Merci fir Äre Besuch op Nature.com. Dir benotzt eng Browserversioun mat limitéierter CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). Zousätzlech, fir eng weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript.
Weist e Karussell vun dräi Folien gläichzäiteg un. Benotzt d'Knäppercher "Virdrun" an "Nächst" fir duerch dräi Folien gläichzäiteg ze navigéieren, oder benotzt d'Schieberknäppercher um Enn fir duerch dräi Folien gläichzäiteg ze navigéieren.
D'Blutt-Hirn-Barrière an d'Blutt-Hirn-Barrière verhënneren, datt biotherapeutesch Agenten hir Ziler am Zentralnervensystem erreechen, wouduerch eng effektiv Behandlung vun neurologesche Krankheeten behënnert gëtt. Fir nei Gehirtransporter in vivo z'entdecken, hu mir eng T7-Phag-Peptidbibliothéik agefouert a seriell Blutt a Gehirnspinalflëssegkeet (CSF) gesammelt mat Hëllef vun engem kanuléierte bewosst grousse Poolmodell vu Ratten. Spezifesch Phagklonen goufen no véier Selektiounsronnen héich u CSF beräichert. Tester vun eenzelne Kandidatpeptiden hunn eng méi wéi 1000-fach beräicherung u CSF gewisen. D'Bioaktivitéit vun der peptidvermittelter Liwwerung an d'Gehir gouf duerch eng 40% Reduktioun vum Niveau vun Amyloid-β an der Gehirnspinalflëssegkeet mat Hëllef vun engem BACE1-Peptidinhibitor bestätegt, deen mam identifizéierten neien Transitpeptid verbonnen ass. Dës Resultater suggeréieren, datt d'Peptiden, déi duerch in vivo-Phag-Selektiounsmethoden identifizéiert goufen, nëtzlech Vehikelen fir d'systemesch Liwwerung vu Makromoleküle mat engem therapeuteschen Effekt an d'Gehir kënne sinn.
D'Fuerschung iwwer gezielt Therapie vum Zentralnervensystem (ZNS) huet sech haaptsächlech op d'Identifikatioun vun optiméierte Medikamenter an Agenten konzentréiert, déi ZNS-zielend Eegeschafte weisen, mat manner Ustrengung fir d'Mechanismen z'entdecken, déi déi aktiv Medikamentenliwwerung an d'Gehir undoen. Dëst fänkt elo un ze änneren, well d'Medikamentenliwwerung, besonnesch grouss Molekülle, en integralen Deel vun der moderner neurowëssenschaftlecher Medikamentenentwécklung ass. D'Ëmwelt vum Zentralnervensystem ass gutt geschützt vum zerebrovaskuläre Barrièresystem, deen aus der Blutt-Hirn-Barrière (BBB) ​​an der Blutt-Hirn-Barrière (BCBB)1 besteet, wat et eng Erausfuerderung mécht, Medikamenter an d'Gehir ze liwweren1,2. Et gëtt geschat, datt bal all groussmolekül Medikamenter a méi wéi 98% vun de klengmolekül Medikamenter aus dem Gehir eliminéiert ginn3. Dofir ass et ganz wichteg, nei Gehirtransportsystemer z'identifizéieren, déi eng effizient a spezifesch Liwwerung vun therapeutesche Medikamenter an den ZNS4,5 garantéieren. Wéi och ëmmer, de BBB an de BCSFB bidden och eng exzellent Méiglechkeet fir d'Medikamentenliwwerung, well se an all Strukturen vum Gehir duerch seng extensiv Vaskulatur andréngen an antrieden. Dofir baséieren déi aktuell Efforte fir net-invasiv Methode vun der Liwwerung an d'Gehir ze benotzen, gréisstendeels op dem Mechanismus vum Rezeptor-vermittelten Transport (PMT) mat Hëllef vum endogene BBB6-Rezeptor. Trotz rezenten, wichtege Fortschrëtter beim Gebrauch vum Transferrin-Rezeptor-Wee7,8 ass eng weider Entwécklung vun neien Liwwersystemer mat verbesserte Eegeschafte noutwendeg. Zu dësem Zweck war eist Zil, Peptiden z'identifizéieren, déi fäeg sinn, den CSF-Transport ze vermëttelen, well se am Prinzip benotzt kënne ginn, fir Makromoleküle an den ZNS ze liwweren oder nei Rezeptorweeër opzemaachen. Besonnesch spezifesch Rezeptoren an Transporter vum zerebrovaskuläre System (BBB a BSCFB) kënnen als potenziell Ziler fir déi aktiv a spezifesch Liwwerung vu biotherapeutesche Medikamenter déngen. Cerebrospinalflëssegkeet (CSF) ass e sekretorescht Produkt vum Choroidplexus (CS) a steet a direkten Kontakt mat der interstitieller Flëssegkeet vum Gehir iwwer de subarachnoidale Raum an de ventrikuläre Raum4. Viru kuerzem gouf gewisen, datt subarachnoidal Cerebrospinalflëssegkeet exzessiv an den Interstitium vum Gehir diffundéiert9. Mir hoffen, iwwer dësen subarachnoidalen Zouflosstrakt oder direkt iwwer de brain-brain-hematesche Blutt (BBB) ​​op de parenchymalen Raum zouzegräifen. Fir dëst z'erreechen, hu mir eng robust In-vivo-Phage-Selektiounsstrategie ëmgesat, déi idealerweis Peptiden identifizéiert, déi iwwer ee vun dësen zwou verschiddene Weeër transportéiert ginn.
Mir beschreiwen elo eng sequentiell In-vivo-Phage-Display-Screeningmethod mat CSF-Sampling gekoppelt mat High-Throughput-Sequenzéierung (HTS), fir déi initial Selektiounsronnen mat der héchster Bibliothéiksdiversitéit ze iwwerwaachen. De Screening gouf op bewossten Ratten mat enger permanent implantéierter grousser Cisterna- (CM) Kanül duerchgefouert, fir Bluttkontaminatioun ze vermeiden. Wichteg ass, datt dësen Usaz souwuel Gehir-Targeting- wéi och Peptiden mat Transportaktivitéit iwwer d'Zerebrovaskulär Barriär selektéiert. Mir hunn T7-Phagen wéinst hirer klenger Gréisst (~60 nm)10 benotzt a proposéiert, datt se fir den Transport vu Vesikelen gëeegent sinn, déi d'transzellulär Kräizung vun der Endothel- an/oder Epithel-Medullabarrière erlaben. No véier Ronnen Panning goufen d'Phagepopulatiounen isoléiert, déi eng staark In-vivo-CSF-Anreicherung an eng Associatioun vu zerebrale Mikrogefässer gewisen hunn. Wichteg ass, datt mir eis Erkenntnisser bestätege konnten, andeems mir demonstréiert hunn, datt déi bevorzugt a chemesch synthetiséiert bescht Kandidat-Peptiden fäeg sinn, Proteinladung an d'Zerebrospinalflëssegkeet ze transportéieren. Éischtens goufen déi pharmakodynamesch Effekter vum ZNS festgestallt andeems e féierend Transitpeptid mat engem Inhibitor vum BACE1-Peptid kombinéiert gouf. Nieft der Noweisung, datt in vivo funktionell Screeningstrategien nei Gehirtransportpeptide als effektiv Proteincargoträger identifizéiere kënnen, erwaarden mir, datt ähnlech funktionell Selektiounsmethoden och wichteg ginn, fir nei Gehirtransportweeër z'identifizéieren.
