Sequenzéierungshomopolymerverlängerungen) a manner wichteg Redundanzen ze läschen, ginn virdru gefilterte N-mer DNA Sequenzinserts (Inserts) no Ähnlechkeet zortéiert.Insertiounen (bis zu 2 net-passende Basen erlaabt) mat engem iterative Algorithmus deen wéi follegt definéiert ass: Insertiounen ginn als éischt no hirer Frequenz zortéiert (héchst op déi niddregst), a wa se d'selwecht sinn, no hirer sekundärer Zort no Längt (längst bis kuerzst)).Also definéieren déi heefegst a längsten Insertiounen déi éischt "Grupp".D'Gruppfrequenz ass op d'Schlësselfrequenz gesat.Duerno gouf all Insertion, déi an der zortéierter Lëscht bleift, probéiert an d'Grupp bäigefüügt ze ginn duerch Pairwise Needleman-Wunsch Ausrichtung.Wann d'Zuel vun de Mëssverständiser, Insertiounen oder Läschen an enger Ausriichtung net méi wéi e Schwell vun 2 iwwerschreift, gëtt eng Insertioun an d'Grupp bäigefüügt, an d'Gesamtgruppefrequenz gëtt erhéicht duerch wéi dacks d'Insertioun bäigefüügt gouf.Inserts, déi zu enger Grupp bäigefüügt ginn, ginn als benotzt markéiert an aus der weiderer Veraarbechtung ausgeschloss.Wann d'Insertsequenz net an eng scho bestehend Grupp bäigefüügt ka ginn, gëtt d'Insertsequenz benotzt fir eng nei Grupp mat der entspriechender Insertfrequenz ze kreéieren an als benotzt markéiert.D'Iteratioun endet wann all Insertiounssequenz entweder benotzt gouf fir eng nei Grupp ze bilden oder kann an enger scho bestehender Grupp abegraff ginn.No allem gi gruppéiert Inserts, déi aus Nukleotiden besteet, schliisslech an Peptid Sequenzen (Peptidbibliothéiken) iwwersat.D'Resultat vun dëser Analyse ass eng Rei vun Insertiounen an hir entspriechend Frequenzen, déi d'Zuel vun de konsekutive Liesungen ausmaachen (Ergänzungsbild 2).
Motiv Generatioun: Baséierend op enger Lëscht vun eenzegaartege Peptiden, gouf eng Bibliothéik erstallt déi all méiglech Aminosaiermuster (aa) enthält wéi hei ënnendrënner.All méiglech Muster vun der Längt 3 gouf aus dem Peptid extrahéiert a säi inverse Muster gouf zesumme mat enger gemeinsamer Motivbibliothéik bäigefüügt, déi all Musteren (Tripeptiden) enthält.Bibliothéike vun héich repetitive Motiver goufen sequenzéiert an Redundanz geläscht.Dann, fir all Tripeptid an der Motivbibliothéik, hu mir op seng Präsenz an der Bibliothéik gepréift mat computationalen Tools.An dësem Fall gëtt d'Frequenz vum Peptid deen dat fonnt Motiv Tripeptid enthält an d'Motiv an der Motivbibliothéik zougewisen ("Zuel vun de Motiver").D'Resultat vun der Motivgeneratioun ass eng zweedimensional Array déi all Optriede vun Tripeptiden (Motiver) an hir jeeweileg Wäerter enthält, déi d'Zuel vun de Sequenzéierungsliesen sinn, déi am entspriechende Motiv resultéieren wann d'Liesen gefiltert, gruppéiert an iwwersat ginn.Metriken wéi am Detail uewen beschriwwen.
Normaliséierung vun der Zuel vun de Motiver an entspriechend scatterplots: D'Zuel vun de Motiver fir all Prouf war normaliséiert benotzt
wou ni d'Zuel vun de Liesungen ass mat Thema i.Sou duerstellt vi de Prozentsaz Frequenz vun liesen (oder peptides) mat Motiv i an der Prouf.P-Wäerter fir déi net normaliséiert Zuel vu Motiver goufen mam Fisher's exakten Test berechent.Wat d'Korrelogramme vun der Unzuel vun de Motiver ugeet, goufen d'Spearman Korrelatiounen berechent mat der normaliséierter Unzuel vu Motiver mat R.
Fir den Inhalt vun Aminosäuren op all Positioun an der Peptidbibliothéik ze visualiséieren, goufen Weblogogramme 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) erstallt.Als éischt gëtt den Inhalt vun Aminosäuren op all Positioun vum 12-Mer Peptid an enger 20 × 12 Matrix gelagert.Dann gëtt e Set vun 1000 Peptiden, déi dee selwechte relativen Aminosaier Inhalt op all Positioun enthalen, a Fasta-Sequenzformat generéiert an als Input zum Web-Logo 3 geliwwert, wat eng grafesch Representatioun vum relativen Aminosaiergehalt op all Positioun generéiert.fir eng ginn peptide Bibliothéik.Fir multidimensional Datesätz ze visualiséieren, goufen Hëtztkaarten erstallt mat engem intern entwéckelten Tool am R (biosHeatmap, e R Package, deen nach net verëffentlecht gëtt).D'Dendrogramme, déi an den Hëtztkaarte presentéiert goufen, goufen berechent mat Ward hir hierarchesch Clustermethod mat der Euklidescher Distanzmetrik.Fir statistesch Analyse vu Motiv Scoring Daten, P Wäerter fir onnormaliséiert Scoring goufen mam Fisher's exakten Test berechent.P-Wäerter fir aner Datesätz goufen am R berechent mam Student's t-Test oder ANOVA.
Ausgewielt phage clones an phages ouni Inserts goufen intravenously iwwer de Schwäif Vene (2 × 1010 phages / Déier an 300 μl PBS) injizéiert.Zéng Minutte virum Perfusioun a spéider Fixatioun goufen déiselwecht Déieren intravenös mat 100 μl DyLight594-markéiert Lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) injizéiert.60 Minutte no der Phageinjektioun goufen d'Ratten duerch d'Häerz mat 50 ml PBS perfuséiert, gefollegt vun 50 ml 4% PFA / PBS.Gehir Echantillon goufen zousätzlech Iwwernuechtung an 4% PFA / PBS fixéiert an an 30% Saccharose Iwwernuechtung bei 4 ° C getippt.Echantillon gi flash gefruer an der OCT Mëschung.Immunohistochemesch Analyse vu gefruerenen Echantillon gouf bei Raumtemperatur op 30 µm Kryosektiounen gesuergt, blockéiert mat 1% BSA a inkubéiert mat polyclonal FITC-Label Antikörper géint T7 Phage (Novus NB 600-376A) bei 4 ° C.Inkubéiert iwwer Nuecht.Endlech goufen d'Sektiounen 3 Mol mat PBS gewäsch a mat engem konfokale Lasermikroskop (Leica TCS SP5) iwwerpréift.
All Peptiden mat engem Minimum Rengheet vun 98% sech duerch GenScript USA synthetiséiert, biotinylated a lyophilized.Biotin ass iwwer en zousätzlechen Triple Glycin Spacer um N-Terminus gebonnen.Iwwerpréift all Peptiden mat Massespektrometrie.
Streptavidin (Sigma S0677) gouf gemëscht mat engem 5-fache equimolar Iwwerschoss vu biotinyléierten Peptid, biotinyléierten BACE1 hemmende Peptid oder enger Kombinatioun (3: 1 Verhältnis) vu biotinyléierten BACE1 hemmende Peptid an BACE1 hemmende Peptid an DMSOBS / 10% kubéiert PSOBS.1 Stonn bei Raumtemperatur virun der Injektioun.Streptavidin-konjugéiert Peptiden goufen intravenös an enger Dosis vun 10 mg / kg an eng vun de Schwanzvenen vu Ratten mat engem zerebrale Kavitéit injizéiert.
D'Konzentratioun vu Streptavidin-Peptid-Komplexe gouf duerch ELISA bewäert.Nunc Maxisorp Mikrotiterplacke (Sigma) goufen iwwer Nuecht bei 4 ° C mat 1,5 μg /ml Maus Anti-Streptavidin Antikörper (Thermo, MA1-20011) beschichtet.No Spär (Blockéierungsbuffer: 140 nM NaCL, 5 mm EDTA, 0,05% NP40, 0,25% Gelatine, 1% BSA) bei Raumtemperatur fir 2 Stonnen, wäscht d'Plack mat 0,05% Tween-20/PBS (Wäschen) fir 3 Sekonn, CSF a Plasma-Puffer-Diluten, CSF a gutt Plasma-Diluten1,0ma, CSF an Plasma-Puffer 0,0ma bäigefüügt. SF 1:115).D'Plack gouf dann iwwer Nuecht bei 4 ° C mat Detektiounsantikörper (1 μg /ml, Anti-Streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) inkubéiert.No dräi Wäschschrëtt gouf Streptavidin duerch Inkubatioun an TMB Substratléisung (Roche) fir bis zu 20 min festgestallt.Nodeems Dir d'Faarwentwécklung mat 1M H2SO4 gestoppt hutt, moosst d'Absorptioun bei 450 nm.
D'Funktioun vum Streptavidin-Peptid-BACE1-Inhibitorkomplex gouf duerch Aβ (1-40) ELISA no dem Protokoll vum Hiersteller (Wako, 294-64701) bewäert.Kuerz, goufen CSF Echantillon am Standard diluent verdënntem (1:23) an iwwer Nuecht bei 4 ° C an 96-Well Placke Beschichtete mat BNT77 capture antibody incubated.No fënnef Wäschschrëtt gouf HRP-konjugéiert BA27 Antikörper bäigefüügt an 2 Stonnen bei 4 ° C inkubéiert, gefollegt vu fënnef Wäschschrëtt.Aβ (1-40) gouf duerch Inkubatioun an TMB Léisung fir 30 Minutten bei Raumtemperatur festgestallt.Nodeems d'Faarwentwécklung mat der Stopléisung gestoppt gouf, moosst d'Absorptioun bei 450 nm.Plasma Echantillon goufen fest Phase Extraktioun virun Aβ (1-40) ELISA ënnerworf.Plasma gouf zu 0,2% DEA (Sigma) an 96-Well Placke dobäi an bei Raumtemperatur fir 30 Minutten incubated.Nodeem d'SPE Placken (Oasis, 186000679) successiv mat Waasser an 100% Methanol wäschen, goufen Plasma Echantillon op d'SPE Placke bäigefüügt an all Flëssegkeet gouf geläscht.Echantillon goufen gewäsch (éischt mat 5% Methanol dann 30% Methanol) an elued mat 2% NH4OH /90% Methanol.No der Trocknung vum Eluat bei 55 ° C fir 99 min bei konstante N2 Stroum, goufen d'Proben a Standardverdünnungsmëttel reduzéiert an Aβ (1-40) gemooss wéi uewen beschriwwen.
Wéi zitéiert dësen Artikel: Urich, E. et al.Cargo Liwwerung am Gehir mat Transitpeptide identifizéiert in vivo.d'Wëssenschaft.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB, and Moos T. Liwwerung vu makromolekuläre Medikamenter an de Gehir mat geziilte Therapie.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Liwwerung vu Peptid- a Protein-Drogen iwwer d'Blutt-Gehir Barrière.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM D'Blutt-Gehir Barrière: e Flaschenhals an der Gehir Drogenentwécklung.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, an Byrd, A. Perspektiven fir eng verbessert Medikament Liwwerung an Zilsetzung fir de Gehir iwwer de Choroid Plexus-CSF Wee.Pharmazeutesch Fuerschung 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Moderniséierung vu Biopharmazeutika mat molekulare Trojanesche Päerd fir Gehir Liwwerung.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM Rezeptor-mediéierte Peptidtransport iwwer d'Blutt-Gehir Barrière.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Erhéije d'Gehirpenetratioun an d'Effizienz vun therapeuteschen Antikörper mat monovalente molekulare Shuttle.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrin Rezeptor (TfR) Transport bestëmmt d'Gehireropnahm vun Affinitéitsvarianten vun TfR Antikörper.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).