ຂໍຂອບໃຈສຳລັບການເຂົ້າເບິ່ງ Nature.com. ເວີຊັນຂອງບຣາວເຊີທີ່ທ່ານກຳລັງໃຊ້ຢູ່ມີການຮອງຮັບ CSS. ສໍາລັບປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ໃນລະຫວ່າງນີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະໜັບສະໜູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບ ແລະ JavaScript.
ມະນຸດ gut morphogenesis ສ້າງຕັ້ງລັກສະນະ crypt-villus ຂອງ microarchitecture epithelial 3D ແລະອົງການຈັດຕັ້ງ spatial. ໂຄງສ້າງທີ່ເປັນເອກະລັກນີ້ແມ່ນຕ້ອງການເພື່ອຮັກສາ homeostasis ລໍາໄສ້ໂດຍການປົກປ້ອງ niche ຈຸລັງລໍາຕົ້ນໃນ crypt ພື້ນຖານຈາກ antigens microbial exogenous ແລະ metabolites ຂອງເຂົາເຈົ້າ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການເຮັດວຽກຂອງເຊລກະເພາະລໍາໄສ້ທີ່ secreted ກັບ mucus ແລະ mucus ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ສິ່ງກີດຂວາງເທິງຜິວເນື້ອເຍື່ອ ລຳ ໄສ້. ສະນັ້ນ, ການສ້າງໂຄງສ້າງຂອງເຍື່ອເມືອກ 3D ແມ່ນມີຄວາມ ສຳ ຄັນຫຼາຍ ສຳ ລັບການສ້າງແບບຈໍາລອງຂອງ ລຳ ໄສ້ໃນ vitro. ໂດຍສະເພາະ, ຊີວະວິທະຍາຂອງ gut-on-a-chip ສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດ morphogenesis 3D spontaneous ຂອງ epithelium ລຳ ໄສ້ດ້ວຍການເສີມສ້າງການເຮັດວຽກຂອງ ລຳ ໄສ້, ຂະບວນການທາງຊີວະວິທະຍາ. ເພື່ອກະຕຸ້ນໃຫ້ເກີດ morphogenesis ລໍາໄສ້ຢ່າງແຂງແຮງຢູ່ໃນຊິບ microfluidic ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໃນຊິບປະສົມ Transwell ຝັງຢູ່. ພວກເຮົາອະທິບາຍວິທີການລະອຽດສໍາລັບການຜະລິດອຸປະກອນ, ການປູກຝັງຂອງ Caco-2 ຫຼືຈຸລັງ epithelial organoid ໃນລໍາໄສ້ໃນການຕັ້ງຄ່າແບບດັ້ງເດີມເຊັ່ນດຽວກັນກັບເວທີ microfluisis, ການ induction ຂອງ gene 3, ການ induction ຂອງ genesphoria. ຮູບແບບການຖ່າຍພາບຫຼາຍຮູບແບບ .ໂປຣໂຕຄໍນີ້ບັນລຸການຟື້ນຟູຂອງສະຖາປັດຕະຍະກຳຂອງລຳໄສ້ທີ່ມີປະໂຫຍດໂດຍການຄວບຄຸມການໄຫຼຂອງນໍ້າໃນຂັ້ນພື້ນຖານເປັນເວລາ 5 d. ວິທີການ morphogenesis ໃນ vitro ຂອງພວກເຮົາໃຊ້ຄວາມກົດດັນດ້ານສະລີລະວິທະຍາ ແລະ ການເຄື່ອນໄຫວທາງກົນຈັກ ແລະ ບໍ່ຈຳເປັນຕ້ອງມີວິສະວະກຳເຊລທີ່ຊັບຊ້ອນ ຫຼື ການໝູນໃຊ້, ເຊິ່ງອາດຈະດີກວ່າເຕັກນິກອື່ນໆທີ່ມີຢູ່ແລ້ວຂອງພວກເຮົາ. ຊຸມຊົນການຄົ້ນຄວ້າທາງຊີວະພາບ, ສະຫນອງວິທີການຟື້ນຟູຊັ້ນ epithelial ລໍາໄສ້ 3D ໃນ vitro ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ທາງຊີວະພາບ, ທາງດ້ານການຊ່ວຍ, ແລະຢາ.
ການທົດລອງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງ Caco-2 ຂອງກະເພາະລໍາໄສ້ທີ່ລ້ຽງລູກໃນລໍາໄສ້ເທິງຊິບ1,2,3,4,5 ຫຼືອຸປະກອນ microfluidic bilayer6,7 ສາມາດຜ່ານ spontaneous 3D morphogenesis ໃນ vitro ໂດຍບໍ່ມີຄວາມເຂົ້າໃຈທີ່ຊັດເຈນກ່ຽວກັບກົນໄກພື້ນຖານ. ມີຄວາມຈໍາເປັນແລະພຽງພໍທີ່ຈະກະຕຸ້ນ 3D epithelial morphogenesis ໃນ vitro, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນໂດຍ Caco-2 ແລະ organoids ລໍາໄສ້ທີ່ມາຈາກຄົນເຈັບ. ຈຸລັງ Epithelial ໄດ້ຖືກກວດສອບແລ້ວ. ໃນການສຶກສານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ໂດຍສະເພາະໃນການຜະລິດເຊນແລະການແຜ່ກະຈາຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຕົວຕ້ານທານ Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), ໃນ gut-on-a-chip ແລະອຸປະກອນ microfluidic ທີ່ຖືກດັດແປງທີ່ປະກອບດ້ວຍ Transwell inserts, ເອີ້ນວ່າ "Hybrid Chip". repressor 1, secreted frizzled-related-related protein 1, or Soggy-1) to the on-chip gut inhibits morphogenesis or disrupts the prestructured epithelial layer 3D , ແນະນໍາວ່າຄວາມກົດດັນເປັນສັດຕູກັນລະຫວ່າງວັດທະນະທໍາແມ່ນຮັບຜິດຊອບສໍາລັບ morphogenesis ລໍາໄສ້ໃນ vitro. ດັ່ງນັ້ນ, ວິທີການປະຕິບັດຕົວຈິງແມ່ນການແກ້ໄຂຫຼືການໂຍກຍ້າຍຂອງ epithelial. ຮັກສາລະດັບຂອງ Wnt antagonists ໃນ basolateral compartment ໂດຍການ flushing ການເຄື່ອນໄຫວ (e. gut-on-a-chip ຫຼື hybrid-on-a-chip platforms) ຫຼືການແຜ່ກະຈາຍ .Basolateral media (e. g. ຈາກ Transwell inserts into large basolateral reservoirs in well).
ໃນໂປໂຕຄອນນີ້, ພວກເຮົາໃຫ້ວິທີການລະອຽດສໍາລັບການ fabricating gut-on-a-chip microdevices ແລະ Transwell-insertable hybrid chips (ຂັ້ນຕອນ 1-5) ເພື່ອວັດທະນະທໍາຈຸລັງ epithelial intestinal ເທິງ polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (ຂັ້ນຕອນ 6A, 7A, 8, 9B ຂອງ inserts, polydimethylsiloxane (ຂັ້ນຕອນ 6A, 7A, 8, 9) membranes. 8, 9) ແລະ induced 3D morphogenesis in vitro (ຂັ້ນຕອນທີ 10).ພວກເຮົາຍັງໄດ້ລະບຸຄຸນສົມບັດຂອງເຊວລູລາ ແລະໂມເລກຸນທີ່ຊີ້ບອກເຖິງການເກີດຂອງຈຸລັງສະເພາະ ແລະຄວາມແຕກຕ່າງຂອງເຊລລູລາທີ່ຂຶ້ນກັບເຊື້ອສາຍໂດຍການໃຊ້ຫຼາຍຮູບແບບການຖ່າຍຮູບ (ຂັ້ນຕອນ 11-24).ພວກເຮົາເຮັດໃຫ້ເກີດ morphogenesis ເຊັ່ນ: ຈຸລັງ intestintest ຂອງມະນຸດ ຫຼື Cali-intest ຂອງມະນຸດ. organoids, ໃນສອງຮູບແບບວັດທະນະທໍາທີ່ມີລາຍລະອຽດດ້ານວິຊາການລວມທັງການດັດແປງພື້ນຜິວຂອງເຍື່ອ porous, ການສ້າງ monolayers 2D, ແລະທາງຊີວະເຄມີໃນລໍາໄສ້ແລະການແຜ່ພັນຂອງ microenvironment.in vitro.in vitro. ເພື່ອ induce morphogenesis 3D ຈາກ 2D epithelial, ພວກເຮົາເອົາ morphogen antagonists ເຂົ້າໄປໃນເນື້ອເຍື່ອຂອງວັດທະນະທໍາຂະຫນາດກາງ. ວັດທະນະທໍາ. ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາສະຫນອງການເປັນຕົວແທນຂອງຜົນປະໂຫຍດຂອງຊັ້ນ epithelial 3D ທີ່ສາມາດຜະລິດຄືນໃຫມ່ໄດ້ທີ່ສາມາດນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງແບບຈໍາລອງການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ epithelial ທີ່ຂຶ້ນກັບ morphogen, ການປູກຝັງຮ່ວມກັນຕາມລວງຍາວຂອງ microbiome, ການຕິດເຊື້ອຂອງເຊື້ອພະຍາດ, ການບາດເຈັບອັກເສບ, ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງອຸປະສັກ epithelial ແລະການປິ່ນປົວດ້ວຍ probiotics. ຕົວຢ່າງ.
ໂປຣໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາອາດຈະເປັນປະໂຫຍດຕໍ່ນັກວິທະຍາສາດຫຼາຍໆຄົນໃນຂັ້ນພື້ນຖານ (ເຊັ່ນ: ຊີວະວິທະຍາຂອງເຍື່ອເມືອກກະເພາະລໍາໄສ້, ຊີວະວິທະຍາຂອງເຊລລໍາຕົ້ນ, ແລະຊີວະວິທະຍາການພັດທະນາ) ແລະການຄົ້ນຄວ້ານໍາໃຊ້ (ຕົວຢ່າງ, ການທົດສອບຢາ preclinical, ການສ້າງແບບຈໍາລອງພະຍາດ, ວິສະວະກໍາເນື້ອເຍື່ອ, ແລະລໍາໄສ້) ຜົນກະທົບຢ່າງກວ້າງຂວາງ. ເນື່ອງຈາກວ່າການສືບພັນຂອງຈຸລັງລໍາຕົ້ນແລະຊີວະວິທະຍາການຈະເລີນເຕີບໂຕ (e.g., ການທົດສອບຢາ preclinical, ການສ້າງແບບຈໍາລອງພະຍາດ, ວິສະວະກໍາເນື້ອເຍື່ອ, ແລະ gastroenterology) ຜົນກະທົບຢ່າງກວ້າງຂວາງ. ເນື່ອງຈາກວ່າການແຜ່ພັນແລະ robustness ingenes3 ທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງການທົດສອບຂອງພວກເຮົາ. epithelium in vitro, ພວກເຮົາຄິດວ່າຍຸດທະສາດດ້ານວິຊາການຂອງພວກເຮົາສາມາດຖືກເຜີຍແຜ່ໃຫ້ຜູ້ຊົມທີ່ສຶກສາການເຄື່ອນໄຫວຂອງສັນຍານຂອງເຊນໃນລະຫວ່າງການພັດທະນາກະເພາະລໍາໄສ້, ການຟື້ນຟູຫຼື homeostasis .ນອກຈາກນັ້ນ, ໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາແມ່ນເປັນປະໂຫຍດສໍາລັບການສອບຖາມການຕິດເຊື້ອພາຍໃຕ້ຕົວແທນການຕິດເຊື້ອຕ່າງໆເຊັ່ນ: Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome CoV-2), SARS-2 (SARS-phileridium) . 9 ຫຼື Vibrio cholerae. ຜູ້ຊົມຂອງພະຍາດ pathology ແລະ pathogenesis ແມ່ນຍັງເປັນປະໂຫຍດ. ການນໍາໃຊ້ລະບົບ microphysiology ລໍາໄສ້ on-chip ອາດຈະອະນຸຍາດໃຫ້ longitudinal co-culture 10 ແລະການປະເມີນຕໍ່ມາຂອງການປ້ອງກັນຂອງເຈົ້າພາບ, ການຕອບສະຫນອງຂອງພູມຕ້ານທານແລະການສ້ອມແປງການບາດເຈັບທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເຊື້ອພະຍາດໃນກະເພາະລໍາໄສ້ (GI) tract 11 .Other GI disease, ພະຍາດຂອງພືດ, ພະຍາດຂອງພືດໃນລໍາໄສ້. ໂຣກ ulcerative colitis, pouchitis, ຫຼືໂຣກກະເພາະລໍາໄສ້ທີ່ລະຄາຍເຄືອງສາມາດຈໍາລອງໄດ້ເມື່ອຊັ້ນ epithelial ລໍາໄສ້ 3D ຖືກກະກຽມໂດຍໃຊ້ຊັ້ນ epithelial ລໍາໄສ້ 3D ຂອງຄົນເຈັບ, ພະຍາດເຫຼົ່ານີ້ປະກອບມີການຫົດຕົວຂອງ villous, crypt shortening, mucosal ທໍາລາຍ, ຫຼື impaired epithelial barrier.Biopsyal ຫຼືຈຸລັງ. organoids12,13.ເພື່ອສ້າງແບບຈໍາລອງໃຫ້ດີກວ່າສະພາບແວດລ້ອມຂອງພະຍາດທີ່ສັບສົນ, ຜູ້ອ່ານອາດຈະພິຈາລະນາເພີ່ມປະເພດຂອງເຊນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ, ເຊັ່ນ: ຈຸລັງ mononuclear ເລືອດ peripheral ຂອງຄົນເຈັບ (PBMCs), ກັບຕົວແບບທີ່ມີ 3D intestinal villus-crypt microarchitectures. ຈຸລັງພູມຕ້ານທານສະເພາະຂອງຈຸລັງ, 5.
ເນື່ອງຈາກຈຸນລະພາກຂອງ epithelial 3D ສາມາດຖືກສ້ອມແຊມແລະເບິ່ງເຫັນໄດ້ໂດຍບໍ່ມີຂະບວນການແບ່ງສ່ວນ, ຜູ້ຊົມທີ່ເຮັດວຽກກ່ຽວກັບ spatial transscriptomics ແລະຮູບພາບທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງຫຼືຄວາມລະອຽດສູງອາດຈະມີຄວາມສົນໃຈໃນແຜນທີ່ຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການເຄື່ອນໄຫວຂອງ spatiotemporal ຂອງ genes ແລະທາດໂປຼຕີນໃນ niches epithelial. ມີຄວາມສົນໃຈໃນເຕັກໂນໂລຊີ.ການຕອບສະຫນອງຕໍ່ຈຸລິນຊີຫຼືພູມຕ້ານທານ stimuli.ນອກຈາກນັ້ນ, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 ທີ່ປະສານງານ homeostasis ລໍາໄສ້ສາມາດໄດ້ຮັບການສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນຊັ້ນ mucosal ລໍາໄສ້ 3D ໂດຍການຮ່ວມກັນລ້ຽງຈຸລິນຊີຊະນິດຕ່າງໆ, ຊຸມຊົນຈຸລິນຊີຫຼື microbiota fecal, ໂດຍສະເພາະໃນ microbiota. ໃນ platform. ວິທີການນີ້ແມ່ນຫນ້າສົນໃຈໂດຍສະເພາະກັບຜູ້ຊົມທີ່ສຶກສາລະບົບພູມຕ້ານທານ mucosal, gastroenterology, microbiome ຂອງມະນຸດ, culturomics ແລະຈຸລິນຊີທາງຄລີນິກທີ່ຊອກຫາການປູກຝັງ microbiota gut uncultured ກ່ອນຫນ້ານີ້ຢູ່ໃນຫ້ອງທົດລອງ. ຖ້າ in vitro morphogenesis protocol ຂອງພວກເຮົາສາມາດໄດ້ຮັບການປັບຕົວເຂົ້າກັບວັດທະນະທໍາ scalable4 ຮູບແບບ inserts multiwell4 9, as well as 6. ແຜ່ນທີ່ສືບຕໍ່ຕື່ມຂໍ້ມູນໃສ່ basolateral compartments, ອະນຸສັນຍາຍັງສາມາດຖືກເຜີຍແຜ່ໃຫ້ກັບຜູ້ພັດທະນາການຢາ, ຊີວະການແພດ ຫຼືເວທີການກວດສອບ ຫຼືການກວດສອບຄວາມຖືກຕ້ອງສູງສຳລັບອຸດສາຫະກໍາອາຫານ. ໃນຖານະເປັນຫຼັກການຫຼັກຖານ, ພວກເຮົາບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ multiplex high-throughput morphogenesis system, 2 s. ຜະລິດຕະພັນ organ-on-a-chip ໄດ້ຖືກເຮັດເປັນການຄ້າ16,17,18.ດັ່ງນັ້ນ, ການກວດສອບຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງວິທີການ morphogenesis in vitro ຂອງພວກເຮົາສາມາດເລັ່ງໄດ້ແລະອາດຈະໄດ້ຮັບການຮັບຮອງເອົາໂດຍຫ້ອງທົດລອງຄົ້ນຄ້ວາ, ອຸດສາຫະກໍາຫຼືລັດຖະບານແລະອົງການກົດລະບຽບເພື່ອເຂົ້າໃຈ reprogramming ຈຸລັງຂອງ in vitro gut morphogenesis ໃນລະດັບ transcriptomic ການປິ່ນປົວຂອງຢາເສບຕິດແລະ abstraction ຂອງຢາເສບຕິດ. ການປະເມີນໂດຍໃຊ້ 3D gut surrogates ຫຼືໃຊ້ແບບຈໍາລອງອະໄວຍະວະທາງການຄ້າທີ່ກໍາຫນົດເອງຫຼືທາງການຄ້າເພື່ອປະເມີນການສືບພັນຂອງຂະບວນການ morphogenesis ລໍາໄສ້.
ຈໍານວນຈໍາກັດຂອງຕົວແບບທົດລອງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະນຸດໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສຶກສາ morphogenesis epithelial ລໍາໄສ້, ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຍ້ອນການຂາດໂປໂຕຄອນທີ່ສາມາດປະຕິບັດໄດ້ເພື່ອກະຕຸ້ນໃຫ້ເກີດ morphogenesis 3D ໃນ vitro. ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ຄວາມຮູ້ໃນປະຈຸບັນກ່ຽວກັບ gut morphogenesis ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນອີງໃສ່ການສຶກສາຂອງສັດ (ຕົວຢ່າງ, zebrafish20, mice21H) ຫຼື ໄກ່, ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍ 2-2. ຄໍາຖາມທາງດ້ານຈັນຍາບັນ, ແລະສໍາຄັນທີ່ສຸດ, ບໍ່ໄດ້ກໍານົດຢ່າງຈະແຈ້ງຂະບວນການພັດທະນາຂອງມະນຸດ. ຮູບແບບເຫຼົ່ານີ້ຍັງຈໍາກັດຫຼາຍໃນການທົດສອບຄວາມສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ຫຼາຍວິທີ. ດັ່ງນັ້ນ, ອະນຸສັນຍາຂອງພວກເຮົາສໍາລັບການສ້າງໂຄງສ້າງເນື້ອເຍື່ອ 3D ໃນ vitro ດີກວ່າໃນຕົວແບບສັດ vivo ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຮູບແບບວັດທະນະທໍາ 2D ແບບຄົງທີ່ແບບດັ້ງເດີມອື່ນໆ. D 3 ໂຄງສ້າງຂອງພວກເຮົາກ່ອນຫນ້ານີ້ໄດ້ອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາ delicizing. ກວດສອບການຕັ້ງຖິ່ນຖານທາງກວ້າງຂອງຈຸລັງທີ່ແຕກຕ່າງໃນແກນ crypt-villus ໃນການຕອບສະໜອງຕໍ່ກັບການກະຕຸ້ນຂອງເຍື່ອເມືອກ ຫຼືພູມຄຸ້ມກັນຕ່າງໆ. ຊັ້ນ epithelial 3D ສາມາດໃຫ້ພື້ນທີ່ເພື່ອສຶກສາວິທີການທີ່ຈຸລັງຈຸລິນຊີແຂ່ງຂັນກັນເພື່ອສ້າງເປັນຊ່ອງຫວ່າງ ແລະວິວັດທະນາການທາງລະບົບນິເວດໃນການຕອບສະໜອງຕໍ່ປັດໃຈທີ່ເປັນເຈົ້າພາບ (ຕົວຢ່າງ: ຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະ ແລະຊັ້ນນອກຂອງຂີ້ມູກ, Irog A. peptides).ນອກຈາກນັ້ນ, morphology epithelial 3D ສາມາດເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາເຂົ້າໃຈວິທີການ microbiota ລໍາໄສ້ໂຄງສ້າງຊຸມຊົນຂອງຕົນແລະ synergistically ຜະລິດ metabolites microbial (ເຊັ່ນ: ອາຊິດໄຂມັນສາຍສັ້ນ) ທີ່ສ້າງອົງການຈັດຕັ້ງຂອງຈຸລັງແລະ niches ຈຸລັງລໍາຕົ້ນໃນ basal vicrypts. ລັກສະນະເຫຼົ່ານີ້ສາມາດສະແດງອອກພຽງແຕ່ 3 ຊັ້ນ.