Baséierend op Plaque-forming Units (PFU) gouf nom Phage-Verpackungsschritt eng Bibliothéik vu zoufällegen 12-mer linearen T7-Phage-Peptiden mat enger Diversitéit vu ronn 109 entwéckelt a geschaf (kuckt Materialien a Methoden). Et ass wichteg ze bemierken, datt mir dës Bibliothéik virum In-vivo-Paning suergfälteg analyséiert hunn. D'PCR-Amplifikatioun vu Phage-Bibliothéiksproben mat modifizéierte Primer huet Amplikonen generéiert, déi direkt op HTS uwendbar waren (Ergänzungsfigur 1a). Wéinst a) HTS11-Sequenzéierungsfeeler, b) Auswierkungen op d'Qualitéit vun de Primer (NNK)1-12, an c) dem Virhandesein vu Wildtyp (wt)-Phagen (Skelett-Inserts) an der Standby-Bibliothéik, gouf eng Sequenzfilterprozedur implementéiert fir nëmmen verifizéiert Sequenzinformatiounen ze extrahéieren (Ergänzungsfigur 1b). Dës Filterschrëtt gëllen fir all HTS-Sequenzéierungsbibliothéiken. Fir d'Standardbibliothéik goufen insgesamt 233.868 Liesungen kritt, vun deenen 39% d'Filterkriterien erfëllt hunn a fir d'Bibliothéiksanalyse an d'Selektioun fir déi nächst Ronnen benotzt goufen (Ergänzungsfigur 1c-e). D'Liesungen ware virun allem Multiple vun 3 Basenpaaren an der Längt mat engem Peak bei 36 Nukleotiden (Ergänzungsfigur 1c), wat den Bibliothéiksdesign (NNK) 1-12 bestätegt. Bemierkenswäert ass, datt ongeféier 11% vun de Bibliothéiksmemberen en 12-dimensionalen Wildtyp (wt) Backbone PAGISRELVDKL-Insert enthalen hunn, a bal d'Halschent vun de Sequenzen (49%) Insertiounen oder Deletiounen enthalen hunn. Den HTS vun der Bibliothéiksbibliothéik huet déi héich Diversitéit vu Peptiden an der Bibliothéik bestätegt: méi wéi 81% vun de Peptidsequenze goufen nëmmen eemol fonnt an nëmmen 1,5% koumen a ≥4 Kopien vir (Ergänzungsfigur 2a). D'Frequenzen vun den Aminosäuren (aa) op allen 12 Positiounen am Repertoire hunn gutt mat de Frequenzen korreléiert, déi fir d'Zuel vun de Codonen, déi vum degeneréierten NKK-Repertoire generéiert ginn, erwaart goufen (Ergänzungsfigur 2b). Déi observéiert Frequenz vun den aa-Reschter, déi vun dësen Insertiounen kodéiert ginn, huet gutt mat der berechenter Frequenz (r = 0,893) korreléiert (Ergänzungsfigur 2c). D'Virbereedung vu Phagebibliothéiken fir d'Injektioun enthält d'Schrëtt vun der Amplifikatioun an der Entfernung vum Endotoxin. Dëst huet sech virdru gewisen, datt et potenziell d'Diversitéit vu Phagebibliothéiken reduzéiert12,13. Dofir hu mir eng op Placken amplifizéiert Phagebibliothéik sequenzéiert, déi Endotoxin-Entfernung duerchgesat hat, a se mat der ursprénglecher Bibliothéik verglach, fir d'Frequenz vun AA ze schätzen. Eng staark Korrelatioun (r = 0,995) gouf tëscht dem urspréngleche Pool an dem amplifizéierten a gereinegte Pool observéiert (Ergänzungsfigur 2d), wat drop hiweist, datt d'Konkurrenz tëscht Klonen, déi op Placken mat T7-Phage amplifizéiert goufen, keng grouss Ofwäichung verursaacht huet. Dëse Verglach baséiert op der Frequenz vun Tripeptidmotiver an all Bibliothéik, well d'Diversitéit vu Bibliothéiken (~109) net emol mat HTS vollstänneg erfaasst ka ginn. D'Frequenzanalyse vun AA op all Positioun huet e klenge Positiounsofhängegen Ofwäichung an de leschten dräi Positioune vum agegebene Repertoire opgedeckt (Ergänzungsfigur 2e). Zesummefaassend hu mir festgestallt, datt d'Qualitéit an d'Diversitéit vun der Bibliothéik akzeptabel waren an nëmme kleng Ännerungen an der Diversitéit wéinst der Amplifikatioun an der Virbereedung vu Phagebibliothéiken tëscht verschiddene Selektiounsronnen observéiert goufen.
Seriell Proufnahme vun der Gehirnflëssegkeet kann duerch chirurgesch Implantatioun vun enger Kanül an de Komplex vu bewossten Ratten duerchgefouert ginn, fir d'Identifikatioun vun T7-Phagen ze erliichteren, déi intravenös (iv) iwwer de BBB an/oder BCSFB injizéiert goufen (Fig. 1a-b). Mir hunn zwou onofhängeg Selektiounsaarme (Äerm A a B) an den éischten dräi Ronnen vun der In-vivo-Selektioun benotzt (Fig. 1c). Mir hunn d'Strengheet vun der Selektioun graduell erhéicht, andeems mir d'Gesamtquantitéit vun de Phagen, déi an den éischten dräi Selektiounsronnen agefouert goufen, reduzéiert hunn. Fir déi véiert Panning-Ronn hu mir Proben aus de Branchen A a B kombinéiert an dräi zousätzlech onofhängeg Selektiounen duerchgefouert. Fir d'In-vivo-Eegeschafte vun den T7-Phagpartikelen an dësem Modell ze studéieren, gouf e Wildtyp-Phag (PAGISRELVDKL Master-Insert) iwwer d'Schwanzvene an d'Ratten injizéiert. D'Erhuelung vu Phagen aus Gehirnflëssegkeet a Blutt zu verschiddenen Zäitpunkten huet gewisen, datt relativ kleng T7-ikosaedresch Phagen eng séier initial Clearance-Phase aus dem Bluttkompartiment haten (Ergänzungsfigur 3). Baséierend op den verabreichten Titeren an dem Bluttvolumen vun de Ratten, hu mir berechent, datt nëmmen ongeféier 1 Gew.-% Phage vun der verabreichter Dosis 10 Minutte no der intravenöser Injektioun am Blutt nogewise gouf. No dësem ufängleche schnelle Réckgang gouf eng méi lues primär Clearance mat enger Hallefzäit vun 27,7 Minutte gemooss. Wichteg ass, datt nëmme ganz wéineg Phagen aus dem CSF-Kompartiment zréckgewonne goufen, wat op en niddregen Hannergrond fir d'Migratioun vu Wildtyp-Phagen an de CSF-Kompartiment hiweist (Ergänzungsfigur 3). Am Duerchschnëtt goufen nëmmen ongeféier 1 x 10-3% Titer vun T7-Phage am Blutt a 4 x 10-8% vun den initial infuséierte Phagen an der Zerebrospinalflëssegkeet iwwer déi ganz Proufzäit (0-250 Min.) nogewise. Bemierkenswäert ass, datt d'Hallefzäit (25,7 Min.) vu Wildtyp-Phage an der Zerebrospinalflëssegkeet ähnlech war wéi déi am Blutt observéiert. Dës Donnéeë weisen datt d'Barriär, déi de CSF-Kompartiment vum Blutt trennt, bei CM-kanuléierte Ratten intakt ass, wat eng in vivo Selektioun vu Phagebibliothéiken erméiglecht, fir Klonen z'identifizéieren, déi liicht aus dem Blutt an de CSF-Kompartiment transportéiert ginn.
(a) Opstellung vun enger Method fir d'Nei-Proufentnahme vu Gehirnflëssegkeet (CSF) aus engem grousse Pool. (b) Diagramm dat d'zellulär Lag vun der Zentralnervensystembarrière (ZNS) an d'Selektiounsstrategie weist, déi benotzt gëtt fir Peptiden z'identifizéieren, déi d'Blutt-Hirn-Barrière (BBB) ​​an d'Blutt-Hirn-Barrière passéieren. (c) In-vivo Phage-Display-Screening-Flossdiagramm. An all Selektiounsronn goufen Phagen (Déieridentifikatoren an de Pfeiler) intravenös injizéiert. Zwee onofhängeg alternativ Branchen (A, B) ginn bis zur 4. Selektiounsronn getrennt gehalen. Fir d'Selektiounsronnen 3 an 4 gouf all Phageklon, deen aus CSF extrahéiert gouf, manuell sequenzéiert. (d) Kinetik vu Phagen, déi aus Blutt (rout Kreesser) a Gehirnflëssegkeet (gréng Dräiecker) während der éischter Selektiounsronn bei zwou kanuléierte Ratten no der intravenöser Injektioun vun der T7-Peptidbibliothéik (2 x 1012 Phagen/Déier) isoléiert goufen. Blo Quadraten weisen déi duerchschnëttlech initial Konzentratioun vu Phagen am Blutt un, berechent aus der Quantitéit vum injizéierte Phage, andeems de gesamte Bluttvolumen berécksiichtegt gëtt. Déi schwaarz Quadrater weisen den Intersektiounspunkt vun der y-Linn un, déi aus de Bluttphagekonzentratioune extrapoléiert ass. (e,f) Stellt déi relativ Frequenz an d'Verdeelung vun alle méiglechen iwwerlappenden Tripeptidmotiver am Peptid duer. D'Zuel vun de Motiver, déi an 1000 Liesungen fonnt goufen, gëtt gewisen. Signifikativ (p < 0,001) sinn beräichert Motiver mat roude Punkten markéiert. (e) Korrelatiounsstreeplot, deen déi relativ Frequenz vum Tripeptidmotiv vun der injizéierter Bibliothéik mat Blutt-ofgeleete Phagen vun den Déieren #1.1 an #1.2 vergläicht. (f) Korrelatiounsstreeplot, deen déi relativ Frequenzen vun den Déierphage-Tripeptidmotiver #1.1 an #1.2 vergläicht, déi a Blutt a Gehirnflëssegkeet isoléiert goufen. (g, h) Sequenz-ID-Representatioun vu Phagen, déi a Blutt beräichert sinn (g) am Verglach zu injizéierte Bibliothéiken a Phagen, déi a CSF beräichert sinn (h) am Verglach zu Blutt no enger Ronn vun In-vivo-Selektioun bei béiden Déieren. D'Gréisst vum Een-Buschtaf-Code weist un, wéi dacks dës Aminosäure op där Positioun virkënnt. Gréng = polar, violett = neutral, blo = basisch, rout = sauer a schwaarz = hydrophob Aminosaieren. D'Figur 1a, b gouf vum Eduard Urich entworf a produzéiert.
