Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, huet limitéiert CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript duerstellen.
Flësseg Biopsie (LB) ass e Konzept, dat am biomedizinesche Beräich séier u Popularitéit gewënnt. De Konzept baséiert haaptsächlech op der Detektioun vu Fragmenter vun zirkulierender extrazellulärer DNA (ccfDNA), déi haaptsächlech als kleng Fragmenter nom Zelltod a verschiddene Gewëss fräigesat ginn. E klenge Prozentsaz vun dëse Fragmenter staamt aus frieme Gewëss oder Organismen. An der aktueller Aarbecht hu mir dëst Konzept op Muschelen ugewannt, eng Sentinel-Aart, déi fir hir héich Mierwaasserfiltratiounskapazitéit bekannt ass. Mir benotzen d'Fäegkeet vu Muschelen, als natierlech Filter ze déngen, fir Ëmwelt-DNA-Fragmenter aus verschiddene Quellen ze fänken, fir Informatiounen iwwer d'Biodiversitéit vu marine Küstenökosystemer ze liwweren. Eis Resultater weisen, datt d'Muschel-Hämolymphe DNA-Fragmenter enthält, déi staark an der Gréisst variéieren, vun 1 bis 5 kb. D'Shotgun-Sequenzéierung huet gewisen, datt eng grouss Zuel vun DNA-Fragmenter vun frieme mikrobiellen Hierkonft sinn. Dorënner hu mir DNA-Fragmenter vu Bakterien, Archaea a Virussen fonnt, dorënner Virussen, déi bekannt sinn, eng Vielfalt vu Wirtsorganismen z'infizéieren, déi allgemeng a Küsten-Mieresökosystemer fonnt ginn. Schlussendlech weist eis Studie, datt de Konzept vun der LB, deen op Muschelen ugewannt gëtt, eng räich, awer nach onerfuerscht Quell vu Wëssen iwwer mikrobiell Diversitéit a marine Küstenökosystemer duerstellt.
Den Impakt vum Klimawandel (KW) op d'Biodiversitéit vu marinen Ökosystemer ass e séier wuessend Fuerschungsgebitt. Déi global Erwiermung verursaacht net nëmme wichteg physiologesch Belaaschtungen, mee dréckt och d'evolutionär Grenzen vun der thermescher Stabilitéit vu marinen Organismen, wat den Liewensraum vun enger Rei vu Spezies beaflosst a se dozou bréngt, no méi gënschtege Konditiounen ze sichen [1, 2]. Nieft der Beeinflussung vun der Biodiversitéit vu Metazoen stéiert KW dat delikat Gläichgewiicht vun den Interaktioune tëscht dem Wirt an dem Mikrobiellen. Dës mikrobiell Dysbakteriose stellt eng eescht Bedrohung fir marinen Ökosystemer duer, well se marinen Organismen méi ufälleg fir infektiéis Pathogenen mécht [3, 4]. Et gëtt ugeholl, datt SS eng wichteg Roll bei Massendoud spillen, wat e seriéist Problem fir d'Gestioun vu globale marinen Ökosystemer ass [5, 6]. Dëst ass e wichtegt Thema wéinst den ekonomeschen, ökologeschen an ernährungsintensiven Auswierkunge vu ville marinen Aarten. Dëst ass besonnesch wouer fir Muschelen, déi an de Polarregiounen liewen, wou d'Auswierkunge vu KW méi direkt a schwéier sinn [6, 7]. Tatsächlech gi Muschelen wéi Mytilus spp. wäit verbreet benotzt fir d'Auswierkunge vu KW op marinen Ökosystemer ze iwwerwaachen. Et ass net iwwerraschend, datt eng relativ grouss Zuel vu Biomarker entwéckelt gouf fir hir Gesondheet ze iwwerwaachen, dacks mat engem zweestufege Wee mat funktionelle Biomarker baséiert op enzymatescher Aktivitéit oder Zellfunktiounen wéi Zellviabilitéit a phagozytärer Aktivitéit [8]. Dës Methode enthalen och d'Miessung vun der Konzentratioun vu spezifesche Drockindikatoren, déi sech a mëllen Gewëss no der Absorptioun vu grousse Quantitéiten u Mierwaasser accumuléieren. Wéi och ëmmer, déi héich Filtratiounskapazitéit an dat hallefoppent Kreeslafsystem vu Muschele bidden eng Méiglechkeet fir nei Hämolymphe-Biomarker z'entwéckelen andeems se de Konzept vun der flësseger Biopsie (LB) benotzen, engem einfache a minimalinvasive Wee fir d'Patientenmanagement. Bluttproben [9, 10]. Och wann verschidden Aarte vu zirkulierenden Molekülen am mënschleche LB fonnt kënne ginn, baséiert dëst Konzept haaptsächlech op der DNA-Sequenzéierungsanalyse vu zirkulierenden extrazelluläre DNA (ccfDNA) Fragmenter am Plasma. Tatsächlech ass d'Präsenz vu zirkulierender DNA am mënschleche Plasma zënter Mëtt vum 20. Joerhonnert bekannt [11], awer eréischt an de leschte Joren huet d'Entstoe vun High-Throughput-Sequenzéierungsmethoden zu enger klinescher Diagnos baséiert op ccfDNA gefouert. D'Präsenz vun dësen zirkulierenden DNA-Fragmenter ass deelweis op déi passiv Fräisetzung vu genomescher DNA (nuklear a mitochondrial) nom Zelltod zeréckzeféieren. Bei gesonde Persounen ass d'Konzentratioun vun der ccfDNA normalerweis niddreg (<10 ng/mL), kann awer bei Patienten, déi un ënnerschiddleche Pathologien leiden oder Stress ausgesat sinn, ëm den 5-10-facht erhéicht sinn, wat zu Gewebesschued féiert. Bei gesonde Persounen ass d'Konzentratioun vun der ccfDNA normalerweis niddreg (<10 ng/mL), kann awer bei Patienten, déi un ënnerschiddleche Pathologien leiden oder Stress ausgesat sinn, ëm den 5-10-facht erhéicht sinn, wat zu Gewebesschued féiert. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), но может повышаться в 5–10 сразунся патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Bei gesonde Leit ass d'Konzentratioun vun der cccDNA normalerweis niddreg (<10 ng/mL), awer si kann ëm den 5-10-facht bei Patienten mat verschiddene Pathologien oder ënner Stress, deen zu Gewebesschued féiert, eropgoen.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml)在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 承 刏中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 мал. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. D'ccfDNA-Konzentratioune si bei gesonde Persounen normalerweis niddreg (<10 ng/ml), kënnen awer bei Patienten mat verschiddene Pathologien oder Stress ëm den 5-10-fach erhéicht sinn, wat zu Gewebesschued féiert.D'Gréisst vun de ccfDNA-Fragmenter variéiert staark, awer läit normalerweis tëscht 150 an 200 bp. [12]. D'Analyse vun der selwer ofgeleeter ccfDNA, also ccfDNA aus normalen oder transforméierte Wirtszellen, kann benotzt ginn, fir genetesch an epigenetesch Verännerungen am nuklearen an/oder mitochondrialen Genom z'entdecken, wouduerch de Kliniker spezifesch molekular gezielt Therapien auswielen kënnen [13]. Wéi och ëmmer, ccfDNA kann aus frieme Quellen gewonnen ginn, wéi ccfDNA aus fetale Zellen während der Schwangerschaft oder aus transplantéierten Organer [14,15,16,17]. ccfDNA ass och eng wichteg Informatiounsquell fir d'Präsenz vun Nukleinsäuren vun engem infektiösen Agent (friemen), wat eng net-invasiv Detektioun vu verbreeten Infektiounen erméiglecht, déi net duerch Bluttkulturen identifizéiert ginn, an eng invasiv Biopsie vum infizéierte Gewëss vermeit [18]. Rezent Studien hunn tatsächlech gewisen, datt mënschlecht Blutt eng räich Informatiounsquell enthält, déi benotzt ka ginn, fir viral a bakteriell Pathogenen z'identifizéieren, an datt ongeféier 1% vun der ccfDNA, déi am mënschleche Plasma fonnt gëtt, vun friemer Hierkonft ass [19]. Dës Studien weisen datt d'Biodiversitéit vum zirkulierenden Mikrobiom vun engem Organismus mat Hëllef vun der ccfDNA-Analyse bewäert ka ginn. Bis viru kuerzem gouf dëst Konzept awer exklusiv beim Mënsch a mannerem Mooss bei anere Wierbeldéieren benotzt [20, 21].