ນອກເຫນືອໄປຈາກວິທີການຂອງພວກເຮົາໃນການສ້າງໂຄງສ້າງຂອງລໍາໄສ້ 3D, ມີຫຼາຍວິທີ in vitro. ວັດທະນະທໍາ organoid ຂອງລໍາໄສ້ເປັນເຕັກນິກວິສະວະກໍາຈຸລັງທີ່ທັນສະໄຫມໂດຍອີງໃສ່ການປູກຝັງຂອງຈຸລັງລໍາຕົ້ນຂອງລໍາໄສ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ morphogen ສະເພາະ 23,24,25. ແນວໃດກໍ່ຕາມ, ການນໍາໃຊ້ 3D organoid ແບບຈໍາລອງການເປັນເຈົ້າພາບ - charobiest ມັກຈະເປັນ courest organoid ການວິເຄາະ. lumen ລໍາໄສ້ແມ່ນຖືກປິດລ້ອມພາຍໃນ organoid ແລະ, ດັ່ງນັ້ນ, ການແນະນໍາອົງປະກອບ luminal ເຊັ່ນຈຸລັງຈຸລິນຊີຫຼື antigens exogenous ແມ່ນຈໍາກັດ. ການເຂົ້າເຖິງ organoid lumens ສາມາດປັບປຸງໄດ້ໂດຍໃຊ້ microinjector, 26,27 ແຕ່ວິທີການນີ້ແມ່ນບຸກລຸກແລະໃຊ້ແຮງງານຫຼາຍແລະຕ້ອງການຄວາມຮູ້ພິເສດເພື່ອປະຕິບັດ. ນອກຈາກນັ້ນ, ວັດທະນະທໍາ organoid ແບບດັ້ງເດີມທີ່ຮັກສາໄວ້ໃນ scaffolds hydrogel ພາຍໃຕ້ສະພາບຄົງທີ່ບໍ່ໄດ້ສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນຢ່າງຖືກຕ້ອງໃນ biomechanics vivo.
ວິທີການອື່ນໆທີ່ຖືກຈ້າງໂດຍກຸ່ມຄົ້ນຄ້ວາຫຼາຍນໍາໃຊ້ scaffolds hydrogel 3D prestructured ເພື່ອ mimic ໂຄງປະກອບການ epithelial ລໍາໄສ້ໂດຍການປູກຝັງຈຸລັງລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດທີ່ໂດດດ່ຽວຢູ່ເທິງພື້ນຜິວ gel. ການສ້າງ scaffolds hydrogel ໂດຍໃຊ້ 3D-printed, micro-milled, ຫຼື lithographically fabricated ຈຸລັງ. physiologically ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ morphogen gradients, ການສ້າງຕັ້ງໂຄງສ້າງ epithelial ອັດຕາສ່ວນສູງແລະ stroma-epithelial crosstalk ໂດຍການລວມເອົາຈຸລັງ stromal ໃນ scaffold. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ລັກສະນະຂອງ scaffolds prestructured ອາດຈະປ້ອງກັນການສະແດງຂອງຂະບວນການ morphogenetic spontaneous ຕົວຂອງມັນເອງ. ຈຸລັງກະເພາະລໍາໄສ້ຕ້ອງໄດ້ຮັບການ morphogenesis ແລະໄດ້ຮັບຫນ້າທີ່ທາງກາຍະພາບ. ການສຶກສາໃຫມ່ອີກອັນຫນຶ່ງໄດ້ນໍາໃຊ້ scaffolds hydrogel ໃນເວທີ microfluidic ແລະໂຄງສ້າງ epithelial ລໍາໄສ້ທີ່ມີຮູບແບບໂດຍໃຊ້ laser-etching techniques. organoids ລໍາໄສ້ຂອງຫນູປະຕິບັດຕາມຮູບແບບ etched ເພື່ອສ້າງເປັນໂຄງສ້າງທໍ່ລໍາໄສ້, ແລະໂມດູນ intraluminal fluid ສາມາດໄຫຼຄືນໄດ້. ແບບຈໍາລອງບໍ່ໄດ້ສະແດງຂະບວນການ morphogenetic spontaneous ຫຼືປະກອບມີການເຄື່ອນໄຫວຂອງ gut mechanobiological ລໍາໄສ້. ເຕັກນິກການພິມ 3D ຈາກກຸ່ມດຽວກັນສາມາດສ້າງທໍ່ລໍາໄສ້ຂະຫນາດນ້ອຍທີ່ມີຂະບວນການ morphogenetic spontaneous. ເຖິງແມ່ນວ່າ fabrication ສະລັບສັບຊ້ອນຂອງພາກສ່ວນ gut ທີ່ແຕກຕ່າງກັນພາຍໃນທໍ່, ຮູບແບບນີ້ຍັງຂາດ operability ແລະ luminalformation flux . ຈໍາກັດ, ໂດຍສະເພາະຫຼັງຈາກຂະບວນການ bioprinting ສໍາເລັດ, ລົບກວນສະພາບການທົດລອງຫຼືປະຕິສໍາພັນຂອງເຊນກັບເຊນ. ແທນທີ່ຈະ, ພິທີການຂອງພວກເຮົາສະເຫນີໃຫ້ morphogenesis gut spontaneous, physiologically shear stress, biomechanics ທີ່ mimic gut motility, ການເຂົ້າເຖິງຂອງ apical ເອກະລາດແລະ basolateral compartments ການຟື້ນຟູຊີວະພາບຂອງພວກເຮົາ. ອະນຸສັນຍາ 3D morphogenesis ໃນ vitro ອາດຈະສະຫນອງວິທີການເສີມເພື່ອເອົາຊະນະສິ່ງທ້າທາຍຂອງວິທີການທີ່ມີຢູ່.
ໂປຣໂຕຄໍຂອງພວກເຮົາແມ່ນສຸມໃສ່ທັງໝົດກ່ຽວກັບ 3D epithelial morphogenesis, ມີພຽງແຕ່ຈຸລັງ epithelial ໃນວັດທະນະທໍາແລະບໍ່ມີປະເພດຂອງຈຸລັງອື່ນໆທີ່ຢູ່ອ້ອມຂ້າງເຊັ່ນ: ຈຸລັງ mesenchymal, ຈຸລັງ endothelial, ແລະຈຸລັງພູມຕ້ານທານ. ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້, ຫຼັກຂອງໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາແມ່ນການກະຕຸ້ນຂອງ morphogenesis epithelial ໂດຍການກໍາຈັດ morphogen secreted ຂ້າງກາງ. modularity ທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງ gut-on-a-chip ຂອງພວກເຮົາແລະ hybrid-on-a-chip ອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາສ້າງຊັ້ນ epithelial 3D undulating, ສະລັບສັບຊ້ອນທາງຊີວະພາບເພີ່ມເຕີມເຊັ່ນ: epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ແລະ, ໃນຮູບແບບການຖ່າຍທອດລະຫັດລັບຂອງພວກເຮົາ, crypt-basstem cell ຂອງພວກເຮົາ. ຍັງຄົງໄດ້ຮັບການພິຈາລະນາຕື່ມອີກ. ຈຸລັງ Stromal (ຕົວຢ່າງ, fibroblasts) ໃນ mesenchyme ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນການຜະລິດໂປຣຕີນ ECM ແລະລະບຽບການຂອງ morphogenesis ລໍາໄສ້ໃນ vivo35,37,38.ການເພີ່ມເຕີມຂອງຈຸລັງ mesenchymal ກັບຕົວແບບຂອງພວກເຮົາໄດ້ປັບປຸງຂະບວນການ morphogenetic ແລະປະສິດທິພາບການຕິດຂອງເຊນ. The endothelial ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນ layer molecular regulating (ie, capillary). transport39 ແລະການທົດແທນທີ່ຈຸລັງພູມຕ້ານທານ 40 ໃນ microenvironment ຂອງລໍາໄສ້. ນອກຈາກນັ້ນ, ອົງປະກອບ vasculature ທີ່ສາມາດເຊື່ອມຕໍ່ລະຫວ່າງຕົວແບບຂອງເນື້ອເຍື່ອແມ່ນເປັນເງື່ອນໄຂເບື້ອງຕົ້ນໃນເວລາທີ່ຕົວແບບຂອງເນື້ອເຍື່ອຖືກອອກແບບມາເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນການໂຕ້ຕອບຫຼາຍອະໄວຍະວະ. ດັ່ງນັ້ນ, ຈຸລັງ endothelial ອາດຈະຈໍາເປັນຕ້ອງຖືກລວມເຂົ້າເພື່ອສ້າງແບບຈໍາລອງລັກສະນະທາງກາຍະພາບທີ່ຖືກຕ້ອງຫຼາຍຂຶ້ນກັບຄວາມລະອຽດຂອງອະໄວຍະວະ. ການນໍາສະເຫນີ antigen, innate adaptive immune crosstalk, ແລະພູມຕ້ານທານສະເພາະຂອງເນື້ອເຍື່ອໃນສະພາບການຂອງ mimicking ພະຍາດລໍາໄສ້.
ການນໍາໃຊ້ຊິບປະສົມແມ່ນກົງໄປກົງມາຫຼາຍກ່ວາຊິບໃນລໍາໄສ້ເພາະວ່າການຕິດຕັ້ງອຸປະກອນແມ່ນງ່າຍດາຍກວ່າແລະການນໍາໃຊ້ Transwell inserts ອະນຸຍາດໃຫ້ຂະຫຍາຍວັດທະນະທໍາຂອງ epithelium ລໍາໄສ້. ແນວໃດກໍ່ຕາມ, ແຜ່ນໃສ່ Transwell ທີ່ມີຂາຍໃນການຄ້າມີເຍື່ອໂພລີເອສເຕີແມ່ນບໍ່ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນແລະບໍ່ສາມາດຈໍາລອງການເຄື່ອນໄຫວຄ້າຍຄື peristaltic ໄດ້. ນອກຈາກນັ້ນ, ຊິບທີ່ວາງໄວ້ຢູ່ໃນສະຖານີ apical hybrid ຍັງຄົງຢູ່. ບໍ່ມີຄວາມກົດດັນດ້ານຂ້າງຂອງ apical. ເຫັນໄດ້ຊັດເຈນ, ຄຸນສົມບັດຄົງທີ່ຢູ່ໃນຊ່ອງ apical ບໍ່ຄ່ອຍຈະເປີດໃຊ້ການລ້ຽງລູກດ້ວຍເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໃນໄລຍະຍາວໃນຊິບປະສົມ. ໃນຂະນະທີ່ພວກເຮົາສາມາດກະຕຸ້ນໃຫ້ເກີດ morphogenesis 3D ຢ່າງແຂງແຮງໃນຕົວແຊກ Transwell ໃນເວລາໃຊ້ຊິບປະສົມ, ການຂາດແຄນຂອງ physiologically ກ່ຽວຂ້ອງກັບການ physiologically ຂອງການໄຫຼວຽນຂອງ chipfeidas ແພລະຕະຟອມ biomechanical ແລະ ap. ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກທີ່ມີທ່າແຮງ.
