ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​. ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ. ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ສະແດງຮູບວົງມົນຂອງສາມສະໄລ້ພ້ອມກັນ. ໃຊ້ປຸ່ມກ່ອນໜ້າ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສາມສະໄລ້ຕໍ່ຄັ້ງ, ຫຼືໃຊ້ປຸ່ມເລື່ອນຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສາມສະໄລ້ຕໍ່ຄັ້ງ.
ອົງການຈັດຕັ້ງທາງ neural ປະກອບດ້ວຍຕົນເອງເປັນຕົວແທນຂອງແພລະຕະຟອມໃນ vitro ທີ່ດີສໍາລັບການສ້າງແບບຈໍາລອງການພັດທະນາຂອງມະນຸດແລະພະຍາດ. ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, organoids ຂາດການເຊື່ອມຕໍ່ທີ່ມີຢູ່ໃນ vivo, ເຊິ່ງຈໍາກັດການເຕີບໃຫຍ່ແລະປ້ອງກັນການເຊື່ອມໂຍງກັບວົງຈອນອື່ນໆທີ່ຄວບຄຸມພຶດຕິກໍາ. ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ organoids cortical ທີ່ມາຈາກຈຸລັງລໍາຕົ້ນຂອງມະນຸດທີ່ transplanted ເຂົ້າໄປໃນ cortex somatosensory ຂອງຫນູ nude ໃນເດັກເກີດໃຫມ່ພັດທະນາປະເພດຈຸລັງທີ່ແກ່ທີ່ປະສົມປະສານເຂົ້າໄປໃນວົງຈອນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຮູ້ສຶກແລະແຮງຈູງໃຈ. MRI ເປີດເຜີຍການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ organoid ຫລັງການຖ່າຍທອດໃນສາຍຈຸລັງລໍາຕົ້ນແລະສັດຈໍານວນຫນຶ່ງ, ໃນຂະນະທີ່ການວິເຄາະຫຼັກດຽວໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມຄືບຫນ້າຂອງ corticogenesis ແລະການປະກົດຕົວຂອງກິດຈະກໍາການຖ່າຍທອດໂຄງການ. ແທ້ຈິງແລ້ວ, neurons cortical transplanted ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄຸນສົມບັດທາງ morphological, synaptic, ແລະເຍື່ອພາຍໃນທີ່ສະລັບສັບຊ້ອນຫຼາຍກ່ວາຄູ່ຮ່ວມງານໃນ vitro, ອະນຸຍາດໃຫ້ກວດພົບຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ neuronal ໃນຄົນເຈັບທີ່ເປັນໂຣກ Timothy. ການຕິດຕາມທາງກາຍະສາດແລະການເຮັດວຽກໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ organelles ທີ່ປູກແລ້ວໄດ້ຮັບການປ້ອນຂໍ້ມູນ thalamocortical ແລະ corticocortical, ແລະໃນການບັນທຶກການເຄື່ອນໄຫວທາງປະສາດໃນ vivo ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າວັດສະດຸປ້ອນເຫຼົ່ານີ້ສາມາດສ້າງການຕອບສະຫນອງທາງດ້ານຄວາມຮູ້ສຶກໃນຈຸລັງຂອງມະນຸດ. ສຸດທ້າຍ, organoids cortical ຂະຫຍາຍ axons ໃນທົ່ວສະຫມອງຂອງຫນູ, ແລະການກະຕຸ້ນ optogenetic ຂອງເຂົາເຈົ້ານໍາໄປສູ່ພຶດຕິກໍາການຊອກຫາລາງວັນ. ດັ່ງນັ້ນ, transplanted neurons cortex ຂອງມະນຸດແກ່ແລ້ວແລະມີສ່ວນຮ່ວມໃນວົງຈອນຂອງເຈົ້າພາບທີ່ຄວບຄຸມພຶດຕິກໍາ. ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າວິທີການນີ້ຈະສ້າງຄວາມສະດວກໃນການກວດຫາ phenotypes ລະດັບ strand ໃນຈຸລັງທີ່ມາຈາກຄົນເຈັບທີ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ໂດຍວິທີອື່ນ.
ສະຫມອງຂອງມະນຸດທີ່ກໍາລັງພັດທະນາແມ່ນຂະບວນການຈັດຕັ້ງຕົນເອງທີ່ໂດດເດັ່ນທີ່ຈຸລັງຈະເລີນເຕີບໂຕ, ແຍກຄວາມແຕກຕ່າງ, ເຄື່ອນຍ້າຍ, ແລະເຊື່ອມຕໍ່ໄປສູ່ວົງຈອນ neuronal ທີ່ເປັນປະໂຫຍດທີ່ປັບປຸງໃຫມ່ໂດຍຜ່ານປະສົບການທາງດ້ານຄວາມຮູ້ສຶກ. ບັນຫາທີ່ສໍາຄັນໃນການເຂົ້າໃຈການພັດທະນາສະຫມອງຂອງມະນຸດ, ໂດຍສະເພາະໃນສະພາບການຂອງພະຍາດ, ແມ່ນການຂາດການເຂົ້າເຖິງເນື້ອເຍື່ອສະຫມອງ. ອົງການຈັດຕັ້ງຂອງຕົນເອງ, ລວມທັງ cortex organoids ຂອງມະນຸດ (hCO; ຍັງເອີ້ນວ່າ cortex sphere ຂອງມະນຸດ), ສາມາດສ້າງ 2,3,4,5,6. ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຂອບເຂດຈໍາກັດຈໍານວນຫນຶ່ງຈໍາກັດການນໍາໃຊ້ກວ້າງຂອງພວກເຂົາເພື່ອເຂົ້າໃຈການພັດທະນາແລະການເຮັດວຽກຂອງວົງຈອນ neural. ໂດຍສະເພາະ, ມັນບໍ່ຈະແຈ້ງວ່າການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງ hCO ແມ່ນຖືກຈໍາກັດໂດຍການຂາດສະພາບແວດລ້ອມ microenmental ແລະ sensory ບາງຢ່າງທີ່ມີຢູ່ໃນ vivo. ນອກຈາກນັ້ນ, ເນື່ອງຈາກວ່າ hCOs ບໍ່ໄດ້ຖືກປະສົມປະສານເຂົ້າໃນວົງຈອນທີ່ສາມາດສ້າງຜົນໄດ້ຮັບທາງດ້ານພຶດຕິກໍາ, ຜົນປະໂຫຍດຂອງພວກເຂົາໃນການສ້າງແບບຈໍາລອງຄວາມຜິດປົກກະຕິທາງພັນທຸກໍາແລະພຶດຕິກໍາທາງດ້ານ neuropsychiatric ແມ່ນຈໍາກັດ.
ການປູກຖ່າຍ hCO ເຂົ້າໄປໃນສະຫມອງທີ່ມີຊີວິດຢູ່ intact ສາມາດເອົາຊະນະຂໍ້ຈໍາກັດເຫຼົ່ານີ້. ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ neurons ຂອງມະນຸດ transplanted ເຂົ້າໄປໃນ cortex ຂອງຫນູສາມາດຢູ່ລອດ, ໂຄງການ, ແລະຕິດຕໍ່ສື່ສານກັບຈຸລັງຈໍາພວກຫນູ7,8,9,10,11,12. ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນປະຕິບັດຢູ່ໃນສັດຜູ້ໃຫຍ່, ເຊິ່ງອາດຈະຈໍາກັດການລວມຕົວຂອງ synaptic ແລະ axonal. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາອະທິບາຍເຖິງຮູບແບບການປູກຖ່າຍທີ່ພວກເຮົາໄດ້ປູກ 3D hCO ທີ່ມາຈາກຈຸລັງ hiPS ເຂົ້າໄປໃນ cortex somatosensory ປະຖົມ (S1) ຂອງຫນູທີ່ມີພູມຕ້ານທານຢູ່ໃນຂັ້ນຕອນຕົ້ນຂອງການພັດທະນາພາດສະຕິກ. ຈຸລັງ neurons hCO (t-hCO) ຜ່ານການເຕີບໃຫຍ່ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ໄດ້ຮັບວັດສະດຸປ້ອນ thalamocortical ແລະ cortical-cortical ທີ່ກະຕຸ້ນການຕອບສະຫນອງທາງດ້ານຄວາມຮູ້ສຶກ, ແລະຂະຫຍາຍການຄາດຄະເນ axonal ເຂົ້າໄປໃນສະຫມອງຫນູເພື່ອຂັບລົດພຶດຕິກໍາການຊອກຫາລາງວັນ. ການຂະຫຍາຍໃຫຍ່ເຕັມຕົວຂອງ t-hCO ໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມບົກຜ່ອງດ້ານ neuronal ໃນຄົນເຈັບທີ່ມີໂຣກ Timothy (TS), ຄວາມຜິດປົກກະຕິທາງພັນທຸກໍາທີ່ຮຸນແຮງທີ່ເກີດຈາກການກາຍພັນໃນຊ່ອງແຄນແຄຊຽມ L-type CaV1.2 (ເຂົ້າລະຫັດໂດຍ CACNA1C).
ເພື່ອສຶກສາ neurons cortical ຂອງມະນຸດໃນວົງຈອນໃນ vivo, ພວກເຮົາ stereotactically transplanted intact 3D hCO ເຂົ້າໄປໃນ S1 ຂອງຫນູ athymic postnatal ຕົ້ນ (ມື້ 3-7 postnatally) (ຮູບ 1a ແລະຂະຫຍາຍຂໍ້ມູນຂອງ Fig. 1a-c). ໃນຈຸດນີ້, ການຄາດຄະເນ axonal thalamocortical ແລະ corticocortical ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ສໍາເລັດ S1 innervation ຂອງເຂົາເຈົ້າ (ອ້າງອີງ 13). ດັ່ງນັ້ນ, ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກອອກແບບເພື່ອເພີ່ມປະສິດທິພາບການເຊື່ອມໂຍງ t-hCO ໃນຂະນະທີ່ຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຕໍ່ວົງຈອນ endogenous. ເພື່ອເບິ່ງສະຖານທີ່ຂອງ t-hCO ໃນສັດທີ່ມີຊີວິດ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການຟື້ນຟູສະຫມອງ MRI ທີ່ມີນ້ໍາຫນັກ T2 ຂອງຫນູ 2-3 ເດືອນຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ (ຮູບ 1b ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 1d). t-hCO ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢ່າງງ່າຍດາຍແລະການວັດແທກປະລິມານຂອງ t-hCO ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຄໍານວນຈາກເມັດຄົງທີ່ (Extended Data Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢ່າງງ່າຍດາຍແລະການວັດແທກປະລິມານຂອງ t-hCO ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຄໍານວນຈາກເມັດຄົງທີ່ (Extended Data Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированшных среннованшных данные, рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໄດ້ງ່າຍ, ແລະການວັດແທກ volumetric t-hCO ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບການຄິດໄລ່ສໍາລັບພາກສ່ວນຄົງທີ່ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 1d, e; P > 0.05).很内易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（找式相伕） 0.05).很内易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированновых сраез данные, рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໄດ້ງ່າຍ, ແລະການວັດແທກ volumetric t-hCO ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບການຄິດໄລ່ສໍາລັບພາກສ່ວນຄົງທີ່ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 1d, e; P > 0.05).ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດ t-hCO ໃນ 81% ຂອງສັດທີ່ປູກແລ້ວປະມານ 2 ເດືອນຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ (n = 72 ສັດ; hCO ຈາກ 10 hiPS cell line; hiPS cell line ໃນຕາຕະລາງເສີມ 1). ໃນນັ້ນ, 87% ແມ່ນຕັ້ງຢູ່ໃນ cerebral cortex (ຮູບ 1c). ໂດຍການປະຕິບັດການສະແກນ MRI serial ໃນຈຸດເວລາຫຼາຍຄັ້ງໃນຫນູດຽວກັນ, ພວກເຮົາພົບເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງປະລິມານ t-hCO ເກົ້າເທົ່າພາຍໃນ 3 ເດືອນ (ຮູບ 1d ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 1f). ສັດທີ່ນຳມາປູກແລ້ວມີອັດຕາການລອດຕາຍສູງ (74%) ໃນເວລາ 12 ເດືອນຫຼັງການປູກຖ່າຍ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 1g ແລະ ຕາຕະລາງເສີມ 2), ແລະບໍ່ພົບຄວາມບົກຜ່ອງດ້ານການເຄື່ອນທີ່ ຫຼື ຄວາມຈຳ, gliosis, ຫຼື electroencephalogram (EEG). ຂໍ້ມູນຮູບ 1g ແລະຕາຕະລາງເສີມ 2). 1h–m ແລະ 3e).
a, ໂຄງຮ່າງຂອງການອອກແບບທົດລອງ. hCO ທີ່ມາຈາກຈຸລັງ hiPS ໄດ້ຖືກຖ່າຍທອດເຂົ້າໄປໃນ S1 ຂອງຫນູ nude ເກີດໃຫມ່ໃນມື້ 30-60 ຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ. b, ຮູບພາບ MRI ທີ່ມີນ້ຳໜັກ T2 ແລະແນວນອນສະແດງໃຫ້ເຫັນ t-hCO ໃນ S1 2 ເດືອນຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ. ແຖບຂະຫນາດ, 2 ມມ. c, ປະລິມານຂອງອັດຕາຄວາມສໍາເລັດຂອງ engraftment ສະແດງໃຫ້ເຫັນສໍາລັບແຕ່ລະສາຍເຊນ hiPS (n = 108, ຕົວເລກພາຍໃນແຖບຊີ້ບອກຈໍານວນ t-hCO ຕໍ່ເສັ້ນຈຸລັງ hIPS) ແລະສະຖານທີ່ cortical ຫຼື subcortical (n = 88). d, ຮູບພາບ MRI ຂອງເສັ້ນເລືອດແດງ coronary (ຊ້າຍ; ແຖບຂະຫນາດ, 3 ມມ) ແລະ 3D volumetric reconstruction (ແຖບຂະຫນາດ, 3 ມມ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ t-hCO ໃນໄລຍະ 3 ເດືອນ. e, ການທົບທວນຄືນຮູບແບບ t-hCO ໃນ rat cerebral cortex. ແຖບຂະຫນາດ, 1 ມມ. f, ຮູບພາບ immunocytochemical ຕົວແທນຂອງ t-hCO ສະແດງໃຫ້ເຫັນຈາກເທິງຊ້າຍຫາຂວາ (ໃນລະຫວ່າງຄວາມແຕກຕ່າງ): PPP1R17 (4 ເດືອນ), NeuN (8 ເດືອນ), SOX9 ແລະ GFAP (8 ເດືອນ), PDGFRα; (8 ເດືອນ), MAP2 (8 ເດືອນ) ແລະ IBA1 (8 ເດືອນ). ແຖບຂະຫນາດ, 20 µm. ການສະແດງອອກຮ່ວມກັນຂອງ HNA ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຈຸລັງຂອງຕົ້ນກໍາເນີດຂອງມະນຸດ. g, snRNA-seq: ການຖ່າຍຮູບການຫຼຸດຜ່ອນມິຕິພາບ manifold ແລະການຄາດຄະເນ (UMAP) ຂອງ nuclei t-hCO ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງທັງຫມົດຫຼັງຈາກການເຊື່ອມໂຍງກັບ Seurat (n = 3 ຕົວຢ່າງ t-hCO, n = 2 hiPS cell cells). Astrocytes, ຈຸລັງຂອງເສັ້ນ astrocyte; cyc prog, circulating progenitors; GluN DL, neurons glutamatergic ເລິກ; GluN DL/SP, ເສັ້ນປະສາດ glutamatergic ເລິກແລະ sublamellar; GluN UL, ຊັ້ນເທິງຂອງ neurons glutamatergic; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, ຈຸລັງ progenitor oligodendrocyte; RELN, neurons reelin. h, Gene Ontology (GO) ການວິເຄາະການຂະຫຍາຍພັນທຸກໍາຂອງ genes ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ປັບ P < 0.05, ການປ່ຽນແປງ fold> 2, ສະແດງອອກຢ່າງຫນ້ອຍ 10% ຂອງ nuclei) ໃນ t-hCO glutamatergic neurons ເມື່ອທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons. h, Gene Ontology (GO) ການວິເຄາະການຂະຫຍາຍພັນທຸກໍາຂອງ genes ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ປັບ P < 0.05, ການປ່ຽນແປງ fold> 2, ສະແດງອອກຢ່າງຫນ້ອຍ 10% ຂອງ nuclei) ໃນ t-hCO glutamatergic neurons ເມື່ອທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, скорректированный P <0,05, скорректированный P <0,05, 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глусага нейронами hCO. h, ການວິເຄາະຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງ Gene Ontology (GO) ສໍາລັບ genes ທີ່ມີການກະຕຸ້ນທີ່ສໍາຄັນ (ປັບ P<0.05, ການປ່ຽນແປງເທົ່າຕົວ>2, ການສະແດງອອກຢ່າງຫນ້ອຍ 10% nuclei) ໃນ t-hCO glutamatergic neurons ເມື່ອທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <化> 0.0. 2，在至少10%的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h，与 hco 谷氨酸能元相比，t-hco 谷氨酸能神经元基因显着 上调（后变化 5 > . 2 ，至少 10% 的 核中表达）基因基因基因的 的 的 的 核中表达）基因基因基因的 的 的 核中 的 本体论(這子 本体论(限子)。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессирует 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO гинтолол термина обогащения. h, genes ໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ປັບ P < 0.05, ການປ່ຽນແປງເທົ່າຕົວ> 2, ສະແດງອອກຢ່າງຫນ້ອຍ 10% ຂອງ nuclei) ໃນ t-hCO glutamatergic neurons ເມື່ອທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) ການວິເຄາະຂອງໄລຍະການເສີມ.ເສັ້ນຈຸດຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄ່າ aq ຂອງ 0.05. i, ການຖ່າຍຮູບ UMAP ຂອງປະເພດເຊນ GluN ໃນ t-hCO ໂດຍໃຊ້ການໂອນປ້າຍຈາກຊຸດຂໍ້ມູນ 22 snRNA-seq ມໍເຕີ cortex ຜູ້ໃຫຍ່. CT — ຈຸລັງ corticothalamic, ET — ຈຸລັງ extracerebral, IT — ຈຸລັງ telencephalic ພາຍໃນ, NP — ໃກ້ກັບການຄາດຄະເນ.
ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ປະເມີນ cytoarchitecture ແລະອົງປະກອບ cellular ໂດຍລວມຂອງ t-hCO. Antibody staining ຂອງຈຸລັງ endothelial ຫນູໄດ້ເປີດເຜີຍ vascularization ກັບ t-hCO, ໃນຂະນະທີ່ staining IBA1 ເປີດເຜີຍການປະກົດຕົວຂອງ microglia ຫນູໃນທົ່ວ graft (ຮູບ 1f ແລະຂະຫຍາຍຂໍ້ມູນ, Fig. 3c,d). ການສ້າງພູມຄຸ້ມກັນໄດ້ເປີດເຜີຍພູມຕ້ານທານນິວເຄລຍຂອງມະນຸດ (HNA) ຈຸລັງບວກທີ່ຮ່ວມສະແດງ PPP1R17 (progenitors cortical), NeuN (neurons), SOX9 ແລະ GFAP (ຈຸລັງ glial-derived) ຫຼື PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (ຮູບ 1f). ເພື່ອສຶກສາອົງປະກອບຂອງເຊນລູລາຂອງ t-hCO ໃນຄວາມລະອຽດເຊນດຽວ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການຈັດລໍາດັບ RNA ຫຼັກດຽວ (snRNA-seq) ຫຼັງຈາກປະມານ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ. ການກັ່ນກອງ ແລະ ການກຳຈັດນິວເຄຍຂອງໜູເປັນຈຳນວນຫຼາຍໄດ້ໃຫ້ຜົນໄດ້ຮັບ 21,500 ແຜນທີ່ mononuclear ຂອງມະນຸດທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງ (ຮູບ 1g ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 4a,b). ຮູບແບບການສະແດງອອກຂອງເຄື່ອງໝາຍປະເພດເຊລແບບປົກກະຕິໄດ້ລະບຸກຸ່ມຂອງຈຸລັງ cortical ທີ່ສໍາຄັນ, ລວມທັງ neurons glutamatergic ເລິກແລະ superficial, circulating progenitors, oligodendrocytes, ແລະເຊື້ອສາຍ astrocyte (ຮູບ 1g, ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 4c, ແລະຕາຕະລາງເສີມ 3). Immunostaining ສໍາລັບ SATB2 ແລະ CTIP2 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເຖິງວ່າຈະມີການປະກົດຕົວຂອງ subtypes cortical, t-hCO ບໍ່ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງ stratification anatomical ຢ່າງຊັດເຈນ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 3a). stage-matched snRNA-seq hCO ຜະລິດຊັ້ນຈຸລັງທີ່ຄ້າຍຄືກັນຢ່າງກວ້າງຂວາງ, ໂດຍມີຂໍ້ຍົກເວັ້ນເລັກນ້ອຍ, ລວມທັງການບໍ່ມີ oligodendrocytes ແລະການປະກົດຕົວຂອງ neurons GABAergic, ເຊິ່ງອາດຈະສະທ້ອນເຖິງເງື່ອນໄຂທີ່ເອື້ອອໍານວຍໃນ vitro ທີ່ໄດ້ລາຍງານຜ່ານມາສໍາລັບຈຸລັງ progenitor ຂ້າງຂ້າງ 15 (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, Fig. 4f – Table4 ແລະເສີມ). ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງ gene ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສໍາຄັນໃນ neurons glutamatergic ລະຫວ່າງ t-hCO ແລະ hCO (ຕາຕະລາງເສີມ 5), ລວມທັງການກະຕຸ້ນຂອງຊຸດຂອງ genes ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ neuronal ເຊັ່ນ: ສັນຍານ synaptic, dendritic localization, ແລະກິດຈະກໍາຊ່ອງທາງທີ່ມີແຮງດັນ (ຮູບ 1h ແລະຕາຕະລາງເສີມ 5). ຕາຕະລາງ 6). ຕາມນັ້ນແລ້ວ, cortical glutamatergic t-hCO neurons ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ transcriptional ເລັ່ງ.
ເພື່ອອະທິບາຍວ່າການປ່ຽນແປງຂອງ transcriptional ເຫຼົ່ານີ້ຢູ່ໃນ t-hCO ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມແຕກຕ່າງທາງດ້ານ morphological ລະຫວ່າງ hCO ໃນ vitro ແລະ t-hCO ໃນ vivo, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງໃຫມ່ໃນຂັ້ນຕອນທີ່ກົງກັນກັບ hCO ແລະ hCO ໃນພາກສ້ວຍແຫຼມຫຼັງຈາກຄວາມແຕກຕ່າງ 7-8 ເດືອນ. hCO neurons (ຮູບ 2a). t-hCO neurons ມີຂະຫນາດໃຫຍ່ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ມີເສັ້ນຜ່າກາງ soma 1.5 ເທົ່າ, ສອງເທົ່າ dendrites ຫຼາຍ, ແລະການເພີ່ມຂຶ້ນ 6 ເທົ່າຂອງຄວາມຍາວ dendritic ທັງຫມົດເມື່ອທຽບກັບ in vitro hCO (ຮູບ 2b). ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic ທີ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ neurons t-hCO ຫຼາຍກ່ວາ neurons hCO (ຮູບ 2c). ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ neurons t-hCO ດໍາເນີນການຂະຫຍາຍ dendritic ຢ່າງກວ້າງຂວາງແລະການແຕກງ່າ, ເຊິ່ງ, ປະສົມປະສານກັບການຂະຫຍາຍຈຸລັງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ອາດຈະປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນການເຕີບໂຕຢ່າງເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ t-hCO ຫຼັງຈາກ transplantation (ຮູບ 1d ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ Fig. 1f). ນີ້ໄດ້ກະຕຸ້ນໃຫ້ພວກເຮົາສືບສວນຄຸນສົມບັດ electrophysiological. Membrane capacitance ສູງກວ່າແປດເທົ່າ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 8d), ທ່າແຮງຂອງ membrane resting-state ແມ່ນ hyperpolarized ຫຼາຍ (ປະມານ 20 mV), ແລະການສັກຢາໃນປະຈຸບັນ induced ອັດຕາການຕື່ນເຕັ້ນສູງສຸດໃນ neurons t-hCO ຫຼາຍກ່ວາ neurons hCO. in vitro (ຮູບ 2d), e), ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບລັກສະນະ morphological ຂະຫນາດໃຫຍ່ແລະສະລັບສັບຊ້ອນຫຼາຍຂອງ t-hCO. ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມຖີ່ຂອງເຫດການປັດຈຸບັນ spontaneous excitatory postsynaptic (EPSC) ແມ່ນສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ neurons t-hCO (ຮູບ 2f), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic ເພີ່ມຂຶ້ນທີ່ສັງເກດເຫັນໃນ neurons t-hCO ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຕື່ນເຕັ້ນທີ່ເປັນປະໂຫຍດ. synapse ທາງເພດ. ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນລັກສະນະທີ່ຍັງອ່ອນຂອງ hCO neurons ໃນ vitro ໂດຍການບັນທຶກການຕິດສະຫຼາກ neurons glutamatergic (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 6a-c).
a, ການຟື້ນຟູ 3D ຂອງ hCO ທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍ biocytin ແລະ neurons t-hCO ຫຼັງຈາກ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ. b, ປະລິມານຂອງລັກສະນະ morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ແລະ ***P < 0.0001). b, ປະລິມານຂອງລັກສະນະ morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ແລະ ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0***P 7). b, ປະລິມານຂອງລັກສະນະ morphological (n=8 hCO neurons, n=6 t-hCO neurons; **P=0.0084, *P=0.0179, ແລະ ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO神经元，n = 6个t-hCO神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179< 0.0170* 和。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO神经元，n = 6个t-hCO神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179< 0.0170* 和。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0***P 7). b, ປະລິມານຂອງລັກສະນະ morphological (n=8 hCO neurons, n=6 t-hCO neurons; **P=0.0084, *P=0.0179, ແລະ ***P<0.0001).c, 3D reconstruction ຂອງ hCO ແລະ t-hCO dendritic ສາຂາຫຼັງຈາກ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ. ດາວສີແດງຊີ້ບອກເຖິງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic putative. ປະລິມານຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ Dendritic (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0092). d, ປະລິມານຂອງທ່າແຮງຂອງເຍື່ອທີ່ພັກຜ່ອນ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P < 0.0001). d, ປະລິມານຂອງທ່າແຮງຂອງເຍື່ອທີ່ພັກຜ່ອນ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,001). d, resting membrane ປະລິມານທ່າແຮງ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,001). d, resting membrane ປະລິມານທ່າແຮງ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P < 0.0001). e, repetitive action firing ໃນ hCO ແລະ t-hCO induced ໂດຍການເພີ່ມການສັກຢາໃນປະຈຸບັນ, ແລະປະລິມານຂອງອັດຕາການຍິງສູງສຸດ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P < 0.0001). e, repetitive action firing ໃນ hCO ແລະ t-hCO induced ໂດຍການເພີ່ມການສັກຢາໃນປະຈຸບັນ, ແລະປະລິມານຂອງອັດຕາການຍິງສູງສຸດ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количнокамтвеннай скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ການປະຕິບັດທີ່ມີທ່າແຮງ re-firing ໃນ hCO ແລະ t-hCO induced ໂດຍການເພີ່ມຂຶ້ນໃນປະຈຸບັນແລະປະລິມານຂອງອັດຕາການຍິງສູງສຸດ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化 5 (n = 2CO)神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001). E，通过增加电流注入的的 hco 和 t-hco 重复电位放电，以及最大的量化（n = 6 珸 n = 25 珸 n = 25;个 t-hco 神经； *** p <0.0001). e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и кятали максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, repetitive firing ຂອງ hCO ແລະ t-hCO ທ່າແຮງການປະຕິບັດ induced ໂດຍການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງການສະຫນອງໃນປະຈຸບັນແລະປະລິມານຂອງອັດຕາການຍິງສູງສຸດ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P < 0.0001). f, spontaneous EPSCs (sEPSCs) ໃນ hCO ແລະ t-hCO neurons ຢູ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ, ແລະປະລິມານຂອງຄວາມຖີ່ຂອງເຫດການ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P < 0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ໃນ hCO ແລະ t-hCO neurons ຢູ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ, ແລະປະລິມານຄວາມຖີ່ຂອງເຫດການ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количесотвенная очистака очиченка событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs spontaneous (sEPSCs) ໃນ hCO ແລະ t-hCO neurons ໃນ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງແລະປະລິມານຂອງອັດຕາເຫດການ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 neurons t-hCO; *** P<0.0001). f，分化8个月时hCO和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量化， 7 hCO n = 2. t-hCO 神经元；***P < 0.0001). f，分化8个月时hCO和t-hCO神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事事件频率的量匼的 2 率的量匼，n = 2. = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P< 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количесотвенная очистака очиченка событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ໃນ hCO ແລະ t-hCO neurons ຢູ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງແລະປະລິມານຂອງອັດຕາເຫດການ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 neurons t-hCO; *** P<0.0001).ສໍາລັບ bf, hCO ແລະ t-hCO ໃນເສັ້ນ 1208-2 ໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກ batch ຄວາມແຕກຕ່າງດຽວກັນທີ່ຮັກສາຢູ່ໃນຂະຫນານ. g, gene set enrichment analysis (one-sided Fisher's exact test) ຂອງ genes upregulated ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ປັບ P < 0.05, fold change > 2, expressed in at least 10% of nuclei) in t-hCO glutamatergic neurons ທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons ກັບ ponrese ER (ທັງສອງຊຸດຂອງ genes) (LRG) ພັນທຸ ກຳ ທີ່ຂຶ້ນກັບກິດຈະ ກຳ ທີ່ລະບຸຈາກການສຶກສາໃນ vivo mouse16 ແລະ LRGs ສະເພາະຂອງມະນຸດຈາກ neurons17 ໃນ vitro. g, gene set enrichment analysis (one-sided Fisher's exact test) ຂອງ genes upregulated ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ປັບ P < 0.05, fold change > 2, expressed in at least 10% of nuclei) in t-hCO glutamatergic neurons ທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons ກັບ ponrese ER (ທັງສອງຊຸດຂອງ genes) (LRG) ພັນທຸ ກຳ ທີ່ຂຶ້ນກັບກິດຈະ ກຳ ທີ່ລະບຸຈາກການສຶກສາໃນ vivo mouse16 ແລະ LRGs ສະເພາະຂອງມະນຸດຈາກ neurons17 ໃນ vitro. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацой активаций <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах нейронах глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависяктих от аскящих от ависящих идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, ການວິເຄາະຂອງຊຸດ gene enrichment (one-tailed Fisher's exact test) ຂອງ genes ທີ່ມີການກະຕຸ້ນທີ່ສຳຄັນ (ປັບ P<0.05, fold change >2, expression in at least 10% of nuclei) in t-hCO glutamatergic neurons ທຽບກັບ hCO glutamatergic neurons sets of both genes (ERde) and early (ERde) ຖືກກໍານົດຢູ່ໃນ vivo mice16 ແລະ LRGs ສະເພາະຂອງມະນຸດຈາກ neurons ໃນ vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG. g，t-hco 谷氨酸神经元与 hco 谷氨酸神经元相比，t-hco 谷氨酸神经元< 上像 5 莰p.倍数> 2，至少至少 10%的细胞核中表达）的集富集分析（单侧 fisher精确）中集分析（单侧 fisher精确）丽魔内单侧精确）丽魔内单侧早期反应反应反应和晚期反应反应(lrg) 活性基因的基因组 16 僌神廏。中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаоматергический (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностйтр Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицирховвансниле на Фишера) vivo16 и нейронах ໃນ vitro17, LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamatergic neurons ໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍເມື່ອທຽບໃສ່ກັບ hCO glutamatergic neurons (ປັບ P<0.05, fold change >2, ຢ່າງຫນ້ອຍ 10% Early response (ERG) ແລະ late response gene enrichment analysis (one-tailed Fisher's exact test) ກິດຈະກໍາການຕອບສະຫນອງຂອງ genes mR 6) void in void (L. vitro neurons.17 LRGs ສະເພາະຂອງມະນຸດ.ເສັ້ນຈຸດຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄ່າ P ທີ່ຖືກແກ້ໄຂ Bonferroni ຂອງ 0.05. h, ການສະແດງອອກຂອງ gene GluN (ການຫຸ້ມຫໍ່ pseudo- ແລະຂະຫນາດຂອງແຕ່ລະ gene) ໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ snRNA-seq replicas ຂອງ genes LRG ໃນ t-hCO glutamatergic neurons. i, immunostaining ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະແດງອອກ SCG2 ໃນ t-hCO (ເທິງ) ແລະ hCO (ຕ່ໍາ) neurons. ລູກສອນສີຂາວຊີ້ໄປຫາເຊລ SCG2+. ແຖບຂະຫນາດ, 25 µm. ຂໍ້​ມູນ​ແມ່ນ​ສະ​ແດງ​ອອກ​ເປັນ​ສະ​ເລ່ຍ ± deviation ມາດ​ຕະ​ຖານ​.
ອີງຕາມກິດຈະກໍາທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ t-hCO ທີ່ສັງເກດເຫັນໃນ ex vivo slices, snRNA-seq ເປີດເຜີຍກິດຈະກໍາທີ່ຂຶ້ນກັບການຄວບຄຸມຂອງ gene transcripts ໃນ t-hCO ເມື່ອທຽບກັບ hCO ໃນ vitro. Glutamatergic t-hCO neurons ສະແດງລະດັບສູງຂອງ genes ຄວບຄຸມກິດຈະກໍາການຕອບສະຫນອງຊ້າ (ຮູບ 2g, h), ເຊິ່ງໄດ້ພົບເຫັນໃນການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໃນຫນູແລະ neurons ຂອງມະນຸດ16,17. ຕົວຢ່າງ, BDNF18, SCG2, ແລະ OSTN, gene ການຄວບຄຸມກິດຈະກໍາ primate-specific, ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະແດງອອກເພີ່ມຂຶ້ນໃນ neurons t-hCO ເມື່ອທຽບກັບ neurons hCO (ຮູບ 2g-i). ດັ່ງນັ້ນ, neurons t-hCO ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄຸນລັກສະນະການເຕີບໃຫຍ່ທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນເມື່ອທຽບກັບ neurons hCO ໂດຍການວິເຄາະ, morphological, ແລະການເຮັດວຽກ.
ເພື່ອປະເມີນຕື່ມອີກວ່າສະມາຄົມຂອງການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ t-hCO ກັບການພັດທະນາສະຫມອງຂອງມະນຸດ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການປຽບທຽບ transcriptomic ຂອງຈຸລັງ cortical fetal ແລະຜູ້ໃຫຍ່ປະເພດ 19,20 ແລະຜູ້ໃຫຍ່21,22 ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຂໍ້ມູນຢ່າງກວ້າງຂວາງກ່ຽວກັບ cortical gene expression23 ໃນລະຫວ່າງການພັດທະນາ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 5). ). ກັບວຽກງານທີ່ຜ່ານມາ 24 , ສະຖານະພາບການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ hCO ແລະ t-hCO t-hCO t-hCO ຂອງການເຕີບໃຫຍ່ຢູ່ 7-8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງແມ່ນສອດຄ່ອງຢ່າງກວ້າງຂວາງກັບເວລາພັດທະນາ vivo ແລະທຽບເທົ່າກັບຊີວິດຂອງ fetal ທ້າຍທີ່ສຸດ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ Fig. 5a). ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ t-hCO ເພີ່ມຂຶ້ນເມື່ອທຽບໃສ່ hCO ທີ່ກົງກັບອາຍຸ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການກະຕຸ້ນ transcriptome ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ synaptogenesis, astrogenesis, ແລະ myelination (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, Fig. 5b-d). ໃນລະດັບ cellular, ພວກເຮົາພົບເຫັນຫຼັກຖານຂອງປະເພດຍ່ອຍ cortex ທີ່ບາງກວ່າໃນ t-hCO, ມີກຸ່ມຂອງ neurons glutamatergic ທັບຊ້ອນກັບຜູ້ໃຫຍ່ L2/3, L5, ແລະ L6 neuron subtypes (ຮູບ 1i). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການຊ້ອນກັນຂອງກຸ່ມລະຫວ່າງ glutamatergic t-hCO neurons ແລະ neurons cortical fetal ແມ່ນຖືກຈໍາກັດຫຼາຍກວ່າໃນການຖືພາກາງ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 5e-j). ເພື່ອກໍານົດວ່າ neurons t-hCO ມີຫນ້າທີ່ຄ້າຍຄືກັບ neurons neocortical postnatal ຂອງມະນຸດ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການບັນທຶກ electrophysiological ແລະການຟື້ນຟູທາງກາຍະວະຂອງ neurons pyramidal L2/3 ຂອງມະນຸດໃນສ່ວນແຫຼມຂອງ cortex postnatal ຂອງມະນຸດ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 7a). ຄຸນສົມບັດ electrophysiological ຂອງ L2/3 pyramidal neurons ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບ neurons t-hCO pyramidal (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 7e). Morphologically, L2/3 neurons ຈາກຕົວຢ່າງຂອງມະນຸດຫຼັງເກີດແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບ t-hCO ຫຼາຍກ່ວາ hCO, ເຖິງແມ່ນວ່າຈຸລັງ L2/3 ຍາວກວ່າ, ມີສາຂາຫຼາຍໂດຍລວມ, ແລະມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງສູງກວ່າ (ຮູບ 3g ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 7b-). G).