An dëser Aarbecht benotze mir de LB-Potenzial fir d'ccfDNA vun Aulacomya atra ze analyséieren, enger südlecher Aart, déi dacks op de subantarktischen Kergueleninselen fonnt gëtt, enger Grupp vun Inselen op engem grousse Plateau, déi viru 35 Millioune Joer entstanen ass. Mat Hëllef vun engem In-vitro-Experimentalsystem hu mir festgestallt, datt DNA-Fragmenter am Mierwaasser séier vu Muschelen opgeholl ginn an an den Hämolymphekompartiment kommen. D'Sequenzéierung vu Schrotflënt huet gewisen, datt d'Hämolymphe-ccfDNA vun der Muschel-Drogenofhängegkeet DNA-Fragmenter vun eegenem an net-selbsten Urspronk enthält, dorënner symbiotesch Bakterien an DNA-Fragmenter aus Biome, déi typesch fir kal vulkanesch marine Küstenökosystemer sinn. D'Hämolymphe-ccfDNA enthält och viral Sequenzen, déi vu Virussen mat verschiddene Wirtsgebidder ofgeleet sinn. Mir hunn och DNA-Fragmenter vu multizelluläre Déieren wéi Knachfësch, Mieranemonen, Algen an Insekten fonnt. Zesummefaassend weist eis Studie, datt den LB-Konzept erfollegräich op marine Wirbeldéieren ugewannt ka ginn, fir e räicht genomescht Repertoire a marinen Ökosystemer ze generéieren.
Erwuessener (55-70 mm laang) Mytilus platensis (M. platensis) an Aulacomya atra (A. atra) goufen am Dezember 2018 vun de Fielsküste vun der Gezäitezon vu Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 O). Kergueleninselen gesammelt. Aner erwuesse Blomuschelen (Mytilus spp.) goufe vun engem kommerzielle Liwwerant (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) kaaft an an en temperaturkontrolléierten (4°C) belëfteten Tank mat 10-20 L 32‰ künstlechen Salzlake (kënschtlecht Mieresalz Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) placéiert. Fir all Experiment goufen d'Längt an d'Gewiicht vun den eenzelne Muschele gemooss.
E gratis Open-Access-Protokoll fir dëst Programm ass online verfügbar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kuerz gesot, gouf LB-Hämolymphe aus Abduktormuskelen gesammelt, wéi beschriwwen [22]. D'Hämolymphe gouf duerch Zentrifugatioun bei 1200×g fir 3 Minutten gekläert, den Iwwerstand gouf agefruer (-20°C) bis zur Benotzung. Fir d'Isolatioun an d'Reinigung vun der cfDNA goufen d'Prouwe (1,5-2,0 ml) opgetaut a mat dem NucleoSnap cfDNA Kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) no den Instruktioune vum Hiersteller veraarbecht. D'ccfDNA gouf bei -80°C bis zur weiderer Analyse gelagert. An e puer Experimenter gouf d'ccfDNA isoléiert a gereinegt mat dem QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Déi gereinegt DNA gouf mat engem Standard PicoGreen Assay quantifizéiert. D'Fragmentverdeelung vun der isoléierter ccfDNA gouf duerch Kapillarelektrophorese mat engem Agilent 2100 Bioanalysator (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) an engem High Sensitivity DNA Kit analyséiert. Den Test gouf mat 1 µl vun der ccfDNA-Prouf no den Instruktioune vum Hiersteller duerchgefouert.
Fir d'Sequenzéierung vun Hämolymphe-ccfDNA-Fragmenter huet Genome Québec (Montreal, Québec, Kanada) Shotgun-Bibliothéike mat dem Illumina DNA Mix Kit vum Illumina MiSeq PE75 Kit virbereet. En Standardadapter (BioO) gouf benotzt. Réi Datendateie sinn am NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 an SRR8924809) verfügbar. D'Basisliesqualitéit gouf mat FastQC [23] bewäert. Trimmomatic [24] gouf fir Clipping-Adapteren a Liesungen vu schlechter Qualitéit benotzt. Shotgun-Liesungen mat gepaarten Enden goufen FLASH a méi laang eenzel Liesungen mat enger minimaler Iwwerlappung vun 20 bp zesummegefaasst, fir Mismatches ze vermeiden [25]. Zesummegefaasst Liesungen goufen mat BLASTN annotéiert mat Hëllef vun enger bivalver NCBI Taxonomie Datebank (e Wäert < 1e−3 an 90% Homologie), an d'Maskéierung vu Sequenzen mat gerénger Komplexitéit gouf mat DUST [26] duerchgefouert. Zesummegefaasst Liesungen goufen mat BLASTN annotéiert mat Hëllef vun enger bivalver NCBI Taxonomie Datebank (e Wäert < 1e−3 an 90% Homologie), an d'Maskéierung vu Sequenzen mat gerénger Komplexitéit gouf mat DUST [26] duerchgefouert. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорча (zначение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнельз ис 26п. Déi zesummegefaasst Liesungen goufen mat BLASTN annotéiert mat Hëllef vun der NCBI Bivalve Taxonomie Datebank (e Wäert < 1e-3 an 90% Homologie), an eng Sequenzmaskéierung mat gerénger Komplexitéit gouf mat DUST [26] duerchgefouert.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿綔娕）进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 2 ， 2 ）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуски (значение e <1e-3 et 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнель с исп6] D'Gepoolte Liesungen goufen mat BLASTN annotéiert andeems d'NCBI Bivalve taxonomesch Datebank benotzt gouf (e-Wäert <1e-3 an 90% Homologie), an eng Sequenzmaskéierung mat gerénger Komplexitéit gouf mat DUST [26] duerchgefouert.D'Liesungen goufen an zwou Gruppen opgedeelt: déi mat Muschelsequenzen zesummenhänken (hei Selbstliesungen genannt) an net-verwandt (net-Selbstliesungen). Zwee Gruppen goufen separat mat MEGAHIT zesummegestallt fir Contigs ze generéieren [27]. Mëttlerweil gouf déi taxonomesch Verdeelung vun den ausserierdesche Mikrobiomliesungen mat Kraken2 [28] klasséiert a grafesch duerch e Krona-Kuerzdiagramm op Galaxy [29, 30] duergestallt. Déi optimal Kmer goufen aus eise virleefegen Experimenter als Kmer-59 bestëmmt. Selbst-Contigs goufen dann duerch Ausriichtung mat BLASTN (bivalve NCBI Datebank, e-Wäert < 1e−10 an 60% Homologie) fir eng lescht Annotatioun identifizéiert. Selbst-Contigs goufen dann duerch Ausriichtung mat BLASTN (bivalve NCBI Datebank, e-Wäert < 1e−10 an 60% Homologie) fir eng lescht Annotatioun identifizéiert. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлых, скечотлию <1e-10 и гомология 60%) fir окончательной аннотации. Selbst-Contigs goufen dann identifizéiert andeems se géint BLASTN (NCBI Bivalve Datebank, e-Wäert <1e-10 an 60% Homologie) fir d'final Annotatioun ofgestëmmt hunn.