Verschidden Themen zur Fehlerbehebung vu LC-Systemer sinn ni veraltet, well et Problemer an der LC-Praxis gëtt, och wann d'Instrumententechnologie sech mat der Zäit verbessert. Et gëtt vill Méiglechkeeten, wéi Problemer an engem LC-System entstoe kënnen an an engem schlechten Peak-Form landen. Wann Problemer am Zesummenhang mat der Peak-Form optrieden, hëlleft eng kuerz Lëscht vu méigleche Grënn fir dës Resultater eis Fehlerbehebungserfahrung ze vereinfachen.
Et huet Spaass gemaach, dës Kolumn "LC Troubleshooting" ze schreiwen an all Mount iwwer Themen nozedenken, well verschidde Themen ni aus der Moud ginn. Wärend am Beräich vun der Chromatographiefuerschung verschidden Themen oder Iddien obsolet ginn, well se duerch méi nei a besser Iddien ersat ginn, am Beräich vun der Troubleshooting, zënter datt den éischten Artikel iwwer Troubleshooting an dëser Zäitschrëft (dem deemolegen LC Journal) erschéngt ass (well verschidde Themen nach ëmmer relevant sinn) am Joer 1983 (1). An de leschte Joren hunn ech mech a verschiddene LC Troubleshooting Sektiounen op aktuell Trends konzentréiert, déi d'Flëssegkeetschromatographie (LC) beaflossen (zum Beispill de relative Verglach vun eisem Verständnis vum Effekt vum Drock op d'Retention [2] Nei Fortschrëtter) Eis Interpretatioun vun LC Resultater a wéi een mat modernen LC Instrumenter Troubleshooting léist. An der Installatioun vun dësem Mount setzen ech meng Serie (3) weider, déi am Dezember 2021 ugefaangen huet, déi sech op e puer vun den "Liewen an Doud" Themen vun der LC Troubleshooting konzentréiert huet - Elementer, déi fir all Troubleshooter super sinn, si wesentlech, egal wéi al de System ass, deen mir benotzen. Den Haaptthema vun dëser Serie ass héich relevant fir de berühmte Wanddiagramm "LC Troubleshooting Guide" vum LCGC (4), deen an ... hänkt. vill Laboratoiren. Fir den drëtten Deel vun dëser Serie hunn ech mech op Themen am Zesummenhang mat der Peakform oder de Peakcharakteristike konzentréiert. Onglaublecherweis lëscht d'Wandtabell 44 verschidde potenziell Ursaache fir eng schlecht Peakform op! Mir kënnen net all dës Problemer am Detail an engem Artikel behandelen, dofir konzentréiere ech mech an dëser éischter Installatioun zum Thema op e puer vun deenen, déi ech am heefegsten gesinn. Ech hoffen, datt jonk an al LC-Benotzer e puer hëllefräich Tipps an Erënnerungen zu dësem wichtegen Thema fannen.
Ech beäntweren Froen zur Fehlerbehebung ëmmer méi dacks mat "alles ass méiglech". Dës Äntwert schéngt vläicht einfach ze sinn, wann een Observatioune berécksiichtegt, déi schwéier z'interpretéieren sinn, awer ech fannen se dacks passend. Mat ville méigleche Grënn fir eng schlecht Peakform ass et wichteg, oppe fir ze bleiwen, wann ee bedenkt, wat de Problem kéint sinn, a fir potenziell Ursaachen ze prioritéieren, fir eis Fehlerbehebungsbemühungen unzefänken, andeems mir eis op déi heefegst Méiglechkeeten konzentréieren, dëse Punkt ass ganz wichteg.