Mir hunn eng Phage-Peptidbibliothéik an zwou CM-Instrumentratten (Kladen A a B) injizéiert an de Phag aus Zerebrospinalflëssegkeet a Blutt isoléiert (Figur 1d). Déi initial séier Clearance vun der Bibliothéik war manner ausgeprägt am Verglach mam Wildtyp-Phag. Déi duerchschnëttlech Hallefzäit vun der injizéierter Bibliothéik bei béiden Déieren war 24,8 Minutten am Blutt, ähnlech wéi beim Wildtyp-Phag, an 38,5 Minutten am CSF. Blutt- a Zerebrospinalflëssegkeet-Phageprouwen vun all Déier goufen HTS ënnerworf an all identifizéiert Peptiden goufen op d'Präsenz vun engem kuerzen Tripeptidmotiv analyséiert. Tripeptidmotiver goufen ausgewielt, well se eng minimal Basis fir d'Strukturbildung an d'Peptid-Protein-Interaktiounen14,15 bidden. Mir hunn eng gutt Korrelatioun an der Verdeelung vun de Motiver tëscht der injizéierter Phagebibliothéik a Klonen fonnt, déi aus dem Blutt vun béiden Déieren extrahéiert goufen (Fig. 1e). D'Donnéeë weisen datt d'Zesummesetzung vun der Bibliothéik am Bluttkompartiment nëmme marginal beräichert ass. Aminosaierfrequenzen a Konsensussequenzen goufen op all Positioun weider analyséiert mat enger Adaptatioun vun der Weblogo16 Software. Interessanterweis hu mir eng staark Anreicherung vun de Bluttglycinreschter festgestallt (Fig. 1g). Wéi Blutt mat Klonen verglach gouf, déi aus CSF ausgewielt goufen, gouf eng staark Selektioun an eng gewëssen Deselektioun vu Motiver observéiert (Fig. 1f), an et waren bevorzugt op virbestëmmte Positiounen am 12-Member präsent (Fig. 1h). Bemierkenswäert ass, datt eenzel Déieren sech an der Zerebrospinalflëssegkeet signifikant ënnerscheet hunn, während eng Bluttglycinanreicherung bei béiden Déieren observéiert gouf (Ergänzungsfigur 4a-j). Nom strenge Filteren vun de Sequenzdaten an der Zerebrospinalflëssegkeet vun den Déieren #1.1 an #1.2 goufen insgesamt 964 an 420 eenzegaarteg 12-mer Peptiden kritt (Ergänzungsfigur 1d-e). Déi isoléiert Phagklonen goufen amplifizéiert an enger zweeter Ronn vun der In-vivo-Selektioun ënnerworf. Phagen, déi aus der zweeter Ronn vun der Selektioun extrahéiert goufen, goufen an all Déier HTS ënnerworf an all identifizéiert Peptiden goufen als Input fir e Motiverkennungsprogramm benotzt fir d'Optriede vun Tripeptidmotiver z'analyséieren (Fig. 2a, b, ef). Am Verglach mam éischten Zyklus vum Phag, deen aus CSF gewonnen gouf, hu mir weider Selektioun an Deselektioun vu ville Motiver am CSF an de Branchen A a B observéiert (Fig. 2). En Netzwierkidentifikatiounsalgorithmus gouf ugewannt fir ze bestëmmen, ob si verschidde Mustere vun enger konsequenter Sequenz representéieren. Eng kloer Ähnlechkeet gouf tëscht den 12-dimensionalen Sequenzen observéiert, déi vum CSF an der alternativer Clade A (Fig. 2c, d) a Clade B gewonnen goufen (Fig. 2g, h). Déi gepoolt Analyse an all Branche huet verschidde Selektiounsprofiler fir 12-mer Peptiden opgedeckt (Ergänzungsfigur 5c, d) an eng Erhéijung vum CSF/Blutt-Titer-Verhältnis iwwer d'Zäit fir gepoolt Klonen no der zweeter Selektiounsronn am Verglach mat der éischter Selektiounsronn (Ergänzungsfigur 5e).
Anreicherung vu Motiver a Peptiden an der Zerebrospinalflëssegkeet duerch zwou hannereneen Ronnen vun in vivo funktioneller Phage-Display-Selektioun.
All Phagen aus der Zerebrospinalflëssegkeet, déi aus der éischter Ronn vun all Déier gewonnen goufen (Déieren #1.1 an #1.2), goufen zesummegefaasst, amplifizéiert, HT-sequenzéiert a re-injizéiert (2 x 1010 Phagen/Déier) 2 SM-kanuléiert Ratten (#1.1 → #). 2.1 an 2.2, 1.2 → 2.3 an 2.4). (a,b,e,f) Korrelatiounsstreediagrammer, déi d'relativ Frequenz vun Tripeptidmotiver vun alle CSF-ofgeleete Phagen an der éischter an zweeter Selektiounsronn vergläichen. Relativ Frequenz a Verdeelung vu Motiver, déi all méiglech iwwerlappend Tripeptide representéieren, déi a Peptiden a béiden Orientéierungen fonnt goufen. D'Zuel vun de Motiver, déi an 1000 Liesungen fonnt goufen, gëtt gewisen. Motiver, déi signifikant (p < 0,001) an enger vun de verglachene Bibliothéike ausgewielt oder ausgeschloss goufen, sinn mat roude Punkten markéiert. (c, d, g, h) Sequenzlogo-Representatioun vun alle CSF-räiche Sequenzen mat 12 Aminosaieren, baséiert op de Ronnen 2 an 1 vun der In-vivo-Selektioun. D'Gréisst vum Een-Buschtaf-Code weist un, wéi dacks dës Aminosaier op där Positioun virkënnt. Fir de Logo ze representéieren, gëtt d'Frequenz vun de CSF-Sequenzen, déi aus eenzelnen Déieren tëscht zwou Selektiounsronnen extrahéiert goufen, verglach an déi beräichert Sequenzen an der zweeter Ronn ginn ugewisen: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 an (h) #1.2–#2.4. Déi beräichertst Aminosaieren op enger bestëmmter Positioun an (c, d) Déieren Nr. 2.1 an Nr. 2.2 oder (g, h) an Déieren Nr. 2.3 an Nr. 2.4 ginn a Faarf ugewisen. Gréng = polar, violett = neutral, blo = basisch, rout = sauer a schwaarz = hydrophob Aminosaieren.
Nom drëtte Selektiounsronn hu mir 124 eenzegaarteg Peptidsequenzen (#3.1 an #3.2) aus 332 CSF-rekonstituéierte Phagklonen identifizéiert, déi vun zwee Déieren isoléiert goufen (Ergänzungsfigur 6a). D'Sequenz LGSVS (18,7%) hat den héchste relative Prozentsaz, gefollegt vun den Wildtyp-Inserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) an SARGSWREIVSLS (2,2%). An der leschter véierter Ronn hu mir zwou onofhängeg ausgewielte Branchen aus dräi separaten Déieren zesummegefaasst (Fig. 1c). Vun den 925 sequenzéierte Phagklonen, déi aus CSF gewonnen goufen, hu mir an der véierter Ronn 64 eenzegaarteg Peptidsequenzen fonnt (Ergänzungsfigur 6b), vun deenen de relative Prozentsaz vu Wildtyp-Phagen op 0,8% gefall ass. Déi heefegst CSF-Klonen an der véierter Ronn waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) an RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). D'Längteberäich vun den ausgewielte Peptiden ass op Nukleotid-Insertiounen/Deletiounen oder virzäiteg Stopcodonen an de Bibliothéiksprimer zeréckzeféieren, wann degeneréiert Codonen fir den NNK-Bibliothéiksdesign benotzt ginn. Virzäiteg Stopcodonen generéieren méi kuerz Peptiden a gi ausgewielt, well se dat favorabelt aa-Motiv enthalen. Länger Peptiden kënnen duerch Insertiounen/Deletiounen an de Primer vun de synthetesche Bibliothéiken entstoen. Dëst positionéiert den entworfene Stopcodon ausserhalb vum Frame a liest en, bis en neie Stopcodon downstream erschéngt. Am Allgemengen hu mir d'Anreicherungsfaktoren fir all véier Selektiounsronnen berechent, andeems mir d'Inputdaten mat den Outputdaten vun der Prouf verglach hunn. Fir déi éischt Screening-Ronn hu mir Wildtyp-Phag-Titer als net-spezifesch Hannergrondreferenz benotzt. Interessanterweis war déi negativ Phage-Selektioun am éischten CSF-Zyklus ganz staark, awer net am Blutt (Fig. 3a), wat eventuell op déi niddreg Wahrscheinlechkeet vun enger passiver Diffusioun vun de meeschte Memberen vun der Peptidbibliothéik an de CSF-Kompartiment zeréckzeféieren ass, oder relativ Phagen tendéieren dozou, méi effizient aus dem Bluttkreeslaf zréckgehale oder ewechgeholl ze ginn wéi Bakteriophagen. Wéi och ëmmer, an der zweeter Ronn vum Panning gouf eng staark Selektioun vu Phagen am CSF a béide Kladen observéiert, wat drop hiweist, datt déi viregt Ronn u Phagen beräichert war, déi Peptiden weisen, déi d'CSF-Opnam förderen (Fig. 3a). Och hei ouni bedeitend Bluttberäicherung. Och an der drëtter a véierter Ronn waren d'Phage-Klonen bedeitend u CSF beräichert. Beim Verglach vun der relativer Frequenz vun all eenzegaarteger Peptidsequenz tëscht den zwou leschten Auswielronnen hu mir festgestallt, datt d'Sequenzen an der véierter Auswielronn nach méi beräichert waren (Fig. 3b). Insgesamt 931 Tripeptidmotiver goufen aus allen 64 eenzegaartege Peptidsequenzen mat béide Peptidorientéierungen extrahéiert. Déi am meeschte beräichert Motiver an der véierter Ronn goufen am Verglach mat der injizéierter Bibliothéik méi genee op hir beräicherungsprofiler iwwer all Ronnen ënnersicht (Grenzwäert: 10% beräicherung) (Ergänzungsfigur 6c). Allgemeng Selektiounsmuster hunn gewisen, datt déi meescht vun de studéierte Motiver an alle fréiere Ronnen vun deenen zwou Selektiounszweige beräichert goufen. Wéi och ëmmer, e puer Motiver (z.B. SGL, VSG, LGS GSV) koumen haaptsächlech aus der alternativer Clade A, während aner (z.B. FGW, RTN, WGF, NTR) an der alternativer Clade B beräichert goufen.
Validatioun vum CSF-Transport vu CSF-angeräicherte Phag-displayéierte Peptiden a biotinyléierte Leaderpeptiden, déi mat Streptavidin-Notloads konjugéiert sinn.