a, ການປູກຖ່າຍຂອງ hCO ທີ່ຜະລິດໂດຍການຄວບຄຸມແລະສາຍເຊນ TS hiPS ເຂົ້າໄປໃນຫນູເດັກເກີດໃຫມ່. b, ການຟື້ນຟູ 3D ຂອງ neurons t-hCO ທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍ biocytin ຫຼັງຈາກ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ. c, ປະລິມານສະເລ່ຍຂອງຄວາມຍາວ dendritic (n = 19 neurons ຄວບຄຸມ, n = 21 TS neurons; ** P = 0.0041). d, 3D-reconstructed dendritic ສາຂາຈາກການຄວບຄຸມແລະ TS t-hCO ຢູ່ທີ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ, ແລະປະລິມານຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic (n = 16 neurons ຄວບຄຸມ, n = 21 TS neurons, ***P < 0.0001). d, 3D-reconstructed dendritic ສາຂາຈາກການຄວບຄຸມແລະ TS t-hCO ຢູ່ທີ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ, ແລະປະລິມານຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic (n = 16 neurons ຄວບຄຸມ, n = 21 TS neurons, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцировки и колиез плотности дендритных шипов(n=16 контрольных нейронов, n=21 TS нейронов, ***P<0,0001). d, ການຟື້ນຟູ 3D ຂອງສາຂາ dendritic ຈາກການຄວບຄຸມແລະ t-hCO TS ຢູ່ທີ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງແລະຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic (n = 16 neurons ຄວບຄຸມ, n = 21 neurons TS, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 煞姸珪煞煞珦21 个TS 神经元，***P < 0.0001). d，分化 8 个时对照和 ts t-hco的 3d 重建 分支 以及树突棘 密媖（重建 分支以及树突棘密媖量化量化）元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p < 0.0001 ). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и нкавличеят плотности дендритных шипов(n=16 контрольных нейронов, n=21 TS нейронов, ***P<0,0001). d, ການຟື້ນຟູ 3D ຂອງສາຂາ dendritic ການຄວບຄຸມແລະ TS t-hCO ຢູ່ທີ່ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງແລະຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic (n = 16 neurons ຄວບຄຸມ, n = 21 neurons TS, ***P<0.0001).ດາວສີແດງຊີ້ບອກເຖິງກະດູກສັນຫຼັງ dendritic putative. e, EPSCs spontaneous ໃນການຄວບຄຸມແລະ neurons TS t-hCO ຫຼັງຈາກ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ. f, ຂອບເຂດຄວາມຖີ່ຂອງການສະສົມແລະປະລິມານຄວາມຖີ່ແລະຄວາມກວ້າງຂອງເຫດການ synaptic (n = 32 neurons ຄວບຄຸມ, n = 26 neurons TS; ** P = 0.0076 ແລະ P = 0.8102). g, ການວິເຄາະ Scholl ຂອງ TS ແລະ neurons ຄວບຄຸມໃນ hCO ແລະ t-hCO. ສາຍ Dashed ສະແດງໃຫ້ເຫັນມະນຸດ L2 / 3 neurons pyramidal postnatal ສໍາລັບການປຽບທຽບ (n = 24 neurons ຄວບຄຸມ t-hCO, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 neurons ຄວບຄຸມ hCO, ແລະ n = 7 TS hCO neurons). ຂໍ້​ມູນ​ແມ່ນ​ສະ​ແດງ​ອອກ​ເປັນ​ສະ​ເລ່ຍ​± deviation ມາດ​ຕະ​ຖານ​
ຄວາມສາມາດຂອງ t-hCO ເພື່ອ replicate ລັກສະນະ morphological ແລະການເຮັດວຽກຂອງ neurons cortex ຂອງມະນຸດໃນລະດັບສູງ prompted ພວກເຮົາເພື່ອຄົ້ນຫາວ່າ t-hCO ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາ phenotypes ຂອງພະຍາດ. ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ TS, ຄວາມຜິດປົກກະຕິທາງດ້ານການພັດທະນາທາງດ້ານ neurodevelopmental ຮ້າຍແຮງທີ່ເກີດຈາກການກາຍພັນຂອງຫນ້າທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນໃນ gene encoding CaV1.2, ເຊິ່ງລິເລີ່ມການຖ່າຍທອດ gene ຂຶ້ນກັບກິດຈະກໍາໃນ neurons. ພວກເຮົາໄດ້ຮັບ hCO ຈາກສາມຄົນເຈັບ TS ປະຕິບັດການທົດແທນທົ່ວໄປທີ່ສຸດ (p.G406R) ແລະສາມການຄວບຄຸມ (ຮູບ 3a). ຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ, ພວກເຮົາພົບວ່າ morphology dendritic ໄດ້ຖືກປ່ຽນແປງໃນ neurons TS ເມື່ອທຽບກັບການຄວບຄຸມ (ຮູບ 3b ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, Fig. 8a, b), ມີການເພີ່ມຂຶ້ນສອງເທົ່າຂອງຈໍານວນ dendrites ຕົ້ນຕໍແລະການເພີ່ມຂຶ້ນໂດຍສະເລ່ຍແລະການຫຼຸດລົງໂດຍລວມຂອງຄວາມຍາວ dendritic (ຮູບ 3c ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, Fig. 8c). ນີ້ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງກະດູກສັນຫຼັງທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນແລະຄວາມຖີ່ຂອງ EPSCs spontaneous ໃນ TS ເມື່ອທຽບກັບ neurons ຄວບຄຸມ (ຮູບ 3d-f ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 8g). ການວິເຄາະເພີ່ມເຕີມໄດ້ເປີດເຜີຍຮູບແບບຂອງສາຂາ dendritic ຜິດປົກກະຕິໃນ t-hCO TS ທຽບກັບການຄວບຄຸມ, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນຢູ່ໃນ vitro TS hCO ໃນຂັ້ນຕອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (ຮູບ 3g). ນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການຫົດຕົວຂອງ dendritic ຂຶ້ນກັບກິດຈະກໍາໃນ TS ແລະຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມສາມາດຂອງເວທີການປູກຖ່າຍນີ້ໃນການກວດສອບປະກົດການຂອງພະຍາດໃນ vivo.
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາຖາມວ່າຈຸລັງ t-hCO ຖືກປະສົມປະສານເຂົ້າໃນ rat S1 ໃນລະດັບໃດ. S1 ໃນສັດຈໍາພວກໄດ້ຮັບວັດສະດຸປ້ອນ synaptic ທີ່ເຂັ້ມແຂງຈາກ ipsilateral ventral basal ແລະ posterior thalamic nuclei, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບ motor ipsilateral ແລະ cortices somatosensory ທີສອງ, ແລະ contralateral S1 (ຮູບ 4a). ເພື່ອຟື້ນຟູຮູບແບບ innervation, ພວກເຮົາໄດ້ຕິດເຊື້ອ hCO ກັບ rabies virus-dG-GFP/AAV-G ແລະ transplanted hCO ເຂົ້າໄປໃນຫນູ S1 3 ມື້ຕໍ່ມາ. ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການສະແດງອອກຂອງ GFP ທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນໃນ neurons ຂອງ ipsilateral S1 ແລະ ganglia basal ventral 7-14 ມື້ຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ (ຮູບ 4b, c). ນອກຈາກນັ້ນ, ພູມຕ້ານທານ staining ຂອງເຄື່ອງຫມາຍ thalamic netrin G1 ເປີດເຜີຍການປະກົດຕົວຂອງ thalamic endings ໃນ t-hCO (ຮູບ 4d, e). ເພື່ອປະເມີນວ່າການຄາດຄະເນ afferent ເຫຼົ່ານີ້ສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດການຕອບໂຕ້ synaptic ໃນຈຸລັງ t-hCO, ພວກເຮົາປະຕິບັດການບັນທຶກຈຸລັງທັງຫມົດຈາກຈຸລັງຂອງມະນຸດໃນສ່ວນແຫຼມຂອງຊັ້ນ thalamocortical. ການກະຕຸ້ນໄຟຟ້າຂອງຫນູ S1, ແຄບຊູນພາຍໃນ, ສີຂາວ, ເສັ້ນໃຍຢູ່ໃກ້ກັບ t-hCO ຫຼືການກະຕຸ້ນ optogenetic ຂອງ opsin-expressing thalamic endings ໃນ t-hCO induced short-latency EPSCs ໃນ neurons t-hCO ທີ່ສໍາຜັດກັບ AMPA receptor antagonist NBQX. (ຮູບ 4f, g ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 9a–g). ຂໍ້​ມູນ​ເຫຼົ່າ​ນີ້​ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ວ່າ t-hCO ແມ່ນ​ປະ​ສົມ​ປະ​ສານ​ທາງ​ວິ​ພາກ​ເຂົ້າ​ໄປ​ໃນ​ສະ​ຫມອງ​ຫນູ​ແລະ​ສາ​ມາດ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ກະ​ຕຸ້ນ​ໂດຍ​ເນື້ອ​ເຍື່ອ​ເຈົ້າ​ພາບ​ຫນູ​.
a, ແຜນວາດແຜນວາດຂອງການທົດລອງຕິດຕາມ rabies. b, GFP ແລະການສະແດງອອກ STEM121 ສະເພາະຂອງມະນຸດລະຫວ່າງ t-hCO ແລະ rat cerebral cortex (ກະດານເທິງ). ຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະແດງອອກຂອງ GFP ໃນຫນູ ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ຊ້າຍລຸ່ມ) ແລະ ipsilateral S1 (ຂວາລຸ່ມ). ແຖບຂະຫນາດ, 50 µm. ສີ່ຫຼ່ຽມສີແດງເປັນຕົວແທນຂອງພື້ນທີ່ຂອງສະຫມອງບ່ອນທີ່ຮູບພາບໄດ້ຖືກປະຕິບັດ. c, ປະລິມານຂອງຈຸລັງທີ່ສະແດງອອກ GFP (n = 4 ຫນູ). d, e — Netrin G1+ terminals thalamic ໃນ t-hCO. d ສະແດງໃຫ້ເຫັນພາກສ່ວນ coronal ທີ່ປະກອບດ້ວຍ t-hCO ແລະ VB nuclei. ແຖບຂະຫນາດ, 2 ມມ. e ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະແດງອອກ Netrin G1 ແລະ STEM121 ໃນ ​​neurons t-hCO (ຊ້າຍ) ແລະ VB (ຂວາ). ແຖບຂະຫນາດ, 50 µm. ເສັ້ນຈຸດສີສົ້ມສະແດງເຖິງຂອບ t-hCO. f, g, ຮ່ອງຮອຍໃນປະຈຸບັນຂອງ neurons t-hCO ຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນໄຟຟ້າໃນ S1 rat (f) ຫຼືແຄບຊູນພາຍໃນ (g), ມີ (ສີມ່ວງ) ຫຼືບໍ່ມີ (ສີດໍາ) NBQX (ຊ້າຍ). ຄວາມກວ້າງຂອງ EPSC ທີ່ມີແລະບໍ່ມີ NBQX (n = 6 S1 neurons, * P = 0.0119; ແລະ n = 6 neurons ແຄບຊູນພາຍໃນ, ** P = 0.0022) (ສູນກາງ). ເປີເຊັນຂອງ neurons t-hCO ສະແດງ EPSC ໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ການກະຕຸ້ນໄຟຟ້າຂອງຫນູ S1 (f) ຫຼືແຄບຊູນພາຍໃນ (g) (ຂວາ). aCSF, ນ້ໍາ cerebrospinal ທຽມ. h, ແຜນວາດ schematic ຂອງການທົດລອງຮູບພາບ 2P (ຊ້າຍ). ການສະແດງອອກຂອງ GCaMP6s ໃນ t-hCO (ກາງ). ແຖບຂະຫນາດ, 100 µm. ເວລາ fluorescence lapse ຂອງ GCaMP6s (ຂວາ). i, Z-score ຂອງ fluorescence ກິດ ຈະ ກໍາ spontaneous. j, ຮູບແຕ້ມ schematic ຂອງການກະຕຸ້ນ mustache. k, z-scored 2P fluorescence trajectories ໃນຫນຶ່ງການທົດລອງ, ສອດຄ່ອງກັບ whisker deviation ໃນເວລາສູນ (ເສັ້ນ dashed) ໃນຈຸລັງຕົວຢ່າງ. l, ການຕອບສະ ໜອງ z-score ໂດຍສະເລ່ຍຂອງປະຊາກອນຂອງເຊນທັງ ໝົດ ທີ່ສອດຄ່ອງກັບການບິດເບືອນຂອງ whisker ໃນຊ່ວງເວລາສູນ (ເສັ້ນ dashed) (ສີແດງ) ຫຼືເວລາທີ່ສ້າງຂຶ້ນແບບສຸ່ມ (ສີຂີ້ເຖົ່າ). ມ. ແຜນວາດແຜນວາດຂອງການທົດລອງກ່ຽວກັບເຄື່ອງຫມາຍ optical. n, ເສັ້ນໂຄ້ງແຮງດັນດິບຈາກຕົວຢ່າງ t-hCO cell ໃນລະຫວ່າງການກະຕຸ້ນ laser ສີຟ້າ ຫຼື whisker deflection. ລູກສອນສີແດງຊີ້ບອກ spikes ທໍາອິດທີ່ເກີດຈາກແສງສະຫວ່າງ (ເທິງ) ຫຼືເກີດມາຈາກ whisker deflection (ລຸ່ມ). ຮົ່ມສີຂີ້ເຖົ່າຊີ້ໃຫ້ເຫັນໄລຍະເວລາຂອງການເຫນັງຕີງຂອງ whisker. o, ຮູບແບບຄື້ນແສງສູງສຸດ ແລະ ການຕອບສະໜອງການເໜັງຕີງຂອງ whisker. p, spikes ຂອງຄວາມພະຍາຍາມດຽວ, ສອດຄ່ອງກັບ deviation ຂອງ whiskers ໃນຈຸລັງຂອງຕົວຢ່າງ. 0 ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມບ່ຽງເບນຂອງ whisker (ເສັ້ນ dashed). q, ອັດຕາການຍິງຄະແນນ z-score ໂດຍສະເລ່ຍຂອງປະຊາກອນສຳລັບທຸກເຊວທີ່ອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບການຖ່າຍພາບ, ສອດຄ່ອງກັບການບ່ຽງເບນຂອງ whisker ຢູ່ທີ່ສູນ (ເສັ້ນ dashed) (ສີແດງ) ຫຼືສະແຕມເວລາທີ່ສ້າງຂຶ້ນແບບສຸ່ມ (ສີຂີ້ເຖົ່າ). r, ອັດຕາສ່ວນຂອງຫນ່ວຍຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງແສງ modulated ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍ whisker deviation (n = 3 ຫນູ) (ຊ້າຍ). Peak z-score latency (n = 3 rats; n = 5 (ສີຂຽວອ່ອນ), n = 4 (ສີຂຽວເຂັ້ມ), ແລະ n = 4 (cyan) whisker deflection modulation units per rat) (ຂວາ). ຂໍ້​ມູນ​ແມ່ນ​ສະ​ແດງ​ອອກ​ເປັນ​ສະ​ເລ່ຍ ± deviation ມາດ​ຕະ​ຖານ​
ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ຖາມວ່າ t-hCO ສາມາດຖືກກະຕຸ້ນໂດຍການກະຕຸ້ນຄວາມຮູ້ສຶກໃນ ​​vivo. ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ປູກ​ເອົາ hCO ທີ່​ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ຕົວ​ຊີ້​ວັດ​ທາດ​ການ​ຊຽມ​ທີ່​ເຂົ້າ​ລະ​ຫັດ​ພັນ​ທຸ​ກໍາ GCaMP6 ເຂົ້າ​ໄປ​ໃນ​ຫນູ S1. ຫຼັງຈາກ 150 ມື້, ພວກເຮົາເຮັດການຖ່າຍຮູບເສັ້ນໄຍ ຫຼືການຖ່າຍຮູບດ້ວຍແຄວຊຽມສອງຮູບ (ຮູບ 4h ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10a). ພວກເຮົາພົບວ່າຈຸລັງ t-hCO ສະແດງກິດຈະກໍາຈັງຫວະ synchronized (ຮູບ 4i, ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10b ແລະວິດີໂອເສີມ 1). ເພື່ອລັກສະນະກິດຈະກໍາ t-hCO ສູງສຸດ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການບັນທຶກ electrophysiological extracellular ໃນຫນູ transplant anesthetized (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10c-f). ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຈຸດປະສານງານ stereotaxic ຈາກຮູບພາບ MRI; ດັ່ງນັ້ນ, ຫນ່ວຍງານທີ່ບັນທຶກໄວ້ເຫຼົ່ານີ້ເປັນຕົວແທນຂອງ neurons ຂອງມະນຸດ putative, ເຖິງແມ່ນວ່າ electrophysiology ຢ່າງດຽວບໍ່ໄດ້ອະນຸຍາດໃຫ້ກໍານົດຊະນິດຂອງຕົ້ນກໍາເນີດ. ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ສັງ​ເກດ​ເຫັນ​ການ​ແຕກ​ຂອງ​ກິດ​ຈະ​ກໍາ synchronized (ຂໍ້​ມູນ​ຂະ​ຫຍາຍ, ຮູບ 10d). ການລະເບີດດັ່ງກ່າວໃຊ້ເວລາປະມານ 460 ms ແລະຖືກແຍກອອກໂດຍໄລຍະເວລາງຽບປະມານ 2 ວິນາທີ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10d, e). ໜ່ວຍ​ງານ​ຂອງ​ບຸກຄົນ​ໄດ້​ຍິງ​ໂດຍ​ສະ​ເລ່ຍ​ປະມານ 3 ຮອບ​ຕໍ່​ການ​ລະ​ເບີດ, ຊຶ່ງ​ແມ່ນ​ປະມານ 73% ຂອງ​ຫົວ​ໜ່ວຍ​ທີ່​ລົງທະບຽນ​ຕໍ່​ການ​ລະ​ເບີດ. ກິດຈະກໍາຂອງແຕ່ລະຫນ່ວຍແມ່ນມີຄວາມສໍາພັນສູງ, ແລະການພົວພັນເຫຼົ່ານີ້ສູງກວ່າຫນ່ວຍງານທີ່ຖືກກໍານົດໄວ້ໃນສັດທີ່ບໍ່ໄດ້ສັກຢາທີ່ຖືກບັນທຶກໄວ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10f). ເພື່ອສ້າງລັກສະນະການຕອບໂຕ້ແບບຮວງຕັ້ງແຈບຂອງ neurons ທີ່ມາຈາກມະນຸດໄດ້ລະບຸໄວ້ຕື່ມອີກ, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການທົດລອງການຕິດປ້າຍແສງໃສ່ຫນູທີ່ມີຢາສລົບທີ່ນຳໄປປູກດ້ວຍ hCO ທີ່ສະແດງຊ່ອງສັນຍານ cation ທີ່ອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບແສງສະຫວ່າງ rhodopsin 2 (hChR2), ໂດຍຜ່ານທີ່ neurons t-hCO ການຮັບຮູ້ສັ້ນ - latency (ຫນ້ອຍກວ່າ 10 ms. blue).i (ໜ້ອຍກວ່າ 10 ms). t-hCO neurons ສະແດງໃຫ້ເຫັນການລະເບີດຂອງກິດຈະກໍາ spontaneous ໃນຄວາມຖີ່ທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນຮູບພາບດ້ວຍທາດການຊຽມ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການບັນທຶກ electrophysiological ປະຕິບັດໃນ t-hCO ໃນບໍ່ມີເຄື່ອງຫມາຍແສງສະຫວ່າງ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10c-g). ບໍ່ມີກິດຈະກໍາ spontaneous ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຂັ້ນຕອນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງ hCO ທີ່ບັນທຶກໄວ້ໃນ vitro. ເພື່ອປະເມີນວ່າ t-hCO ສາມາດໄດ້ຮັບການກະຕຸ້ນໂດຍການກະຕຸ້ນຄວາມຮູ້ສຶກ, ພວກເຮົາໄລຍະສັ້ນໆ deflected ຫນູ whiskers ຫ່າງຈາກ t-hCO (ຮູບ 4j,m ແລະຂະຫຍາຍຂໍ້ມູນ, ຮູບ 10h, k). ອີງຕາມການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາ 8,10, ຊຸດຍ່ອຍຂອງຈຸລັງ t-hCO ສະແດງໃຫ້ເຫັນກິດຈະກໍາທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ whisker deflection, ເຊິ່ງບໍ່ໄດ້ສັງເກດເຫັນໃນເວລາທີ່ຂໍ້ມູນຖືກປຽບທຽບກັບສະແຕມທີ່ໃຊ້ເວລາແບບສຸ່ມ (ຮູບ 4k–q ແລະຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ, ຮູບ 10h–q). ແທ້ຈິງແລ້ວ, ປະມານ 54% ຂອງຫນ່ວຍງານ opto-labeled ສະແດງໃຫ້ເຫັນອັດຕາການປຸກເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນ whisker, ສູງສຸດຢູ່ທີ່ປະມານ 650 ms (ຮູບ 4r). ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ແນະນໍາວ່າ t-hCO ໄດ້ຮັບວັດສະດຸປ້ອນທີ່ເຫມາະສົມແລະສາມາດຖືກກະຕຸ້ນໂດຍການກະຕຸ້ນສິ່ງແວດລ້ອມ.
ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນວ່າ t-hCO ສາມາດກະຕຸ້ນວົງຈອນໃນຫນູເພື່ອຄວບຄຸມພຶດຕິກໍາ. ພວກເຮົາທໍາອິດສືບສວນວ່າ axons ຂອງໂຄງການ neurons t-hCO ເຂົ້າໄປໃນເນື້ອເຍື່ອອ້ອມຂ້າງຂອງຫນູ. ພວກເຮົາຕິດເຊື້ອ hCO ດ້ວຍການເຂົ້າລະຫັດ lentivirus hChR2 fused ກັບ EYFP (hChR2-EYFP). ຫຼັງຈາກ 110 ມື້, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນການສະແດງອອກຂອງ EYFP ໃນເຂດ ipsilateral cortical, ລວມທັງ auditory, motor, ແລະ somatosensory cortices, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໃນເຂດ subcortical, ລວມທັງ striatum, hippocampus, ແລະ thalamus (ຮູບ 5a). ເພື່ອປະເມີນວ່າການຄາດຄະເນເຫຼົ່ານີ້ສາມາດກະຕຸ້ນການຕອບໂຕ້ synaptic ໃນຈຸລັງຫນູ, ພວກເຮົາເປີດໃຊ້ optically ຈຸລັງ t-hCO ສະແດງ hChR2-EYFP ໂດຍການບັນທຶກຈຸລັງ cerebral cortex ຂອງຫນູຢູ່ໃນພາກສ່ວນສະຫມອງແຫຼມ. ການເປີດໃຊ້ t-hCO axons ທີ່ມີແສງສີຟ້າ induced short-latency EPSCs ໃນ rat pyramidal cortex neurons, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກສະກັດໂດຍ NBQX (ຮູບ 5b-g). ນອກຈາກນັ້ນ, ຄໍາຕອບເຫຼົ່ານີ້ສາມາດຖືກສະກັດໂດຍ tetrodotoxin (TTX) ແລະຟື້ນຟູໂດຍ 4-aminopyridine (4-AP), ແນະນໍາວ່າພວກມັນເກີດຈາກການເຊື່ອມຕໍ່ monosynaptic (ຮູບ 5e).
a, ແຜນວາດແຜນວາດຂອງການຕິດຕາມ axon (ຊ້າຍ). t-hCO EYFP ສະແດງອອກ (ຂວາ). ແຖບຂະຫນາດ, 100 µm. A1, auditory cortex, ACC, anterior cingulate cortex, ງ. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus ຂອງ thalamus, VTA, ventral tegmental region. ສີ່ຫຼ່ຽມສີແດງເປັນຕົວແທນຂອງພື້ນທີ່ຂອງສະຫມອງບ່ອນທີ່ຮູບພາບໄດ້ຖືກປະຕິບັດ. b, ແຜນວາດແຜນວາດຂອງການທົດລອງກະຕຸ້ນ. c, d, ຕົວຢ່າງການຕອບສະຫນອງຂອງ photocurrent ແສງສະຫວ່າງສີຟ້າ (ເທິງ) ແລະແຮງດັນ (ລຸ່ມ) ໃນມະນຸດ (c) EYFP+ t-hCO ຫຼືຫນູ (d) EYFP- ຈຸລັງ. e, f, ຮ່ອງຮອຍໃນປະຈຸບັນຂອງ neurons ຫນູຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນແສງສະຫວ່າງສີຟ້າຂອງ t-hCO axons ກັບ TTX ແລະ 4-AR (ສີຂຽວ), TTX (ສີຂີ້ເຖົ່າ) ຫຼື aCSF (ສີດໍາ) (e), ມີ (violet) ຫຼືບໍ່ມີ (ສີດໍາ)) NBQX (e). g, latency ຂອງການຕອບສະຫນອງ induced ໂດຍແສງສະຫວ່າງສີຟ້າໃນຈຸລັງຫນູ (n = 16 ຈຸລັງ); ແຖບແນວນອນຊີ້ບອກເຖິງຄວາມເລັ່ງເວລາສະເລ່ຍ (7.13 ms) (ຊ້າຍ). ຄວາມກວ້າງຂອງແສງຂອງ EPSCs ທີ່ບັນທຶກດ້ວຍ ຫຼືບໍ່ມີ NBQX (n = 7 ເຊລ; ***P < 0.0001) (ກາງ). ຄວາມກວ້າງຂອງແສງຂອງ EPSCs ທີ່ບັນທຶກດ້ວຍ ຫຼືບໍ່ມີ NBQX (n = 7 ເຊລ; ***P < 0.0001) (ກາງ). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). ຄວາມກວ້າງໃຫຍ່ຂອງ EPSCs ທີ່ມີແສງສະຫວ່າງທີ່ບັນທຶກໄວ້ດ້ວຍ ຫຼືບໍ່ມີ NBQX (n = 7 ເຊລ; ***P < 0.0001) (ສູນ).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). ຄວາມກວ້າງໃຫຍ່ຂອງ EPSCs ທີ່ມີແສງສະຫວ່າງທີ່ບັນທຶກໄວ້ດ້ວຍ ຫຼືບໍ່ມີ NBQX (n = 7 ເຊລ; ***P < 0.0001) (ສູນ).ເປີເຊັນຂອງຈຸລັງຫນູທີ່ສະແດງ EPSCs ທີ່ຕອບສະຫນອງກັບແສງສີຟ້າ (ຂວາ). h, ແຜນວາດແຜນວາດຂອງໜ້າທີ່ການປະພຶດ. d0, ມື້ 0. i. ການປະຕິບັດຂອງສັດທີ່ເປັນຕົວຢ່າງໃນມື້ 1 (ຊ້າຍ) ຫຼືວັນທີ 15 (ຂວາ) ຂອງການຝຶກອົບຮົມ. ຈໍານວນສະເລ່ຍຂອງ licks ປະຕິບັດໃນມື້ 1 (ຊ້າຍ) ຫຼືວັນທີ 15 (ສູນກາງຂວາ) (n = 150 ການທົດລອງແສງສີຟ້າ, n = 150 ການທົດລອງແສງສີແດງ; ***P < 0.0001). ຈໍານວນສະເລ່ຍຂອງ licks ປະຕິບັດໃນມື້ 1 (ຊ້າຍ) ຫຼືວັນທີ 15 (ສູນກາງຂວາ) (n = 150 ການທົດລອງແສງສີຟ້າ, n = 150 ການທົດລອງແສງສີແດງ; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 исним исний светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). ຕົວເລກສະເລ່ຍຂອງ licks ດໍາເນີນໃນວັນທີ 1 (ຊ້າຍ) ຫຼືວັນທີ 15 (ກາງຂວາ) (n = 150 ການທົດລອງແສງສີຟ້າ, n = 150 ການທົດລອງແສງສີແດງ; ***P < 0.0001).第1天（左）或第15天（右中）执行的平均舔次数（n=150次蓝光试验，n=150次红匉。；150次红匉。；第1天（左）或第15天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红匉； 150 欯红匉 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 исним исний светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). ຕົວເລກສະເລ່ຍຂອງ licks ດໍາເນີນໃນວັນທີ 1 (ຊ້າຍ) ຫຼືວັນທີ 15 (ກາງຂວາ) (n = 150 ການທົດລອງແສງສີຟ້າ, n = 150 ການທົດລອງແສງສີແດງ; ***P < 0.0001).ການຈູດສະສົມສຳລັບການທົດລອງແສງສີແດງ ແລະສີຟ້າໃນວັນທີ 1 (ກາງຊ້າຍ) ຫຼື ວັນທີ 15 (ຂວາ). NS, ບໍ່ສໍາຄັນ. j,k, ລັກສະນະພຶດຕິກໍາຂອງສັດທັງຫມົດທີ່ transplanted ກັບ t-hCO ສະແດງອອກ hChR2-EYFP (j) ຫຼືຄວບຄຸມ fluorophore (k) ໃນມື້ 1 ຫຼື 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ຫນູ, ** P = 0.0049; ການຄວບຄຸມ: n = 9, P = 0.1497). l, ການວິວັດທະນາການຄະແນນຄວາມມັກ (n = 9 hChR2, n = 9 ການຄວບຄຸມ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, ການວິວັດທະນາການຄະແນນຄວາມມັກ (n = 9 hChR2, n = 9 ການຄວບຄຸມ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, ການວິວັດທະນາການຄະແນນຄວາມມັກ (n = 9 hChR2, n = 9 ການຄວບຄຸມ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9对照；**P < 0.001，***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9对照；**P < 0.001，***P < 0.0001). l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, ການວິວັດທະນາການຄະແນນຄວາມມັກ (n = 9 hChR2, n = 9 ການຄວບຄຸມ; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, ການສະແດງອອກ FOS ໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ການກະຕຸ້ນ optogenetic ຂອງ t-hCO ໃນ S1. ຮູບພາບຂອງການສະແດງອອກ FOS (ຊ້າຍ), ແລະປະລິມານ (n = 3 ຕໍ່ກຸ່ມ; *P < 0.05, **P < 0.01 ແລະ ***P < 0.001) (ຂວາ) ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ. ຮູບພາບຂອງການສະແດງອອກ FOS (ຊ້າຍ), ແລະປະລິມານ (n = 3 ຕໍ່ກຸ່ມ; *P < 0.05, **P < 0.01 ແລະ ***P < 0.001) (ຂວາ) ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P<0,05,**P<0,05,**P<0,01,01,000,000. ຮູບພາບຂອງການສະແດງອອກ FOS (ຊ້າຍ) ແລະປະລິມານ (n = 3 ຕໍ່ກຸ່ມ; *P<0.05, **P<0.01, ແລະ ***P<0.001) ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ (ຂວາ).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P< 0.05、**P< 0.01和***P< 0.001）（右）的图像.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P< 0.05、**P< 0.01和***P< 0.001）（右）的图像. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P<0,05,**P<0,05,**P<0,01,01,000,000. ຮູບພາບຂອງການສະແດງອອກ FOS (ຊ້າຍ) ແລະປະລິມານ (n = 3 ຕໍ່ກຸ່ມ; *P<0.05, **P<0.01, ແລະ ***P<0.001) ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ (ຂວາ).ແຖບຂະຫນາດ, 100 µm. ຂໍ້​ມູນ​ແມ່ນ​ສະ​ແດງ​ອອກ​ເປັນ​ຄວາມ​ຜິດ​ພາດ​ສະ​ເລ່ຍ​±​ມາດ​ຕະ​ຖານ​ຂອງ BLA​, ຕ່ອມ​ທອນ​ຊີນ basolateral​, MDT​, dorsomedial thalamic nucleus​, PAG​, periaqueductal ສີ​ຂີ້​ເຖົ່າ​.
ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາໄດ້ຖາມວ່າ t-hCO ສາມາດດັດແປງພຶດຕິກໍາຂອງຫນູໄດ້ບໍ. ເພື່ອທົດສອບນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ປູກ hChR2-EYFP-expressing hCO ເຂົ້າໄປໃນ S1, ແລະ 90 ມື້ຕໍ່ມາ, ພວກເຮົາປູກເສັ້ນໃຍ optical ເຂົ້າໄປໃນ t-hCO ສໍາລັບການສົ່ງແສງສະຫວ່າງ. ຈາກນັ້ນພວກເຮົາກໍໄດ້ຝຶກຝົນໜູດ້ວຍຮູບແບບການປັບສະພາບຂອງຜູ້ປະກອບການທີ່ຖືກດັດແປງ (ຮູບ 5h). ພວກເຮົາໄດ້ຈັດວາງສັດໄວ້ໃນຫ້ອງທົດລອງພຶດຕິກໍາ ແລະ ນຳໃຊ້ເລເຊີ 5 ວິນາທີສີຟ້າ (473 nm) ແລະສີແດງ (635 nm). ສັດໄດ້ຮັບລາງວັນນ້ໍາຖ້າພວກເຂົາເລຍໃນລະຫວ່າງການກະຕຸ້ນແສງສະຫວ່າງສີຟ້າແຕ່ບໍ່ໄດ້ເລຍໃນລະຫວ່າງການກະຕຸ້ນແສງສະຫວ່າງສີແດງ. ໃນມື້ທໍາອິດຂອງການຝຶກອົບຮົມ, ສັດບໍ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງໃນການເລຍໃນເວລາທີ່ກະຕຸ້ນດ້ວຍແສງສີຟ້າຫຼືສີແດງ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນມື້ 15, ສັດທີ່ transplanted ກັບ hCO ສະແດງອອກ hChR2-EYFP ສະແດງໃຫ້ເຫັນ licking ມີການເຄື່ອນໄຫວຫຼາຍໃນເວລາທີ່ກະຕຸ້ນດ້ວຍແສງສະຫວ່າງສີຟ້າເມື່ອທຽບກັບການກະຕຸ້ນຂອງແສງສີແດງ. ການປ່ຽນແປງເຫຼົ່ານີ້ໃນພຶດຕິກໍາການ licking ບໍ່ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນສັດຄວບຄຸມ transplanted ກັບ hCO ສະແດງອອກ fluorophore ການຄວບຄຸມ (ອັດຕາຜົນສໍາເລັດການຮຽນຮູ້: hChR2 89%, EYFP 0%, ຮູບ 5i-1 ແລະວິດີໂອເສີມ 2). ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງ t-hCO ສາມາດກະຕຸ້ນ neurons ຫນູເພື່ອກະຕຸ້ນພຶດຕິກໍາການຊອກຫາລາງວັນ. ເພື່ອຊອກຫາວ່າ rat t-hCO ວົງຈອນ neural ໃດອາດຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການປ່ຽນແປງພຶດຕິກໍາເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ເປີດໃຊ້ optogenetically t-hCO ໃນສັດທີ່ໄດ້ຮັບການຝຶກອົບຮົມແລະເນື້ອເຍື່ອຂຸດຄົ້ນ 90 ນາທີຕໍ່ມາ. Immunohistochemistry ເປີດເຜີຍການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ FOS ທີ່ຂຶ້ນກັບກິດຈະກໍາໃນຫຼາຍໆພື້ນທີ່ຂອງສະຫມອງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພຶດຕິກໍາທີ່ກະຕຸ້ນ, ລວມທັງ cortex prefrontal medial, medial thalamus, ແລະ periaqueductal gray matter, ເຊິ່ງສະແດງອອກໃນສັດຄວບຄຸມ unstimulated ຫຼືໃນສັດ. ເຂົ້າ. 5 ມ). ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ແນະນໍາວ່າ t-hCO ສາມາດ modulate ກິດຈະກໍາ neuronal ຫນູເພື່ອຂັບລົດພຶດຕິກໍາ.
organoids Neural ເປັນຕົວແທນຂອງລະບົບທີ່ດີສໍາລັບການສຶກສາການພັດທະນາຂອງມະນຸດແລະພະຍາດໃນ vitro, ແຕ່ພວກມັນຖືກຈໍາກັດໂດຍການຂາດການເຊື່ອມຕໍ່ລະຫວ່າງວົງຈອນທີ່ມີຢູ່ໃນ vivo. ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາແພລະຕະຟອມນະວະນິຍາຍທີ່ພວກເຮົາໄດ້ຖ່າຍທອດ hCO ເຂົ້າໄປໃນ S1 ຂອງຫນູຫຼັງເກີດ immunocompromised ເພື່ອສຶກສາການພັດທະນາຈຸລັງຂອງມະນຸດແລະການເຮັດວຽກຢູ່ໃນ vivo. ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ t-hCO ພັດທະນາປະເພດຂອງເຊນທີ່ແກ່ທີ່ບໍ່ໄດ້ສັງເກດເຫັນໃນ vitro28 ແລະວ່າ t-hCO ແມ່ນປະສົມປະສານທາງດ້ານ anatomically ແລະເຮັດວຽກຢູ່ໃນສະຫມອງຂອງຫນູ. ການເຊື່ອມໂຍງຂອງ t-hCO ເຂົ້າໄປໃນວົງຈອນ neural ຂອງຫນູໄດ້ອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາສ້າງການເຊື່ອມໂຍງລະຫວ່າງກິດຈະກໍາ cellular ຂອງມະນຸດແລະການສຶກສາພຶດຕິກໍາຂອງສັດ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ neurons t-hCO ສາມາດ modulate ກິດຈະກໍາ neuronal ຫນູເພື່ອຂັບລົດການຕອບສະຫນອງທາງດ້ານພຶດຕິກໍາ.
