Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript maachen.
Et gëtt e Bedierfnes fir en zouverléissege In vitro System deen d'physiologesch Ëmfeld vum Häerz fir Drogentest präzis reproduzéieren kann.Déi limitéiert Verfügbarkeet vu mënschlechen Häerzgewebe Kultursystemer huet zu ongenauen Interpretatioune vu kardiologeschen Drogeneffekter gefouert.Hei hu mir e Herzgewebekulturmodell (CTCM) entwéckelt, deen d'Häerzscheiwen elektromechanesch stimuléiert a physiologesch Ausdehnung während der systolescher an diastolescher Phase vum Herzzyklus erliewt.No 12 Deeg Kultur huet dës Approche deelweis d'Viabilitéit vun Häerzschnëtter verbessert, awer hir strukturell Integritéit net voll erhaalen.Dofir, no klenge Molekül Duerchmusterung, hu mir festgestallt datt d'Zousatz vun 100 nM Triiodothyronin (T3) an 1 μM Dexamethason (Dex) zu eisem Medium d'Mikrostruktur vun de Sektiounen fir 12 Deeg behalen.A Kombinatioun mat T3 / Dex Behandlung huet de CTCM System Transkriptiounsprofile, Viabilitéit, metabolesch Aktivitéit a strukturell Integritéit um selwechten Niveau wéi frësch Häerzgewebe fir 12 Deeg behalen.Zousätzlech induzéiert exzessiv Ausdehnung vum Häerzgewebe an der Kultur hypertrophesch Herzsignaléierung, déi Beweiser fir d'Fäegkeet vum CTCM fir hypertrophesch Bedéngungen ze mimikéieren, déi duerch d'Herzstreck induzéiert sinn.Als Conclusioun kann CTCM d'Physiologie an d'Pathophysiologie vum Häerz an der Kultur iwwer laang Zäit modelléieren, wat zuverlässeg Drogenscreening erméiglecht.
Virun der klinescher Fuerschung sinn zouverlässeg In vitro Systemer gebraucht, déi d'physiologesch Ëmfeld vum mënschleche Häerz präzis reproduzéieren kënnen.Esou Systemer solle verännert mechanesch Streck, Häerzgeschwindegkeet an elektrophysiologesch Eegeschafte mimikéieren.Déiermodeller ginn allgemeng als Screeningplattform fir Häerzphysiologie benotzt mat limitéierter Zouverlässegkeet fir d'Effekter vun Drogen am mënschleche Häerz ze reflektéieren1,2.Schlussendlech ass den Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) e Modell deen héich sensibel a spezifesch ass fir verschidde therapeutesch an pharmakologesch Interventiounen, déi d'Physiologie an d'Pathophysiologie vum mënschlechen Häerz präzis reproduzéieren3.D'Feele vu sou engem System limitéiert d'Entdeckung vun neie Behandlungen fir Häerzversoen4,5 an huet zu Drogenkardiotoxizitéit gefouert als e wichtege Grond fir de Maart ze verloossen6.
An de leschte Jorzéngt sinn aacht net-kardiovaskulär Medikamenter aus der klinescher Benotzung zréckgezunn, well se QT-Intervallverlängerung verursaachen, wat zu ventrikulären Arrhythmien a plötzlechen Doud féiert7.Also ass et ëmmer méi Bedierfnes fir zouverlässeg preklinesch Screeningstrategien fir kardiovaskulär Effizienz an Toxizitéit ze bewäerten.Déi rezent Notzung vu mënschlech-induzéierter pluripotenter Stammzell-ofgeleet Kardiomyozyten (hiPS-CM) am Drogenscreening an Toxizitéitstest bitt eng deelweis Léisung fir dëse Problem.Wéi och ëmmer, déi onreifend Natur vun HiPS-CMs an de Mangel u multicellularer Komplexitéit vum Herzgewebe si grouss Aschränkungen vun dëser Method.Rezent Studien hu gewisen datt dës Begrenzung deelweis iwwerwonne ka ginn andeems se fréi HiPS-CM benotzt fir Häerzgewebe Hydrogelen ze bilden kuerz nom Ufank vu spontane Kontraktiounen a graduell eropgoen elektresch Stimulatioun iwwer Zäit.Wéi och ëmmer, dës hiPS-CM Mikrotissue feelen déi reife elektrophysiologesch a kontraktile Eegeschafte vum erwuessene Myokardium.Zousätzlech huet de mënschleche Herzgewebe eng méi komplex Struktur, besteet aus enger heterogener Mëschung vu verschiddenen Zelltypen, dorënner Endothelzellen, Neuronen a stromal Fibroblasten, matenee verbonne mat spezifesche Sets vun extrazelluläre Matrixproteine.Dës Heterogenitéit vun Net-Cardiomyocyte Populatiounen11,12,13 am erwuessene Mamendéieren Häerz ass eng grouss Barrière fir d'Herzgewebe ze modelléieren mat individuellen Zelltypen.Dës grouss Aschränkungen ënnersträichen d'Wichtegkeet vun der Entwécklung vu Methoden fir intakt Myokardialgewebe ënner physiologeschen a pathologesche Bedéngungen ze kultivéieren.
Kulturéiert dënn (300 µm) Sektioune vum mënschleche Häerz hunn bewisen e verspriechende Modell vun intakt mënschlecht Myokardium ze sinn.Dës Method gëtt Zougang zu engem kompletten 3D multicelluläre System ähnlech wéi mënschlecht Häerzgewebe.Wéi och ëmmer, bis 2019 war d'Benotzung vu kultivéierten Häerzsektioune limitéiert duerch déi kuerz (24 h) Kultur Iwwerliewe.Dëst ass wéinst enger Rei vu Faktoren, dorënner de Mangel u kierperlech-mechanesch Stretch, d'Loft-Flësseg-Interface, an d'Benotzung vun einfache Medien, déi d'Bedierfnesser vum Herzgewebe net ënnerstëtzen.Am Joer 2019 hu verschidde Fuerschungsgruppen bewisen datt d'Integratioun vu mechanesche Faktoren an d'Häerzgewebekultursystemer d'Kulturliewen verlängeren, den Häerzausdrock verbesseren an d'Herzpathologie mimikéieren.Zwee elegant Studien 17 an 18 weisen datt uniaxial mechanesch Belaaschtung e positiven Effekt op d'Herzphänotyp während der Kultur huet.Allerdéngs hunn dës Studien net déi dynamesch dreidimensional physesch-mechanesch Belaaschtung vum Herzzyklus benotzt, well d'Häerzsektioune mat entweder isometresche Spannkraaft 17 oder linear auxotonic Belaaschtung 18 gelueden goufen.Dës Methode vum Tissue-Stretching hunn zu der Ënnerdréckung vu ville Herzgenen oder der Iwwerexpressioun vun Genen gefouert, déi mat anormalen Stretchreaktiounen assoziéiert sinn.Notamment, Pitoulis et al.19 entwéckelt eng dynamesch Häerzschnëttkulturbad fir Herzzyklusrekonstruktioun mat Hëllef vu Kraafttransducer Feedback a Spannungsdriven.Och wann dëse System eng méi präzis In vitro Herzzyklusmodelléierung erméiglecht, limitéiert d'Komplexitéit an den nidderegen Duerchsatz vun der Method d'Applikatioun vun dësem System.Eise Labo huet viru kuerzem e vereinfachte Kultursystem entwéckelt mat elektrescher Stimulatioun an engem optimiséierte Medium fir d'Viabilitéit vu Sektioune vu Schwein a mënschlecht Häerzgewebe fir bis zu 6 Deeg z'erhalen20,21.
Am aktuellen Manuskript beschreiwen mir e Herzkierperkulturmodell (CTCM) mat Sektioune vum Schweinhäerz, deen humoral Hiweiser integréiert fir dräi-zweedimensional Herzphysiologie a pathophysiologesch Ausdehnung während dem Herzzyklus ze rekapituleren.Dës CTCM kann d'Genauegkeet vun der pre-klinescher Medikamentprevisioun op e Niveau erhéijen, deen ni virdru erreecht gouf andeems en e kosteneffektiven, mid-throughput-Herzsystem ubitt, deen d'Physiologie / Pathophysiologie vum Mamendéierenhäerz fir pre-klinesch Drogentest mimics.
Hämodynamesch mechanesch Signaler spillen eng kritesch Roll beim Erhalen vun der Kardiomyozytfunktioun in vitro 22,23,24.Am aktuellen Manuskript hu mir e CTCM entwéckelt (Dorënner 1a) deen d'Erwuessene Häerz-Ëmfeld mimiéiere kann andeems se souwuel elektresch wéi mechanesch Stimulatioun bei physiologeschen Frequenzen (1,2 Hz, 72 Beats pro Minutt) induzéieren.Fir exzessiv Tissuestrecken während der Diastole ze vermeiden, gouf en 3D-Drockapparat benotzt fir Tissuegréisst ëm 25% ze erhéijen (Fig. 1b).Elektresch Pacing induzéiert vum C-PACE System gouf ugepasst fir 100 ms virum Systole unzefänken mat engem Datenacquisitiounssystem fir den Herzzyklus voll ze reproduzéieren.De Tissuekultursystem benotzt e programméierbaren pneumateschen Aktuator (LB Engineering, Däitschland) fir eng flexibel Silikonmembran zyklesch auszebauen fir Expansioun vun den Häerzschnëtt an der ieweschter Chamber ze verursaachen.De System gouf mat enger externer Loftlinn duerch en Drocktransducer verbonnen, wat et méiglech gemaach huet den Drock (± 1 mmHg) an d'Zäit (± 1 ms) (Fig. 1c) präzis unzepassen.
a Befestegt den Tissuesektioun un den 7 mm Supportring, blo gewisen, an der Kulturkammer vum Apparat.D'Kulturkammer gëtt vun der Loftkammer duerch eng dënn flexibel Silikonmembran getrennt.Plaz eng Dichtung tëscht all Chamber fir Leckage ze vermeiden.Den Deckel vum Apparat enthält Grafitelektroden déi elektresch Stimulatioun ubidden.b Schematesch Representatioun vun der grousser Otemschwieregkeeten Apparat, Guide Ring an Ënnerstëtzung Ring.D'Tissue-Sektiounen (brong) ginn op den iwwerdriwwenen Apparat mat dem Guidering an der Groove op der äusserst Rand vum Apparat plazéiert.Benotzt de Guide, plazéiert virsiichteg den Ënnerstëtzungsring, deen mat Tissue-Acrylklebstoff beschichtet ass, iwwer d'Sektioun vum Häerzgewebe.c Grafik weist d'Zäit vun der elektrescher Stimulatioun als Funktioun vum Loftkammerdrock kontrolléiert vun engem programméierbare pneumateschen Aktuator (PPD).En Datenacquisitiounsapparat gouf benotzt fir elektresch Stimulatioun mat Drocksensoren ze synchroniséieren.Wann den Drock an der Kulturkammer de festgeluegte Schwell erreecht, gëtt e Pulssignal un d'C-PACE-EM geschéckt fir elektresch Stimulatioun auszeléisen.d Bild vu véier CTCMs op engem Inkubator Regal gesat.Véier Apparater si mat engem PPD iwwer e pneumatesch Circuit verbonnen, an Drocksensoren ginn an den hemostatesche Ventil agebaut fir den Drock am pneumatesche Circuit ze iwwerwaachen.All Apparat enthält sechs Tissue Sektiounen.