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги fir окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BINC для BLASTN) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 a гомология 60%). Selbst-Contigs goufen dann fir d'final Annotatioun identifizéiert andeems se géint BLASTN (NCBI Muscheldatenbank, e-Wäert <1e-10 an 60% Homologie) ofgestëmmt hunn. Parallel goufen Net-Selbst-Gruppen-Contigs mat BLASTN annotéiert (nt NCBI Datebank, e-Wäert < 1e−10 an 60% Homologie). Parallel goufen Net-Selbst-Gruppen-Contigs mat BLASTN annotéiert (nt NCBI Datebank, e-Wäert < 1e−10 an 60% Homologie). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (Basa данных nt NCBI, den 1. Mee 10. Mee 60%). Parallel goufen auslännesch Gruppencontigs mat BLASTN annotéiert (NT NCBI Datebank, e-Wäert <1e-10 an 60% Homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннче <1e-10 a géigesäiteg 60%). Parallel goufen net-Selbstgrupp-Contigs mat BLASTN annotéiert (nt NCBI Datebank, e-Wäert <1e-10 an 60% Homologie). BLASTX gouf och op Net-Selbst-Contigs mat Hëllef vun den nr- an RefSeq-Protein-NCBI-Datebanken duerchgefouert (e-Wäert < 1e−10 an 60% Homologie). BLASTX gouf och op Net-Selbst-Contigs mat Hëllef vun den nr- an RefSeq-Protein-NCBI-Datebanken duerchgefouert (e-Wäert < 1e−10 an 60% Homologie). BLASTX ass net zougänglech fir net-kontinuéierlech Konnektivitéit mat der Verëffentlechung vun der Zuel an RefSeq NCBI (Zënter <1e-1e) Erhéijung 60%). BLASTX gouf och op net-Self-Contigs mat Hëllef vun den nr- an RefSeq NCBI-Proteindatenbanken duerchgefouert (e-Wäert < 1e-10 an 60% Homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 吺 BLASTX setzt выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (zënter <1e-1) Erhéijung 60%). BLASTX gouf och op net-Self-Contigs mat Hëllef vun den nr- an RefSeq NCBI-Proteindatenbanken duerchgefouert (e-Wäert <1e-10 an 60% Homologie).D'BLASTN- a BLASTX-Pools vun net-Selbst-Contigs representéieren déi lescht Contigs (kuckt Ergänzungsdatei).
D'Primer, déi fir d'PCR benotzt goufen, sinn an der Tabell S1 opgezielt. Taq DNA Polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) gouf benotzt fir d'ccfDNA Zilgenen ze amplifizéieren. Folgend Reaktiounsbedéngunge goufen ugewannt: Denaturatioun bei 95°C fir 3 Minutten, 95°C fir 1 Minutt, festgeluecht Glühtemperatur fir 1 Minutt, Elongatioun bei 72°C fir 1 Minutt, 35 Zyklen, a schliisslech 72°C bannent 10 Minutten. . D'PCR-Produkter goufen duerch Elektrophorese an Agarosegelen (1,5%) getrennt, déi SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) bei 95 V enthalen.
Miesmuschelen (Mytilus spp.) goufen 24 Stonnen bei 4°C a 500 ml sauerstoffräichem Mierwaasser (32 PSU) akklimatiséiert. Plasmid-DNA mat engem Insert, deen d'mënschlech Galectin-7 cDNA-Sequenz kodéiert (NCBI-Accessiounsnummer L07769), gouf an d'Fläsch mat enger Endkonzentratioun vun 190 μg/μl bäigefüügt. Miesmuschelen, déi ënner de selwechte Konditiounen ouni DNA-Zousätz inkubéiert goufen, waren d'Kontroll. Den drëtte Kontrolltank huet DNA ouni Miesmuschelen enthale. Fir d'Qualitéit vun der DNA am Mierwaasser ze iwwerwaachen, goufen Mierwaasserprouwen (20 μl; dräi Widderhuelungen) aus all Tank zur uginnen Zäit geholl. Fir d'Plasmid-DNA-Verfolgbarkeet goufen LB-Miesmuschelen zu den uginnen Zäiten geernt an duerch qPCR an ddPCR analyséiert. Wéinst dem héije Salzgehalt vum Mierwaasser goufen Aliquoten virun all PCR-Tester a Waasser mat PCR-Qualitéit (1:10) verdënnt.
Digital Drëpsen-PCR (ddPCR) gouf mam BioRad QX200 Protokoll (Mississauga, Ontario, Kanada) duerchgefouert. Benotzt den Temperaturprofil fir déi optimal Temperatur ze bestëmmen (Tabell S1). D'Drëpse goufe mat engem QX200 Drëpsgenerator (BioRad) generéiert. ddPCR gouf wéi follegt duerchgefouert: 95°C fir 5 Minutten, 50 Zyklen vun 95°C fir 30 Sekonnen an eng bestëmmt Glühtemperatur fir 1 Minutt an 72°C fir 30 Sekonnen, 4°C fir 5 Minutten an 90°C bannent 5 Minutten. D'Zuel vun den Drëpsen an déi positiv Reaktiounen (Zuel vun de Kopien/µl) goufe mat engem QX200 Drëpsenlieser (BioRad) gemooss. Prouwe mat manner wéi 10.000 Drëpse goufen ofgewisen. D'Musterkontroll gouf net all Kéier duerchgefouert, wann ddPCR duerchgefouert gouf.
D'qPCR gouf mat Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) a LGALS7-spezifesche Primer duerchgefouert. All quantitativ PCRs goufen an 20 µl mat dem QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) duerchgefouert. D'qPCR gouf mat enger 15-Minutte-Inkubatioun bei 95°C gestart, gefollegt vun 40 Zyklen bei 95°C fir 10 Sekonnen an bei 60°C fir 60 Sekonnen mat enger Datenerfassung. Schmelzkurve goufen duerch hannereneen Miessunge bei 95°C fir 5 Sekonnen, 65°C fir 60 Sekonnen an 97°C um Enn vun der qPCR generéiert. All qPCR gouf dräimol duerchgefouert, ausser fir Kontrollprouwen.
Well Moulen fir hir héich Filtratiounsquote bekannt sinn, hu mir als éischt ënnersicht, ob si DNA-Fragmenter am Mierwaasser filtere a späichere kënnen. Mir waren och interesséiert, ob dës Fragmenter sech an hirem hallefoppene Lymphsystem accumuléieren. Mir hunn dëst Problem experimentell geléist, andeems mir d'Schicksal vu lösleche DNA-Fragmenter, déi a Blomuschelbecken bäigefüügt goufen, verfollegt hunn. Fir d'Verfollegung vun DNA-Fragmenter ze erliichteren, hu mir friem (net selwer) Plasmid-DNA benotzt, déi de mënschleche Galectin-7-Gen enthält. ddPCR verfollegt Plasmid-DNA-Fragmenter am Mierwaasser a Moulen. Eis Resultater weisen, datt wann d'Quantitéit vun DNA-Fragmenter am Mierwaasser iwwer d'Zäit (bis zu 7 Deeg) relativ konstant bliwwen ass, ouni Moulen, dann ass dësen Niveau a Präsenz vu Moulen bannent 8 Stonnen bal komplett verschwonnen (Fig. 1a,b). Fragmenter vun exogener DNA konnten einfach bannent 15 Minutten an der intravalvulärer Flëssegkeet an der Hämolymphe nogewise ginn (Fig. 1c). Dës Fragmenter konnten nach bis zu 4 Stonnen no der Expositioun nogewise ginn. Dës Filteraktivitéit a Bezuch op DNA-Fragmenter ass vergläichbar mat der Filteraktivitéit vu Bakterien an Algen [31]. Dës Resultater suggeréieren, datt Moulen friem DNA an hire Flëssegkeetskompartimenter filtere a späichere kënnen.