ການສ້າງຄືນໃຫມ່ຂອງແກນ crypt-villus ຂອງມະນຸດໃນ gut-on-a-chip ແລະ hybrid-on-a-chip ວັດທະນະທໍາຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນຢ່າງເຕັມສ່ວນ. ເນື່ອງຈາກວ່າ morphogenesis ເລີ່ມຕົ້ນຈາກ monolayer epithelial, ສະຖາປັດຕະຍະກໍາ 3D ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງສະຫນອງຄວາມຄ້າຍຄືກັນທາງ morphological ກັບ crypts ປະຊາກອນທີ່ມີຊີວິດຊີວາ. ໂດເມນໃນ epithelium 3D ວິສະວະກໍາຈຸລະພາກ, ພື້ນທີ່ crypt ແລະ villous ບໍ່ໄດ້ຖືກແບ່ງອອກຢ່າງຊັດເຈນ. ເຖິງແມ່ນວ່າຊ່ອງທາງເທິງທີ່ສູງຂຶ້ນໃນຊິບນໍາໄປສູ່ການເພີ່ມຄວາມສູງຂອງ epithelium microengineered, ລະດັບຄວາມສູງສູງສຸດແມ່ນຍັງຈໍາກັດຢູ່ທີ່ ~ 300-400 µm. ຄວາມເລິກທີ່ແທ້ຈິງຂອງ crypts ລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດໃນຂະຫນາດນ້ອຍ ~ 0 µm 3 µm ແລະ intestine ຂະຫນາດໃຫຍ່. ຕາມລໍາດັບ, ແລະຄວາມສູງຂອງ villi ລໍາໄສ້ຂະຫນາດນ້ອຍແມ່ນ ~ 600 µm41.
ຈາກທັດສະນະການຖ່າຍພາບ, ການຖ່າຍພາບທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງຂອງສະຖາປັດຕະຍະກຳ 3 ມິຕິຂອງຈຸນລະພາກອາດຈະຖືກຈຳກັດໃຫ້ຢູ່ໃນຊິບ, ເພາະວ່າໄລຍະການເຮັດວຽກທີ່ຕ້ອງການຈາກເລນເປົ້າໝາຍເຖິງຊັ້ນ epithelial ແມ່ນຢູ່ຕາມລຳດັບຂອງສອງສາມມິນລີແມັດ. ເພື່ອເອົາຊະນະບັນຫານີ້, ເປົ້າໝາຍທີ່ຫ່າງໄກອາດຈະຕ້ອງການ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການເຮັດໃຫ້ພາກສ່ວນບາງໆທີ່ຢືດຢຸ່ນເພື່ອກະກຽມການຖ່າຍຮູບໄດ້ສູງ. PDMS. ນອກຈາກນັ້ນ, ນັບຕັ້ງແຕ່ microfabrication ຊັ້ນ by-layer ຂອງລໍາໄສ້ໃນ chip ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຍຶດຕິດຖາວອນລະຫວ່າງແຕ່ລະຊັ້ນ, ມັນເປັນສິ່ງທ້າທາຍທີ່ສຸດທີ່ຈະເປີດຫຼືເອົາຊັ້ນເທິງເພື່ອກວດກາເບິ່ງໂຄງສ້າງຂອງຊັ້ນ epithelial. ສໍາລັບການຍົກຕົວຢ່າງ, ໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດເອເລັກໂຕຣນິກສະແກນ (SEM).
hydrophobicity ຂອງ PDMS ໄດ້ເປັນປັດໃຈຈໍາກັດໃນການສຶກສາ microfluidic ທີ່ຈັດການກັບໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍ hydrophobic, ເນື່ອງຈາກວ່າ PDMS ສາມາດດູດຊຶມໂມເລກຸນ hydrophobic ດັ່ງກ່າວໂດຍບໍ່ສະເພາະ. ທາງເລືອກຂອງ PDMS ອາດຈະຖືກພິຈາລະນາກັບວັດສະດຸໂພລີເມີອື່ນໆ. ອີກທາງເລືອກ, ການດັດແປງຫນ້າດິນຂອງ PDMS (ເຊັ່ນ: ການເຄືອບ polyethene ຫຼື lipophilic ວັດສະດຸ 42ylphilic). ) ສາມາດພິຈາລະນາເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການດູດຊຶມຂອງໂມເລກຸນ hydrophobic.
ສຸດທ້າຍ, ວິທີການຂອງພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ມີລັກສະນະທີ່ດີໃນແງ່ຂອງການສະຫນອງການຄັດລອກໂດຍຜ່ານລະດັບສູງຫຼືເວທີການທົດລອງທີ່ເປັນມິດກັບຜູ້ໃຊ້ "ຫນຶ່ງຂະຫນາດເຫມາະທັງຫມົດ". 96-well, ຫຼື 384-well porous inserts ທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ການທົດແທນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງແລະການໂຍກຍ້າຍຂອງສື່ມວນຊົນ basolateral).
ເພື່ອສ້າງ 3D morphogenesis ຂອງ epithelium ລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດໃນ vitro, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ອຸປະກອນໃນລໍາໄສ້ຊິບ microfluidic ທີ່ປະກອບດ້ວຍສອງ microchannels ຂະຫນານແລະເຍື່ອ porous elastic ໃນລະຫວ່າງເພື່ອສ້າງການໂຕ້ຕອບ lumen-capillary. ພວກເຮົາຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນການນໍາໃຊ້ອຸປະກອນ microfluidic ຊ່ອງດຽວ (ເປັນ chip ດ້ານຂ້າງປະສົມ) ການຂະຫຍາຍຕົວຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງຂອງ epineath baslio ໄດ້. Transwell inserts.In two platforms, morphogenesis of various intestinal intestinal cells can be demonstrated by applying directional manipulation of flow to remove morphogen antagonists from the basolateral compartment.ຂັ້ນຕອນການທົດລອງທັງໝົດ (ຮູບທີ 1) ປະກອບດ້ວຍຫ້າພາກສ່ວນ: (i) microfabrication ຂອງ chip gutable ໄດ້, 1step ກ່ອງ, ຫຼື 1-Transwell insert. (ii) ການກະກຽມຂອງຈຸລັງ epithelial ລໍາໄສ້ (ຈຸລັງ Caco-2) ຫຼື organoids ລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດ; ກ່ອງ 2-5), (iii) ວັດທະນະທໍາຂອງຈຸລັງ epithelial ລໍາໄສ້ໃນ chip ລໍາໄສ້ຫຼື chip ປະສົມ (ຂັ້ນຕອນ 6-9), (iv) induction ຂອງ 3D morphogenesis ໃນ vitro (ຂັ້ນຕອນ 10) ແລະ (v) ) ເພື່ອ characterize the 3D epithelial microstructure (ຂັ້ນຕອນ 11-24, ການຄວບຄຸມເພີ່ມເຕີມແມ່ນກຸ່ມທີ່ເຫມາະສົມ). ກວດສອບປະສິດທິພາບຂອງ morphogenesis ໃນ vitro ໂດຍການປຽບທຽບ morphogenesis epithelial ກັບການຄວບຄຸມທາງກວ້າງຂອງພື້ນ, ທາງໂລກ, ຕາມເງື່ອນໄຂ, ຫຼືຂັ້ນຕອນການຄວບຄຸມ.
ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ສອງແພລະຕະຟອມວັດທະນະທໍາທີ່ແຕກຕ່າງກັນ: gut-on-a-chip ທີ່ມີຊ່ອງທາງກົງຫຼືຊ່ອງ convoluted nonlinear, ຫຼື chip hybrid ທີ່ປະກອບດ້ວຍ Transwell (TW) inserts ໃນອຸປະກອນ microfluidic, fabricated ຕາມທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນກ່ອງ 1, ແລະຂັ້ນຕອນ 1 -5. "ອຸປະກອນ Fabrication" ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂັ້ນຕອນຕົ້ນຕໍໃນການສ້າງຊິບດຽວຫຼື chip hybrid ຈຸລັງຂອງມະນຸດ. ແຫຼ່ງ (Caco-2 ຫຼື organoids ໃນລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດ) ແລະຂະບວນການວັດທະນະທໍາທີ່ໃຊ້ໃນອະນຸສັນຍານີ້. "In vitro morphogenesis" ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂັ້ນຕອນໂດຍລວມທີ່ Caco-2 ຫຼືຈຸລັງ epithelial ທີ່ມາຈາກ organoid ໄດ້ຖືກຝັງຢູ່ໃນຊິບລໍາໄສ້ຫຼືໃສ່ Transwell ຂອງຊິບປະສົມ, ປະຕິບັດຕາມໂດຍການກະຕຸ້ນຂອງ 3D epithelial ໂຄງສ້າງຂອງຕົວເລກຫຼືໂຄງສ້າງຂອງ morphogenesis. ແມ່ນສະແດງຢູ່ລຸ່ມລູກສອນແຕ່ລະອັນ. ແອັບພລິເຄຊັນໃຫ້ຕົວຢ່າງຂອງວິທີການທີ່ຕັ້ງຂອງຊັ້ນ epithelial ລໍາໄສ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້, ສໍາລັບການຍົກຕົວຢ່າງ, ໃນລັກສະນະຄວາມແຕກຕ່າງຂອງເຊນ, ການສຶກສາທາງກາຍະພາບຂອງລໍາໄສ້, ການສ້າງຕັ້ງລະບົບນິເວດ microbiome, ແລະການສ້າງແບບຈໍາລອງພະຍາດ. ຮູບພາບຂອງ Immunofluorescence ໃນ "ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຈຸລັງ" ສະແດງໃຫ້ເຫັນ nuclei, F-actin ແລະ MUC-23dli ສະແດງອອກໃນຊັ້ນ epithelial ຂອງ Ca-23. gut chip.MUC2 signaling ແມ່ນມີຢູ່ໃນຈຸລັງ goblet ແລະ mucus secreted ຈາກ mucosal ຜິວເນື້ອສີຂາວ.ຮູບພາບ Fluorescent ໃນ Gut Physiology ສະແດງໃຫ້ເຫັນ mucus ທີ່ຜະລິດໂດຍການ staining ສໍາລັບອາຊິດ sialic ແລະ N-acetylglucosamine residues fluorescent wheat germ agglutinin.ທັງສອງຮູບທີ່ທັບຊ້ອນກັນໃນ "host-Microbes" ຕົວແທນ co-host. ລໍາໄສ້ຢູ່ເທິງຊິບ.ແຜງດ້ານຊ້າຍສະແດງໃຫ້ເຫັນການຮ່ວມວັດທະນະທໍາຂອງ E. coli ສະແດງທາດໂປຼຕີນຈາກ fluorescent ສີຂຽວ (GFP) ກັບຈຸລັງ epithelial 3D Caco-2 ວິສະວະກໍາຈຸນລະພາກ. ແຜງດ້ານຂວາສະແດງໃຫ້ເຫັນການທ້ອງຖິ່ນຂອງ GFP E. coli ຮ່ວມກັນກັບ 3D Caco-2 ຈຸລັງ epithelial, ປະຕິບັດຕາມດ້ວຍ immunofluorescence (F) ແລະ stainiscles (immunofluorescence). ການສ້າງແບບຈໍາລອງສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການມີສຸຂະພາບດີທຽບກັບລໍາໄສ້ຮົ່ວໃນຊິບອັກເສບຂອງລໍາໄສ້ພາຍໃຕ້ການທ້າທາຍທາງຊີວະວິທະຍາກັບ antigens ເຊື້ອແບັກທີເລຍ (ເຊັ່ນ: lipopolysaccharide, LPS) ແລະຈຸລັງພູມຕ້ານທານ (ເຊັ່ນ: PBMC; ສີຂຽວ). ຈຸລັງ Caco-2 ໄດ້ຖືກປູກຝັງເພື່ອສ້າງຊັ້ນ epithelial 3D. Scale bar, 50 µm ຊັ້ນລຸ່ມການອະນຸຍາດ:Im. ຈາກ reference.2. ຫນັງສືພິມມະຫາວິທະຍາໄລ Oxford; ຜະລິດຄືນໃໝ່ດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກ Ref.5. NAS; “Host-Microbe Co-Culture” ດັດແປງໂດຍການອະນຸຍາດຈາກ ref.3. NAS; “ການສ້າງແບບຈໍາລອງພະຍາດ” ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.5. NAS.