(a) Anreicherungsverhältnisser, déi an alle véier Ronnen (R1-R4) berechent goufen, baséiert op injizéierten (Input = I) Phag (PFU) Titeren an bestëmmten CSF Phag Titeren (Output = O). D'Anreicherungsfaktoren fir déi lescht dräi Ronnen (R2-R4) goufen duerch Verglach mat der viregter Ronn an der éischter Ronn (R1) mat Gewiichtsdaten berechent. Oppe Balke sinn Zerebrospinalflëssegkeet, schatteiert Balke sinn Plasma. (***p<0,001, baséiert op dem Student's t-Test). (b) Lëscht vun den heefegsten Phagpeptiden, klasséiert no hirem relative Verhältnis zu alle Phagen, déi no der 4. Ronn vun der Selektioun am CSF gesammelt goufen. Déi sechs heefegst Phagklonen sinn a Faarf markéiert, nummeréiert an hir Anreicherungsfaktoren tëscht de Ronnen 3 an 4 vun der Selektioun (Insets). (c,d) Déi sechs am meeschten anreichert Phagklonen, eidel Phag- a Parental-Phag-Peptidbibliothéiken aus der 4. Ronn goufen eenzel an engem CSF-Probemodell analyséiert. CSF- a Bluttproben goufen zu den uginnen Zäitpunkten gesammelt. (c) Gläich Quantitéiten vu 6 Kandidat-Phag-Klonen (2 x 1010 Phagen/Déieren), eidele Phagen (#1779) (2 x 1010 Phagen/Déieren) a Stock-Phag-Peptidbibliothéiken (2 x 1012 Phagen/Déieren). Op d'mannst 3 CM gëtt separat iwwer d'Schwanzvene un dat kanuléiert Déier injizéiert. D'CSF-Pharmakokinetik vun all injizéiertem Phag-Klon a Phag-Peptidbibliothéik iwwer d'Zäit gëtt gewisen. (d) weist dat duerchschnëttlecht CSF/Blutt-Verhältnis fir all gewonnen Phagen/ml iwwer d'Probenahmenzäit. (e) Véier synthetesch Leaderpeptiden an eng duerchernee Kontroll goufen mat Biotin iwwer hiren N-Terminus mat Streptavidin verbonnen (Tetramer-Display), gefollegt vun enger Injektioun (Schwanzvene iv, 10 mg Streptavidin/kg). Op d'mannst dräi intubéiert Ratten (N = 3). CSF-Prouwen goufen zu den uginnen Zäitpunkten gesammelt an d'Streptavidin-Konzentratioune goufen duerch CSF-Anti-Streptavidin-ELISA gemooss (nd = net detektéiert). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, baséiert op ANOVA-Test). (f) Vergläich vun der Aminosaiersequenz vum am meeschte beräicherte Phagpeptidklon #2002 (violett) mat anere ausgewählte Phagpeptidklonen aus der 4. Selektiounsronn. Identesch an ähnlech Aminosaierfragmenter sinn faarweg kodéiert.
Vun all den angereicherten Phagen an der véierter Ronn (Fig. 3b) goufen sechs Kandidatklonen fir weider individuell Analysen am CSF-Samplingmodell ausgewielt. Gläich Quantitéiten vu sechs Kandidatphage-, eidele Phage- (keen Insert)- a Prophage-Peptidbibliothéike goufen an dräi kanuléiert CM-Déieren injizéiert, an d'Pharmakokinetik gouf a CSF- (Fig. 3c) an Blutt- (Ergänzungsfig. 7) Tester bestëmmt. All geteste Phageklonen hunn de CSF-Kompartiment op engem Niveau gezielt, deen 10-1000 Mol méi héich war wéi dee vum eidele Kontrollphage (#1779). Zum Beispill haten d'Klonen #2020 an #2077 ongeféier 1000 Mol méi héich CSF-Titer wéi d'Kontrollphage. De pharmakokinetische Profil vun all ausgewielte Peptid ass anescht, awer all hunn eng héich CSF-Homing-Fäegkeet. Mir hunn e konstante Réckgang iwwer d'Zäit fir d'Klonen #1903 an #2011 observéiert, während fir d'Klonen #2077, #2002 an #2009 eng Erhéijung an den éischten 10 Minutten op en aktiven Transport hiweise kéint, awer muss verifizéiert ginn. D'Klonen #2020, #2002 an #2077 hunn sech op héijen Niveauen stabiliséiert, während d'CSF-Konzentratioun vum Klon #2009 no der initialer Erhéijung lues a lues erofgaangen ass. Mir hunn dann déi relativ Frequenz vun all CSF-Kandidat mat senger Bluttkonzentratioun verglach (Fig. 3d). D'Korrelatioun vum mëttleren Titer vun all CSF-Kandidat mat sengem Blutttiter zu all Proufzäiten huet gewisen, datt dräi vun de sechs Kandidaten signifikant u Blutt-CSF beräichert waren. Interessanterweis huet de Klon #2077 eng méi héich Bluttstabilitéit gewisen (Ergänzungsfigur 7). Fir ze bestätegen, datt d'Peptiden selwer fäeg sinn, aner Ladung wéi Phagpartikelen aktiv an de CSF-Kompartiment ze transportéieren, hu mir véier Leaderpeptiden synthetiséiert, déi mat Biotin um N-Terminus derivatiséiert goufen, wou d'Peptiden sech un d'Phagpartikel bannen. Biotinyléiert Peptiden (Nr. 2002, 2009, 2020 an 2077) goufe mat Streptavidin (SA) konjugéiert fir multimer Formen ze kréien, déi d'Phaggeometrie e bëssen imitéieren. Dëst Format huet et eis och erlaabt, d'SA-Expositioun a Blutt a Gehirnflëssegkeet als Frachttransportproteinpeptiden ze moossen. Wichteg ass, datt Phagdaten dacks reproduzéiert konnten ginn, wann synthetesch Peptiden an dësem SA-konjugéierte Format verabreicht goufen (Fig. 3e). Déi zerquetscht Peptiden haten eng manner initial Expositioun a méi séier CSF-Clearance mat ondetektéierbare Niveauen bannent 48 Stonnen. Fir Abléck an d'Liwwerweeër vun dëse Peptid-Phagklonen an de CSF-Raum ze kréien, hu mir d'Lokaliséierung vun eenzelne Phag-Peptid-Treffer mat Hëllef vun der Immunhistochemie (IHC) analyséiert, fir Phagpartikelen 1 Stonn no der intravenöser Injektioun in vivo direkt z'entdecken. Bemerkenswäert ass, datt d'Klonen #2002, #2077 an #2009 duerch staark Färbung a Gehirkapillaren nogewise konnten ginn, während Kontrollphage (#1779) a Klon #2020 net nogewise goufen (Ergänzungsfigur 8). Dëst weist drop hin, datt dës Peptiden zur Wierkung um Gehir bäidroen, andeems se de BBB kräizen. Eng weider detailléiert Analyse ass néideg fir dës Hypothese ze testen, well de BSCFB-Wee och bedeelegt ka sinn. Beim Verglach vun der Aminosaiersequenz vum am meeschte beräicherte Klon (#2002) mat anere ausgewählte Peptiden gouf festgestallt, datt e puer vun hinnen ähnlech Aminosaierverlängerungen hunn, wat op en ähnlechen Transportmechanismus hiweise kéint (Fig. 3f).
Wéinst sengem eenzegaartege Plasmaprofil an der bedeitender Erhéijung vum CSF iwwer d'Zäit gouf de Phage-Display-Klon #2077 iwwer eng méi laang Zäit vu 48 Stonnen weider ënnersicht a konnt déi séier Erhéijung vum CSF reproduzéieren, déi a Verbindung mat dauerhaften SA-Niveauen observéiert gouf (Fig. 4a). Wat aner identifizéiert Phageklonen ugeet, huet #2077 eng staark Faarf fir Gehirkapillaren gewisen a weist eng bedeitend Kolokaliséierung mat Kapillarmarkerlektin bei méi héijer Opléisung a méiglecherweis eng gewëssen Färbung am parenchymalen Raum (Figur 4b). Fir z'ënnersichen, ob peptidvermittelte pharmakologesch Effekter am ZNS erreecht kënne ginn, hu mir en Experiment duerchgefouert, bei deem biotinyléiert Versioune vun i) dem #2077 Transitpeptid an ii) dem BACE1-Inhibitorpeptid mat SA a zwou verschiddene Verhältnisser gemëscht goufen. Fir eng Kombinatioun hu mir nëmmen de BACE1-Peptidinhibitor benotzt a fir déi aner hu mir e Verhältnis vun 1:3 vum BACE1-Peptidinhibitor zum #2077-Peptid benotzt. Béid Prouwe goufen intravenös verabreicht an d'Blutt- a Gehirnwirbelsäuleflëssegkeetsniveauen vum Beta-Amyloid-Peptid 40 (Abeta40) goufen iwwer Zäit gemooss. Abeta40 gouf am CSF gemooss, well et d'BACE1-Inhibitioun am Gehirparenchym reflektéiert. Wéi erwaart hunn béid Komplexe d'Bluttniveauen vun Abeta40 signifikant reduzéiert (Fig. 4c, d). Wéi och ëmmer, nëmme Prouwe mat enger Mëschung aus Peptid Nr. 2077 an engem Inhibitor vum BACE1-Peptid, deen un SA konjugéiert ass, hunn eng signifikant Ofsenkung vun Abeta40 an der Gehirnwirbelsäuleflëssegkeet verursaacht (Fig. 4c). D'Donnéeë weisen, datt Peptid Nr. 2077 fäeg ass, dat 60 kDa SA-Protein an den ZNS ze transportéieren an och pharmakologesch Effekter mat SA-konjugéierten Inhibitoren vum BACE1-Peptid induzéiert.