Relativ Konzentratioune vu Plasmid-DNA am Mierwaasser a Präsenz (A) oder Absenz (B) vu Muschelen, gemooss mat ddPCR. An A sinn d'Resultater a Prozentsätz ausgedréckt, woubäi d'Grenze vun de Këschten déi 75. an 25. Perzentil representéieren. Déi ugepasst logarithmesch Kurve gëtt a Rout gewisen, an de groe Beräich stellt den 95%-Konfidenzintervall duer. An B stellt déi rout Linn de Mëttelwäert an déi blo Linn den 95%-Konfidenzintervall fir d'Konzentratioun duer. C Akkumulatioun vu Plasmid-DNA an der Hämolymphe a Klappenflëssegkeet vu Muschelen zu verschiddenen Zäiten nom Zousaz vu Plasmid-DNA. D'Resultater ginn als absolut detektéiert Kopien/ml (±SE) presentéiert.
Duerno hu mir den Urspronk vun der ccfDNA a Miesmuschelen ënnersicht, déi aus Miesmuschelbetter op de Kergueleninselen gesammelt goufen, enger ofgeleeëner Inselgrupp mat limitéiertem anthropogenen Afloss. Fir dësen Zweck gouf cccDNA aus Miesmuschel-Hämolymphen isoléiert a gereinegt duerch Methoden, déi üblech fir d'Reinigung vu mënschlecher cccDNA benotzt ginn [32, 33]. Mir hunn festgestallt, datt déi duerchschnëttlech Hämolymphe-ccfDNA-Konzentratioune a Miesmuschelen am niddrege Beräich vun Mikrogramm pro ml Hämolymphe leien (kuckt Tabelle S2, Ergänzungsinformatiounen). Dëse Beräich vun de Konzentratioune ass vill méi grouss wéi bei gesonde Leit (niddreg Nanogramm pro Milliliter), awer a rare Fäll, bei Kriibspatienten, kann den Niveau vun der ccfDNA e puer Mikrogramm pro Milliliter erreechen [34, 35]. Eng Analyse vun der Gréisstenverdeelung vun der Hämolymphe-ccfDNA huet gewisen, datt dës Fragmenter staark an der Gréisst variéieren, vun 1000 bp bis 1000 bp bis zu 5000 bp (Fig. 2). Ähnlech Resultater goufen mat dem Silica-baséierte QIAamp Investigator Kit kritt, enger Method déi an der forensescher Wëssenschaft dacks benotzt gëtt fir genomesch DNA aus DNA-Prouwen mat gerénger Konzentratioun, dorënner ccfDNA, séier ze isoléieren an ze purifizéieren [36].
Representativt ccfDNA-Elektrophorogramm vun der Hämolymphe vun enger Muschel. Extrahéiert mam NucleoSnap Plasma Kit (uewen) an dem QIAamp DNA Investigator Kit. B Violindiagramm, dat d'Verdeelung vun den ccfDNA-Konzentratioune vun der Hämolymphe (±SE) a Muschele weist. Déi schwaarz a rout Linne representéieren de Median an den éischten respektiv drëtten Quartil.
Ongeféier 1% vun der ccfDNA bei Mënschen a Primaten huet eng friem Quell [21, 37]. Ënner Berécksiichtegung vum halboppene Kreeslafsystem vu Muschelen, mikrobiellt räichem Mierwaasser an der Gréisstverdeelung vun der ccfDNA vu Muschelen, hu mir d'Hypothes opgestallt, datt d'Hämolymphe-ccfDNA vu Muschelen e räiche a diverse Pool vu mikrobieller DNA kéint enthalen. Fir dës Hypothes ze testen, hu mir d'Hämolymphe-ccfDNA aus Aulacomya atra-Prouwe sequenzéiert, déi vun de Kerguelen-Insele gesammelt goufen, wat iwwer 10 Millioune Liesungen erginn huet, vun deenen 97,6% d'Qualitéitskontroll bestanen hunn. D'Liesungen goufen dann no Selbst- a Net-Selbstquellen klasséiert mat Hëllef vun de BLASTN- an NCBI-Muscheldatebanken (Fig. S1, Ergänzungsinformatiounen).
Beim Mënsch kënnen souwuel nuklear wéi och mitochondrial DNA an de Bluttkreeslaf fräigesat ginn [38]. An der aktueller Studie war et awer net méiglech, d'nuklear genomesch DNA vu Muschelen am Detail ze beschreiwen, well den A. atra Genom net sequenzéiert oder beschriwwe gouf. Mir konnten awer eng Rei vu ccfDNA Fragmenter vun eisem eegenen Urspronk mat Hëllef vun der Muschelbibliothéik identifizéieren (Fig. S2, Ergänzungsinformatiounen). Mir hunn och d'Präsenz vun DNA Fragmenter vun eisem eegenen Urspronk duerch geriicht PCR Amplifikatioun vun deenen A. atra Genen bestätegt, déi sequenzéiert goufen (Fig. 3). Ähnlech, well de mitochondriale Genom vun A. atra an ëffentleche Datebanken verfügbar ass, kann een Hiweiser fir d'Präsenz vu mitochondrialen ccfDNA Fragmenter an der Hämolymphe vun A. atra fannen. D'Präsenz vu mitochondrialen DNA Fragmenter gouf duerch PCR Amplifikatioun bestätegt (Fig. 3).
Verschidde mitochondrial Genen waren an der Hämolymphe vun A. atra (rout Punkten – Stocknummer: SRX5705969) an M. platensis (blo Punkten – Stocknummer: SRX5705968) präsent, déi duerch PCR amplifizéiert goufen. Figur adaptéiert vum Breton et al., 2011 B Amplifikatioun vum Hämolymphesupernatant aus A. atra. Op FTA-Pabeier gespäichert. Benotzt e 3 mm Stanzmaschinn fir direkt an d'PCR-Réier mat dem PCR-Mix bäizefügen.