Mat engem eenzegen pneumateschen Aktuator konnte mir 4 CTCM-Geräter kontrolléieren, jidderee vun deenen 6 Tissue-Sektiounen halen (Fig. 1d).Am CTCM gëtt de Loftdrock an der Loftkammer zum Synchronen Drock an der Flëssegkeetskammer ëmgewandelt an induzéiert physiologesch Expansioun vum Häerzschnëtt (Figur 2a an Ergänzungsfilm 1).Evaluatioun vun Tissue Stretch bei 80 mm Hg.Art.gewisen Stretching vun Otemschwieregkeeten Rubriken vun 25% (Fig. 2b).Dëse Prozentsaz Stretch gouf gewisen fir eng physiologesch Sarkomerlängt vun 2,2-2,3 µm fir normal Herzsektioun Kontraktilitéit17,19,25 ze korrespondéieren.Tissuebewegung gouf mat personaliséierte Kamera-Astellunge bewäert (Ergänzungsbild 1).D'Amplitude an d'Geschwindegkeet vun der Tissuebewegung (Fig. 2c, d) entsprécht während dem Herzzyklus an der Zäit während der Systole an der Diastole (Fig. 2b).D'Stretch an d'Geschwindegkeet vum Herzkierper während der Kontraktioun an der Entspanung blouf konstant fir 12 Deeg an der Kultur (Fig. 2f).Fir den Effekt vun der elektrescher Stimulatioun op Kontraktilitéit während der Kultur ze evaluéieren, hu mir eng Method entwéckelt fir eng aktiv Deformitéit ze bestëmmen mat engem Schattenalgorithmus (Ergänzungsbild 2a, b) a konnten tëscht Deformatiounen mat an ouni elektresch Stimulatioun z'ënnerscheeden.Déi selwecht Sektioun vum Häerz (Fig. 2f).An der bewegbarer Regioun vum Schnëtt (R6-9) war d'Spannung während der elektrescher Stimulatioun 20% méi héich wéi an der Ofwuelung vun der elektrescher Stimulatioun, wat de Bäitrag vun der elektrescher Stimulatioun zur kontraktile Funktioun weist.
Representativ Spure vum Loftkammerdrock, Flëssegkeetskammerdrock an Tissuebewegungsmiessungen bestätegen datt de Kammerdrock de Flëssegkeetskammerdrock ännert, wat eng entspriechend Bewegung vun der Tissueschneiss verursaacht.b Representativ Spure vun Prozentsaz Streck (blo) vun Tissue Rubriken entspriechend Prozent Streck (orange).c Déi gemoossene Bewegung vun der Häerzschnëtt ass konsequent mat der gemoosser Beweegungsgeschwindegkeet.(d) Representativ Trajectoiren vun der zyklescher Bewegung (blo Linn) a Geschwindegkeet (orange gestippte Linn) an engem Scheck vum Häerz.e Quantifikatioun vun Zykluszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schweine), Kontraktiounszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp), Entspanungszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schweine), Tissuebewegung (n = 25).Scheiwen) / Grupp vu verschiddene Schweine), Héichpunkt systolesch Geschwindegkeet (n = 24 (D0), 25 (D12) Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schweine) a Peak Relaxatiounsquote (n = 24 (D0), 25 (D12) Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schwäin).Zwee-tailed Student d'T-Test huet kee groussen Ënnerscheed zu all Parameter gewisen.f Representativ Stammanalyse Spure vun Tissue Sektiounen mat (rout) an ouni (blo) elektresch Stimulatioun, zéng regional Beräicher vun Tissue Sektiounen aus der selwechter Rubrik.Déi ënnescht Paneele weisen d'Quantifizéierung vum Prozentsaz Ënnerscheed an der Belaaschtung an Tissue Sektiounen mat an ouni elektresch Stimulatioun an zéng Gebidder aus verschiddene Sektiounen. (n = 8 Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student T-Test gëtt gemaach; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student T-Test gëtt gemaach; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,01. (n = 8 Sektiounen/Grupp aus verschiddene Schwäin, zwee-tailed Student's t-Test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 Sektiounen / Grupp, vu verschiddene Schwäin, zwee-tailed Student d'T-Test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± Standarddeviatioun.
An eisem fréiere statesche biomimetesche Häerzschnëttkultursystem [20, 21], hu mir d'Viabilitéit, d'Funktioun an d'strukturell Integritéit vun den Häerzschnëss fir 6 Deeg behalen andeems mir elektresch Stimulatioun applizéieren an d'mëttel Zesummesetzung optimiséieren.Allerdéngs sinn dës Zuelen no 10 Deeg staark erofgaang.Mir bezéien eis un Sanktiounen - Ech beschiedegen an eiser bed Statichhaftescher Kulturfast Comitalkonditic, a mir benotzen eise Coursen als eventueller Medium).genannt.Éischtens, festhuele mer eis villanesch Stimulatioun, déi net genuch war fir Tissu vu 6 Deeg (Zoufälleg Figur ze halen. 3 Deeg (Zousaz Fig. 3 DeegInteressanterweis, mat der Aféierung vun physio-mechanesch an elektresch Stimulatioun mat STCM, ass d'Viabilitéit vun 12-Deeg Häerz Sektiounen déi selwecht bliwwen wéi an frësch Häerz Rubriken ënner MS Konditiounen, awer net ënner Ctrl Konditiounen, wéi duerch MTT Analyse gewisen (Fig. 1).3a).Dëst proposéiert déi mechanesch Stimulatioun an Simulatioun vum Contacy Zyklus kann d'Tissue Sektorsvisionen déi an eisem statesche Kultur System bericht hunn.D'Bewäertung vun der strukturell Integritéit vun Tissu Sektiounsverbrauch vu Kardiaac Troonin t a Verbindung am Dag op McAllerdéngs waren eenheetlech connexin 43 Ausdrock an Z-disc Opstellung net voll erhale bleiwen (Lalumi 3b).Mir stellen eng kënschtlech Interlligeratioun (AI) Kader fir Tissiounen Archebe Integritéit26, e Bild-baséiert déi strukturell Integritéit am Beräich vun der Schoulprioritéit fir d'Struktur vu Lokalisatioun auszeschléissen.Dës Method benotzt en convolutionalen neurale Netzwierk (CNN) an en déiwen Léierendrahlform fir zouverlässeg ze zorifer Integritéit vun der Cardiac Tissu, wéi an der Inspizated an onbestänneg an onbestännegt Manéier26. MC Tissu huet verbessert strukturell Ähnlechkeet mam Dag 0 am Verglach mat statesche Kontroll Sektiounen.Zousätzlech, masson Trichorme staining e wesentleche Prozentsaz vu Fibrosis ënner m msbestänn am Verglach zum Dag vun den Dag vun der Kultur (Figcc).Do iwwer CTCm ass d'Vokaler géint Häerzen Tissiounen am Dag fir all Dag wéi wier d'strecklech Intressheet vum Häerz Tissiounen verbesseren, awer dat vu dee strukturell Integritéit vum Häerz Tissiounen net verbesseren.
