Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript maachen.
Liquid Biopsie (LB) ass e Konzept dat séier Popularitéit am biomedizinesche Beräich gewënnt.D'Konzept baséiert haaptsächlech op der Detektioun vu Fragmenter vun zirkuléierender extrazellulärer DNA (ccfDNA), déi haaptsächlech als kleng Fragmenter nom Zell Doud a verschiddene Stoffer fräigelooss ginn.E klengen Deel vun dëse Fragmenter staamt aus auslännesche (auslännesche) Stoffer oder Organismen.An der aktueller Aarbecht hu mir dëst Konzept op Muschelen applizéiert, eng Sentinelart bekannt fir hir héich Mierwaasserfiltratiounskapazitéit.Mir benotzen d'Fäegkeet vu Muschelen als natierlech Filteren ze handelen fir Ëmwelt-DNA Fragmenter aus enger Rei vu Quellen z'erfaassen fir Informatiounen iwwer d'Biodiversitéit vun de Marine Küstekosystemer ze liwweren.Eis Resultater weisen datt Muschelhemolymph DNA Fragmenter enthält déi vill an der Gréisst variéieren, vun 1 bis 5 kb.Shotgun Sequenzéierung huet gewisen datt eng grouss Zuel vun DNA Fragmenter aus auslännesche mikrobiellen Hierkonft sinn.Dorënner hu mir DNA Fragmenter vu Bakterien, Archaea a Virussen fonnt, dorënner Virussen, déi bekannt sinn fir eng Vielfalt vun Hosten ze infizéieren, déi allgemeng a Küstemarinekosystemer fonnt ginn.Als Conclusioun weist eis Studie datt d'Konzept vu LB op Muschelen applizéiert eng räich awer nach onerfuerscht Quell vu Wëssen iwwer mikrobieller Diversitéit an de Marine Küstekosystemer duerstellt.
Den Impakt vum Klimawandel (CC) op d'Biodiversitéit vu Marine Ökosystemer ass e séier wuessend Fuerschungsberäich.Global Erwiermung verursaacht net nëmme wichteg physiologesch Belaaschtungen, mee dréckt och d'evolutiounsgrenze vun der thermescher Stabilitéit vun de Marine Organismen, beaflosst de Liewensraum vun enger Rei vun Arten, wat se freet fir méi gënschteg Konditiounen ze sichen [1, 2].Zousätzlech fir d'Biodiversitéit vu Metazoanen ze beaflossen, stéiert CC de delikate Gläichgewiicht vun Host-mikrobiellen Interaktiounen.Dëst microbial dysbacteriosis stellt eng sérieux Gefor fir Marine Ökosystemer wéi et Marine Organismen méi ufälleg fir ustiechend pathogens mécht [3, 4].Et gëtt ugeholl datt SS eng wichteg Roll bei Massendout spillt, wat e seriöse Problem fir d'Gestioun vun de globale Marine Ökosystemer ass [5, 6].Dëst ass e wichtegt Thema wéinst de wirtschaftlechen, ökologeschen an Ernährungsauswierkunge vu ville Marine Arten.Dëst ass besonnesch wouer fir Bivalves, déi an de polare Regiounen liewen, wou d'Auswierkunge vum CK méi direkt a schwéier sinn [6, 7].Tatsächlech sinn Bivalve wéi Mytilus spp.gi wäit benotzt fir d'Effekter vum CC op Marine Ökosystemer ze iwwerwaachen.Net iwwerraschend, sinn eng relativ grouss Zuel vu Biomarker entwéckelt fir hir Gesondheet ze iwwerwaachen, dacks mat enger zweestäckeg Approche mat funktionnelle Biomarker baséiert op enzymatesch Aktivitéit oder bewosst Funktiounen wéi Zell-Viabilitéit an phagocytesch Aktivitéit [8].Dës Methoden enthalen och d'Messung vun der Konzentratioun vu spezifesche Drockindikatoren, déi a mëlle Stoffer accumuléieren no der Absorptioun vu grousse Quantitéite Mierwaasser.Wéi och ëmmer, déi héich Filtratiounskapazitéit an semi-oppene Zirkulatiounssystem vu Bivalves bidden eng Geleeënheet fir nei Hämolymph-Biomarker z'entwéckelen andeems d'Konzept vu flësseger Biopsie (LB) benotzt gëtt, eng einfach a minimal invasiv Approche fir d'Patientemanagement.Bluttproben [9, 10].Och wa verschidden Aarte vu zirkuléierende Moleküle am mënschleche LB fonnt kënne ginn, baséiert dëst Konzept haaptsächlech op DNA Sequenzéierungsanalyse vun zirkuléierend extrazellulären DNA (ccfDNA) Fragmenter am Plasma.Tatsächlech ass d'Präsenz vun zirkuléierender DNA am mënschleche Plasma zanter der Mëtt vum 20. Joerhonnert bekannt [11], awer et ass nëmmen an de leschte Joeren datt d'Entstoe vu High-Throughput-Sequencing-Methoden zu enger klinescher Diagnostik baséiert op ccfDNA gefouert huet.D'Präsenz vun dësen zirkuléierende DNA Fragmenter ass deelweis wéinst der passiver Verëffentlechung vu genomesch DNA (nuklear a Mitochondrial) nom Zell Doud. Bei gesonden Individuen ass d'Konzentratioun vu ccfDNA normalerweis niddereg (<10 ng / ml), awer kann ëm 5-10 Mol eropgesat ginn bei Patienten, déi vu verschiddene Pathologien leiden oder ënner Stress ausgesat sinn, wat zu Tissueschued resultéiert. Bei gesonden Individuen ass d'Konzentratioun vu ccfDNA normalerweis niddereg (<10 ng / ml), awer kann ëm 5-10 Mol eropgesat ginn bei Patienten, déi vu verschiddene Pathologien leiden oder ënner Stress ausgesat sinn, wat zu Tissueschued resultéiert. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), но может повышаться в 5–10 мл. логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Bei gesonde Leit ass d'Konzentratioun vu cccDNA normalerweis niddereg (<10 ng / ml), awer et kann ëm 5-10 Mol eropgoen bei Patienten mat verschiddene Pathologien oder ënner Stress, déi zu Tissueschued féiert.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各姍病理戅手壏加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 承 刂可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 маличение логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA Konzentratioune sinn normalerweis niddereg (<10 ng/ml) bei gesonden Individuen, awer kënne 5-10-fach erhéicht ginn bei Patienten mat verschiddene Pathologien oder Stress, wat zu Tissueschued resultéiert.D'Gréisst vun de ccfDNA Fragmenter variéiert wäit, awer reegelméisseg tëscht 150 an 200 bp.[12] an.Analyse vun Self-ofgeleet ccfDNA, dh ccfDNA aus normal oder transforméiert Gaascht Zellen, kann benotzt ginn genetesch an epigenetic Ännerungen presentéieren am nuklear an /oder mitochondrial Genom z'entdecken, domat hëllefen Kliniker spezifesch molekulare geziilt Therapien wielen [13].Wéi och ëmmer, ccfDNA kann aus auslännesche Quelle wéi ccfDNA aus Fetalzellen während der Schwangerschaft oder aus transplantéierten Organer kritt ginn [14,15,16,17].ccfDNA ass och eng wichteg Informatiounsquell fir d'Präsenz vun Nukleinsäuren vun engem ustiechend Agent (auslännesch) z'entdecken, déi net-invasiv Detektioun vu verbreeten Aids net duerch Bluttkulturen identifizéiert erlaabt, invasiv Biopsie vu infizéierte Tissue vermeit [18].Rezent Studien hu jo gewisen datt mënschlecht Blutt eng räich Informatiounsquell enthält déi benotzt ka ginn fir viral a bakteriell Pathogenen z'identifizéieren, an datt ongeféier 1% vun der ccfDNA am mënschleche Plasma fonnt ass aus auslänneschen Hierkonft [19].Dës Studie weisen datt d'Biodiversitéit vun engem zirkuléierende Mikrobiom vun engem Organismus ka mat ccfDNA Analyse bewäert ginn.Wéi och ëmmer, bis viru kuerzem gouf dëst Konzept exklusiv bei Mënschen benotzt an, a mannerem Mooss, an anere Wirbeldéieren [20, 21].