(a) Klonal Injektioun (2 × 10 Phagen/Déier) vun T7-Phag, déi laangfristeg pharmakokinetesch Profiler vum CSF-Peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) an net-injizéiertem Kontrollphag (#1779) an op d'mannst dräi CM-intubéierte Ratten weist. (b) Konfokalmikroskopescht Bild vu representativen kortikale Mikrogefässer a Phag-injizéierte Ratten (2 × 10 10 Phagen/Déier), dat d'Géigefärbung vum Peptid #2077 a Gefässer (Lektin) weist. Dës Phagklonen goufen 3 Ratten verabreicht a si 1 Stonn virun der Perfusioun zirkuléiere gelooss. D'Gehirer goufen duerchgeschnidden a mat polyklonalen FITC-markéierten Antikörper géint den T7-Phag-Kapsid gefierft. Zéng Minutte virun der Perfusioun an der spéiderer Fixatioun gouf DyLight594-markéiert Lektin intravenös verabreicht. Fluoreszent Biller, déi d'Lektinfärbung (rout) vun der luminaler Säit vu Mikrogefässer a Phagen (gréng) am Lumen vu Kapillaren a perivaskulärem Gehirgewebe weisen. D'Skala-Balke entsprécht 10 µm. (c, d) Biotinyléiert BACE1-inhibitorescht Peptid eleng oder a Kombinatioun mat biotinyléiertem Transitpeptid #2077 gouf mat Streptavidin gekoppelt, gefollegt vun intravenöser Injektioun vun op d'mannst dräi kanuléierte CM-Ratten (10 mg Streptavidin/kg). D'Reduktioun vun Aβ40, déi duerch de BACE1-Peptid-Inhibitor vermittelt gouf, gouf mat Aβ1-40 ELISA a Blutt (rout) a Gehirnflëssegkeet (orange) zu den uginnen Zäitpunkten gemooss. Fir eng besser Kloerheet ass eng gepunkelt Linn um Grafik op enger Skala vun 100% gezeechent. (c) Prozentsaz Reduktioun vun Aβ40 a Blutt (rout Dräiecker) a Gehirnflëssegkeet (orange Dräiecker) bei Ratten, déi mat Streptavidin konjugéiert mat Transitpeptid #2077 a BACE1-inhibitoresche Peptid an engem Verhältnes vun 3:1 behandelt goufen. (d) Prozentsaz Reduktioun vum Blutt Aβ40 (rout Kreesser) a Gehirnflëssegkeet (orange Kreesser) vu Ratten, déi mat Streptavidin nëmmen gekoppelt mat engem BACE1-hemmende Peptid behandelt goufen. D'Aβ-Konzentratioun an der Kontroll war 420 pg/ml (Standardofwäichung = 101 pg/ml).
Phage-Display gouf erfollegräich a verschiddene Beräicher vun der biomedizinescher Fuerschung17 ugewannt. Dës Method gouf fir in vivo vaskulär Diversitéitsstudien18,19 souwéi Studien, déi sech op zerebral Gefässer20,21,22,23,24,25,26 abzielen, benotzt. An dëser Studie hu mir d'Uwendung vun dëser Selektiounsmethod net nëmmen op déi direkt Identifikatioun vu Peptiden, déi sech op zerebral Gefässer abzielen, erweidert, mä och op d'Entdeckung vu Kandidaten mat aktive Transporteigenschaften, fir d'Blutt-Hirn-Barrière ze passéieren. Mir beschreiwen elo d'Entwécklung vun enger in vivo Selektiounsprozedur bei CM-intubéierte Ratten a demonstréieren hiert Potenzial, Peptiden mat CSF-Homing-Eegeschaften z'identifizéieren. Mat dem T7-Phag, deen eng Bibliothéik vun 12-mer zoufällege Peptiden weist, konnten mir noweisen, datt den T7-Phag kleng genuch ass (ongeféier 60 nm am Duerchmiesser)10, fir sech un d'Blutt-Hirn-Barrière unzepassen an doduerch direkt d'Blutt-Hirn-Barrière oder de Choroidplexus ze passéieren. Mir hunn observéiert, datt d'CSF-Ernte vu kanuléierte CM-Ratten eng gutt kontrolléiert in vivo funktionell Screeningmethod war, an datt de extrahéierte Phag net nëmmen un d'Gefässer gebonnen ass, mä och als Transporter iwwer d'Blutt-Hirn-Barrière funktionéiert huet. Ausserdeem, andeems mir gläichzäiteg Blutt gesammelt an HTS op CSF a Blutt-ofgeleet Phagen ugewannt hunn, hu mir bestätegt, datt eis Wiel vum CSF net vun der Bluttanreicherung oder der Fitness fir Expansioun tëscht Selektiounsronnen beaflosst gouf. De Bluttkompartiment ass awer Deel vun der Selektiounsprozedur, well Phagen, déi fäeg sinn, de CSF-Kompartiment z'erreechen, laang genuch iwwerliewen a zirkuléiere mussen, fir sech am Gehir anzeräicheren. Fir zouverlässeg Sequenzinformatiounen aus Roh-HTS-Daten ze extrahéieren, hu mir Filter implementéiert, déi u plattformspezifesch Sequenzéierungsfeeler am Analyseworkflow ugepasst sinn. Duerch d'Integratioun vu kinetesche Parameteren an d'Screeningmethod hu mir déi séier Pharmakokinetik vu Wildtyp T7-Phagen (t½ ~ 28 min) am Blutt bestätegt24, 27, 28 an och hir Hallefzäit an der Zerebrospinalflëssegkeet (t½ ~ 26 min) pro Minutt bestëmmt. Trotz ähnlechen pharmakokineteschen Profiler am Blutt a Liquor cerebrospinalis (CSF), konnten nëmmen 0,001% vun der Bluttkonzentratioun vu Phagen am CSF nogewise ginn, wat op eng niddreg Hannergrondmobilitéit vu Wildtyp T7-Phagen iwwer d'Blutt-Hirn-Barrière hiweist. Dës Aarbecht ënnersträicht d'Wichtegkeet vun der éischter Selektiounsronn bei der Uwendung vun In-vivo-Panning-Strategien, besonnesch fir Phagesystemer, déi séier aus dem Bluttkreeslaf erausgeholl ginn, well nëmme wéineg Klonen de CNS-Kompartiment erreechen kënnen. Dofir war d'Reduktioun vun der Bibliothéiksdiversitéit an der éischter Ronn ganz grouss, well nëmmen eng limitéiert Zuel vu Klonen an dësem ganz strikte CSF-Modell schlussendlech gesammelt goufen. Dës In-vivo-Panning-Strategie huet verschidde Selektiounsschrëtt abegraff, wéi aktiv Akkumulatioun am CSF-Kompartiment, Kloniwwerliewe am Bluttkompartiment an eng séier Entfernung vun T7-Phag-Klonen aus dem Blutt bannent den éischten 10 Minutten (Fig. 1d an Ergänzungsfigur 4M). Dofir goufen no der éischter Ronn verschidde Phag-Klonen am CSF identifizéiert, obwuel deeselwechten initialen Pool fir eenzel Déieren benotzt gouf. Dëst weist drop hin, datt verschidde strikt Selektiounsschrëtt fir Quellbibliothéike mat enger grousser Zuel vu Bibliothéiksmemberen zu enger bedeitender Reduktioun vun der Diversitéit féieren. Dofir ginn zoufälleg Evenementer en integralen Deel vum initialen Selektiounsprozess a beaflossen d'Resultat staark. Et ass wahrscheinlech, datt vill vun de Klonen an der ursprénglecher Bibliothéik eng ganz ähnlech CSF-Anreicherungsneigung haten. Wéi och ëmmer, och ënner de selwechten experimentellen Konditiounen, kënnen d'Selektiounsresultater sech ënnerscheeden wéinst der klenger Zuel vun all eenzelne Klon am initialen Pool.