e Bar Grafik weist Quantifikatioun vun der MTT Viabilitéit vun frësch Häerz Scheiwen (D0) oder Häerz Scheiwen Kultur fir 12 Deeg entweder an statesch Kultur (D12 Ctrl) oder an CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Scheiwen duerchgefouert ANO pig / #0, # 0 verschidde Manéieren ANO pig / # 0; 01 am Verglach zum D0 an **p < 0,01 am Verglach zum D12 Ctrl). e Bar Grafik weist Quantifikatioun vun der MTT Viabilitéit vun frësch Häerz Scheiwen (D0) oder Häerz Scheiwen Kultur fir 12 Deeg entweder an statesch Kultur (D12 Ctrl) oder an CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Scheiwen vun engem Wee VA / # 0; 001 am Verglach zum D0 an **p <0,01 am Verglach zum D12 Ctrl).den Histogramm weist d'Quantifizéierung vun der Viabilitéit vu MTT Frësch Häerz Sektiounen (D0) oder Kultur vun Häerz Sektiounen fir 12 Deeg an entweder statesch Kultur (D12 Kontroll) oder CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontroll).####p < 0,0001 bei D0 an **p < 0,01 mat D12 Ctrl). ####p < 0,0001 am Verglach zum D0 an **p < 0,01 am Verglach zum D12 Ctrl). 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测踎D ４； 0； 0；0#0.#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心不脏別片(D0 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**pHistogramm weist d'Quantifizéierung vun der MTT Viabilitéit a frësche Häerzsektiounen (D0) oder Häerzsektiounen, déi fir 12 Deeg an der statesch Kultur (D12 Kontroll) oder CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontroll)) kultivéiert goufen, 12 (D12 MC) Sektiounen / Grupp aus verschiddene ANOVA-Sektiounen;####p < 0,0001 bei D0, **p < 0,01 mat D12 Ctrl). ####p < 0,0001 am Verglach zum D0, **p < 0,01 am Verglach zum D12 Ctrl).b Troponin-T (gréng), Connexin 43 (rout) an DAPI (blo) a frësch isoléiert Häerz Sektiounen (D0) oder Häerz Sektiounen cultured ënner statesch Konditiounen (Ctrl) oder CTCM Konditiounen (MC) fir 12 Deeg) vun representativ immunofluorescence Biller (eidel Skala = 100 µm). Kënschtlech Intelligenz Quantifikatioun vun der Strukturell Integritéit vum Häerzgewebe (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen / Grupp jidderee vu verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA Test gëtt gemaach; ####p <0.0001 am Verglach zum D0 an D100 <1 am Verglach zu 0.000. Kënschtlech Intelligenz Quantifikatioun vun der Strukturell Integritéit vum Häerzgewebe (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen / Grupp jidderee vu verschiddene Schweine, Een-Wee ANOVA Test gëtt gemaach; ####p <0.0001 am Verglach zum D0 an ****p <10. Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сD 12), прег (D12 сD) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 op сравнению с D0 an ****p < 0,0001 op D12х Ctrl). Quantifikatioun vun der struktureller Integritéit vum Herzgewebe duerch kënschtlech Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Sektiounen / Gruppen aus verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA Test gemaach; ####p <0.0001 vs.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen/Grupp jeweils vu verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA-Test <1 ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen/Grupp jiddereng vun de verschiddene Schweine, e-Wee 0#整 0Va-Test <0 ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект fir количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl), преков (D512) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. Kënschtlech Intelligenz fir d'strukturell Integritéit vum Herzgewebe ze quantifizéieren (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Sektiounen / Grupp jidderee vu verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA Test; ####p<0.0001 vs .D0 <Vergleich 0.****0201. c Representativ Biller (lénks) a Quantifizéierung (riets) fir Häerzstécker gefierft mam Masson's Trichrome Fleck (Skala kaal = 500 µm) (n = 10 Scheiwen / Grupp jidderee vu verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA Test gëtt gemaach; ####p <0.0001 am Verglach zu D0 an D0.*** Ctrl am Verglach <D0 an 120p Ctrl). C representativ Biller (lénks) an d'Quantifikatioun am Verglach zu D0 a *** P <0,00 Triona am Verglach zu D12 CTRL). c Репрезентативные изображения (слева) a количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тесполница тесно ### ANO 0 0; D0 an ***p < 0,001 mat D12 Ctrl). c Representativ Biller (lénks) a Quantifizéierung (riets) vun Häerzschnëtter gefierft mam Masson Trichrome Fleck (onbeschichtete Skala = 500 µm) (n = 10 Sektiounen / Grupp vu verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA Test gemaach; #### p <0 .0001 am Verglach zu D0 an .***01 am Verglach mat D0 an .***0p Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裼=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 与D0 相比，01p Ctrl <0.1***D . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壺庰 帺壺庰 帺 庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 跑 0##0 浵 0 0 ##0相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) a количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром я шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофогоного ;### #p < 0,0001 bei D0, ***p < 0,001 mat D12 Ctrl). c Representativ Biller (lénks) a Quantitatioun (riets) vun Häerzschnëtter gefierft mam Masson's Trichrome Fleck (Leer = 500 µm) (n = 10 Sektiounen / Grupp, jidderee vun engem anere Schwäin, getest duerch een-Wee Varianzanalyse ;### # p <0.0001 am Verglach zu D0,10***p <D0.Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± Standarddeviatioun.
Mir hunn hypothetiséiert datt andeems kleng Molekülen zum Kulturmedium bäigefüügt ginn, d'Kardiomyozytenintegritéit kéint verbessert ginn an d'Fibrose Entwécklung reduzéiert wärend der CTCM Kultur.Mir hunn dofir op kleng Moleküle gescannt mat eise statesche Kontrollkulturen20,21 wéinst der klenger Zuel vu verwiessele Faktoren.Dexamethason (Dex), Triiodothyronin (T3), an SB431542 (SB) goufen fir dësen Écran gewielt.Dës kleng Moleküle goufen virdru an hiPSC-CM Kulturen benotzt fir Reifung vu Kardiomyozyten ze induzéieren andeems d'Sarkomerlängt, T-Tubelen an d'Leedungsgeschwindegkeet erhéijen.Zousätzlech si souwuel Dex (e Glukokortikoid) wéi och SB bekannt fir Entzündung z'ënnerdrécken29,30.Dofir hu mir getest ob d'Inklusioun vun engem oder enger Kombinatioun vun dëse klenge Moleküle d'strukturell Integritéit vun Häerzsektiounen verbessert.Fir initial Duerchmusterung, gouf d'Dosis vun all Verbindung ausgewielt baséiert op der Konzentratioune allgemeng an Zell Kultur Modeller benotzt (1 μM Dex27, 100 nM T327, an 2,5 μM SB31).No 12 Deeg Kultur huet d'Kombinatioun vun T3 an Dex zu enger optimaler Kardiomyocyte struktureller Integritéit a minimale fibrous Remodeling gefouert (Ergänzungsfiguren 4 a 5).Zousätzlech, Benotzung vun duebel oder duebel dës Konzentratioune vun T3 an Dex produzéiert schiedlech Effekter am Verglach zu normal Konzentratioune (Ergänzlech Lalumi 6a, b).
No der initialitéiert mir e Kapp - un der Spond-Verglach vu 15 Kulturbrauch (Figo Loun: Beglag-Secteur, déi d'Medium bedentter musse, avitatesch Kultur, a geprägt Medium20.21 TD: T3 an Ctrl s Dobäi Dex Mëttwoch;MC: Häerz Sektiounen an CTCM kultivéiert mat eisem virdru optimiséierte Medium;an MT: CTCM mat T3 an Dex der mëttelfristeg dobäi.No 12 Deeg Kultivatioun blouf d'Viabilitéit vu MS a MT Stoffer déiselwecht wéi a frësche Stoffer, déi duerch MTT Assay bewäert ginn (Fig. 4b).Dofir hunn d'Zousatz vun T3 an dex fir Kulturen (TD) gefouert op dat heescht an der ganzerstellung vun der Händlerinatioun am Koign wat deen eng wichteg Roll de Ministesch Konditiounen esouicht deen esou erfällt an dëser këlleger Staatkeet
e Experimentell Designdiagramm deen déi véier Kulturbedéngungen ausbildt, déi benotzt gi fir d'Effekter vun der mechanescher Stimulatioun an der T3 / Dex Ergänzung op Medium fir 12 Deeg ze evaluéieren. b Bar Grafik weist Quantifizéierung vun Viabilitéit 12 Deeg Post Kultur an all 4 Kultur Konditiounen (Ctrl, TD, MC, an MT) am Verglach mat frësch Häerz Scheiwen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), 12 (D12 MC) Scheiwen ausgefouert, # 0 Pigs / Grupp, # 0 verschidde Manéieren ANO / Grupp, # 0; 001, ###p < 0,001 am Verglach zum D0 an **p < 0,01 am Verglach zum D12 Ctrl). B Bar = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), 12 (D12 MC) Scheiwen / Grupp, MC, MC, MC <0SPLUS AUS AN MTSULT AN PTS) ATSPLE AN DÉI AN DI BA = N = 18 (D0 WAFFT EIGLISCH AM1N.S12 POST), 12 (D12 MC) SLIGS / Grupp aus verschiddene Anoo-Asa am Verglach verglach mam D12 Ctrl). B ass d'Bargalesch Grafscriptéiert / Grupp vu verschiddene Pigelen, ee-Wee Ano Anove: #### p <0.00 Auer an der frësch (* 0.00 PS0) 01 verginn mam D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (150)぀2TD (D)぀2TD (D) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，，#，，，，，，，##01缌p < 0.00p < 0.001，与D12控制).b 4 12 (D12 MC) B гистограмммузмузомзззвва щщщщщщщ ььиивививистим. (D0), 15 (D12 CTRL, ### PTO PT), разн роенениюей 12 (D12 срупононо;; #### p <0,0001, ## 0,0011 раыхынениюей 12 (D12 MC) гнононезе 0## P <0,0001, ** P <0.01 по СравНенению сконтролем D12). b Histogram weist all 4 Kultur Konditiounen (Kontroll, TD, MC an MT) am Verglach zu frësch Häerz Rubriken (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), aus verschiddene Schwäin 12 (D12 MC) Rubriken / Grupp, eent-Manéier ANOVA Test; #.#0.#0p1, #0.0#0; , **p<0,01 vs Kontroll D12). c Bar Grafik weist d'Quantifizéierung vum Glukosefluss 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedéngungen (Ctrl, TD, MC, a MT) am Verglach mat frëschen Häerzstécker (D0) (n = 6 Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schweine, een-Wee ANOVA Test gëtt gemaach; ###p <0.001, am Verglach zu D0.10.***p 1 am Verglach zu D0. c Bar Grafik weist d'Quantifizéierung vum Glukosefluss 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedéngungen (Ctrl, TD, MC, a MT) am Verglach mat frëschen Häerzstécker (D0) (n = 6 Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schweine, een-Wee ANOVA Test gëtt gemaach; ###p <0.001, am Verglach zu D0.10.***p 1 am Verglach zu D0. c г ггитограммммузоказывалиственцунку пововиви Ования (Контру раза it, mt) поней, равоеноеноенонию свыимимистим .. Полнетсстсет Aso anvish; ### p <0,001 по сравнению ю * * 3.001еноееноению itолнетсстсстая ^ ## p <0.001 по поениюению с * * 3.001еноеное C Histogram weist d'Quantitéit vun der Glukosin Flix 12 Deeg Postxkultilung ënner all 4 Kulturbedingunge (Kontroll, TD an MT) De MC and mt (Gratis Sektiounen (N = 6 Häerzsvirbelen (D0) Dee Ano ShoDring; c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 蛸毹儅嚑喑牄嚑喐儅嚳嚑通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与***D0 盌，与***D0 盌 0.001，与***D0 盌相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切缉 切 片 切 片 切12测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）. C стогограмммузомузозымзввая щличличтннненезеуууввеннвеи гостогогрограммузазыва зщщщлаченнене по до до до до до до до. Вироваупонтроль, td, mc и lle соней, Оданою нию соннни й llыли проведены Тыы IVE CO Histogog huet d'Quantifikatioun vu Glukosglas um D0-Kulturates fir all 4 Kulturstudien (Kontroll, T12 am Verglach (CHTI, CC am Verglach zum benachten Häerzen)D Strahl Analyse vu frësche (blo), Dag 12 MC (gréng), an Dag 12 Mt (rout) Tissue op zéng Regional Tissue Sektiounspunkten (N = 4 Scheiwen.e Vulkan Komplott weist differenziell ausgedréckte Genen a frësche Häerzsektiounen (D0) am Verglach mat Häerzsektioune kultivéiert ënner statesche Bedéngungen (Ctrl) oder ënner MT Bedéngungen (MT) fir 10-12 Deeg.f Heatmap vun Sarcomere Genen fir Häerz Sektiounen cultured ënner jiddereng vun de Kultur Konditiounen.Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± Standarddeviatioun.