Wéinst dem héije Mikrobiellengehalt am Mierwaasser hu mir eis ufanks op d'Charakteriséierung vu mikrobiellen DNA-Sequenzen an der Hämolymphe konzentréiert. Fir dëst ze maachen, benotze mir zwou verschidde Strategien. Déi éischt Strategie huet Kraken2 benotzt, e Sequenzklassifikatiounsprogramm op Basis vun Algorithmen, dat mikrobiell Sequenzen mat enger Genauegkeet identifizéiere kann, déi vergläichbar ass mat BLAST an aneren Tools [28]. Méi wéi 6719 Liesungen goufen als vu bakteriellen Urspronk festgestallt, während 124 a 64 vun Archaea respektiv Virussen koumen (Fig. 4). Déi heefegst bakteriell DNA-Fragmenter ware Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) a Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Dës Verdeelung entsprécht fréiere Studien iwwer de Mikrobiom vun de Miermuschelen [39, 40]. Gammaproteobakterien waren déi Haaptklass vu Proteobakterien (44%), dorënner vill Vibrionales (Fig. 4b). D'ddPCR-Method huet d'Präsenz vu Vibrio-DNA-Fragmenter an der ccfDNA vun der A. atra-Hämolymphe bestätegt (Fig. 4c) [41]. Fir méi Informatiounen iwwer den bakteriellen Urspronk vun der ccfDNA ze kréien, gouf eng zousätzlech Approche benotzt (Fig. S2, Ergänzungsinformatiounen). An dësem Fall goufen iwwerlappend Liesungen als gepaarte Liesungen zesummegestallt a goufen als vu selwer (Muschelen) oder net-selbstverurspronk klasséiert mat Hëllef vu BLASTN an engem e-Wäert vun 1e−3 an engem Cutoff mat >90% Homologie. An dësem Fall goufen iwwerlappend Liesungen als gepaarte Liesungen zesummegestallt a goufen als vu selwer (Muschelen) oder net-selbstverurspronk klasséiert mat Hëllef vu BLASTN an engem e-Wäert vun 1e−3 an engem Cutoff mat >90% Homologie. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были класиксиов (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения> 0%. An dësem Fall goufen iwwerlappend Liesungen als gepaarte Liesungen gesammelt a mat Hëllef vu BLASTN an engem e-Wäert vun 1e-3 an engem Cutoff-Wäert vun >90% Homologie als nativ (Muschelen) oder net-original klasséiert.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和和和和和和和和和和和和和皒e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焚 的 用 的 用 的 用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфициров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN an 1e-3 и пого 9%. An dësem Fall goufen iwwerlappend Liesungen als gepaarte Liesungen gesammelt a mat Hëllef vun e-BLASTN- an 1e-3-Wäerter an engem Homologieschwellwäert vun >90% als eege (Muschelen) oder net-originell klasséiert.Well den A. atra Genom nach net sequenzéiert gouf, hu mir d'de novo Assembléierungsstrategie vum MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) Assembler benotzt. Insgesamt goufen 147.188 Contigs als ofhängeg (Muschelen) vum Urspronk identifizéiert. Dës Contigs goufen dann mat e-Wäerter vun 1e-10 mat Hëllef vu BLASTN a BLASTX explodéiert. Dës Strategie huet et eis erméiglecht, 482 net-Muschelfragmenter z'identifizéieren, déi an der A. atra ccfDNA präsent sinn. Méi wéi d'Halschent (57%) vun dësen DNA-Fragmenter goufe vu Bakterien gewonnen, haaptsächlech vu Kiemensymbionten, dorënner sulfotroph Symbionten, a vu Kiemensymbionten Solemya velum (Fig. 5).
Relativ Heefegkeet op Typniveau. B Mikrobiell Diversitéit vun zwou Haaptphyla (Firmicutes a Proteobacteria). Representativ Amplifikatioun vun ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenter vum 16S rRNA-Gen (blo) an dräi Atra-Hämolymphen.
Insgesamt goufen 482 gesammelt Contigs analyséiert. Allgemengt Profil vun der taxonomescher Verdeelung vu metagenomesche Contig-Annotatiounen (Prokaryoten an Eukaryoten). B Detailéiert Verdeelung vu bakteriellen DNA-Fragmenter, déi duerch BLASTN a BLASTX identifizéiert goufen.
D'Kraken2-Analyse huet och gewisen, datt d'ccfDNA vun der Muschel archaeal DNA-Fragmenter enthält, dorënner DNA-Fragmenter vun Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) an Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). D'Präsenz vun DNA-Fragmenter, déi vun Euryarchaeota a Crenarchaeota ofgeleet sinn, déi virdru an der mikrobieller Gemeinschaft vu kalifornesche Muschele fonnt goufen, sollt net iwwerraschend sinn [42]. Och wann Euryarchaeota dacks mat extremen Zoustänn a Verbindung bruecht gëtt, gëtt elo unerkannt, datt souwuel Euryarchaeota wéi och Crenarcheota zu den heefegsten Prokaryoten an der mariner kryogener Ëmwelt gehéieren [43, 44]. D'Präsenz vu methanogene Mikroorganismen a Muschele ass net iwwerraschend, well rezent Berichter iwwer extensiv Methanleckage vu Buedemleckage um Kerguelen-Plateau [45] an eng méiglech mikrobiell Methanproduktioun virun der Küst vun de Kerguelen-Insele observéiert goufen [46].
Eis Opmierksamkeet huet sech dann op d'Miessunge vun DNA-Viren geriicht. No eisem beschte Wëssen ass dëst déi éischt Off-Target-Studie iwwer den Virusgehalt vu Muschelen. Wéi erwaart hu mir DNA-Fragmenter vu Bakteriophagen (Caudovirales) fonnt (Fig. 6b). Déi heefegst viral DNA kënnt awer aus engem Stamm vun Nukleocytovirussen, och bekannt als den nuklearen zytoplasmatesche grousse DNA-Virus (NCLDV), deen dat gréisst Genom vun all Virus huet. Bannent dësem Stamm gehéieren déi meescht DNA-Sequenzen zu de Familljen Mimimidoviridae (58%) a Poxviridae (21%), deenen hir natierlech Wirtsgruppen Wierbeldéieren an Arthropoden enthalen, während e klengen Deel vun dësen DNA-Sequenzen zu bekannte virologeschen Algen gehéieren. Infizéiert marine eukaryotesch Algen. D'Sequenze goufen och vum Pandora-Virus kritt, dem Risevirus mat der gréisster Genomgréisst vun all bekannte virale Gattungen. Interessanterweis war d'Gamme vun den Wirtsgruppen, déi bekannt sinn, mam Virus infizéiert ze sinn, wéi duerch d'Hämolymphe-ccfDNA-Sequenzéierung bestëmmt, relativ grouss (Figur S3, Ergänzungsinformatiounen). Et ëmfaasst Viren, déi Insekten wéi Baculoviridae an Iridoviridae infizéieren, souwéi Viren, déi Amöben, Algen a Wierbeldéieren infizéieren. Mir hunn och Sequenzen fonnt, déi mam Genom vum Pithovirus sibericum iwwereneestëmmen. Pitoviren (och bekannt als "Zombieviren") goufen fir d'éischt aus 30.000 Joer ale Permafrost a Sibirien isoléiert [47]. Dofir sinn eis Resultater am Aklang mat fréiere Berichter, déi weisen, datt net all modern Aarte vun dëse Viren ausgestuerwe sinn [48] an datt dës Viren a wäiten subarktischen Marineökosystemer präsent kéinte sinn.
Schlussendlech hu mir getest, ob mir DNA-Fragmenter vun aneren multizellulären Déieren fanne konnten. Insgesamt goufen 482 auslännesch Contigs duerch BLASTN a BLASTX mat nt-, nr- a RefSeq-Bibliothéiken (genomesch a proteinesch) identifizéiert. Eis Resultater weisen, datt ënner de frieme Fragmenter vun der ccfDNA vu multizellulären Déieren d'DNA vu knachege Schanken dominéiert (Fig. 5). DNA-Fragmenter vun Insekten an aneren Aarte goufen och fonnt. E relativ groussen Deel vun den DNA-Fragmenter gouf net identifizéiert, méiglecherweis wéinst der Ënnerrepresentatioun vun enger grousser Zuel vu Marinearten a genomesche Datebanken am Verglach mat terrestreschen Aarten [49].