D'Motiver, déi am CSF beräichert sinn, ënnerscheede sech vun deenen am Blutt. Interessanterweis hu mir déi éischt Verschiebung a Richtung Glycin-räiche Peptiden am Blutt vun eenzelnen Déieren festgestallt. (Fig. 1g, Ergänzungsfiguren 4e, 4f). Phagen, déi Glycin-Peptiden enthalen, kënne méi stabil sinn a manner wahrscheinlech aus dem Blutt erausgeholl ginn. Dës Glycin-räich Peptiden goufen awer net an de Prouwen aus der Zerebrospinalflëssegkeet nogewise, wat drop hiweist, datt déi kuréiert Bibliothéiken zwou verschidde Selektiounsschrëtt duerchlafen: een am Blutt an en aneren, deen an der Zerebrospinalflëssegkeet accumuléiere konnt. CSF-beräichert Klonen, déi aus der véierter Selektiounsronn resultéieren, goufen extensiv getest. Bal all eenzel geteste Klonen goufen als CSF-beräichert am Verglach zum Kontrollphage bestätegt. Ee Peptid-Treffer (#2077) gouf méi detailléiert ënnersicht. En huet eng méi laang Plasma-Hallefzäit am Verglach mat aneren Treffer gewisen (Figur 3d an Ergänzungsfigur 7), an interessanterweis huet dëse Peptid e Cysteinrescht um C-Terminus enthalen. Et gouf viru kuerzem gewisen, datt d'Zousätzlech vu Cystein zu Peptide hir pharmakokinetesch Eegeschafte verbessere kann, andeems se un Albumin 29 binden. Dëst ass de Moment onbekannt fir Peptid #2077 a brauch weider Studien. E puer Peptide weisen eng Valenzofhängegkeet an der CSF-Anreicherung (Donnéeën net gewisen), déi mat der ugewisener Uewerflächegeometrie vum T7-Kapsid zesummenhänke kann. Den T7-System, deen mir benotzt hunn, huet 5-15 Kopie vun all Peptid pro Phagpartikel gewisen. IHC gouf op Kandidat-Lead-Phag-Klonen duerchgefouert, déi intravenös an de Gehircortex vu Ratten injizéiert goufen (Ergänzungsfigur 8). D'Donnéeë weisen, datt op d'mannst dräi Klonen (Nr. 2002, Nr. 2009 an Nr. 2077) mam BBB interagéiert hunn. Et bleift ze bestëmmen, ob dës BBB-Interaktioun zu der Akkumulatioun vu CSF oder zur Beweegung vun dëse Klonen direkt an de BCSFB féiert. Wichteg ass, datt mir weisen, datt déi ausgewielte Peptide hir CSF-Transportkapazitéit behalen, wann se synthetiséiert a mat der Proteinladung gebonne ginn. D'Bindung vun N-terminalen biotinyléierte Peptiden un SA widderhëlt am Fong d'Resultater, déi mat hire jeeweilege Phagklonen am Blutt a Gehirnflëssegkeet kritt goufen (Fig. 3e). Schlussendlech weisen mir, datt de Leadpeptid #2077 fäeg ass, d'Gehirnaktioun vun engem biotinyléierte Peptidinhibitor vu BACE1, deen un SA konjugéiert ass, ze förderen, wat ausgeprägte pharmakodynamesch Effekter am ZNS verursaacht, andeems d'Abeta40-Niveauen am CSF signifikant reduzéiert ginn (Fig. 4). Mir konnten keng Homologe an der Datebank identifizéieren, andeems mir eng Peptid-Sequenz-Homologie-Sich vun allen Hits duerchgefouert hunn. Et ass wichteg ze bemierken, datt d'Gréisst vun der T7-Bibliothéik ongeféier 109 ass, während déi theoretesch Bibliothéiksgréisst fir 12-Mer 4 x 1015 ass. Dofir hu mir nëmmen e klenge Brochdeel vum Diversitéitsraum vun der 12-Mer-Peptidbibliothéik ausgewielt, wat bedeite kann, datt méi optiméiert Peptiden identifizéiert kënne ginn, andeems de benachbarte Sequenzraum vun dësen identifizéierten Hits evaluéiert gëtt. Hypothetesch kéint ee vun de Grënn, firwat mir keng natierlech Homologe vun dëse Peptiden fonnt hunn, d'Deselektioun während der Evolutioun sinn, fir den onkontrolléierten Antrëtt vu bestëmmte Peptidmotiver an d'Gehir ze verhënneren.
Zesummegeholl bidden eis Resultater eng Basis fir zukünfteg Aarbechten, fir d'Transportsystemer vun der zerebrovaskulärer Barrière in vivo méi detailléiert z'identifizéieren an ze charakteriséieren. Déi grondleeënd Opstellung vun dëser Method baséiert op enger funktioneller Selektiounsstrategie, déi net nëmmen Klonen mat zerebrovaskuläre Bindungseigenschaften identifizéiert, mä och e kritesche Schrëtt enthält, an deem erfollegräich Klonen intrinsesch Aktivitéit hunn, fir biologesch Barrièren in vivo an den ZNS-Kompartiment ze kräizen. D'Zil ass et, de Mechanismus vum Transport vun dëse Peptiden an hir Präferenz fir d'Bindung un d'Mikrovaskulatur, déi spezifesch fir d'Gehirregioun ass, opzeklären. Dëst kéint zu der Entdeckung vun neie Weeër fir den Transport vum BBB a Rezeptoren féieren. Mir erwaarden, datt déi identifizéiert Peptiden direkt un zerebrovaskulär Rezeptoren oder un zirkulierend Liganden, déi duerch de BBB oder BCSFB transportéiert ginn, bannen kënnen. D'Peptidvektoren mat CSF-Transportaktivitéit, déi an dëser Aarbecht entdeckt goufen, ginn weider ënnersicht. Mir ënnersichen de Moment d'Gehirspezifizitéit vun dëse Peptiden op hir Fäegkeet, de BBB an/oder BCSFB ze kräizen. Dës nei Peptide wäerte extrem wäertvoll Instrumenter fir déi potenziell Entdeckung vun neie Rezeptoren oder Weeër a fir d'Entwécklung vun neien héicheffiziente Plattforme fir d'Liwwerung vu Makromoleküle, wéi Biologika, an d'Gehir sinn.
Kanüléiert d'grouss Zisterna (CM) mat enger Modifikatioun vun der virdru beschriwwener Method. Anästhetiséiert Wistar-Ratten (200-350 g) goufen op engem stereotaxeschen Apparat montéiert an et gouf e mëttleren Schnëtt iwwer der raséierter an aseptesch virbereeter Kopfhaut gemaach, fir de Schädel fräizeleeën. Zwee Lächer am Beräich vum ieweschte Schierm gebuert an d'Fixatiounsschrauwen an de Lächer befestegt. En zousätzlecht Lach gouf am lateralen Ockipitalamm fir stereotaktesch Féierung vun enger Edelstahlkanül an de CM gebuert. Dentalzement ronderëm d'Kanül applizéieren a mat Schrauwen befestegen. Nom Photohärten an Zementhärten gouf d'Hautvunk mat 4/0 Supramidsnout zougemaach. Déi richteg Plazéierung vun der Kanül gëtt duerch spontan Leckage vun der Gehirnspinnflëssegkeet (CSF) bestätegt. D'Ratt aus dem stereotaxeschen Apparat eraushuelen, eng entspriechend postoperativ Betreiung a Schmerzbehandlung kréien, a loosst se sech op d'mannst eng Woch erhuelen, bis Zeeche vu Blutt an der Gehirnspinnflëssegkeet observéiert ginn. D'Wistar-Ratten (Crl:WI/Han) goufen aus Charles River (Frankräich) kritt. All Ratten goufen ënner spezifesche pathogenfräie Konditioune gehalen. All Déierversich goufen vum Veterinärbüro vun der Stad Basel, Schwäiz, guttgeheescht a goufen am Aklang mat der Déierelizenz Nr. 2474 (Bewäertung vum aktiven Gehirtransport duerch d'Miessung vun den Niveauen vun therapeutesche Kandidaten an der Cerebrospinalflëssegkeet a vum Gehir vun der Ratt) duerchgefouert.
Halt d'Ratt virsiichteg beim bewosst, mat der CM-Kanül an der Hand. Huelt d'Datura aus der Kanül eraus a sammelt 10 µl spontan fléissend Zerebrospinalflëssegkeet. Well d'Duerchgängegkeet vun der Kanül schlussendlech kompromittéiert war, goufen nëmme kloer Zerebrospinalflëssegkeetsproben ouni Zeeche vu Bluttkontaminatioun oder Verfärbung an dës Studie abegraff. Parallel goufen ongeféier 10–20 µl Blutt aus engem klenge Schnëtt un der Schwanzspëtz a Réier mat Heparin (Sigma-Aldrich) geholl. Liquor cerebrospinalflëssegkeet a Blutt goufen zu verschiddenen Zäitpunkten no der intravenöser Injektioun vum T7-Phag gesammelt. Ongeféier 5–10 µl Flëssegkeet goufen ewechgehäit, ier all Liquor-Prouf gesammelt gouf, wat dem Doudege Volumen vum Katheter entsprécht.
Bibliothéike goufe mat dem T7Select 10-3b Vektor generéiert, wéi am T7Select System Handbuch beschriwwen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kuerz gesot, gouf en zoufällegen 12-mer DNA Insert am folgende Format synthetiséiert:
Den NNK-Codon gouf benotzt fir duebel Stopcodonen an Aminosäure-Iwwerexpressioun am Insert ze vermeiden. N ass e manuell gemëschten equimolare Verhältnis vun all Nukleotid, a K ass e manuell gemëschten equimolare Verhältnis vun Adenin- a Cytosin-Nukleotiden. Eenzelstrangregiounen goufen duerch weider Inkubatioun mat dNTP (Novagen) an dem Klenow-Enzym (New England Biolabs) am Klenow-Puffer (New England Biolabs) fir 3 Stonnen bei 37°C an duebelstrangeg DNA ëmgewandelt. Nom Reaktioun gouf duebelstrangeg DNA duerch EtOH-Ausfällung gewonnen. Déi resultéierend DNA gouf mat de Restriktiounsenzym EcoRI an HindIII (béid vu Roche) verdaut. Den gespalten an gereinegten (QIAquick, Qiagen) Insert (T4-Ligase, New England Biolabs) gouf dann am Frame an e virgespalten T7-Vektor no der Aminosäure 348 vum 10B-Kapsidgen ligéiert. Ligatiounsreaktiounen goufen 18 Stonnen bei 16°C inkubéiert, ier se in vitro verpackt goufen. D'Phageverpackung in vitro gouf no den Instruktioune vum T7Select 10-3b Klonéierungskit (Novagen) duerchgefouert an d'Verpackungsléisung gouf eemol mat Escherichia coli (BLT5615, Novagen) op Lyse amplifizéiert. D'Lysate goufen zentrifugéiert, titréiert a bei -80°C als Stammléisung vu Glycerol agefruer.