ເວທີທີ່ພວກເຮົາອະທິບາຍມີຂໍ້ໄດ້ປຽບຫຼາຍຢ່າງຕໍ່ກັບການຄົ້ນຄວ້າທີ່ຜ່ານມາກ່ຽວກັບການຖ່າຍທອດຈຸລັງຂອງມະນຸດເຂົ້າໄປໃນສະຫມອງຂອງຫນູ. ຫນ້າທໍາອິດ, ພວກເຮົາ transplanted hCO ເຂົ້າໄປໃນ cortex ການພັດທະນາຂອງຫນູ postnatal ຕົ້ນ, ເຊິ່ງອາດຈະສ້າງຄວາມສະດວກໃນການປະສົມປະສານທາງກາຍະສາດແລະການເຮັດວຽກ. ອັນທີສອງ, ການກວດສອບ t-hCO MRI ອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາສຶກສາຕໍາແຫນ່ງ graft ແລະການຂະຫຍາຍຕົວຂອງສັດທີ່ມີຊີວິດ, ໃຫ້ພວກເຮົາເຮັດການສຶກສາຫຼາຍສັດໃນໄລຍະຍາວແລະສ້າງຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືຂອງສາຍຈຸລັງ hiPS ຫຼາຍສາຍ. ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາປູກ organoids intact, ແທນທີ່ຈະເປັນ suspension ຈຸລັງດຽວທີ່ໂດດດ່ຽວ, ເຊິ່ງທໍາລາຍຈຸລັງຂອງມະນຸດຫນ້ອຍລົງແລະສາມາດສົ່ງເສີມການລວມຕົວແລະການສ້າງ neurons cortex ຂອງມະນຸດໃນສະຫມອງຫນູ.
ພວກເຮົາຮັບຮູ້ວ່າເຖິງວ່າຈະມີຄວາມກ້າວຫນ້າໃນເວທີນີ້, ຂໍ້ຈໍາກັດທາງໂລກ, ທາງກວ້າງຂອງພື້ນ, ແລະຂ້າມຊະນິດປ້ອງກັນການສ້າງຕັ້ງຂອງວົງຈອນ neural ຂອງມະນຸດທີ່ມີຄວາມຊື່ສັດສູງ, ເຖິງແມ່ນວ່າຫຼັງຈາກ transplantation ໃນໄລຍະຕົ້ນຂອງການພັດທະນາ. ຕົວຢ່າງ, ມັນບໍ່ຊັດເຈນວ່າກິດຈະກໍາ spontaneous ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນ t-hCO ເປັນຕົວແທນຂອງການພັດທະນາ phenotype ທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບກິດຈະກໍາຈັງຫວະທີ່ສັງເກດເຫັນໃນລະຫວ່າງການພັດທະນາ cortical, ຫຼືວ່າມັນແມ່ນຍ້ອນບໍ່ມີປະເພດຂອງເຊນສະກັດກັ້ນທີ່ມີຢູ່ໃນ t-hCO. ເຊັ່ນດຽວກັນ, ມັນບໍ່ຊັດເຈນວ່າການຂາດການ lamination ໃນ t-hCO ມີຜົນກະທົບແນວໃດຕໍ່ການເຊື່ອມຕໍ່ຕ່ອງໂສ້30. ການເຮັດວຽກໃນອະນາຄົດຈະສຸມໃສ່ການລວມເອົາປະເພດເຊນອື່ນໆເຊັ່ນ microglia ຂອງມະນຸດ, ຈຸລັງ endothelial ຂອງມະນຸດ, ແລະອັດຕາສ່ວນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ GABAergic interneurons ດັ່ງທີ່ສະແດງໂດຍໃຊ້ການປະກອບ 6 in vitro, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບວິທີການປະສົມປະສານແລະການປຸງແຕ່ງ neural ສາມາດເກີດຂື້ນໃນ t-hCO ປ່ຽນແປງ. ລະດັບການຖ່າຍທອດ, synaptic ແລະພຶດຕິກໍາໃນຈຸລັງທີ່ໄດ້ຮັບຈາກຄົນເຈັບ.
ໂດຍລວມແລ້ວ, ນີ້ໃນເວທີ vivo ເປັນຕົວແທນຂອງຊັບພະຍາກອນທີ່ມີປະສິດທິພາບທີ່ສາມາດເສີມການພັດທະນາສະຫມອງຂອງມະນຸດແລະການຄົ້ນຄວ້າພະຍາດໃນ vitro. ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າເວທີນີ້ຈະອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາຄົ້ນພົບ phenotypes ລະດັບ strand ລະດັບໃຫມ່ໃນຈຸລັງທີ່ມາຈາກຄົນເຈັບທີ່ມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນແລະທົດສອບຍຸດທະສາດການປິ່ນປົວໃຫມ່.
ພວກເຮົາສ້າງ hCO2.5 ຈາກຈຸລັງ HiPS ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້. ເພື່ອເລີ່ມຕົ້ນການຜະລິດ hCO ຈາກຈຸລັງ hiPS ທີ່ລ້ຽງຢູ່ໃນຊັ້ນ feeder, ອານານິຄົມຂອງຈຸລັງ hiPS ທີ່ບໍ່ສະອາດໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກຈາກຖ້ວຍວັດທະນະທໍາໂດຍໃຊ້ dispase (0.35 mg/mL) ແລະໂອນໄປສູ່ວັດທະນະທໍາພລາສຕິກທີ່ຕິດກັບຕ່ໍາສຸດທີ່ມີຖ້ວຍທີ່ມີຕົວກາງວັດທະນະທໍາຈຸລັງ hiPS. (Corning) ເສີມດ້ວຍສອງ SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ແລະ SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ແລະ ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). ໃນລະຫວ່າງ 5 ມື້ທໍາອິດ, ຂະຫນາດກາງຂອງຈຸລັງ hiPS ໄດ້ຖືກປ່ຽນແປງປະຈໍາວັນແລະ dorsomorphine ແລະ SB-431542 ໄດ້ຖືກເພີ່ມ. ໃນມື້ທີ 6 ໃນການ suspension, neural spheroids ໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາ neural media ທີ່ມີ neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplemented without vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin and 10000 life supplemented, streptomycin. ປັດໄຈການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ແລະປັດໄຈການເຕີບໂຕຂອງ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ຈົນເຖິງວັນທີ 24. ຈາກມື້ 25 ຫາມື້ 42, ຂະຫນາດກາງໄດ້ຖືກເສີມດ້ວຍປັດໃຈ neurotrophic ທີ່ມາຈາກສະຫມອງ (BDNF; 20 NT3 3 ມລ); ng ml−1; Peprotech) ມີການປ່ຽນແປງປານກາງທຸກໆມື້. ໃນມື້ທີ 6 ໃນການ suspension, neural spheroids ໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາ neural media ທີ່ມີ neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplemented without vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin and 10000 life supplemented, streptomycin. ປັດໄຈການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ແລະປັດໄຈການເຕີບໂຕຂອງ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ຈົນເຖິງວັນທີ 24. ຈາກມື້ 25 ຫາມື້ 42, ຂະຫນາດກາງໄດ້ຖືກເສີມດ້ວຍປັດໃຈ neurotrophic ທີ່ມາຈາກສະຫມອງ (BDNF; 20 NT3 3 ມລ); ng ml−1; Peprotech) ມີການປ່ຽນແປງປານກາງທຸກໆມື້.ໃນມື້ທີ 6 ໃນການ suspension, spheroids ທາງດ້ານ neural ໄດ້ຖືກໂອນໄປສູ່ neural media ປະກອບດ້ວຍ Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement without vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ແລະ дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и факто фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. ແລະ streptomycin (1:100, Life Technologies) ແລະເສີມດ້ວຍປັດໄຈການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ແລະ fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) ຈົນເຖິງວັນທີ 24.ຈາກມື້ 25 ຫາ 42, ປັດໄຈ neurotrophic ທີ່ມາຈາກສະຫມອງ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ແລະ neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນຂະຫນາດກາງ, ປ່ຽນສື່ກາງທຸກໆມື້.在悬浮的第6天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A的B-27，7，125剅ເທັກໂນໂລຍີ), GlutaMax (1:100, Life Technologies), 青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表嚿素（1:100，Life Technologies）并辅以表嚿四ml-1；R&D Systems)和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24天.在悬浮的第第6天将神经球体转移含有含有 neurobasal-a（10888，Life Technologies）不含维移含有含有 neurobasal-a（10888，現在就加入 Facebook。 （12587，Life Technologies） Glutamax (1:100，Life TechNOGIS青霉素的神经培养基中链霉素（1:100，Life Technologies）青霉素的神经培养基中链霉素（1:100，Life Technologies囐砿囐用盐稭宿） （（20 ng ml-1； r&d Systems）成纤维细胞生长 2（fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies-2задек) витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг); 1м-1 ໃນມື້ 6, neurosphere suspensions ໄດ້ຖືກປ່ຽນໄປເປັນອາຫານເສີມທີ່ມີ neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement without vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin, 1 ຊີວິດການເສີມ (1:100, ເທັກໂນໂລຢີການຈະເລີນເຕີບໂຕ) (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ແລະປັດໄຈການເຕີບໂຕຂອງ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) до 24-го дня. R&D Systems) ຈົນຮອດວັນທີ 24.ຈາກມື້ 25 ຫາ 42, ປັດໄຈ neurotrophic ທີ່ມາຈາກສະຫມອງ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ແລະປັດໄຈ neurotrophic 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນອຸປະກອນວັດທະນະທໍາທຸກໆມື້. ການປ່ຽນແປງຂະຫນາດກາງຫນຶ່ງຄັ້ງ.ເລີ່ມຕົ້ນຈາກມື້ 43, hCO ໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ໃນຂະຫນາດກາງ neurobasal-A ທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການເສີມ (NM; 1088022, Thermo Fisher) ມີການປ່ຽນແປງຂະຫນາດກາງທຸກໆ 4-6 ມື້. ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບ hCO ຈາກຈຸລັງ hiPS ທີ່ລ້ຽງພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ບໍ່ມີອາຫານ, ຈຸລັງ hiPS ໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍ Accutase (AT-104, ປະດິດສ້າງ Cell Technologies) ຢູ່ທີ່ 37°C ສໍາລັບ 7 ນາທີ, ແຍກອອກເປັນຈຸລັງດຽວ, ແລະໃສ່ແຜ່ນ AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies per 10 Esential Cells 3 den) ທີ່ຢູ່ 1 ເຊນດຽວ. 8 ຂະຫນາດກາງເສີມດ້ວຍ ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). ຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງ, ສື່ໃນນໍ້າສ້າງໄດ້ຖືກທໍ່ຂຶ້ນແລະລົງເຂົ້າໄປໃນສື່ທີ່ປະກອບດ້ວຍ Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) ເສີມດ້ວຍ dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ແລະ SB-431542 (10 μM); 161 μM; , Tocrida). ຈາກມື້ 2 ຫາ 6, Essential 6 medium ໄດ້ຖືກທົດແທນປະຈໍາວັນດ້ວຍ dorsomorphine ແລະເສີມ SB-431542. ຈາກມື້ທີຫົກ, suspensions neurosphere ໄດ້ຖືກໂອນໄປສູ່ຂະຫນາດກາງ neurobasal ແລະຮັກສາໄວ້ຕາມທີ່ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.
ຂັ້ນຕອນການລ້ຽງສັດທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍສອດຄ່ອງກັບຄໍາແນະນໍາກ່ຽວກັບການດູແລສັດທີ່ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດໂດຍຄະນະກໍາມະການຄຸ້ມຄອງການດູແລສັດຂອງມະຫາວິທະຍາໄລ Stanford (APLAC). ໜູທີ່ຖືພາ euthymic RNU (rnu/+) ຖືກຊື້ (ຫ້ອງທົດລອງ Charles River) ຫຼືຢູ່ເຮືອນ. ສັດໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນວົງຈອນແສງສະຫວ່າງ - ມືດ 12 ຊົ່ວໂມງດ້ວຍອາຫານແລະນ້ໍາ. ໝາໜູທີ່ເປືອຍກາຍ (FOXN1–/–) ອາຍຸສາມຫາເຈັດມື້ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການເຕີບໃຫຍ່ຂອງຂີ້ໝິ້ນທີ່ຍັງອ່ອນກ່ອນການຂ້າເຊື້ອ. Puppies (ເພດຊາຍແລະຍິງ) ໄດ້ຖືກ anesthetized ດ້ວຍ isoflurane 2-3% ແລະໃສ່ໃນກອບ stereotaxic. ການ trepanation ຂອງກະໂຫຼກຫົວທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງປະມານ 2-3 ມມຂ້າງເທິງ S1 ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນຂະນະທີ່ການຮັກສາຄວາມສົມບູນຂອງ dura mater. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໃຫ້ໃຊ້ເຂັມ 30-G (ປະມານ 0.3 ມມ) ຢູ່ຂ້າງນອກຂອງ craniotomy ເພື່ອເຈາະ dura. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເອົາ HCO ໃສ່ parafilm ບາງໆ 3 × 3 ຊມແລະເອົາຂະຫນາດກາງເກີນ. ການນໍາໃຊ້ເຂັມສັກຢາ Hamilton ຕິດກັບເຂັມ 23 G, 45°, ຄ່ອຍໆແຕ້ມ hCO ເຂົ້າໄປໃນປາຍປາຍສຸດຂອງເຂັມ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຕິດຕັ້ງ syringe ໃນປັ໊ມ syringe ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບອຸປະກອນ stereotaxic. ຈາກນັ້ນວາງປາຍຂອງເຂັມໃສ່ຮູເຈາະກວ້າງ 0.3 ມມ ທີ່ເຮັດກ່ອນໜ້ານີ້ຢູ່ໃນ dura (z = 0 ມມ) ແລະແຄບເຂັມສັກຢາ 1–2 ມມ (z = ປະມານ –1.5 ມມ) ຈົນກ່ວາເຂັມຢູ່ລະຫວ່າງ dura mater A. ມີການປະທັບຕາທີ່ຫນາແຫນ້ນ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຍົກ syringe ໄປຫາສູນກາງຂອງຫນ້າດິນ cortical ທີ່ z = -0.5 ມມແລະການສັກຢາ hCO ໃນອັດຕາ 1-2 µl ຕໍ່ນາທີ. ຫຼັງຈາກສໍາເລັດການສີດ hCO, ເຂັມຖືກຖອດອອກໃນອັດຕາ 0.2-0.5 ມມຕໍ່ນາທີ, ຜິວຫນັງຖືກ sutured, ແລະ puppy ທັນທີຖືກວາງໃສ່ແຜ່ນຄວາມຮ້ອນທີ່ອົບອຸ່ນຈົນກ່ວາການຟື້ນຕົວຢ່າງສົມບູນ. ສັດບາງຊະນິດໄດ້ຖືກນຳໄປປູກແບບສອງຝ່າຍ.
ຂັ້ນຕອນການລ້ຽງສັດທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ແນະນຳການດູແລສັດທີ່ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກມະຫາວິທະຍາໄລສະແຕນຟອດ APLAC. ໜູ (ຫຼາຍກວ່າ 60 ມື້ຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ) ໄດ້ຖືກຊັກຈູງດ້ວຍ 5% isoflurane anesthesia ແລະ anesthetized ດ້ວຍ isoflurane 1-3% ໃນລະຫວ່າງການຖ່າຍຮູບ. ສໍາລັບການເບິ່ງເຫັນ, ເຄື່ອງສະແກນ borehole 7 Tesla ປົກປ້ອງຢ່າງຫ້າວຫັນ Bruker (Bruker Corp.) ກັບບໍລິສັດໄຟຟ້າສາກົນ (IECO) ຂັບ gradient, ໄສ້ເລື່ອນທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງພາຍໃນ 120 ມມ (600 mT / m, 1000 T / m / s) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍໃຊ້ AVANCE. III, ແປດຊ່ອງສັນຍານ RF ແລະຫຼາຍແກນ, ແລະແພລະຕະຟອມ Paravision 6.0.1 ມາພ້ອມກັບ. ການບັນທຶກໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ທໍ່ RF volumetric decoupled ຢ່າງຫ້າວຫັນທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງພາຍໃນ 86 ມມແລະມ້ວນ RF ສີ່ຊ່ອງທີ່ເຢັນດ້ວຍ cryo ສໍາລັບການຮັບເທົ່ານັ້ນ. Axial 2D Turbo-RARE (ເວລາການຊໍ້າຄືນ = 2500 ms, ເວລາ echo = 33 ms, 2 ໂດຍສະເລ່ຍ) ມີ 16 slice captures, slice thickness 0.6–0.8 mm, ບັນຈຸ 256 × 256 ຕົວຢ່າງ. ສັນຍານໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ quadrature transceiver volumetric coil RF ທີ່ມີເສັ້ນຜ່າສູນກາງພາຍໃນ 2 ຊມ (Rapid MR International, LLC). ສຸດທ້າຍ, ໃຊ້ຟັງຊັນການຄາດຄະເນພື້ນຜິວຂອງ Imaris (BitPlane) ໃນຕົວສໍາລັບການສະແດງຜົນ 3D ແລະການວິເຄາະປະລິມານ. ການປູກຖ່າຍທີ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດໄດ້ຖືກກໍານົດວ່າເປັນບ່ອນທີ່ສັນຍານ MRI ທີ່ມີນ້ໍາຫນັກ T2 ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນຢູ່ໃນ hemisphere ທີ່ຖືກໂອນ. ການປະຕິເສດການຕິດຕາໄດ້ຖືກກໍານົດວ່າເປັນການຕິດຕາທີ່ບໍ່ໄດ້ຜະລິດພື້ນທີ່ຂອງສັນຍານ MRI ທີ່ມີນ້ໍາຫນັກ T2 ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງໃນ hemisphere ທີ່ຖືກໂອນ. Subcortical t-hCO ໄດ້ຖືກຍົກເວັ້ນຈາກການວິເຄາະຕໍ່ມາ.