An dëser Aarbecht applizéieren mir den LB-Konzept op Muschelen, a argumentéieren, datt d'ccfDNA-Shotsequenzéierung vun der Hämolymphe Abléck an d'Zesummesetzung vu marine Küstenökosystemer ka ginn. Besonnesch hu mir festgestallt, datt 1) ​​d'Muschel-Hämolymphe relativ héich Konzentratioune (Mikrogrammniveauen) vu relativ groussen (~1-5 kb) zirkulierenden DNA-Fragmenter enthält; 2) dës DNA-Fragmenter souwuel onofhängeg wéi och net-onofhängeg sinn; 3) Ënnert den auslännesche Quelle vun dësen DNA-Fragmenter hu mir bakteriell, archaesch a viral DNA, souwéi DNA vun aneren multizelluläre Déieren fonnt; 4) D'Akkumulation vun dëse frieme ccfDNA-Fragmenter an der Hämolymphe geschitt séier a dréit zur interner Filteraktivitéit vu Muschelen bäi. Zesummefaassend weist eis Studie, datt de Konzept vun der LB, deen bis elo haaptsächlech am Beräich vun der Biomedizin ugewannt gouf, eng räich, awer onerfuerscht Quell vu Wëssen kodéiert, déi benotzt ka ginn, fir d'Interaktioun tëscht Sentinel-Aarten an hirer Ëmwelt besser ze verstoen.
Nieft Primaten gouf och d'Isolatioun vun ccfDNA bei Mamendéieren, dorënner Mais, Hënn, Kazen a Päerd, gemellt [50, 51, 52]. Wéi och ëmmer, souwäit mir wëssen, ass eis Studie déi éischt, déi d'Detektioun an d'Sequenzéierung vun ccfDNA a Mieresarten mat engem oppene Kreeslafsystem bericht. Dës anatomesch Charakteristik a Filterfäegkeet vu Muschelen kéinten, zumindest deelweis, déi ënnerschiddlech Gréisstcharakteristike vu zirkulierenden DNA-Fragmenter am Verglach mat aneren Aarten erklären. Beim Mënsch sinn déi meescht DNA-Fragmenter, déi am Blutt zirkulieren, kleng Fragmenter mat enger Gréisst vun 150 bis 200 bp, mat engem maximalen Héichpunkt vun 167 bp [34, 53]. En klengen awer bedeitenden Deel vun den DNA-Fragmenter ass tëscht 300 a 500 bp grouss, an ongeféier 5% si méi laang wéi 900 bp. [54]. De Grond fir dës Gréisstenverdeelung ass, datt d'Haaptquell vun der ccfDNA am Plasma duerch Zelltod entsteet, entweder wéinst Zelltod oder wéinst Nekrose vu zirkulierenden hämatopoeteschen Zellen bei gesonde Persounen oder wéinst Apoptose vun Tumorzellen bei Kriibspatienten (bekannt als zirkulierend Tumor-DNA, ctDNA). D'Gréisstenverdeelung vun der Hämolymphe-ccfDNA, déi mir a Muschele fonnt hunn, louch tëscht 1000 an 5000 bp, wat drop hiweist, datt d'CCFDNA vun der Muschel en aneren Urspronk huet. Dëst ass eng logesch Hypothese, well Muschele e semi-oppent Gefässsystem hunn a a marinen aquateschen Ëmfeld liewen, déi héich Konzentratioune vu mikrobieller genomescher DNA enthalen. Tatsächlech hunn eis Laborexperimenter mat exogener DNA gewisen, datt Muschele DNA-Fragmenter am Mierwaasser accumuléieren, op d'mannst no e puer Stonnen ginn se no der Zellopnahm ofgebaut an/oder fräigesat an/oder a verschiddenen Organisatiounen gespäichert. Wéinst der Raritéit vun Zellen (souwuel prokaryotesch wéi och eukaryotesch), wäert d'Benotzung vun intravalvuläre Kompartimenter d'Quantitéit vun der ccfDNA aus eegenen Quellen souwéi aus auslännesche Quellen reduzéieren. Ënner Berécksiichtegung vun der Wichtegkeet vun der ugebuerner Immunitéit vu Muschelen an der grousser Zuel vu zirkulierenden Phagozyten, hu mir weider d'Hypothes opgestallt, datt souguer auslännesch ccfDNA mat zirkulierenden Phagozyten beräichert ass, déi friem DNA beim Ophuele vu Mikroorganismen an/oder Zellreschter accumuléieren. Zesummegefaasst weisen eis Resultater, datt d'ccfDNA vun der Muschelhemolymphe e spezielle Späicher vu molekulare Informatiounen ass a stäerkt hire Status als Sentinel-Aart.
Eis Donnéeën weisen drop hin, datt d'Sequenzéierung an d'Analyse vu bakteriellen Hämolymphe-ccfDNA-Fragmenter Schlësselinformatiounen iwwer d'Wirtbakterieflora an d'Bakterien, déi am ëmleiende marine Ökosystem präsent sinn, liwwere kënnen. Shot-Sequenzéierungstechniken hunn Sequenzen vun de kommensalen Bakterien A. atra Gill opgedeckt, déi verpasst gi wieren, wann konventionell 16S rRNA-Identifikatiounsmethoden benotzt gi wieren, deelweis wéinst engem Referenzbibliothéiksbias. Tatsächlech huet eis Notzung vun LB-Donnéeën, déi vu M. platensis an der selwechter Muschelschicht zu Kerguelen gesammelt goufen, gewisen, datt d'Zesummesetzung vun de kiemenassoziéierte bakteriellen Symbionten fir béid Muschelarten d'selwecht war (Fig. S4, Ergänzungsinformatiounen). Dës Ähnlechkeet vun zwou genetesch verschiddene Muschelen kéint d'Zesummesetzung vu Bakteriengemeinschaften an de kale, schwefelhaltegen a vulkaneschen Oflagerungen zu Kerguelen reflektéieren [55, 56, 57, 58]. Méi héich Niveaue vu schwefelreduzéierende Mikroorganismen goufen gutt beschriwwen, wann d'Muschelen aus bioturbéierte Küstegebidder geernt goufen [59], wéi der Küst vu Port-au-France. Eng aner Méiglechkeet ass, datt d'Flora vun de kommensalen Muschelen duerch horizontal Transmissioun beaflosst ka ginn [60, 61]. Méi Fuerschung ass néideg fir d'Korrelatioun tëscht dem Mieresëmfeld, der Uewerfläch vum Mierbuedem an der Zesummesetzung vu symbiotesche Bakterien a Muschelen ze bestëmmen. Dës Studien lafen de Moment.