ທັງສອງ chip gut-on-chip ແລະລູກປະສົມໄດ້ຖືກ fabricated ໂດຍໃຊ້ replicas PDMS ທີ່ຖືກ demolded ຈາກ molds ຊິລິໂຄນໂດຍ lithography ອ່ອນ 1,44 ແລະຮູບແບບກັບ SU-8. ການອອກແບບຂອງ microchannels ໃນແຕ່ລະ chip ຖືກກໍານົດໂດຍການພິຈາລະນາ hydrodynamics ເຊັ່ນຄວາມກົດດັນ shear ແລະ hydrodynamic pressure1,4,12.The ຕົ້ນສະບັບ gut-on-achi ອອກແບບ (Extended Data). juxtaposed ຂະຫນານກົງ microchannels, ໄດ້ evolved ເປັນ gut-on-a-chip ທີ່ຊັບຊ້ອນ (Extended Data Fig. 1b) ທີ່ປະກອບມີຄູ່ຂອງ microchannels ໂຄ້ງເພື່ອ induce ເພີ່ມເວລາທີ່ຢູ່ອາໄສຂອງນ້ໍາ, ຮູບແບບການໄຫຼ nonlinear, ແລະການ deformation multiaxial ຂອງຈຸລັງການລ້ຽງ (ຮູບ 2a-f) ສະລັບສັບຊ້ອນຫຼາຍ, gutchant ຕ້ອງການ 12. gut-on-a-chips ສາມາດເລືອກໄດ້. ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ Gut-Chip convoluted ຍັງ induces morphogenesis 3D ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນໄລຍະເວລາທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບລະດັບການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ epithelial ທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບ Gut-Chip ຕົ້ນສະບັບ, ໂດຍບໍ່ຄໍານຶງເຖິງປະເພດຂອງເຊນ cultured. ດັ່ງນັ້ນ, ເພື່ອ induce 3D morphogenesis ສະລັບສັບຊ້ອນກ່ຽວກັບ PD-chip, replicar ແລະການປ່ຽນເສັ້ນ. ການປິ່ນປົວຢູ່ໃນແມ່ພິມຊິລິຄອນທີ່ມີຮູບແບບ SU-8 ສະຫນອງລັກສະນະລົບຫຼັງຈາກ demolding (ຮູບ 2a). ເພື່ອສ້າງລໍາໄສ້ໃສ່ຊິບ, ຊັ້ນ PDMS ເທິງທີ່ກຽມໄວ້ໄດ້ຖືກຜູກມັດຕາມລໍາດັບກັບຮູບເງົາ PDMS ທີ່ມີຮູຂຸມຂົນແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃຫ້ສອດຄ່ອງກັບຊັ້ນ PDMS ຕ່ໍາໂດຍການຜູກມັດທີ່ບໍ່ສາມາດປ່ຽນແປງໄດ້ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງປິ່ນປົວ corona (ຮູບທີ່ 2). ໄດ້ຖືກຜູກມັດກັບແຜ່ນສະໄລ້ແກ້ວເພື່ອສ້າງອຸປະກອນ microfluidic ຊ່ອງດຽວທີ່ສາມາດຮອງຮັບຊ່ອງສຽບ Transwell (ຮູບ 2h ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ Fig. 2). ຂະບວນການຜູກມັດແມ່ນປະຕິບັດໂດຍການປິ່ນປົວພື້ນຜິວຂອງ replica PDMS ແລະແກ້ວດ້ວຍ plasma ອົກຊີເຈນຫຼືການປິ່ນປົວ corona. ຫຼັງຈາກການຂ້າເຊື້ອຂອງ microfabricated ອຸປະກອນ D ພ້ອມທີ່ຈະເຮັດອຸປະກອນຊິລິໂຄນ. ຂອງ epithelium ລໍາໄສ້ (ຮູບ 2g).
a, ຮູບແຕ້ມແບບແຜນຂອງການກະກຽມຊິ້ນສ່ວນ PDMS ຈາກແມ່ພິມຊິລິໂຄນທີ່ມີຮູບແບບ SU-8. ການແກ້ໄຂ PDMS ທີ່ບໍ່ໄດ້ປິ່ນປົວໄດ້ຖືກຖອກໃສ່ໃສ່ແມ່ພິມຊິລິຄອນ (ຊ້າຍ), ປິ່ນປົວທີ່ອຸນຫະພູມ 60 °C (ກາງ) ແລະ demolded (ຂວາ). PDMS demolded ໄດ້ຖືກຕັດອອກເປັນຕ່ອນແລະທໍາຄວາມສະອາດສໍາລັບການນໍາໃຊ້ເພີ່ມເຕີມ.b, mold PDMS ການກະກຽມຊັ້ນເທິງຂອງ silicon ໄດ້. mold silicon ໃຊ້ເພື່ອ fabricate PDMS porous membrane.d, ຊຸດຂອງການຖ່າຍຮູບຂອງອົງປະກອບ PDMS ເທິງແລະຕ່ໍາແລະປະກອບ on-chip intestinal device.e, Schematic ການຈັດຕໍາແຫນ່ງຂອງອົງປະກອບ PDMS ເທິງ, ເຍື່ອ, ແລະຕ່ໍາ. superimposed convoluted microchannels ແລະຫ້ອງສູນຍາກາດ.g, ການຕິດຕັ້ງ gut-on-a-chip ສໍາລັບ microfluidic cell culture. ລໍາໄສ້ fabricated ສຸດ chip ປະກອບກັບທໍ່ຊິລິໂຄນແລະ syringe ໄດ້ຖືກວາງໄວ້ເທິງ coverslip. ອຸປະກອນ chip ໄດ້ຖືກວາງໄວ້ເທິງຝາຂອງຖ້ວຍ 150 ມມ Petri ສໍາລັບການປຸງແຕ່ງ. ການປິດຂອງທໍ່ຊິລິໂຄນຮ້ອນແມ່ນໃຊ້. ການຜະລິດຊິບປະສົມ ແລະ morphogenesis 3D ໂດຍໃຊ້ຊິບປະສົມ.Transwell inserts ກະກຽມເປັນເອກະລາດເພື່ອວັດທະນະທໍາ 2D monolayers ຂອງຈຸລັງ epithelial ລໍາໄສ້ໄດ້ຖືກແຊກເຂົ້າໄປໃນຊິບປະສົມເພື່ອ induce intestinal morphogenesis 3D. ຂະຫນາດກາງແມ່ນ perfused ຜ່ານ microchannels ພາຍໃຕ້ຊັ້ນຈຸລັງທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນ barale. 1 cm ການອະນຸຍາດ. Elsevier.
ໃນໂປໂຕຄອນນີ້, ເສັ້ນຈຸລັງ Caco-2 ແລະ organoids ໃນລໍາໄສ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແຫຼ່ງ epithelial (ຮູບ 3a). ຈຸລັງທັງສອງຊະນິດໄດ້ຖືກປູກຝັງຢ່າງເປັນເອກະລາດ (ກ່ອງ 2 ແລະກ່ອງ 5) ແລະນໍາໃຊ້ເພື່ອເມັດ microchannels ເຄືອບ ECM ຂອງລໍາໄສ້ເທິງຊິບຫຼື Transwell inserts. ເມື່ອຈຸລັງມີ confluent (> 95% ) ຈຸລັງ Caco-2 (ລະຫວ່າງ passages 10 ແລະ 50) ໃນ T-flasks ໄດ້ຖືກຂຸດຄົ້ນເພື່ອກະກຽມການລະງັບເຊນທີ່ແຕກແຍກໂດຍສານ trypsinization (ກ່ອງ 2). organoids ລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດຈາກການ biopsies ລໍາໄສ້ຫຼືການຜ່າຕັດໄດ້ຖືກຝັງຢູ່ໃນ Matrigel scaffold domes ໃນ 24-welluring plates ສະຫນັບສະຫນູນ. morphogens (ເຊັ່ນ: Wnt, R-spondin, ແລະ Noggin) ແລະປັດໄຈການຂະຫຍາຍຕົວທີ່ກຽມໄວ້ຕາມທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນກ່ອງ 3 ໄດ້ຖືກເສີມທຸກໆມື້ຈົນກ່ວາ organoids ເຕີບໂຕເຖິງ ~ 500 µm ໃນເສັ້ນຜ່າກາງ. organoids ທີ່ເຕີບໃຫຍ່ເຕັມທີ່ໄດ້ຖືກເກັບກ່ຽວແລະແຍກອອກເປັນຈຸລັງດຽວສໍາລັບການກ້າແກ່ນໃສ່ລໍາໄສ້ຫຼື Transwell inserts on a chip 5 ກ່ອນຫນ້ານີ້). type12,13 (ຕົວຢ່າງ ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, or normal donor), lesion site (eg, lesion versus non-lesioned area) and the gastrointestinal location in the tract (eg, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum5). (coloids) ທີ່ປົກກະຕິແລ້ວຕ້ອງການຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ morphogens ສູງກວ່າ organoids ລໍາໄສ້ຂະຫນາດນ້ອຍ.