Metabolesch Ofhängegkeet vum Wiessel vu Fettsäureoxidatioun op Glykolyse ass e Markenzeeche vun der Kardiomyozyt-Differenzéierung.Ongerecht Kardiomyozyten benotzen haaptsächlech Glukos fir ATP Produktioun an hunn hypoplastesch Mitochondrien mat wéinege Cristae5,32.Analyse vun der Glukosnotzung huet gewisen datt ënner MC an MT Bedéngungen d'Glukosenotzung ähnlech war wéi déi am Dag 0 Stoffer (Dorënner 4c).Wéi och ëmmer, Ctrl Proben hunn eng bedeitend Erhéijung vun der Glukosnotzung am Verglach zum frësche Tissu gewisen.Dëst weist datt d'Kombinatioun vun CTCM an T3 /Dex Tissue Viabilitéit verbessert an de metabolesche Phänotyp vun 12-Deeg kultivéierten Häerzsektiounen erhaalt.Zousätzlech huet d'Belaaschtungsanalyse gewisen datt d'Belaaschtungsniveauen d'selwecht bliwwen wéi am frësche Häerzgewebe fir 12 Deeg ënner MT- a MS-Konditiounen (Figebam. 4d).
Fir de globale Impakt vun CTCM an T3 /Dex op der globaler transcriptional Landschaft vun Häerz Slice Otemschwieregkeeten ze analyséieren, hu mir RNAseq op Häerz Scheiwen aus all véier verschiddene Kultur Konditiounen (Ergänzungsdaten 1).Interessanterweis hunn MT Sektiounen héich transkriptional Ähnlechkeet mat frëschem Häerzgewebe gewisen, mat nëmmen 16 differentiell ausgedréckt aus 13.642 Genen.Wéi och ëmmer, wéi mir virdru gewisen hunn, weisen Ctrl Scheiwen 1229 differentiell ausgedréckt Genen no 10-12 Deeg an der Kultur (Lalumi 4e).Dës Donnéeën goufen duerch qRT-Hinnen alleguer vun Häerz an fibroblast Genen bestätegt (Ergänzlech Lalumi 7a-c).Interessanterweis hunn d'Ctrl-Sektiounen Downregulatioun vun Herz- a Zellzyklusgenen an Aktivatioun vun entzündlechen Genprogrammer gewisen.Dës Donnéeën hindeit datt d'Differenzéierung, déi normalerweis no laangfristeg Kultivatioun geschitt ass, ënner MT Bedéngungen komplett ofgeschwächt ass (Ergänzlech Fig. 8a, b).Virsiichteg Etude vun Sarcomere Genen gewisen, datt nëmmen ënner MT Konditiounen sinn d'Genen codéieren der Sarcomere (Figebam. 4f) an Ion Kanal (Ergänzlech Lalumi 9) konservéiert, schützen hinnen aus Ennerdréckung ënner Ctrl, TD, an MC Konditiounen.Dës Donnéeën weisen datt mat enger Kombinatioun vu mechanescher an humoraler Stimulatioun (T3 / Dex), den Häerzschnëtt-Transkriptom no 12 Deeg an der Kultur ähnlech wéi frësch Häerzschnëtt bleift.
Dësen Triich iwwer d'Tatsaach ginn vun der Tatsaach, datt d'Tatsaacher Intaritéit vun de Kardoozimesch gemaach gëtt, déi am beschten ënner Statschdages- an lokaliséiertt Verbindung (Figo) ugestallt ass am Land.Zousätzlech gi Fetze bei Häerz Sektiounen am Häerzsbestinatiounen ganz ëmgesat am Verglach mat CTLL an ähnlech wéi frësch Häerzer Sektiounen (Fig. 5b?Dës Dateien beweisen datt d'Kombinatioun vun mechanesche Stimulatioun an T3 / dexbehandlung effektiv an der Häerzschlag an der Kulturschaft an der Kulturschafter an der Kulturverbrauch an der Kulturverbrauch an der Cultion
Eng representativ Immunofholerolencescens Biller vun troonin-t (gréng), Connexin 43 (rout), an DAPI (blo) an der frëscher ISULTIONS (D0 HANDE LËSCHTEREN EISTIVATIONSIVATIVTIVATIVIMATIMUNCHERSUPERSLESSPORTS VUN TROPONIN-T (Gréng), Connexin 43 (rout), an DAPI (Blo) a blo.). Kënschtlech Intelligenz Quantifizéierung vun der Strukturell Integritéit vum Häerzgewebe (n = 7 (D0 an D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC an D12 MT) Scheiwen / Grupp vu verschiddene Schweine, een-Wee ANOVA Test gëtt gemaach; ####p <0.0001 am Verglach zum D0.****p <oder <0.****05 am Verglach mat D0.****0. 12 Ctrl). ATCIFIAL Intelligenz Quantifizéierung vum Häerzbau strukturell Integritéit am D0 an * 0,0 an D12 CTRL), 5 0,00 TD, D12 MT12 MT1NS) Piges / Grupp aus verschiddene Pigelen MCLATIOUN SIVERSEN AKREKOME Integritéit vun Häerzerwierker, ee-Art thollifeschen Intelligenz对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 咼艇庿工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，戔****p < 0.0000 Ctrl对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5（d12 td 、 t ， d12 mc 庄 缌 d12 mc 廒智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 缌 0.0****D < 0.05 缌斔 0.0****相比).Quantifikatioun vun der struktureller Integritéit vum Herzkierper mat kënschtlecher Intelligenz a verschiddene Schweine (n = 7 (D0 an D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC an D12 MT) Sektiounen / Grupp) mat engem One-Way ANOVA Test;#### p < 0,0001 bei D0 an *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 mat D12 Ctrl). #### p < 0,0001 am Verglach zum D0 an *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 am Verglach zum D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifizéierung fir Häerzstécker gefierft mam Masson's Trichrome Fleck (Skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, an D12 MC), 9 (D12 MT) Scheiwen/Grupp aus verschiddene Schwäin, Test gëtt vergläicht 1NO.## a vergläicht een-Wee *** an *** D1NO. p < 0,001, oder ****p < 0,0001 am Verglach zum D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifizéierung fir Häerzstécker gefierft mam Masson's Trichrome Fleck (Skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, an D12 MC), 9 (D12 MT) Scheiwen/Grupp aus verschiddene Schwäin, Test gëtt vergläicht 1NO.## a vergläicht een-Wee *** an *** D1NO. p < 0,001, oder ****p < 0,0001 am Verglach zum D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителема ( = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0,#0; 1 mat D0 an ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 mat D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifikatioun vun Häerz Sektiounen mat Masson d'Trichrom stain gefierft (Skala Bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) Sektiounen / Grupp aus verschiddene Schwäin, duerchgefouert eent-Manéier ANOVA <v.#0pVA <***0.#0 an D1-0. 01 oder ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D！、2（n（10（n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分渔；渔；缛0#.***#p 0.001，或****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 尺 = 、0（n（n（1（n trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分縎差分##0. ***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Reguléierungsausbildung a Versécherungsausbildung fir d'Ausmooss vun der Verëffentlechung, d'Ofkierzung an d'Mëtt 5 Méint (Mënz 0) n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; ####p < 0,0,0p < 0,0,0 001 oder ****p < 0,0001 mat D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifikatioun vun Häerzschnëtter gefierft mat Masson's Trichrome (Skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) Sektioune vu verschiddene Schwäin/Grupp, eng ANOVA Method; ###0,0.***0 oder ****0.***0. p < 0,0001 am Verglach zum D12 Ctrl).Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± Standarddeviatioun.
Schlussendlech gouf d'Fäegkeet vum CTCM fir d'Herzhypertrophie ze mimikéieren duerch d'Erhéijung vum Herzgewebe Stretch.Am CTCM ass de Peak Loftkammerdrock vun 80 mmHg op 80 mmHg eropgaang.Art.(normal Streck) bis 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Dëst entsprécht enger 32% Erhéijung vun der Streck (Fig. 6b), déi virdru als entspriechend Prozentsaz Streck gewise gouf fir Häerzsektiounen fir eng Sarkomerlängt ähnlech wéi déi an der Hypertrophie ze erreechen.Stretch a Geschwindegkeet vum Herzkierper während der Kontraktioun an der Entspanung blouf konstant während sechs Deeg Kultur (Fig. 6c).Herzgewebe aus MT Bedéngungen gouf fir sechs Deeg ënner normale Stretch (MT (Normal)) oder Overstretch Bedéngungen (MT (OS)) ënnerworf.Scho no véier Deeg an der Kultur, war de hypertrophic biomarker NT-ProBNP bedeitend am mëttelfristeg ënner MT (OS) Konditiounen am Verglach zu MT (normal) Konditiounen erhéicht (Lalumi 7a).Zousätzlech, no sechs Deeg Kultivatioun, huet d'Zellgréisst am MT (OS) (Lalumi 7b) wesentlech erhéicht am Verglach mat Sektiounen vum MT Häerz (normal).Zousätzlech, war NFATC4 nuklear translocation vill an overstretched Stoffer erhéicht (Lalumi 7c).Dës Resultater weisen d'progressiv Entwécklung vun der pathologescher Remodeling no Hyperdistensioun an ënnerstëtzen d'Konzept datt de CTCM-Apparat als Plattform benotzt ka ginn fir Stretch-induzéiert Herzhypertrophie Signaliséierung ze studéieren.