Am haitege Pabeier benotze mir d'LB Potenzial fir d'ccfDNA vun Aulacomya atra ze analyséieren, eng südlech Spezies déi allgemeng an de subantarkteschen Kerguelen Inselen fonnt gëtt, eng Grupp vun Inselen op engem grousse Plateau, dee sech virun 35 Millioune Joer geformt huet.Vulkanausbroch.Mat engem in vitro experimentelle System hu mir festgestallt datt DNA Fragmenter am Mierwaasser séier vu Muschelen opgeholl ginn an an d'Hämolymph-Kompartiment kommen.Shotgun Sequencing huet gewisen datt Muschelhemolymph ccfDNA DNA Fragmenter vu senger eegener an net-selwer Hierkonft enthält, dorënner symbiotesch Bakterien an DNA Fragmenter aus Biome typesch fir kal vulkanesch Marine Küstekosystemer.Hemolymph ccfDNA enthält och viral Sequenzen ofgeleet vu Viren mat verschiddene Hostberäicher.Mir hunn och DNA Fragmenter vu multicellulären Déieren fonnt wéi knacheg Fësch, Mieranemonen, Algen an Insekten.Als Conclusioun beweist eis Etude datt d'LB Konzept erfollegräich op Marine Invertebrate applizéiert ka ginn fir e räiche genomesche Repertoire a Marine Ökosystemer ze generéieren.
Erwuessener (55-70 mm laang) Mytilus platensis (M. platensis) an Aulacomya atra (A. atra) goufen aus der intertidal Rocky Uferen vun Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E gesammelt).Kerguelen Inselen am Dezember 2018. Aner erwuessener blo Muschelen (Mytilus spp.) goufen aus engem kommerziellen Fournisseur kritt (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) an an engem Temperatur kontrolléiert haten (4 ° C) aerated Tank mat 10-20 L vun 32‰ kënschtlech Salzlake.(kënschtlech Mier Salz Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Fir all Experiment goufen d'Längt a Gewiicht vun eenzelne Muschelen gemooss.
E gratis Open Access Protokoll fir dëse Programm ass online verfügbar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kuerz, war LB hemolymph aus abductor Muskelen gesammelt wéi beschriwwen [22].D'hemolymph war vun centrifugation bei 1200 × g fir 3 Minutten gekläert, der supernatant war gefruer (-20 ° C) bis benotzen.Fir Isolatioun an Offäll vun cfDNA, Echantillon (1,5-2,0 ml) goufen thawed a veraarbecht mat der NucleoSnap cfDNA Kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) no den Hiersteller d'Instruktioune.ccfDNA war bei -80 ° C bis weider Analyse gespäichert.An e puer Experimenter gouf ccfDNA isoléiert a gereinegt mat dem QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Purifizéiert DNA gouf mat engem Standard PicoGreen Assay quantifizéiert.D'Fragmentverdeelung vun der isoléierter ccfDNA gouf duerch Kapillär Elektrophorese mat engem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) mat engem High Sensitivity DNA Kit analyséiert.D'assay war mat 1 μl vun der ccfDNA Prouf gesuergt no den Hiersteller d'Instruktioune.
Fir d'Sequenzéierung vun Hämolymph ccfDNA Fragmenter, huet de Génome Québec (Montreal, Québec, Kanada) Gewierbibliothéike virbereet mat dem Illumina DNA Mix Kit vum Illumina MiSeq PE75 Kit.E Standardadapter (BioO) gouf benotzt.Raw Datedateie si verfügbar vum NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 an SRR8924809).Basis Liesqualitéit gouf mat FastQC bewäert [23].Trimmomatic [24] gouf fir Clipadapteren a schlecht Qualitéitsliesen benotzt.Shotgun Liesungen mat gepaarten Enden goufen FLASH fusionéiert a méi laang eenzel Liesungen mat engem Minimum Iwwerlappung vun 20 bp fir Mëssverständis ze vermeiden [25]. Fusiounsliesen goufen mat BLASTN mat enger bivalve NCBI Taxonomie Datebank (e Wäert <1e-3 an 90% Homologie) annotéiert, a Maske vu niddereg-Komplexitéit Sequenzen gouf mat DUST gesuergt [26]. Fusiounsliesen goufen mat BLASTN mat enger bivalve NCBI Taxonomie Datebank (e Wäert <1e-3 an 90% Homologie) annotéiert, a Maske vu niddereg-Komplexitéit Sequenzen gouf mat DUST gesuergt [26]. (Obъединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуствический 1e-3 an 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. Pooled Liesungen goufen mat BLASTN mat der NCBI bivalve Taxonomie Datebank (e Wäert <1e-3 an 90% Homologie) annotéiert, an d'niddereg Komplexitéit Sequenzmaskéierung gouf mat DUST gesuergt [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿娔，DUST 2.低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 輿濹 2行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данныхна двуNC е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использов [26]. Pooled Liesungen goufen mat BLASTN mat der NCBI bivalve taxonomescher Datebank (e Wäert <1e-3 an 90% Homologie) annotéiert, an d'niddereg Komplexitéit Sequenzmaskéierung gouf mat DUST gesuergt [26].Liesungen goufen an zwou Gruppen opgedeelt: Zesummenhang mat bivalve Sequenzen (hei Selbstliesen genannt) an net verwandt (net Selbstliesen).Zwou Gruppe sech getrennt versammelt MEGAHIT benotzt contigs ze generéieren [27].Mëttlerweil gouf d'Taxonomesch Verdeelung vun alien Mikrobiome Liesungen mat Kraken2 klasséiert [28] a grafesch duergestallt vun engem Krona Pie Chart op Galaxy [29, 30].Déi optimal kmers goufe kmers-59 aus eise virleefegen Experimenter bestëmmt. Selwer Contigs goufen dunn duerch Ausrichtung mat BLASTN (bivalve NCBI Datebank, e Wäert <1e-10 a 60% Homologie) fir eng final Annotatioun identifizéiert. Selwer Contigs goufen dunn duerch Ausrichtung mat BLASTN (bivalve NCBI Datebank, e Wäert <1e-10 a 60% Homologie) fir eng final Annotatioun identifizéiert. Затем собственные контиги идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчентицированы путем сопоставления с BLASTN) и гомология 60%) для окончательной аннотации. Self-contigs sech dann duerch passende géint BLASTN (NCBI bivalve Datebank, e Wäert <1e-10 an 60% homology) fir Finale Annotatioun identifizéiert.