a, ຂະບວນການເຮັດວຽກສໍາລັບການ induction ຂອງ morphogenesis ລໍາໄສ້ຢູ່ໃນ chip ລໍາໄສ້.Caco-2 epithelium ລໍາໄສ້ຂອງມະນຸດແລະ organoids ລໍາໄສ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນພິທີການນີ້ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນ 3D morphogenesis. ຈຸລັງ epithelial ທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກ seeded ໃນອຸປະກອນ gut-on-a-chip ກະກຽມ (chip ກະກຽມ) ທີ່ຢູ່ (ການກຽມຕົວຂອງຊິບ MS). ເຍື່ອ porous ໃນມື້ 0 (D0), ການໄຫຼຂອງ apical (AP) ແມ່ນເລີ່ມຕົ້ນແລະຮັກສາໄວ້ສໍາລັບ 2 ມື້ທໍາອິດ (ການໄຫຼ, AP, D0-D2). ການໄຫຼຂອງ basolateral (BL) ຍັງຖືກລິເລີ່ມພ້ອມກັບການເຄື່ອນໄຫວຍືດຮອບວຽນ (stretch, flow, AP ແລະ BL) ເມື່ອມີການສ້າງ monolayer 2D ຄົບຖ້ວນສົມບູນ.Intestinal genes 3D ມື້ຫຼັງຈາກ morphofl genesis. (morphogenesis, D5).ຮູບພາບທາງກົງກັນຂ້າມສະແດງໃຫ້ເຫັນສະມາທິຂອງເຊລ Caco-2 ໃນແຕ່ລະຂັ້ນຕອນການທົດລອງ ຫຼືຈຸດເວລາ (ເສັ້ນສະແດງແຖບ, 100 µm). ສີ່ແຜນວາດທີ່ສະແດງເຖິງການຕົກແຕ່ງທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງ morphogenesis ລຳໄສ້ (ເທິງເບື້ອງຂວາ). ລູກສອນຂີດຂັ້ນເທິງຂອງຮູບການໄຫຼວຽນຂອງ schematic. 3D Caco-2 epithelium (ຊ້າຍ). inset ເນັ້ນພື້ນທີ່ຂະຫຍາຍ (ກ່ອງ dashed ສີຂາວ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນ microvilli regenerated ຢູ່ໃນຊັ້ນ Caco-2 3D (ຂວາ).c, ມຸມເບິ່ງທາງຂວາງຂອງ Caco-2 3D ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ, claudin (ZO-1, ສີແດງ) ແລະເສັ້ນໄຍແປງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງທີ່ມີປ້າຍກໍາກັບ F-fluoricleen (nulommunommune) ແລະເຍື່ອຫຸ້ມຫໍ່. confocal visualization ຂອງຈຸລັງ epithelial ໃນ chip intestinal. ລູກສອນຊີ້ໄປຫາ schematic ກາງຊີ້ໃຫ້ເຫັນສະຖານທີ່ຂອງຍົນໂຟກັສສໍາລັບແຕ່ລະ confocal view.d, ໄລຍະເວລາຂອງການປ່ຽນແປງ morphological ໃນ organoids cultured ໃນ chip ທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍ microscopy ໄລຍະກົງກັນຂ້າມໃນມື້ 3, 7, 9, 11, ແລະ 13. ຮູບພາບຂອງ magnification ສູງສຸດຂອງ IC. photomicrograph ຂອງ organoid 3D epithelium ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນລໍາໄສ້ໃນ slice ຖ່າຍໃນມື້ 7.f, overlaid ຮູບພາບ immunofluorescence ສະແດງເຄື່ອງຫມາຍສໍາລັບ stem cells (LGR5; magenta), goblet cells (MUC2; ສີຂຽວ), F-actin (ສີຂີ້ເຖົ່າ) ແລະ nuclei (cyan) ການຂະຫຍາຍຕົວໃນລໍາໄສ້ chips ເປັນເວລາ 3 ມື້ (Left) ໃນລະຫວ່າງ 3 ມື້ (Left). ຢູ່ໃນຊັ້ນ epithelial. ເບິ່ງຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍຮູບທີ່ 3, ເຊິ່ງເນັ້ນໃສ່ສັນຍານ LGR5 ໂດຍບໍ່ມີການສົ່ງສັນຍານ MUC2. ຮູບພາບ Fluorescence ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂຄງສ້າງຈຸນລະພາກຂອງ epithelial (ຂວາ) ຂອງ 3D organoid epithelium ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນລໍາໄສ້ເທິງຊິບໂດຍການ staining ເຍື່ອ plasma ດ້ວຍການຍ້ອມສີ CellMask (ສິດ 3 ຂີດ) ແມ່ນບໍ່ມີ Scale 1 ມື້ອື່ນໆ. stated.b ພິມຄືນດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກອ້າງອີງ.2. ຫນັງສືພິມມະຫາວິທະຍາໄລ Oxford; c ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກ Reference.2. ຫນັງສືພິມມະຫາວິທະຍາໄລ Oxford; e ແລະ f ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດໂດຍອ້າງອີງ.12 ພາຍໃຕ້ໃບອະນຸຍາດ Creative Commons CC BY 4.0.
ໃນລໍາໄສ້ໃນຊິບ, ມັນເປັນສິ່ງຈໍາເປັນທີ່ຈະດັດແປງຫນ້າ hydrophobic ຂອງເຍື່ອ PDMS porous ສໍາລັບການເຄືອບ ECM ສົບຜົນສໍາເລັດ. ໃນພິທີການນີ້, ພວກເຮົານໍາໃຊ້ສອງວິທີທີ່ແຕກຕ່າງກັນເພື່ອປັບປ່ຽນ hydrophobicity ຂອງເຍື່ອ PDMS. ສໍາລັບການປູກຝັງຈຸລັງ Caco-2, ການກະຕຸ້ນຫນ້າດິນໂດຍການປິ່ນປົວດ້ວຍ UV / ozone ຢ່າງດຽວແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະຫຼຸດຜ່ອນການ hydrophobicity ຂອງຈຸລັງ Caco-PD2 CM. ເຍື່ອ PDMS. ແນວໃດກໍ່ຕາມ, ວັດທະນະທໍາ microfluidic ຂອງ epithelium organoid ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການທໍາງານຂອງພື້ນຜິວທີ່ອີງໃສ່ສານເຄມີເພື່ອບັນລຸການຝາກປະສິດທິພາບຂອງທາດໂປຼຕີນ ECM ໂດຍການສະຫມັກຕາມລໍາດັບ polyethyleneimine (PEI) ແລະ glutaraldehyde ກັບ PDMS microchannels. ຫຼັງຈາກການດັດແປງພື້ນຜິວ, ທາດໂປຼຕີນ ECM ໄດ້ຖືກຝາກໄວ້ເພື່ອປົກຫຸ້ມຂອງ PDMS ຫນ້າທີ່ເຮັດວຽກແລະການນໍາສະເຫນີຂອງອະໄວຍະວະ. epithelium.ຫຼັງຈາກຈຸລັງຖືກຕິດ, ວັດທະນະທໍາຈຸລັງ microfluidic ເລີ່ມຕົ້ນໂດຍການດູດຊຶມພຽງແຕ່ຂະຫນາດກາງເຂົ້າໄປໃນ microchannel ເທິງຈົນກ່ວາຈຸລັງປະກອບເປັນ monolayer ສົມບູນ, ໃນຂະນະທີ່ microchannel ຕ່ໍາຮັກສາສະພາບຄົງທີ່. ວິທີການທີ່ດີທີ່ສຸດນີ້ສໍາລັບການກະຕຸ້ນຫນ້າດິນແລະການເຄືອບ ECM ເຮັດໃຫ້ການຕິດພັນຂອງ epithelium organoid ເຮັດໃຫ້ເກີດ morphogenesis 3D ເທິງຫນ້າດິນ PD ໄດ້.
ວັດທະນະທໍາ Transwell ຍັງຕ້ອງການການເຄືອບ ECM ກ່ອນທີ່ຈະມີເມັດ; ແນວໃດກໍ່ຕາມ, ການປູກຝັງ Transwell ບໍ່ຕ້ອງການຂັ້ນຕອນການປິ່ນປົວທີ່ຊັບຊ້ອນເພື່ອກະຕຸ້ນພື້ນຜິວຂອງຊ່ອງສຽບທີ່ມີຮູຂຸມຂົນ. ສໍາລັບການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊລ Caco-2 ໃນຊ່ອງສຽບ Transwell, ການເຄືອບ ECM ເທິງຊ່ອງສຽບທີ່ມີ porous ເລັ່ງການຕິດຂອງເຊລ Caco-2 ທີ່ແຕກແຍກ (<1 ຊົ່ວໂມງ) ແລະການສ້າງສິ່ງກີດຂວາງທາງເຊື່ອມຕໍ່ທີ່ແຫນ້ນຫນາ (<1-2 ມື້). ເພື່ອເບິ່ງການໃສ່ສານອິນຊີໃນວັດທະນະທໍາ, ມີການໃສ່ສານອິນຊີຂອງ Transwell. inserts, ຕິດກັບຫນ້າດິນເຍື່ອ (<3 h) ແລະຮັກສາຈົນກ່ວາ organoids ປະກອບເປັນ monolayer ສົມບູນທີ່ມີຄວາມສົມບູນອຸປະສັກ. ວັດທະນະທໍາ Transwell ປະຕິບັດໃນແຜ່ນ 24 ດີໂດຍບໍ່ມີການນໍາໃຊ້ຊິບປະສົມ.
In vitro 3D morphogenesis ສາມາດເລີ່ມຕົ້ນໄດ້ໂດຍການ ນຳ ໃຊ້ການໄຫຼຂອງນ້ ຳ ໄປສູ່ລັກສະນະພື້ນຖານຂອງຊັ້ນ epithelial ທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ. ໃນລໍາໄສ້ເທິງຊິບ, ໂຣກ epithelial morphogenesis ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນໃນເວລາທີ່ສື່ກາງໄດ້ຖືກ perfused ເຂົ້າໄປໃນ microchannels ເທິງແລະຕ່ໍາ (ຮູບ 3a). ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້, ມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນທີ່ຈະແນະນໍາການໄຫຼເຂົ້າຂອງ fluidor ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງຂອງ bass ໃນດ້ານຂ້າງ. ຕົວຍັບຍັ້ງ morphogen secreted. ເພື່ອໃຫ້ສານອາຫານແລະ serum ພຽງພໍກັບຈຸລັງທີ່ຜູກມັດຢູ່ໃນເຍື່ອຫຸ້ມທີ່ມີຮູຂຸມຂົນແລະສ້າງຄວາມກົດດັນດ້ານແສງສະຫວ່າງ, ພວກເຮົາມັກຈະນໍາໃຊ້ການໄຫຼສອງໃນລໍາໄສ້ໃສ່ຊິບ. ໃນຊິບປະສົມ, ແຜ່ນໃສ່ Transwell ທີ່ປະກອບດ້ວຍ monolayers epithelial ໄດ້ຖືກໃສ່ເຂົ້າໄປໃນ chip ປະສົມ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຂະຫນາດກາງໄດ້ຖືກນໍາໄປໃຊ້ພາຍໃຕ້ຊ່ອງສຽບ microtest ພາຍໃຕ້ຊ່ອງ basotest. morphogenesis ເກີດຂຶ້ນ 3-5 ມື້ຫຼັງຈາກການເລີ່ມຕົ້ນຂອງການໄຫຼ basolateral ໃນເວທີວັດທະນະທໍາທັງສອງ.