Direkt PCR-Amplifikatioun vu Phagevariablenregiounen, déi an der Bouillon oder op enger Plack amplifizéiert goufen, mat proprietäre 454/Roche-Amplicon-Fusiounsprimer. De Forward-Fusiounsprimer enthält Sequenzen, déi d'variabel Regioun (NNK) 12 (Schablounspezifesch), den GS FLX Titanium Adapter A an eng véierbaseg Bibliothéiksschlësselsequenz (TCAG) flankéieren (Ergänzungsfigur 1a):
De Reverse-Fusiounsprimer enthält och Biotin, deen u Capture-Perlen an den GS FLX Titanium Adapter B befestegt ass, deen fir d'klonal Amplifikatioun während der Emulsiouns-PCR gebraucht gëtt:
D'Amplikonen goufen duerno enger 454/Roche-Pyrosequenzéierung no dem 454 GS-FLX Titanium-Protokoll ënnerworf. Fir manuell Sanger-Sequenzéierung (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) gouf T7-Phag-DNA duerch PCR amplifizéiert a mat de folgende Primerpaaren sequenzéiert:
Inserts aus eenzelne Plaquen goufen enger PCR-Amplifikatioun mat dem Roche Fast Start DNA Polymerase Kit ënnerworf (geméiss den Instruktioune vum Hiersteller). Féiert en Hot Start (10 Minutten bei 95 °C) an 35 Boost-Zyklen (50 Sekonnen bei 95 °C, 1 Minutt bei 50 °C an 1 Minutt bei 72 °C) duerch.
Phagen aus Bibliothéiken, Wildtyp-Phagen, Phagen, déi aus Liquor cerebrospinalis a Blutt gerett goufen, oder eenzel Klonen goufen an Escherichia coli BL5615 an TB-Bouillon (Sigma Aldrich) oder a 500 cm2-Schalen (Thermo Scientific) fir 4 Stonnen bei 37°C amplifizéiert. D'Phagen goufen aus de Placke extrahéiert andeems d'Placke mat Tris-EDTA-Puffer (Fluka Analytical) gespullt goufen oder d'Plaques mat sterile Pipettespiesse gesammelt goufen. D'Phagen goufen aus dem Kultursupernatant oder dem Extraktiounspuffer mat enger Ronn Polyethylenglykol (PEG 8000)-Ausfällung (Promega) isoléiert an an Tris-EDTA-Puffer resuspendéiert.
De verstäerkte Phag gouf 2-3 Ronnen Endotoxin-Entfernung mat Endotoxin-Entfernungsperlen (Miltenyi Biotec) ënnerworf, ier en intravenös (IV) injizéiert gouf (500 μl/Déier). An der éischter Ronn goufen 2×1012 Phagen agefouert; an der zweeter 2×1010 Phagen; an der drëtter a véierter Selektiounsronn 2×109 Phagen pro Déier. De Phagengehalt an CSF- a Bluttproben, déi zu den uginnen Zäitpunkten gesammelt goufen, gouf duerch Plaquezielung no den Instruktioune vum Hiersteller (T7Select Systemhandbuch) bestëmmt. D'Phageselektioun gouf duerch intravenös Injektioun vu gereinegten Bibliothéiken an d'Schwanzven oder duerch Neiinjektioun vu Phagen, déi aus CSF aus der viregter Selektiounsronn extrahéiert goufen, duerchgefouert, an déi folgend Ernte goufen no 10 Minutten, 30 Minutten, 60 Minutten, 90 Minutten, 120 Minutten, 180 Minutten a respektiv 240 Minutten CSF- a Bluttproben duerchgefouert. Insgesamt véier Ronnen In-vivo-Panning goufen duerchgefouert, bei deenen déi zwou ausgewielte Branchen separat gelagert an analyséiert goufen, während den éischten dräi Selektiounsronnen. All Phage-Inserts, déi aus CSF aus den éischten zwou Selektiounsronnen extrahéiert goufen, goufen enger 454/Roche-Pyrosequenzéierung ënnerworf, während all Klonen, déi aus CSF aus den leschten zwou Selektiounsronnen extrahéiert goufen, manuell sequenzéiert goufen. All Bluttphagen aus der éischter Selektiounsronn goufen och enger 454/Roche-Pyrosequenzéierung ënnerworf. Fir d'Injektioun vu Phageklonen goufen ausgewielte Phagen an E. coli (BL5615) op 500 cm2 Placken bei 37°C fir 4 Stonnen amplifizéiert. Individuell ausgewielte a manuell sequenzéiert Klonen goufen an TB-Medium propagéiert. No der Phagextraktioun, der Purifikatioun an der Entfernung vum Endotoxin (wéi uewe beschriwwen), goufen 2×1010 Phagen/Déier an 300 μl intravenös an eng Schwanzvene injizéiert.
Virveraarbechtung a qualitativ Filterung vun Sequenzdaten. Réi 454/Roche-Date goufen aus engem binäre Standard Stream Map Format (sff) an e Pearson Human Readable Format (fasta) mat Hëllef vun engem Vendor-Software konvertéiert. Déi weider Veraarbechtung vun der Nukleotidsequenz gouf mat proprietäre C-Programmer a Scripten (net verëffentlecht Softwarepaket) duerchgefouert, wéi hei ënnendrënner beschriwwen. D'Analyse vun den primären Daten enthält strikt Méistufe-Filterungsprozeduren. Fir Liesungen erauszefilteren, déi keng gülteg 12mer-Insert-DNA-Sequenz enthalen, goufen d'Liesungen sequentiell op Startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), Stoplabel (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) an Hannergrond-Insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mat Hëllef vum globale Needleman-Wunsch-Test ausgeriicht. D'Ausrichtung erlaabt bis zu 2 Inkonsistenzen pro Ausrichtung31. Dofir goufen Liesungen ouni Start- an Stop-Tags a Liesungen, déi Hannergrond-Inserts enthalen, also Ausrichtungen, déi déi erlaabt Zuel vun Mismatches iwwerschreiden, aus der Bibliothéik ewechgeholl. Wat déi reschtlech Liesungen ugeet, gouf d'N-mer DNA Sequenz, déi vum Startmark bis virun der Stopmark geet, aus der ursprénglecher Liessequenz erausgeholl a weider veraarbecht (am weidere Sënn als "Insert" bezeechent). Nom Translatioun vum Insert gëtt den Deel nom éischte Stopcodon um 5'-Enn vum Primer aus dem Insert ewechgeholl. Zousätzlech goufen och Nukleotiden ewechgeholl, déi zu onkomplette Codonen um 3'-Enn vum Primer féieren. Fir Inserts mat nëmmen Hannergrondsequenzen auszeschléissen, goufen och translatéiert Inserts, déi mam Aminosaiermuster "PAG" ufänken, ewechgeholl. Peptiden mat enger posttranslationaler Längt vu manner wéi 3 Aminosaieren goufen aus der Bibliothéik ewechgeholl. Schlussendlech gouf d'Redundanz am Insertpool ewechgeholl an d'Frequenz vun all eenzegaartegen Insert bestëmmt. D'Resultater vun dëser Analyse hunn eng Lëscht vun Nukleotidsequenzen (Inserts) an hir (Lies-)Frequenzen enthalen (Ergänzungsfiguren 1c an 2).
Grupp N-mer DNA-Inserts no Sequenzähnlechkeet: Fir 454/Roche-spezifesch Sequenzéierungsfeeler (wéi z.B. Problemer mat Sequenzéierungs-Homopolymer-Extensiounen) ze eliminéieren an manner wichteg Redundanzen ze läschen, ginn virdru gefiltert N-mer DNA-Sequenz-Inserts (Inserts) no Ähnlechkeet sortéiert. Inserts (bis zu 2 net-iwwereneepassende Basen erlaabt) mat Hëllef vun engem iterativen Algorithmus, deen wéi follegt definéiert ass: Inserts ginn als éischt no hirer Frequenz (héchst bis niddregst) sortéiert, a wa se d'selwecht sinn, no hirer sekundärer Sortéierung no Längt (längst bis kierzt). Sou definéieren déi heefegst an déi längst Inserts déi éischt "Grupp". D'Gruppenfrequenz gëtt op d'Schlësselfrequenz gesat. Duerno gouf probéiert, all Insert, déi an der sortéierter Lëscht bleift, duerch paarweis Needleman-Wunsch-Ausriichtung an d'Grupp bäizefügen. Wann d'Zuel vun den Net-Methodungen, Inserts oder Läschen an enger Ausriichtung e Schwellwäert vun 2 net iwwerschreit, gëtt eng Insert an d'Grupp bäigefüügt, an déi allgemeng Gruppenfrequenz gëtt ëm d'Frequenz vun der Insertioun erhéicht. Inserts, déi zu enger Grupp bäigefüügt ginn, ginn als benotzt markéiert an aus der weiderer Veraarbechtung ausgeschloss. Wann d'Insertsequenz net zu enger scho existéierender Grupp bäigefüügt ka ginn, gëtt d'Insertsequenz benotzt fir eng nei Grupp mat der entspriechender Insertfrequenz ze kreéieren an als benotzt markéiert. D'Iteratioun endet wann all Insertsequenz entweder benotzt gouf fir eng nei Grupp ze bilden oder an eng scho existéierend Grupp opgeholl ka ginn. Schlussendlech ginn gruppéiert Inserts, déi aus Nukleotiden bestinn, schlussendlech a Peptidsequenzen (Peptidbibliothéiken) iwwersat. D'Resultat vun dëser Analyse ass eng Rei vun Inserts an hir entspriechend Frequenzen, déi d'Zuel vun den hannereneen Liesungen ausmaachen (Ergänzungsfigur 2).