E Schlësselschrëtt an all Troubleshooting-Übung - awer ee vun deem ech mengen, datt en ënnerschätzt gëtt - ass ze erkennen, datt et e Problem gëtt, dat muss geléist ginn. Ze erkennen, datt et e Problem gëtt, bedeit dacks ze erkennen, datt dat, wat mam Tool geschitt, anescht ass wéi eis Erwaardungen, déi duerch Theorie, empirescht Wëssen an Erfahrung geformt sinn (5). Déi "Peakform", op déi hei higewisen gëtt, bezitt sech eigentlech net nëmmen op d'Form vum Peak (symmetresch, asymmetresch, glat, flauscheg, virkant, schwanz, etc.), mee och op d'Breet. Eis Erwaardungen un déi tatsächlech Peakform sinn einfach. Theorie (6) ënnerstëtzt gutt d'Erwaardung am Léierbuch, datt an de meeschte Fäll d'chromatographesch Peaks symmetresch solle sinn a sech der Form vun enger Gauss-Verdeelung entspriechen, wéi an der Figur 1a gewisen. Wat mir vu Peakbreeten erwaarden, ass e méi komplex Thema, an dat Thema wäerte mir an engem zukünftegen Artikel diskutéieren. Déi aner Peakformen an der Figur 1 weisen e puer vun den anere Méiglechkeeten, déi observéiert kënne ginn - mat anere Wierder, e puer vun de Weeër, wéi d'Saache falsch kéinte lafen. Am Rescht vun dëser Installatioun wäerte mir Zäit verbréngen, fir e puer spezifesch Beispiller vu Situatiounen ze diskutéieren, déi zu ... féiere kënnen. dës Formtypen.
Heiansdo ginn Peaken am Chromatogramm guer net observéiert, wou se erwaart ginn eluéiert ze ginn. Déi uewe genannte Wanddiagramm weist datt d'Feele vun engem Peak (ënner der Viraussetzung datt d'Prouf tatsächlech den Zilanalyt an enger Konzentratioun enthält, déi d'Detektoräntwert ausreechend maache soll fir en iwwer dem Rauschen ze gesinn) normalerweis mat engem Instrumentproblem oder falschen mobilen Phasenbedingungen zesummenhänkt (wann iwwerhaapt observéiert). Peaken, normalerweis ze "schwaach"). Eng kuerz Lëscht vu potenziellen Problemer a Léisungen an dëser Kategorie kann an der Tabell I fonnt ginn.
Wéi uewe scho gesot, ass d'Fro, wéi vill Peak-Verbreedung toleréiert soll ginn, ier een drop oppasst a probéiert, se ze behiewen, en komplex Thema, dat ech an engem zukünftegen Artikel diskutéiere wäert. Meng Erfahrung ass, datt eng bedeitend Peak-Verbreedung dacks vun enger bedeitender Ännerung vun der Peak-Form begleet gëtt, an datt Peak-Taling méi heefeg ass wéi Pre-Peak oder Splitting. Wéi och ëmmer, déi nominell symmetresch Peaks sinn och verbreet, wat duerch e puer verschidde Grënn verursaacht ka ginn:
All dës Problemer goufen a fréiere Ausgaben vun Troubleshooting LC am Detail diskutéiert, a Lieser, déi un dësen Themen interesséiert sinn, kënnen dës fréier Artikelen consultéieren fir Informatiounen iwwer d'Ursaachen an déi potenziell Léisunge fir dës Problemer ze kréien. Méi Detailer
Peak Tailing, Peak Fronting a Splitting kënnen all duerch chemesch oder physikalesch Phänomener verursaacht ginn, an d'Lëscht vun de potenziellen Léisunge fir dës Problemer variéiert staark, jee nodeem ob et sech ëm e chemescht oder physikalescht Problem handelt. Dacks kann een, andeems een déi verschidde Peaks an engem Chromatogramm vergläicht, wichteg Hiweiser fannen, wéi ee vun hinnen de Schëllegen ass. Wann all Peaks an engem Chromatogramm ähnlech Formen hunn, ass d'Ursaach héchstwahrscheinlech net physikalesch. Wann nëmmen een oder e puer Peaks betraff sinn, awer de Rescht gutt ausgesäit, ass d'Ursaach héchstwahrscheinlech chemesch.