Representativ Spure vum Loftkammerdrock, Flëssegkeetskammerdrock an Tissuebewegungsmiessungen bestätegen datt de Kammerdrock de Flëssegkeetskammerdrock ännert, wat eng entspriechend Bewegung vun der Tissueschneiss verursaacht.b Representativ Stretchprozents- a Stretchratekurven fir normal gestreckt (orange) an iwwerstreckt (blo) Tissue Sektiounen.c Bar Grafik déi Zykluszäit weist (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schweine), Kontraktiounszäit (n = 18-19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schweine), Entspanungszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schwäin), Amplitude vun der Tissuebewegung (n = 14 Scheiwen/Grupp, vu verschiddene Slice/Grupp), vu verschiddene Slice/Grupp, vu verschiddene Slice/Grupp, vu verschiddene Slice / Grupp, verschidde Schwäin) an Héichpunkt Entspanung Taux (n = 14 (D0), 15 (D6)) Rubriken / Gruppen) aus verschiddene Schwäin), zwee-tailed Student d'T-Test huet kee groussen Ënnerscheed zu all Parameter gewisen, datt dës Parameteren konstant bliwwen während 6 Deeg vun Kultur mat overvoltage.Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± Standarddeviatioun.
eng Bar graph Quantifikatioun vun NT-ProBNP Konzentratioun an Kultur Medien aus Häerz Scheiwen cultured ënner MT normal Stretch (Norm) oder overstretching (OS) Konditiounen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, an D4 MTOS) Scheiwen / Grupp aus verschiddene Schwäin, zwee-Weeër ausgeführt, 0-Wee stattfannen; eng Bar Grafik Quantifikatioun vun der NT-ProBNP Konzentratioun a Kulturmedien aus Häerzscheiwen kultivéiert ënner MT normal Stretch (Norm) oder Overstretching (OS) Konditiounen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, an D4 MTOS) Scheiwen / Grupp vu verschiddene A**NOs, Zwee-Wee vergläicht.Quantitativ Histogramm vun NT-ProBNP Konzentratioun am Kulturmedium aus Häerzschnëtt kultivéiert ënner Bedéngungen vun normaler MT Stretch (Norm) oder Iwwerstreckung (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, an D4).**p < 0,01 fir сравнению нормальным растяжением). **p <0,01 am Verglach zum normale Stretch). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 絢序(D2 MTNorm)、3(D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS) ，p < 0.01）. eng Quantifikatioun vun NT-ProBNP Konzentratioun an Häerz Scheiwen kultivéiert ënner MT normal Stretch (Norm) oder Overstretch (OS) Konditiounen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) aus verschiddene 猪暄切䉇/幏幏弌动; ** am Verglach mat normale Stretching, p < 0,01).Histogram Quantifikatioun vun NT-ProBNP Konzentratioune an Häerz Scheiwen cultured ënner Konditiounen vun normal MT Streck (Norm) oder overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) an D4 MTOS) Scheiwen / Grupp aus verschiddene Schwäin, zwee-Manéier Analyse vun Varianz;**p < 0,01 fir сравнению нормальным растяжением). **p <0,01 am Verglach zum normale Stretch). b Représentant Biller fir Häerz Scheiwen mat Troponin-T an WGA (lénks) an Zell Gréisst Quantifizéierung (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen / Grupp aus 10 verschiddene Scheiwen aus verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student t-Test vergläicht 0 gesuergt, ****0 <1 normal 01 gesuergt, zwee-tailed Student t-Test gëtt am Verglach 0; b Vertrieder Biller fir Häerz Scheiwen mat Troponin-T an WGA (lénks) an Zell Gréisst Quantifikatioun (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen / Grupp aus 10 verschiddene Scheiwen aus verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student t-Test ass Verglach 0; ****000000000000 aus verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student t-Test ass Verglach 0; b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т an АЗП (слева) a количествениногос права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов vun разных свиней, два- провохдит entа; ****p < 0,0001 fir сравнению нормальным растяжением). b Représentant Biller vun Häerz Rubriken mat Troponin-T an AZP (lénks) an Zell Gréisst quantification (riets) Kierchefënster (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen /Grupp aus 10 verschiddene Rubriken aus verschiddene Schwäin, zwee-tailed Student d'T-Test <1 war am Verglach zu .****0s ausgefouert Verglach ****0s; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代胏n =3（徃），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鰸与季生 有鰾季生比,****p < 0,0001). B Vertrieder Biller vun Häerzschlieder huele mat KalChare-t a wga (lénks) an der Zellgréisst (riets) (n = 330 moth oder 0.00 Auer). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т an АЗП (слева) a количественное (количественная (количественная) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов vun разных свиней Клетки/группа, двустороСние критер, 0,0;0; сравнению с нормальным растяжением). b Vertrieder Biller vun Häerz Rubriken mat troponin-T an AZP (lénks) Kierchefënster an quantification vun Zell Gréisst (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) aus 10 verschiddene Rubriken aus verschiddene Schwäin) Zellen /Grupp, zwee-tailed Critère Student d't;****p < 0,0001 am Verglach zum normale Stamm). c Representativ Biller fir Dag 0 an Dag 6 MTOS Häerz Scheiwen immunolabeled fir Troponin-T an NFATC4 a quantification vun der Translokatioun vun NFATC4 op d'Käre vun CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen / Grupp aus verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student 0.5p Test ass gesuergt 0; c Representativ Biller fir Dag 0 an Dag 6 MTOS Häerz Scheiwen immunolabeled fir Troponin-T an NFATC4 a quantification vun der Translokatioun vun NFATC4 op d'Käre vun CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen / Grupp aus verschiddene Schwäin, Zwee-tailed Student .0p-Test gëtt gemaach; c Репрезентативные изображения fir срезов сердца 0 a 6 дней MTOS, иммуномеченых fir тропонина-Т и NFATC4, a коспоники ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется та; *p < 0,05). c Vertrieder Biller fir Häerz Rubriken op 0 a 6 Deeg MTOS, immunolabeled fir Troponin-T an NFATC4, an quantification vun NFATC4 translocation am Kär vun cavernous Zellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen /Grupp aus verschiddene Schwäin) gesuergt zwee-tailed Student ';*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图媌的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟「t 检0*5) 。 0*5) c Representativ Biller vu Calcanin-T an NFATC4 Immunolabeling 第0天和第6天MTOS Häerzscheiwen, an NFATC4 vu verschiddenen NFATC4 易位至CM Zellkären Quantitéit 化 (n = 4 (D0), 北族鈄, 缇, 缇, 缇, 缌 , 刻 , 缌 , 刻 , 缌尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS op 0 an 6 день fir иммуномаркировки тропонинством-Т an NFATC4 и коцичи ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть, 5). c Representativ Biller vun MTOS Häerz Scheiwen um Dag 0 a 6 fir Troponin-T an NFATC4 immunolabeling an quantification vun NFATC4 translocation am Kär vun CM aus verschiddene Schwäin (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen / Grupp, zwee-tailed t -Critère; 0p;Feeler Baren representéieren Moyenne ± Standarddeviatioun.
Iwwersetzung Kardiovaskulär Fuerschung erfuerdert cellulär Modeller déi d'Häerzëmfeld präzis reproduzéieren.An dëser Etude gouf e CTCM Apparat entwéckelt a charakteriséiert, deen ultradënn Sektiounen vum Häerz stimuléiere kann.De CTCM System enthält physiologesch synchroniséiert elektromechanesch Stimulatioun an T3 an Dex Flëssegkeetsberäicherung.Wann Porcine Häerz Sektiounen zu dëse Faktoren ausgesat waren, blouf hir Viabilitéit, strukturell Integritéit, metabolesch Aktivitéit an transkriptional Ausdrock d'selwecht wéi am frësche Häerzgewebe no 12 Deeg Kultur.Zousätzlech kann exzessiv Ausdehnung vum Häerzgewebe verursaachen Hypertrophie vum Häerz verursaacht duerch Hyperextensioun.Insgesamt ënnerstëtzen dës Resultater déi kritesch Roll vun de physiologesche Kulturbedéngungen beim Erhalen vun engem normale kardiologesche Phänotyp a bidden eng Plattform fir Drogenscreening.
Vill Faktoren droen zur Schafung vun engem optimalen Ëmfeld fir de Fonctionnement an d'Iwwerliewe vu Kardiomyozyten bäi.Déi offensichtlechst vun dëse Faktoren si verbonne mat (1) interzelluläre Interaktiounen, (2) elektromechanesch Stimulatioun, (3) humoral Faktoren, a (4) metabolesche Substrate.Physiologesch Zell-zu-Zell Interaktiounen erfuerderen komplex dreidimensional Netzwierker vu multiple Zelltypen, ënnerstëtzt vun enger extrazellulärer Matrix.Esou komplex cellulär Interaktioune si schwéier ze rekonstruéieren in vitro duerch Co-Kultur vun eenzelne Zelltypen, awer kënne ganz einfach mat der organotypescher Natur vun Häerzsektiounen erreecht ginn.
Mechanesch Stretch an elektresch Stimulatioun vu Kardiomyozyten si kritesch fir den Häerzphenotyp33,34,35 z'erhalen.Wärend mechanesch Stimulatioun vill fir hiPSC-CM Konditioun a Reifung benotzt gouf, hunn e puer elegant Studien viru kuerzem versicht mechanesch Stimulatioun vun Häerzschnëtter an der Kultur mat uniaxialer Belaaschtung ze benotzen.Dës Studie weisen datt 2D uniaxial mechanesch Belaaschtung e positiven Effekt op de Phänotyp vum Häerz während der Kultur huet.An dëse Studien goufen Sektiounen vum Häerz entweder mat isometresche Spannkraaft gelueden17, linear auxotonic Belaaschtung18, oder den Herzzyklus gouf erstallt mat Hëllef vu Kraafttransducer-Feedback a Spannungsdriven.Wéi och ëmmer, dës Methoden benotzen uniaxial Tissue Stretch ouni Ëmweltoptimiséierung, wat zu der Ënnerdréckung vu villen Herzgenen oder Iwwerexpressioun vun Genen assoziéiert mat anormalen Stretchreaktiounen.De CTCM, deen hei beschriwwe gëtt, bitt en 3D elektromechanesche Reiz deen den natierlechen Herzzyklus a punkto Zykluszäit a physiologescher Streck miméiert (25% Stretch, 40% Systole, 60% Diastole, an 72 Beats pro Minute).Och wann dës dreidimensional mechanesch Stimulatioun eleng net genuch ass fir d'Dieren, eng Kombinatioun vun der Humoritéit ze erhalen, funktionnéiert
Humoral Faktoren spillen eng wichteg Roll bei der Modulatioun vum erwuessene Häerzphenotyp.Dëst gouf an HiPS-CM Studien beliicht, an deenen T3 an Dex zu Kulturmedien bäigefüügt goufen fir Zell Reifung ze beschleunegen.T3 kann den Transport vun Aminosäuren, Zucker a Kalzium iwwer Zellmembranen beaflossen36.Zousätzlech fördert T3 MHC-α Ausdrock an MHC-β Downregulatioun, fördert d'Bildung vu schnelle twitch Myofibrillen a reife Kardiomyozyten am Verglach mat luesen twitch Myofibrillen am fetale CM.T3-Mangel bei Hypothyroidpatienten resultéiert am Verloscht vu myofibrillar Bands an e reduzéierten Taux vun der Tounentwécklung37.Dex handelt op Glukokortikoid Rezeptoren a gouf gewisen datt d'myokardial Kontraktilitéit an isoléierten perfuséierten Häerzer erhéicht gëtt;38 dës Verbesserung gëtt ugeholl datt se mam Effekt op Kalziumdepot-driven Entrée (SOCE) 39,40 verbonne sinn.Zousätzlech bindet Dex u seng Rezeptoren, wat eng breet intrazellulär Äntwert verursaacht, déi d'Immunfunktioun an d'Entzündung ënnerdréckt30.