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги fir окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BiNC fir BLASTN) х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Self-contigs sech dann fir Finale Annotatioun identifizéiert vun passende géint BLASTN (NCBI bivalve Datebank, e Wäert <1e-10 an 60% homology). Parallel goufen nonself Grupp contigs mat BLASTN (nt NCBI Datebank, e Wäert <1e-10 an 60% Homologie) annotéiert. Parallel goufen nonself Grupp contigs mat BLASTN (nt NCBI Datebank, e Wäert <1e-10 an 60% Homologie) annotéiert. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (Basa данных nt NCBI, мечение-10%). Parallel goufen auslännesch Grupp contigs mat BLASTN (NT NCBI Datebank, e Wäert <1e-10 an 60% homology) annotéiert.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (ab 1, 10 даннче an 60%. Parallel, Net-Selbstgrupp contigs sech mat BLASTN (nt NCBI Datebank, e Wäert <1e-10 an 60% homology) annotéiert. BLASTX war och op nonself contigs gehaal mat der nr an RefSeq Protein NCBI Datenbanken (e Wäert <1e-10 an 60% Homologie). BLASTX war och op nonself contigs gehaal mat der nr an RefSeq Protein NCBI Datenbanken (e Wäert <1e-10 an 60% Homologie). BLASTX ass berechent fir net-kontinuéierlech Konsequenze mat использованием mat enger Zuel vu RefSeq NCBI (zënter 6-1 Joer) %). BLASTX war och op Net-Selbstkontigs gesuergt mat der nr an RefSeq NCBI Protein Datenbanken (e Wäert <1e-10 a 60% Homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 吺 Blastx Такжже выполняли Намоесамостостхыхе huet e <1 vun den Uдогииииииииии cо ). BLASTX war och op Net-Selbstkontigs gesuergt mat der nr an RefSeq NCBI Protein Datenbanken (e Wäert <1e-10 a 60% Homologie).D'BLASTN- a BLASTX-Pools vun net-Selbstkontigen representéieren déi lescht Contigs (kuckt Zousazdatei).
D'primers fir PCR benotzt ginn an Table S1 opgezielt.Taq DNA polymerase (Bio Grondleegend Kanada, Markham, ON) war benotzt der ccfDNA Zil- Genen ze amplify.Déi folgend Reaktiounsbedéngungen goufen benotzt: Denaturatioun bei 95 ° C fir 3 Minutten, 95 ° C fir 1 Minutt, festgeluegt Glühtemperatur fir 1 Minutt, Verlängerung bei 72 ° C fir 1 Minutt, 35 Zyklen, a schliisslech 72 ° C bannent 10 Minutten..PCR Produkter goufen duerch Elektrophorese an Agarosegelen (1,5%) getrennt mat SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) bei 95 V.
Muschelen (Mytilus spp.) goufen a 500 ml oxygenéiert Mierwaasser (32 PSU) fir 24 Stonnen bei 4 ° C acclimatiséiert.Plasmid DNA mat engem Insert deen de mënschleche Galectin-7 cDNA Sequenz (NCBI Bäitrëttsnummer L07769) codéiert, gouf an d'Flasche mat enger final Konzentratioun vun 190 μg /μl bäigefüügt.Muschelen, déi ënner de selwechte Bedéngungen ouni DNA Zousatz inkubéiert goufen, waren d'Kontroll.Den drëtte Kontrolltank hat DNA ouni Muschelen.Fir d'Qualitéit vun der DNA am Mierwaasser ze iwwerwaachen, goufen Mierwaasserproben (20 μl; dräi Wiederholungen) aus all Tank op der uginner Zäit geholl.Fir Plasmid DNA Traceabilitéit, goufen LB Muschelen um uginn Zäiten gesammelt an duerch qPCR an ddPCR analyséiert.Wéinst dem héije Salzgehalt vu Mierwaasser goufen Aliquoten an PCR Qualitéitswasser verdünnt (1:10) virun all PCR Assays.
Digital Droplet PCR (ddPCR) gouf mat dem BioRad QX200 Protokoll (Mississauga, Ontario, Kanada) gesuergt.Benotzt den Temperaturprofil fir déi optimal Temperatur ze bestëmmen (Table S1).Drops goufen mat engem QX200 Drop Generator (BioRad) generéiert.ddPCR war wéi follegt duerchgefouert: 95 ° C fir 5 min, 50 Zykle vun 95 ° C fir 30 s an eng gegebene annealing Temperatur fir 1 min an 72 ° C fir 30 s, 4 ° C fir 5 min an 90 ° C bannent 5 Minutten.D'Zuel vun den Drëpsen a positiven Reaktiounen (Zuel vun de Kopien / µl) goufe mat engem QX200 Drop Reader (BioRad) gemooss.Echantillon mat manner wéi 10.000 Tropfen goufen ofgeleent.Muster Kontroll war net all Kéier ddPCR gesuergt.
qPCR war mat Rotor-Gene® 3000 (Corbett Fuerschung, Sydney, Australien) an LGALS7 spezifesch primers gesuergt.All quantitative PCRs goufen an 20 μl mat der QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) gesuergt.qPCR gouf mat enger 15 min Inkubatioun bei 95 ° C gestart, gefollegt vun 40 Zyklen bei 95 ° C fir 10 Sekonnen a bei 60 ° C fir 60 Sekonnen mat enger Datensammlung.Schmelzkurven goufen mat successive Miessunge bei 95 ° C fir 5 s, 65 ° C fir 60 s, an 97 ° C um Enn vum qPCR generéiert.All qPCR war an triplicate gesuergt, ausser Kontroll Echantillon.
Well Muschelen fir hir héich Filtratiounsquote bekannt sinn, hu mir als éischt ënnersicht ob se DNA Fragmenter, déi am Mierwaasser präsent sinn, filteren an behalen.Mir waren och interesséiert ob dës Fragmenter an hirem semi-oppenen Lymphsystem accumuléieren.Mir hunn dëst Thema experimentell geléist andeems mir d'Schicksal vun löslechen DNA Fragmenter op blo Muschelbehälter bäigefüügt hunn.Fir d'Verfolgung vun DNA Fragmenter ze erliichteren, hu mir auslännesch (net Selbst) Plasmid DNA benotzt mat dem mënschleche Galectin-7 Gen.ddPCR Spuer Plasmid DNA Fragmenter am Mierwaasser a Muschelen.Eis Resultater weisen datt wann d'Quantitéit vun DNA Fragmenter am Mier Waasser relativ konstant iwwer Zäit bliwwen (bis zu 7 Deeg) an der Verontreiung vu Muschelen, dann an der Präsenz vun Muschelen dësem Niveau bal komplett verschwonnen bannent 8 Stonnen (Fig. 1a, b).Fragmenter vun exogenous DNA sech liicht bannent 15 min an intravalvular Flesseggassystem an hemolymph fonnt (Lalumi 1c).Dës Fragmenter konnten nach bis zu 4 Stonnen no der Beliichtung festgestallt ginn.Dës Filteraktivitéit mat Respekt fir DNA Fragmenter ass vergläichbar mat der Filteraktivitéit vu Bakterien an Algen [31].Dës Resultater suggeréieren datt Muschelen auslännesch DNA an hire Flëssegkeetskompartimenter filteren an accumuléieren.
