ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ສະແດງຮູບວົງມົນຂອງສາມສະໄລ້ພ້ອມກັນ.ໃຊ້ປຸ່ມກ່ອນໜ້າ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສາມສະໄລ້ຕໍ່ຄັ້ງ, ຫຼືໃຊ້ປຸ່ມເລື່ອນຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສາມສະໄລ້ຕໍ່ຄັ້ງ.
ອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງແລະອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ຕົວແທນ biotherapeutic ສາມາດບັນລຸເປົ້າຫມາຍຂອງພວກເຂົາໃນລະບົບປະສາດສ່ວນກາງ, ດັ່ງນັ້ນຂັດຂວາງການປິ່ນປົວພະຍາດທາງປະສາດທີ່ມີປະສິດທິພາບ.ເພື່ອຄົ້ນພົບຕົວຂົນສົ່ງສະໝອງແບບໃໝ່ໃນ vivo, ພວກເຮົາໄດ້ແນະນຳຫ້ອງສະໝຸດ T7 phage peptide ແລະເກັບກຳຂໍ້ມູນເລືອດ ແລະນ້ຳສະໝອງ (CSF) ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງໂດຍໃຊ້ຕົວແບບສະລອຍນ້ຳຂະໜາດໃຫຍ່ທີ່ມີສະຕິຂອງໜູ.ໂຄລນ phage ສະເພາະໄດ້ຖືກປັບປຸງສູງໃນ CSF ຫຼັງຈາກສີ່ຮອບຂອງການຄັດເລືອກ.ການທົດສອບຂອງ peptides ຜູ້ສະຫມັກສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ເປີດເຜີຍຫຼາຍກ່ວາ 1000-fold enrichment ໃນ CSF.ການເຄື່ອນໄຫວທາງຊີວະພາບຂອງການຈັດສົ່ງ peptide-mediated ໄປສູ່ສະຫມອງໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍການຫຼຸດຜ່ອນ 40% ໃນລະດັບຂອງ amyloid-βໃນນ້ໍາ cerebrospinal ໂດຍໃຊ້ BACE1 peptide inhibitor ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ peptide ໃຫມ່ທີ່ກໍານົດ.ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ peptides ທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍວິທີການເລືອກ vivo phage ອາດຈະເປັນຍານພາຫະນະທີ່ເປັນປະໂຫຍດສໍາລັບການຈັດສົ່ງລະບົບຂອງ macromolecules ໄປສູ່ສະຫມອງທີ່ມີຜົນກະທົບດ້ານການປິ່ນປົວ.
ການຄົ້ນຄວ້າການປິ່ນປົວດ້ວຍເປົ້າຫມາຍຂອງລະບົບປະສາດກາງ (CNS) ໄດ້ສຸມໃສ່ການກໍານົດຢາທີ່ດີທີ່ສຸດແລະຕົວແທນທີ່ສະແດງຄຸນສົມບັດການກໍາຫນົດເປົ້າຫມາຍ CNS, ໂດຍມີຄວາມພະຍາຍາມຫນ້ອຍລົງໃນການຄົ້ນພົບກົນໄກທີ່ກະຕຸ້ນການສົ່ງຢາທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວໄປສູ່ສະຫມອງ.ນີ້ແມ່ນເລີ່ມມີການປ່ຽນແປງໃນປັດຈຸບັນຍ້ອນວ່າການຈັດສົ່ງຢາ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນໂມເລກຸນຂະຫນາດໃຫຍ່, ເປັນສ່ວນຫນຶ່ງທີ່ສໍາຄັນຂອງການພັດທະນາຢາ neuroscience ທີ່ທັນສະໄຫມ.ສະພາບແວດລ້ອມຂອງລະບົບປະສາດສ່ວນກາງແມ່ນໄດ້ຮັບການປົກປ້ອງເປັນຢ່າງດີໂດຍລະບົບອຸປະສັກຂອງເສັ້ນເລືອດສະໝອງ, ປະກອບດ້ວຍອຸປະສັກເລືອດ-ສະໝອງ (BBB) ​​​​ແລະອຸປະສັກເລືອດສະໝອງ (BCBB)1, ເຮັດໃຫ້ມັນທ້າທາຍໃນການສົ່ງຢາໄປສະໝອງ1,2.ມັນໄດ້ຖືກຄາດຄະເນວ່າເກືອບທັງຫມົດຢາໂມເລກຸນຂະຫນາດໃຫຍ່ແລະຫຼາຍກ່ວາ 98% ຂອງຢາໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍໄດ້ຖືກກໍາຈັດອອກຈາກສະຫມອງ3.ນັ້ນແມ່ນເຫດຜົນທີ່ວ່າມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນຫຼາຍທີ່ຈະກໍານົດລະບົບການຂົນສົ່ງສະຫມອງໃຫມ່ທີ່ສະຫນອງການຈັດສົ່ງຢາທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະສະເພາະກັບ CNS 4,5.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, BBB ແລະ BCSFB ຍັງສະເຫນີໂອກາດທີ່ດີເລີດສໍາລັບການຈັດສົ່ງຢາຍ້ອນວ່າພວກເຂົາເຈາະແລະເຂົ້າໄປໃນໂຄງສ້າງທັງຫມົດຂອງສະຫມອງໂດຍຜ່ານ vasculature ຢ່າງກວ້າງຂວາງຂອງມັນ.ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມພະຍາຍາມໃນປັດຈຸບັນທີ່ຈະນໍາໃຊ້ວິທີການທີ່ບໍ່ມີການຮຸກຮານຂອງການສົ່ງກັບສະຫມອງແມ່ນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນອີງໃສ່ກົນໄກຂອງ receptor-mediated transport (PMT) ໂດຍໃຊ້ endogenous BBB6 receptor.ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມກ້າວຫນ້າທີ່ສໍາຄັນທີ່ຜ່ານມາໂດຍໃຊ້ Transferrin receptor pathway7,8, ການພັດທະນາເພີ່ມເຕີມຂອງລະບົບການຈັດສົ່ງໃຫມ່ທີ່ມີຄຸນສົມບັດປັບປຸງແມ່ນຕ້ອງການ.ເພື່ອເຮັດສິ່ງນີ້, ເປົ້າຫມາຍຂອງພວກເຮົາແມ່ນເພື່ອກໍານົດ peptides ທີ່ມີຄວາມສາມາດໃນການໄກ່ເກ່ຍການຂົນສົ່ງ CSF, ຍ້ອນວ່າພວກເຂົາສາມາດນໍາໃຊ້ໃນຫຼັກການເພື່ອສົ່ງ macromolecules ກັບ CNS ຫຼືເປີດເສັ້ນທາງ receptor ໃຫມ່.ໂດຍສະເພາະ, receptors ສະເພາະແລະການຂົນສົ່ງຂອງລະບົບ cerebrovascular (BBB ແລະ BSCFB) ສາມາດເປັນເປົ້າຫມາຍທີ່ມີທ່າແຮງສໍາລັບການຈັດສົ່ງຢ່າງຫ້າວຫັນແລະສະເພາະຂອງຢາ biotherapeutic.ນ້ໍາ Cerebrospinal (CSF) ແມ່ນຜະລິດຕະພັນ secretory ຂອງ choroid plexus (CS) ແລະຢູ່ໃນການຕິດຕໍ່ໂດຍກົງກັບນ້ໍາ interstitial ຂອງສະຫມອງໂດຍຜ່ານຊ່ອງ subarachnoid ແລະຊ່ອງ ventricular4.ບໍ່ດົນມານີ້, ມັນໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່ານ້ໍາ cerebrospinal subarachnoid ແຜ່ຫຼາຍເຂົ້າໄປໃນ interstitium ຂອງສະຫມອງ9.ພວກເຮົາຫວັງວ່າຈະເຂົ້າເຖິງຊ່ອງ parenchymal ໂດຍໃຊ້ subarachnoid inflow tract ຫຼືໂດຍກົງຜ່ານ BBB.ເພື່ອບັນລຸສິ່ງດັ່ງກ່າວ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດຍຸດທະສາດການຄັດເລືອກ vivo phage ທີ່ເຂັ້ມແຂງທີ່ກໍານົດ peptides ທີ່ຂົນສົ່ງໂດຍທັງສອງເສັ້ນທາງທີ່ແຕກຕ່າງກັນເຫຼົ່ານີ້.
ຕອນນີ້ພວກເຮົາອະທິບາຍວິທີການກວດກາການສະແດງຜົນຂອງ vivo phage ທີ່ເປັນລຳດັບດ້ວຍການເກັບຕົວຢ່າງ CSF ພ້ອມກັບການຈັດລຽງລຳດັບສູງ (HTS) ເພື່ອຕິດຕາມຮອບຄັດເລືອກເບື້ອງຕົ້ນທີ່ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດສູງສຸດ.ການກວດຫາຫນູທີ່ມີສະຕິດ້ວຍການຝັງເຂັມ (CM) cannula ຂະໜາດໃຫຍ່ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນເລືອດ.ສິ່ງສໍາຄັນ, ວິທີການນີ້ເລືອກທັງການກໍານົດເປົ້າຫມາຍຂອງສະຫມອງແລະ peptides ທີ່ມີກິດຈະກໍາການຂົນສົ່ງໃນທົ່ວອຸປະສັກ cerebrovascular.ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ T7 phages ເນື່ອງຈາກຂະຫນາດຂະຫນາດນ້ອຍຂອງພວກເຂົາ (~60 nm) 10 ແລະແນະນໍາວ່າພວກມັນເຫມາະສົມສໍາລັບການຂົນສົ່ງຂອງ vesicles ທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ຜ່ານ transcellular ຂອງອຸປະສັກ endothelial ແລະ / ຫຼື epithelial-medulla.ຫຼັງຈາກສີ່ຮອບຂອງການ panning, ປະຊາກອນ phage ໄດ້ຖືກໂດດດ່ຽວສະແດງໃຫ້ເຫັນທີ່ເຂັ້ມແຂງໃນ vivo CSF ​​​​enrichment ແລະສະມາຄົມ microvessel cerebral.ສິ່ງສໍາຄັນ, ພວກເຮົາສາມາດຢືນຢັນການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາໂດຍສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ peptides ທີ່ດີທີ່ສຸດທີ່ຕ້ອງການແລະສັງເຄາະທາງເຄມີແມ່ນສາມາດຂົນສົ່ງທາດໂປຼຕີນເຂົ້າໄປໃນນ້ໍາ cerebrospinal ໄດ້.ຫນ້າທໍາອິດ, ຜົນກະທົບທາງ pharmacodynamic ຂອງ CNS ໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍການລວມເອົາ peptide ການຂົນສົ່ງຊັ້ນນໍາກັບ inhibitor ຂອງ BACE1 peptide.ນອກເຫນືອຈາກການສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າກົນລະຍຸດການກວດສອບທີ່ເປັນປະໂຫຍດໃນ vivo ສາມາດກໍານົດ peptides ການຂົນສົ່ງສະຫມອງໃຫມ່ເປັນຜູ້ໃຫ້ບໍລິການຂົນສົ່ງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີປະສິດຕິຜົນ, ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າວິທີການຄັດເລືອກທີ່ເປັນປະໂຫຍດທີ່ຄ້າຍຄືກັນຍັງມີຄວາມສໍາຄັນໃນການກໍານົດເສັ້ນທາງການຂົນສົ່ງສະຫມອງໃຫມ່.
ໂດຍອີງໃສ່ຫົວຫນ່ວຍການສ້າງແຜ່ນແຜ່ນ (PFU), ຫຼັງຈາກຂັ້ນຕອນການຫຸ້ມຫໍ່ phage, ຫ້ອງສະຫມຸດຂອງ peptides 12-mer linear T7 peptides ທີ່ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງປະມານ 109 ໄດ້ຖືກອອກແບບແລະສ້າງຂື້ນ (ເບິ່ງວັດສະດຸແລະວິທີການ).ມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນທີ່ຈະສັງເກດວ່າພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະຫ້ອງສະຫມຸດນີ້ຢ່າງລະມັດລະວັງກ່ອນທີ່ຈະຢູ່ໃນ vivo panning.ການຂະຫຍາຍ PCR ຂອງຕົວຢ່າງຫ້ອງສະຫມຸດ phage ໂດຍໃຊ້ primers ດັດແກ້ທີ່ສ້າງ amplicons ທີ່ໃຊ້ໄດ້ໂດຍກົງກັບ HTS (ຕື່ມ Fig. 1a).ເນື່ອງຈາກ a) ຄວາມຜິດພາດການຈັດລໍາດັບ HTS11, b) ຜົນກະທົບຕໍ່ຄຸນນະພາບຂອງ primers (NNK)1-12, ແລະ c) ການປະກົດຕົວຂອງ wild-type (wt) phage (skeleton inserts) ໃນຫ້ອງສະແຕນບາຍ, ຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງຕາມລໍາດັບໄດ້ຖືກປະຕິບັດເພື່ອສະກັດເອົາຂໍ້ມູນລໍາດັບທີ່ຖືກຢືນຢັນເທົ່ານັ້ນ (ຮູບພາບເສີມ 1b).ຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງເຫຼົ່ານີ້ໃຊ້ກັບຫ້ອງສະໝຸດ HTS ທັງໝົດ.ສໍາລັບຫ້ອງສະຫມຸດມາດຕະຖານ, ຈໍານວນອ່ານທັງຫມົດ 233,868 ໄດ້ຖືກອ່ານ, ໃນນັ້ນ 39% ໄດ້ຜ່ານເງື່ອນໄຂການກັ່ນຕອງແລະຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະແລະການຄັດເລືອກຫ້ອງສະຫມຸດສໍາລັບຮອບຕໍ່ມາ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 1c–e).ການອ່ານໄດ້ຖືກຄູນເປັນສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ 3 ຄູ່ພື້ນຖານໃນຄວາມຍາວທີ່ມີຈຸດສູງສຸດຢູ່ທີ່ 36 nucleotides (ຕື່ມ Fig. 1c), ຢືນຢັນການອອກແບບຫ້ອງສະຫມຸດ (NNK) 1-12.ໂດຍສະເພາະ, ປະມານ 11% ຂອງສະມາຊິກຫ້ອງສະໝຸດມີ 12-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL inserts, ແລະເກືອບເຄິ່ງຫນຶ່ງຂອງລໍາດັບ (49%) ມີການແຊກ ຫຼື ລຶບ.HTS ຂອງຫ້ອງສະຫມຸດຫ້ອງສະຫມຸດໄດ້ຢືນຢັນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງ peptides ສູງໃນຫ້ອງສະຫມຸດ: ຫຼາຍກ່ວາ 81% ຂອງລໍາດັບ peptide ໄດ້ຖືກພົບເຫັນພຽງແຕ່ຄັ້ງດຽວແລະພຽງແຕ່ 1.5% ເກີດຂຶ້ນໃນ≥4 ສໍາເນົາ (ຕື່ມ Fig. 2a).ຄວາມຖີ່ຂອງອາຊິດ amino (aa) ຢູ່ທັງຫມົດ 12 ຕໍາແຫນ່ງໃນ repertoire ໄດ້ correlated ດີກັບຄວາມຖີ່ທີ່ຄາດວ່າຈະສໍາລັບຈໍານວນຂອງ codons ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ degenerate NKK repertoire (ຕື່ມ Fig. 2b).ຄວາມຖີ່ທີ່ສັງເກດໄດ້ຂອງ aa residues ທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດໂດຍ inserts ເຫຼົ່ານີ້ມີຄວາມສໍາພັນດີກັບຄວາມຖີ່ຂອງການຄິດໄລ່ (r = 0.893) (ຕື່ມ Fig. 2c).ການກະກຽມຫ້ອງສະຫມຸດ phage ສໍາລັບການສັກຢາປະກອບມີຂັ້ນຕອນຂອງການຂະຫຍາຍແລະການກໍາຈັດ endotoxin.ນີ້ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນກ່ອນຫນ້ານີ້ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ phage12,13.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ຈັດລໍາດັບຫ້ອງສະຫມຸດ phage ຂະຫຍາຍແຜ່ນທີ່ຜ່ານການກໍາຈັດ endotoxin ແລະປຽບທຽບມັນກັບຫ້ອງສະຫມຸດຕົ້ນສະບັບເພື່ອຄາດຄະເນຄວາມຖີ່ຂອງ AA.ການພົວພັນທີ່ເຂັ້ມແຂງ (r = 0.995) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນລະຫວ່າງສະນຸກເກີຕົ້ນສະບັບແລະສະນຸກເກີ amplified ແລະ purified (ຕື່ມ Fig. 2d), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການແຂ່ງຂັນລະຫວ່າງ clones amplified ໃນແຜ່ນທີ່ໃຊ້ T7 phage ບໍ່ໄດ້ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມລໍາອຽງທີ່ສໍາຄັນ.ການປຽບທຽບນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ຄວາມຖີ່ຂອງ motifs tripeptide ໃນແຕ່ລະຫ້ອງສະຫມຸດ, ເນື່ອງຈາກວ່າຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ (~109) ບໍ່ສາມາດຈັບໄດ້ຢ່າງເຕັມສ່ວນເຖິງແມ່ນວ່າມີ HTS.ການວິເຄາະຄວາມຖີ່ຂອງ aa ໃນແຕ່ລະຕໍາແຫນ່ງໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມລໍາອຽງທີ່ຂຶ້ນກັບຕໍາແຫນ່ງຂະຫນາດນ້ອຍໃນສາມຕໍາແຫນ່ງສຸດທ້າຍຂອງ repertoire ທີ່ເຂົ້າມາ (ຕື່ມ Fig. 2e).ສະຫຼຸບແລ້ວ, ພວກເຮົາໄດ້ສະຫຼຸບວ່າຄຸນນະພາບແລະຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະຫມຸດແມ່ນເປັນທີ່ຍອມຮັບແລະພຽງແຕ່ມີການປ່ຽນແປງເລັກນ້ອຍໃນຄວາມຫຼາກຫຼາຍໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຍ້ອນການຂະຫຍາຍແລະການກະກຽມຫ້ອງສະຫມຸດ phage ລະຫວ່າງຫຼາຍໆຮອບຂອງການຄັດເລືອກ.
ການເກັບຕົວຢ່າງນ້ຳສະຫຼັດສະໝູນວຽນສາມາດປະຕິບັດໄດ້ໂດຍການຜ່າຕັດເອົາ cannula ເຂົ້າໄປໃນ CM ຂອງໜູທີ່ມີສະຕິເພື່ອອຳນວຍຄວາມສະດວກໃນການກວດຫາ T7 phage ທີ່ສັກເຂົ້າທາງເສັ້ນເລືອດ (iv) ຜ່ານ BBB ແລະ/ຫຼື BCSFB (ຮູບ 1a-b).ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ສອງແຂນການຄັດເລືອກເອກະລາດ (ແຂນ A ແລະ B) ໃນສາມຮອບທໍາອິດຂອງການເລືອກ vivo (ຮູບ 1c).ພວກເຮົາຄ່ອຍໆເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມງວດຂອງການຄັດເລືອກໂດຍການຫຼຸດຈໍານວນ phage ທັງຫມົດທີ່ນໍາສະເຫນີໃນສາມຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກ.ສໍາລັບການ panning ຮອບສີ່, ພວກເຮົາໄດ້ລວມຕົວຢ່າງຈາກສາຂາ A ແລະ B ແລະດໍາເນີນການສາມທາງເລືອກເອກະລາດເພີ່ມເຕີມ.ເພື່ອສຶກສາຄຸນສົມບັດໃນ vivo ຂອງອະນຸພາກ T7 phage ໃນຮູບແບບນີ້, phage ປະເພດທໍາມະຊາດ (PAGISRELVDKL master insert) ໄດ້ຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນຫນູຜ່ານເສັ້ນກ່າງຫາງ.ການຟື້ນຕົວຂອງ phages ຈາກນ້ໍາ cerebrospinal ແລະເລືອດຢູ່ໃນຈຸດເວລາທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ T7 icosahedral phages ຂ້ອນຂ້າງນ້ອຍມີໄລຍະການເກັບກູ້ເບື້ອງຕົ້ນຢ່າງໄວວາຈາກຫ້ອງເລືອດ (ຕື່ມຮູບ 3).ໂດຍອີງໃສ່ titers ບໍລິຫານແລະປະລິມານເລືອດຂອງຫນູ, ພວກເຮົາຄິດໄລ່ວ່າມີພຽງແຕ່ປະມານ 1% wt.phage ຈາກປະລິມານຢາຖືກກວດພົບໃນເລືອດ 10 ນາທີຫຼັງຈາກການສັກຢາເຂົ້າເສັ້ນເລືອດ.ຫຼັງຈາກການຫຼຸດລົງຢ່າງໄວວາໃນເບື້ອງຕົ້ນນີ້, ການເກັບກູ້ເບື້ອງຕົ້ນທີ່ຊ້າລົງໄດ້ຖືກວັດແທກດ້ວຍເຄິ່ງຊີວິດຂອງ 27.7 ນາທີ.ສິ່ງສໍາຄັນ, ມີພຽງແຕ່ phages ຈໍານວນຫນ້ອຍຫຼາຍທີ່ຖືກດຶງມາຈາກຊ່ອງ CSF, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງພື້ນຖານຕ່ໍາສໍາລັບການຍ້າຍ phage ປະເພດທໍາມະຊາດເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 3).ໂດຍສະເລ່ຍ, ພຽງແຕ່ປະມານ 1 x 10-3% titers ຂອງ T7 phage ໃນເລືອດແລະ 4 x 10-8% ຂອງ phages infused ໃນເບື້ອງຕົ້ນໄດ້ຖືກກວດພົບໃນນ້ໍາ cerebrospinal ໃນໄລຍະການເກັບຕົວຢ່າງທັງຫມົດ (0-250 ນາທີ).ໂດຍສະເພາະ, ເຄິ່ງຊີວິດ (25.7 ນາທີ) ຂອງ phage ປະເພດທໍາມະຊາດໃນນ້ໍາ cerebrospinal ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນເລືອດ.ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າອຸປະສັກທີ່ແຍກ CSF compartment ອອກຈາກເລືອດແມ່ນ intact ໃນຫນູ CM-cannulated, ອະນຸຍາດໃຫ້ໃນ vivo ການຄັດເລືອກຫ້ອງສະຫມຸດ phage ເພື່ອກໍານົດ clones ທີ່ພ້ອມທີ່ຈະຂົນສົ່ງຈາກເລືອດເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF.
(a) ການຕັ້ງວິທີການເກັບຕົວຢ່າງນ້ຳສະໝອງຄືນໃໝ່ (CSF) ຈາກສະລອຍນ້ຳຂະໜາດໃຫຍ່.(b) ແຜນວາດສະແດງສະຖານທີ່ຂອງຈຸລັງຂອງອຸປະສັກຂອງລະບົບປະສາດສ່ວນກາງ (CNS) ແລະຍຸດທະສາດການຄັດເລືອກທີ່ໃຊ້ເພື່ອກໍານົດ peptides ທີ່ຂ້າມອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ (BBB) ​​​​ແລະອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ.(c) ແຜນຜັງຈໍສະແດງຜົນໃນ vivo phage.ໃນແຕ່ລະຮອບຂອງການຄັດເລືອກ, phages (ຕົວລະບຸສັດພາຍໃນລູກສອນ) ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນເລືອດ.ສອງສາຂາທາງເລືອກທີ່ເປັນເອກະລາດ (A, B) ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ແຍກຕ່າງຫາກຈົນກ່ວາຮອບຄັດເລືອກຄັ້ງທີ 4.ສໍາລັບຮອບຄັດເລືອກ 3 ແລະ 4, ແຕ່ລະ phage clone ສະກັດຈາກ CSF ໄດ້ຖືກຈັດລໍາດັບດ້ວຍຕົນເອງ.(d) Kinetics ຂອງ phage ທີ່ແຍກອອກຈາກເລືອດ (ວົງສີແດງ) ແລະນ້ໍາ cerebrospinal (ສາມຫຼ່ຽມສີຂຽວ) ໃນລະຫວ່າງຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກໃນສອງຫນູ cannulated ຫຼັງຈາກການສັກຢາ intravenous ຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ peptide T7 (2 x 1012 phages / ສັດ).ສີ່ຫຼ່ຽມສີຟ້າສະແດງເຖິງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ phage ເບື້ອງຕົ້ນໂດຍສະເລ່ຍໃນເລືອດ, ຄິດໄລ່ຈາກປະລິມານຂອງ phage ທີ່ຖືກສັກ, ຄໍານຶງເຖິງປະລິມານເລືອດທັງຫມົດ.ສີ່ຫຼ່ຽມສີດຳຊີ້ບອກຈຸດຕັດກັນຂອງເສັ້ນ y ທີ່ແຍກອອກຈາກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເລືອດ.(e,f) ນໍາສະເຫນີຄວາມຖີ່ຂອງພີ່ນ້ອງແລະການແຜ່ກະຈາຍຂອງ motifs tripeptide ທັບຊ້ອນທີ່ເປັນໄປໄດ້ທັງຫມົດທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ peptide.ຈໍານວນຂອງ motifs ທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ 1000 ອ່ານແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.ທີ່ສໍາຄັນ (p <0.001) motifs enriched ແມ່ນຫມາຍດ້ວຍຈຸດສີແດງ.(e) Correlation scatterplot ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ຂອງເສັ້ນໄຍ tripeptide ຂອງຫ້ອງສະໝຸດທີ່ສັກຢາກັບ phage ທີ່ມາຈາກເລືອດຈາກສັດ #1.1 ແລະ #1.2.(f) Correlation scatterplot ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ຂອງສັດ phage tripeptide motifs #1.1 ແລະ #1.2 ທີ່ໂດດດ່ຽວໃນເລືອດ ແລະນ້ຳສະໝອງ.(g, h) Sequence ID ເປັນຕົວແທນຂອງ phage enriched ໃນເລືອດ (g) ທຽບກັບ injected libraries ແລະ phage enriched ໃນ CSF (h) ທຽບກັບເລືອດຫຼັງຈາກຮອບຂອງການຄັດເລືອກ vivo ໃນສັດທັງສອງ.ຂະໜາດຂອງລະຫັດຕົວອັກສອນຕົວໜຶ່ງຊີ້ບອກເຖິງຄວາມຖີ່ຂອງອາຊິດ amino ທີ່ເກີດຂຶ້ນຢູ່ຕຳແໜ່ງນັ້ນ.ສີຂຽວ = ຂົ້ວໂລກ, ສີມ່ວງ = ເປັນກາງ, ສີຟ້າ = ພື້ນຖານ, ສີແດງ = ເປັນກົດແລະສີດໍາ = ອາຊິດ amino hydrophobic.ຮູບ 1a, b ຖືກອອກແບບແລະຜະລິດໂດຍ Eduard Urich.
ພວກເຮົາໄດ້ສັກຢາ phage peptide ຫ້ອງສະຫມຸດເຂົ້າໄປໃນສອງຫນູເຄື່ອງມື CM (clades A ແລະ B) ແລະ phage ທີ່ແຍກອອກຈາກນ້ໍາ cerebrospinal ແລະເລືອດ (ຮູບ 1d).ການເກັບກູ້ຢ່າງໄວວາເບື້ອງຕົ້ນຂອງຫ້ອງສະຫມຸດແມ່ນຫນ້ອຍທີ່ຊັດເຈນເມື່ອທຽບກັບ phage ທໍາມະຊາດ.ເຄິ່ງຊີວິດສະເລ່ຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດທີ່ສັກຢາຢູ່ໃນສັດທັງສອງແມ່ນ 24.8 ນາທີໃນເລືອດ, ຄ້າຍຄືກັນກັບ phage ປະເພດປ່າ, ແລະ 38.5 ນາທີໃນ CSF.ຕົວຢ່າງ phage ເລືອດແລະນ້ໍາ cerebrospinal ຈາກສັດແຕ່ລະຄົນແມ່ນຂຶ້ນກັບ HTS ແລະ peptides ທັງຫມົດທີ່ລະບຸໄວ້ໄດ້ຖືກວິເຄາະສໍາລັບການມີ motif tripeptide ສັ້ນ.motifs tripeptide ໄດ້ຖືກເລືອກເພາະວ່າພວກເຂົາສະຫນອງພື້ນຖານຫນ້ອຍທີ່ສຸດສໍາລັບການສ້າງໂຄງສ້າງແລະການໂຕ້ຕອບຂອງ peptide-protein14,15.ພວກເຮົາພົບເຫັນຄວາມສໍາພັນທີ່ດີໃນການແຈກຢາຍຂອງ motifs ລະຫວ່າງຫ້ອງສະຫມຸດ phage ສັກແລະ clones ສະກັດຈາກເລືອດຂອງສັດທັງສອງ (ຮູບ 1e).ຂໍ້​ມູນ​ຊີ້​ໃຫ້​ເຫັນ​ວ່າ​ອົງ​ປະ​ກອບ​ຂອງ​ຫ້ອງ​ສະ​ຫມຸດ​ແມ່ນ​ພຽງ​ແຕ່​ການ​ເສີມ​ຂະ​ຫຍາຍ​ຂອບ​ເຂດ​ໃນ​ຊ່ອງ​ເລືອດ​.ຄວາມຖີ່ຂອງອາຊິດອາມິໂນ ແລະລໍາດັບຄວາມເຫັນດີນໍາກັນໄດ້ຖືກວິເຄາະຕື່ມອີກໃນແຕ່ລະຕໍາແໜ່ງໂດຍໃຊ້ການປັບຕົວຂອງຊອບແວ Weblogo16.ຫນ້າສົນໃຈ, ພວກເຮົາພົບເຫັນການເສີມທີ່ເຂັ້ມແຂງໃນສານຕົກຄ້າງ glycine ໃນເລືອດ (ຮູບ 1g).ໃນເວລາທີ່ເລືອດໄດ້ຖືກປຽບທຽບກັບ clones ທີ່ເລືອກຈາກ CSF, ການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມແຂງແລະບາງ deselection ຂອງ motifs ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ (ຮູບ 1f), ແລະບາງອາຊິດ amino ແມ່ນມີຄວາມນິຍົມໃນຕໍາແຫນ່ງທີ່ກໍານົດໄວ້ໃນ 12-member (ຮູບ 1h).ເປັນທີ່ໜ້າສັງເກດ, ສັດແຕ່ລະໂຕມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນນ້ຳສະໝອງ, ໃນຂະນະທີ່ການເພີ່ມລະດັບ glycine ໃນເລືອດໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນສັດທັງສອງ (ຮູບການເສີມ 4a-j).ຫຼັງຈາກການກັ່ນຕອງຢ່າງເຂັ້ມງວດຂອງຂໍ້ມູນລໍາດັບໃນນ້ໍາ cerebrospinal ຂອງສັດ #1.1 ແລະ #1.2, ຈໍານວນທັງຫມົດຂອງ 964 ແລະ 420 peptides 12-mer ເປັນເອກະລັກໄດ້ຖືກໄດ້ຮັບ (ຕື່ມ Fig. 1d-e).ໂຄລນ phage ທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍອອກໄປແລະຖືກຄັດເລືອກຮອບທີສອງໃນ vivo.Phage ສະກັດຈາກຮອບທີສອງຂອງການຄັດເລືອກແມ່ນຂຶ້ນກັບ HTS ໃນແຕ່ລະສັດແລະ peptides ທັງຫມົດທີ່ລະບຸໄວ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນວັດສະດຸປ້ອນເຂົ້າໃນໂຄງການຮັບຮູ້ motif ເພື່ອວິເຄາະການປະກົດຕົວຂອງ motifs tripeptide (ຮູບ 2a, b, ef).ເມື່ອປຽບທຽບກັບວົງຈອນທໍາອິດຂອງ phage ທີ່ໄດ້ຟື້ນຕົວຈາກ CSF, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການຄັດເລືອກຕື່ມອີກແລະ deselection ຂອງ motifs ຫຼາຍໃນ CSF ໃນສາຂາ A ແລະ B (ຮູບ 2).ຂັ້ນຕອນການກໍານົດເຄືອຂ່າຍຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດວ່າພວກເຂົາເປັນຕົວແທນຂອງຮູບແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງລໍາດັບທີ່ສອດຄ່ອງ.ຄວາມຄ້າຍຄືກັນທີ່ຊັດເຈນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນລະຫວ່າງລໍາດັບ 12 ມິຕິທີ່ຟື້ນຕົວໂດຍ CSF ໃນ clade A (ຮູບ 2c, d) ແລະ clade B (ຮູບ 2g, h).ການວິເຄາະແບບລວມກັນໃນແຕ່ລະສາຂາໄດ້ເປີດເຜີຍຂໍ້ມູນການຄັດເລືອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນສໍາລັບ peptides 12-mer (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 5c,d) ແລະການເພີ່ມຂື້ນຂອງອັດຕາສ່ວນ CSF / titer ເລືອດໃນໄລຍະເວລາສໍາລັບ clones ປະສົມປະສານຫຼັງຈາກຮອບທີສອງຂອງການຄັດເລືອກເມື່ອທຽບກັບຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກ (ຮູບພາບເສີມ 5e).).
ການເສີມສ້າງ motifs ແລະ peptides ໃນນ້ໍາ cerebrospinal ໂດຍສອງຮອບຕິດຕໍ່ກັນຂອງຢູ່ໃນ vivo functional phage display ເລືອກ.
phages ນ້ໍາ cerebrospinal ທັງຫມົດທີ່ຟື້ນຕົວຈາກຮອບທໍາອິດຂອງແຕ່ລະສັດ (ສັດ #1.1 ແລະ #1.2) ໄດ້ຖືກລວບລວມ, ຂະຫຍາຍ, HT-sequenced ແລະ reinjected ຮ່ວມກັນ (2 x 1010 phages / ສັດ) 2 ຫນູ cannulated SM (#1.1 → #).2.1 ແລະ 2.2, 1.2 → 2.3 ແລະ 2.4).(a,b,e,f) Correlation scatterplots ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ຂອງຕົວແຕ້ມ tripeptide ຂອງ phages ທີ່ມາຈາກ CSF ທັງໝົດໃນຮອບຄັດເລືອກຄັ້ງທໍາອິດ ແລະທີສອງ.ຄວາມຖີ່ຂອງພີ່ນ້ອງແລະການກະຈາຍຂອງ motifs ເປັນຕົວແທນຂອງ tripeptides ທັບຊ້ອນທີ່ເປັນໄປໄດ້ທັງຫມົດທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ peptides ໃນທັງສອງປະຖົມນິເທດ.ຈໍານວນຂອງ motifs ທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ 1000 ອ່ານແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.motifs ທີ່ຖືກເລືອກຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (p < 0.001) ທີ່ຖືກເລືອກຫຼືຖືກຍົກເວັ້ນຢູ່ໃນຫນຶ່ງໃນຫ້ອງສະຫມຸດທີ່ປຽບທຽບແມ່ນຖືກເນັ້ນໃສ່ດ້ວຍຈຸດສີແດງ.(c, d, g, h) ລໍາດັບສັນຍາລັກຂອງລໍາດັບຂອງອາຊິດ amino 12 ທີ່ອຸດົມສົມບູນ CSF ທັງຫມົດໂດຍອີງໃສ່ຮອບ 2 ແລະ 1 ຂອງການເລືອກຢູ່ໃນ vivo.ຂະໜາດຂອງລະຫັດຕົວອັກສອນຕົວໜຶ່ງຊີ້ບອກເຖິງຄວາມຖີ່ຂອງອາຊິດ amino ທີ່ເກີດຂຶ້ນຢູ່ຕຳແໜ່ງນັ້ນ.ເພື່ອເປັນຕົວແທນຂອງໂລໂກ້, ຄວາມຖີ່ຂອງລຳດັບ CSF ທີ່ສະກັດຈາກສັດແຕ່ລະໂຕລະຫວ່າງສອງຮອບຄັດເລືອກຈະຖືກປຽບທຽບ ແລະ ລຳດັບທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນຮອບທີສອງແມ່ນສະແດງ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ແລະ (h) #1.2–#2.4.ອາຊິດ amino ທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດຢູ່ໃນຕໍາແຫນ່ງທີ່ລະບຸໄວ້ໃນ (c, d) ສັດ No.2.1 ແລະບໍ່ມີ.2.2 ຫຼື (g, h) ໃນສັດ No.2.3 ແລະບໍ່ມີ.2.4 ສະແດງຢູ່ໃນສີ.ສີຂຽວ = ຂົ້ວໂລກ, ສີມ່ວງ = ເປັນກາງ, ສີຟ້າ = ພື້ນຖານ, ສີແດງ = ເປັນກົດແລະສີດໍາ = ອາຊິດ amino hydrophobic.
ຫຼັງຈາກການຄັດເລືອກຮອບທີສາມ, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດ 124 ລໍາດັບ peptide ທີ່ບໍ່ຊ້ໍາກັນ (#3.1 ແລະ #3.2) ຈາກ 332 CSF-reconstituted phage clones ທີ່ໂດດດ່ຽວຈາກສັດສອງຕົວ (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 6a).ລຳດັບ LGSVS (18.7%) ມີອັດຕາສ່ວນທີ່ສົມທຽບສູງສຸດ, ຖັດມາດ້ວຍການແຊກປະເພດປ່າ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ແລະ SARGSWREIVSLS (2.2%).ໃນຮອບທີ 4 ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາໄດ້ຮວບຮວມເອົາສອງສາຂາທີ່ເປັນເອກະລາດຈາກສັດສາມແຍກ (ຮູບ 1c).ໃນບັນດາ 925 ລໍາດັບ phage clones ຟື້ນຕົວຈາກ CSF, ໃນຮອບທີສີ່ພວກເຮົາພົບເຫັນ 64 ລໍາດັບ peptide ເປັນເອກະລັກ (ຕື່ມ Fig. 6b), ໃນນັ້ນອັດຕາສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງ phage ທໍາມະຊາດຫຼຸດລົງເຖິງ 0.8%.ໂຄນ CSF ທົ່ວໄປທີ່ສຸດໃນຮອບທີ 4 ແມ່ນ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ແລະ RLSSVDSDLSGC (3,6%).%)).ຊ່ວງຄວາມຍາວຂອງ peptides ທີ່ເລືອກແມ່ນເນື່ອງມາຈາກການແຊກ/ການລຶບນິວຄລີໂອຕານ ຫຼື codons ຢຸດກ່ອນໄວອັນຄວນໃນ primers ຫ້ອງສະໝຸດ ເມື່ອໃຊ້ codons degenerate ສໍາລັບການອອກແບບຫ້ອງສະໝຸດ NNK.codons ຢຸດກ່ອນໄວອັນຄວນສ້າງ peptides ສັ້ນກວ່າແລະຖືກເລືອກເພາະວ່າພວກມັນມີ motif aa ທີ່ເອື້ອອໍານວຍ.peptides ທີ່ຍາວກວ່າອາດຈະເປັນຜົນມາຈາກການແຊກ / ການລຶບໃນ primers ຂອງຫ້ອງສະຫມຸດສັງເຄາະ.ນີ້ຈັດຕໍາແຫນ່ງ stop codon ອອກແບບຢູ່ນອກກອບແລະອ່ານມັນຈົນກ່ວາ codon ຢຸດໃຫມ່ປາກົດລົງລຸ່ມ.ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ, ພວກເຮົາໄດ້ຄິດໄລ່ປັດໄຈເສີມສ້າງສໍາລັບຮອບຄັດເລືອກທັງໝົດສີ່ຮອບໂດຍການປຽບທຽບຂໍ້ມູນການປ້ອນຂໍ້ມູນກັບຂໍ້ມູນຜົນຜະລິດຕົວຢ່າງ.ສໍາລັບຮອບທໍາອິດຂອງການກວດກາ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ phage titers ປະເພດທໍາມະຊາດເປັນການອ້າງອີງພື້ນຖານທີ່ບໍ່ສະເພາະ.ຫນ້າສົນໃຈ, ການຄັດເລືອກ phage ໃນທາງລົບແມ່ນມີຄວາມເຂັ້ມແຂງຫຼາຍໃນວົງຈອນ CSF ທໍາອິດ, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນຢູ່ໃນເລືອດ (ຮູບ 3a), ເຊິ່ງອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມເປັນໄປໄດ້ຕໍ່າຂອງການແຜ່ກະຈາຍຕົວຕັ້ງຕົວຕີຂອງສະມາຊິກສ່ວນໃຫຍ່ຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ peptide ເຂົ້າໄປໃນ CSF compartment ຫຼື phages ພີ່ນ້ອງມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະຮັກສາຫຼືເອົາອອກຈາກເສັ້ນເລືອດຫຼາຍກວ່າ bacteriophages.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນຮອບທີສອງຂອງ panning, ການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງ phages ໃນ CSF ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນທັງສອງ clades, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຮອບທີ່ຜ່ານມາແມ່ນ enriched ໃນ phages ສະແດງ peptides ທີ່ສົ່ງເສີມການ uptake CSF (ຮູບ 3a).ອີກເທື່ອຫນຶ່ງ, ໂດຍບໍ່ມີການເສີມເລືອດທີ່ສໍາຄັນ.ນອກຈາກນີ້ໃນຮອບທີສາມແລະສີ່, ໂຄນ phage ໄດ້ຖືກເພີ່ມຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ CSF.ການປຽບທຽບຄວາມຖີ່ຂອງແຕ່ລະລໍາດັບ peptide ທີ່ເປັນເອກະລັກລະຫວ່າງສອງຮອບສຸດທ້າຍຂອງການຄັດເລືອກ, ພວກເຮົາພົບວ່າລໍາດັບແມ່ນມີຄວາມອຸດົມສົມບູນຫຼາຍຂຶ້ນໃນຮອບສີ່ຂອງການຄັດເລືອກ (ຮູບ 3b).ຈໍານວນທັງຫມົດຂອງ 931 motifs tripeptide ໄດ້ຖືກສະກັດອອກຈາກທັງຫມົດ 64 ລໍາດັບ peptide ເປັນເອກະລັກໂດຍໃຊ້ທັງສອງທິດທາງ peptide.motifs enriched ຫຼາຍທີ່ສຸດໃນຮອບສີ່ໄດ້ຖືກກວດກາຢ່າງໃກ້ຊິດຫຼາຍສໍາລັບ profile enrichment ຂອງເຂົາເຈົ້າໃນທົ່ວທຸກຮອບເມື່ອທຽບກັບຫ້ອງສະຫມຸດ injected (ຕັດອອກ: 10% enrichment) (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 6c).ຮູບ​ແບບ​ການ​ຄັດ​ເລືອກ​ທົ່ວ​ໄປ​ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ວ່າ​ແຮງ​ຈູງ​ໃຈ​ຂອງ​ການ​ສຶກ​ສາ​ສ່ວນ​ໃຫຍ່​ແມ່ນ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ເສີມ​ຂະ​ຫຍາຍ​ໃນ​ຮອບ​ທີ່​ຜ່ານ​ມາ​ທັງ​ສອງ​ສາຂາ​ການ​ຄັດ​ເລືອກ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ບາງ motifs (e.g. SGL, VSG, LGS GSV) ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນມາຈາກ clade A, ໃນຂະນະທີ່ອື່ນໆ (ເຊັ່ນ: FGW, RTN, WGF, NTR) ແມ່ນ enriched ໃນ clade B ທາງເລືອກ.
ການກວດສອບການຂົນສົ່ງ CSF ຂອງ CSF-enriched phage-displayed peptides ແລະ peptides ຜູ້ນໍາ biotinylated conjugated ກັບ payloads streptavidin.
(a) ອັດ​ຕາ​ສ່ວນ​ການ​ເສີມ​ທີ່​ຄິດ​ໄລ່​ທັງ​ສີ່​ຮອບ (R1-R4​) ໂດຍ​ອີງ​ໃສ່ (input = I) phage (PFU) titers ແລະ​ກໍາ​ນົດ CSF phage titers (ຜົນ​ຜະ​ລິດ = O​)​.ປັດໄຈເສີມສ້າງສໍາລັບສາມຮອບສຸດທ້າຍ (R2-R4) ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການປຽບທຽບກັບຮອບກ່ອນຫນ້າແລະຮອບທໍາອິດ (R1) ດ້ວຍຂໍ້ມູນນ້ໍາຫນັກ.ແຖບເປີດແມ່ນນ້ໍາ cerebrospinal, ແຖບທີ່ມີຮົ່ມແມ່ນ plasma.(***p<0.001, ອີງຕາມການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນ).(b) ບັນຊີລາຍຊື່ຂອງ peptides phage ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດ, ຈັດອັນດັບຕາມອັດຕາສ່ວນພີ່ນ້ອງຂອງເຂົາເຈົ້າກັບ phages ທັງຫມົດທີ່ເກັບກໍາໃນ CSF ຫຼັງຈາກຮອບ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ.ຫົກ clones phage ທົ່ວໄປທີ່ສຸດແມ່ນເນັ້ນໃສ່ໃນສີ, ຕົວເລກແລະປັດໃຈເສີມຂອງພວກມັນລະຫວ່າງຮອບ 3 ແລະ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ (insets).(c,d) ຫົກ clones phage ທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດ, phage ຫວ່າງເປົ່າ ແລະຫ້ອງສະໝຸດ peptide phage ຂອງພໍ່ແມ່ຈາກຮອບທີ 4 ໄດ້ຖືກວິເຄາະເປັນສ່ວນບຸກຄົນໃນຮູບແບບການເກັບຕົວຢ່າງ CSF.CSF ແລະຕົວຢ່າງເລືອດໄດ້ຖືກເກັບກໍາຢູ່ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້.(c) ປະລິມານເທົ່າກັນຂອງ 6 phage clones (2 x 1010 phages/ສັດ), phages ເປົ່າ (#1779) (2 x 1010 phages/ສັດ) ແລະ stock phage peptide libraries (2 x 1012 phages/ສັດ) ສັກຢ່າງໜ້ອຍ 3 CM ແມ່ນບໍລິຫານໃຫ້ສັດທີ່ແຍກກັນຜ່ານ cannulated.CSF pharmacokinetics ຂອງແຕ່ລະ phage clone ສັກຢາແລະຫ້ອງສະຫມຸດ phage peptide ໃນໄລຍະເວລາແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.(d) ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ອັດ​ຕາ​ສ່ວນ CSF/ເລືອດ​ສະ​ເລ່ຍ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຟື້ນ​ຟູ phages/mL ທັງ​ຫມົດ​ໃນ​ໄລ​ຍະ​ທີ່​ໃຊ້​ເວ​ລາ​ການ​ເກັບ​ຕົວ​ຢ່າງ.(e) ສີ່ peptides ຜູ້ນໍາສັງເຄາະແລະຫນຶ່ງ scrambled ການຄວບຄຸມໄດ້ຖືກເຊື່ອມຕໍ່ biotin ກັບ streptavidin ຜ່ານ N-terminus ຂອງເຂົາເຈົ້າ (ການສະແດງ tetramer) ຕິດຕາມດ້ວຍການສັກຢາ (ເສັ້ນກ່າງຫາງ iv, 10 mg streptavidin/kg).ຢ່າງຫນ້ອຍສາມຫນູ intubated (N = 3).).ຕົວຢ່າງ CSF ໄດ້ຖືກເກັບກໍາຢູ່ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ streptavidin ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ບໍ່ກວດພົບ).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ອີງຕາມການທົດສອບ ANOVA).(f) ການປຽບທຽບລໍາດັບອາຊິດ amino ຂອງໂຄນ phage peptide ທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດ #2002 (ສີມ່ວງ) ກັບ phage peptide clones ທີ່ເລືອກອື່ນໆຈາກຮອບທີ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ.ຊິ້ນສ່ວນອາຊິດ amino ທີ່ຄືກັນ ແລະຄ້າຍຄືກັນແມ່ນມີລະຫັດສີ.
ຂອງ phages enriched ທັງຫມົດໃນຮອບສີ່ (ຮູບ 3b), ຫົກ clones ຜູ້ສະຫມັກໄດ້ຖືກຄັດເລືອກສໍາລັບການວິເຄາະສ່ວນບຸກຄົນເພີ່ມເຕີມໃນຮູບແບບການເກັບຕົວຢ່າງ CSF.ປະລິມານເທົ່າທຽມກັນຂອງຫົກ phage ຜູ້ສະຫມັກ, phage ເປົ່າ (ບໍ່ມີ insert) ແລະຫ້ອງສະຫມຸດ prophage peptide ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນສາມສັດ CM cannulated, ແລະ pharmacokinetics ໄດ້ຖືກກໍານົດໃນ CSF (ຮູບ 3c) ແລະເລືອດ (ຕື່ມ Fig. 7) assays.ທັງໝົດ phage clones ທີ່ທົດສອບໄດ້ແນເປົ້າໃສ່ຊ່ອງ CSF ໃນລະດັບທີ່ສູງກວ່າ 10-1000 ເທົ່າຂອງ controlphage ຫວ່າງເປົ່າ (#1779).ຕົວຢ່າງ, clones #2020 ແລະ #2077 ມີປະມານ 1000 ເທົ່າ CSF titers ສູງກວ່າ phage ຄວບຄຸມ.ໂປຣໄຟລ໌ pharmacokinetic ຂອງແຕ່ລະ peptide ທີ່ເລືອກແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ພວກມັນທັງຫມົດມີຄວາມສາມາດ CSF homeing ສູງ.ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການຫຼຸດລົງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງໃນໄລຍະເວລາສໍາລັບ clones #1903 ແລະ #2011, ໃນຂະນະທີ່ສໍາລັບ clones #2077, #2002 ແລະ #2009 ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ 10 ນາທີທໍາອິດອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການຂົນສົ່ງທີ່ຫ້າວຫັນແຕ່ຕ້ອງໄດ້ຮັບການກວດສອບ.Clones #2020, #2002, ແລະ #2077 ຄົງຕົວຢູ່ໃນລະດັບສູງ, ໃນຂະນະທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ CSF ຂອງ clone #2009 ຫຼຸດລົງຊ້າໆຫຼັງຈາກການເພີ່ມຂຶ້ນໃນເບື້ອງຕົ້ນ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາປຽບທຽບຄວາມຖີ່ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງຜູ້ສະຫມັກ CSF ແຕ່ລະຄົນກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເລືອດຂອງມັນ (ຮູບ 3d).ການພົວພັນຂອງ titer ສະເລ່ຍຂອງຜູ້ສະຫມັກ CSF ແຕ່ລະຄົນກັບ titer ເລືອດຂອງມັນຢູ່ໃນທຸກເວລາຕົວຢ່າງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຜູ້ສະຫມັກສາມຄົນໃນຫົກຄົນໄດ້ຮັບສານ CSF ເລືອດຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.ຫນ້າສົນໃຈ, clone #2077 ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງເລືອດທີ່ສູງຂຶ້ນ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 7).ເພື່ອຢືນຢັນວ່າ peptides ຕົວເອງມີຄວາມສາມາດໃນການຂົນສົ່ງສິນຄ້າຢ່າງຫ້າວຫັນນອກເຫນືອຈາກ peptides ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເຄາະ peptides ຜູ້ນໍາສີ່ຕົວທີ່ມາຈາກ biotin ຢູ່ປາຍ N ທີ່ peptides ຕິດກັບ peptides.peptides biotinylated (ສະບັບເລກທີ 2002, 2009, 2020 ແລະ 2077) ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ streptavidin (SA) ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບຮູບແບບ multimeric ຂ້ອນຂ້າງ mimicing ເລຂາຄະນິດ phage.ຮູບແບບນີ້ຍັງອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາວັດແທກ SA exposure ໃນເລືອດແລະນ້ໍາ cerebrospinal ເປັນ peptides ທາດໂປຼຕີນຈາກການຂົນສົ່ງສິນຄ້າ.ສິ່ງສໍາຄັນ, ຂໍ້ມູນ phage ມັກຈະຖືກຜະລິດຄືນໃຫມ່ເມື່ອ peptides ສັງເຄາະຖືກປະຕິບັດໃນຮູບແບບ SA-conjugated ນີ້ (ຮູບ 3e).peptides ຂູດມີການເປີດເຜີຍເບື້ອງຕົ້ນຫນ້ອຍລົງແລະການເກັບກູ້ CSF ໄວຂຶ້ນດ້ວຍລະດັບທີ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ພາຍໃນ 48 ຊົ່ວໂມງ.ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບເສັ້ນທາງການຈັດສົ່ງຂອງ peptide phage clones ເຫຼົ່ານີ້ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະການທ້ອງຖິ່ນຂອງ peptide hits ສ່ວນບຸກຄົນໂດຍໃຊ້ immunohistochemistry (IHC) ເພື່ອກວດຫາ peptide particles ໂດຍກົງ 1 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການສັກຢາ intravenous in vivo.ໂດຍສະເພາະ, clones #2002, #2077, ແລະ #2009 ສາມາດກວດພົບໄດ້ໂດຍການ staining ທີ່ເຂັ້ມແຂງໃນ capillaries ສະຫມອງ, ໃນຂະນະທີ່ການຄວບຄຸມ phage (#1779) ແລະ clone #2020 ບໍ່ໄດ້ຖືກກວດພົບ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 8).ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ peptides ເຫຼົ່ານີ້ປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນຜົນກະທົບຂອງສະຫມອງທີ່ຊັດເຈນໂດຍການຂ້າມ BBB.ການວິເຄາະລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອທົດສອບສົມມຸດຕິຖານນີ້, ເນື່ອງຈາກວ່າເສັ້ນທາງ BSCFB ອາດຈະມີສ່ວນຮ່ວມ.ເມື່ອປຽບທຽບລໍາດັບອາຊິດ amino ຂອງ clone ທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດ (#2002) ກັບ peptides ອື່ນໆທີ່ເລືອກ, ມັນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນວ່າບາງສ່ວນຂອງພວກມັນມີການຂະຫຍາຍອາຊິດ amino ທີ່ຄ້າຍຄືກັນ, ເຊິ່ງອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງກົນໄກການຂົນສົ່ງທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (ຮູບ 3f).
ເນື່ອງຈາກໂປຼໄຟລ໌ plasma ຂອງມັນເປັນເອກະລັກແລະການເພີ່ມຂື້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ CSF ໃນໄລຍະເວລາ, phage display clone #2077 ໄດ້ຖືກຄົ້ນຫາຕື່ມອີກໃນໄລຍະເວລາ 48 ຊົ່ວໂມງທີ່ຍາວກວ່າແລະສາມາດແຜ່ພັນການເພີ່ມຂື້ນຢ່າງໄວວາຂອງ CSF ທີ່ສັງເກດເຫັນໃນການເຊື່ອມໂຍງກັບລະດັບ SA ແບບຍືນຍົງ (ຮູບ 4a).ກ່ຽວກັບ clones phage ອື່ນທີ່ລະບຸ, #2077 stained ທີ່ເຂັ້ມແຂງສໍາລັບ capillaries ສະຫມອງແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນ colocalization ທີ່ສໍາຄັນກັບ capillary marker lectin ເມື່ອເບິ່ງໃນຄວາມລະອຽດທີ່ສູງຂຶ້ນແລະອາດຈະເປັນການ staining ຢູ່ໃນຊ່ອງ parenchymal (ຮູບ 4b).ເພື່ອກວດກາເບິ່ງວ່າຜົນກະທົບທາງຢາຂອງ peptide-mediated ສາມາດໄດ້ຮັບໃນ CNS, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການທົດລອງທີ່ biotinylated versions ຂອງ i) the #2077 transit peptide ແລະ ii) BACE1 inhibitor peptide ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ SA ໃນສອງອັດຕາສ່ວນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ສໍາລັບການປະສົມປະສານຫນຶ່ງທີ່ພວກເຮົາໃຊ້ພຽງແຕ່ BACE1 peptide inhibitor ແລະອີກອັນຫນຶ່ງທີ່ພວກເຮົາໃຊ້ອັດຕາສ່ວນ 1:3 ຂອງ BACE1 peptide inhibitor ກັບ #2077 peptide.ທັງສອງຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະຕິບັດທາງເສັ້ນເລືອດແລະເລືອດແລະນ້ໍາ cerebrospinal ລະດັບ beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ໄດ້ຖືກວັດແທກໃນໄລຍະເວລາ.Abeta40 ໄດ້ຖືກວັດແທກໃນ CSF ຍ້ອນວ່າມັນສະທ້ອນເຖິງການຍັບຍັ້ງ BACE1 ໃນ parenchyma ສະຫມອງ.ຕາມຄາດຫມາຍ, ທັງສອງສະລັບສັບຊ້ອນຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນເລືອດຂອງ Abeta40 (ຮູບ 4c, d).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ມີພຽງແຕ່ຕົວຢ່າງທີ່ມີສ່ວນປະສົມຂອງ peptide no.2077 ແລະ inhibitor ຂອງ BACE1 peptide conjugated ກັບ SA ເຮັດໃຫ້ເກີດການຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ Abeta40 ໃນນ້ໍາ cerebrospinal (ຮູບ 4c).ຂໍ້ມູນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ peptide no.2077 ສາມາດຂົນສົ່ງທາດໂປຼຕີນຈາກ 60 kDa SA ເຂົ້າໄປໃນ CNS ແລະຍັງເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນກະທົບທາງຢາດ້ວຍ SA-conjugated inhibitors ຂອງ BACE1 peptide.
(a) ການສັກຢາ clonal (2 × 10 phages / ສັດ) ຂອງ T7 phage ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂປຣໄຟລ໌ pharmacokinetic ໄລຍະຍາວຂອງ CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ແລະ phage ຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ໄດ້ສີດ (#1779) ໃນຢ່າງຫນ້ອຍສາມຫນູ CM-intubated.(b) ຮູບພາບກ້ອງຈຸລະທັດແບບ confocal ຂອງ microvessels cortical ຕົວແທນໃນຫນູ phage-injected (2 × 10 10 phages / ສັດ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນ counterstaining ຂອງ peptide #2077 ແລະເຮືອ (lectin).ໂຄລນ phage ເຫຼົ່ານີ້ຖືກປະຕິບັດໃຫ້ຫນູ 3 ໂຕແລະອະນຸຍາດໃຫ້ແຜ່ລາມເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງກ່ອນການດູດຊຶມ.ສະໝອງຖືກແຍກອອກ ແລະເປັນສີດ້ວຍພູມຕ້ານທານທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ polyclonal FITC ຕໍ່ກັບ T7 phage capsid.ສິບນາທີກ່ອນການດູດຊຶມແລະການສ້ອມແຊມຕໍ່ມາ, DyLight594-labeled Lectin ໄດ້ຖືກປະຕິບັດທາງເສັ້ນເລືອດ.ຮູບພາບ fluorescent ສະແດງໃຫ້ເຫັນການ staining lectin (ສີແດງ) ຂອງຂ້າງ luminal ຂອງ microvessels ແລະ phages (ສີຂຽວ) ໃນ lumen ຂອງ capillaries ແລະຈຸລັງສະຫມອງ perivascular.ແຖບຂະໜາດເທົ່າກັບ 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide ຢ່າງດຽວຫຼືປະສົມປະສານກັບ biotinylated transit peptide #2077 ໄດ້ຖືກສົມທົບກັບ streptavidin ຕິດຕາມດ້ວຍການສັກຢາເຂົ້າເສັ້ນເລືອດຂອງຫນູ CM ຢ່າງຫນ້ອຍສາມ cannulated (10 mg streptavidin / kg).BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction ໃນAβ40 ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ Aβ1-40 ELISA ໃນເລືອດ (ສີແດງ) ແລະນ້ໍາ cerebrospinal (ສີສົ້ມ) ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້.ເພື່ອຄວາມຊັດເຈນທີ່ດີຂຶ້ນ, ເສັ້ນຈຸດຖືກແຕ້ມຢູ່ໃນກາຟໃນລະດັບ 100%.(c) ການຫຼຸດຜ່ອນອັດຕາສ່ວນຂອງ Aβ40 ໃນເລືອດ (ສາມຫຼ່ຽມສີແດງ) ແລະນ້ໍາ cerebrospinal (ສາມຫຼ່ຽມສີສົ້ມ) ໃນຫນູທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ streptavidin conjugated ກັບ transit peptide #2077 ແລະ BACE1 inhibitory peptide ໃນອັດຕາສ່ວນ 3: 1.(d) ການຫຼຸດຜ່ອນອັດຕາສ່ວນໃນເລືອດ Aβ40 (ວົງສີແດງ) ແລະນ້ໍາ cerebrospinal (ວົງສີສົ້ມ) ຂອງຫນູທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ streptavidin ສົມທົບກັບ BACE1 peptide inhibitory ເທົ່ານັ້ນ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Aβ ໃນການຄວບຄຸມແມ່ນ 420 pg/ml (ມາດຕະຖານ deviation = 101 pg/ml).
ການສະແດງ phage ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງສໍາເລັດຜົນໃນຫຼາຍໆຂົງເຂດຂອງການຄົ້ນຄວ້າຊີວະວິທະຍາ17.ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສຶກສາຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງເສັ້ນເລືອດຂອງ vivo 18,19 ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການສຶກສາທີ່ກໍານົດເປົ້າຫມາຍຂອງເຮືອສະຫມອງ 20,21,22,23,24,25,26.ໃນການສຶກສານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຂະຫຍາຍການນໍາໃຊ້ວິທີການຄັດເລືອກນີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ການກໍານົດໂດຍກົງຂອງ peptides ເປົ້າຫມາຍຂອງເຮືອສະຫມອງ, ແຕ່ຍັງເປັນການຄົ້ນພົບຜູ້ສະຫມັກທີ່ມີຄຸນສົມບັດການຂົນສົ່ງຢ່າງຫ້າວຫັນເພື່ອຂ້າມອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ.ຕອນນີ້ພວກເຮົາອະທິບາຍເຖິງການພັດທະນາຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກໃນ vivo ໃນຫນູ CM intubated ແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນທ່າແຮງຂອງມັນໃນການກໍານົດ peptides ທີ່ມີຄຸນສົມບັດຂອງ CSF homeing.ການນໍາໃຊ້ T7 phage ສະແດງຫ້ອງສະຫມຸດຂອງ peptides random 12-mer, ພວກເຮົາສາມາດສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ T7 phage ມີຂະຫນາດນ້ອຍພຽງພໍ (ປະມານເສັ້ນຜ່າກາງ 60 nm) 10 ເພື່ອປັບຕົວເຂົ້າກັບອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ, ດັ່ງນັ້ນການຂ້າມຜ່ານອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງຫຼື choroid plexus.ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າການຂຸດຄົ້ນ CSF ຈາກຫນູ CM ທີ່ມີກະປ໋ອງແມ່ນເປັນວິທີການກວດກາທີ່ເຮັດວຽກຂອງ vivo, ຄວບຄຸມໄດ້ດີ, ແລະ phage ສະກັດບໍ່ພຽງແຕ່ຜູກມັດກັບ vasculature, ແຕ່ຍັງເຮັດວຽກເປັນການຂົນສົ່ງຂ້າມອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ.ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ໂດຍການລວບລວມເລືອດພ້ອມໆກັນແລະນໍາໃຊ້ HTS ກັບ CSF ​​ແລະ phages ທີ່ມາຈາກເລືອດ, ພວກເຮົາຢືນຢັນວ່າການເລືອກ CSF ຂອງພວກເຮົາບໍ່ມີອິດທິພົນຈາກການເພີ່ມເລືອດຫຼືການສອດຄ່ອງກັບການຂະຫຍາຍລະຫວ່າງຮອບຄັດເລືອກ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຊ່ອງເລືອດແມ່ນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກ, ເນື່ອງຈາກວ່າ phages ທີ່ສາມາດເຂົ້າຫາຊ່ອງ CSF ໄດ້ຕ້ອງຢູ່ລອດແລະໄຫຼວຽນຢູ່ໃນກະແສເລືອດດົນພໍທີ່ຈະອຸດົມສົມບູນໃນສະຫມອງ.ເພື່ອສະກັດຂໍ້ມູນລໍາດັບທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຈາກຂໍ້ມູນ HTS ດິບ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດຕົວກອງທີ່ປັບຕົວເຂົ້າກັບຄວາມຜິດພາດການຈັດລໍາດັບຂອງເວທີໃນຂັ້ນຕອນການວິເຄາະ.ໂດຍການລວມເອົາຕົວກໍານົດການ kinetic ເຂົ້າໃນວິທີການກວດ, ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນການ pharmacokinetics ຢ່າງໄວວາຂອງ phages ປະເພດທໍາມະຊາດ T7 (t½ ~ 28 ນາທີ) ໃນເລືອດ 24, 27, 28 ແລະຍັງໄດ້ກໍານົດເຄິ່ງຫນຶ່ງຊີວິດຂອງເຂົາເຈົ້າໃນນ້ໍາ cerebrospinal (t½ ~ 26 ນາທີ) ຕໍ່ນາທີ).ເຖິງວ່າຈະມີໂປຣໄຟລ pharmacokinetic ທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນເລືອດແລະ CSF, ພຽງແຕ່ 0.001% ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເລືອດຂອງ phage ສາມາດກວດພົບໄດ້ໃນ CSF, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການເຄື່ອນໄຫວຂອງພື້ນຫລັງຕ່ໍາຂອງ phage ປະເພດທໍາມະຊາດ T7 ໃນທົ່ວອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ.ວຽກງານນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມສໍາຄັນຂອງການຄັດເລືອກຮອບທໍາອິດໃນເວລາທີ່ນໍາໃຊ້ໃນຍຸດທະສາດການ panning vivo, ໂດຍສະເພາະແມ່ນສໍາລັບລະບົບ phage ທີ່ຖືກລ້າງຢ່າງໄວວາຈາກການໄຫຼວຽນ, ຍ້ອນວ່າ clones ຈໍານວນຫນ້ອຍທີ່ສາມາດບັນລຸຊ່ອງໃສ່ CNS.ດັ່ງນັ້ນ, ໃນຮອບທໍາອິດ, ການຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະຫມຸດແມ່ນມີຂະຫນາດໃຫຍ່ຫຼາຍ, ມີພຽງແຕ່ຈໍານວນຈໍາກັດຂອງ clones ໃນທີ່ສຸດໄດ້ຖືກເກັບກໍາໃນຮູບແບບ CSF ທີ່ເຄັ່ງຄັດຫຼາຍນີ້.ນີ້ໃນຍຸດທະສາດການ panning vivo ປະກອບມີຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກຈໍານວນຫນຶ່ງເຊັ່ນ: ການສະສົມຢ່າງຫ້າວຫັນໃນ CSF compartment, ການລອດຊີວິດຂອງ clone ໃນຊ່ອງເລືອດ, ແລະການໂຍກຍ້າຍຢ່າງໄວວາຂອງ clones T7 phage ອອກຈາກເລືອດພາຍໃນ 10 ນາທີທໍາອິດ (ຮູບ 1d ແລະເພີ່ມເຕີມ Fig. 4M).).ດັ່ງນັ້ນ, ຫຼັງຈາກຮອບທໍາອິດ, ໂຄນ phage ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ໃນ CSF, ເຖິງແມ່ນວ່າສະນຸກເກີເບື້ອງຕົ້ນດຽວກັນຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບສັດສ່ວນບຸກຄົນ.ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຫຼາຍຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມງວດສໍາລັບຫ້ອງສະຫມຸດແຫຼ່ງທີ່ມີຈໍານວນສະມາຊິກຫ້ອງສະຫມຸດເປັນຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍເຮັດໃຫ້ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.ດັ່ງນັ້ນ, ເຫດການແບບສຸ່ມຈະກາຍເປັນສ່ວນຫນຶ່ງທີ່ສໍາຄັນຂອງຂະບວນການຄັດເລືອກເບື້ອງຕົ້ນ, ມີອິດທິພົນຕໍ່ຜົນໄດ້ຮັບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າຈໍານວນຫຼາຍຂອງ clones ໃນຫ້ອງສະຫມຸດຕົ້ນສະບັບມີ propensity enrichment CSF ທີ່ຄ້າຍຄືກັນຫຼາຍ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງແມ່ນວ່າພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການທົດລອງດຽວກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບການຄັດເລືອກອາດຈະແຕກຕ່າງກັນເນື່ອງຈາກຈໍານວນຂະຫນາດນ້ອຍຂອງແຕ່ລະ clone ໂດຍສະເພາະໃນສະນຸກເກີເບື້ອງຕົ້ນ.
motifs enriched ໃນ CSF ແຕກຕ່າງຈາກສິ່ງທີ່ຢູ່ໃນເລືອດ.ຫນ້າສົນໃຈ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການປ່ຽນແປງຄັ້ງທໍາອິດໄປສູ່ peptides ທີ່ອຸດົມສົມບູນ glycine ໃນເລືອດຂອງສັດສ່ວນບຸກຄົນ.(ຮູບ 1g, ເສີມ Fig. 4e, 4f).Phage ທີ່ບັນຈຸ glycine peptides ອາດຈະມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຫຼາຍແລະຫນ້ອຍທີ່ຈະເອົາອອກຈາກການໄຫຼວຽນຂອງ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, peptides ທີ່ອຸດົມສົມບູນ glycine ເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນຕົວຢ່າງນ້ໍາ cerebrospinal, ແນະນໍາວ່າຫ້ອງສະຫມຸດ curated ໄດ້ຜ່ານສອງຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ: ຫນຶ່ງໃນເລືອດແລະອີກອັນຫນຶ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ສະສົມຢູ່ໃນນ້ໍາ cerebrospinal.CSF-enriched clones ທີ່ເປັນຜົນມາຈາກການຄັດເລືອກຮອບສີ່ໄດ້ຖືກທົດສອບຢ່າງກວ້າງຂວາງ.ເກືອບທັງ ໝົດ ຂອງ clones ທີ່ຖືກທົດສອບເປັນສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ຖືກຢືນຢັນວ່າຈະອຸດົມສົມບູນໃນ CSF ເມື່ອທຽບກັບ phage ຄວບຄຸມເປົ່າ.ຫນຶ່ງ peptide hit (#2077) ໄດ້ຖືກກວດກາໃນລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມ.ມັນສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງເຄິ່ງຫນຶ່ງຂອງ plasma ຊີວິດທີ່ຍາວກວ່າເມື່ອທຽບກັບ hits ອື່ນໆ (ຮູບ 3d ແລະຮູບພາບເສີມ 7), ແລະຫນ້າສົນໃຈ, peptide ນີ້ມີ residue cysteine ​​​​ຢູ່ C-terminus.ບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການເພີ່ມ cysteine ​​​​peptides ສາມາດປັບປຸງຄຸນສົມບັດ pharmacokinetic ຂອງເຂົາເຈົ້າໂດຍການຜູກມັດກັບ albumin 29 .ໃນປັດຈຸບັນນີ້ແມ່ນບໍ່ຮູ້ສໍາລັບ peptide #2077 ແລະຕ້ອງການການສຶກສາຕື່ມອີກ.ບາງ peptides ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງ valence-dependency ໃນ CSF enrichment (ຂໍ້ມູນບໍ່ໄດ້ສະແດງ), ເຊິ່ງອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບເລຂາຄະນິດຂອງພື້ນຜິວທີ່ສະແດງຂອງ T7 capsid.ລະບົບ T7 ທີ່ພວກເຮົາໃຊ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນ 5-15 ສໍາເນົາຂອງແຕ່ລະ peptide ຕໍ່ particle.IHC ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນ clones ນໍາຜູ້ສະຫມັກ phage ສັກເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນເລືອດເຂົ້າໄປໃນ cerebral cortex ຂອງຫນູ (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 8).ຂໍ້ມູນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຢ່າງຫນ້ອຍສາມ clones (ສະບັບເລກທີ 2002, ສະບັບເລກທີ 2009 ແລະສະບັບເລກທີ 2077) ໄດ້ພົວພັນກັບ BBB.ມັນຍັງເປັນການກໍານົດວ່າປະຕິສໍາພັນ BBB ນີ້ເຮັດໃຫ້ການສະສົມຂອງ CSF ຫຼືການເຄື່ອນໄຫວຂອງ clones ເຫຼົ່ານີ້ໂດຍກົງກັບ BCSFB.ສິ່ງສໍາຄັນ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ peptides ທີ່ຖືກຄັດເລືອກຮັກສາຄວາມສາມາດໃນການຂົນສົ່ງ CSF ຂອງພວກເຂົາເມື່ອສັງເຄາະແລະຜູກມັດກັບການຂົນສົ່ງທາດໂປຼຕີນ.ການຜູກມັດຂອງ N-terminal biotinylated peptides ກັບ SA ສໍາຄັນແມ່ນເຮັດເລື້ມຄືນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ໄດ້ຮັບກັບ phage clones ຂອງເຂົາເຈົ້າໃນເລືອດແລະນ້ໍາ cerebrospinal (ຮູບ 3e).ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ lead peptide #2077 ສາມາດສົ່ງເສີມການປະຕິບັດຂອງສະຫມອງຂອງສານຍັບຍັ້ງ peptide biotinylated ຂອງ BACE1 conjugated ກັບ SA, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດຜົນກະທົບທາງ pharmacodynamic ໃນ CNS ໂດຍການຫຼຸດຜ່ອນລະດັບ Abeta40 ໃນ CSF ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 4).ພວກ​ເຮົາ​ບໍ່​ສາ​ມາດ​ທີ່​ຈະ​ກໍາ​ນົດ homologues ໃດ​ໃນ​ຖານ​ຂໍ້​ມູນ​ໂດຍ​ການ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ການ​ຊອກ​ຫາ​ລໍາ​ດັບ peptide homology ຂອງ hits ທັງ​ຫມົດ​.ມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນທີ່ຈະສັງເກດວ່າຂະຫນາດຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ T7 ແມ່ນປະມານ 109, ໃນຂະນະທີ່ຂະຫນາດຫ້ອງສະຫມຸດທິດສະດີສໍາລັບ 12-mers ແມ່ນ 4 x 1015. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາເລືອກພຽງແຕ່ສ່ວນນ້ອຍໆຂອງພື້ນທີ່ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ peptide 12-mer, ເຊິ່ງອາດຈະຫມາຍຄວາມວ່າ peptides ທີ່ດີທີ່ສຸດເຫຼົ່ານີ້ສາມາດຖືກກໍານົດໂດຍການປະເມີນຄວາມຖີ່ຂອງພື້ນທີ່ໃກ້ຄຽງ.ສົມມຸດຕິຖານ, ຫນຶ່ງໃນເຫດຜົນວ່າເປັນຫຍັງພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ພົບເຫັນ homologues ທໍາມະຊາດຂອງ peptides ເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະເປັນການຍົກເລີກການເລືອກໃນລະຫວ່າງການ evolution ເພື່ອປ້ອງກັນການເຂົ້າ uncontrolled ຂອງບາງ motifs peptides ເຂົ້າໄປໃນສະຫມອງ.
ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະຫນອງພື້ນຖານສໍາລັບການເຮັດວຽກໃນອະນາຄົດເພື່ອກໍານົດແລະລັກສະນະຂອງລະບົບການຂົນສົ່ງຂອງອຸປະສັກ cerebrovascular ໃນ vivo ໃນລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມ.ການຕິດຕັ້ງພື້ນຖານຂອງວິທີການນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ຍຸດທະສາດການຄັດເລືອກທີ່ເປັນປະໂຫຍດທີ່ບໍ່ພຽງແຕ່ກໍານົດ clones ທີ່ມີຄຸນສົມບັດຜູກມັດເສັ້ນເລືອດສະຫມອງ, ແຕ່ຍັງປະກອບມີຂັ້ນຕອນທີ່ສໍາຄັນທີ່ clones ສົບຜົນສໍາເລັດມີກິດຈະກໍາພາຍໃນເພື່ອຂ້າມອຸປະສັກທາງຊີວະພາບໃນ vivo ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CNS.ແມ່ນເພື່ອ elucidate ກົນໄກການຂົນສົ່ງຂອງ peptides ເຫຼົ່ານີ້ແລະຄວາມມັກຂອງເຂົາເຈົ້າສໍາລັບການຜູກມັດກັບ microvasculature ສະເພາະກັບພາກພື້ນສະຫມອງ.ນີ້ອາດຈະນໍາໄປສູ່ການຄົ້ນພົບເສັ້ນທາງໃຫມ່ສໍາລັບການຂົນສົ່ງຂອງ BBB ແລະ receptors.ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າ peptides ທີ່ຖືກກໍານົດສາມາດຜູກມັດໂດຍກົງກັບ cerebrovascular receptors ຫຼືການໄຫຼວຽນຂອງ ligands ທີ່ຂົນສົ່ງຜ່ານ BBB ຫຼື BCSFB.vectors peptide ທີ່ມີກິດຈະກໍາການຂົນສົ່ງ CSF ທີ່ຄົ້ນພົບໃນວຽກງານນີ້ຈະຖືກສືບສວນຕື່ມອີກ.ໃນປັດຈຸບັນພວກເຮົາກໍາລັງສືບສວນຄວາມສະເພາະຂອງສະຫມອງຂອງ peptides ເຫຼົ່ານີ້ສໍາລັບຄວາມສາມາດໃນການຂ້າມ BBB ແລະ / ຫຼື BCSFB.peptides ໃຫມ່ເຫຼົ່ານີ້ຈະເປັນເຄື່ອງມືທີ່ມີຄຸນຄ່າທີ່ສຸດສໍາລັບການຄົ້ນພົບທີ່ມີທ່າແຮງຂອງ receptors ຫຼືເສັ້ນທາງໃຫມ່ແລະສໍາລັບການພັດທະນາແພລະຕະຟອມທີ່ມີປະສິດທິພາບສູງໃຫມ່ສໍາລັບການຈັດສົ່ງ macromolecules, ເຊັ່ນ: ຊີວະວິທະຍາ, ໄປສູ່ສະຫມອງ.
Cannulate cisterna ຂະ​ຫນາດ​ໃຫຍ່ (CM​) ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ການ​ດັດ​ແກ້​ຂອງ​ວິ​ທີ​ການ​ອະ​ທິ​ບາຍ​ໃນ​ເມື່ອ​ກ່ອນ​.ໜູ Wistar ທີ່ຖືກຢາສລົບ (200-350 ກຣາມ) ໄດ້ຖືກຕິດຕັ້ງໃສ່ເຄື່ອງ stereotaxic ແລະ ຜ່າຕັດເຄິ່ງກາງແມ່ນເຮັດໃສ່ໜັງຫົວທີ່ໂກນ ແລະ ກະກຽມ aseptically ເພື່ອເປີດເຜີຍກະໂຫຼກຫົວ.ເຈາະສອງຮູຢູ່ໃນພື້ນທີ່ຂອງ sash ເທິງແລະ fasten screws ການແກ້ໄຂໃນຮູ.ມີຂຸມເພີ່ມເຕີມໄດ້ຖືກເຈາະຢູ່ໃນ crest occipital ຂ້າງສໍາລັບການຊີ້ນໍາ stereotactic ຂອງ cannula ສະແຕນເລດເຂົ້າໄປໃນ CM.ທາຊີມັງຮອບໆ cannula ແລະຮັບປະກັນດ້ວຍສະກູ.ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ປິ່ນ​ປົວ​ຮູບ​ພາບ​ແລະ​ຊີ​ມັງ​ແຂງ​, ບາດ​ແຜ​ຜິວ​ຫນັງ​ໄດ້​ຖືກ​ປິດ​ດ້ວຍ suture 4/0 supramid​.ການຈັດວາງທີ່ຖືກຕ້ອງຂອງ cannula ແມ່ນໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການຮົ່ວໄຫລຂອງນ້ໍາ cerebrospinal (CSF).ເອົາຫນູອອກຈາກອຸປະກອນ stereotaxic, ໄດ້ຮັບການເບິ່ງແຍງຫຼັງການຜ່າຕັດທີ່ເຫມາະສົມແລະການຄຸ້ມຄອງຄວາມເຈັບປວດ, ແລະປ່ອຍໃຫ້ມັນຟື້ນຕົວຢ່າງຫນ້ອຍຫນຶ່ງອາທິດຈົນກ່ວາອາການຂອງເລືອດສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນນ້ໍາ cerebrospinal.ໜູ Wistar (Crl:WI/Han) ໄດ້ມາຈາກ Charles River (ຝຣັ່ງ).ໜູທັງໝົດຖືກຮັກສາໄວ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂສະເພາະທີ່ບໍ່ມີເຊື້ອພະຍາດ.ການທົດລອງສັດທັງຫມົດໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກຫ້ອງການສັດຕະວະແພດຂອງເມືອງ Basel, ປະເທດສະວິດເຊີແລນ, ແລະໄດ້ດໍາເນີນການຕາມໃບອະນຸຍາດສັດ No. 2474 (ການປະເມີນການຂົນສົ່ງສະຫມອງທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວໂດຍການວັດແທກລະດັບຂອງຜູ້ສະຫມັກປິ່ນປົວໃນນ້ໍາ Cerebrospinal ແລະສະຫມອງຂອງຫນູ).
ຄ່ອຍໆຮັກສາສະຕິຫນູດ້ວຍ CM cannula ໃນມື.ເອົາ Datura ອອກຈາກ cannula ແລະເກັບກໍາ 10 µl ຂອງນ້ໍາ cerebrospinal ໄຫຼໂດຍທໍາມະຊາດ.ເນື່ອງຈາກ patency ຂອງ cannula ໄດ້ຖືກຫຼຸດຫນ້ອຍລົງໃນທີ່ສຸດ, ພຽງແຕ່ຕົວຢ່າງນ້ໍາ cerebrospinal ທີ່ຊັດເຈນທີ່ບໍ່ມີຫຼັກຖານຂອງການປົນເປື້ອນຫຼືການປ່ຽນສີຂອງເລືອດໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າໃນການສຶກສານີ້.ໃນຂະຫນານ, ປະມານ 10-20 μlຂອງເລືອດໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກການຜ່າຕັດຂະຫນາດນ້ອຍຢູ່ປາຍຂອງຫາງເຂົ້າໄປໃນທໍ່ທີ່ມີ heparin (Sigma-Aldrich).CSF ແລະເລືອດໄດ້ຖືກເກັບກໍາຢູ່ໃນຈຸດເວລາຕ່າງໆຫຼັງຈາກການສັກຢາ T7 phage ເຂົ້າທາງເສັ້ນເລືອດ.ປະມານ 5-10 μlຂອງນ້ໍາໄດ້ຖືກຍົກເລີກກ່ອນທີ່ຈະເກັບຕົວຢ່າງ CSF, ເຊິ່ງກົງກັບປະລິມານທີ່ຕາຍແລ້ວຂອງ catheter.
ຫ້ອງສະຫມຸດໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນໂດຍໃຊ້ vector T7Select 10-3b ຕາມທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນຄູ່ມືລະບົບ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).ໂດຍຫຍໍ້, ການແຊກ DNA 12-mer ແບບສຸ່ມໄດ້ຖືກສັງເຄາະໃນຮູບແບບດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:
NNK codon ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການ double stop codons ແລະອາຊິດ amino overexpression ໃນ insert.N ແມ່ນອັດຕາສ່ວນ equimolar ປະສົມດ້ວຍຕົນເອງຂອງແຕ່ລະ nucleotide, ແລະ K ແມ່ນອັດຕາສ່ວນ equimolar ປະສົມດ້ວຍຕົນເອງຂອງ adenine ແລະ cytosine nucleotides.ພາກພື້ນທີ່ມີສາຍດ່ຽວຖືກປ່ຽນເປັນ DNA ເສັ້ນຄູ່ໂດຍການຟອກຕື່ມອີກດ້ວຍ dNTP (Novagen) ແລະ enzyme Klenow (New England Biolabs) ໃນ Klenow buffer (New England Biolabs) ເປັນເວລາ 3 ຊົ່ວໂມງຢູ່ທີ່ 37 ° C.ຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາ, DNA ສອງສາຍໄດ້ຖືກຟື້ນຕົວໂດຍການຝົນ EtOH.DNA ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຖືກຍ່ອຍດ້ວຍ enzymes ຈໍາກັດ EcoRI ແລະ HindIII (ທັງສອງຈາກ Roche).ແຜ່ນແຊກ (QIAquick, Qiagen) ທີ່ຖືກຕັດ ແລະ ຊຳລະແລ້ວ (T4 ligase, New England Biolabs) ໄດ້ຖືກເຊື່ອມເຂົ້າໃນກອບເປັນ vector T7 ທີ່ຖືກຕັດກ່ອນຫຼັງຈາກອາຊິດ amino 348 ຂອງ 10B capsid gene.ປະຕິກິລິຍາ ligation ແມ່ນ incubated ຢູ່ທີ່ 16 ° C. ສໍາລັບ 18 ຊົ່ວໂມງກ່ອນທີ່ຈະຫຸ້ມຫໍ່ຢູ່ໃນ vitro.ການຫຸ້ມຫໍ່ phage ໃນ vitro ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມຄໍາແນະນໍາທີ່ສະຫນອງໃຫ້ກັບຊຸດ cloning T7Select 10-3b (Novagen) ແລະການແກ້ໄຂການຫຸ້ມຫໍ່ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍອອກຫນຶ່ງຄັ້ງເພື່ອ lysis ໂດຍໃຊ້ Escherichia coli (BLT5615, Novagen).lysates ໄດ້ centrifuged, titrated ແລະ frozen ຢູ່ -80 ° C. ເປັນການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບຂອງ glycerol.
ການຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍກົງຂອງພາກພື້ນທີ່ປ່ຽນແປງໄດ້ຂອງ phage ຂະຫຍາຍຢູ່ໃນ broth ຫຼືແຜ່ນໂດຍໃຊ້ primers fusion 454/Roche-amplicon ທີ່ເປັນເຈົ້າຂອງ.primer fusion ຂ້າງຫນ້າປະກອບດ້ວຍລໍາດັບທີ່ flanking ພາກພື້ນ variable (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, ແລະລໍາດັບສີ່ຖານຫ້ອງສະຫມຸດ key (TCAG) (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 1a):
primer fusion reverse ຍັງມີ biotin ທີ່ຕິດກັບຈັບລູກປັດແລະ GS FLX Titanium Adapter B ທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບການຂະຫຍາຍ clonal ໃນລະຫວ່າງການ emulsion PCR:
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, amplicons ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມ 454/Roche pyrosequencing ຕາມ 454 GS-FLX Titanium protocol.ສໍາລັບການຈັດລໍາດັບ Sanger ຄູ່ມື (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໂດຍ PCR ແລະຈັດລໍາດັບດ້ວຍຄູ່ primer ດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:
ແຜ່ນແຊກຈາກແຜ່ນແຕ່ລະອັນແມ່ນຂຶ້ນກັບການຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍໃຊ້ຊຸດ Roche Fast Start DNA Polymerase (ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ).ດໍາເນີນການເລີ່ມຕົ້ນທີ່ຮ້ອນ (10 ນາທີຢູ່ທີ່ 95 ° C) ແລະ 35 ຮອບວຽນກະຕຸ້ນ (50 ວິນາທີທີ່ 95 ° C, 1 ນາທີຢູ່ທີ່ 50 ° C, ແລະ 1 ນາທີຢູ່ທີ່ 72 ° C).
Phage ຈາກຫ້ອງສະຫມຸດ, phage ປະເພດທໍາມະຊາດ, phage ຊ່ວຍເຫຼືອຈາກ CSF ແລະເລືອດ, ຫຼື clones ບຸກຄົນໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍຢູ່ໃນ Escherichia coli BL5615 ໃນ broth TB (Sigma Aldrich) ຫຼືໃນຖ້ວຍ 500 cm2 (Thermo Scientific) ສໍາລັບ 4 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C.Phage ໄດ້ຖືກສະກັດອອກຈາກແຜ່ນໂດຍການລ້າງແຜ່ນດ້ວຍ Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) ຫຼືໂດຍການລວບລວມແຜ່ນທີ່ມີຄໍາແນະນໍາ pipette ທີ່ບໍ່ສະອາດ.Phage ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກຊັ້ນສູງຂອງວັດທະນະທໍາ ຫຼື buffer ການສະກັດເອົາກັບຫນຶ່ງຮອບຂອງ polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) ແລະ resuspended ໃນ Tris-EDTA buffer.
ການຂະຫຍາຍ phage ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ 2-3 ຮອບຂອງການກໍາຈັດ endotoxin ໂດຍໃຊ້ລູກປັດກໍາຈັດ endotoxin (Miltenyi Biotec) ກ່ອນທີ່ຈະສັກຢາທາງເສັ້ນເລືອດ (IV) (500 μl / ສັດ).ໃນຮອບທໍາອິດ, 2×1012 phages ໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີ;ໃນຄັ້ງທີສອງ, 2 × 1010 phages;ໃນຮອບຄັດເລືອກທີສາມແລະສີ່, 2×109 phages ຕໍ່ສັດ.ເນື້ອໃນຂອງ phage ໃນ CSF ແລະຕົວຢ່າງເລືອດທີ່ເກັບກໍາຢູ່ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການນັບ plaque ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ (ຄູ່ມືລະບົບ T7Select).ການຄັດເລືອກ phage ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍການສັກຢາ intravenous ຂອງຫ້ອງສະຫມຸດ purified ເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນກ່າງຫາງຫຼືໂດຍການ re-injection ຂອງ phage ສະກັດຈາກ CSF ຈາກຮອບຄັດເລືອກທີ່ຜ່ານມາ, ແລະການເກັບກ່ຽວຕໍ່ມາໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ແລະ 240 CSF ຕາມລໍາດັບ.ທັງ ໝົດ 4 ຮອບຂອງການ panning ໃນ vivo ໄດ້ດໍາເນີນ, ເຊິ່ງສອງສາຂາທີ່ເລືອກໄດ້ຖືກເກັບໄວ້ແຍກຕ່າງຫາກແລະວິເຄາະໃນລະຫວ່າງສາມຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກ.ເມັດ phage ທັງຫມົດທີ່ສະກັດຈາກ CSF ຈາກສອງຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກແມ່ນຂຶ້ນກັບ 454 / Roche pyrosequencing, ໃນຂະນະທີ່ clones ທັງຫມົດທີ່ສະກັດຈາກ CSF ຈາກສອງຮອບສຸດທ້າຍຂອງການຄັດເລືອກໄດ້ຖືກຈັດລໍາດັບດ້ວຍຕົນເອງ.phages ເລືອດທັງຫມົດຈາກຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກແມ່ນຍັງຂຶ້ນກັບ 454 / Roche pyrosequencing.ສໍາລັບການສັກຢາ phage clones, phage ທີ່ເລືອກໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍຢູ່ໃນ E. coli (BL5615) ໃນແຜ່ນ 500 cm2 ທີ່ອຸນຫະພູມ 37 ° C ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ.ໂຄລນທີ່ຖືກຄັດເລືອກເປັນສ່ວນບຸກຄົນ ແລະ ດ້ວຍຕົນເອງໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍພັນໃນຂະໜາດກາງຂອງວັນນະໂລກ.ຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາ phage, ການຊໍາລະລ້າງແລະການກໍາຈັດ endotoxin (ດັ່ງທີ່ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ), 2 × 1010 phages / ສັດໃນ 300 μlໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນເລືອດຂອງຫາງຫນຶ່ງ.
Preprocessing ແລະການກັ່ນຕອງຄຸນນະພາບຂອງຂໍ້ມູນລໍາດັບ.ຂໍ້ມູນ 454/Roche ດິບຖືກປ່ຽນຈາກຮູບແບບແຜນທີ່ສະຕຣີມມາດຕະຖານຄູ່ (sff) ໄປເປັນຮູບແບບທີ່ສາມາດອ່ານໄດ້ຂອງມະນຸດ Pearson (fasta) ໂດຍໃຊ້ຊອບແວຜູ້ຂາຍ.ການປະມວນຜົນເພີ່ມເຕີມຂອງລໍາດັບ nucleotide ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ໂປລແກລມ C ແລະສະຄິບທີ່ເປັນເຈົ້າຂອງ (ຊຸດຊອບແວທີ່ຍັງບໍ່ໄດ້ປ່ອຍອອກມາ) ຕາມທີ່ອະທິບາຍຂ້າງລຸ່ມນີ້.ການວິເຄາະຂໍ້ມູນເບື້ອງຕົ້ນປະກອບມີຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງຫຼາຍຂັ້ນຕອນຢ່າງເຂັ້ມງວດ.ເພື່ອກັ່ນຕອງການອ່ານທີ່ບໍ່ມີການໃສ່ 12mer DNA ທີ່ຖືກຕ້ອງ, ການອ່ານຖືກຈັດຮຽງຕາມລໍາດັບເພື່ອເລີ່ມຕົ້ນປ້າຍກຳກັບ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ປ້າຍຢຸດ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ແລະການໃສ່ພື້ນຫຼັງ (CCCTGCAGGATATCCCGGGAGAGCTCGTCGAC) ທີ່ໃຊ້ທົ່ວໂລກ.ການ​ຈັດ​ວາງ​ທີ່​ອະ​ນຸ​ຍາດ​ໃຫ້​ສູງ​ເຖິງ 2 ຄວາມ​ບໍ່​ສອດ​ຄ່ອງ​ຕໍ່​ການ​ຈັດ​ຕັ້ງ31.ດັ່ງນັ້ນ, ອ່ານໂດຍບໍ່ມີການເລີ່ມຕົ້ນແລະຢຸດ tags ແລະການອ່ານທີ່ມີແຊກພື້ນຫລັງ, ie, ການຈັດຕໍາແຫນ່ງທີ່ເກີນຈໍານວນທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ບໍ່ກົງກັນ, ໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກຈາກຫ້ອງສະຫມຸດ.ສໍາລັບການອ່ານທີ່ຍັງເຫຼືອ, ລໍາດັບ N-mer DNA ທີ່ຂະຫຍາຍຈາກເຄື່ອງຫມາຍເລີ່ມຕົ້ນແລະສິ້ນສຸດກ່ອນທີ່ເຄື່ອງຫມາຍຢຸດຈະຖືກຕັດອອກຈາກລໍາດັບການອ່ານຕົ້ນສະບັບແລະການປຸງແຕ່ງຕື່ມອີກ (ຕໍ່ໄປນີ້ເອີ້ນວ່າ "ໃສ່").ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ແປ​ພາ​ສາ​ຂອງ​ການ​ແຊກ​, ສ່ວນ​ທີ່​ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ຢຸດ codon ຄັ້ງ​ທໍາ​ອິດ​ຢູ່​ໃນ 5′ ທ້າຍ​ຂອງ primer ໄດ້​ຖືກ​ໂຍກ​ຍ້າຍ​ອອກ​ຈາກ​ການ​ແຊກ​.ນອກຈາກນັ້ນ, nucleotides ທີ່ນໍາໄປສູ່ codons ທີ່ບໍ່ສົມບູນຢູ່ປາຍ 3′ ຂອງ primer ກໍ່ໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກ.ເພື່ອຍົກເວັ້ນຊ່ອງສຽບທີ່ປະກອບມີພຽງແຕ່ລໍາດັບພື້ນຫລັງ, ແຜ່ນທີ່ແປທີ່ເລີ່ມຕົ້ນດ້ວຍຮູບແບບອາຊິດ amino “PAG” ກໍ່ຖືກເອົາອອກ.Peptides ທີ່​ມີ​ຄວາມ​ຍາວ​ຫຼັງ​ການ​ແປ​ພາ​ສາ​ຫນ້ອຍ​ກ​່​ວາ 3 ອາ​ຊິດ amino ໄດ້​ຖືກ​ເອົາ​ອອກ​ຈາກ​ຫ້ອງ​ສະ​ຫມຸດ​.ສຸດທ້າຍ, ເອົາການຊໍ້າຊ້ອນຢູ່ໃນສະນຸກເກີແຊກແລະກໍານົດຄວາມຖີ່ຂອງແຕ່ລະຊ່ອງສຽບທີ່ເປັນເອກະລັກ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະນີ້ປະກອບມີບັນຊີລາຍຊື່ຂອງລໍາດັບ nucleotide (ແຊກ) ແລະຄວາມຖີ່ (ອ່ານ) ຂອງພວກເຂົາ (ຮູບເສີມ 1c ແລະ 2).
ການແຊກ DNA ຂອງກຸ່ມ N-mer ໂດຍຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງລໍາດັບ: ເພື່ອລົບລ້າງຄວາມຜິດພາດການຈັດລໍາດັບ 454/Roche-specific (ເຊັ່ນ: ບັນຫາກັບການຈັດລໍາດັບ homopolymer extensions) ແລະເອົາການຊ້ໍາຊ້ອນທີ່ສໍາຄັນຫນ້ອຍ, ການກັ່ນຕອງກ່ອນຫນ້ານີ້ N-mer DNA ລໍາດັບ inserts (ໃສ່) ຖືກຈັດຮຽງຕາມຄວາມຄ້າຍຄືກັນ.insertions (ສູງສຸດ 2 ພື້ນຖານທີ່ບໍ່ກົງກັນໄດ້ອະນຸຍາດໃຫ້) ໂດຍໃຊ້ສູດການຄິດໄລ່ຊ້ໍາຊ້ອນທີ່ກໍານົດດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ການແຊກຊ້ອນແມ່ນຈັດຮຽງທໍາອິດໂດຍຄວາມຖີ່ຂອງມັນ (ສູງສຸດຫາຕ່ໍາສຸດ), ແລະຖ້າພວກມັນຄືກັນ, ໂດຍການຈັດລຽງຂັ້ນສອງໂດຍຄວາມຍາວ (ຍາວທີ່ສຸດຫາສັ້ນທີ່ສຸດ).ດັ່ງນັ້ນ, ການໃສ່ເລື້ອຍໆແລະຍາວທີ່ສຸດກໍານົດ "ກຸ່ມ" ທໍາອິດ.ຄວາມຖີ່ຂອງກຸ່ມຖືກຕັ້ງເປັນຄວາມຖີ່ຫຼັກ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແຕ່ລະແຊກທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ໃນບັນຊີລາຍຊື່ທີ່ຖືກຈັດຮຽງໄດ້ຖືກພະຍາຍາມເພີ່ມເຂົ້າໃນກຸ່ມໂດຍການວາງຄູ່ Needleman-Wunsch.ຖ້າຈໍານວນຂອງການບໍ່ກົງກັນ, ການແຊກ, ຫຼືການລົບໃນການຈັດຕໍາແຫນ່ງບໍ່ເກີນ 2, ການແຊກໃສ່ເຂົ້າໄປໃນກຸ່ມ, ແລະຄວາມຖີ່ຂອງກຸ່ມໂດຍລວມແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນໂດຍຄວາມຖີ່ຂອງການແຊກໃສ່.ແຊກທີ່ເພີ່ມໃສ່ກຸ່ມຖືກໝາຍວ່າຖືກໃຊ້ ແລະຖືກຍົກເວັ້ນຈາກການປະມວນຜົນຕໍ່ໄປ.ຖ້າລໍາດັບການແຊກໃສ່ບໍ່ສາມາດຖືກເພີ່ມໃສ່ກຸ່ມທີ່ມີຢູ່ແລ້ວ, ລໍາດັບການແຊກແມ່ນຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງກຸ່ມໃຫມ່ທີ່ມີຄວາມຖີ່ຂອງການແຊກທີ່ເຫມາະສົມແລະຫມາຍເປັນການນໍາໃຊ້.ການຊໍ້າຄືນຈະສິ້ນສຸດເມື່ອແຕ່ລະລໍາດັບການແຊກໃສ່ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງກຸ່ມໃຫມ່ ຫຼືສາມາດລວມຢູ່ໃນກຸ່ມທີ່ມີຢູ່ແລ້ວ.ຫຼັງຈາກທີ່ທັງຫມົດ, ເມັດທີ່ເປັນກຸ່ມປະກອບດ້ວຍ nucleotides ໃນທີ່ສຸດກໍຖືກແປເປັນລໍາດັບ peptide (ຫ້ອງສະຫມຸດ peptide).ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະນີ້ແມ່ນຊຸດຂອງ insertions ແລະຄວາມຖີ່ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງພວກມັນເຊິ່ງປະກອບເປັນຈໍານວນການອ່ານຕິດຕໍ່ກັນ (ຕື່ມ Fig. 2).
ການສ້າງ Motif: ອີງໃສ່ບັນຊີລາຍຊື່ຂອງ peptides ເປັນເອກະລັກ, ຫ້ອງສະຫມຸດໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນທີ່ປະກອບດ້ວຍຮູບແບບອາຊິດ amino ທີ່ເປັນໄປໄດ້ທັງຫມົດ (aa) ດັ່ງທີ່ສະແດງຂ້າງລຸ່ມນີ້.ແຕ່ລະຮູບແບບທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງຄວາມຍາວ 3 ໄດ້ຖືກສະກັດອອກຈາກ peptide ແລະຮູບແບບ inverse ຂອງມັນຖືກເພີ່ມພ້ອມກັບຫ້ອງສະຫມຸດ motif ທົ່ວໄປທີ່ມີຮູບແບບທັງຫມົດ (tripeptides).ຫ້ອງສະຫມຸດຂອງ motifs ຊ້ໍາຊ້ອນຫຼາຍໄດ້ຖືກຈັດລໍາດັບແລະຊ້ໍາຊ້ອນ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສໍາລັບແຕ່ລະ tripeptide ໃນຫ້ອງສະຫມຸດ motif, ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງການປະກົດຕົວຂອງມັນຢູ່ໃນຫ້ອງສະຫມຸດໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືການຄິດໄລ່.ໃນກໍລະນີນີ້, ຄວາມຖີ່ຂອງ peptide ທີ່ມີ tripeptide motif ທີ່ພົບເຫັນແມ່ນໄດ້ຖືກເພີ່ມແລະມອບຫມາຍໃຫ້ motif ໃນຫ້ອງສະຫມຸດ motif ("ຈໍານວນຂອງ motifs").ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການສ້າງ motif ແມ່ນ array ສອງມິຕິລະດັບທີ່ປະກອບດ້ວຍການປະກົດຕົວທັງຫມົດຂອງ tripeptides (motifs) ແລະຄ່າຂອງພວກມັນ, ເຊິ່ງເປັນຈໍານວນການອ່ານລໍາດັບທີ່ສົ່ງຜົນໃຫ້ motif ທີ່ສອດຄ້ອງກັນໃນເວລາທີ່ການອ່ານຖືກກັ່ນຕອງ, ຈັດກຸ່ມ, ແລະແປ.Metrics ດັ່ງທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນລາຍລະອຽດຂ້າງເທິງ.
Normalization ຂອງຈໍານວນຂອງ motifs ແລະ scatterplots ທີ່ສອດຄ້ອງກັນ: ຈໍານວນຂອງ motifs ສໍາລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງແມ່ນ normalized ການນໍາໃຊ້.
ບ່ອນທີ່ ni ແມ່ນຈໍານວນການອ່ານທີ່ມີຫົວຂໍ້ i.ດັ່ງນັ້ນ, vi ສະແດງເຖິງຄວາມຖີ່ສ່ວນຮ້ອຍຂອງການອ່ານ (ຫຼື peptides) ທີ່ມີ motif i ໃນຕົວຢ່າງ.P-values ​​ສໍາລັບຈໍານວນ motifs ທີ່ບໍ່ແມ່ນປົກກະຕິໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບທີ່ແນ່ນອນຂອງ Fisher.ກ່ຽວກັບ correlograms ຂອງຈໍານວນຂອງແຮງຈູງໃຈ, ການພົວພັນຂອງ Spearman ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ຕົວເລກປົກກະຕິຂອງແຮງຈູງໃຈທີ່ມີ R.
ເພື່ອເບິ່ງເນື້ອໃນຂອງອາຊິດ amino ໃນແຕ່ລະຕໍາແຫນ່ງໃນຫ້ອງສະຫມຸດ peptide, web logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນ.ຫນ້າທໍາອິດ, ເນື້ອໃນຂອງອາຊິດ amino ໃນແຕ່ລະຕໍາແຫນ່ງຂອງ peptide 12-mer ຖືກເກັບໄວ້ໃນ 20 × 12 matrix.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຊຸດຂອງ 1000 peptides ທີ່ມີເນື້ອໃນອາຊິດ amino ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັນໃນແຕ່ລະຕໍາແຫນ່ງແມ່ນຖືກສ້າງຂຶ້ນໃນຮູບແບບ fasta-sequence ແລະສະຫນອງໃຫ້ເປັນການປ້ອນກັບ web-logo 3, ເຊິ່ງສ້າງການສະແດງຮູບພາບຂອງເນື້ອໃນອາຊິດ amino ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໃນແຕ່ລະຕໍາແຫນ່ງ.ສໍາລັບຫ້ອງສະຫມຸດ peptide ທີ່ໃຫ້.ເພື່ອສ້າງຮູບພາບຊຸດຂໍ້ມູນຫຼາຍມິຕິ, ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືທີ່ພັດທະນາພາຍໃນໃນ R (biosHeatmap, ຊຸດ R ທີ່ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ປ່ອຍອອກມາ).dendrograms ທີ່ນໍາສະເຫນີໃນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ວິທີການຈັດກຸ່ມຕາມລໍາດັບຂອງ Ward ດ້ວຍການວັດແທກໄລຍະທາງ Euclidean.ສໍາລັບການວິເຄາະສະຖິຕິຂອງຂໍ້ມູນການໃຫ້ຄະແນນ motif, ຄ່າ P ສໍາລັບການໃຫ້ຄະແນນທີ່ບໍ່ປົກກະຕິໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບທີ່ແນ່ນອນຂອງ Fisher.P-values ​​ສໍາລັບຊຸດຂໍ້ມູນອື່ນໆໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໃນ R ໂດຍໃຊ້ t-test ຂອງນັກຮຽນຫຼື ANOVA.
ການຄັດເລືອກ phage clones ແລະ phages ໂດຍບໍ່ມີການ inserts ແມ່ນ intravenously ຜ່ານເສັ້ນກ່າງຫາງ (2 × 1010 phages / ສັດໃນ 300 μl PBS).ສິບນາທີກ່ອນທີ່ຈະ perfusion ແລະການສ້ອມແຊມຕໍ່ມາ, ສັດດຽວກັນໄດ້ຖືກສັກຢາ intravenously ດ້ວຍ 100 μlຂອງ DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 ນາທີຫຼັງຈາກການສັກຢາ phage, ຫນູໄດ້ຖືກ perfuse ຜ່ານຫົວໃຈດ້ວຍ 50 ml PBS ຕິດຕາມດ້ວຍ 50 ml 4% PFA / PBS.ຕົວຢ່າງຂອງສະຫມອງໄດ້ຖືກແກ້ໄຂເພີ່ມເຕີມໃນຄືນໃນ 4% PFA / PBS ແລະແຊ່ນ້ໍາ 30% sucrose ຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C.ຕົວຢ່າງແມ່ນ frozen flash ໃນປະສົມ OCT.ການວິເຄາະທາງພູມຄຸ້ມກັນທາງເຄມີຂອງຕົວຢ່າງແຊ່ແຂງໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນ 30 µm cryosections ສະກັດດ້ວຍ 1% BSA ແລະ incubated ກັບ polyclonal FITC-labeled antibodies ຕ້ານ T7 phage (Novus NB 600-376A) ຢູ່ທີ່ 4 ° C.ອົບຄ້າງຄືນ.ສຸດທ້າຍ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ PBS ແລະກວດເບິ່ງດ້ວຍກ້ອງຈຸລະທັດເລເຊີ confocal (Leica TCS SP5).
peptides ທັງຫມົດທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດຕ່ໍາສຸດຂອງ 98% ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍ GenScript USA, biotinylated ແລະ lyophilized.Biotin ຖືກຜູກມັດໂດຍຜ່ານຊ່ອງຫວ່າງ glycine triple ເພີ່ມເຕີມຢູ່ທີ່ N-terminus.ກວດເບິ່ງ peptides ທັງຫມົດໂດຍໃຊ້ spectrometry ມະຫາຊົນ.
Streptavidin (Sigma S0677) ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ 5 ເທົ່າ equimolar ເກີນຂອງ peptide biotinylated, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, ຫຼືປະສົມປະສານ (3:1 ອັດຕາສ່ວນ) ຂອງ biotinylated BACE1 peptide inhibitory peptide ແລະ BACE1 inhibitory peptide ໃນ 5–10% DMSO/.BS incubated ໃນ Peptide.1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງກ່ອນທີ່ຈະສີດ.Streptavidin-conjugated peptides ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າທາງເສັ້ນເລືອດໃນປະລິມານ 10 mg/kg ເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນກ່າງຫາງຂອງໜູອັນໜຶ່ງທີ່ມີຊ່ອງຄອດສະໝອງ.
ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ streptavidin-peptide ໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍ ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) ຖືກເຄືອບຄືນທີ່ 4°C ດ້ວຍ 1.5 μg/ml ພູມຕ້ານທານຕ້ານ streptavidin ຂອງຫນູ (Thermo, MA1-20011).ຫຼັງຈາກສະກັດ (buffer ຕັນ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 2 ຊົ່ວໂມງ, ລ້າງແຜ່ນດ້ວຍ 0.05% Tween-20 / PBS (ລ້າງ buffer) ສໍາລັບ 3 ທີສອງ plalute blocks ນ້ໍາດີ, CSF sma 1:10,000, CSF 1:115).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແຜ່ນໄດ້ຖືກ incubated ຄືນທີ່ 4 ° C ດ້ວຍພູມຕ້ານທານກວດພົບ (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).ຫຼັງຈາກສາມຂັ້ນຕອນການລ້າງ, streptavidin ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍການ incubation ໃນ TMB substrate solution (Roche) ສໍາລັບເຖິງ 20 ນາທີ.ຫຼັງຈາກຢຸດການພັດທະນາສີດ້ວຍ 1M H2SO4, ວັດແທກການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 450 nm.
ການເຮັດວຽກຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ inhibitor streptavidin-peptide-BACE1 ໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍ Aβ(1-40) ELISA ຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ (Wako, 294-64701).ໂດຍຫຍໍ້, ຕົວຢ່າງ CSF ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງໃນສານເຈືອປົນມາດຕະຖານ (1:23) ແລະ incubated ຄືນທີ່ 4 ° C ໃນແຜ່ນ 96 ດີທີ່ເຄືອບດ້ວຍ BNT77 ພູມຕ້ານທານການຈັບ.ຫຼັງຈາກການລ້າງຫ້າຂັ້ນຕອນ, HRP-conjugated BA27 antibody ໄດ້ຖືກເພີ່ມແລະ incubated ສໍາລັບ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ 4 ° C., ປະຕິບັດຕາມຫ້າຂັ້ນຕອນການລ້າງ.Aβ(1–40) ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍການ incubation ໃນການແກ້ໄຂ TMB ສໍາລັບ 30 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກການພັດທະນາສີໄດ້ຖືກຢຸດເຊົາດ້ວຍການແກ້ໄຂຢຸດ, ວັດແທກການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 450 nm.ຕົວຢ່າງ plasma ໄດ້ຮັບການສະກັດເອົາໄລຍະແຂງກ່ອນ Aβ(1-40) ELISA.Plasma ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ 0.2% DEA (Sigma) ໃນແຜ່ນ 96 ດີແລະ incubated ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 30 ນາທີ.ຫຼັງຈາກລ້າງແຜ່ນ SPE ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ (Oasis, 186000679) ດ້ວຍນ້ໍາແລະ 100% methanol, ຕົວຢ່າງ plasma ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ແຜ່ນ SPE ແລະຂອງແຫຼວທັງຫມົດຖືກເອົາອອກ.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກລ້າງ (ທໍາອິດດ້ວຍ 5% methanol ຫຼັງຈາກນັ້ນ 30% methanol) ແລະ eluted ດ້ວຍ 2% NH4OH / 90% methanol.ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ eluate ແຫ້ງຢູ່ທີ່ 55 ° C ເປັນເວລາ 99 ນາທີທີ່ປະຈຸບັນ N2 ຄົງທີ່, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງໃນສານເຈືອຈາງມາດຕະຖານແລະ Aβ(1-40) ໄດ້ຖືກວັດແທກຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.
ວິທີການອ້າງເຖິງບົດຄວາມນີ້: Urich, E. et al.ການຈັດສົ່ງສິນຄ້າໄປສູ່ສະຫມອງໂດຍໃຊ້ peptides ການຂົນສົ່ງທີ່ລະບຸໄວ້ໃນ vivo.ວິທະຍາສາດ.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ແລະ Moos T. ການຈັດສົ່ງຢາ macromolecular ໄປສູ່ສະຫມອງໂດຍໃຊ້ການປິ່ນປົວດ້ວຍເປົ້າຫມາຍ.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ແລະ Martinez-Martinez, P. ການຈັດສົ່ງຢາ peptide ແລະທາດໂປຼຕີນໃນທົ່ວອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM ອຸປະສັກທາງເລືອດ-ສະໝອງ: ເປັນຂວດໃນການພັດທະນາຢາໃນສະໝອງ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ແລະ Byrd, A. ຄວາມສົດໃສດ້ານສໍາລັບການປັບປຸງການຈັດສົ່ງຢາແລະການກໍານົດເປົ້າຫມາຍໄປສູ່ສະຫມອງໂດຍຜ່ານເສັ້ນທາງ choroid plexus-CSF.ການຄົ້ນຄວ້າຢາ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernization ຂອງ biopharmaceuticals ກັບ molecular ມ້າ Trojan ສໍາລັບການຈັດສົ່ງສະຫມອງ.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide ການຂົນສົ່ງຂ້າມອຸປະສັກເລືອດສະຫມອງ.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.ເພີ່ມທະວີການເຈາະຂອງສະຫມອງແລະປະສິດທິພາບຂອງພູມຕ້ານທານການປິ່ນປົວການນໍາໃຊ້ shuttles ໂມເລກຸນ monovalent.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.ການຂົນສົ່ງຂອງ Transferrin receptor (TfR) ກໍານົດການດູດຊຶມຂອງສະຫມອງຂອງຕົວແປຄວາມສຳພັນຂອງພູມຕ້ານທານ TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).