Déi chemesch Ursaache vu Peak-Taling si ze komplex fir se hei kuerz ze diskutéieren. Den interesséierte Lieser gëtt op déi rezent Ausgab vun "LC Troubleshooting" fir eng méi detailléiert Diskussioun verwisen (10). Eng einfach Saach, déi een awer versiche kann, ass d'Mass vum injizéierten Analyt ze reduzéieren a kucken, ob d'Peakform sech verbessert. Wann dat de Fall ass, dann ass dat e gudden Hiwäis, datt de Problem eng "Mass-Iwwerbelaaschtung" ass. An dësem Fall muss d'Method op d'Injektioun vu klenge Analytmassen limitéiert sinn, oder d'chromatographesch Konditioune mussen geännert ginn, sou datt gutt Peakformen och mat gréissere Massen, déi injizéiert ginn, kritt kënne ginn.
Et gëtt och vill potenziell physikalesch Grënn fir Peak Tailing. Lieser, déi un enger detailléierter Diskussioun iwwer d'Méiglechkeeten interesséiert sinn, ginn op eng aner rezent Ausgab vun "LC Troubleshooting" (11) verwisen. Eng vun den heefegsten physikaleschen Ursaache fir Peak Tailing ass eng schlecht Verbindung op engem Punkt tëscht dem Injektor an dem Detektor (12). En extremt Beispill ass an der Figur 1d gewisen, déi virun e puer Wochen a mengem Laboratoire opgeholl gouf. An dësem Fall hu mir e System mat engem neien Injektiounsventil gebaut, deen mir nach net benotzt haten, an eng Injektiounsschleef mat klengem Volumen mat enger Ferrule installéiert, déi op eng Kapillär aus Edelstol gegoss war. No e puer initialen Experimenter fir d'Feelerléisung hu mir gemierkt, datt d'Déift vum Port am Stator vum Injektiounsventil vill méi déif war wéi mir gewinnt waren, wat zu engem groussen Doudevolumen um Buedem vum Port gefouert huet. Dëst Problem ass einfach ze léisen andeems d'Injektiounsschleef duerch en anert Rouer ersat gëtt, mir kënnen d'Ferrule an déi richteg Positioun upassen fir den Doudevolumen um Buedem vum Port ze eliminéieren.
Peakfronten, wéi déi an der Figur 1e gewisen, kënnen och duerch physikalesch oder chemesch Problemer verursaacht ginn. Eng heefeg physikalesch Ursaach vum Leading Edge ass, datt d'Partikelbett vun der Kolonn net gutt gepackt ass, oder datt d'Partikelen sech mat der Zäit nei organiséiert hunn. Wéi bei Peak Tailing, deen duerch dëst physikalescht Phänomen verursaacht gëtt, ass de beschte Wee fir dëst ze léisen, d'Kolonn z'ersetzen a weiderzemaachen. Grondsätzlech entstinn d'Formen vun de Leading Edge Peaks mat chemeschen Urspronk dacks aus deem, wat mir "net-linear" Retentiounsbedéngungen nennen. Ënner idealen (linearen) Bedéngungen ass d'Quantitéit vum Analyt, déi vun der stationärer Phas zréckgehale gëtt (dofir de Retentiounsfaktor), linear mat der Konzentratioun vum Analyt an der Kolonn verbonnen. Chromatographesch bedeit dat, datt wann d'Mass vum Analyt, deen an d'Kolonn injizéiert gëtt, eropgeet, de Peak méi héich gëtt, awer net méi breet. Dës Bezéiung gëtt gebrach, wann d'Retentiounsverhalen net-linear ass, an d'Peaks ginn net nëmme méi héich, mä och méi breet, wann méi Mass injizéiert gëtt. Zousätzlech bestëmmen net-linear Formen d'Form vun de chromatographesche Peaks, wat zu Leading- oder Trailing-Kante féiert. Wéi bei Masseiwwerlaaschtung, déi Peak Tailing verursaacht (10), gëtt Peak Leading verursaacht duerch netlinear Retentioun kann och diagnostizéiert ginn andeems d'injizéiert Analytmass reduzéiert gëtt. Wann d'Peakform sech verbessert, muss d'Method modifizéiert ginn, fir d'Injektiounsqualitéit, déi de Virrand verursaacht, net ze iwwerschreiden, oder d'chromatographesch Konditioune mussen geännert ginn, fir dëst Verhalen ze minimiséieren.