Relativ Konzentratioune vu Plasmid DNA am Mierwaasser an der Präsenz (A) oder der Verontreiung (B) vu Muschelen, gemooss duerch ddPCR.An A ginn d'Resultater als Prozentsaz ausgedréckt, mat de Grenzen vun de Këschte representéiert de 75. an 25. Prozent.Déi ugepasst logarithmesch Curve gëtt a rout ugewisen, an d'Géigend grau stellt den 95% Vertrauensintervall duer.Am B representéiert déi rout Linn d'Moyenne an déi blo Linn stellt den 95% Vertrauensintervall fir d'Konzentratioun duer.C Akkumulation vu Plasmid DNA an der Hämolymph a Valvular Flëssegkeet vu Muschelen zu verschiddenen Zäiten no der Zousatz vun der Plasmid DNA.D'Resultater ginn als absolute Kopie festgestallt /ml (± SE) presentéiert.
Als nächst hu mir d'Origine vum ccfDNA a Muschelen ënnersicht, déi aus Muschelbetter op de Kerguelen Inselen gesammelt goufen, eng erweidert Grupp vun Inselen mat limitéierten anthropogenen Afloss.Fir dësen Zweck, war cccDNA aus Muschel hemolymphs isoléiert a gereinegt duerch Methoden allgemeng benotzt Mënsch cccDNA ze purifizéieren [32, 33].Mir hu festgestallt, datt duerchschnëttlech Hämolymph ccfDNA Konzentratioune bei Muschelen am nidderegen Mikrogramm pro ml Hämolymphberäich sinn (kuckt Table S2, Ergänzungsinformatioun).Dës Gamme vu Konzentratioune ass vill méi grouss wéi bei gesonde Leit (niddereg Nanogramm pro Milliliter), awer a rare Fäll, bei Kriibspatienten, kann den Niveau vun der ccfDNA e puer Mikrogramm pro Milliliter erreechen [34, 35].Eng Analyse vun der Gréisst Verdeelung vun hemolymph ccfDNA gewisen, datt dës Fragmenter vill an Gréisst variéieren, rangéiert vun 1000 BP bis 1000 BP.bis zu 5000 bp (Fig. 2).Ähnlech Resultater goufen mat der Silica-baséiert QIAamp Investigator Kit kritt, eng Method déi allgemeng an der forensescher Wëssenschaft benotzt gëtt fir séier genomesch DNA aus gerénger Konzentratioun DNA Proben ze isoléieren an ze purifizéieren, dorënner ccfDNA [36].
Vertrieder ccfDNA Elektrophoregramm vu Muschelhemolymph.Extraitéiert mat NucleoSnap Plasma Kit (uewen) a QIAamp DNA Investigator Kit.B Violin Komplott weist d'Verdeelung vun hemolymph ccfDNA Konzentratioune (± SE) an Muschelen.Déi schwaarz a rout Linnen representéieren de Median an den éischten an drëtte Quartil, respektiv.
Ongeféier 1% vun ccfDNA bei Mënschen an Primaten huet eng auslännesch Quell [21, 37].Kritt der semi-oppen circulatory System vun bivalves, microbial-räich Mierwaasser, an der Gréisst Verdeelung vun Muschel ccfDNA, mir hypothetiséiert, datt Muschel hemolymph ccfDNA e räichen a verschiddenste Pool vun microbial DNA enthalen kann.Fir dës Hypothese ze testen, hu mir Hämolymph ccfDNA aus Aulacomya atra Proben gesammelt vun de Kerguelen Inselen gesammelt, iwwer 10 Millioune Liesungen erginn, vun deenen 97,6% Qualitéitskontroll passéiert hunn.D'Liesunge goufen dann no Selbst- an Net-Selbstquellen klasséiert mat der BLASTN an NCBI bivalve Datenbanken (Figebam. S1, Ergänzungsinformatioun).
Bei Mënschen kënne souwuel nuklear wéi och mitochondrial DNA an de Bluttkrees fräigelooss ginn [38].Wéi och ëmmer, an der aktueller Etude war et net méiglech am Detail déi nuklear genomesch DNA vu Muschelen ze beschreiwen, well den A. atra Genom net sequentéiert oder beschriwwe gouf.Allerdéngs konnten mir eng Rei vun ccfDNA Fragmenter vun eisem eegenen Urspronk ze identifizéieren der bivalve Bibliothéik benotzt (Lalumi S2, Zousaz Informatiounen).Mir bestätegt och d'Präsenz vun DNA Fragmenter vun eiser eegener Hierkonft duerch riicht Hinnen alleguer amplification vun deenen A. atra Genen datt sequenced goufen (Lalumi 3).Ähnlech, well de mitochondriale Genom vun A. atra an ëffentlechen Datenbanken verfügbar ass, kann ee Beweiser fir d'Präsenz vu mitochondrialen ccfDNA Fragmenter an der Hämolymph vun A. atra fannen.D'Präsenz vun mitochondrial DNA Fragmenter war vun PCR amplification bestätegt (Lalumi 3).
Verschidde mitochondrial Genen waren präsent an der hemolymph vun A. atra (roude Punkten - Stock Zuel: SRX5705969) an M. platensis (blo Punkten - Stock Zuel: SRX5705968) vun PCR verstäerkt.Figur ugepasst aus Breton et al., 2011 B Amplification vun hemolymph supernatant vun A. atra op FTA Pabeier gespäichert.Benotzt en 3 mm Punch fir direkt an d'PCR-Röhre mat der PCR-Mëschung ze addéieren.