Eis Resultater weisen datt physesch mechanesch Stimulatioun (MS) d'Gesamtkulturleistung am Verglach zum Ctrl verbessert huet, awer d'Viabilitéit, d'strukturell Integritéit an d'Häerzausdrock iwwer 12 Deeg an der Kultur erhalen.Am Verglach mat Ctrl, Zousatz vun T3 an Dex zu CTCM (MT) Kulturen verbessert d'Viabilitéit an erhale ähnlech Transkriptiounsprofile, strukturell Integritéit a metabolesch Aktivitéit mat frëschem Häerzgewebe fir 12 Deeg.Zousätzlech, duerch d'Kontroll vum Grad vun der Tissue-Stretch, gouf en Hyperextension-induzéierten Häerzhypertrophiemodell mat STCM erstallt, wat d'Vielfalt vum STCM-System illustréiert.Et sollt bemierkt datt och wann d'Herzremodeling an d'Fibrose normalerweis intakt Organer involvéieren, deenen hir zirkuléierend Zellen déi entspriechend Zytokine kënnen ubidden, souwéi Phagozytose an aner Remodeling Faktoren, Sektiounen vum Häerz kënnen nach ëmmer de fibrotesche Prozess als Äntwert op Stress an Trauma mimikéieren.an Myofibroblasten.Dëst gouf virdru an dësem Häerzschnëttmodell bewäert.Et sollt bemierkt datt CTCM Parameteren moduléiert kënne ginn andeems d'Drock / elektresch Amplituden an d'Frequenz änneren fir vill Konditioune wéi Tachykardie, Bradykardie a mechanesch Zirkulatiounshëllef (mechanesch entlaascht Häerz) ze simuléieren.Dëst mécht de System e mëttleren Duerchsatz fir Drogentest.D'Fäegkeet vum CTCM fir Iwweranstrengung-induzéiert Häerzhypertrophie ze modelléieren mécht de Wee fir dëse System fir personaliséiert Therapie ze testen.Als Conclusioun beweist déi aktuell Studie datt mechanesch Stretch an humoral Stimulatioun kritesch sinn fir d'Kultur vun Herzgewebe Sektiounen z'erhalen.
Och wann d'Daten hei virgestallt suggeréieren datt CTCM eng ganz villverspriechend Plattform ass fir intakt Myokardium ze modelléieren, huet dës Kulturmethod e puer Aschränkungen.D'Haaptbegrenzung vun der CTCM Kultur ass datt et kontinuéierlech dynamesch mechanesch Belaaschtungen op d'Scheiwen setzt, wat d'Fähigkeit ausschléisst fir d'Herzschnëttkontraktioune während all Zyklus aktiv ze iwwerwaachen.Zousätzlech, wéinst der klenger Gréisst vun Häerzschnëtter (7 mm), ass d'Fäegkeet fir systolesch Funktioun ausserhalb vu Kultursystemer mat traditionelle Kraaftsensoren ze evaluéieren limitéiert.Am aktuellen Manuskript iwwerwanne mir deelweis dës Begrenzung andeems d'optesch Spannung als Indikator vun der kontraktile Funktioun evaluéiert gëtt.Wéi och ëmmer, dës Begrenzung wäert weider Aarbecht erfuerderen a kann an Zukunft adresséiert ginn duerch Methoden fir optesch Iwwerwaachung vun der Funktioun vun Häerzschnëtt an der Kultur, wéi optesch Kartéierung mat Kalzium a Spannungsempfindlech Faarfstoffer.Eng aner Begrenzung vu CTCM ass datt den Aarbechtsmodell de physiologesche Stress (Preload an Afterload) net manipuléiert.Am CTCM gouf den Drock an entgéintgesate Richtungen induzéiert fir 25% physiologesch Stretch an Diastole (voll Stretch) a Systole (Längt vun der Kontraktioun während der elektrescher Stimulatioun) a ganz grousse Stoffer ze reproduzéieren.Dës Begrenzung soll an zukünfteg CTCM-Designen duerch adäquat Drock op d'Häerzgewebe vu béide Säiten ofgeschaaft ginn an duerch d'Applikatioun vun den exakten Drock-Volumenverhältnisser, déi an de Chambers vum Häerz optrieden.
D'Overstretch-induzéiert Remodeling, déi an dësem Manuskript gemellt gëtt, ass limitéiert fir hypertrophesch Hyperstretch Signaler ze mimikéieren.Also, well dëse Modell an der Studie hëllefen ,oppschoul Signal suergen, datt den Humor oder neurend Ersécherunge gëtt (wat net an dësem System gëtt).
Dräizéng Schwäin goufen an dëser Etude benotzt.All Déierprozedure goufen am Aklang mat institutionnelle Richtlinnen gesuergt a goufen vun der University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee guttgeheescht.D'aortic arch war ageklemmt an d'Häerz war mat 1 L vun steril cardioplegia perfused (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U /ml Heparin, pH bis 7,4); d'Häerzer goufen an äiskale kardioplegesche Léisung konservéiert bis se an de Labo op Äis transportéiert ginn, wat normalerweis <10 min ass. d'Häerzer goufen an äiskale kardioplegesche Léisung konservéiert bis se an de Labo op Äis transportéiert ginn, wat normalerweis <10 min ass. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе fir транспортировки an лабораторию zu льду, что обанично <10m. Häerzer goufen an äiskal kardioplegic Léisung gespäichert bis Transport an de Labo op Äis, déi normalerweis dauert <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常8<10。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常8<10。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию zu льду, обычно <10 min. Halt d'Häerzer op Äis Kardioplegie bis den Transport an de Labo op Äis, normalerweis <10 min.
Den CTCM Apparat gouf a SolidWorks Computer-aided Design (CAD) Software entwéckelt.D'Kulturkammer, Trennen a Loftkammer sinn aus CNC kloer Acrylplastik.De 7mm Duerchmiesser Back-Up Ring ass aus héijer Dicht Polyethylen (HDPE) am Zentrum an huet en O-Ring Groove fir de Silicon O-Ring ze kréien.Eng dënn Silica-Membran trennt d'Kulturkammer vun der Trennplack.D'Silikonmembran ass aus engem 0,02 ″ décke Silikonplack aus Laser geschnidden an huet eng Härte vun 35A.Déi ënnescht an iewescht Silikondichtungen sinn aus engem 1/16 ″ décke Silikonplack aus Laser geschnidden an hunn eng Härte vu 50A.316L Edelstahl Schrauwen a Fligelmutter gi benotzt fir de Block ze befestigen an e loftdichte Sigel ze kreéieren.
Eng speziell gedréckte Circuit Board (PCB) ass entwéckelt fir mat dem C-PACE-EM System integréiert ze ginn.D'Schwäizer Maschinn Connector Sockets op der PCB sinn mat GRAPHITE Elektroden duerch sëlwer-plated Kupferdraht a Bronze 0-60 Schrauwen an d'Elektroden geschrauft.De gedréckte Circuit Board gëtt an de Cover vum 3D Drécker gesat.
De CTCM Apparat gëtt duerch e programméierbar pneumatesche Aktuator kontrolléiert (ppd) déi e kontrolléiert kreesfërmegen Drock ähnlech ass ähnlech wéi e Kardiac Zyklus.Wéi den Drock an der Loftkammer eropgeet, erweidert déi flexibel Silikonmembran no uewen, an zwéngt d'Medium ënner dem Tissue Site.D'Gebitt vum Tissue gëtt dann duerch dës Ausdreiwung vu Flëss gestreckt, wat d'physiologesch Expansioun vum Häerz während der Diastole mimikéiert.Um Héichpunkt vun der Entspanung gouf elektresch Stimulatioun duerch Grafitelektroden applizéiert, déi den Drock an der Loftkammer reduzéiert an d'Kontraktioun vu Gewëssenabschnëtter verursaacht huet.Am Päif ass en hemostatesche Ventil mat engem Drocksensor fir den Drock am Loftsystem z'entdecken.Den Drock, dee vum Drocksensor gesi gëtt, gëtt op en Datekollektor ugewannt, deen mam Laptop verbonnen ass.Dëst erlaabt eng kontinuéierlech Iwwerwaachung vum Drock an der Gaskammer.Wann de maximale Chamberdrock erreecht gouf (Standard 80 mmhg, 140 mmhgs Os)
Häerz Sektiounen goufen kritt a Kultur Konditiounen an 6 Wells sech wéi follegt gesuergt: Transfert der recoltéiert Häerzer aus der Transfermaart Schëffer zu engem Schacht kal (4 ° C.) Cardioplegie.De lénksen Ventrikel gouf mat engem sterile Blade isoléiert an a Stécker vun 1-2 cm3 geschnidden.Dës Tissue-Blöcke goufen mat Tissue-Klebstoff mat Tissue-Klebstoff befestegt an an engem vibréierende Mikrotom-Tissuebad mat der Tyrode-Léisung gesat a kontinuéierlech oxygenéiert (3 g/L 2,3-Butanedion-Monooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM) (0,447 mM), (0,447 mM) (D100 mM) (D1,010 mM), (1,0 g/L) .38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M Léisung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M Léisung), bis zu 1 L ddH2O).De vibréierende Mikrotom gouf gesat fir 300 µm décke Scheiwen mat enger Frequenz vun 80 Hz ze schneiden, enger horizontaler Schwéngungsamplitude vun 2 mm, an enger Avance vun 0,03 mm / s.D'Tissuebad gouf mat Äis ëmginn fir d'Léisung cool ze halen an d'Temperatur gouf op 4 ° C gehalen.Transfert Tissue Sektiounen aus dem Mikrotombad an en Inkubatiounsbad mat kontinuéierlech oxygenéierter Tyrode Léisung op Äis bis genuch Sektioune fir eng Kulturplack kritt ginn.Fir transwell Kulturen, goufen Tissue Rubriken zu steril 6 mm breet Polyurethan Ënnerstëtzung befestegt an an 6 ml vun optimiséiert mëttel- (199 mëttelfristeg, 1x ITS Zousaz, 10% FBS, 5 ng /ml VEGF, 10 ng /ml FGF-alkalesch an 2X Antibiotikum-antifungal gesat).Elektresch Stimulatioun (10 V, Frequenz 1,2 Hz) gouf op d'Tissue-Sektiounen duerch den C-Pace applizéiert.Fir TD Konditiounen, frësch T3 an Dex goufen op 100 nM an 1 μM bei all mëttelfristeg änneren dobäi.De Medium ass mat Sauerstoff gesättegt virum Ersatz 3 Mol am Dag.Tissue Sektiounen goufen an engem Inkubator bei 37 ° C a 5% CO2 kultivéiert.