ເພື່ອສະແດງ GCaMP6s ຢ່າງຄົງທີ່ໃນ hCO ສໍາລັບການຖ່າຍຮູບດ້ວຍທາດການຊຽມສອງໂຟຕອນ, ເຊນຂອງ hiPS ໄດ້ຖືກຕິດເຊື້ອກັບ pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ຕິດຕາມດ້ວຍການເລືອກຢາຕ້ານເຊື້ອ. ໂດຍຫຍໍ້, ຈຸລັງໄດ້ຖືກແຍກຕົວກັບ EDTA ແລະຖືກໂຈະຢູ່ໃນ 1 ml ຂອງ Essential 8 ຂະຫນາດກາງທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງປະມານ 300,000 ຈຸລັງທີ່ມີ polybrine (5 μg / ml) ແລະ 15 μlຂອງເຊື້ອໄວຣັສ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກ incubated ໃນ suspension ສໍາລັບ 60 ນາທີແລະແກ່ນໃນຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ 50,000 ເຊນຕໍ່ດີ. ຫຼັງຈາກ confluence, ຈຸລັງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ 5-10 μg ml-1 puromycin ສໍາລັບ 5-10 ມື້ຫຼືຈົນກ່ວາອານານິຄົມທີ່ຫມັ້ນຄົງປາກົດ. ການຕິດເຊື້ອ hCO ສ້ວຍແຫຼມໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ 5 ດ້ວຍການດັດແປງບາງຢ່າງ. ໂດຍຫຍໍ້, ໂອນມື້ 30-45 hCO ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ 1.5 ມລ Eppendorf microcentrifuge ທີ່ມີ 100 µl ຂອງເສັ້ນປະສາດ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ປະມານ 90 µl ຂອງຂະຫນາດກາງໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍ, 3-6 µl ຂອງ lentivirus titer ສູງ (ຈາກ 0.5 x 108 ຫາ 1.2 x 109) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນທໍ່, ແລະ hCO ໄດ້ຖືກໂອນເຂົ້າໄປໃນຫ້ອງອົບເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ຈາກນັ້ນຕື່ມ 90-100 µl ຂອງຂະຫນາດກາງໃສ່ແຕ່ລະທໍ່ແລະສົ່ງຄືນທໍ່ກັບ incubator ຄືນ. ໃນມື້ຕໍ່ມາ, ໂອນ hCO ໄປສູ່ເສັ້ນປະສາດສົດໃນແຜ່ນຕິດຕ່ໍາ. ຫຼັງຈາກ 7 ມື້, hCO ໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາແຜ່ນລຸ່ມແກ້ວ 24 ທີ່ດີສໍາລັບການເບິ່ງເຫັນແລະການປະເມີນຄຸນນະພາບການຕິດເຊື້ອ. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ແລະ pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍ VectorBuilder. Lentivirus ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການທົດລອງສ່ວນໃຫຍ່ເນື່ອງຈາກວ່າມັນຖືກປະສົມປະສານເຂົ້າໃນ genome ເຈົ້າພາບ, ອະນຸຍາດໃຫ້ການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອສາຍຂອງນັກຂ່າວໃນສາຍເຊນທີ່ຕິດເຊື້ອ. ສໍາລັບການຕິດຕາມພະຍາດ rabies, ມື້ 30-45 hCO ໄດ້ຮ່ວມກັບ rabies-ΔG-eGFP ແລະ AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), ລ້າງຢ່າງລະອຽດສໍາລັບ 3 ມື້, ແລະການປູກເຂົ້າໄປໃນຫນູໃນ S1 ແລະຮັກສາຢູ່ໃນ vivo ສໍາລັບ 7-14 ມື້.
ສໍາລັບ immunocytochemistry, ສັດໄດ້ຖືກ anesthetized ແລະ transcardially perfused ກັບ PBS ປະຕິບັດຕາມໂດຍ 4% paraformaldehyde (PFA ໃນ PBS; Electron Microscopy Sciences). ສະຫມອງໄດ້ຖືກສ້ອມແຊມໃນ 4% PFA ສໍາລັບ 2 ຊົ່ວໂມງຫຼືຄ້າງຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C, ເກັບຮັກສາໄວ້ cryopreserved ໃນ 30% sucrose ໃນ PBS ສໍາລັບ 48-72 ຊົ່ວໂມງ, ແລະຝັງຢູ່ໃນ 1: 1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek cryo 30 µ) ແລະ statm 30 µ. (Leica). ສໍາລັບ immunohistochemistry ຂອງພາກສ່ວນຫນາ, ສັດໄດ້ຖືກ perfused ກັບ PBS, ແລະສະຫມອງໄດ້ຖືກ dissected ແລະພາກສ່ວນ coronally ຢູ່ທີ່ 300-400 µm ໂດຍໃຊ້ vibratome (Leica) ແລະພາກສ່ວນໄດ້ຖືກແກ້ໄຂດ້ວຍ 4% PFA ສໍາລັບ 30 ນາທີ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, cryosections ຫຼືພາກສ່ວນຫນາໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ PBS, ສະກັດສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (10% ປົກກະຕິ donkey serum (NDS) ແລະ 0.3% Triton X-100 diluted ໃນ PBS) ແລະສະກັດດ້ວຍການແກ້ໄຂສະກັດຢູ່ທີ່ 4 ° C. – ການຟອກການອົບແມ່ນໄດ້ອົບຄ້າງຄືນ ແລະ ໜຶ້ງສ່ວນໜາເປັນເວລາ 5 ມື້. ພູມຕ້ານທານຫຼັກທີ່ໃຊ້ແມ່ນ: ຕ້ານ NeuN (ຫນູ, 1:500; ab104224, abcam) ຕ້ານ CTIP2 (ຫນູ, 1:300; ab18465, abcam), ຕ້ານ GFAP (ກະຕ່າຍ, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (01ch); GTX13970, GeneTex), ຕ້ານ HNA (ຫນູ, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), ຕ້ານ PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz, 10R), anti-PP (PP: HPA047819, Atlas Antibodies), ຕ້ານ RECA-1 (ຫນູ, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ແບ້, 1:500; AF3075), Netgo 1: 100; 1:100; ab5076, abcam). ພູມຕ້ານທານຫຼັກທີ່ໃຊ້ແມ່ນ: ຕ້ານ NeuN (ຫນູ, 1:500; ab104224, abcam) ຕ້ານ CTIP2 (ໜູ, 1:300; ab18465, abcam), ຕ້ານ GFAP (ກະຕ່າຍ, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (:01ch); GTX13970, GeneTex), ຕ້ານ HNA (ຫນູ, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), ຕ້ານ PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz, 10R), anti-PP (PP: HPA047819, Atlas Antibodies), ຕ້ານ RECA-1 (ຫນູ, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ຕ້ານ SOX9 (ແບ້, 1:500; AFgoat, Systems), 1:500; 1:100; AF1166, R&D Systems), ຕ້ານ STEM121 (ເມົາສ໌ , 1:200; Y40410, Takara Bio), ຕ້ານ SATB2 (ເມົາສ໌, 1:50; ab51502, abcam), ຕ້ານ GAD65/67 (rabbit, 1:49orego, 1:400; 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (кр,8,1:500; abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:1910), 8ab; 1910. анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200, кролик; ພູມຕ້ານທານ), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:35,000), AF&System. нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50), 1:50; анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ແລະ анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). ພູມຕ້ານທານຫຼັກທີ່ໃຊ້ແມ່ນ: ຕ້ານ NeuN (ຫນູ, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), ຕ້ານ GFAP (ກະຕ່າຍ, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP100, 1000; ໄກ່. GeneTex), ຕ້ານ HNA (ຫນູ, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), ຕ້ານ PDGFRA (ກະຕ່າຍ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17, 204PA; ພູມຕ້ານທານ), ຕ້ານ RECA-1 (ຫນູ, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ຕ້ານ SOX9 (ແບ້, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin 106, AF106, AF100, G1a. R&D Systems), ຕ້ານ STEM121 (ເມົາສ໌, 1:200; Y40410, Takara Bio), ຕ້ານ SATB2 (ເມົາສ໌, 1:50; ab51502, abcam), ຕ້ານ GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore: 15ab, 610, ຕ້ານ-6, 10-10; abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，FRA），抗PDG 1:200；sc-338，Santa Cruz),抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，SCAM） 1:100；20357-1-AP,Proteintech),抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems 1:20），ST使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:4，Zo30） -GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500； ABN78，ມິນລິປໍ，1:30 ລ້ານປີ，弊弊200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，SCG2， 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），1:20;Y40410, Takara Bio), ຕ້ານ SATB2 (ຫນູ, 1:50; ab51502, abcam), ຕ້ານ GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) ແລະຕ້ານ IBA1 (ແບ້, 1:100; ab5076, abcam).ພູມຕ້ານທານຕົ້ນຕໍທີ່ໃຊ້ແມ່ນ: ຕ້ານ NeuN (ຫນູ, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako). , ຕ້ານ GFP (ໄກ່, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ຕ້ານ HNA (ຫນູ, 1:200; ab191181, abcam), ຕ້ານ NeuN (ກະຕ່າຍ, 1:500; ABN78, Millipore), ຕ້ານ PDGFRA (ກະຕ່າຍ, 1:00, 200), 1:200; ຕ້ານ PPP1R17 (rabbit, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), anti-RECA-1 (ຫນູ, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анть; 10:20m. Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ແລະ анти-IBA70;1, колик; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), ຕ້ານ SOX9 (ແບ້, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ແບ້, 1:100; AF1166, R&D Systems), ຕ້ານ STEM121 (ຫນູ, 1:200; ຕ້ານການໜູ, Takara241), 1:50; ab51502, abcam), ຕ້ານ GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore), ແລະຕ້ານ IBA1 (ແບ້, 1:100; ab5076, abkam).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ PBS ແລະ incubated ດ້ວຍພູມຕ້ານທານຮອງສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (ພາກສ່ວນແຊ່ແຂງ) ຫຼືຄ້າງຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C (ສ່ວນຫນາ). Alexa Fluor ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງ (ເຕັກໂນໂລຊີຊີວິດ) diluted 1: 1000 ໃນການແກ້ໄຂສະກັດຖືກນໍາໃຊ້. ຫຼັງຈາກການລ້າງດ້ວຍ PBS, ແກນໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນດ້ວຍ Hoechst 33258 (Life Technologies). ສຸດທ້າຍ, ແຜ່ນສະໄລ້ໄດ້ຖືກວາງໃສ່ກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ມີຝາປິດ (Fisher Scientific) ໂດຍໃຊ້ Aquamount (Polysciences) ແລະວິເຄາະໃສ່ກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescent Keyence (BZ-X analyzer) ຫຼື Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) ໃນຮູບພາບ. ຮູບພາບໄດ້ຖືກປຸງແຕ່ງໂດຍໃຊ້ໂຄງການ ImageJ (Fiji). ເພື່ອຄິດໄລ່ອັດຕາສ່ວນຂອງ neurons ຂອງມະນຸດໃນ t-hCO ແລະ rat cortex, ຮູບສີ່ຫລ່ຽມກວ້າງ 387.5 μmໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃຈກາງຂອງ t-hCO, ຢູ່ຫຼືໃກ້ກັບຂອບຂອງ rat cortex. ຂອບໃບຕາຖືກກຳນົດໂດຍການປະເມີນການປ່ຽນແປງຂອງຄວາມໂປ່ງໃສຂອງເນື້ອເຍື່ອ, ແກນ HNA+, ແລະ/ຫຼື ການປະກົດຕົວຂອງເນື້ອເຍື່ອ autofluorescence. ໃນ​ແຕ່​ລະ​ຮູບ​ພາບ​, ຈໍາ​ນວນ​ທັງ​ຫມົດ​ຂອງ NeuN+ ແລະ HNA+ cell ໄດ້​ຖືກ​ແບ່ງ​ອອກ​ໂດຍ​ຈໍາ​ນວນ​ທັງ​ຫມົດ​ຂອງ NeuN+ cell ໃນ​ພື້ນ​ທີ່​ດຽວ​ກັນ​. ເພື່ອຮັບປະກັນວ່າພຽງແຕ່ຈຸລັງທີ່ມີນິວເຄລຍໃນຍົນຮູບພາບໄດ້ຖືກນັບ, ມີພຽງແຕ່ຈຸລັງທີ່ເປັນ Hoechst+ ທີ່ຖືກລວມເຂົ້າໃນການຄິດໄລ່. ສອງຮູບທີ່ແຍກກັນຢ່າງໜ້ອຍ 1 ມມ ແມ່ນສະເລ່ຍເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຜິດພາດທາງສະຖິຕິ.
ຫນຶ່ງອາທິດກ່ອນທີ່ຈະເກັບກໍາຕົວຢ່າງ, ເອົາສັດ transplant hCO (ປະມານ 8 ເດືອນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ) ຢູ່ໃນຫ້ອງຊ້ໍາທີ່ມີ whiskers trimmed ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການກະຕຸ້ນ sensory. ການໂດດດ່ຽວຂອງນິວເຄລຍໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້, ດ້ວຍການດັດແປງບາງຢ່າງ. ໂດຍຫຍໍ້, t-hCO ແລະ hCO ໄດ້ຖືກທໍາລາຍໂດຍໃຊ້ detergent-mechanical lysis ແລະເຄື່ອງປັ່ນເນື້ອເຍື່ອແກ້ວ 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແກນດິບໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງອອກໂດຍໃຊ້ຕົວກອງ 40 µm ແລະ centrifuged ທີ່ 320 g ເປັນເວລາ 10 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C ກ່ອນທີ່ຈະດໍາເນີນການ gradient ຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ sucrose. ຫຼັງຈາກຂັ້ນຕອນການ centrifugation (320 g ສໍາລັບ 20 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C), ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຢຸດຄືນໃຫມ່ໃນ 0.04% BSA / PBS ດ້ວຍການເພີ່ມ 0.2 ຫນ່ວຍຂອງ µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ແລະຜ່ານການກັ່ນຕອງ 40 μm. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ນິວເຄລຍທີ່ແຕກແຍກໄດ້ຖືກຢຸດຄືນໃຫມ່ໃນ PBS ທີ່ມີ 0.02% BSA ແລະຖືກໂຫລດໃສ່ຊິບ Chromium Single Cell 3′ (ຄາດຄະເນການຟື້ນຕົວຂອງ 8,000 ເຊນຕໍ່ເລນ). ຫ້ອງສະໝຸດ snRNA-seq ໄດ້ຖືກກະກຽມດ້ວຍ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). ຫ້ອງສະໝຸດ snRNA-seq ໄດ້ຖືກກະກຽມດ້ວຍ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). ຫ້ອງສະໝຸດ snRNA-seq ໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍໃຊ້ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). ຫ້ອງສະໝຸດ snRNA-seq ໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍໃຊ້ Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).ຫ້ອງສະຫມຸດຈາກຕົວຢ່າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກລວບລວມແລະຈັດລໍາດັບໂດຍ Admera Health on NovaSeq S4 (Illumina).
ລະດັບການສະແດງອອກຂອງພັນທຸກໍາສໍາລັບແຕ່ລະ barcode ນິວເຄລຍຂອງ putative ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ຊຸດຊອບແວການວິເຄາະ 10x Genomics CellRanger (ຮຸ່ນ 6.1.2). ໂດຍສະເພາະ, ການອ່ານໄດ້ຖືກຈັບຄູ່ກັບການລວມກັນຂອງມະນຸດ (GRCh38, Ensemble, ຮຸ່ນ 98) ແລະຫນູ (Rnor_6.0, Ensemble, ຮຸ່ນ 100) genomes ອ້າງອີງທີ່ສ້າງຂຶ້ນດ້ວຍຄໍາສັ່ງ mkref ແລະໃຊ້ການນັບດ້ວຍຄໍາສັ່ງ –include-introns=TRUE ເພື່ອປະລິມານລວມເຖິງການອ່ານແຜນທີ່ກັບພາກພື້ນ intron. ສໍາລັບຕົວຢ່າງ t-hCO, ນິວເຄລຍຂອງມະນຸດໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍອີງໃສ່ຂໍ້ກໍານົດແບບອະນຸລັກວ່າຢ່າງຫນ້ອຍ 95% ຂອງການອ່ານແຜນທີ່ທັງຫມົດກົງກັບ genome ຂອງມະນຸດ. ການວິເຄາະຕໍ່ໄປທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຜົນອອກຂອງອາເຣບາໂຄດທີ່ຖືກກັ່ນຕອງຈາກ CellRanger ໂດຍໃຊ້ຊຸດ R (ຮຸ່ນ 4.1.2) Seurat (ຮຸ່ນ 4.1.1)32.
ເພື່ອຮັບປະກັນວ່າມີພຽງແຕ່ nuclei ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກລວມເຂົ້າໃນການວິເຄາະຕໍ່ໄປ, ຂະບວນການການກັ່ນຕອງແບບຊ້ໍາຊ້ອນໄດ້ຖືກປະຕິບັດສໍາລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງ. ທໍາອິດ, ແກນທີ່ມີຄຸນນະພາບຕ່ໍາທີ່ມີຫນ້ອຍກວ່າ 1000 genes ເປັນເອກະລັກທີ່ພົບເຫັນແລະຫຼາຍກ່ວາ 20% ຂອງ mitochondria ທັງຫມົດໄດ້ຖືກລະບຸແລະເອົາອອກ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, matrix ຈໍານວນ gene ດິບໄດ້ຖືກປັບປຸງເປັນປົກກະຕິໂດຍການຖົດຖອຍ binomial ລົບເປັນປົກກະຕິໂດຍໃຊ້ຟັງຊັນ sctransform(vst.flavor=”v2″), ເຊິ່ງຍັງໄດ້ກໍານົດ 3000 genes ການປ່ຽນແປງຫຼາຍທີ່ສຸດໂດຍໃຊ້ຕົວກໍານົດການເລີ່ມຕົ້ນ. ການຫຼຸດຜ່ອນຂະຫນາດແມ່ນດໍາເນີນຢູ່ໃນ genes ຕົວແປເທິງໂດຍໃຊ້ Analysis ຂອງ Principal parameter (Compion) ຂໍ້ມູນຄ່າເລີ່ມຕົ້ນ. 30 (dims = 30 ຖືກເລືອກໂດຍອີງໃສ່ການກວດກາສາຍຕາຂອງສະຖານທີ່ຫົວເຂົ່າແລະນໍາໃຊ້ສໍາລັບຕົວຢ່າງທັງຫມົດແລະການວິເຄາະກຸ່ມ). ກໍານົດແລະເອົາຈຸລັງ putative ທີ່ມີຄຸນນະພາບຕ່ໍາແລະ/ຫຼືອັດຕາສ່ວນສູງຂອງຝາແຝດທີ່ສົງໃສຖືກລະບຸໂດຍໃຊ້ຊຸດ DoubletFinder33 (ສະເລ່ຍຄະແນນ DoubletFinder ຂ້າງເທິງເປີເຊັນທີ 95). ປະຕິບັດດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.