Wéinst dem reichleche mikrobiellen Inhalt am Mierwaasser hu mir ufanks op d'Charakteriséierung vu mikrobiellen DNA Sequenzen an Hämolymph konzentréiert.Fir dëst ze maachen, benotze mir zwou verschidde Strategien.Déi éischt Strategie huet Kraken2 benotzt, en Algorithmus-baséiert Sequenz Klassifikatiounsprogramm deen mikrobiell Sequenze mat enger Genauegkeet vergläichbar mat BLAST an aner Tools identifizéieren kann [28].Méi wéi 6719 Liesungen goufen als bakteriell Hierkonft ermëttelt, während 124 an 64 aus Archaea a Viren bzw. (Fig. 4).Déi meescht reichend bakteriell DNA Fragmenter waren Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), a Bacteroidetes (17%) (Lalumi 4a).Dës Verdeelung ass konsequent mat fréiere Studien vum Marineblo Muschelmikrobiom [39, 40].Gammaproteobacteria waren d'Haaptklass vun Proteobacteria (44%), dorënner vill Vibrionales (Figebam. 4b).D'ddPCR Method bestätegt d'Präsenz vun Vibrio DNA Fragmenter an der ccfDNA vun A. atra hemolymph (Lalumi 4c) [41].Fir méi Informatiounen iwwert d'bakteriell Urspronk vun ccfDNA ze kréien, war eng zousätzlech Approche geholl (Lalumi S2, Zousaz Informatiounen). An dësem Fall, liest, datt iwwerlappt goufen als gepaart-Enn liest versammelt a sech als vun Self (bivalves) oder nonself Origine mat BLASTN an engem e Wäert vun 1e-3 an engem cutoff mat> 90% Homologie klasséiert. An dësem Fall, liest, datt iwwerlappt goufen als gepaart-Enn liest versammelt a sech als vun Self (bivalves) oder nonself Origine mat BLASTN an engem e Wäert vun 1e-3 an engem cutoff mat> 90% Homologie klasséiert. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классивис ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения> с гого%. An dësem Fall goufen iwwerlappend Liesungen als gepaart-end Lies gesammelt a goufen als gebierteg (bivalve) oder Net-Original klasséiert mat BLASTN an e Wäert vun 1e-3 a Cutoff mat> 90% Homologie.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倧暒倢倢倢倢倢倢倢值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使缄 嚄 缄 用 的 用 的 用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфицович ые моллюски) oder несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN an 1e-3 a порога гомолог. An dësem Fall goufen iwwerlappend Liesungen als gepaart-end Lies gesammelt a klasséiert als eegen (bivalves) oder net-originell mat e BLASTN an 1e-3 Wäerter an eng Homologie-Schwell > 90%.Zënter dem A. atra Genom ass nach net sequenzéiert ginn, hu mir d'de novo Assemblée Strategie vum MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) Assembler benotzt.Insgesamt 147.188 Contigs goufen als ofhängeg (bivalves) vun Urspronk identifizéiert.Dës Contigs goufen duerno mat E-Wäerter vun 1e-10 mat BLASTN a BLASTX explodéiert.Dës Strategie erlaabt eis 482 Net-bivalve Fragmenter präsent an A. atra ccfDNA ze identifizéieren.Méi wéi d'Halschent (57%) vun dësen DNA Fragmenter goufen aus Bakterien kritt, haaptsächlech aus Gill symbionts, dorënner sulfotrophic symbionts, an aus Gill symbionts Solemya velum (Figebam. 5).
Relativ Heefegkeet um Typniveau.B Mikrobieller Diversitéit vun zwee Haaptphyla (Firmicutes a Proteobacteria).Representativ Amplifikatioun vun ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenter vum 16S rRNA Gen (blo) an dräi atra hemolymphs.
Am Ganzen 482 gesammelt Contigs goufen analyséiert.Allgemeng Profil vun der taxonomescher Verdeelung vu metagenomesche Contig Annotatiounen (Prokaryoten an Eukaryoten).B Detailléiert Verdeelung vun bakteriell DNA Fragmenter identifizéiert vun BLASTN an BLASTX.
Kraken2 Analyse huet och gewisen datt Muschel ccfDNA archaeal DNA Fragmenter enthält, dorënner DNA Fragmenter vun Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), an Thaurmarcheota (11%) (Lalumi 6a).D'Präsenz vun DNA Fragmenter ofgeleet vun Euryarchaeota an Crenarchaeota, virdrun an der microbial Communautéit vun Californian Muschelen fonnt, soll net als Iwwerraschung kommen [42].Och wann Euryarchaeota dacks mat extremen Konditiounen assoziéiert ass, ass et elo unerkannt datt souwuel Euryarchaeota wéi och Crearcheota ënnert de meeschte verbreet Prokaryoten am marinecryogene Ëmfeld sinn [43, 44].D'Präsenz vu methanogenen Mikroorganismen an de Muschelen ass net iwwerraschend, well rezent Berichter iwwer extensiv Methan-Lecke vun ënnen Lecke um Kerguelen Plateau [45] a méiglecher mikrobieller Methanproduktioun virun der Küst vun de Kerguelen Inselen observéiert goufen [46].
Eis Opmierksamkeet ass dunn op Liesungen vun DNA Virussen verréckelt.Sou bescht vun eisem Wëssen, ass dëst déi éischt off-Zil Etude vum Virus Inhalt vun Muschelen.Wéi erwaart, fonnt mir DNA Fragmenter vun bacteriophages (Caudovirales) (Lalumi 6b).Wéi och ëmmer, déi heefegst viral DNA kënnt aus engem Phylum vun Nukleozytoviren, och bekannt als den nuklearen zytoplasmesche groussen DNA Virus (NCLDV), deen de gréisste Genom vun all Virus huet.An dësem Phylum gehéieren déi meescht DNA Sequenzen zu de Familljen Mimimidoviridae (58%) a Poxviridae (21%), deenen hir natierlech Hosten Wirbeldéieren an Arthropoden enthalen, während e klengen Deel vun dësen DNA Sequenzen zu bekannte virologesche Algen gehéieren.Infizéiert marine eukaryotesche Algen.D'Sequenze goufen och vum Pandora Virus kritt, de riesegen Virus mat der gréisster Genomgréisst vun all bekannte virale Genera.Interessanterweis war d'Gamme vu Hosten bekannt fir mam Virus infizéiert ze sinn, wéi duerch Hämolymph ccfDNA Sequenzéierung bestëmmt, relativ grouss (Dorënner S3, Ergänzungsinformatioun).Et enthält Viren déi Insekte wéi Baculoviridae an Iridoviridae infizéieren, souwéi Virussen déi Amöben, Algen a Wirbeldéieren infizéieren.Mir hunn och Sequenzen fonnt, déi dem Pithovirus sibericum Genom passen.Pitoviruses (och bekannt als "Zombie Viren") goufen éischt aus 30.000 Joer ale Permafrost a Sibirien isoléiert [47].Also sinn eis Resultater konsequent mat fréiere Berichter, déi weisen datt net all modern Aarte vun dëse Viren ausgestuerwen sinn [48] an datt dës Virussen an de Fernseh subarktesch Marine Ökosystemer präsent sinn.
Schlussendlech hu mir getest fir ze kucken ob mir DNA Fragmenter vun anere multicelluläre Déieren fanne kënnen.Insgesamt 482 auslännesch Contigs goufen duerch BLASTN a BLASTX mat nt, nr a RefSeq Bibliothéiken (genomesch a Protein) identifizéiert.Eis Resultater weisen, datt ënnert der auslännesch Fragmenter vun ccfDNA vun multicellular Déieren DNA vun bony Schanken predominates (Figebam. 5).DNA Fragmenter vun Insekten an aner Arten goufen och fonnt.E relativ groussen Deel vun der DNA Fragmenter ass net identifizéiert ginn, méiglecherweis wéinst der underrepresentation vun enger grousser Zuel vun Marine Arten an genomic Datenbanken Verglach zu terrestresch Arten [49].