ລັກສະນະທາງສະນິຍະພາບຂອງຊັ້ນ epithelial 3D ທີ່ຖືກວິສະວະກໍາຈຸນລະພາກສາມາດວິເຄາະໄດ້ໂດຍການໃຊ້ວິທີການຖ່າຍຮູບຕ່າງໆ, ລວມທັງກ້ອງຈຸລະທັດໄລຍະກົງກັນຂ້າມ, ກ້ອງຈຸລະທັດທາງກົງກັນຂ້າມທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (DIC), SEM, ຫຼື immunofluorescence confocal microscopy (ຮູບ 3 ແລະ 4). ໄລຍະກົງກັນຂ້າມສາມາດເຮັດການຕິດຕາມກວດກາຮູບຮ່າງຫຼື DIC ໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ. protrusion ຂອງຊັ້ນ epithelial 3D. ເນື່ອງຈາກຄວາມໂປ່ງໃສທາງ optical ຂອງ PDMS ແລະຮູບເງົາ polyester, ທັງສອງ gut-on-a-chip ແລະແພລະຕະຟອມ chip hybrid ສາມາດສະຫນອງໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງໃນ situ imaging ໂດຍບໍ່ມີການຕ້ອງການສໍາລັບການແບ່ງສ່ວນຫຼື disassembly ຂອງອຸປະກອນ. ເມື່ອປະຕິບັດການຮູບພາບ immunofluorescence (ຮູບ, ຕາຕະລາງ 4, ປົກກະຕິ, 1, ຕາຕະລາງ, ຕາຕະລາງ 1, ຕົວເລກ, ຕາຕະລາງ 1. ດ້ວຍ 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), ຖັດມາດ້ວຍ Triton X-100 ແລະ 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), ຕາມລໍາດັບ. ອີງຕາມປະເພດເຊລ, ສານແກ້ໄຂທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ທາດ permeabilizers, ແລະສານສະກັດສາມາດຖືກນໍາໃຊ້. ພູມຕ້ານທານຕົ້ນຕໍແມ່ນໃຊ້ໃນເຊລbilide markers ທີ່ເປັນກຸ່ມເປົ້າໝາຍ. situ ເທິງຊິບ, ຕິດຕາມດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງພ້ອມກັບສີຍ້ອມ counterstain ທີ່ແນໃສ່ນິວເຄລຍ (ເຊັ່ນ: 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) ຫຼື F-actin (ເຊັ່ນ: fluorescently labeled phalloidin). ການຖ່າຍພາບສົດໂດຍອີງໃສ່ fluorescence ຍັງສາມາດປະຕິບັດໄດ້ໃນສະຖານທີ່ "FiC. "ການຜະລິດຂີ້ມູກ. physiology”), ການສ້າງອານານິຄົມແບບສຸ່ມຂອງຈຸລັງຈຸລິນຊີ (ຮູບທີ 1, “ການລ້ຽງສັດຮ່ວມຂອງຈຸລິນຊີ”), ການບັນຈຸຈຸລັງພູມຄຸ້ມກັນ (ຮູບທີ 1, 'ການສ້າງແບບຈໍາລອງພະຍາດ') ຫຼືຮູບຊົງຂອງ 3D epithelial morphology (ຮູບ 3c,f ແລະ 4b ການດັດແປງຈຸນລະພາກທາງລຸ່ມ). ຊັ້ນ, ດັ່ງທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ ref. ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບທີ 2, ຮູບຮ່າງຂອງ epithelial 3D ເຊັ່ນດຽວກັນກັບ microvilli ໃນຂອບແປງປາຍສາມາດເບິ່ງເຫັນໄດ້ໂດຍ SEM (ຮູບ 3b). ການສະແດງອອກຂອງເຄື່ອງຫມາຍຄວາມແຕກຕ່າງສາມາດຖືກປະເມີນໄດ້ໂດຍການປະຕິບັດການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ PCR5 ດ້ານປະລິມານຫຼືຈຸລັງ RNA ຊັ້ນດຽວຂອງລໍາດັບ, ໃນກໍລະນີ g3D. ຊິບຫຼືຊິບປະສົມແມ່ນຖືກຂຸດຄົ້ນໂດຍ trypsinization ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະໂມເລກຸນຫຼືພັນທຸກໍາ.
a, Workflow ສໍາລັບການ induction ຂອງ morphogenesis ລໍາໄສ້ໃນ chip ປະສົມ.Caco-2 ແລະ organoids ລໍາໄສ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນ protocol ນີ້ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນ morphogenesis 3D ໃນແພລະຕະຟອມ chip ປະສົມ. ຈຸລັງ epithelial ແຍກກັນໄດ້ຖືກ seeded ໃນ inserts Transwell ກະກຽມ (TW prep; ຈຸລັງ transwell ເບິ່ງຮູບຂ້າງລຸ່ມນີ້). ແຊກ, ຈຸລັງທັງໝົດຖືກປູກຝັງພາຍໃຕ້ສະພາບສະຖິດ (TW culture). ຫຼັງຈາກ 7 ມື້, ການໃສ່ Transwell ດຽວທີ່ມີ monolayer 2D ຂອງຈຸລັງ epithelial ໄດ້ຖືກປະສົມປະສານເຂົ້າໄປໃນຊິບປະສົມເພື່ອແນະນໍາການໄຫຼຂອງ basolateral (Flow, BL), ເຊິ່ງໃນທີ່ສຸດກໍ່ນໍາໄປສູ່ການສ້າງຊັ້ນ epithelial 3D (morphogenesis). ໄດ້ມາຈາກຜູ້ໃຫ້ທຶນປົກກະຕິ (C103 ເສັ້ນ) ascending ຈໍ້າສອງເມັດຢູ່ໃນແຕ່ລະຂັ້ນຕອນການທົດລອງຫຼືຈຸດເວລາ. schematics ໃນຊັ້ນເທິງສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການຕັ້ງຄ່າການທົດລອງສໍາລັບແຕ່ລະຂັ້ນຕອນ.b, chip ປະສົມ (schematic ຊ້າຍ) ສາມາດນໍາໄປສູ່ການ morphogenesis 3D ຂອງຈຸລັງ epithelial organoid ທີ່ມີມຸມເບິ່ງທາງເທິງລົງເທິງລົງລຸ່ມ confocal ຕ່ໍາ, ເບິ່ງ microcopy ກາງ, ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. schematic ແລະເສັ້ນຈຸດທີ່ສອດຄ້ອງກັນ). ສະແດງໃຫ້ເຫັນລັກສະນະທາງສະນີຍະພາບທີ່ເຫັນໄດ້ຊັດເຈນ.F-actin (cyan), ແກນ (ສີເທົາ).c, Fluorescence confocal micrographs (ມຸມເບິ່ງມຸມ 3D) ຂອງຈຸລັງ epithelial ທີ່ມາຈາກ organoid ທີ່ລ້ຽງຢູ່ໃນ static Transwell (TW; inset within white dashed box) ທຽບກັບ chip hybrid D (fluorest respected full shot) ປຽບທຽບກັບ 2 morphusology. ມຸມເບິ່ງຂ້າມແນວຕັ້ງ 2D (ໃສ່ໃນມຸມຂວາເທິງ; “XZ”) ຍັງສະແດງລັກສະນະ 2D ແລະ 3D.Scale bar, 100 µm.c ພິມຄືນດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.4. Elsevier.
ການຄວບຄຸມສາມາດຖືກກະກຽມໂດຍການລ້ຽງຈຸລັງດຽວກັນ (Caco-2 ຫຼືຈຸລັງ epithelial organoid ໃນລໍາໄສ້) ເຂົ້າໄປໃນ monolayers ສອງມິຕິພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂວັດທະນະທໍາ static ທໍາມະດາ. ທີ່ຫນ້າສັງເກດ, ການຂາດສານອາຫານອາດຈະເປັນຜົນມາຈາກຄວາມຈຸຂອງ microchannels ຈໍາກັດ (ເຊັ່ນ: ~ 4 µL ໃນຊ່ອງທາງເທິງສຸດໃນການອອກແບບ epithelial gut-chip ຕົ້ນສະບັບ).Thealrefore ທັງສອງດ້ານຂອງການນໍາໃຊ້ແລະການໄຫຼເຂົ້າ. ຍັງຖືກປຽບທຽບ.
ຂະບວນການ lithography ອ່ອນໆຄວນຈະຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຫ້ອງທີ່ສະອາດ. ສໍາລັບແຕ່ລະຊັ້ນໃນຊິບ (ຊັ້ນເທິງແລະຕ່ໍາແລະແຜ່ນ) ແລະຊິບປະສົມ, photomasks ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ແລະ fabricated ໃນ wafers ຊິລິຄອນແຍກຕ່າງຫາກເພາະວ່າຄວາມສູງຂອງ microchannels ແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ. ຄວາມສູງເປົ້າຫມາຍຂອງ microchannels ເທິງແລະຕ່ໍາຂອງລໍາໄສ້ໃນ chip ແມ່ນ 500 µm ຄວາມສູງຂອງຊ່ອງຕາມລໍາດັບ. ຊິບປະສົມແມ່ນ 200 µm.
ເອົາຊິລິໂຄນ wafer ຂະໜາດ 3 ນິ້ວໃສ່ຈານດ້ວຍອາເຊໂທນ. ໝູນຈານຄ່ອຍໆປະໄວ້ 30 ວິນາທີ, ຈາກນັ້ນເອົາເວເຟີໃຫ້ແຫ້ງ. ໂອນ wafer ໃສ່ຈານດ້ວຍ IPA, ຈາກນັ້ນໝຸນແຜ່ນປະມານ 30 ວິນາທີເພື່ອເຮັດຄວາມສະອາດ.
ການແກ້ໄຂ piranha (ປະສົມຂອງ hydrogen peroxide ແລະອາຊິດຊູນຟູຣິກເຂັ້ມຂຸ້ນ, 1: 3 (vol / vol)) ສາມາດເລືອກໄດ້ເພື່ອເພີ່ມປະສິດທິພາບການກໍາຈັດສານຕົກຄ້າງຂອງອິນຊີອອກຈາກຫນ້າດິນ silicon wafer.