Heiansdo observéiere mir eppes wat wéi e "gespléckte" Peak schéngt, wéi an der Figur 1f gewisen. Den éischte Schrëtt fir dëst Problem ze léisen ass ze bestëmmen ob d'Peakform op partiell Koelutioun zréckzeféieren ass (dh d'Präsenz vun zwou verschiddenen, awer no beieneen eluéierende Verbindungen). Wann et tatsächlech zwou verschidden Analyten gëtt, déi no beieneen eluéieren, dann ass et eng Fro vun der Verbesserung vun hirer Opléisung (zum Beispill andeems d'Selektivitéit, d'Retentioun oder d'Plattenzuel erhéicht ginn), an déi scheinbar "gespléckte" Peaks hänke mat der kierperlecher Leeschtung zesummen. D'Leeschtung huet näischt mat der Kolonn selwer ze dinn. Dacks ass de wichtegsten Hiwäis op dës Entscheedung ob all Peaks am Chromatogramm gespléckt Formen weisen, oder nëmmen eng oder zwou. Wann et nëmmen eng oder zwou sinn, ass et wahrscheinlech e Problem mat der Koelutioun; wann all Peaks gespléckt sinn, ass et wahrscheinlech e physikalescht Problem, dat héchstwahrscheinlech mat der Kolonn selwer zesummenhänkt.
Split Peaks, déi mat de physikalesche Eegeschafte vun der Kolonn selwer zesummenhänken, sinn normalerweis op deelweis blockéiert Entrée- oder Auslaaffritten oder op eng Reorganisatioun vun de Partikelen an der Kolonn zeréckzeféieren, wouduerch déi mobil Phas a bestëmmte Beräicher vun der Kolonnkanalbildung an anere Regiounen méi séier fléisst wéi déi mobil Phas (11). Deelweis verstoppte Fritten kënnen heiansdo duerch d'Ëmdréie vum Floss duerch d'Kolonn behuewe ginn; awer menger Erfahrung no ass dat normalerweis eng kuerzfristeg anstatt eng laangfristeg Léisung. Dëst ass bei modernen Kolonnen dacks fatal, wann d'Partikelen sech an der Kolonn nei verbannen. Zu dësem Zäitpunkt ass et am beschten, d'Kolonn z'ersetzen a weiderzemaachen.
De Peak an der Figur 1g, och aus engem rezenten Beispill a mengem eegenen Laboratoire, weist normalerweis drop hin, datt d'Signal sou héich ass, datt et den héijen Enn vum Äntwertberäich erreecht huet. Fir optesch Absorbanzdetektoren (an dësem Fall UV-Vis), wann d'Analytkonzentratioun ganz héich ass, absorbéiert den Analyt de gréissten Deel vum Liicht, dat duerch d'Flosszell vum Detektor geet, sou datt ganz wéineg Liicht detektéiert ka ginn. Ënner dëse Konditioune gëtt den elektresche Signal vum Photodetektor staark vun ënnerschiddleche Rauschquellen beaflosst, wéi Stréiliicht an "Donkelstroum", wouduerch d'Signal ganz "onkloer" ausgesäit an onofhängeg vun der Analytkonzentratioun ass. Wann dëst geschitt, kann de Problem dacks einfach geléist ginn, andeems d'Injektiounsvolumen vum Analyt reduzéiert gëtt - d'Injektiounsvolumen reduzéiert gëtt, d'Prouf verdënnt gëtt oder béides.