Am heitege Pabeier gëlle mir d'LB Konzept op Muschelen, argumentéieren datt Hämolymph ccfDNA Schoss Sequenzéierung kann Abléck an d'Zesummesetzung vun de Marine Küstekosystemer ubidden.Besonnesch hu mir fonnt datt 1) ​​Muschelhemolymph relativ héich Konzentratioune (Mikrogrammniveauen) vu relativ grousser (~ 1-5 kb) zirkuléierend DNA Fragmenter enthält;2) dës DNA Fragmenter sinn onofhängeg an net onofhängeg 3) Ënnert den auslännesche Quelle vun dësen DNA Fragmenter hu mir bakteriell, archaeal a viral DNA, souwéi DNA vun anere multicellular Déieren fonnt;4) D'Akkumulation vun dësen auslännesche ccfDNA Fragmenter an der Hämolymph geschitt séier a dréit zur interner Filteraktivitéit vu Muschelen bäi.Als Conclusioun beweist eis Studie datt d'Konzept vu LB, dat bis elo haaptsächlech am Beräich vun der Biomedizin applizéiert gouf, eng räich awer onerfuerscht Quell vu Wëssen kodéiert, déi benotzt ka ginn fir d'Interaktioun tëscht Sentinel Arten an hirer Ëmwelt besser ze verstoen.
Zousätzlech zu Primaten, gouf ccfDNA Isolatioun an Mamendéieren gemellt, dorënner Mais, Hënn, Kazen a Päerd [50, 51, 52].Wéi och ëmmer, fir eis Wëssen, ass eis Studie déi éischt fir d'Detektioun an d'Sequenzéierung vu ccfDNA a Marinearten mat engem oppene Circulatiounssystem ze berichten.Dës anatomesch Feature an d'Filterfäegkeet vu Muschelen kënnen, op d'mannst deelweis, déi verschidde Gréisstcharakteristike vun zirkuléierend DNA Fragmenter am Verglach mat aner Spezies erklären.Bei Mënschen sinn déi meescht DNA-Fragmenter, déi am Blutt zirkuléieren, kleng Fragmenter, déi an der Gréisst vun 150 bis 200 bp variéieren.mat engem Maximum Peak vun 167 bp [34, 53].E klengen awer bedeitendsten Deel vun DNA Fragmenter sinn tëscht 300 an 500 bp grouss, a ronn 5% si méi laang wéi 900 bp.[54] Eng.De Grond fir dës Gréisst Verdeelung ass, datt d'Haaptquell vun ccfDNA am Plasma als Resultat vun Zell Doud geschitt, entweder wéinst Zell Doud oder wéinst necrosis vun zirkuléieren hematopoietic Zellen an gesond Persounen oder wéinst Apoptosis vun Tumor Zellen an Kriibs Patienten (bekannt als zirkuléierend Tumor DNA)., ctDNA).D'Gréisst Verdeelung vun hemolymph ccfDNA datt mir a Muschelen fonnt hunn, rangéiert vun 1000 bis 5000 bp, wat suggeréiert datt Muschel ccfDNA en aneren Hierkonft huet.Dëst ass eng logesch Hypothese, well Muschelen e semi-oppenen vaskuläre System hunn a liewen a marien aquateschen Ëmfeld mat héije Konzentratioune vu mikrobieller genomesch DNA.Tatsächlech hunn eis Laborexperimenter mat exogener DNA gewisen, datt Muschelen DNA-Fragmenter am Mierwaasser accumuléieren, op d'mannst no e puer Stonnen sinn se no der cellulärer Opnam degradéiert an/oder fräigelooss an/oder a verschiddenen Organisatiounen gespäichert.Mat der Raritéit vun Zellen (souwuel prokaryotesch wéi eukaryot), wäert d'Benotzung vun intravalvuläre Kompartimenter d'Quantitéit vum ccfDNA aus Selbstquellen reduzéieren wéi och aus auslännesche Quellen.Bedenkt d'Wichtegkeet vun der bivalve gebuerene Immunitéit an der grousser Unzuel vun zirkuléierende Phagozyten, hu mir weider hypothetiséiert datt och auslännesch ccfDNA an zirkuléierende Phagozyten beräichert ass, déi auslännesch DNA accumuléieren beim Verdauung vu Mikroorganismen an / oder cellulären Debris.Zesummegefaasst weisen eis Resultater datt bivalve Hämolymph ccfDNA en eenzegaartege Repository vu molekulare Informatioun ass a verstäerkt hire Status als Sentinel Spezies.
Eis Donnéeë weisen datt d'Sequenzéierung an d'Analyse vu bakteriell ofgeleet Hämolymph ccfDNA Fragmenter Schlësselinformatioun iwwer d'Hostbakteriell Flora an d'Bakterien, déi am Ëmgéigend Marine Ökosystem präsent sinn.Shot sequencing Techniken hunn Sequenzen vun der commensal Bakterien A. atra gill verroden, datt verpasst ginn hätt wann konventionell 16S rRNA Identifikatioun Methoden benotzt goufen, wéinst deelweis zu enger Referenz Bibliothéik Viraussetzunge.Tatsächlech, eis Benotzung vun LB Daten aus M. platensis an der selwechter Muschel Layer op Kerguelen gesammelt gewisen, datt d'Zesummesetzung vun Gill-assoziéiert bakteriell symbionts déi selwecht war fir béid Muschel Arten (Figebam. S4, Zousaz Informatiounen).Dës Ähnlechkeet vun zwee genetesch ënnerschiddlech Muschelen kann d'Zesummesetzung vu bakterielle Gemeinschaften an de kale, schwefelhaften a vulkaneschen Oflagerunge vu Kerguelen reflektéieren [55, 56, 57, 58].Méi héich Niveaue vu Schwiefel-reduzéierter Mikroorganismen si gutt beschriwwe ginn wann Dir Muschelen aus bioturbéierte Küstegebidder ernannt [59], wéi d'Küst vu Port-au-France.Eng aner Méiglechkeet ass datt d'kommensal Muschelflora duerch horizontaler Iwwerdroung beaflosst ka ginn [60, 61].Méi Fuerschung ass gebraucht fir d'Korrelatioun tëscht dem Marineëmfeld, dem Mieresbuedem Uewerfläch an der Zesummesetzung vu symbiotesche Bakterien a Muschelen ze bestëmmen.Dës Studien sinn am Moment lafend.
D'Längt an d'Konzentratioun vun Hämolymph ccfDNA, seng Liichtegkeet vun der Reinigung, an héich Qualitéit fir séier Gewier Sequenzéierung z'erméiglechen sinn e puer vun de ville Virdeeler fir Muschel ccfDNA ze benotzen fir d'Biodiversitéit an de Marine Küstekosystemer ze bewäerten.Dës Approche ass besonnesch effektiv fir viral Gemeinschaften (Viromen) an engem bestëmmten Ökosystem ze charakteriséieren [62, 63].Am Géigesaz zu Bakterien, Archaea, an Eukaryoten, enthalen viral Genome keng phylogenetesch konservéiert Genen wéi 16S Sequenzen.Eis Resultater weisen datt flësseg Biopsien aus Indikatorarten wéi Muschelen kënne benotzt ginn fir relativ grouss Zuelen vu ccfDNA Virusfragmenter z'identifizéieren, déi bekannt sinn fir Hosten ze infizéieren déi typesch Küstmarinekosystemer bewunnen.Dëst beinhalt Viren, déi bekannt sinn fir Protozoen, Arthropoden, Insekten, Planzen a bakteriell Viren (zB Bakteriophagen) ze infizéieren.Eng ähnlech Verdeelung gouf fonnt, wa mir d'Hemolymph ccfDNA Virome vu bloe Muschelen (M. platensis) iwwerpréift hunn, gesammelt an der selwechter Muschelschicht zu Kerguelen (Table S2, Ergänzungsinformatioun).Shotgun Sequencing vu ccfDNA ass wierklech eng nei Approche déi Dynamik an der Studie vum Virome vu Mënschen oder aner Spezies kritt [21, 37, 64].Dës Approche ass besonnesch nëtzlech fir duebel-gestrengt DNA Viren ze studéieren, well keen eenzege Gen ënner all duebel-strenged DNA Viren konservéiert ass, representéiert déi verschiddenst a breet Klass vu Viren zu Baltimore [65].Obwuel déi meescht vun dëse Viren onklasséiert bleiwen a Viren aus engem komplett onbekannten Deel vun der viraler Welt enthalen kënnen [66], hu mir festgestallt datt d'Viromen an d'Hostberäicher vun de Muschelen A. atra a M. platensis tëscht den zwou Arten falen.ähnlech (gesinn Figur S3, zousätzlech Informatiounen).Dës Ähnlechkeet ass net iwwerraschend, well et kann e Manktem u Selektivitéit an der Opnahm vun DNA präsent an der Ëmwelt reflektéieren.Zukünfteg Studien mat gereinegt RNA sinn am Moment gebraucht fir d'RNA-Virom ze charakteriséieren.
An eiser Etude hu mir eng ganz rigoréis Pipeline benotzt, ugepasst aus der Aarbecht vu Kowarski a Kollegen [37], déi eng zwee-Schrëtt Läschung vu pooléierte Liesen a Contigs virun an no der Assemblée vun gebierteg ccfDNA benotzt hunn, wat zu engem héijen Undeel vun unmapped Liesen resultéiert.Dofir kënne mir net ausschléissen datt e puer vun dësen onmapéierte Liesungen nach ëmmer hiren eegene Urspronk hunn, virun allem well mir kee Referenzgenom fir dës Muschelaart hunn.Mir hunn och dës Pipeline benotzt well mir eis Suergen iwwer d'Chimären tëscht Selbst- an Net-Selbstliesen an d'Lieslängen generéiert vum Illumina MiSeq PE75.En anere Grond fir d'Majoritéit vun onbekannte Liesungen ass datt vill vun de Marinemikroben, besonnesch a wäit ewech wéi Kerguelen, net annotéiert goufen.Mir hunn Illumina MiSeq PE75 benotzt, ugeholl datt ccfDNA Fragmentlängen ähnlech wéi mënschlech ccfDNA.Fir zukünfteg Studien, gitt eis Resultater, déi weisen datt Hämolymph ccfDNA méi laang Liesungen huet wéi Mënschen an /oder Mamendéieren, recommandéiere mir eng Sequenzéierungsplattform ze benotzen déi méi gëeegent ass fir méi laang ccfDNA Fragmenter.Dës Praxis wäert et vill méi einfach maachen méi Indikatiounen fir méi déif Analyse z'identifizéieren.Kréien déi aktuell net erreechbar komplett A. atra nuklear Genom Sequenz géif och vill d'Diskriminéierung vun ccfDNA aus Self an Net-Selbstquellen erliichtert.Well eis Fuerschung sech op d'Méiglechkeet konzentréiert huet d'Konzept vu flësseger Biopsie op Muschelen z'applizéieren, hoffe mir datt wéi dëst Konzept an zukünfteg Fuerschung benotzt gëtt, nei Tools a Pipelines entwéckelt ginn fir d'Potenzial vun dëser Method ze erhéijen fir d'mikrobial Diversitéit vu Muschelen ze studéieren.Marine Ökosystem.
Als net-invasiv klineschen Biomarker sinn erhöhte mënschlech Plasmaniveauen vu ccfDNA mat verschiddene Krankheeten, Tissueschued a Stressbedéngungen assoziéiert [67,68,69].Dës Erhéijung ass verbonne mat der Verëffentlechung vun DNA Fragmenter vu senger eegener Hierkonft no Tissueschued.Mir hunn dëse Problem mat akuten Hëtztstress behandelt, bei deem Muschelen kuerz bei enger Temperatur vun 30 °C ausgesat waren.Mir hunn dës Analyse op dräi verschidden Aarte vu Muschelen an dräi onofhängeg Experimenter gemaach.Wéi och ëmmer, hu mir keng Ännerung am ccfDNA Niveauen no akuten Hëtztstress fonnt (kuckt Figur S5, zousätzlech Informatioun).Dës Entdeckung kann op d'mannst deelweis d'Tatsaach erklären datt Muschelen e semi-oppenen Zirkulatiounssystem hunn a grouss Quantitéiten un auslännesch DNA accumuléieren wéinst hirer héijer Filteraktivitéit.Op der anerer Säit, Muschelen, wéi vill Invertebraten, kënne méi resistent géint Stress-induzéierten Tissueschued sinn, an doduerch d'Verëffentlechung vu ccfDNA an hirer Hämolymph limitéieren [70, 71].