D'Längt an d'Konzentratioun vun der Hämolymphe-ccfDNA, hir einfach Reinigung an hir héich Qualitéit, fir eng séier Shotgun-Sequenzéierung z'erméiglechen, sinn e puer vun de ville Virdeeler vun der Notzung vu Muschel-ccfDNA fir d'Biodiversitéit a marine Küstenökosystemer ze evaluéieren. Dësen Usaz ass besonnesch effektiv fir d'Charakteriséierung vu virale Gemeinschaften (Viromen) an engem bestëmmten Ökosystem [62, 63]. Am Géigesaz zu Bakterien, Archaea an Eukaryoten enthalen viral Genome keng phylogenetesch konservéiert Genen wéi 16S-Sequenzen. Eis Resultater weisen datt flësseg Biopsien vun Indikatorarten wéi Muschele kënne benotzt ginn, fir relativ grouss Zuelen vun ccfDNA-Virusfragmenter z'identifizéieren, déi bekannt sinn, fir Wirtsorganismen z'infizéieren, déi typescherweis a Küstenökosystemer liewen. Dëst beinhalt Virussen, déi bekannt sinn, fir Protozoen, Arthropoden, Insekten, Planzen a bakteriell Virussen (z.B. Bakteriophagen) z'infizéieren. Eng ähnlech Verdeelung gouf fonnt, wéi mir den Hämolymphe-ccfDNA-Virom vu Blomuschelen (M. platensis) ënnersicht hunn, déi an der selwechter Muschelschicht zu Kerguelen gesammelt goufen (Tabell S2, Ergänzungsinformatiounen). D'Shotgun-Sequenzéierung vun ccfDNA ass tatsächlech eng nei Approche, déi an der Studie vum Virom vum Mënsch oder aner Spezies Dynamik gewënnt [21, 37, 64]. Dës Approche ass besonnesch nëtzlech fir d'Studie vun Duebelstrang-DNA-Viren, well kee Gen ënner all Duebelstrang-DNA-Viren erhale bleift, wat déi diversst a breetst Klass vu Viren zu Baltimore representéiert [65]. Och wann déi meescht vun dëse Viren net klasséiert bleiwen a Viren aus engem komplett onbekannte Deel vun der viraler Welt enthalen kënnen [66], hu mir festgestallt, datt d'Viromen an d'Wirtsgebidder vun de Muschelen A. atra an M. platensis ähnlech tëscht den zwou Spezies leien (kuckt Figur S3, zousätzlech Informatiounen). Dës Ähnlechkeet ass net iwwerraschend, well se e Manktem u Selektivitéit bei der Opnam vun DNA, déi an der Ëmwelt präsent ass, reflektéiere kann. Zukünfteg Studien mat gereinegter RNA sinn de Moment néideg fir den RNA-Virom ze charakteriséieren.
An eiser Studie hu mir eng ganz rigoréis Pipeline benotzt, déi vun der Aarbecht vum Kowarski a Kollegen [37] adaptéiert gouf, déi eng zwee-Schrëtt-Deletioun vu gepoolte Liesungen a Contigs virun an no der Assemblage vun der nativer ccfDNA benotzt hunn, wat zu engem héije Prozentsaz vun net kartéierte Liesungen gefouert huet. Dofir kënne mir net ausschléissen, datt e puer vun dësen net kartéierte Liesungen nach ëmmer hiren eegenen Urspronk hunn, haaptsächlech well mir kee Referenzgenom fir dës Muschelart hunn. Mir hunn dës Pipeline och benotzt, well mir eis Suergen iwwer d'Chimären tëscht Selbst- a Net-Selbstliesungen an d'Lieslängten gemaach hunn, déi vum Illumina MiSeq PE75 generéiert ginn. En anere Grond fir déi meescht net kartéiert Liesungen ass, datt vill vun de marine Mikroben, besonnesch a wäiten Gebidder wéi Kerguelen, net annotéiert goufen. Mir hunn Illumina MiSeq PE75 benotzt, ënner der Viraussetzung datt ccfDNA-Fragmentlängten ähnlech wéi déi vum Mënsch ccfDNA sinn. Fir zukünfteg Studien, well eis Resultater weisen datt d'Hämolymphe ccfDNA méi laang Liesungen huet wéi Mënschen an/oder Mamendéieren, empfeelen mir eng Sequenzéierungsplattform ze benotzen, déi besser fir méi laang ccfDNA-Fragmenter gëeegent ass. Dës Praxis wäert et vill méi einfach maachen, méi Indikatiounen fir eng méi déifgräifend Analyse z'identifizéieren. D'Erhalen vun der aktuell net verfügbarer kompletter A. atra-Nukleargenomsequenz géif och d'Ënnerscheedung vun ccfDNA vu selbst- a net-selbstquellen däitlech erliichteren. Well eis Fuerschung sech op d'Méiglechkeet konzentréiert huet, de Konzept vun der flësseger Biopsie op Muschelen anzuwenden, hoffen mir, datt wann dëst Konzept an zukünfteger Fuerschung benotzt gëtt, nei Tools a Pipelines entwéckelt ginn, fir de Potenzial vun dëser Method fir d'Studie vun der mikrobieller Diversitéit vu Muschelen am marine Ökosystem ze erhéijen.
Als net-invasiven klineschen Biomarker sinn erhéicht mënschlech Plasma-Niveaue vun ccfDNA mat verschiddene Krankheeten, Gewebeschued a Stressbedingungen a Verbindung bruecht [67,68,69]. Dës Erhéijung ass mat der Fräisetzung vun DNA-Fragmenter vun eegenem Urspronk no Gewebeschued verbonnen. Mir hunn dëst Thema mat Hëllef vun akutem Hëtzestress behandelt, bei deem Muschele kuerz enger Temperatur vun 30 °C ausgesat waren. Mir hunn dës Analyse op dräi verschiddenen Aarte vu Muschele an dräi onofhängege Experimenter duerchgefouert. Mir hunn awer keng Ännerung vun den ccfDNA-Niveaue no akutem Hëtzestress festgestallt (kuckt Figur S5, zousätzlech Informatiounen). Dës Entdeckung kéint, zumindest deelweis, d'Tatsaach erklären, datt Muschele e semi-oppent Kreeslafsystem hunn a grouss Quantitéiten un friemer DNA accumuléieren wéinst hirer héijer Filteraktivitéit. Op der anerer Säit kënne Muschele, wéi vill Wierbeldéieren, méi resistent géint stressinduzéiert Gewebeschued sinn, wouduerch d'Fräisetzung vun ccfDNA an hirer Hämolymphe limitéiert gëtt [70, 71].