ໂຊລູຊັ່ນ Piranha ແມ່ນມີສານກັດກ່ອນ ແລະສ້າງຄວາມຮ້ອນໄດ້. ຈໍາເປັນຕ້ອງໄດ້ລະມັດລະວັງດ້ານຄວາມປອດໄພເພີ່ມເຕີມ. ສຳລັບການກໍາຈັດສິ່ງເສດເຫຼືອ, ປ່ອຍໃຫ້ການແກ້ໄຂເຮັດໃຫ້ເຢັນ ແລະ ໂອນໄປໃສ່ຖັງຂີ້ເຫຍື້ອທີ່ສະອາດ, ແຫ້ງ. ໃຊ້ພາຊະນະສຳຮອງ ແລະ ຕິດປ້າຍໃສ່ຖັງຂີ້ເຫຍື້ອຢ່າງຖືກຕ້ອງ. ກະລຸນາປະຕິບັດຕາມຄໍາແນະນໍາດ້ານຄວາມປອດໄພຂອງສະຖານທີ່ສໍາລັບຂັ້ນຕອນລະອຽດເພີ່ມເຕີມ.
ເຮັດໃຫ້ wafers ຂາດນ້ໍາໂດຍການວາງໃສ່ຈານຮ້ອນ 200 °C ເປັນເວລາ 10 ນາທີ. ຫຼັງຈາກທີ່ຂາດນ້ໍາ, wafer ໄດ້ຖືກ shaken ຫ້າຄັ້ງໃນອາກາດເຢັນ.
ຖອກ SU-8 2100 10 ກຣາມໃສ່ກາງຂອງ wafer ຊິລິໂຄນທີ່ສະອາດແລ້ວ. ໃຊ້ tweezers ເພື່ອແຜ່ກະຈາຍ photoresist ເທົ່າທຽມກັນເທິງ wafer. ບາງເທື່ອເອົາ wafer ໃສ່ແຜ່ນຮ້ອນ 65 ° C ເພື່ອເຮັດໃຫ້ photoresist ຫນ້ອຍຫນຽວແລະແຜ່ງ່າຍ.
SU-8 ໄດ້ຖືກແຈກຢາຍຢ່າງເທົ່າທຽມກັນໃນ wafer ໂດຍການແລ່ນການເຄືອບ spin. ດໍາເນີນໂຄງການການຫມຸນຂາເຂົ້າຂອງ SU-8 ສໍາລັບ 5-10 s ເພື່ອຂະຫຍາຍພັນດ້ວຍຄວາມໄວ 500 rpm ດ້ວຍຄວາມເລັ່ງ 100 rpm/s. ກໍານົດການ spin ຕົ້ນຕໍສໍາລັບ 200 µm ຄວາມຫນາຮູບແບບທີ່ 1,500 aµm rpm (ຄວາມຫນາ 2,500 aµm, ບັນລຸ 1,500 aµm. ລະດັບຄວາມສູງ 500 µm ສໍາລັບຊັ້ນເທິງຂອງລໍາໄສ້ໃນຊິບ;
ຄວາມໄວ spin ຕົ້ນຕໍສາມາດປັບໄດ້ຕາມຄວາມຫນາເປົ້າຫມາຍຂອງຮູບແບບ SU-8 ໃນ wafer ຊິລິໂຄນ.
ເພື່ອຜະລິດຮູບແບບ SU-8 ທີ່ມີຄວາມສູງ 500 µm ສໍາລັບຊັ້ນເທິງຂອງລໍາໄສ້ເທິງຊິບ, ການເຄືອບ spin ແລະຂັ້ນຕອນອົບອ່ອນຂອງກ່ອງນີ້ (ຂັ້ນຕອນທີ 7 ແລະ 8) ໄດ້ຖືກເຮັດຊ້ໍາຕາມລໍາດັບ (ເບິ່ງຂັ້ນຕອນທີ 9) ເພື່ອຜະລິດສອງຊັ້ນຂອງ 250 µm ຊັ້ນຫນາຂອງ SU-8, ເຊິ່ງສາມາດວາງຊັ້ນແລະເຂົ້າຮ່ວມໃນ 1 ກ່ອງນີ້ 0 2 exure. ສູງ µm.
ອົບອ່ອນຂອງ SU-8 wafers ເຄືອບໂດຍການວາງ wafers ລະມັດລະວັງໃສ່ແຜ່ນຮ້ອນທີ່ 65 ° C ເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນສະຫຼັບການຕັ້ງຄ່າເປັນ 95 °C ແລະ incubate ສໍາລັບ 40 ນາທີເພີ່ມເຕີມ.
ເພື່ອບັນລຸຄວາມສູງ 500 μmຂອງຮູບແບບ SU-8 ໃນ microchannel ເທິງ, ເຮັດຊ້ໍາຂັ້ນຕອນ 7 ແລະ 8 ເພື່ອສ້າງສອງຊັ້ນ SU-8 ທີ່ມີຄວາມຫນາ 250 μm.
ໂດຍໃຊ້ຕົວຈັດຮຽງໜ້າກາກ UV, ປະຕິບັດການທົດສອບໂຄມໄຟຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດເພື່ອຄິດໄລ່ເວລາເປີດຮັບແສງຂອງ wafer.(ເວລາຮັບແສງ, ms) = (ປະລິມານແສງ, mJ/cm2)/(ພະລັງງານໂຄມໄຟ, mW/cm2).
ຫຼັງຈາກກໍານົດເວລາການຮັບແສງ, ເອົາ photomask ໃສ່ທີ່ຖືຫນ້າກາກຂອງຕົວຈັດຮຽງຫນ້າກາກ UV ແລະວາງ photomask ໃສ່ SU-8 wafer ເຄືອບ.
ວາງພື້ນຜິວທີ່ພິມອອກຂອງ photomask ໂດຍກົງໃສ່ດ້ານທີ່ເຄືອບ SU-8 ຂອງ silicon wafer ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການກະຈາຍຂອງ UV.
ປ່ອຍ SU-8 ທີ່ເຄືອບ wafer ແລະ photomask ໃນແນວຕັ້ງໃຫ້ 260 mJ/cm2 ຂອງແສງ UV ສໍາລັບເວລາການຮັບແສງທີ່ໄດ້ກໍານົດໄວ້ (ເບິ່ງຂັ້ນຕອນ 10 ຂອງກ່ອງນີ້).
ຫຼັງຈາກການສໍາຜັດ UV, wafers ຊິລິຄອນ SU-8-coated ໄດ້ຖືກ baked ຢູ່ທີ່ 65 ° C ສໍາລັບ 5 min ແລະ 95 ° C ສໍາລັບ 15 ນາທີໃນແຕ່ລະແຜ່ນຮ້ອນເພື່ອ fabricate ຮູບແບບທີ່ມີຄວາມສູງ 200 μm. ຂະຫຍາຍເວລາຫລັງອົບທີ່ 95 ° C ເປັນ 30 ນາທີເພື່ອ fabricate ຮູບແບບທີ່ມີຄວາມສູງ 50 µm.
ນັກພັດທະນາຖືກຖອກໃສ່ຖ້ວຍແກ້ວ, ແລະ wafer baked ແມ່ນຖືກຈັດໃສ່ໃນຖ້ວຍ. ປະລິມານຂອງນັກພັດທະນາ SU-8 ອາດຈະແຕກຕ່າງກັນໄປຕາມຂະຫນາດຂອງແຜ່ນແກ້ວ. ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າໃຊ້ SU-8 developer ພຽງພໍເພື່ອເອົາ SU-8 ທີ່ບໍ່ເປີດເຜີຍອອກຢ່າງສົມບູນ. ຕົວຢ່າງເຊັ່ນ, ເມື່ອໃຊ້ຖ້ວຍແກ້ວທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງ 150 ມມທີ່ມີຄວາມຈຸ 1 L, ໃຫ້ໃຊ້ mold ~ 300-28 mL. ການຫມູນວຽນທີ່ອ່ອນໂຍນບາງຄັ້ງຄາວ.
ລ້າງແມ່ພິມທີ່ພັດທະນາດ້ວຍຜູ້ພັດທະນາສົດ ~ 10 ມລຕາມດ້ວຍ IPA ໂດຍການສີດຢາແກ້ໄຂດ້ວຍທໍ່ທໍ່.
ວາງ wafer ໃນເຄື່ອງເຮັດຄວາມສະອາດ plasma ແລະເປີດເຜີຍອົກຊີເຈນໃນ plasma (ອາຍແກັສໃນບັນຍາກາດ, ຄວາມກົດດັນເປົ້າຫມາຍ 1 × 10−5 Torr, ພະລັງງານ 125 W) ສໍາລັບ 1.5 ນາທີ.
ວາງ wafer ໃນ desiccator ສູນຍາກາດທີ່ມີສະໄລ້ແກ້ວພາຍໃນ. wafers ແລະ slides ສາມາດວາງໄວ້ຂ້າງຄຽງກັນ. ຖ້າ desiccator ສູນຍາກາດແບ່ງອອກເປັນຫຼາຍຊັ້ນໂດຍແຜ່ນ, ວາງ slides ໃນຫ້ອງຕ່ໍາແລະ wafers ຢູ່ໃນຫ້ອງເທິງ. ວາງ 100 μLຂອງ trichloro (1H, 1H-2H) ການແກ້ໄຂແກ້ວ trichloro(1H, 1H-2H), ເລື່ອນແລະນໍາໃຊ້ສູນຍາກາດສໍາລັບການ silanization.
ເທເຊລ Caco-2 ແຊ່ແຂງໃນອ່າງອາບນໍ້າ 37 ອົງສາເຊ, ຫຼັງຈາກນັ້ນໂອນເຊລທີ່ທາແລ້ວໃສ່ກະເປົ໋າ T75 ທີ່ມີ 15 ມລຂອງ Caco-2 ທີ່ມີຄວາມຮ້ອນ 37 ອົງສາເຊ.
ເພື່ອຜ່ານຈຸລັງ Caco-2 ຢູ່ທີ່ຄວາມສອດຄ່ອງ 90%, ທໍາອິດທີ່ອົບອຸ່ນ Caco-2 medium, PBS, ແລະ 0.25% trypsin/1 mM EDTA ໃນອາບນ້ໍາ 37 ° C.
ດູດເອົາຕົວກາງໂດຍການດູດຊືມສູນຍາກາດ.ລ້າງຈຸລັງສອງເທື່ອດ້ວຍ 5 mL ຂອງ PBS ອົບອຸ່ນໂດຍການດູດຊຶມສູນຍາກາດອີກຄັ້ງ ແລະເພີ່ມ PBS ສົດ.