Bis haut huet d'DNA Analyse vun der Biodiversitéit an aquateschen Ökosystemer haaptsächlech op Ëmwelt-DNA (eDNA) Metabarcoding konzentréiert.Wéi och ëmmer, dës Method ass normalerweis an der Biodiversitéitsanalyse limitéiert wann Primer benotzt ginn.D'Benotzung vu Gewier Sequenzéierung ëmkreest d'Aschränkungen vum PCR an déi biased Auswiel vu Primer Sets.Also, an engem Sënn, ass eis Method méi no un der kierzlech benotzter High-Throughput eDNA Shotgun Sequenzéierungsmethod, déi fäeg ass direkt fragmentéiert DNA ze Sequenzéieren a bal all Organismen ze analyséieren [72, 73].Wéi och ëmmer, et ginn eng Rei fundamental Themen déi LB vu Standard eDNA Methoden ënnerscheeden.Natierlech ass den Haaptunterschied tëscht eDNA an LB d'Benotzung vun natierleche Filterhost.D'Benotzung vu Marinearten wéi Schwämmen a Bivalven (Dresseina spp.) Als natierleche Filter fir eDNA ze studéieren gouf gemellt [74, 75].D'Etude vum Dreissena huet awer Tissuebiopsien benotzt, aus deenen DNA extrahéiert gouf.Analyse vu ccfDNA aus LB erfuerdert keng Tissuebiopsie, spezialiséiert an heiansdo deier Ausrüstung a Logistik verbonne mat eDNA oder Tissuebiopsie.Tatsächlech hu mir viru kuerzem gemellt datt ccfDNA vu LB mat FTA-Ënnerstëtzung gespäichert an analyséiert ka ginn ouni eng Kältekette z'erhalen, wat eng grouss Erausfuerderung fir Fuerschung an Ferngebidder ass [76].D'Extraktioun vu ccfDNA aus flëssege Biopsien ass och einfach a liwwert héichqualitativ DNA fir Gewier Sequenzéierung a PCR Analyse.Dëst ass e grousse Virdeel wéinst e puer vun den techneschen Aschränkungen verbonne mat eDNA Analyse [77].D'Einfachheet an d'niddreg Käschte vun der Probemethod sinn och besonnesch gëeegent fir laangfristeg Iwwerwaachungsprogrammer.Zousätzlech zu hirer héijer Filterfäegkeet ass eng aner bekannte Feature vu Bivalves déi chemesch Mucopolysaccharid Zesummesetzung vun hirem Schleim, wat d'Absorptioun vu Viren fördert [78, 79].Dëst mécht Bivalves en idealen natierleche Filter fir d'Biodiversitéit an den Impakt vum Klimawandel an engem bestëmmten aquateschen Ökosystem ze charakteriséieren.Och wann d'Präsenz vun Host-ofgeleet DNA Fragmenter als Begrenzung vun der Method am Verglach zum eDNA gesi ka ginn, sinn d'Käschte verbonne mat sou engem gebiertege ccfDNA am Verglach zum eDNA gläichzäiteg verständlech fir déi grouss Quantitéit un Informatioun verfügbar fir Gesondheetsstudien.offset Host.Dëst beinhalt d'Präsenz vu virale Sequenzen integréiert an de Genom vum Hosthost.Dëst ass besonnesch wichteg fir Muschelen, wéinst der Präsenz vun horizontal iwwerdroenen leukemesche Retroviren a Bivalven [80, 81].En anere Virdeel vu LB iwwer eDNA ass datt et déi phagocytesch Aktivitéit vun zirkuléierende Bluttzellen an der Hämolymph ausnotzt, déi Mikroorganismen (an hir Genome) verschlëmmert.Phagozytose ass d'Haaptfunktioun vu Bluttzellen a Bivalven [82].Schlussendlech profitéiert d'Method vun der héijer Filterkapazitéit vu Muschelen (Duerchschnëtt 1,5 l/h Mierwaasser) an zwee Deeg Zirkulatioun, déi d'Vermëschung vu verschiddene Schichten vum Mierwaasser erhéijen, wat d'Erfaassung vun heterologen eDNA erlaabt.[83, 84].Also, Muschel ccfDNA Analyse ass eng interessant Avenue wéinst den Ernärungs-, wirtschaftlechen an Ëmweltimpakte vu Muschelen.Ähnlech wéi d'Analyse vu LB vu Mënschen gesammelt, mécht dës Method och d'Méiglechkeet op fir genetesch an epigenetesch Verännerungen am Host-DNA als Äntwert op exogene Substanzen ze moossen.Zum Beispill kënnen Drëtt-Generatioun Sequenzéierungstechnologien virgesi sinn fir Genom-breet Methylatiounsanalyse an gebierteg ccfDNA mat Nanopore Sequenzen auszeféieren.Dëse Prozess soll vun der Tatsaach erliichtert ginn, datt d'Längt vun der Muschel ccfDNA Fragmenter Idealfall kompatibel mat laang-liesen sequencing Plattformen ass, datt Genom-breet DNA methylation Analyse vun engem eenzege sequencing Laf ouni de Besoin fir chemesch Transformatiounen erlaben.Dofir kann et e wäertvollen Abléck an déi ënnerierdesch Mechanismen déi d'Äntwert regéieren no der Belaaschtung vum Klimawandel oder Verschmotzung [87].Wéi och ëmmer, d'Benotzung vu LB ass net ouni Aschränkungen.Natierlech erfuerdert dëst d'Präsenz vun Indikatorarten am Ökosystem.Wéi uewen ernimmt, erfuerdert d'Benotzung vun LB fir d'Biodiversitéit vun engem bestëmmten Ökosystem ze bewäerten och eng rigoréis Bioinformatik Pipeline déi d'Präsenz vun DNA Fragmenter aus der Quell berücksichtegt.En anere grousse Problem ass d'Disponibilitéit vu Referenzgenome fir Marinearten.Et gëtt gehofft datt Initiativen wéi de Marine Mamal Genomes Project an de kierzlech etabléierte Fish10k Projet [88] sou eng Analyse an der Zukunft erliichteren.D'Applikatioun vum LB Konzept op Marine Filter-Fütterungsorganismen ass och kompatibel mat de leschte Fortschrëtter an der Sequenzéierungstechnologie, sou datt et gutt passt fir d'Entwécklung vu Multi-ohm Biomarker fir wichteg Informatioun iwwer d'Gesondheet vun de Marine Habitaten als Äntwert op Ëmweltstress ze liwweren.
Genom Sequenzéierungsdaten goufen am NCBI Sequence Read Archive deposéiert https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ënner Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impakt vum Klimawandel op Marine Liewen an Ökosystemer.Cole Biologie.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Bedenkt d'kombinéiert Auswierkunge vum Klimawandel an aner lokal Stressuren op d'Marineëmfeld.allgemeng wëssenschaftlech Ëmfeld.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Wëssenschaft vum éischte Mäerz.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduzéiert Hëtzttoleranz ënner repetitive Hëtztstressbedéngungen erkläert d'héich Summerstierflechkeet vu bloe Muschelen.Wëssenschaftleche Bericht 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Rezent Ännerungen an der Frequenz, Ursaachen an Ausmooss vun Déier Doudesfäll.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Multiple net-spezifesch Pathogenen hu vläicht Massestierflechkeet vu Pinna nobilis verursaacht.Liewen.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potenziell Impakt vum Klimawandel op Arktis zoonotesch Krankheeten.Int J Circumpolar Gesondheet.2005;64:468–77.
Beyer J, Greene NW, Brooks S, Allan IJ, Ruus A, Gomez T, et al.Blue Muschels (Mytilus edulis spp.) als Signalorganismen an der Küsteverschmotzungsmonitoréierung: eng Iwwerpréiwung.Mar Ëmfeld Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Flësseg Biopsie Reifung: Erlaabt Tumor DNA zirkuléieren.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsäuren am mënschleche Plasma.Sëtzungsprotokoller vun Soc Biol Filialen.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Eng nei Roll fir zellfräi DNA als molekulare Marker fir Kriibsbehandlung.Quantifikatioun vun biomolar Analyse.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid Biopsie geet an d'Klinik - Implementéierungsproblemer an zukünfteg Erausfuerderungen.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW et al.Fetal DNA ass präsent am Mammeplasma a Serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR.Dopédiatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Flësseg Biopsie: Donorzellfräi DNA gëtt benotzt fir allogene Läsionen an engem Niertransplantat z'entdecken.Nat Rev Nephrol.2021;17:591-603.
Juan FC, Lo YM Innovatiounen an der prenataler Diagnostik: Maternal Plasma Genom Sequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Rapid Pathogen Detektioun mat der nächster Generatioun metagenomescher Sequenzéierung vun infizéierte Kierperflëssegkeeten.Nat Medezin.2021;27:115-24.