Fir CTCM Kulturen, goufen Tissue Sektiounen op engem personaliséierte 3D Dréckerspäicher an engem Petri Plat mat modifizéiert Tyrode Léisung gesat.Den Apparat ass entwéckelt fir d'Gréisst vum Scheck vum Häerz ëm 25% vum Gebitt vum Supportring ze erhéijen.Dëst gëtt gemaach fir datt d'Sektiounen vum Häerz net ausdehnen nodeems se vun der Tyrode Léisung op d'Mëttel a während der Diastole transferéiert ginn.Mat histoacrylesche Klebstoff goufen Sektiounen 300 µm déck op engem Stützring 7 mm Duerchmiesser fixéiert.Nodeems Dir d'Tissue Sektiounen un den Ënnerstëtzungsring befestegt hutt, schneiden d'iwwerschësseg Tissue Sektiounen of a setzen déi befestegt Tissue Sektiounen zréck an d'Bad vun der Tyrode Léisung op Äis (4 ° C) bis genuch Sektioune fir een Apparat virbereet sinn.D'total Veraarbechtungszäit fir all Apparater däerf net méi wéi 2 Stonnen sinn.Nodeems 6 Tissue Sektiounen un hir Ënnerstëtzungsringen befestegt goufen, gouf de CTCM Apparat zesummegesat.D'CTCM Kulturkammer ass virgefëllt mat 21 ml pre-oxygenéiert Medium.Transfert d'Tissue-Sektiounen an d'Kulturkammer a läscht virsiichteg all Loftblasen mat enger Pipette.Den Tissue-Sektioun gëtt dann an d'Lach gefouert a sanft op d'Plaz gedréckt.Schlussendlech setzt d'Elektrodenkapp op den Apparat a transferéiert den Apparat an den Inkubator.Dann verbënnt den CTCM mat der Loftröhre an dem C-PACE-EM System.De pneumatesch Aktuator mécht op an de Loftventil mécht den CTCM op.De C-PACE-EM System gouf konfiguréiert fir 4 V bei 1,2 Hz während biphasesche Stimulatioun fir 2 ms ze liwweren.De Medium gouf zweemol am Dag geännert an d'Elektroden goufen eemol am Dag geännert fir d'Akkumulation vu Graphit op den Elektroden ze vermeiden.Wann néideg, kënnen Tissue-Sektiounen aus hire Kulturbrunnen ofgeschaaft ginn fir Loftblasen ze verdreiwen déi ënner hinnen gefall sinn.Fir MT Behandlungskonditioune gouf T3 /Dex frësch mat all mëttlerer Ännerung mat 100 nM T3 an 1 μM Dex bäigefüügt.D'CTCM Apparater goufen an engem Inkubator bei 37 ° C a 5% CO2 kultivéiert.
Fir gestreckt Trajectoiren vun Häerzschnëtt ze kréien, gouf e spezielle Kamerasystem entwéckelt.Eng SLR Kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) gouf mat engem Navitar Zoom 7000 18-108mm Makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA) benotzt.Visualiséierung gouf bei Raumtemperatur gemaach nodeems de Medium mat frëschem Medium ersat gouf.D'Kamera ass an engem 51 ° Wénkel positionéiert a Video gëtt mat 30 Frames pro Sekonn opgeholl.Als éischt gouf Open Source Software (MUSCLEMOTION43) mat Image-J benotzt fir d'Bewegung vun Häerzschnëtt ze quantifizéieren.D'Mask gouf mat MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) erstallt fir Regiounen ze definéieren déi interesséiert sinn fir Häerzschneider ze schloen fir Geräischer ze vermeiden.Manuell segmentéiert Maske ginn op all Biller an enger Framesequenz ugewannt an dann un de MUSCLEMOTION Plug-in weiderginn.Muscle Motion benotzt déi duerchschnëttlech Intensitéit vun de Pixel an all Frame fir seng Bewegung relativ zum Referenzrahmen ze quantifizéieren.Daten goufen opgeholl, gefiltert a benotzt fir Zykluszäit ze quantifizéieren an Tissuestrecken während dem Herzzyklus ze bewäerten.Den opgeholl Video gouf post-veraarbecht mat engem éischten Uerdnung Null-Phase Digitalfilter.Fir Tissuestrecken (Peak-to-Peak) ze quantifizéieren, gouf d'Peak-to-Peak Analyse gemaach fir tëscht Peaks an Troughs am opgeholl Signal z'ënnerscheeden.Zousätzlech gëtt d'Ofdreiwung duerchgefouert mat engem Polynom vun der 6ter Uerdnung fir Signaldrift ze eliminéieren.Programmcode entwéckelt gouf am MATLAB entwéckelt fir d'Globbolbe-Motioun ze bestëmmen, Zyklus Zäit, an Contraktiounszäit (Zousazungszäit 44).
Fir ze stäegend Analyse, benotzt déi selwecht Videoen erstallt fir mechanesch Strecken Bewäertung, mir zwee Biller, déi zwee Biller representéieren, déi d'Motor (ieweschte Liglen vun der Muschel)Mir hunn dunn d'Gewëssregiounen segmentéiert an eng Form vu Schattenalgorithmus op de segmentéierten Tissu applizéiert (Ergänzlech Fig. 2a).De Segebunn, respektiv Zousazfahrt, an de Stress op all Uewerfläch gouf mat der folgender Equatioun ausgerechent: Strain = (Supdowns sinn an der Distanz vun der Form
Häerz Sektioune goufen an 4% Paraformaldehyde fir 48 Stonnen fixéiert.Fix Stoffer goufen an 10% an 20% Saccharose fir 1 h dehydréiert, dann an 30% Saccharose Iwwernuechtung.D'Sektioune goufen dann an enger optimaler Schneidtemperaturverbindung (OCT Verbindung) agebonnen a graduell an engem Isopentan / Trockenäisbad gefruer.Store OCT Embedding Blocks bei -80 ° C bis Trennung.Rutschen goufen als Sektiounen mat enger Dicke vun 8 μm virbereet.
Fir OCT aus Häerz Sektiounen ze läschen, Hëtzt d'Rutschen op engem Heizblock bei 95 ° C fir 5 min.Füügt 1 ml PBS op all Rutsch an inkubéiert fir 30 Minutten bei Raumtemperatur, permeéiert dann d'Sektiounen andeems Dir 0,1% Triton-X an PBS fir 15 Minutten bei Raumtemperatur setzt.Fir net-spezifesch Antikörper ze verhënneren, datt se un d'Probe binden, füügt 1 ml 3% BSA-Léisung op Rutschen an inkubéiert 1 Stonn bei Raumtemperatur.D'BSA gouf duerno geläscht an d'Rutschen goufen mat PBS gewäsch.Markéiert all Probe mat engem Bleistift.Primär Antikörper (verdünnt 1:200 an 1% BSA) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) an Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) goufen iwwer 90 Minutten bäigefüügt, dann 200% Antikörper géint Gripp: 200 an 1 Mo. oder 488 (Thermo Scientific; #A16079), géint Kanéngchen Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) fir eng zousätzlech 90 Minutten 3 Mol mat PBS Wäscht 3 Mol mat PBS. mat Nagellack.-x Vergréisserung) a Keyence Mikroskop mat 40x Vergréisserung.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Wëssenschaftlech; # W32464) bei 5 μg /ml an PBS war fir WGA staining benotzt an op fixen Rubriken fir 30 Minutten bei Raumtemperatur applizéiert.D'Rutschen goufen duerno mat PBS gewäsch an Sudan Schwaarz gouf op all Rutsch bäigefüügt a fir 30 Minutten inkubéiert.D'Rutschen goufen duerno mat PBS gewäsch a Vectashield Embedding Medium gouf bäigefüügt.Rutschen goufen op engem Keyence Mikroskop bei 40x Vergréisserung visualiséiert.
OCT gouf aus de Echantillon geläscht wéi uewen beschriwwen.Nodeems Dir den OCT ewechgeholl hutt, taucht d'Rutschen an der Bouin Léisung iwwer Nuecht.D'Rutschen goufen duerno mat destilléiertem Waasser fir 1 Stonn gespullt an duerno an enger Bibrich Aloe Säure Fuchsin Léisung fir 10 Minutten gesat.Duerno goufen d'Rutschen mat destilléiertem Waasser gewascht an an enger Léisung vu 5% Phosphomolybdän / 5% Phosphowolframsäure fir 10 Minutten gesat.Ouni Spülen, transferéiert d'Rutschen direkt an d'Anilinblo Léisung fir 15 Minutten.Duerno goufen d'Rutschen mat destilléiertem Waasser gewascht an an enger 1% Essigsäureléisung fir 2 Minutten plazéiert.Rutschen goufen an 200 N Ethanol getrocknegt an op Xylen transferéiert.Stained Rutschen goufen visualiséiert mat engem Keyence Mikroskop mat engem 10x Objektiv.Fibrose Beräich Prozentsaz gouf mat Keyence Analyzer Software quantifizéiert.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), Katalognummer V13154, laut dem Protokoll vum Hiersteller mat e puer Ännerungen.Besonnesch e chirurgesche Punch mat engem Duerchmiesser vu 6 mm gouf benotzt fir eenheetlech Tissuegréisst während der MTT Analyse ze garantéieren.Tissue goufen individuell an de Wells vun enger 12-Well Plack mat MTT-Substrat no dem Protokoll vum Hiersteller gepflanzt.D'Sektioune ginn bei 37 ° C. fir 3 Stonnen inkubéiert an de liewegen Tissu metaboliséiert de MTT-Substrat fir eng purpurroude Formazan-Verbindung ze bilden.Ersetzt d'MTT-Léisung mat 1 ml DMSO an inkubéiert bei 37 ° C fir 15 Minutten fir purpurroude Formazan aus Häerzsektiounen ze extrahieren.Sample goufen 1:10 an Dmso an der 96-gutt-bannenzeger Teller a purpurroude Faarfintensitéit déi am 570 NM benotzt gëtt (Biotat.D'Liesunge goufen op d'Gewiicht vun all Scheck vum Häerz normaliséiert.