Motivgeneratioun: Baséierend op enger Lëscht vun eenzegaartege Peptiden, gouf eng Bibliothéik erstallt, déi all méiglech Aminosaiermuster (aa) enthält, wéi hei ënnendrënner gewisen. All méiglech Muster mat der Längt 3 gouf aus dem Peptid extrahéiert an säin inverst Muster gouf zesumme mat enger gemeinsamer Motivbibliothéik mat all Muster (Tripeptiden) bäigefüügt. Bibliothéike vu staark repetitive Motiver goufen sequenzéiert an d'Redundanz gouf ewechgeholl. Duerno hu mir fir all Tripeptid an der Motivbibliothéik seng Präsenz an der Bibliothéik mat Hëllef vu Berechnungsinstrumenter iwwerpréift. An dësem Fall gëtt d'Frequenz vum Peptid, deen dat fonnt Motiv-Tripeptid enthält, bäigefüügt an dem Motiv an der Motivbibliothéik zougewisen ("Zuel vun de Motiver"). D'Resultat vun der Motivgeneratioun ass en zweedimensionalt Array, dat all Optriede vun Tripeptiden (Motiver) an hir jeeweileg Wäerter enthält, déi d'Zuel vun de Sequenzéierungsliesungen sinn, déi zum entspriechende Motiv féieren, wann d'Liesungen gefiltert, gruppéiert an iwwersat ginn. Metriken wéi uewen am Detail beschriwwen.
Normaliséierung vun der Zuel vun de Motiver an entspriechende Streudiagrammer: D'Zuel vun de Motiver fir all Prouf gouf normaliséiert mat Hëllef vun
woubei ni d'Zuel vun de Liesungen ass, déi den Thema i enthalen. Dofir representéiert vi d'Prozentsfrequenz vun de Liesungen (oder Peptiden), déi den Thema i an der Prouf enthalen. P-Wäerter fir déi net-normaliséiert Zuel vu Motiver goufen mam Fisher-exakten Test berechent. Wat d'Korrelogrammer vun der Zuel vu Motiver ugeet, goufen d'Spearman-Korrelatiounen mat der normaliséierter Zuel vu Motiver mat R berechent.
Fir den Inhalt vun Aminosaieren op all Positioun an der Peptidbibliothéik ze visualiséieren, goufen Weblogramme 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) erstallt. Als éischt gëtt den Inhalt vun Aminosaieren op all Positioun vum 12-mer Peptid an enger 20×12 Matrix gespäichert. Duerno gëtt e Set vun 1000 Peptiden, déi deeselwechten relative Aminosaiergehalt op all Positioun enthalen, am Fasta-Sequenzformat generéiert an als Input fir Web-Logo 3 geliwwert, wat eng graphesch Duerstellung vum relative Aminosaiergehalt op all Positioun fir eng bestëmmt Peptidbibliothéik generéiert. Fir multidimensional Datensätz ze visualiséieren, goufen Hëtzekaarte mat engem intern entwéckelten Tool an R erstallt (biosHeatmap, en nach ze verëffentlechen R-Package). D'Dendrogramme, déi an den Hëtzekaarte presentéiert goufen, goufen mat der hierarchescher Clusteringmethod vum Ward mat der euklidescher Distanzmetrik berechent. Fir d'statistesch Analyse vun de Motiv-Scoring-Daten goufen d'P-Wäerter fir onnormaliséiert Scoring mat dem Fisher-Exakten-Test berechent. P-Wäerter fir aner Datensätz goufen an R mat Hëllef vum Student's t-Test oder ANOVA berechent.
Ausgewielte Phageklonen a Phagen ouni Inserts goufen intravenös iwwer d'Schwanzvene injizéiert (2×1010 Phagen/Déier an 300 μl PBS). Zéng Minutte virun der Perfusioun an der spéiderer Fixatioun goufen déiselwecht Déieren intravenös mat 100 μl DyLight594-markéiertem Lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) injizéiert. 60 Minutte no der Phaginjektioun goufen d'Ratten duerch d'Häerz mat 50 ml PBS, gefollegt vun 50 ml 4% PFA/PBS, perfuséiert. Gehirprouwen goufen zousätzlech iwwer Nuecht a 4% PFA/PBS fixéiert an iwwer Nuecht an 30% Saccharose bei 4°C ageweit. D'Prouwen ginn an der OCT-Mëschung séier agefruer. Eng immunhistochemesch Analyse vun de gefruerenen Prouwen gouf bei Raumtemperatur op 30 µm Kryosektiounen duerchgefouert, déi mat 1% BSA blockéiert waren, an mat polyklonalen FITC-markéierten Antikörper géint T7-Phag (Novus NB 600-376A) bei 4°C inkubéiert goufen. Iwwer Nuecht inkubéieren. Schlussendlech goufen d'Schnëtter 3-mol mat PBS gewäsch an mat engem konfokalen Lasermikroskop (Leica TCS SP5) ënnersicht.
All Peptide mat enger Mindestreinheet vun 98% goufen vu GenScript USA synthetiséiert, biotinyléiert a lyophiliséiert. Biotin ass iwwer en zousätzlechen Triple Glycin Spacer um N-Terminus gebonnen. Kontrolléiert all Peptide mat Massenspektrometrie.
Streptavidin (Sigma S0677) gouf mat engem 5-fache äquimolare Iwwerschoss vu biotinyléiertem Peptid, biotinyléiertem BACE1-inhibitoresche Peptid oder enger Kombinatioun (3:1 Verhältnis) vu biotinyléiertem BACE1-inhibitoresche Peptid a BACE1-inhibitoresche Peptid an 5–10% DMSO/inkubéiert a PBS gemëscht. 1 Stonn bei Raumtemperatur virun der Injektioun. Streptavidin-konjugéiert Peptiden goufen intravenös an enger Dosis vun 10 mg/kg an eng vun de Schwanzvenen vu Ratten mat enger Gehirhöhl injizéiert.
D'Konzentratioun vu Streptavidin-Peptid-Komplexe gouf duerch ELISA bewäert. Nunc Maxisorp Mikrotiterplacke (Sigma) goufen iwwer Nuecht bei 4°C mat 1,5 μg/ml Maus-Anti-Streptavidin-Antikörper (Thermo, MA1-20011) beschichtet. Nodeems d'Plat 2 Stonnen laang bei Raumtemperatur blockéiert gouf (Blockéierungspuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% Gelatine, 1% BSA), d'Plat 3 Sekonne laang mat 0,05% Tween-20/PBS (Wäschpuffer) gewäsch gouf, goufen CSF- a Plasmaproben an d'Pëtze bäigefüügt, déi mat Blockéierungspuffer (Plasma 1:10.000, CSF 1:115) verdënnte Lächer bäigefüügt. D'Plat gouf dann iwwer Nuecht bei 4°C mat Detektiounsantikörper (1 μg/ml, Anti-Streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) inkubéiert. No dräi Wäschschrëtt gouf Streptavidin duerch Inkubatioun an enger TMB-Substratléisung (Roche) fir bis zu 20 Minutten nogewise. Nodeems d'Faarwentwécklung mat 1M H2SO4 gestoppt gouf, gëtt d'Absorptioun bei 450 nm gemooss.
D'Funktioun vum Streptavidin-Peptid-BACE1-Inhibitorkomplex gouf duerch Aβ(1-40)-ELISA no dem Protokoll vum Hiersteller (Wako, 294-64701) bewäert. Kuerz gesot, goufen CSF-Prouwen a Standardverdënnungsmëttel (1:23) verdënnt an iwwer Nuecht bei 4°C a 96-Well-Platten, déi mat BNT77-Capture-Antikörper beschichtet waren, inkubéiert. No fënnef Wäschschrëtt gouf den HRP-konjugéierten BA27-Antikörper bäigefüügt an 2 Stonnen bei 4°C inkubéiert, gefollegt vu fënnef Wäschschrëtt. Aβ(1–40) gouf duerch Inkubatioun an TMB-Léisung fir 30 Minutten bei Raumtemperatur detektéiert. Nodeems d'Faarwentwécklung mat enger Stopléisung gestoppt gouf, gëtt d'Absorptioun bei 450 nm gemooss. Plasma-Prouwen goufen enger Festphasextraktioun virun der Aβ(1–40)-ELISA ënnerworf. Plasma gouf zu 0,2% DEA (Sigma) a 96-Well-Platten bäigefüügt an 30 Minutten bei Raumtemperatur inkubéiert. Nodeems d'SPE-Platten (Oasis, 186000679) hannereneen mat Waasser an 100% Methanol gewäsch goufen, goufen d'Plasmaproben op d'SPE-Platten bäigefüügt an all Flëssegkeet gouf ewechgeholl. D'Proben goufen gewäsch (als éischt mat 5% Methanol, dann mat 30% Methanol) an eluéiert mat 2% NH4OH/90% Methanol. Nodeems den Eluat 99 Minutte laang bei 55°C mat konstantem N2-Stroum gedréchent gouf, goufen d'Proben a Standardverdënnungsmëttel reduzéiert an Aβ(1–40) gouf wéi uewe beschriwwen gemooss.
Wéi een dësen Artikel zitéiert: Urich, E. et al. Cargo Delivery to the Brain using Transit Peptides identified in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Liwwerung vu makromolekulare Medikamenter an d'Gehir mat Hëllef vun enger gezielter Therapie. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., a Martinez-Martinez, P. Liwwerung vu Peptid- a Proteinmedikamenter iwwer d'Blutt-Hirn-Barrière. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM D'Blutt-Hirn-Barrière: e Flaschenhals an der Entwécklung vu Gehirmedikamenter. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, a Byrd, A. Perspektiven fir eng verbessert Medikamentenliwwerung an Zilsetzung an d'Gehir iwwer de Choroidplexus-CSF-Wee. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Moderniséierung vu Biopharmazeutika mat molekulare Trojanesche Päerd fir d'Gehirliwwerung. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-Rezeptor-vermittelten Peptidtransport iwwer d'Blutt-Hirn-Barrière. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Erhéijung vun der Gehirpenetratioun an der Effizienz vun therapeuteschen Antikörper mat Hëllef vu monovalente molekulare Shuttlen. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Den Transferrinrezeptor (TfR)-Transport bestëmmt d'Opnam vun Affinitéitsvarianten vun TfR-Antikörper am Gehir. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).