Bis elo huet sech d'DNA-Analyse vun der Biodiversitéit an aquateschen Ökosystemer haaptsächlech op d'Metabarcodéierung vun der Ëmwelt-DNA (eDNA) konzentréiert. Dës Method ass awer normalerweis limitéiert an der Biodiversitéitsanalyse, wann Primer benotzt ginn. D'Benotzung vun der Shotgun-Sequenzéierung ëmgeet d'Limiten vun der PCR an der verzerrter Auswiel vu Primer-Sets. Dofir ass eis Method an engem Sënn méi no un der kierzlech benotzter High-Throughput eDNA Shotgun-Sequenzéierungsmethod, déi fäeg ass, fragmentéiert DNA direkt ze sequenzéieren an bal all Organismen z'analyséieren [72, 73]. Et gëtt awer eng Rei vu fundamentale Problemer, déi LB vun de Standard-eDNA-Methoden ënnerscheeden. Natierlech ass den Haaptunterschied tëscht eDNA an LB d'Benotzung vun natierleche Filterwirten. D'Benotzung vu Marinearten wéi Schwämmen a Muschelen (Dresseina spp.) als natierleche Filter fir d'Studie vun eDNA gouf gemellt [74, 75]. D'Studie vum Dreissena huet awer Gewebebiopsien benotzt, aus deenen d'DNA extrahéiert gouf. D'Analyse vun der ccfDNA aus LB erfuerdert keng Gewebebiopsie, spezialiséiert an heiansdo deier Ausrüstung a Logistik am Zesummenhang mat eDNA oder Gewebebiopsie. Tatsächlech hu mir viru kuerzem bericht, datt ccfDNA aus LB mat FTA-Ënnerstëtzung gespäichert a analyséiert ka ginn, ouni eng kal Kette z'erhalen, wat eng grouss Erausfuerderung fir d'Fuerschung a wäit ewechgeleeëne Gebidder ass [76]. D'Extraktioun vu ccfDNA aus flëssege Biopsien ass och einfach a liwwert héichqualitativ DNA fir Shotgun-Sequenzéierung an PCR-Analyse. Dëst ass e grousse Virdeel, wann een e puer vun den techneschen Aschränkungen am Zesummenhang mat der eDNA-Analyse berécksiichtegt [77]. D'Einfachheet an déi niddreg Käschte vun der Proufnahmemethod si besonnesch gëeegent fir laangfristeg Iwwerwaachungsprogrammer. Nieft hirer héijer Filterfäegkeet ass eng aner bekannt Eegeschaft vu Muschelen déi chemesch Mukopolysaccharid-Zesummesetzung vun hirem Schleim, déi d'Absorptioun vu Virussen fördert [78, 79]. Dëst mécht Muschelen zu engem idealen natierleche Filter fir d'Biodiversitéit an den Impakt vum Klimawandel an engem bestëmmten aquateschen Ökosystem ze charakteriséieren. Och wann d'Präsenz vun DNA-Fragmenter, déi vum Wirt ofgeleet sinn, als eng Aschränkung vun der Method am Verglach mat eDNA ka gesi ginn, sinn d'Käschten, déi mat sou enger nativer ccfDNA am Verglach mat eDNA verbonne sinn, gläichzäiteg verständlech fir déi grouss Quantitéit un Informatiounen, déi fir Gesondheetsstudien verfügbar sinn. Dëst beinhalt d'Präsenz vu virale Sequenzen, déi am Genom vum Wirt integréiert sinn. Dëst ass besonnesch wichteg fir Muschelen, well horizontal iwwerdroe leukemesch Retrovirussen a Muschelen virkommen [80, 81]. En anere Virdeel vu LB géintiwwer eDNA ass, datt et d'phagozytesch Aktivitéit vu zirkulierenden Bluttzellen an der Hämolymphe ausnotzt, déi Mikroorganismen (an hir Genomer) opschléit. Phagozytose ass déi Haaptfunktioun vu Bluttzellen a Muschelen [82]. Schlussendlech notzt d'Method déi héich Filterkapazitéit vu Muschelen (duerchschnëttlech 1,5 l/h Mierwaasser) an déi zwee Deeg laang Zirkulatioun, déi d'Vermëschung vu verschiddene Schichten aus Mierwaasser erhéijen an d'Erfassung vun heterologer eDNA erlaben. [83, 84]. Dofir ass d'Analyse vun der ccfDNA vu Muschelen eng interessant Méiglechkeet, wann een d'Ernärungs-, wirtschaftlech an ökologesch Auswierkunge vu Muschelen berécksiichtegt. Ähnlech wéi d'Analyse vu LB, déi vu Mënsche gesammelt gëtt, eröffnet dës Method och d'Méiglechkeet, genetesch an epigenetesch Verännerungen an der Wirts-DNA als Reaktioun op exogen Substanzen ze moossen. Zum Beispill kënnen Drëttgeneratiouns-Sequenzéierungstechnologien virgesinn ginn, fir genomwäit Methylierungsanalysen an nativer ccfDNA mat Hëllef vun Nanopore-Sequenzéierung duerchzeféieren. Dëse Prozess sollt duerch d'Tatsaach erliichtert ginn, datt d'Längt vun de Muschel-ccfDNA-Fragmenter idealerweis mat Long-Read-Sequenzéierungsplattforme kompatibel ass, déi eng genomwäit DNA-Methylierungsanalyse vun engem eenzege Sequenzéierungslaf ouni d'Noutwendegkeet vu chemesche Transformatiounen erlaben.85,86] Dëst ass eng interessant Méiglechkeet, well et gewisen gouf, datt DNA-Methylierungsmuster eng Reaktioun op Ëmweltstress reflektéieren a sech iwwer vill Generatiounen uhalen. Dofir kann et wäertvoll Abléck an déi zugronnleeënd Mechanismen ubidden, déi d'Reaktioun no der Belaaschtung duerch Klimawandel oder Schadstoffer reguléieren [87]. D'Benotzung vu LB ass awer net ouni Grenzen. Natierlech erfuerdert dëst d'Präsenz vun Indikatorarten am Ökosystem. Wéi uewe scho gesot, erfuerdert d'Benotzung vu LB fir d'Biodiversitéit vun engem bestëmmten Ökosystem ze bewäerten och eng rigoréis Bioinformatik-Pipeline, déi d'Präsenz vun DNA-Fragmenter vun der Quell berücksichtegt. En anert grousst Problem ass d'Disponibilitéit vu Referenzgenomen fir Mieresarten. Et gëtt gehofft, datt Initiativen wéi de Marine Mammal Genomes Project an de kierzlech gegrënnte Fish10k Projet [88] sou eng Analyse an Zukunft erliichteren. D'Uwendung vum LB-Konzept op marine Filterernährungsorganismen ass och kompatibel mat de leschten Fortschrëtter an der Sequenzéierungstechnologie, wat et gutt geegent mécht fir d'Entwécklung vu Multi-Ohm-Biomarker, fir wichteg Informatiounen iwwer d'Gesondheet vu marine Liewensraim als Reaktioun op Ëmweltstress ze liwweren.
D'Genomsequenzéierungsdaten goufen am NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ënner Bioprojects SRR8924808 deposéiert.
Brierley AS, Kingsford MJ Auswierkunge vum Klimawandel op d'Mieresliewen an d'Ökosystemer. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Betruecht déi kombinéiert Auswierkunge vum Klimawandel an aner lokalen Stressoren op d'Mieresëmwelt. general scientific environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Wëssenschaft vum éischte Mäerz. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduzéiert Hëtzttoleranz ënner widderhuelende Hëtztstressbedingungen erkläert déi héich Summermortalitéit vu Muschelen. Wëssenschaftleche Bericht 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Rezent Ännerungen an der Frequenz, den Ursaachen an dem Ausmooss vun Déierdouden. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Multiple net-spezifesch Pathogenen hu vläicht Massestierflechkeet vu Pinna nobilis verursaacht. Liewen. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Méiglech Auswierkunge vum Klimawandel op zoonotesch Krankheeten an der Arktis. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blo Miesmuschelen (Mytilus edulis spp.) als Signalorganismen an der Iwwerwaachung vun der Küstenverschmotzung: e Réckbléck. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integratioun vu flësseger Biopsie an der Kriibsbehandlung. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Flësseg Biopsie Reifung: Erlaabt Tumor-DNA ze zirkulieren. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsäuren am mënschleche Plasma. Protokoll vun der Versammlung vun de Soc Biol Duechtergesellschaften. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Eng nei Roll fir zellfräi DNA als molekulare Marker fir Kriibsbehandlung. Quantifizéierung vun der biomolarer Analyse. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flësseg Biopsie kënnt an d'Klinik - Ëmsetzungsproblemer a zukünfteg Erausfuerderungen. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW an anerer. Fetal DNA ass am Plasma a Serum vun der Mamm präsent. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie iwwer de Verlaf vun der Schwangerschaft a seng Komplikatiounen mat Hëllef vun zirkulierender extrazellulärer RNA am Blutt vu Fraen während der Schwangerschaft. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Flësseg Biopsie: Spenderzellfräi DNA gëtt benotzt fir allogen Läsionen an engem Nierentransplantat z'entdecken. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovatiounen an der pränataler Diagnostik: Genomsequenzéierung vum maternelle Plasma. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Schnell Detektioun vu Pathogenen mat der metagenomescher Sequenzéierung vun der nächster Generatioun vun infizéierte Kierperflëssegkeeten. Nat Medicine. 2021;27:115-24.