Häerz Slice Medien gouf mat Medien ersat 1 μCi /ml [5-3H] -Glukose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) fir Glukose Notzung assay wéi virdru beschriwwen.No 4 Stonnen Inkubatioun fügen 100 μl Medium an en oppene Mikrocentrifuge-Röhre mat 100 μl 0,2 N HCl.Duerno gouf d'Röhre an e Scintillatiounsröhre gesat mat 500 μl dH2O fir [3H]2O fir 72 Stonnen bei 37 ° C ze verdampen.Dann huelt de Mikrocentrifuge-Röhre aus dem Scintillatiounsröhre a füügt 10 ml Scintillatiounsflëssegkeet derbäi.Scintillation zielt sech mat engem Tri-Carb 2900TR flësseg scintillation Analyser (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) gesuergt.D'Glukosenotzung gouf duerno berechent andeems d'[5-3H]-Glukosespezifesch Aktivitéit, onkomplett Gläichgewiicht an Hannergrond, Verdünnung vu [5-3H]-zu unlabeled Glukos a Szintillatiounskonter Effizienz berücksichtegt.D'Donnéeë ginn normaliséiert op d'Mass vun de Sektiounen vum Häerz.
No Tissuehomogeniséierung am Trizol, gouf RNS aus Häerzsektiounen isoléiert mam Qiagen miRNeasy Mikro Kit #210874 no dem Hiersteller Protokoll.RNAsec Bibliothéik Virbereedung, Sequenzéierung an Datenanalyse goufen wéi follegt gemaach:
1 μg RNS pro Probe gouf als Startmaterial fir d'Virbereedung vun der RNS-Bibliothéik benotzt.Sequencing Bibliothéiken goufen generéiert mat der NEBNext Ultra TM RNA Bibliothéik Preparatioun Kit fir Illumina (NEB, USA) no den Hiersteller Empfehlungen, an Index Coden goufen zu den Attributer Sequenzen fir all Prouf dobäigesat.Kuerz gesot, mRNA gouf aus total RNA gereinegt mat magnetesche Perlen verbonne mat Poly-T Oligonukleotiden.Fragmentatioun gëtt mat divalente Kationen bei héijer Temperatur am NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) duerchgefouert.Éischt Strang cDNA gouf synthetiséiert mat zoufälleg Hexamer Primer a M-MuLV ëmgedréint Transkriptase (RNase H-).Déi zweet Strang cDNA gëtt dann mat DNA Polymerase I an RNase H synthetiséiert. Déi verbleiwen Iwwerhänge ginn duerch Exonuklease/Polymerase Aktivitéit zu stompegen Enden ëmgewandelt.No der Adenylatioun vum 3′ Enn vum DNA Fragment gëtt en NEBNext Adapter mat enger Haarnadelschleifstruktur dermat befestegt fir et op Hybridiséierung virzebereeden.Fir Auswiel vun cDNA Fragmenter vun bevorzugt Längt 150-200 bp.Bibliothéik Fragmenter goufen mat der AMPure XP System (Beckman Coulter, Beverly, USA) gereinegt.Dann, 3 μl USER Enzym (NEB, USA) mat Gréisst-ausgewielt cDNA ligated mat engem Adapter war fir 15 Minutte bei 37 ° C benotzt an dann fir 5 Minutte bei 95 ° C virun PCR.PCR gouf duerno mat Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, Universal PCR Primer, an Index (X) Primer gemaach.Endlech goufen PCR Produkter gereinegt (AMPure XP System) a Bibliothéikqualitéit bewäert op engem Agilent Bioanalyzer 2100 System.D'cDNA-Bibliothéik gouf duerno mat engem Novaseq-Sequencer sequentéiert.Raw Bilddateien vun Illumina goufen op raw Liesungen ëmgewandelt mat CASAVA Base Calling.Raw Daten ginn a FASTQ (fq) Formatdateien gespäichert déi Liessequenzen an entspriechend Basisqualitéiten enthalen.Wielt HISAT2 fir gefilterte Sequenzéierungsliesen un de Sscrofa11.1 Referenzgenom ze passen.Allgemeng ënnerstëtzt HISAT2 Genome vun all Gréisst, och Genome méi grouss wéi 4 Milliarde Basen, a Standardwäerter gi fir déi meescht Parameter gesat.Splicing Liesunge vun RNA Seq Daten kënnen effizient ausgeriicht ginn mat HISAT2, dee schnellsten System dee momentan verfügbar ass, mat der selwechter oder besserer Genauegkeet wéi all aner Method.
D'Heefegkeet vun Transkriptiounen reflektéiert direkt den Niveau vum Genausdrock.Genausdrockniveauen ginn bewäert duerch d'Heefegkeet vun Transkriptiounen (Sequenzéierungszuel) verbonne mat dem Genom oder Exonen.D'Zuel vu Liesungen ass proportional zum Genausdrockniveauen, Genlängt a Sequenzéierungsdéift.FPKM (Fragmenter pro dausend Basispaar vun Transkript sequenzéiert pro Millioun Basispaar) goufen berechent a P-Wäerter vum Differentialausdrock goufen mam DESeq2 Package bestëmmt.Mir hunn dann de falschen Entdeckungsquote (FDR) fir all P Wäert berechent mat der Benjamini-Hochberg Method9 baséiert op der agebauter R-Funktioun "p.adjust".
RNA isoléiert aus Häerz Sektiounen gouf zu cDNA bei enger Konzentratioun vun 200 ng /μl ëmgewandelt mat der SuperScript IV Vilo Master Mix vun Thermo (Thermo, Kat. Nr. 11756050).Quantitative RT-Hinnen alleguer war mat engem applizéiert Biosystems Endura Plate Microamp 384-gutt transparent Reaktioun Plack (Thermo, cat. Nr. 4483319) an microamp opteschen Kliewefolie (Thermo, cat. Nr. 4311971) gesuergt.D'Reaktiounsmëschung bestoung aus 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mëschung (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer an 3,5 µl H2O gemëscht pro Well.Standard qPCR Zyklen goufen ausgefouert an CT Wäerter goufen gemooss mat engem Applied Biosystems Quantstudio 5 Echtzäit PCR Instrument (384-Well Modul; Produkt # A28135).Taqman Primer goufen vun Thermo kaaft (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss8906_08m1 (Ss8906_08m1), 8906_01s1 (Ss8906_010m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1 Wäerter vun Génévolat normaliséiert vun Généquipe vun Généquipe vun Généquipe normaliséiert.
Media Verëffentlechung vun NT-ProBNP gouf mat der NT-ProBNP Kit (Schwäin) (Cat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) no dem Fabrikant d'Protokoll bewäert.Kuerz gesot, 250 μl vun all Probe a Standard gouf an Duplikat zu all Well bäigefüügt.Direkt nodeems d'Probe bäigefüügt gouf, füügt 50 μl Assay Reagens A an all Well.Schütt d'Plack sanft a versiegelt mat Dichtstoff.Duerno goufen d'Tabletten bei 37 ° C fir 1 Stonn inkubéiert.Dann aspiréiert d'Léisung a wäscht d'Brunnen 4 Mol mat 350 μl 1X Wäschléisung, inkubéiert d'Wäschléisung fir 1-2 Minutten all Kéier.Dann fügen se 100 μl Assay Reagens B pro Brunn derbäi a versiegelt mat Plattendichtstoff.D'Tablet gouf sanft gerëselt a bei 37 ° C fir 30 Minutten inkubéiert.Aspiréiert d'Léisung a wäscht d'Brunnen 5 Mol mat 350 μl 1X Wäschléisung.Füügt 90 μl Substratléisung an all Brunn a versiegelt d'Plack.Inkubéiert d'Plack bei 37 ° C fir 10-20 Minutten.Füügt 50 µl Stop Solution fir all Brunn.D'Plack gouf direkt mat engem Cytation (BioTek) Plack Lieser gemooss op 450 nm.
Power Analyser goufen opgefouert fir de Gruppgréissten ze wielen, déi> 80% Kraaft ubidden fir en Absolut% in absolut Verännerung vun der Parameter z'entdecken mat engem 5% Type-Typ. Power Analyser goufen opgefouert fir de Gruppgréissten ze wielen, déi> 80% Kraaft ubidden fir en Absolut% in absolut Verännerung vun der Parameter z'entdecken mat engem 5% Type-Typ. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% мощности fir бобаружения 10% тра с 5% частотой ошибок типа I. Kraaft Analyse gouf ausgefouert fir Gruppgréissten ze wielen déi> 80% Kraaft ubelosse fir 10% absolute Parameter z'entdecken mat engem 5% Type trëtt.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄垯嚄进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄垯嚄 Б 8 8% провости длиззззунощ д д д в в рорумерупорупыйпогыу р> 80% мощноенарружощощн д д д в в рорумупыйпорыыупыйпорыйпымупыног 80 80% мощносе ззунощ д д д в в вррогрумгрупорыыйпору> 80% мощносе зууоще 10 10% д вюорогом групО ения параметров и 5% чатоотои оибок Топа i. Eng Muecht Analyse gouf ausgefouert fir eng Gruppgréisst ze wielen déi> 80% Kraaft ubidden fir 10% absolute Parameter z'entdecken an 5% Type IRE Taux.Tissue Sektioune goufen zoufälleg virum Experiment ausgewielt.All Analysë waren Konditioun blann a Echantillon waren nëmmen decoded nodeems all Daten analyséiert goufen.GraphPad Prism Software (San Diego, CA) gouf benotzt fir all statistesch Analysen ze maachen. Fir all Statistike goufen p-Wäerter bedeitend bei Wäerter <0,05 ugesinn. Fir all Statistike goufen p-Wäerter bedeitend bei Wäerter <0,05 ugesinn. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fir all Statistike goufen p-Wäerter bedeitend bei Wäerter <0,05 ugesinn.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fir all Statistike goufen p-Wäerter bedeitend bei Wäerter <0,05 ugesinn.Zwee-tailed Student d'T-Test gouf op den Donnéeën mat nëmmen 2 Vergläicher gesuergt.Een-Wee oder Zwee-Wee ANOVA gouf benotzt fir Bedeitung tëscht verschidde Gruppen ze bestëmmen.Wann Dir Post hoc Tester ausféiert, gouf dem Tukey seng Korrektur applizéiert fir verschidde Vergläicher ze berechnen.RNAsec Daten huet speziell statistesch Considératiounen wann FDR Berechent an p.adjust wéi an der Method Rubrik beschriwwen.
Fir méi Informatioun iwwer Studiedesign, kuckt den Nature Research Report Abstrakt verbonne mat dësem Artikel.