An der Chromatographieschoul benotze mir den Detektorsignal (dh d'y-Achs am Chromatogramm) als Indikator fir d'Analytkonzentratioun an der Prouf. Dofir schéngt et komesch, e Chromatogramm mat engem Signal ënner Null ze gesinn, well déi einfach Interpretatioun ass, datt dëst eng negativ Analytkonzentratioun weist - wat natierlech net physikalesch méiglech ass. No menger Erfahrung ginn negativ Peaks am heefegsten observéiert wann optesch Absorbanzdetektoren (z.B. UV-Vis) benotzt ginn.
An dësem Fall bedeit en negativen Héichpunkt einfach, datt d'Moleküle, déi aus der Kolonn eluéieren, manner Liicht absorbéieren wéi déi mobil Phas selwer direkt virun an nom Héichpunkt. Dëst kann zum Beispill optrieden, wann een relativ niddreg Detektiounswellelängten (<230 nm) an Zousätz fir mobil Phasen benotzt, déi de gréissten Deel vum Liicht bei dëse Wellelängten absorbéieren. Sou Zousätz kënne Léisungsmëttelkomponenten an der mobiler Phas wéi Methanol oder Pufferkomponenten wéi Acetat oder Format sinn. Negativ Héichpunkter kënnen tatsächlech benotzt ginn, fir eng Kalibratiounskurve ze preparéieren a korrekt quantitativ Informatiounen ze kréien, sou datt et kee fundamentale Grond gëtt, se per se ze vermeiden (dës Method gëtt heiansdo als "indirekt UV-Detektioun" bezeechent) (13). Wann mir awer negativ Héichpunkter ganz wëllen vermeiden, ass déi bescht Léisung am Fall vun der Absorbanzdetektioun, eng aner Detektiounswellelängt ze benotzen, sou datt den Analyt méi absorbéiert wéi déi mobil Phas, oder d'Zesummesetzung vun der mobiler Phas z'änneren, sou datt se manner Liicht absorbéieren wéi Analyten.
Negativ Peaks kënnen och optrieden, wann d'Detektioun vu Breechungsindex (RI) benotzt gëtt, wann de Breechungsindex vun anere Komponenten wéi den Analyt an der Prouf, wéi zum Beispill d'Léisungsmëttelmatrix, sech vum Breechungsindex vun der mobiler Phas ënnerscheet. Dëst geschitt och bei der UV-Vis-Detektioun, awer dësen Effekt tendéiert am Verglach mat der RI-Detektioun ofgeschwächt ze ginn. An zwou Fäll kënnen negativ Peaks miniméiert ginn, andeems d'Zesummesetzung vun der Proufmatrix méi genee mat där vun der mobiler Phas ugepasst gëtt.
Am drëtten Deel iwwer dat grondleeënd Thema vun der LC-Troubleshooting hunn ech Situatiounen diskutéiert, an deenen déi observéiert Peakform sech vun der erwaarter oder normaler Peakform ënnerscheet. Effektiv Troubleshooting vun esou Problemer fänkt mat der Kenntnis vun den erwaarten Peakformen un (baséiert op Theorie oder fréierer Erfahrung mat existente Methoden), sou datt Ofwäichunge vun dësen Erwaardungen offensichtlech sinn. Peakformproblemer hunn vill verschidde potenziell Ursaachen (ze breet, Tailling, Leading Edge, etc.). An dëser Installatioun diskutéieren ech am Detail e puer vun de Grënn, déi ech am heefegsten gesinn. Dës Detailer ze kennen ass e gudde Startpunkt fir d'Troubleshooting ze bekämpfen, awer et erfëllt net all Méiglechkeeten. Lieser, déi un enger méi detailléierter Lëscht vun Ursaachen a Léisunge interesséiert sinn, kënnen d'LCGC "LC Troubleshooting Guide" Wandtabell consultéieren.
(4) Wanddiagramm vum LCGC "LC Troubleshooting Guide". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Datenanalyse a Signalveraarbechtung an der Chromatographie (Elsevier, New York, NY, 1998), S. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF an Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.