ຫຼັງຈາກການຖອນເມັດທີ່ມີຄຸນນະພາບຕ່ໍາ, ຊຸດຂໍ້ມູນປະສົມປະສານໄດ້ຖືກຈັດເປັນກຸ່ມ (ຄວາມລະອຽດ = 0.5) ແລະຖືກຝັງໄວ້ເພື່ອຈຸດປະສົງການເບິ່ງເຫັນ UMAP34. genes ເຄື່ອງຫມາຍສໍາລັບແຕ່ລະ cluster ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ຟັງຊັນ FindMarkers ກັບພາລາມິເຕີເລີ່ມຕົ້ນທີ່ຄິດໄລ່ຈາກຂໍ້ມູນການສະແດງອອກຂອງ gene ປົກກະຕິ. ພວກເຮົາກໍານົດແລະຈັດປະເພດຈຸລັງທີ່ສໍາຄັນໂດຍການລວມເອົາຊຸດຂໍ້ມູນການອ້າງອິງ cortical fetal ແລະຜູ້ໃຫຍ່ທີ່ມີການສະແດງອອກຂອງ gene marker 19,20,21,35 ແລະຄໍາບັນຍາຍ. ໂດຍສະເພາະ, ຕົວຊີ້ບອກການໄຫຼວຽນໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການສະແດງອອກຂອງ MKI67 ແລະ TOP2A. ກຸ່ມ Progenitor ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການຂາດການຖອດຂໍ້ຄວາມຈາກ mitotic, ການຊ້ອນກັນສູງກັບກຸ່ມ progenitor glial multipotent ທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ latex metaphase fetal cortex, ແລະການສະແດງອອກຂອງ EGFR ແລະ OLIG1. ພວກເຮົາໃຊ້ຄໍາວ່າ astrocyte ເພື່ອກວມເອົາລັດຈໍານວນຫນຶ່ງຂອງຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ astrocyte, ຈາກ glia radial ທ້າຍຈົນເຖິງການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ astrocytes. ກຸ່ມ Astrocyte ສະແດງເຖິງລະດັບສູງຂອງ SLC1A3 ແລະ AQP4 ແລະໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນແຜນທີ່ທີ່ມີປະເພດຍ່ອຍຂອງ radial glia fetal ແລະ / ຫຼື astrocytes ຜູ້ໃຫຍ່. OPCs ສະແດງ PDGFRA ແລະ SOX10 ໃນຂະນະທີ່ oligodendrocytes ສະແດງເຄື່ອງຫມາຍ myelination (MOG ແລະ MYRF). ເສັ້ນປະສາດ Glutamatergic ຖືກກໍານົດໂດຍການປະກົດຕົວຂອງ neuronal transcripts (SYT1 ແລະ SNAP25), ການຂາດ GABAergic markers (GAD2), ແລະການສະແດງອອກຂອງ NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, ຫຼື SATB2. neurons GluN ໄດ້ຖືກແບ່ງອອກຕື່ມອີກເປັນຊັ້ນເທິງ (ການສະແດງອອກ SATB2 ແລະການສູນເສຍ BCL11B) ແລະຊັ້ນຍ່ອຍ (BCL11B expression) ເລິກ. Putative subplate (SP) neurons ສະແດງເຄື່ອງຫມາຍ SP18 ທີ່ຮູ້ຈັກເຊັ່ນ ST18 ແລະ SORCS1 ນອກເຫນືອຈາກເຄື່ອງຫມາຍ GluN ເລິກ. ຈຸລັງທີ່ຄ້າຍຄື choroid plexus ໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍການສະແດງອອກ TTR, ແລະຈຸລັງທີ່ຄ້າຍຄື meningeal ສະແດງພັນທຸກໍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ fibroblast ແລະຈຸລັງ pial / vascular ແຜນທີ່ຂອງຊຸດຂໍ້ມູນອ້າງອີງ.
ການວິເຄາະຄວາມແຕກຕ່າງຂອງການສະແດງອອກຂອງ gene ລະຫວ່າງ t-hCO ແລະ hCO subclasses ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ວິທີການ pseudo-batch ທີ່ພັດທະນາໃຫມ່ທີ່ຜະລິດຄືນໃຫມ່ໃນຕົວຢ່າງທີ່ປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊຸດ Libra R (ຮຸ່ນ 1.0.0). ໂດຍສະເພາະ, ການທົດສອບຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ edgeR (ຮຸ່ນ 3.36.0, ຊຸດ R) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດສໍາລັບກຸ່ມໂດຍການລວມເອົາຈໍານວນ genes ໃນຈຸລັງສໍາລັບຊັ້ນຈຸລັງທີ່ກໍານົດສໍາລັບການຈໍາລອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງ. ສໍາລັບການເບິ່ງເຫັນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນ, normalized per million (CPM) values ​​are computed using edgeR (cpm() function) ແລະ scaled (ເພື່ອບັນລຸ mean = 0, standard deviation = 1). ການວິເຄາະການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Gene Ontology (GO) ຂອງ genes t-hCO GluN ທີ່ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໄດ້ຖືກປະຕິບັດ (Benjamini-Hochberg ແກ້ໄຂຄ່າ P ຫນ້ອຍກວ່າ 0.05 ສະແດງອອກໃນຢ່າງຫນ້ອຍ 10% ຂອງຈຸລັງ t-hCO GluN ແລະການເພີ່ມຂື້ນຂອງການປ່ຽນແປງຢ່າງຫນ້ອຍ 2 ເທື່ອ). ປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ TopGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. ພວກເຮົາໃຊ້ແອັບ ToppFun ທີ່ມີຕົວກໍານົດການເລີ່ມຕົ້ນແລະລາຍງານ P-values ​​ທີ່ຖືກແກ້ໄຂ Benjamini-Hochberg ​​ຈາກການທົດສອບ GO-annotated hypergeometric.
ເພື່ອຈັບຄູ່ກຸ່ມ snRNA-seq ຂອງພວກເຮົາກັບກຸ່ມເຊນທີ່ລະບຸໄວ້ຈາກການສຶກສາອ້າງອີງຂອງ RNA-seq ເຊນດຽວຕົ້ນຕໍ ຫຼື snRNA-seq19,20,21,22, ພວກເຮົາໄດ້ນຳໃຊ້ວິທີການລວມຊຸດຂໍ້ມູນແບບຄູ່. ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ຂັ້ນຕອນການເຮັດວຽກປົກກະຕິຂອງ SCTransform (v2) ໃນ Seurat ເພື່ອປະສົມປະສານ ແລະປຽບທຽບການທັບຊ້ອນຂອງກຸ່ມລະຫວ່າງຊຸດຂໍ້ມູນ (ໂດຍໃຊ້ຕົວກໍານົດການດຽວກັນກັບຂ້າງເທິງ). ຊຸດຂໍ້ມູນສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ຖືກຈັດແບ່ງແບບສຸ່ມເຖິງ 500 ເຊລ ຫຼື ແກນຕໍ່ກຸ່ມຕົ້ນສະບັບເພື່ອປະສິດທິພາບການຄຳນວນ. ການນໍາໃຊ້ວິທີການທີ່ຄ້າຍຄືກັນດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້, ການຊ້ອນກັນຂອງກຸ່ມໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນອັດຕາສ່ວນຂອງຈຸລັງຫຼື nuclei ໃນແຕ່ລະກຸ່ມທີ່ລວມກັນທີ່ທັບຊ້ອນກັນກັບປ້າຍຊື່ຂອງກຸ່ມອ້າງອີງ. ເພື່ອຈັດປະເພດ GluNs ຕື່ມອີກ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ຂັ້ນຕອນການເຮັດວຽກຂອງ TransferData ຂອງ Seurat ສໍາລັບຂໍ້ມູນຊຸດຍ່ອຍ GluN ເພື່ອກໍານົດປ້າຍກຳກັບຊຸດຂໍ້ມູນອ້າງອີງໃຫ້ກັບເຊລ GluN ຂອງພວກເຮົາ.
ເພື່ອປະເມີນສະຖານະພາບການເຕີບໃຫຍ່ຂອງບົດບັນທຶກທົ່ວໂລກຂອງຕົວຢ່າງ t-hCO ແລະ hCO, ພວກເຮົາໄດ້ປຽບທຽບຕົວຢ່າງ pseudo-bulk ຂອງພວກເຮົາກັບ BrainSpan/psychENCODE23, ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍລໍາດັບ RNA ຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ກວມເອົາການພັດທະນາສະຫມອງຂອງມະນຸດ. ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດ PCA ໃນ matrix ການສະແດງອອກຂອງ gene ທີ່ມີຮູບແບບປົກກະຕິຈາກຕົວຢ່າງ cortical 10 ອາທິດຫຼັງຈາກ conception ແລະຕໍ່ມາ, ໃນ 5567 genes (ຮ່ວມກັບຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາ) ທີ່ໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ວ່າມີການເຄື່ອນໄຫວຢູ່ໃນ BrainSpan cortical ຕົວຢ່າງ (ກໍານົດຫຼາຍກ່ວາ 50% ໃນການປ່ຽນແປງການພັດທະນາທີ່ອະທິບາຍໂດຍອາຍຸ 38. cubic model) ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ຮັບພັນທຸກໍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບລາຍເຊັນ transcriptome ທີ່ສໍາຄັນຂອງການພັດທະນາ neuro ໂດຍໃຊ້ matrix factorization ທີ່ບໍ່ແມ່ນທາງລົບຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍກ່ອນຫນ້ານີ້. ນ້ ຳ ໜັກ ຕົວຢ່າງທີ່ຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ຂັ້ນຕອນການແຍກຕົວປະກອບ matrix ທີ່ບໍ່ແມ່ນລົບແມ່ນຖືກວາງແຜນໄວ້ໃນຮູບ. 5b ກັບຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍສໍາລັບແຕ່ລະຫ້າລາຍເຊັນທີ່ອະທິບາຍໂດຍ Zhu et al.38. ອີກເທື່ອຫນຶ່ງ, ກິດຈະກໍາທີ່ຂຶ້ນກັບການຖອດຂໍ້ຄວາມແມ່ນໄດ້ມາຈາກການສຶກສາທີ່ຈັດພີມມາກ່ອນຫນ້ານີ້. ໂດຍສະເພາະ, ERG ແລະ LRG ໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ neurons glutamatergic ທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍການລວບລວມຂໍ້ມູນຂອງ mouse visual cortex snRNA-seq ຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນສາຍຕາຈາກຕາຕະລາງເສີມ 3 Hrvatin et al.16. LRGs ທີ່ອຸດົມດ້ວຍມະນຸດແມ່ນໄດ້ຮັບຈາກ KCl-activated human fetal cultures and harvested 6 hours post-stimulation, and the filtered genes are significantly upregulated in humans but not in rodents (ຕາຕະລາງເສີມ 4). ການວິເຄາະການເສີມສ້າງຊຸດ gene ໂດຍໃຊ້ຊຸດ gene ເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ການທົດສອບອັນດຽວຂອງ Fisher.
anesthetize ຫນູທີ່ມີ isoflurane, ເອົາສະຫມອງແລະສະຖານທີ່ເຢັນ (ປະມານ 4 ° C) ອົກຊີເຈນທີ່ (95% O2 ແລະ 5% CO2) ການແກ້ໄຂ sucrose ສໍາລັບພາກສ່ວນທີ່ປະກອບດ້ວຍ: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ແລະ 0.5 mM CaCl2 (ປະມານ 310 mOsm). ພາກສ່ວນຂອງສະໝອງຂອງໜູ (300–400 µm) ທີ່ບັນຈຸ t-hCO ແມ່ນເຮັດດ້ວຍເຄື່ອງສັ່ນສະເທືອນ Leica VT1200 ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້39. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາຫ້ອງສ່ວນທີ່ມີອົກຊີເຈນທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງປະກອບດ້ວຍ aCSF ກະກຽມຈາກ: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ແລະ 126 mOsm NaCl (298 mOsm). ຢ່າງໜ້ອຍ 45 ນາທີກ່ອນການບັນທຶກ. ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນຫ້ອງ immersed ບ່ອນທີ່ພວກເຂົາໄດ້ຖືກ perfused ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງດ້ວຍ aCSF (95% O2 ແລະ 5% CO2 vial). ຂໍ້ມູນທັງໝົດຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. neurons t-hCO ໄດ້ຖືກຢຸດເຊົາດ້ວຍທໍ່ແກ້ວ borosilicate ເຕັມໄປດ້ວຍການແກ້ໄຂທີ່ມີ 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ແລະ 0.6 mM EGTA, pH 7.2, ການແກ້ໄຂພາຍໃນ 20 mKO (29 mKO sm). ເພື່ອຟື້ນຕົວ, biocytin (0.2%) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນການແກ້ໄຂບັນທຶກ.
ຂໍ້ມູນໄດ້ມາໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຂະຫຍາຍສຽງ MultiClamp 700B (ອຸປະກອນໂມເລກຸນ) ແລະຕົວຂະຫຍາຍ Digidata 1550B (ອຸປະກອນໂມເລກຸນ), low-pass filtered at 2 kHz, digitized at 20 kHz, and analysis using Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ແລະຟັງຊັນ MATLAB ແບບກຳນົດເອງ (Mathworks). ທ່າແຮງຂອງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ JPCalc ແລະລາຍການໄດ້ຖືກປັບເປັນຄ່າທີ່ຄິດໄລ່ຂອງ -14 mV. ການດໍາເນີນງານ IV ປະກອບດ້ວຍຊຸດຂອງຂັ້ນຕອນປະຈຸບັນໃນ 10-25 pA ຂັ້ນຕອນ, ຈາກ -250 ຫາ 750 pA.
ສານ thalamus, ສີຂາວ, ແລະ S1 afferents ໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍໄຟຟ້າໃນຕ່ອນ thalamocortical ໃນລະຫວ່າງການບັນທຶກ patch-clamp ຂອງ neurons hCO, ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້. ໂດຍຫຍໍ້, ສະໝອງຖືກວາງຢູ່ເທິງໂຕະພິມ 3 ມິຕິທີ່ອຽງເປັນມຸມ 10°, ແລະດ້ານໜ້າຂອງສະໝອງຖືກຕັດເປັນມຸມ 35°. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສະຫມອງໄດ້ຖືກກາວກັບຫນ້າດິນທີ່ຖືກຕັດແລະແຍກອອກ, ຮັກສາ axons thalamocortical protruding. ໄຟຟ້າ tungsten bipolar (0.5 MΩ) ຖືກຕິດຕັ້ງຢູ່ໃນ micromanipulator ທີສອງແລະວາງຍຸດທະສາດເພື່ອກະຕຸ້ນສີ່ພາກພື້ນຕໍ່ຈຸລັງ (ແຄບຊູນພາຍໃນ, ສີຂາວ, S1 ແລະ hCO). ບັນທຶກການຕອບສະໜອງ synaptic ຫຼັງຈາກ 300 µA phasic stimulation ທີ່ 0.03–0.1 Hz.
hChR2-expressing hCO neurons ໄດ້ຖືກເປີດໃຊ້ຢູ່ທີ່ 480 nm ແລະ pulses ແສງສະຫວ່າງທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ LED (Prizmatix) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍຜ່ານຈຸດປະສົງ ×40 (0.9 NA; Olympus) ເພື່ອບັນທຶກການສະແດງອອກ hChR2 ຢູ່ໃກ້ກັບຈຸລັງ. ເສັ້ນຜ່າສູນກາງຂອງພາກສະຫນາມ illuminated ແມ່ນປະມານ 0.5 ມມແລະພະລັງງານທັງຫມົດແມ່ນ 10-20 mW. ຄວາມກວ້າງຂອງກໍາມະຈອນຖືກຕັ້ງເປັນ 10 ms, ເຊິ່ງກົງກັບກໍາມະຈອນທີ່ໄດ້ຮັບໃນລະຫວ່າງການທົດລອງການຮຽນຮູ້ພຶດຕິກໍາ. ຄວາມຖີ່ຂອງການກະຕຸ້ນຕ່າງໆໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້, ຈາກ 1 ຫາ 20 Hz, ແຕ່ວ່າພຽງແຕ່ກໍາມະຈອນທໍາອິດຂອງຊຸດໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບປະລິມານ. ໄລຍະຫ່າງລະຫວ່າງລົດໄຟໂດຍປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນຍາວກວ່າ 30 ວິນາທີເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຕໍ່ synaptic inhibitory ຫຼືການອໍານວຍຄວາມສະດວກໃນເສັ້ນທາງ. ເພື່ອທົດສອບວ່າການຕອບສະຫນອງຂອງ hChR2 ແມ່ນ monosynaptic, ພວກເຮົານໍາໃຊ້ TTX (1 μM) ໃນອາບນ້ໍາຈົນກ່ວາປະຕິກິລິຍາ EPSC ຫາຍໄປ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນໍາໃຊ້ 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). ໂດຍປົກກະຕິ, ການຕອບສະ ໜອງ ຈະຖືກສົ່ງຄືນພາຍໃນສອງສາມນາທີ, ມີການຊັກຊ້າເລັກນ້ອຍລະຫວ່າງການໄຟ LED ແລະການຜະລິດ EPSC. NBQX (10 μM) ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອທົດສອບວ່າການຕອບສະຫນອງແມ່ນຂັບເຄື່ອນໂດຍ AMPA receptors.
ພາກສ່ວນ hCO ແຫຼມຖືກສ້າງຂື້ນຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້. ໂດຍຫຍໍ້, ພາກສ່ວນ hCO ໄດ້ຖືກຝັງຢູ່ໃນ 4% agarose ແລະຖືກໂອນໄປຫາຈຸລັງທີ່ມີ 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ແລະ 10 mM d-ose(20µg) - 30μg. ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງສັ່ນ Leica VT1200 ແລະເກັບໄວ້ໃນ ASF ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການບັນທຶກ patch-camp ຂອງຈຸລັງທັງຫມົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນພາກສ່ວນ hCO ພາຍໃຕ້ກ້ອງຈຸລະທັດ SliceScope ໂດຍກົງ (ວິທະຍາສາດ). ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກ perfused ກັບ aCSF (95% O2 ແລະ 5% CO2) ແລະສັນຍານໂທລະສັບມືຖືໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. hCO neurons ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍໃຊ້ pipette ແກ້ວ borosilicate ເຕັມໄປດ້ວຍການແກ້ໄຂທີ່ມີ 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ແລະ 0.6 mM EGTA, pH ພາຍໃນ 7, 2, ປັບດ້ວຍ KOH (osmolarity). ສໍາລັບຈຸດປະສົງການຟື້ນຕົວ, ເພີ່ມ 0.2% Biocytin ກັບການແກ້ໄຂພາຍໃນ.
ຂໍ້ມູນແມ່ນໄດ້ມາໂດຍ Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ໂດຍໃຊ້ MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) ແລະ Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), low-pass filtered at 2 kHz, digitized at 20 kHz, and fitted version 1. ຟັງຊັນ MATLAB ແບບກຳນົດເອງ (MATLAB 2019b, Mathworks). ທ່າແຮງທາງແຍກໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ JPCalc ແລະລາຍການຕ່າງໆໄດ້ຖືກປັບໃຫ້ເປັນທ່າແຮງທາງແຍກທີ່ຖືກຄິດໄລ່ຂອງ -14 mV. ການດໍາເນີນງານ IV ປະກອບດ້ວຍຊຸດຂອງຂັ້ນຕອນປະຈຸບັນໃນ 5-10 pA ຂັ້ນຕອນຈາກ -50 ຫາ 250 pA.
ສໍາລັບການຟື້ນຟູ morphological ຂອງ neurons pinched, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນການແກ້ໄຂພາຍໃນ. ຈຸລັງໄດ້ຖືກ primed ຢ່າງຫນ້ອຍ 15 ນາທີຫຼັງຈາກ hacking. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ທໍ່ທໍ່ນັ້ນຖືກດຶງອອກມາຢ່າງຊ້າໆໃນເວລາ 1-2 ນາທີຈົນກ່ວາເຍື່ອທີ່ລົງທະບຽນຈະປິດຢ່າງສົມບູນ. ປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນການ Physiology ຂອງພາກສ່ວນ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກແກ້ໄຂຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C. ໃນ 4% PFA, ລ້າງດ້ວຍ PBS X3, ແລະເຈືອຈາງ 1:1000 ດ້ວຍ streptavidin-conjugated DyLight 549 ຫຼື DyLight 405 (Vector Labs). ຈຸລັງທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍ biocytin (2%; Sigma-Aldrich) ໄດ້ຖືກຕິດສະຫຼາກໃນລະຫວ່າງການບັນທຶກ patch clamp ຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກຕິດຢູ່ເທິງແຜ່ນສະໄລ້ກ້ອງຈຸລະທັດໂດຍໃຊ້ Aquamount (Thermo Scientific) ແລະສະແດງພາບໃນມື້ຕໍ່ມາໃນກ້ອງຈຸລະທັດເຊື່ອມຕໍ່ Leica TCS SP8 ໂດຍໃຊ້ຈຸດປະສົງການແຊ່ນ້ໍາມັນທີ່ມີຮູຮັບແສງເປັນຕົວເລກ ×40 1.3, ການຂະຫຍາຍ ×0.9–1.0, xy. ອັດຕາການເກັບຕົວຢ່າງແມ່ນປະມານ 7 pixels ຕໍ່ micron. Z-stacks ໃນຊ່ວງ 1 µm ໄດ້ຖືກຮັບເປັນລໍາດັບ, ແລະ z-stack mosaics ແລະການ stitching ອັດຕະໂນມັດໂດຍອີງໃສ່ Leica ໄດ້ຖືກປະຕິບັດເພື່ອໃຫ້ກວມເອົາຕົ້ນໄມ້ dendritic ທັງຫມົດຂອງແຕ່ລະ neuron. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, Neurons ໄດ້ຖືກຕິດຕາມເຄິ່ງຄູ່ມືໂດຍໃຊ້ອິນເຕີເຟດ neuTube 40 ແລະໄຟລ໌ SWC ໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໄຟລ໌ດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກອັບໂຫລດໄປຍັງ plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, ຮຸ່ນ 2.1.0; NIH).
ເນື້ອເຍື່ອ cortical ຂອງມະນຸດແມ່ນໄດ້ຮັບການຍິນຍອມເຫັນດີໂດຍອີງຕາມພິທີການອະນຸມັດໂດຍຄະນະກໍາມະການກວດກາສະຖາບັນຂອງມະຫາວິທະຍາໄລ Stanford. ສອງຕົວຢ່າງຂອງເນື້ອເຍື່ອຫຼັງເກີດຂອງມະນຸດ (ອາຍຸ 3 ແລະ 18 ປີ) ໄດ້ຮັບໂດຍການຜ່າຕັດຂອງ cortex ດ້ານຫນ້າ (middle frontal gyrus) ເປັນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງການຜ່າຕັດສໍາລັບພະຍາດບ້າຫມູ refractory. ຫຼັງຈາກການຜ່າຕັດແລ້ວ, ການເກັບກ່ຽວເນື້ອເຍື່ອໃນນ້ຳກ້ອນ NMDG-aCSF ທີ່ບັນຈຸ: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea, 5 mM sodium pyru5 mM, sodium ascorb. CaCl2 4H2O ແລະ 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate ກັບ pH 7.3-7.4 ດ້ວຍອາຊິດ hydrochloric ເຂັ້ມຂຸ້ນ. ເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກສົ່ງໃຫ້ຫ້ອງທົດລອງພາຍໃນ 30 ນາທີແລະພາກສ່ວນ coronal ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.
ຂັ້ນຕອນການລ້ຽງສັດທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ແນະນຳການດູແລສັດທີ່ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກມະຫາວິທະຍາໄລສະແຕນຟອດ APLAC. ໜູ (ຫຼາຍກວ່າ 140 ມື້ຫຼັງການປ່ຽນຖ່າຍ) ໄດ້ຖືກຊັກຈູງດ້ວຍການໃຫ້ຢາສລົບ isoflurane 5% ແລະຢາສລົບດ້ວຍ 1-3% isoflurane intraoperatively. ສັດໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນກອບ stereotaxic (Kopf) ແລະ buprenorphine ການປ່ອຍຕົວແບບຍືນຍົງ (SR) ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນຜິວຫນັງ. ກະໂຫຼກໄດ້ຖືກເປີດເຜີຍ, ເຮັດຄວາມສະອາດແລະ 3-5 screws ກະດູກຖືກໃສ່. ເພື່ອກໍານົດເປົ້າຫມາຍ t-hCO, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຈຸດປະສານງານ stereotaxic ຈາກຮູບພາບ MRI. ຂຸມ burr ໄດ້ຖືກເຈາະຢູ່ບ່ອນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈແລະເສັ້ນໃຍ (ເສັ້ນຜ່າກາງ 400 µm, NA 0.48, Doric) ຖືກຫຼຸດລົງ 100 µm ພາຍໃຕ້ຫນ້າດິນ hCO ແລະຮັບປະກັນກັບກະໂຫຼກດ້ວຍຊີມັງ UV-curable ແຂ້ວ (Relyx).
ການບັນທຶກ photometric ເສັ້ນໄຍໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້42. ເພື່ອບັນທຶກກິດຈະກໍາ spontaneous, ຫນູໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນ cage ສະອາດແລະສາຍ patch ເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 400 µm ໃຍແກ້ວນໍາແສງ (Doric) ເຊື່ອມຕໍ່ກັບລະບົບການໄດ້ຮັບຂໍ້ມູນເສັ້ນໄຍ optic photometric ໄດ້ເຊື່ອມຕໍ່ກັບສາຍໃຍແກ້ວນໍາແສງ implanted. ໃນ​ລະ​ຫວ່າງ​ການ​ບັນ​ທຶກ​ການ 10 ນາ​ທີ​ຂອງ​ກິດ​ຈະ​ກໍາ​ຍານ​ຍົນ​, ສັດ​ສາ​ມາດ​ສໍາ​ຫຼວດ cage ໄດ້​. ເພື່ອບັນທຶກກິດຈະກໍາທີ່ຖືກກະຕຸ້ນ, ຫນູ (ຫຼາຍກວ່າ 140 ມື້ຫຼັງຈາກການປູກຖ່າຍ) ໄດ້ຖືກ anesthetized ດ້ວຍ 5% isoflurane ສໍາລັບການ induction ແລະ 1-3% isoflurane ສໍາລັບການບໍາລຸງຮັກສາ. ວາງສັດຢູ່ໃນກອບ stereotactic (Kopf) ແລະ whiskers ຢູ່ດ້ານກົງກັນຂ້າມຂອງ t-hCO ຖືກຕັດອອກປະມານ 2 ຊມແລະຜ່ານຕາຫນ່າງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ actuator piezoelectric (PI). ສາຍເສັ້ນໃຍແກ້ວນໍາແສງຂະໜາດ 400 µm (Doric) ໄດ້ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເສັ້ນໄຍທີ່ຝັງໄວ້ ແລະ ເຊື່ອມຕໍ່ກັບລະບົບການຮັບຂໍ້ມູນ. whiskers ໃນດ້ານກົງກັນຂ້າມຂອງ t-hCO ໄດ້ຖືກ deflected 50 ເທື່ອ (2 ມມຢູ່ທີ່ 20 Hz, 2 s ຕໍ່ການນໍາສະເຫນີ) ໃນເວລາສຸ່ມໂດຍໄດ piezoelectric ໃນໄລຍະການບັນທຶກ 20 ນາທີ. ໃຊ້ Arduino MATLAB Support Package ເພື່ອຄວບຄຸມເວລາ deflection ດ້ວຍລະຫັດ MATLAB ແບບກຳນົດເອງ. ເຫດການຖືກ synchronized ກັບຊອບແວທີ່ໄດ້ມາຂໍ້ມູນໂດຍໃຊ້ transistor-transistor logic (TTL) pulses.
ໜູ (ຫຼາຍກວ່າ 140 ມື້ຫຼັງການປ່ຽນຖ່າຍ) ໄດ້ຖືກຊັກຈູງດ້ວຍການໃຫ້ຢາສລົບ isoflurane 5% ແລະຢາສລົບດ້ວຍ 1-3% isoflurane intraoperatively. ສັດໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນກອບ stereotaxic (Kopf) ແລະ buprenorphine SR ແລະ dexamethasone ໄດ້ຖືກສີດ subcutaneously. ກະໂຫຼກໄດ້ຖືກເປີດເຜີຍ, ເຮັດຄວາມສະອາດແລະ 3-5 screws ກະດູກຖືກໃສ່. ເພື່ອກໍານົດເປົ້າຫມາຍ t-hCO, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຈຸດປະສານງານ stereotaxic ຈາກຮູບພາບ MRI. ການຜ່າຕັດເສັ້ນປະສາດເປັນວົງກົມ (ເສັ້ນຜ່າສູນກາງປະມານ 1 ຊຕມ) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍການເຈາະຄວາມໄວສູງໂດຍກົງໃສ່ hCO ທີ່ປູກແລ້ວ. ເມື່ອກະດູກບາງທີ່ສຸດເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້, ແຕ່ກ່ອນທີ່ຈະເຈາະຜ່ານກະດູກທັງຫມົດ, ໃຫ້ໃຊ້ forceps ເພື່ອເອົາແຜ່ນກະດູກທີ່ຍັງເຫຼືອທີ່ບໍ່ສະອາດອອກເພື່ອເປີດເຜີຍ t-hCO ທີ່ຕິດພັນ. Craniotomy ໄດ້ເຕີມລົງໄປດ້ວຍນ້ໍາເຄັມເປັນຫມັນ, ແລະຝາປິດແລະຫົວພິເສດໄດ້ຖືກຕິດກັບກະໂຫຼກຫົວດ້ວຍຊີມັງແຂ້ວ UV (Relyx).
ການຖ່າຍຮູບສອງໂຟຕອນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ Bruker multiphoton ດ້ວຍຈຸດປະສົງ Nikon LWD (×16, 0.8 NA). ການຖ່າຍຮູບ GCaMP6 ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 920 nm ດ້ວຍການຂະຫຍາຍ 1.4x ຍົນ z ດຽວແລະ 8x ໂດຍສະເລ່ຍຂອງ 7.5 fps. ຫນູຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍຢາສະລົບ isoflurane 5% ແລະຮັກສາດ້ວຍ isoflurane 1-3%. ໜູຖືກວາງໄວ້ໃນເຄື່ອງຕັດຫົວທີ່ເຮັດເອງ ແລະວາງຢູ່ກ້ອງເລນ. ໄດ້ຮັບການບັນທຶກປະຫວັດການເຄື່ອນໄຫວຂອງມໍເຕີເປັນເວລາ 3 ນາທີ. ໃນໄລຍະ 20 ນາທີຂອງການບັນທຶກ, 50 puffs (ແຕ່ລະນໍາສະເຫນີ 100 ms ຍາວ) ໄດ້ຖືກສົ່ງໂດຍສຸ່ມໃສ່ແຜ່ນ whisker ກົງກັນຂ້າມ t-hCO ໂດຍໃຊ້ picospricer. ໃຊ້ Arduino MATLAB Support Package ເພື່ອຄວບຄຸມເວລາລະເບີດດ້ວຍລະຫັດ MATLAB ແບບກຳນົດເອງ. synchronize ເຫດການກັບຊອບແວທີ່ໄດ້ມາຂໍ້ມູນ (PrairieView 5.5) ໂດຍໃຊ້ TTL pulses. ສໍາລັບການວິເຄາະ, ຮູບພາບໄດ້ຖືກແກ້ໄຂສໍາລັບການເຄື່ອນໄຫວ xy ໂດຍໃຊ້ການແກ້ໄຂ affine ໃນໂຄງການ MoCo ທີ່ເປີດຕົວໃນຟິຈິ. ການສະກັດເອົາຮ່ອງຮອຍ fluorescent ຈາກແຕ່ລະຈຸລັງໂດຍໃຊ້ CNMF-E43. Fluorescence ຖືກສະກັດອອກສໍາລັບແຕ່ລະຂົງເຂດທີ່ມີຄວາມສົນໃຈ, ປ່ຽນເປັນເສັ້ນໂຄ້ງ dF/F, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນປ່ຽນເປັນ z-scores.
ໜູ (ຫຼາຍກວ່າ 140 ມື້ຫຼັງການປ່ຽນຖ່າຍ) ໄດ້ຖືກຊັກຈູງດ້ວຍການໃຫ້ຢາສລົບ isoflurane 5% ແລະຢາສລົບດ້ວຍ 1-3% isoflurane intraoperatively. ສັດໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນກອບ stereotaxic (Kopf) ແລະ buprenorphine SR ແລະ dexamethasone ໄດ້ຖືກສີດ subcutaneously. ເຄື່ອງປັ່ນປ່ວນຢູ່ດ້ານກົງກັນຂ້າມຂອງ t-hCO ຖືກຕັດອອກປະມານ 2 ຊຕມແລະ threaded ຜ່ານຕາຫນ່າງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບຕົວກະຕຸ້ນ piezoelectric. ກະໂຫຼກຖືກເປີດເຜີຍແລະເຮັດຄວາມສະອາດ. ສະກູດິນສະແຕນເລດຕິດຢູ່ກັບກະໂຫຼກຫົວ. ເພື່ອກໍານົດເປົ້າຫມາຍ t-hCO, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຈຸດປະສານງານ stereotaxic ຈາກຮູບພາບ MRI. ດໍາເນີນການ craniotomy ວົງ (ປະມານປະມານ 1 ຊຕມໃນເສັ້ນຜ່າກາງ) ດ້ວຍການເຈາະຄວາມໄວສູງພຽງແຕ່ຂ້າງເທິງ t-hCO. ເມື່ອກະດູກບາງທີ່ສຸດເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້, ແຕ່ກ່ອນທີ່ຈະເຈາະຜ່ານກະດູກທັງຫມົດ, ໃຫ້ໃຊ້ forceps ເພື່ອເອົາແຜ່ນກະດູກທີ່ຍັງເຫຼືອທີ່ບໍ່ສະອາດອອກເພື່ອເປີດເຜີຍ t-hCO ທີ່ຕິດພັນ. ຈຸລັງສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໂດຍໃຊ້ 32-channel ຫຼື 64-channel ຊິລິຄອນຄວາມຫນາແຫນ້ນສູງ probes (Cambridge Neurotech) grounded ກັບ screws ດິນແລະ pre-amplified ກັບ RHD amplifiers (Intan). ໃຊ້ການຫມູນໃຊ້ເພື່ອຫຼຸດ electrodes ໄປຫາສະຖານທີ່ເປົ້າຫມາຍໂດຍຜ່ານ craniotomy, ເຊິ່ງເຕັມໄປດ້ວຍນ້ໍາເຄັມເປັນຫມັນ. ການເກັບຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຄວາມຖີ່ຂອງ 30 kHz ໂດຍໃຊ້ລະບົບການເກັບຂໍ້ມູນ Open Ephys. ການບັນທຶກໄດ້ສືບຕໍ່ພຽງແຕ່ໃນເວລາທີ່ພວກເຮົາກວດພົບກິດຈະກໍາ spontaneous rhythmic ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງສູງໃນຫຼາຍກ່ວາ 10 ຊ່ອງ, ແນະນໍາວ່າ electrodes ໄດ້ຕັ້ງຢູ່ໃນ graft ໄດ້ (ອີງໃສ່ຂໍ້ມູນການຖ່າຍຮູບດ້ວຍທາດການຊຽມສອງ photon). ໄດ້ຮັບການບັນທຶກການເຄື່ອນໄຫວໃນພື້ນຫຼັງເປັນເວລາ 10 ນາທີ. whiskers ໃນດ້ານກົງກັນຂ້າມຂອງ t-hCO ໄດ້ຖືກ deflected 50 ເທື່ອ (2 ມມຢູ່ທີ່ 20 Hz, 2 s ຕໍ່ການນໍາສະເຫນີ) ໃນເວລາສຸ່ມໂດຍໄດ piezoelectric ໃນໄລຍະການບັນທຶກ 20 ນາທີ. ການນໍາໃຊ້ຊຸດສະຫນັບສະຫນູນ MATLAB ສໍາລັບ Arduino (MATLAB 2019b), ຄວບຄຸມເວລາ deflection ດ້ວຍລະຫັດ MATLAB ທີ່ກໍາຫນົດເອງ. ໃຊ້ TTL pulses ເພື່ອ synchronize ເຫດການກັບຊອບແວທີ່ໄດ້ມາຂໍ້ມູນ.
ສໍາລັບການທົດລອງເຄື່ອງຫມາຍ optical, ສາຍ patch optical 200 µm (Doric) ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ laser 473 nm (Omicron) ໄດ້ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເສັ້ນໄຍ optical 200 µm ວາງໄວ້ເທິງ craniotomy. ທັນທີກ່ອນນີ້, ປັບພະລັງງານ jumper ເປັນ 20 mW. ໃຊ້ການຫມູນໃຊ້ເພື່ອຫຼຸດ electrodes ໄປຫາສະຖານທີ່ເປົ້າຫມາຍໂດຍຜ່ານ craniotomy, ເຊິ່ງເຕັມໄປດ້ວຍນ້ໍາເຄັມເປັນຫມັນ. ໃນ​ຕອນ​ຕົ້ນ​ຂອງ​ການ​ບັນ​ທຶກ​, ສິບ​ກໍາ​ມະ​ຈອນ​ຂອງ​ແສງ 473 nm (ຄວາມ​ຖີ່​ຂອງ​ການ 2 Hz​, ກໍາ​ມະ​ຈອນ​ໄລ​ຍະ 10 ms​) ໄດ້​ຖືກ​ປ່ອຍ​ອອກ​ມາ​. ຈຸລັງທີ່ຮັບຮູ້ແສງໄດ້ຖືກກໍານົດວ່າເປັນຈຸລັງທີ່ສະແດງການຕອບສະຫນອງແບບຮວງຕັ້ງແຈບພາຍໃນ 10 ms ຂອງແສງໃນ 70% ຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນຂອງການທົດລອງ.