ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ໃນເວລານີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
Liquid biopsy (LB) ແມ່ນແນວຄວາມຄິດທີ່ກໍາລັງໄດ້ຮັບຄວາມນິຍົມຢ່າງໄວວາໃນຂົງເຂດຊີວະແພດ.ແນວຄວາມຄິດສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນອີງໃສ່ການກວດພົບຊິ້ນສ່ວນຂອງ DNA extracellular circulating (ccfDNA), ເຊິ່ງສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຖືກປ່ອຍອອກມາເປັນຊິ້ນສ່ວນນ້ອຍໆຫຼັງຈາກການເສຍຊີວິດຂອງເຊນໃນເນື້ອເຍື່ອຕ່າງໆ.ອັດຕາສ່ວນນ້ອຍຂອງຊິ້ນສ່ວນເຫຼົ່ານີ້ມາຈາກເນື້ອເຍື່ອ ຫຼືສິ່ງມີຊີວິດຕ່າງປະເທດ (ຕ່າງປະເທດ).ໃນການເຮັດວຽກໃນປະຈຸບັນ, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ແນວຄວາມຄິດນີ້ກັບ mussels, ຊະນິດ sentinel ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກສໍາລັບຄວາມສາມາດການກັ່ນຕອງນ້ໍາທະເລສູງ.ພວກເຮົາໃຊ້ຄວາມສາມາດຂອງ mussels ເພື່ອເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຕົວກອງທໍາມະຊາດເພື່ອເກັບກໍາຊິ້ນສ່ວນ DNA ຂອງສິ່ງແວດລ້ອມຈາກແຫຼ່ງຕ່າງໆເພື່ອໃຫ້ຂໍ້ມູນກ່ຽວກັບຊີວະນາໆພັນຂອງລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງທະເລ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ mussel hemolymph ມີຊິ້ນ DNA ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຂະຫນາດ, ຈາກ 1 ຫາ 5 kb.ການຈັດລຽງຕາມລຳດັບຂອງປືນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຊິ້ນສ່ວນ DNA ຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍແມ່ນມາຈາກຈຸລິນຊີຕ່າງປະເທດ.ໃນບັນດາພວກມັນ, ພວກເຮົາພົບເຫັນຊິ້ນ DNA ຈາກເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, archaea, ແລະໄວຣັສ, ລວມທັງເຊື້ອໄວຣັສທີ່ຮູ້ຈັກການຕິດເຊື້ອຫຼາຍໆຊະນິດທີ່ພົບທົ່ວໄປໃນລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງ.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແນວຄວາມຄິດຂອງ LB ທີ່ນໍາໃຊ້ກັບ mussels ເປັນຕົວແທນຂອງຄວາມຮູ້ທີ່ອຸດົມສົມບູນແຕ່ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຄົ້ນຫາກ່ຽວກັບຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຈຸລິນຊີໃນລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງທະເລ.
ຜົນກະທົບຂອງການປ່ຽນແປງດິນຟ້າອາກາດ (CC) ຕໍ່ຊີວະນາໆພັນຂອງລະບົບນິເວດທະເລເປັນພື້ນທີ່ທີ່ເຕີບໂຕຢ່າງໄວວາຂອງການຄົ້ນຄວ້າ.ພາວະໂລກຮ້ອນບໍ່ພຽງແຕ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມເຄັ່ງຕຶງທາງດ້ານສະລີລະວິທະຍາທີ່ສໍາຄັນ, ແຕ່ຍັງຊຸກຍູ້ການຈໍາກັດການວິວັດທະນາການຂອງຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນຂອງສິ່ງມີຊີວິດໃນທະເລ, ຜົນກະທົບຕໍ່ທີ່ຢູ່ອາໄສຂອງຊະນິດພັນ, ກະຕຸ້ນໃຫ້ພວກເຂົາຊອກຫາເງື່ອນໄຂທີ່ເອື້ອອໍານວຍຫຼາຍຂຶ້ນ [1, 2].ນອກເຫນືອຈາກການສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຊີວະນາໆພັນຂອງ metazoans, CC ຂັດຂວາງຄວາມສົມດຸນທີ່ລະອຽດອ່ອນຂອງການໂຕ້ຕອບຂອງ host-microbial.dysbacteriosis ຈຸລິນຊີນີ້ເປັນໄພຂົ່ມຂູ່ທີ່ຮ້າຍແຮງຕໍ່ລະບົບນິເວດທະເລຍ້ອນວ່າມັນເຮັດໃຫ້ສິ່ງມີຊີວິດໃນທະເລມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບເຊື້ອພະຍາດຕິດຕໍ່ [3, 4].ມັນເຊື່ອວ່າ SS ມີບົດບາດສໍາຄັນຕໍ່ການເສຍຊີວິດຂອງມະຫາຊົນ, ເຊິ່ງເປັນບັນຫາທີ່ຮ້າຍແຮງສໍາລັບການຄຸ້ມຄອງລະບົບນິເວດທະເລທົ່ວໂລກ [5, 6].ນີ້​ແມ່ນ​ບັນຫາ​ສຳຄັນ​ທີ່​ໄດ້​ຮັບ​ຜົນ​ກະທົບ​ຕໍ່​ເສດຖະກິດ, ນິ​ເວດ​ວິທະຍາ ​ແລະ ​ໂພຊະນາ​ການ​ຂອງ​ສັດ​ທະ​ເລ​ຫຼາຍ​ຊະນິດ.ນີ້ແມ່ນຄວາມຈິງໂດຍສະເພາະສໍາລັບ bivalves ທີ່ອາໄສຢູ່ໃນເຂດຂົ້ວໂລກ, ບ່ອນທີ່ຜົນກະທົບຂອງ CK ແມ່ນທັນທີທັນໃດແລະຮ້າຍແຮງກວ່າເກົ່າ [6, 7].ໃນຄວາມເປັນຈິງ, bivalves ເຊັ່ນ Mytilus spp.ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເພື່ອຕິດຕາມຜົນກະທົບຂອງ CC ຕໍ່ລະບົບນິເວດທະເລ.ບໍ່ແປກໃຈ, ຈໍານວນ biomarkers ຂ້ອນຂ້າງຫຼາຍໄດ້ຖືກພັດທະນາເພື່ອຕິດຕາມສຸຂະພາບຂອງເຂົາເຈົ້າ, ມັກຈະໃຊ້ວິທີການສອງຊັ້ນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ biomarkers ທີ່ເປັນປະໂຫຍດໂດຍອີງໃສ່ກິດຈະກໍາ enzymatic ຫຼືການເຮັດວຽກຂອງເຊນເຊັ່ນ: ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງເຊນແລະກິດຈະກໍາ phagocytic [8].ວິທີການເຫຼົ່ານີ້ຍັງປະກອບມີການວັດແທກຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຕົວຊີ້ວັດຄວາມກົດດັນສະເພາະທີ່ສະສົມຢູ່ໃນເນື້ອເຍື່ອອ່ອນຫຼັງຈາກການດູດຊຶມຂອງນ້ໍາທະເລໃນຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຄວາມອາດສາມາດການກັ່ນຕອງສູງແລະລະບົບການໄຫຼວຽນຂອງເຄິ່ງເປີດຂອງ bivalves ສະຫນອງໂອກາດທີ່ຈະພັດທະນາ biomarkers hemolymph ໃຫມ່ໂດຍນໍາໃຊ້ແນວຄວາມຄິດຂອງ biopsy ແຫຼວ (LB), ເປັນວິທີການທີ່ງ່າຍດາຍແລະຫນ້ອຍທີ່ສຸດໃນການຄຸ້ມຄອງຄົນເຈັບ.ຕົວຢ່າງເລືອດ [9, 10].ເຖິງແມ່ນວ່າຫຼາຍຊະນິດຂອງໂມເລກຸນທີ່ໄຫຼວຽນສາມາດພົບເຫັນຢູ່ໃນ LB ຂອງມະນຸດ, ແນວຄວາມຄິດນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ການວິເຄາະລໍາດັບ DNA ຕົ້ນຕໍຂອງຊິ້ນ DNA extracellular (ccfDNA) ແຜ່ກະຈາຍຢູ່ໃນ plasma.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ການປະກົດຕົວຂອງ DNA ທີ່ໄຫຼວຽນຢູ່ໃນ plasma ຂອງມະນຸດແມ່ນເປັນທີ່ຮູ້ຈັກນັບຕັ້ງແຕ່ກາງສະຕະວັດທີ 20 [11], ແຕ່ວ່າມັນແມ່ນພຽງແຕ່ໃນຊຸມປີມໍ່ໆມານີ້ທີ່ການມາເຖິງຂອງວິທີການຈັດລໍາດັບທີ່ມີລະດັບສູງໄດ້ນໍາໄປສູ່ການວິນິດໄສທາງດ້ານຄລີນິກໂດຍອີງໃສ່ ccfDNA.ການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ DNA ທີ່ໄຫຼວຽນຂອງເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນເນື່ອງມາຈາກບາງສ່ວນຂອງການປ່ອຍຕົວແບບ passive ຂອງ DNA ພັນທຸ ກຳ (ນິວເຄຼຍແລະ mitochondrial) ຫຼັງຈາກການຕາຍຂອງເຊນ. ໃນບຸກຄົນທີ່ມີສຸຂະພາບດີ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ ccfDNA ປົກກະຕິແມ່ນຕໍ່າ (<10 ng / mL) ແຕ່ສາມາດເພີ່ມຂຶ້ນ 5-10 ເທົ່າໃນຄົນເຈັບທີ່ທົນທຸກຈາກພະຍາດຕ່າງໆຫຼືໄດ້ຮັບຄວາມກົດດັນ, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ. ໃນບຸກຄົນທີ່ມີສຸຂະພາບດີ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ ccfDNA ປົກກະຕິແມ່ນຕໍ່າ (<10 ng / mL) ແຕ່ສາມາດເພີ່ມຂຶ້ນ 5-10 ເທົ່າໃນຄົນເຈັບທີ່ທົນທຸກຈາກພະຍາດຕ່າງໆຫຼືໄດ້ຮັບຄວາມກົດດັນ, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разонох бочальратальрать послатальрать подной записи. гией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ໃນຄົນທີ່ມີສຸຂະພາບດີ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ cccDNA ປົກກະຕິແມ່ນຕໍ່າ (<10 ng / mL), ແຕ່ມັນສາມາດເພີ່ມຂຶ້ນ 5-10 ເທົ່າໃນຄົນເຈັບທີ່ມີພະຍາດຕ່າງໆຫຼືພາຍໃຕ້ຄວາມກົດດັນທີ່ນໍາໄປສູ່ຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ.在健康个体中，ccfDNA的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患倅0，但在患有各种理或承受压力的患倅与导致组织损伤.在健康个体中，ccfdna的浓度较低（（<10 ng/ml）但在各种病理或承受压力 10 ng/ml 或承受压力 0 ng倍，从而组织。。损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз усть ологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ ccfDNA ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນຕໍ່າ (<10 ng/ml) ໃນບຸກຄົນທີ່ມີສຸຂະພາບດີ, ແຕ່ສາມາດເພີ່ມຂຶ້ນ 5-10 ເທົ່າໃນຄົນເຈັບທີ່ມີ pathologies ຕ່າງໆຫຼືຄວາມກົດດັນ, ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ.ຂະຫນາດຂອງຊິ້ນສ່ວນ ccfDNA ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງກວ້າງຂວາງ, ແຕ່ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນຕັ້ງແຕ່ 150 ຫາ 200 bp.[12].ການວິເຄາະ ccfDNA ທີ່ມາຈາກຕົນເອງ, ie, ccfDNA ຈາກຈຸລັງເຈົ້າພາບປົກກະຕິຫຼືການປ່ຽນແປງ, ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາການປ່ຽນແປງທາງພັນທຸກໍາແລະ epigenetic ທີ່ມີຢູ່ໃນ genome nuclear ແລະ / ຫຼື mitochondrial, ດັ່ງນັ້ນການຊ່ວຍເຫຼືອນັກແພດເລືອກການປິ່ນປົວເປົ້າຫມາຍໂມເລກຸນສະເພາະ [13].ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ccfDNA ສາມາດໄດ້ຮັບຈາກແຫຼ່ງຕ່າງປະເທດເຊັ່ນ: ccfDNA ຈາກຈຸລັງ fetal ໃນລະຫວ່າງການຖືພາຫຼືຈາກອະໄວຍະວະທີ່ຖ່າຍທອດ [14,15,16,17].ccfDNA ຍັງເປັນແຫລ່ງຂໍ້ມູນທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບການກວດສອບການປະກົດຕົວຂອງອາຊິດນິວເຄຼຍຂອງຕົວແທນຕິດເຊື້ອ (ຕ່າງປະເທດ), ເຊິ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ກວດຫາການຕິດເຊື້ອທີ່ບໍ່ແຜ່ລາມຢ່າງແຜ່ຫຼາຍທີ່ບໍ່ໄດ້ລະບຸໂດຍວັດທະນະທໍາເລືອດ, ຫຼີກເວັ້ນການ invasive biopsy ຂອງຈຸລັງທີ່ຕິດເຊື້ອ [18].ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຢ່າງແທ້ຈິງວ່າເລືອດຂອງມະນຸດມີແຫຼ່ງຂໍ້ມູນທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດເຊື້ອໄວຣັດແລະເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, ແລະປະມານ 1% ຂອງ ccfDNA ທີ່ພົບໃນ plasma ຂອງມະນຸດແມ່ນມາຈາກຕ່າງປະເທດ [19].ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຊີວະນາໆພັນຂອງຈຸລິນຊີທີ່ໝູນວຽນຂອງສິ່ງມີຊີວິດສາມາດຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະ ccfDNA.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຈົນກ່ວາບໍ່ດົນມານີ້, ແນວຄວາມຄິດນີ້ຖືກນໍາໃຊ້ສະເພາະໃນມະນຸດແລະ, ໃນຂອບເຂດຫນ້ອຍ, ໃນກະດູກສັນຫຼັງອື່ນໆ [20, 21].
ໃນເອກະສານປະຈຸບັນ, ພວກເຮົາໃຊ້ທ່າແຮງ LB ເພື່ອວິເຄາະ ccfDNA ຂອງ Aulacomya atra, ເປັນຊະນິດທາງພາກໃຕ້ທີ່ພົບເຫັນທົ່ວໄປໃນຫມູ່ເກາະ Kerguelen subantarctic, ເປັນກຸ່ມຂອງຫມູ່ເກາະຢູ່ເທິງພູສູງທີ່ສ້າງຂຶ້ນ 35 ລ້ານປີກ່ອນ.ການລະເບີດຂອງພູເຂົາໄຟ.ການນໍາໃຊ້ລະບົບການທົດລອງໃນ vitro, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າຊິ້ນ DNA ໃນນ້ໍາທະເລໄດ້ຖືກເອົາໄປຢ່າງໄວວາໂດຍ mussels ແລະເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ hemolymph.ການຈັດລຽງຕາມລຳດັບຂອງລູກປືນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ mussel hemolymph ccfDNA ມີຊິ້ນສ່ວນ DNA ຂອງຕົ້ນກຳເນີດຂອງມັນເອງ ແລະ ທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົວຂອງມັນເອງ, ລວມທັງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ symbiotic ແລະຊິ້ນ DNA ຈາກ biomes ປົກກະຕິຂອງລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງທະເລພູເຂົາໄຟເຢັນ.Hemolymph ccfDNA ຍັງມີລໍາດັບໄວຣັສທີ່ມາຈາກໄວຣັສທີ່ມີຂອບເຂດທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ພວກເຮົາຍັງພົບເຫັນຊິ້ນ DNA ຈາກສັດຫຼາຍຈຸລັງເຊັ່ນ: ປາກະດູກ, ສັດທະເລ, algae ແລະແມງໄມ້.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແນວຄວາມຄິດຂອງ LB ສາມາດນໍາໃຊ້ໄດ້ຢ່າງສໍາເລັດຜົນກັບສັດບໍ່ມີກະດູກສັນຫຼັງໃນທະເລເພື່ອສ້າງ repertoire genomic ທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນລະບົບນິເວດທະເລ.
ໂຕໃຫຍ່ (ຍາວ 55-70 ມມ) Mytilus platensis (M. platensis) ແລະ Aulacomya atra (A. atra) ໄດ້ຖືກເກັບມາຈາກຝັ່ງຫີນ intertidal ຂອງ Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).ໝູ່ເກາະ Kerguelen ໃນເດືອນທັນວາ 2018. ແມງກະເບື້ອສີຟ້າຜູ້ໃຫຍ່ອື່ນໆ (Mytilus spp.) ແມ່ນໄດ້ມາຈາກຜູ້ສະໜອງການຄ້າ (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ແລະຖືກຈັດໃສ່ໃນຖັງບັນຈຸອາກາດທີ່ຄວບຄຸມອຸນຫະພູມ (4°C) ບັນຈຸນ້ຳເກືອ 32‰ 10–20 ລິດ.(ເກືອທະເລທຽມ Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).ສໍາລັບແຕ່ລະການທົດລອງ, ຄວາມຍາວແລະນ້ໍາຫນັກຂອງຫອຍແຕ່ລະຄົນໄດ້ຖືກວັດແທກ.
ໂປຣໂຕຄໍການເຂົ້າເຖິງແບບເປີດຟຣີສໍາລັບໂຄງການນີ້ແມ່ນມີໃຫ້ອອນໄລນ໌ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).ໂດຍຫຍໍ້, LB hemolymph ໄດ້ຖືກລວບລວມຈາກກ້າມຊີ້ນ abductor ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍ [22].hemolymph ໄດ້ຖືກຊີ້ແຈງໂດຍການ centrifugation ຢູ່ທີ່ 1200 × g ສໍາລັບ 3 ນາທີ, supernatant ໄດ້ຖືກແຊ່ແຂງ (-20 ° C) ຈົນກ່ວາການນໍາໃຊ້.ສໍາລັບການໂດດດ່ຽວແລະການເຮັດຄວາມສະອາດຂອງ cfDNA, ຕົວຢ່າງ (1.5-2.0 ml) ໄດ້ຖືກ thawed ແລະປຸງແຕ່ງໂດຍໃຊ້ຊຸດ NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ.ccfDNA ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80 ° C ຈົນກ່ວາການວິເຄາະຕື່ມອີກ.ໃນບາງການທົດລອງ, ccfDNA ໄດ້ຖືກແຍກອອກ ແລະຖືກຊໍາລະໃຫ້ສະອາດໂດຍໃຊ້ QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).DNA ທີ່ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ PicoGreen ມາດຕະຖານ.ການແຈກຢາຍຊິ້ນສ່ວນຂອງ ccfDNA ທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ electrophoresis capillary ໂດຍໃຊ້ Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ໂດຍໃຊ້ຊຸດ DNA ທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ.ການວິເຄາະໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ 1 µl ຂອງຕົວຢ່າງ ccfDNA ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ.
ສໍາລັບການຈັດລໍາດັບຂອງຊິ້ນສ່ວນ hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, ການາດາ) ໄດ້ກະກຽມຫ້ອງສະຫມຸດປືນຍິງໂດຍໃຊ້ຊຸດ Illumina DNA Mix ຂອງຊຸດ Illumina MiSeq PE75.ອະແດັບເຕີມາດຕະຖານ (BioO) ຖືກໃຊ້.ໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນມີໃຫ້ຈາກ NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ແລະ SRR8924809).ຄຸນນະພາບການອ່ານພື້ນຖານໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ FastQC [23].Trimmomatic [24] ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຕັດຕົວດັດແປງແລະການອ່ານທີ່ມີຄຸນນະພາບທີ່ບໍ່ດີ.Shotgun reads with paired ends are FLASH merged into long single reads with low 20 bp overlap ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການບໍ່ກົງກັນ [25]. ການອ່ານທີ່ຖືກລວມເຂົ້າກັນໄດ້ຖືກອະທິບາຍດ້ວຍ BLASTN ໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ NCBI Taxonomy bivalve (e value < 1e−3 ແລະ 90% homology), ແລະການປິດບັງຂອງລໍາດັບຄວາມຊັບຊ້ອນຕໍ່າໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ DUST [26]. ການອ່ານທີ່ຖືກລວມເຂົ້າກັນໄດ້ຖືກອະທິບາຍດ້ວຍ BLASTN ໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ NCBI Taxonomy bivalve (e value < 1e−3 ແລະ 90% homology), ແລະການປິດບັງຂອງລໍາດັບຄວາມຊັບຊ້ອນຕໍ່າໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуслтвор e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполь ການອ່ານແບບລວມກັນໄດ້ຖືກອະທິບາຍດ້ວຍ BLASTN ໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ NCBI bivalve taxonomy (e value < 1e-3 ແລະ 90% homology), ແລະການໃສ່ຜ້າອັດດັງລໍາດັບຄວາມຊັບຊ້ອນຕໍ່າໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读潰，并低甍 6DUS 低杂度序列的掩蔽.使用双壳类 ncbi 分类（（<1e-3和90%同源）用用用注释合并蝻数，幨卽6用注释合并读数，幨卽6甶卽6甶忽甶卽6甶忽用双壳类。序列的。。。 掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данныхвской данныхвской чение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с. ການອ່ານແບບລວມກັນໄດ້ຖືກອະທິບາຍດ້ວຍ BLASTN ໂດຍໃຊ້ NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 ແລະ 90% homology), ແລະການໃສ່ຜ້າອັດດັງລໍາດັບຄວາມຊັບຊ້ອນຕໍ່າແມ່ນປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ DUST [26].ການອ່ານຖືກແບ່ງອອກເປັນສອງກຸ່ມ: ກ່ຽວຂ້ອງກັບລໍາດັບ bivalve (ໃນທີ່ນີ້ເອີ້ນວ່າການອ່ານດ້ວຍຕົນເອງ) ແລະທີ່ບໍ່ກ່ຽວຂ້ອງ (ບໍ່ໄດ້ອ່ານດ້ວຍຕົນເອງ).ສອງກຸ່ມໄດ້ຖືກປະກອບແຍກຕ່າງຫາກໂດຍໃຊ້ MEGAHIT ເພື່ອສ້າງ contigs [27].ໃນຂະນະດຽວກັນ, ການແຈກຢາຍ taxonomic ຂອງ microbiome ມະນຸດຕ່າງດາວທີ່ອ່ານໄດ້ຖືກຈັດປະເພດໂດຍໃຊ້ Kraken2 [28] ແລະສະແດງຮູບພາບໂດຍຕາຕະລາງ pie Krona ໃນ Galaxy [29, 30].kmers ທີ່ດີທີ່ສຸດຖືກກໍານົດວ່າເປັນ kmers-59 ຈາກການທົດລອງເບື້ອງຕົ້ນຂອງພວກເຮົາ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, contigs ຕົນເອງໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍການສອດຄ່ອງກັບ BLASTN (ຖານຂໍ້ມູນ bivalve NCBI, e value < 1e−10 ແລະ 60% homology) ສໍາລັບຄໍາບັນຍາຍສຸດທ້າຍ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, contigs ຕົນເອງໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍການສອດຄ່ອງກັບ BLASTN (ຖານຂໍ້ມູນ bivalve NCBI, e value < 1e−10 ແລະ 60% homology) ສໍາລັບຄໍາບັນຍາຍສຸດທ້າຍ. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двуствор члата, база данных двуствор чата <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, contigs ຕົນເອງໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍການຈັບຄູ່ກັບ BLASTN (ຖານຂໍ້ມູນ NCBI bivalve, e value <1e-10 ແລະ 60% homology) ສໍາລັບຄໍາບັນຍາຍສຸດທ້າຍ.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI数据库，e值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别荪和60% 同源性）对蜜来识别荪迫開注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI数据库，e值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления NC сопоставления бата устворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, contigs ຕົນເອງໄດ້ຖືກກໍານົດສໍາລັບຄໍາບັນຍາຍສຸດທ້າຍໂດຍການຈັບຄູ່ກັບ BLASTN (ຖານຂໍ້ມູນ NCBI bivalve, e value <1e-10 ແລະ 60% homology). ໃນ​ຂະ​ຫນານ​ກັນ, contigs ຂອງ​ກຸ່ມ​ທີ່​ບໍ່​ແມ່ນ​ຕົນ​ເອງ​ໄດ້​ຖືກ​ອະ​ທິ​ບາຍ​ດ້ວຍ BLASTN (nt NCBI ຖານ​ຂໍ້​ມູນ, ຄ່າ e < 1e−10 ແລະ 60% homology). ໃນ​ຂະ​ຫນານ​ກັນ, contigs ຂອງ​ກຸ່ມ​ທີ່​ບໍ່​ແມ່ນ​ຕົນ​ເອງ​ໄດ້​ຖືກ​ອະ​ທິ​ບາຍ​ດ້ວຍ BLASTN (nt NCBI ຖານ​ຂໍ້​ມູນ, ຄ່າ e < 1e−10 ແລະ 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значиоe-1гом 6 данных nt NCBI, значиони.-1гом 6 ໃນຂະຫນານ, contigs ຂອງກຸ່ມຕ່າງປະເທດໄດ້ຖືກອະທິບາຍດ້ວຍ BLASTN (ຖານຂໍ້ມູນ NT NCBI, e value <1e-10 ແລະ 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (базачни данены) ແລະ гомология 60%). ໃນຂະຫນານ, contigs ກຸ່ມທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົນເອງໄດ້ຖືກອະທິບາຍດ້ວຍ BLASTN (ຖານຂໍ້ມູນ NT NCBI, e value <1e-10 ແລະ 60% homology). BLASTX ຍັງໄດ້ດໍາເນີນການກ່ຽວກັບ contigs ທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົນເອງໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ NCBI nr ແລະ ໂປຣຕີນ RefSeq (e value < 1e−10 ແລະ 60% homology). BLASTX ຍັງໄດ້ດໍາເນີນການກ່ຽວກັບ contigs ທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົນເອງໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ NCBI nr ແລະ ໂປຣຕີນ RefSeq (e value < 1e−10 ແລະ 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значо01eгого значо 1 гогоречили 1000000 . BLASTX ຍັງຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນ contigs ທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົວເອງໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນທາດໂປຼຕີນຈາກ nr ແລະ RefSeq NCBI (e value < 1e-10 ແລະ 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 倧源）.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 倧源）. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значиени. 1гом 6 дачиние) BLASTX ຍັງຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນ contigs ທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົວເອງໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນທາດໂປຼຕີນຈາກ nr ແລະ RefSeq NCBI (e value <1e-10 ແລະ 60% homology).ກຸ່ມ BLASTN ແລະ BLASTX ຂອງ contigs ທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົວມັນເອງເປັນຕົວແທນຂອງ contigs ສຸດທ້າຍ (ເບິ່ງເອກະສານເສີມ).
primers ທີ່ໃຊ້ສໍາລັບ PCR ແມ່ນລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງ S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຂະຫຍາຍພັນທຸກໍາເປົ້າຫມາຍ ccfDNA.ເງື່ອນໄຂການປະຕິກິລິຢາດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້: denaturation ທີ່ 95 ° C ສໍາລັບ 3 ນາທີ, 95 ° C ສໍາລັບ 1 ນາທີ, ກໍານົດອຸນຫະພູມ annealing ສໍາລັບ 1 ນາທີ, elongation ທີ່ 72 ° C ສໍາລັບ 1 ນາທີ, 35 ຮອບ, ແລະສຸດທ້າຍ 72 ° C ພາຍໃນ 10 ນາທີ..ຜະລິດຕະພັນ PCR ຖືກແຍກອອກໂດຍ electrophoresis ໃນ agarose gels (1.5%) ທີ່ປະກອບດ້ວຍ SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ຢູ່ 95 V.
Mussels (Mytilus spp.) ຖືກປັບໃຫ້ເຂົ້າກັນໄດ້ໃນນ້ໍາທະເລທີ່ມີອົກຊີເຈນ 500 ມລ (32 PSU) ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງທີ່ 4 ° C.Plasmid DNA ທີ່ບັນຈຸໃສ່ເຂົ້າລະຫັດ galectin-7 cDNA ຂອງມະນຸດ (ໝາຍເລກເຂົ້າ NCBI L07769) ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ໃນຂວດທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 190 μg/μl.Mussels incubated ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນໂດຍບໍ່ມີການເພີ່ມ DNA ແມ່ນການຄວບຄຸມ.ຖັງຄວບຄຸມທີສາມບັນຈຸ DNA ໂດຍບໍ່ມີ mussels.ເພື່ອຕິດຕາມຄຸນນະພາບຂອງ DNA ໃນນ້ໍາທະເລ, ຕົວຢ່າງນ້ໍາທະເລ (20 μl; ສາມຊ້ໍາຊ້ອນ) ໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກແຕ່ລະຖັງໃນເວລາລະບຸ.ສໍາລັບ plasmid DNA traceability, LB mussels ໄດ້ຖືກຂຸດຄົ້ນໃນເວລາທີ່ລະບຸໄວ້ແລະການວິເຄາະໂດຍ qPCR ແລະ ddPCR.ເນື່ອງຈາກປະລິມານເກືອສູງຂອງນ້ໍາທະເລ, aliquots ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງໃນນ້ໍາທີ່ມີຄຸນນະພາບ PCR (1: 10) ກ່ອນການທົດສອບ PCR ທັງຫມົດ.
Digital droplet PCR (ddPCR) ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada).ໃຊ້ໂປຣໄຟລ໌ອຸນຫະພູມເພື່ອກໍານົດອຸນຫະພູມທີ່ດີທີ່ສຸດ (ຕາຕະລາງ S1).ການຫຼຸດລົງໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຜະລິດການຫຼຸດລົງ QX200 (BioRad).ddPCR ໄດ້ຖືກປະຕິບັດດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: 95 ° C ສໍາລັບ 5 min, 50 ຮອບວຽນຂອງ 95 ° C ສໍາລັບ 30 s ແລະອຸນຫະພູມ annealing ສໍາລັບ 1 min ແລະ 72 ° C ສໍາລັບ 30 s, 4 ° C ສໍາລັບ 5 ນາທີແລະ 90 ° C ພາຍໃນ 5 ນາທີ.ຈໍາ​ນວນ​ຂອງ​ການ​ຫຼຸດ​ລົງ​ແລະ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ທາງ​ບວກ (ຈໍາ​ນວນ​ຂອງ​ສໍາ​ເນົາ / µl​) ໄດ້​ຖືກ​ວັດ​ແທກ​ໂດຍ​ນໍາ​ໃຊ້ QX200 drop reader (BioRad​)​.ຕົວຢ່າງທີ່ມີໜ້ອຍກວ່າ 10,000 ຢອດໄດ້ຖືກປະຕິເສດ.ການຄວບຄຸມຮູບແບບບໍ່ໄດ້ປະຕິບັດທຸກຄັ້ງທີ່ ddPCR ຖືກແລ່ນ.
qPCR ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) ແລະ primers ສະເພາະ LGALS7.PCRs ປະລິມານທັງຫມົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນ 20 µl ໂດຍໃຊ້ QuantFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນດ້ວຍການ incubation 15 ນາທີຢູ່ທີ່ 95 ° C, ຕິດຕາມດ້ວຍ 40 ຮອບວຽນຢູ່ທີ່ 95 ° C ສໍາລັບ 10 ວິນາທີແລະຢູ່ທີ່ 60 ° C ສໍາລັບ 60 ວິນາທີດ້ວຍການເກັບຂໍ້ມູນຫນຶ່ງ.ເສັ້ນ​ໂຄ້ງ​ການ​ລະ​ລາຍ​ໄດ້​ຖືກ​ສ້າງ​ຂຶ້ນ​ໂດຍ​ນໍາ​ໃຊ້​ການ​ວັດ​ແທກ​ຕໍ່​ເນື່ອງ​ທີ່ 95°C ສໍາ​ລັບ 5 ວິ​, 65°C ສໍາ​ລັບ 60 ວິ​, ແລະ 97°C ໃນ​ຕອນ​ທ້າຍ​ຂອງ qPCR​.ແຕ່ລະ qPCR ຖືກປະຕິບັດເປັນ triplicate, ຍົກເວັ້ນຕົວຢ່າງການຄວບຄຸມ.
ເນື່ອງຈາກ mussels ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກສໍາລັບອັດຕາການກອງສູງ, ພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນຄັ້ງທໍາອິດວ່າພວກເຂົາສາມາດກັ່ນຕອງແລະຮັກສາຊິ້ນ DNA ທີ່ມີຢູ່ໃນນ້ໍາທະເລໄດ້.ພວກເຮົາຍັງສົນໃຈວ່າຊິ້ນສ່ວນເຫຼົ່ານີ້ສະສົມຢູ່ໃນລະບົບ lymphatic ເຄິ່ງເປີດ.ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ແກ້​ໄຂ​ບັນ​ຫາ​ນີ້​ໂດຍ​ການ​ທົດ​ລອງ​ໂດຍ​ການ​ຕິດ​ຕາມ​ຊະ​ຕາ​ກໍາ​ຂອງ​ຊິ້ນ DNA ທີ່​ລະ​ລາຍ​ເພີ່ມ​ເຂົ້າ​ໄປ​ໃນ tank mussel ສີ​ຟ້າ​.ເພື່ອອໍານວຍຄວາມສະດວກໃນການຕິດຕາມຊິ້ນສ່ວນ DNA, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ plasmid DNA ຂອງຕ່າງປະເທດ (ບໍ່ແມ່ນຕົວຕົນ) ທີ່ມີ gene galectin-7 ຂອງມະນຸດ.ddPCR ຕິດຕາມຊິ້ນສ່ວນ DNA plasmid ໃນນ້ໍາທະເລແລະ mussels.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຖ້າຫາກວ່າປະລິມານຂອງຊິ້ນ DNA ໃນນ້ໍາທະເລຍັງຄົງຂ້ອນຂ້າງຄົງທີ່ໃນໄລຍະເວລາ (ເຖິງ 7 ມື້) ໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີ mussels, ຫຼັງຈາກນັ້ນໃນທີ່ປະທັບຂອງ mussels ລະດັບນີ້ເກືອບຫມົດໄປພາຍໃນ 8 ຊົ່ວໂມງ (ຮູບ 1a, b).Fragments ຂອງ DNA exogenous ໄດ້ຖືກກວດພົບໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍພາຍໃນ 15 ນາທີໃນນ້ໍາ intravalvular ແລະ hemolymph (ຮູບ 1c).ຊິ້ນສ່ວນເຫຼົ່ານີ້ຍັງສາມາດກວດພົບໄດ້ເຖິງ 4 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການເປີດເຜີຍ.ກິດຈະກໍາການກັ່ນຕອງນີ້ກ່ຽວກັບຊິ້ນ DNA ແມ່ນປຽບທຽບກັບກິດຈະກໍາການກັ່ນຕອງຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍແລະພຶຊະຄະນິດ [31].ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ mussels ສາມາດກັ່ນຕອງແລະສະສົມ DNA ຕ່າງປະເທດຢູ່ໃນຊ່ອງນ້ໍາຂອງເຂົາເຈົ້າ.
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງ plasmid DNA ໃນນ້ໍາທະເລຢູ່ໃນການມີ (A) ຫຼືບໍ່ມີ (B) ຂອງ mussels, ວັດແທກໂດຍ ddPCR.ໃນ A, ຜົນໄດ້ຮັບສະແດງອອກເປັນເປີເຊັນ, ໂດຍມີຂອບຂອງກ່ອງທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງເປີເຊັນທີ 75 ແລະ 25.ເສັ້ນໂຄ້ງ logarithmic ທີ່ພໍດີແມ່ນສະແດງເປັນສີແດງ, ແລະພື້ນທີ່ທີ່ມີຮົ່ມເປັນສີຂີ້ເຖົ່າເປັນຕົວແທນຂອງໄລຍະຄວາມຫມັ້ນໃຈ 95%.ໃນ B, ເສັ້ນສີແດງສະແດງເຖິງຄ່າສະເລ່ຍແລະເສັ້ນສີຟ້າເປັນຕົວແທນຂອງໄລຍະຄວາມຫມັ້ນໃຈ 95% ສໍາລັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ.C ການສະສົມຂອງ plasmid DNA ໃນ hemolymph ແລະນ້ໍາ valvular ຂອງ mussels ໃນເວລາທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼັງຈາກການເພີ່ມຂອງ plasmid DNA.ຜົນໄດ້ຮັບຖືກສະແດງເປັນສໍາເນົາຢ່າງແທ້ຈິງທີ່ກວດພົບ/mL (±SE).
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາສືບສວນຕົ້ນກໍາເນີດຂອງ ccfDNA ໃນ mussels ທີ່ເກັບກໍາຈາກ mussel beds ໃນຫມູ່ເກາະ Kerguelen, ກຸ່ມຫ່າງໄກສອກຫຼີກຂອງເກາະທີ່ມີອິດທິພົນ anthropogenic ຈໍາກັດ.ສໍາລັບຈຸດປະສົງນີ້, cccDNA ຈາກ mussel hemolymphs ໄດ້ຖືກແຍກອອກແລະບໍລິສຸດໂດຍວິທີການທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປເພື່ອຊໍາລະ cccDNA ຂອງມະນຸດ [32, 33].ພວກເຮົາພົບວ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ hemolymph ccfDNA ສະເລ່ຍໃນ mussels ແມ່ນຢູ່ໃນ micrograms ຕ່ໍາຕໍ່ລະດັບ hemolymph (ເບິ່ງຕາຕະລາງ S2, ຂໍ້ມູນເສີມ).ລະດັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນນີ້ແມ່ນໃຫຍ່ກວ່າໃນຄົນທີ່ມີສຸຂະພາບດີ (nanograms ຕ່ໍາຕໍ່ milliliter), ແຕ່ໃນກໍລະນີທີ່ຫາຍາກ, ໃນຄົນເຈັບທີ່ເປັນມະເຮັງ, ລະດັບຂອງ ccfDNA ສາມາດບັນລຸຫຼາຍ micrograms ຕໍ່ milliliter [34, 35].ການວິເຄາະການແຜ່ກະຈາຍຂະຫນາດຂອງ hemolymph ccfDNA ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຊິ້ນເຫຼົ່ານີ້ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຂະຫນາດ, ຕັ້ງແຕ່ 1000 bp ຫາ 1000 bp.ເຖິງ 5000 bp (ຮູບ 2).ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ QIAamp Investigator Kit ທີ່ໃຊ້ຊິລິກາ, ວິທີການທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປໃນວິທະຍາສາດ forensic ເພື່ອແຍກແລະຊໍາລະ DNA genomic ຢ່າງໄວວາຈາກຕົວຢ່າງ DNA ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາ, ລວມທັງ ccfDNA [36].
ຕົວແທນ ccfDNA electrophoregram ຂອງ mussel hemolymph.ສະກັດດ້ວຍ NucleoSnap Plasma Kit (ເທິງ) ແລະ QIAamp DNA Investigator Kit.B Violin plot ສະແດງໃຫ້ເຫັນການແຜ່ກະຈາຍຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ hemolymph ccfDNA (±SE) ໃນ mussels.ເສັ້ນສີດໍາແລະສີແດງເປັນຕົວແທນຂອງກາງແລະ quartiles ທໍາອິດແລະທີສາມ, ຕາມລໍາດັບ.
ປະມານ 1% ຂອງ ccfDNA ໃນມະນຸດ ແລະ primates ມີແຫຼ່ງຕ່າງປະເທດ [21, 37].ເນື່ອງຈາກລະບົບການໄຫຼວຽນຂອງເຄິ່ງເປີດຂອງ bivalves, ນ້ໍາທະເລທີ່ອຸດົມສົມບູນຂອງຈຸລິນຊີ, ແລະການແຜ່ກະຈາຍຂະຫນາດຂອງ mussel ccfDNA, ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າ mussel hemolymph ccfDNA ອາດຈະມີສະນຸກເກີທີ່ອຸດົມສົມບູນແລະຫຼາກຫຼາຍຂອງ DNA microbial.ເພື່ອທົດສອບສົມມຸດຕິຖານນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຈັດລໍາດັບ hemolymph ccfDNA ຈາກຕົວຢ່າງ Aulacomya atra ທີ່ເກັບກໍາຈາກຫມູ່ເກາະ Kerguelen, ໃຫ້ຜົນຜະລິດຫຼາຍກວ່າ 10 ລ້ານອ່ານ, 97.6% ທີ່ໄດ້ຜ່ານການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການອ່ານໄດ້ຖືກຈັດປະເພດຕາມແຫຼ່ງຂອງຕົນເອງແລະບໍ່ແມ່ນຕົນເອງໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ BLASTN ແລະ NCBI bivalve (ຮູບ S1, ຂໍ້ມູນເສີມ).
ໃນມະນຸດ, ທັງ DNA ນິວເຄລຍແລະ mitochondrial ສາມາດຖືກປ່ອຍອອກມາໃນກະແສເລືອດ [38].ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນການສຶກສາໃນປະຈຸບັນ, ມັນບໍ່ສາມາດທີ່ຈະອະທິບາຍລາຍລະອຽດກ່ຽວກັບ DNA ພັນທຸ ກຳ ຂອງ mussels ນິວເຄຼຍ, ເພາະວ່າ genome A. atra ບໍ່ໄດ້ຖືກຈັດລຽງຕາມລໍາດັບຫຼືອະທິບາຍ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ພວກເຮົາສາມາດກໍານົດຈໍານວນຂອງຊິ້ນ ccfDNA ຂອງຕົ້ນກໍາເນີດຂອງພວກເຮົາເອງໂດຍໃຊ້ຫ້ອງສະຫມຸດ bivalve (ຮູບ S2, ຂໍ້ມູນເສີມ).ພວກເຮົາຍັງໄດ້ຢືນຢັນການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ DNA ຂອງຕົ້ນກໍາເນີດຂອງພວກເຮົາໂດຍການຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍກົງຂອງ genes A. atra ເຫຼົ່ານັ້ນທີ່ຖືກຈັດລໍາດັບ (ຮູບ 3).ເຊັ່ນດຽວກັນ, ເນື່ອງຈາກວ່າ genome mitochondrial ຂອງ A. atra ແມ່ນມີຢູ່ໃນຖານຂໍ້ມູນສາທາລະນະ, ຄົນເຮົາສາມາດຊອກຫາຫຼັກຖານສໍາລັບການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ mitochondrial ccfDNA ໃນ hemolymph ຂອງ A. atra.ການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ DNA ຂອງ mitochondrial ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍການຂະຫຍາຍ PCR (ຮູບ 3).
genes mitochondrial ຕ່າງໆມີຢູ່ໃນ hemolymph ຂອງ A. atra (ຈຸດສີແດງ - ຈໍານວນຫຼັກຊັບ: SRX5705969) ແລະ M. platensis (ຈຸດສີຟ້າ - ຈໍານວນຫຼັກຊັບ: SRX5705968) ຂະຫຍາຍໂດຍ PCR.ຮູບທີ່ດັດແປງມາຈາກ Breton et al., 2011 B Amplification of hemolymph supernatant from A. atra Stored on FTA paper.ໃຊ້ punch 3 ມມເພື່ອເພີ່ມໂດຍກົງໃສ່ທໍ່ PCR ທີ່ມີເຄື່ອງປະສົມ PCR.
ເນື່ອງຈາກເນື້ອໃນຈຸລິນຊີທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນນ້ໍາທະເລ, ພວກເຮົາໃນເບື້ອງຕົ້ນໄດ້ສຸມໃສ່ການກໍານົດລັກສະນະຂອງ microbial ລໍາດັບ DNA ໃນ hemolymph.ເພື່ອເຮັດສິ່ງນີ້, ພວກເຮົາໃຊ້ສອງຍຸດທະສາດທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ຍຸດທະສາດທໍາອິດໄດ້ນໍາໃຊ້ Kraken2, ໂຄງການການຈັດປະເພດລໍາດັບທີ່ອີງໃສ່ algorithm ທີ່ສາມາດກໍານົດລໍາດັບ microbial ທີ່ມີຄວາມຖືກຕ້ອງທຽບເທົ່າກັບ BLAST ແລະເຄື່ອງມືອື່ນໆ [28].ຫຼາຍກວ່າ 6719 ອ່ານໄດ້ຖືກກໍານົດວ່າມີຕົ້ນກໍາເນີດຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, ໃນຂະນະທີ່ 124 ແລະ 64 ແມ່ນມາຈາກ archaea ແລະໄວຣັສ, ຕາມລໍາດັບ (ຮູບ 4).ຊິ້ນສ່ວນ DNA ຂອງແບັກທີເລຍທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດແມ່ນ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ແລະ Bacteroidetes (17%) (ຮູບ 4a).ການແຈກຢາຍນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງ microbiome mussel blue ທະເລ [39, 40].Gammaproteobacteria ແມ່ນຊັ້ນຕົ້ນຕໍຂອງ Proteobacteria (44%), ລວມທັງ Vibrionales ຫຼາຍ (ຮູບ 4b).ວິທີການ ddPCR ໄດ້ຢືນຢັນການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ Vibrio DNA ໃນ ccfDNA ຂອງ A. atra hemolymph (ຮູບ 4c) [41].ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບຕົ້ນກໍາເນີດຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຂອງ ccfDNA, ວິທີການເພີ່ມເຕີມໄດ້ຖືກປະຕິບັດ (ຮູບ S2, ຂໍ້ມູນເສີມ). ໃນກໍລະນີນີ້, ການອ່ານທີ່ທັບຊ້ອນກັນໄດ້ຖືກປະກອບເປັນການອ່ານແບບຄູ່ແລະຖືກຈັດປະເພດເປັນຂອງຕົນເອງ (bivalves) ຫຼືຕົ້ນກໍາເນີດທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົວມັນເອງໂດຍໃຊ້ BLASTN ແລະຄ່າ e ຂອງ 1e−3 ແລະການຕັດອອກທີ່ມີ > 90% homology. ໃນກໍລະນີນີ້, ການອ່ານທີ່ທັບຊ້ອນກັນໄດ້ຖືກປະກອບເປັນການອ່ານແບບຄູ່ແລະຖືກຈັດປະເພດເປັນຂອງຕົນເອງ (bivalves) ຫຼືຕົ້ນກໍາເນີດທີ່ບໍ່ແມ່ນຕົວມັນເອງໂດຍໃຊ້ BLASTN ແລະຄ່າ e ຂອງ 1e−3 ແລະການຕັດອອກທີ່ມີ > 90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицир в иместа (да им се сифициров) рчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гиомолол> 9 гиомолол. ໃນກໍລະນີນີ້, ການອ່ານທີ່ທັບຊ້ອນກັນໄດ້ຖືກເກັບກໍາເປັນການອ່ານທີ່ສິ້ນສຸດເປັນຄູ່ ແລະຖືກຈັດປະເພດເປັນຕົ້ນສະບັບ (bivalve) ຫຼືບໍ່ແມ່ນຕົ້ນສະບັບໂດຍໃຊ້ BLASTN ແລະ e ຄ່າຂອງ 1e-3 ແລະຕັດອອກດ້ວຍ >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和>90% 姸溢同自身（双壳类）或非自身来源.在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用使用使用 blastn和 - 9 %源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированыка е моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гиом> олога гиом> 9. ໃນ​ກໍ​ລະ​ນີ​ນີ້, ການ​ອ່ານ​ທັບ​ຊ້ອນ​ແມ່ນ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ເກັບ​ກໍາ​ເປັນ​ຄູ່​ການ​ອ່ານ​ສິ້ນ​ສຸດ​ແລະ​ຈັດ​ປະ​ເພດ​ເປັນ​ຂອງ​ຕົນ (bivalves​) ຫຼື​ບໍ່​ແມ່ນ​ຕົ້ນ​ສະ​ບັບ​ໂດຍ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້ e BLASTN ແລະ 1e-3 ຄ່າ​ແລະ​ຄວາມ​ໃກ້​ຊິດ​ຄວາມ​ດຽວ​ກັນ​> 90%.ເນື່ອງຈາກ genome A. atra ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຖືກຈັດລໍາດັບ, ພວກເຮົາໃຊ້ຍຸດທະສາດການປະກອບ de novo ຂອງ MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).ຈໍາ ນວນ ທັງ ຫມົດ ຂອງ 147,188 contigs ໄດ້ ຖືກ ກໍາ ນົດ ວ່າ ເປັນ (bivalves) ຂອງ ຕົ້ນ ກໍາ ເນີດ.contigs ເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກລະເບີດຫຼັງຈາກນັ້ນ e-values ​​ຂອງ 1e-10 ໂດຍໃຊ້ BLASTN ແລະ BLASTX.ຍຸດທະສາດນີ້ອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາກໍານົດ 482 ຊິ້ນທີ່ບໍ່ແມ່ນ bivalve ທີ່ມີຢູ່ໃນ A. atra ccfDNA.ຫຼາຍກວ່າເຄິ່ງຫນຶ່ງ (57%) ຂອງຊິ້ນ DNA ເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນໄດ້ມາຈາກເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນມາຈາກ gill symbionts, ລວມທັງ symbionts sulfotrophic, ແລະຈາກ gill symbionts Solemya velum (ຮູບ 5).
ຄວາມອຸດົມສົມບູນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໃນລະດັບປະເພດ.B ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຈຸລິນຊີຂອງສອງ phyla ຕົ້ນຕໍ (Firmicutes ແລະ Proteobacteria).ການຂະຫຍາຍຕົວແທນຂອງ ddPCR C Vibrio spp.A. ຊິ້ນສ່ວນຂອງ 16S rRNA gene (ສີຟ້າ) ໃນສາມ atra hemolymphs.
ໄດ້ມີການວິເຄາະທັງໝົດ 482 ພະຍາດຕິດຕໍ່ກັນ.ຂໍ້ມູນທົ່ວໄປຂອງການແຈກຢາຍແບບ taxonomic ຂອງຄໍາບັນຍາຍ contig metaagenomic (prokaryotes ແລະ eukaryotes).B ການແຜ່ກະຈາຍລາຍລະອຽດຂອງຊິ້ນ DNA ຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍ BLASTN ແລະ BLASTX.
ການວິເຄາະ Kraken2 ຍັງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ mussel ccfDNA ມີຊິ້ນສ່ວນ DNA archaeal, ລວມທັງຊິ້ນ DNA ຂອງ Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ແລະ Thaurmarcheota (11%) (ຮູບ 6a).ການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ DNA ທີ່ມາຈາກ Euryarchaeota ແລະ Crenarchaeota, ກ່ອນຫນ້ານີ້ພົບເຫັນຢູ່ໃນຊຸມຊົນຈຸລິນຊີຂອງ mussels ຄາລິຟໍເນຍ, ບໍ່ຄວນແປກໃຈ [42].ເຖິງແມ່ນວ່າ Euryarchaeota ມັກຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບສະພາບທີ່ຮ້າຍແຮງ, ມັນໄດ້ຖືກຮັບຮູ້ໃນປັດຈຸບັນວ່າທັງ Euryarchaeota ແລະ Crenarcheota ແມ່ນໃນບັນດາ prokaryotes ທົ່ວໄປທີ່ສຸດໃນສະພາບແວດລ້ອມ cryogenic ທະເລ [43, 44].ການປະກົດຕົວຂອງຈຸລິນຊີ methanogenic ໃນ mussels ແມ່ນບໍ່ແປກໃຈ, ເນື່ອງຈາກບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາກ່ຽວກັບການຮົ່ວໄຫລຂອງ methane ຢ່າງກວ້າງຂວາງຈາກການຮົ່ວໄຫຼຢູ່ລຸ່ມສຸດພູພຽງ Kerguelen [45] ແລະການຜະລິດ methane microbial ທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ສັງເກດເຫັນຢູ່ນອກຊາຍຝັ່ງຂອງຫມູ່ເກາະ Kerguelen [46].
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຄວາມສົນໃຈຂອງພວກເຮົາໄດ້ຫັນໄປຫາການອ່ານຈາກໄວຣັສ DNA.ເພື່ອຄວາມຮູ້ທີ່ດີທີ່ສຸດຂອງພວກເຮົາ, ນີ້ແມ່ນການສຶກສານອກເປົ້າຫມາຍຄັ້ງທໍາອິດຂອງເນື້ອຫາໄວຣັສຂອງ mussels.ດັ່ງທີ່ຄາດໄວ້, ພວກເຮົາພົບເຫັນຊິ້ນ DNA ຂອງ bacteriophages (Caudovirales) (ຮູບ 6b).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, DNA ໄວຣັສທົ່ວໄປທີ່ສຸດແມ່ນມາຈາກ phylum ຂອງ nucleocytoviruses, ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າເຊື້ອໄວຣັສ DNA ຂະຫນາດໃຫຍ່ cytoplasmic nuclear (NCLDV), ເຊິ່ງມີ genome ທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດຂອງເຊື້ອໄວຣັສໃດໆ.ພາຍໃນ phylum ນີ້, ລໍາດັບ DNA ສ່ວນໃຫຍ່ເປັນຂອງຄອບຄົວ Mimimidoviridae (58%) ແລະ Poxviridae (21%), ເຈົ້າຂອງທໍາມະຊາດປະກອບມີສັດກະດູກສັນຫຼັງແລະ arthropods, ໃນຂະນະທີ່ອັດຕາສ່ວນຫນ້ອຍຂອງລໍາດັບ DNA ເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນຂອງ algae virological ທີ່ຮູ້ຈັກ.ຕິດເຊື້ອ algae eukaryotic ທະເລ.ລໍາດັບດັ່ງກ່າວຍັງໄດ້ຮັບຈາກເຊື້ອໄວຣັສ Pandora, ເຊື້ອໄວຣັສຍັກໃຫຍ່ທີ່ມີຂະຫນາດພັນທຸກໍາທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດຂອງເຊື້ອໄວຣັດທີ່ຮູ້ຈັກ.ຫນ້າສົນໃຈ, ຂອບເຂດຂອງເຈົ້າພາບທີ່ຮູ້ວ່າຕິດເຊື້ອໄວຣັດ, ຕາມການກໍານົດໂດຍລໍາດັບ hemolymph ccfDNA, ແມ່ນຂ້ອນຂ້າງໃຫຍ່ (ຮູບ S3, ຂໍ້ມູນເສີມ).ມັນປະກອບມີໄວຣັສທີ່ຕິດເຊື້ອແມງໄມ້ເຊັ່ນ Baculoviridae ແລະ Iridoviridae, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບເຊື້ອໄວຣັສທີ່ຕິດເຊື້ອ amoeba, algae ແລະກະດູກສັນຫຼັງ.ພວກເຮົາຍັງພົບເຫັນລໍາດັບທີ່ກົງກັບ genome Pithovirus sibericum.Pitoviruses (ຍັງເອີ້ນວ່າ "ເຊື້ອໄວຣັສ zombie") ໄດ້ຖືກແຍກອອກຄັ້ງທໍາອິດຈາກ permafrost ອາຍຸ 30,000 ປີໃນ Siberia [47].ດັ່ງນັ້ນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາແມ່ນສອດຄ່ອງກັບບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ແມ່ນທຸກຊະນິດທີ່ທັນສະໄຫມຂອງເຊື້ອໄວຣັສເຫຼົ່ານີ້ຈະສູນພັນ [48] ແລະວ່າໄວຣັສເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະມີຢູ່ໃນລະບົບນິເວດທະເລ subarctic ຫ່າງໄກສອກຫຼີກ.
ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາທົດສອບເພື່ອເບິ່ງວ່າພວກເຮົາສາມາດຊອກຫາຊິ້ນ DNA ຈາກສັດ multicellular ອື່ນໆ.ຈໍານວນທັງຫມົດ 482 contigs ຕ່າງປະເທດໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍ BLASTN ແລະ BLASTX ກັບຫ້ອງສະຫມຸດ nt, nr ແລະ RefSeq (genomic ແລະທາດໂປຼຕີນ).ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນບັນດາ fragments ຕ່າງປະເທດຂອງ ccfDNA ຂອງສັດ multicellular DNA ຂອງກະດູກກະດູກ predominates (ຮູບ 5).ຍັງພົບເຫັນຊິ້ນສ່ວນ DNA ຈາກແມງໄມ້ ແລະຊະນິດອື່ນໆ.ຊິ້ນສ່ວນ DNA ທີ່ຂ້ອນຂ້າງໃຫຍ່ບໍ່ໄດ້ຖືກລະບຸ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນການສະແດງອອກຂອງຊະນິດພັນທະເລຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍໃນຖານຂໍ້ມູນພັນທຸກໍາເມື່ອທຽບໃສ່ກັບຊະນິດພັນເທິງບົກ [49].
ໃນເອກະສານປະຈຸບັນ, ພວກເຮົານໍາໃຊ້ແນວຄວາມຄິດ LB ກັບ mussels, ການໂຕ້ຖຽງວ່າລໍາດັບການສັກຢາ hemolymph ccfDNA ສາມາດໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບອົງປະກອບຂອງລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງທະເລ.ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າ 1) mussel hemolymph ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂ້ອນຂ້າງສູງ (ລະດັບ microgram) ຂ້ອນຂ້າງໃຫຍ່ (~1-5 kb) ແຜ່ກະຈາຍຊິ້ນ DNA;2) ຊິ້ນ DNA ເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນມີທັງເອກະລາດແລະບໍ່ເປັນເອກະລາດ 3) ໃນບັນດາແຫຼ່ງຕ່າງປະເທດຂອງຊິ້ນ DNA ເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາພົບເຫັນ DNA ເຊື້ອແບັກທີເລຍ, archaeal ແລະ viral, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບ DNA ຂອງສັດ multicellular ອື່ນໆ;4) ການສະສົມຂອງຊິ້ນ ccfDNA ຕ່າງປະເທດເຫຼົ່ານີ້ຢູ່ໃນ hemolymph ເກີດຂື້ນຢ່າງໄວວາແລະປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນກິດຈະກໍາການກັ່ນຕອງພາຍໃນຂອງ mussels.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແນວຄວາມຄິດຂອງ LB, ເຊິ່ງມາຮອດປັດຈຸບັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນສ່ວນໃຫຍ່ໃນດ້ານຊີວະຢາ, ໄດ້ເຂົ້າລະຫັດແຫຼ່ງຄວາມຮູ້ທີ່ອຸດົມສົມບູນແຕ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການຂຸດຄົ້ນເຊິ່ງສາມາດນໍາໃຊ້ເພື່ອເຂົ້າໃຈການພົວພັນລະຫວ່າງຊະນິດ sentinel ແລະສະພາບແວດລ້ອມຂອງມັນໄດ້ດີຂຶ້ນ.
ນອກເຫນືອໄປຈາກ primates, ການໂດດດ່ຽວ ccfDNA ໄດ້ຖືກລາຍງານຢູ່ໃນສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ, ລວມທັງຫນູ, ຫມາ, ແມວ, ແລະມ້າ [50, 51, 52].ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເພື່ອຄວາມຮູ້ຂອງພວກເຮົາ, ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາແມ່ນຄັ້ງທໍາອິດທີ່ຈະລາຍງານການກວດພົບແລະການຈັດລໍາດັບຂອງ ccfDNA ໃນສັດນ້ໍາທະເລທີ່ມີລະບົບການໄຫຼວຽນເປີດ.ຄຸນລັກສະນະທາງກາຍະພາບນີ້ແລະຄວາມສາມາດໃນການກັ່ນຕອງຂອງ mussels ອາດຈະ, ຢ່າງຫນ້ອຍໃນບາງສ່ວນ, ອະທິບາຍລັກສະນະຂະຫນາດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງການໄຫຼວຽນຂອງຊິ້ນ DNA ເມື່ອທຽບກັບຊະນິດອື່ນໆ.ໃນມະນຸດ, ຊິ້ນສ່ວນ DNA ສ່ວນໃຫຍ່ທີ່ໄຫຼວຽນຢູ່ໃນເລືອດແມ່ນຊິ້ນນ້ອຍໆທີ່ມີຂະຫນາດຕັ້ງແຕ່ 150 ຫາ 200 bp.ດ້ວຍລະດັບສູງສຸດ 167 bp [34, 53].ສ່ວນຂະຫນາດນ້ອຍແຕ່ສໍາຄັນຂອງຊິ້ນ DNA ແມ່ນຢູ່ລະຫວ່າງ 300 ແລະ 500 bp ໃນຂະຫນາດ, ແລະປະມານ 5% ແມ່ນຍາວກວ່າ 900 bp.[54].ເຫດຜົນສໍາລັບການແຜ່ກະຈາຍຂອງຂະຫນາດນີ້ແມ່ນວ່າແຫຼ່ງຕົ້ນຕໍຂອງ ccfDNA ໃນ plasma ເກີດຂື້ນເປັນຜົນມາຈາກການຕາຍຂອງເຊນ, ບໍ່ວ່າຈະເປັນການຕາຍຂອງເຊນຫຼືເນື່ອງຈາກ necrosis ຂອງຈຸລັງ hematopoietic ແຜ່ກະຈາຍຢູ່ໃນບຸກຄົນທີ່ມີສຸຂະພາບດີຫຼືຍ້ອນ apoptosis ຂອງຈຸລັງ tumor ໃນຄົນເຈັບທີ່ເປັນມະເຮັງ (ເອີ້ນວ່າ DNA tumor circulating)., ctDNA).ການແຜ່ກະຈາຍຂະຫນາດຂອງ hemolymph ccfDNA ທີ່ພວກເຮົາພົບເຫັນຢູ່ໃນ mussels ຕັ້ງແຕ່ 1000 ຫາ 5000 bp, ແນະນໍາວ່າ mussel ccfDNA ມີຕົ້ນກໍາເນີດທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ນີ້ແມ່ນສົມມຸດຕິຖານທີ່ມີເຫດຜົນ, ເນື່ອງຈາກວ່າ mussels ມີລະບົບ vascular ເຄິ່ງເປີດແລະອາໄສຢູ່ໃນສະພາບແວດລ້ອມນ້ໍາທະເລທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງຂອງ DNA ພັນທຸ ກຳ ຂອງຈຸລິນຊີ.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ການທົດລອງໃນຫ້ອງທົດລອງຂອງພວກເຮົາໂດຍໃຊ້ DNA exogenous ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ mussels ໄດ້ສະສົມຊິ້ນ DNA ໃນນ້ໍາທະເລ, ຢ່າງຫນ້ອຍຫຼັງຈາກສອງສາມຊົ່ວໂມງພວກມັນຖືກທໍາລາຍຫຼັງຈາກການດູດຊຶມຂອງຈຸລັງແລະ / ຫຼືປ່ອຍອອກມາແລະ / ຫຼືເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອົງການຈັດຕັ້ງຕ່າງໆ.ເນື່ອງຈາກຄວາມຫາຍາກຂອງຈຸລັງ (ທັງ prokaryotic ແລະ eukaryotic), ການນໍາໃຊ້ intravalvular compartments ຈະຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງ ccfDNA ຈາກແຫຼ່ງຂອງຕົນເອງເຊັ່ນດຽວກັນກັບແຫຼ່ງຕ່າງປະເທດ.ພິຈາລະນາຄວາມສໍາຄັນຂອງພູມຕ້ານທານພາຍໃນ bivalve ແລະຈໍານວນ phagocytes ໄຫຼວຽນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານຕື່ມອີກວ່າເຖິງແມ່ນວ່າ ccfDNA ຕ່າງປະເທດກໍ່ອຸດົມດ້ວຍ phagocytes ໄຫຼວຽນທີ່ສະສົມ DNA ຕ່າງປະເທດເມື່ອກິນຈຸລິນຊີແລະ / ຫຼືສິ່ງເສດເຫຼືອຂອງຈຸລັງ.ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ bivalve hemolymph ccfDNA ເປັນບ່ອນເກັບຂໍ້ມູນໂມເລກຸນທີ່ເປັນເອກະລັກແລະເສີມສ້າງສະຖານະພາບຂອງພວກມັນເປັນສາຍພັນ sentinel.
ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການຈັດລໍາດັບແລະການວິເຄາະຊິ້ນສ່ວນ hemolymph ccfDNA ທີ່ມາຈາກເຊື້ອແບັກທີເຣັຍສາມາດສະຫນອງຂໍ້ມູນທີ່ສໍາຄັນກ່ຽວກັບພືດທີ່ເປັນເຈົ້າພາບແລະເຊື້ອແບັກທີເຣັຍທີ່ມີຢູ່ໃນລະບົບນິເວດທະເລອ້ອມຂ້າງ.ເຕັກນິກການຈັດລໍາດັບການສັກຢາໄດ້ເປີດເຜີຍລໍາດັບຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ commensal A. atra gill ທີ່ຈະຖືກພາດຖ້າວິທີການກໍານົດ 16S rRNA ແບບດັ້ງເດີມໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້, ອັນເນື່ອງມາຈາກຄວາມລໍາອຽງຂອງຫ້ອງສະຫມຸດອ້າງອີງ.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ການນໍາໃຊ້ຂໍ້ມູນ LB ຂອງພວກເຮົາເກັບກໍາຈາກ M. platensis ໃນຊັ້ນ mussel ດຽວກັນຢູ່ Kerguelen ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າອົງປະກອບຂອງ gill-associated bacterial symbionts ແມ່ນຄືກັນສໍາລັບທັງສອງຊະນິດຂອງ mussel (ຮູບ S4, ຂໍ້ມູນເສີມ).ຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງແມງກະເບື້ອທີ່ແຕກຕ່າງກັນທາງພັນທຸກໍານີ້ອາດຈະສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງອົງປະກອບຂອງຊຸມຊົນທີ່ມີເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຢູ່ໃນບ່ອນເຢັນ, ຊູນຟູຣິກ, ແລະພູເຂົາໄຟຂອງ Kerguelen [55, 56, 57, 58].ລະດັບສູງຂອງຈຸລິນຊີທີ່ຫຼຸດຜ່ອນການຊູນຟູຣິກໄດ້ຖືກອະທິບາຍໄດ້ດີໃນເວລາທີ່ການຂຸດຄົ້ນ mussels ຈາກເຂດຊາຍຝັ່ງ bioturbated [59], ເຊັ່ນ coast ຂອງ Port-au-France.ຄວາມເປັນໄປໄດ້ອີກຢ່າງຫນຶ່ງແມ່ນວ່າ flora mussel commensal ອາດຈະໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກການສົ່ງຜ່ານທາງນອນ [60, 61].ຈໍາເປັນຕ້ອງມີການຄົ້ນຄວ້າເພີ່ມເຕີມເພື່ອກໍານົດຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັນລະຫວ່າງສະພາບແວດລ້ອມທາງທະເລ, ພື້ນຜິວທະເລ, ແລະອົງປະກອບຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ symbiotic ໃນ mussels.ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ກຳລັງດຳເນີນຢູ່.
ຄວາມຍາວແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ hemolymph ccfDNA, ຄວາມງ່າຍຂອງການທໍາຄວາມສະອາດຂອງມັນ, ແລະຄຸນນະພາບສູງເພື່ອອະນຸຍາດໃຫ້ການຈັດລໍາດັບປືນໄວແມ່ນບາງຂໍ້ໄດ້ປຽບຂອງການໃຊ້ mussel ccfDNA ເພື່ອປະເມີນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຊີວະນາໆພັນໃນລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງທະເລ.ວິທີການນີ້ແມ່ນມີປະສິດທິພາບໂດຍສະເພາະສໍາລັບການກໍານົດລັກສະນະຂອງຊຸມຊົນໄວຣັສ (viromes) ໃນລະບົບນິເວດທີ່ໃຫ້ [62, 63].ບໍ່ເຫມືອນກັບເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, archaea, ແລະ eukaryotes, genomes ໄວຣັສບໍ່ມີ genes ອະນຸລັກທາງທໍາມະຊາດເຊັ່ນ: ລໍາດັບ 16S.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການກວດທາດແຫຼວຈາກຊະນິດຕົວຊີ້ວັດເຊັ່ນ: ແມງສາບສາມາດຖືກໃຊ້ເພື່ອລະບຸຊິ້ນສ່ວນເຊື້ອໄວຣັສ ccfDNA ຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍທີ່ຮູ້ກັນວ່າຕິດເຊື້ອເຈົ້າພາບທີ່ປົກກະຕິອາໄສຢູ່ໃນລະບົບນິເວດທະເລຊາຍຝັ່ງ.ອັນນີ້ລວມເຖິງໄວຣັສທີ່ຮູ້ກັນວ່າຕິດເຊື້ອໂປຣໂຕຊົວ, ກະດູກແຂນຂາ, ແມງໄມ້, ພືດ, ແລະໄວຣັສແບັກທີເລຍ (ເຊັ່ນ: ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ).ການແຜ່ກະຈາຍທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ຖືກພົບເຫັນໃນເວລາທີ່ພວກເຮົາກວດສອບ hemolymph ccfDNA virome ຂອງ mussels ສີຟ້າ (M. platensis) ເກັບກໍາຢູ່ໃນຊັ້ນ mussel ດຽວກັນຢູ່ Kerguelen (ຕາຕະລາງ S2, ຂໍ້ມູນເສີມ).ການຈັດລຽງຕາມລຳດັບຂອງ ccfDNA ແທ້ຈິງແລ້ວແມ່ນເປັນວິທີການໃໝ່ທີ່ໄດ້ຮັບແຮງບັນດານໃຈໃນການສຶກສາ virome ຂອງມະນຸດ ຫຼືຊະນິດອື່ນໆ [21, 37, 64].ວິທີການນີ້ແມ່ນເປັນປະໂຫຍດໂດຍສະເພາະສໍາລັບການສຶກສາໄວຣັສ DNA ສອງສາຍ, ນັບຕັ້ງແຕ່ບໍ່ມີເຊື້ອສາຍດຽວທີ່ຖືກຮັກສາໄວ້ໃນບັນດາເຊື້ອໄວຣັສ DNA ສອງສາຍ, ເຊິ່ງເປັນຕົວແທນຂອງປະເພດໄວຣັສທີ່ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍແລະກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດໃນ Baltimore [65].ເຖິງແມ່ນວ່າເຊື້ອໄວຣັສເຫຼົ່ານີ້ສ່ວນໃຫຍ່ຍັງບໍ່ຖືກຈັດປະເພດແລະອາດຈະປະກອບມີໄວຣັສຈາກພາກສ່ວນທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກຢ່າງສົມບູນຂອງໂລກໄວຣັສ [66], ພວກເຮົາພົບວ່າ viromes ແລະລະດັບເຈົ້າພາບຂອງ mussels A. atra ແລະ M. platensis ຕົກຢູ່ລະຫວ່າງສອງຊະນິດ.ເຊັ່ນດຽວກັນ (ເບິ່ງຮູບ S3, ຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມ).ຄວາມຄ້າຍຄືກັນນີ້ບໍ່ແປກໃຈ, ຍ້ອນວ່າມັນອາດຈະສະທ້ອນເຖິງການຂາດການຄັດເລືອກໃນການດູດເອົາ DNA ທີ່ມີຢູ່ໃນສະພາບແວດລ້ອມ.ການສຶກສາໃນອະນາຄົດໂດຍນໍາໃຊ້ RNA ບໍລິສຸດແມ່ນມີຄວາມຈໍາເປັນໃນປັດຈຸບັນເພື່ອກໍານົດລັກສະນະ RNA virome.
ໃນການສຶກສາຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ທໍ່ທີ່ເຄັ່ງຄັດຫຼາຍທີ່ດັດແປງຈາກການເຮັດວຽກຂອງ Kowarski ແລະເພື່ອນຮ່ວມງານ [37], ຜູ້ທີ່ໃຊ້ການລຶບສອງຂັ້ນຕອນຂອງການອ່ານແບບລວມກັນແລະ contigs ກ່ອນແລະຫຼັງຈາກການປະກອບຂອງ ccfDNA ພື້ນເມືອງ, ເຮັດໃຫ້ມີອັດຕາສ່ວນສູງຂອງການອ່ານທີ່ບໍ່ມີແຜນທີ່.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາບໍ່ສາມາດປະຕິເສດໄດ້ວ່າບາງການອ່ານທີ່ບໍ່ມີແຜນທີ່ເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະຍັງມີຕົ້ນກໍາເນີດຂອງຕົນເອງ, ຕົ້ນຕໍແມ່ນຍ້ອນວ່າພວກເຮົາບໍ່ມີ genome ອ້າງອີງສໍາລັບຊະນິດ mussel ນີ້.ພວກເຮົາຍັງໄດ້ນໍາໃຊ້ທໍ່ນີ້ເພາະວ່າພວກເຮົາມີຄວາມກັງວົນກ່ຽວກັບ chimeras ລະຫວ່າງການອ່ານດ້ວຍຕົນເອງແລະບໍ່ແມ່ນຕົວຕົນແລະຄວາມຍາວການອ່ານທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ Illumina MiSeq PE75.ເຫດຜົນອີກຢ່າງຫນຶ່ງສໍາລັບການອ່ານທີ່ບໍ່ມີຕາຕະລາງສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນວ່າຈຸລິນຊີໃນທະເລຫຼາຍ, ໂດຍສະເພາະໃນເຂດຫ່າງໄກສອກຫຼີກເຊັ່ນ Kerguelen, ບໍ່ໄດ້ຖືກອະທິບາຍ.ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ Illumina MiSeq PE75, ສົມມຸດວ່າ ccfDNA fragment ຄວາມຍາວຄ້າຍຄືກັນກັບ ccfDNA ຂອງມະນຸດ.ສໍາລັບການສຶກສາໃນອະນາຄົດ, ເນື່ອງຈາກຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ hemolymph ccfDNA ອ່ານໄດ້ດົນກວ່າມະນຸດແລະ / ຫຼືສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ, ພວກເຮົາແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ແພລະຕະຟອມການຈັດລໍາດັບທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບຊິ້ນ ccfDNA ທີ່ຍາວກວ່າ.ການປະຕິບັດນີ້ຈະເຮັດໃຫ້ມັນງ່າຍຂຶ້ນຫຼາຍໃນການກໍານົດຕົວຊີ້ບອກເພີ່ມເຕີມສໍາລັບການວິເຄາະທີ່ເລິກເຊິ່ງ.ການໄດ້ຮັບລໍາດັບ genome A. atra nuclear ທີ່ສົມບູນທີ່ຍັງບໍ່ທັນມີໃນປັດຈຸບັນຍັງຈະອໍານວຍຄວາມສະດວກຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນການຈໍາແນກຂອງ ccfDNA ຈາກແຫຼ່ງຂອງຕົນເອງແລະບໍ່ແມ່ນຂອງຕົນເອງ.ເນື່ອງຈາກການຄົ້ນຄວ້າຂອງພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງການນໍາໃຊ້ແນວຄວາມຄິດຂອງ biopsy ແຫຼວກັບ mussels, ພວກເຮົາຫວັງວ່າຍ້ອນວ່າແນວຄວາມຄິດນີ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການຄົ້ນຄວ້າໃນອະນາຄົດ, ເຄື່ອງມືແລະທໍ່ໃຫມ່ຈະຖືກພັດທະນາເພື່ອເພີ່ມທ່າແຮງຂອງວິທີການນີ້ໃນການສຶກສາຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຈຸລິນຊີຂອງ mussels.ລະບົບນິເວດທະເລ.
ໃນຖານະທີ່ເປັນຕົວຊີ້ບອກທາງຄລີນິກທີ່ບໍ່ມີການບຸກລຸກ, ລະດັບ ccfDNA ຂອງມະນຸດທີ່ສູງຂື້ນໃນ plasma ຂອງມະນຸດແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດຕ່າງໆ, ຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ, ແລະເງື່ອນໄຂຄວາມກົດດັນ [67,68,69].ການເພີ່ມຂຶ້ນນີ້ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບການປ່ອຍຊິ້ນ DNA ຂອງຕົ້ນກໍາເນີດຂອງຕົນເອງຫຼັງຈາກຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ.ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ແກ້​ໄຂ​ບັນ​ຫາ​ນີ້​ໂດຍ​ນໍາ​ໃຊ້​ຄວາມ​ກົດ​ດັນ​ຄວາມ​ຮ້ອນ​ສ້ວຍ​ແຫຼມ​, ໃນ​ທີ່​ແມງ​ໄມ້​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ສໍາ​ຜັດ​ໂດຍ​ຫຍໍ້​ກັບ​ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຂອງ 30 ° C​.ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການວິເຄາະນີ້ກ່ຽວກັບສາມປະເພດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ mussels ໃນສາມການທົດລອງເອກະລາດ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ພົບເຫັນການປ່ຽນແປງໃດໆໃນລະດັບ ccfDNA ຫຼັງຈາກຄວາມກົດດັນຄວາມຮ້ອນສ້ວຍແຫຼມ (ເບິ່ງຮູບ S5, ຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມ).ການຄົ້ນພົບນີ້ອາດຈະອະທິບາຍ, ຢ່າງຫນ້ອຍໃນບາງສ່ວນ, ຄວາມຈິງທີ່ວ່າ mussels ມີລະບົບການໄຫຼວຽນຂອງເຄິ່ງເປີດແລະສະສົມຂອງ DNA ຕ່າງປະເທດຈໍານວນຫຼາຍເນື່ອງຈາກກິດຈະກໍາການກັ່ນຕອງສູງ.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ແມງກະເບື້ອ, ຄືກັບສັດທີ່ບໍ່ມີກະດູກສັນຫຼັງຫຼາຍ, ອາດຈະທົນທານຕໍ່ຄວາມເສຍຫາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມກົດດັນ, ດັ່ງນັ້ນການຈໍາກັດການປ່ອຍ ccfDNA ໃນ hemolymph ຂອງພວກເຂົາ [70, 71].
ມາຮອດປະຈຸ, ການວິເຄາະ DNA ຂອງຊີວະນາໆພັນໃນລະບົບນິເວດນ້ໍາໄດ້ສຸມໃສ່ການ metabarcoding DNA ຂອງສິ່ງແວດລ້ອມ (eDNA).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ວິທີການນີ້ມັກຈະຖືກຈໍາກັດໃນການວິເຄາະຊີວະນາໆພັນໃນເວລາທີ່ primers ຖືກນໍາໃຊ້.ການນໍາໃຊ້ການຈັດລໍາດັບປືນໄດ້ຫລີກລ່ຽງຂໍ້ຈໍາກັດຂອງ PCR ແລະການຄັດເລືອກແບບລໍາອຽງຂອງຊຸດ primer.ດັ່ງນັ້ນ, ໃນຄວາມຫມາຍ, ວິທີການຂອງພວກເຮົາແມ່ນໃກ້ຊິດກັບວິທີການລໍາດັບ eDNA Shotgun ທີ່ມີຄວາມໄວສູງທີ່ໃຊ້ໃນບໍ່ດົນມານີ້, ເຊິ່ງສາມາດຈັດລໍາດັບ DNA ທີ່ແຕກແຍກໂດຍກົງແລະວິເຄາະເກືອບທຸກສິ່ງມີຊີວິດ [72, 73].ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ມີຫຼາຍບັນຫາພື້ນຖານທີ່ຈໍາແນກ LB ຈາກວິທີການ eDNA ມາດຕະຖານ.ແນ່ນອນ, ຄວາມແຕກຕ່າງຕົ້ນຕໍລະຫວ່າງ eDNA ແລະ LB ແມ່ນການນໍາໃຊ້ຕົວກອງທໍາມະຊາດ.ການນໍາໃຊ້ສັດນ້ໍາທະເລເຊັ່ນ: sponges ແລະ bivalves (Dresseina spp.) ເປັນການກັ່ນຕອງທໍາມະຊາດສໍາລັບການສຶກສາ eDNA ໄດ້ຖືກລາຍງານ [74, 75].ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການສຶກສາຂອງ Dreissena ໄດ້ນໍາໃຊ້ການ biopsies ເນື້ອເຍື່ອຈາກ DNA ໄດ້ຖືກສະກັດ.ການວິເຄາະ ccfDNA ຈາກ LB ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີເນື້ອເຍື່ອ biopsy, ອຸປະກອນພິເສດແລະບາງຄັ້ງລາຄາແພງແລະການຂົນສົ່ງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ eDNA ຫຼື biopsy ເນື້ອເຍື່ອ.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ພວກເຮົາບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ລາຍງານວ່າ ccfDNA ຈາກ LB ສາມາດຖືກເກັບຮັກສາແລະວິເຄາະດ້ວຍການສະຫນັບສະຫນູນ FTA ໂດຍບໍ່ມີການຮັກສາລະບົບຕ່ອງໂສ້ເຢັນ, ເຊິ່ງເປັນສິ່ງທ້າທາຍທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບການຄົ້ນຄວ້າໃນເຂດຫ່າງໄກສອກຫຼີກ [76].ການສະກັດເອົາ ccfDNA ຈາກການກວດເລືອດຂອງແຫຼວແມ່ນຍັງງ່າຍດາຍແລະສະຫນອງ DNA ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງສໍາລັບການຈັດລໍາດັບປືນແລະການວິເຄາະ PCR.ນີ້ແມ່ນປະໂຫຍດອັນໃຫຍ່ຫຼວງຍ້ອນບາງຂໍ້ຈໍາກັດດ້ານວິຊາການທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການວິເຄາະ eDNA [77].ຄວາມງ່າຍດາຍແລະຄ່າໃຊ້ຈ່າຍຕ່ໍາຂອງວິທີການເກັບຕົວຢ່າງແມ່ນເຫມາະສົມໂດຍສະເພາະສໍາລັບໂຄງການຕິດຕາມໄລຍະຍາວ.ນອກເຫນືອຈາກຄວາມສາມາດໃນການກັ່ນຕອງສູງຂອງພວກເຂົາ, ລັກສະນະທີ່ມີຊື່ສຽງອີກອັນຫນຶ່ງຂອງ bivalves ແມ່ນອົງປະກອບຂອງ mucopolysaccharide ສານເຄມີຂອງຂີ້ມູກຂອງພວກເຂົາ, ເຊິ່ງສົ່ງເສີມການດູດຊຶມຂອງໄວຣັສ [78, 79].ນີ້ເຮັດໃຫ້ bivalves ເປັນຕົວກອງທໍາມະຊາດທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບລັກສະນະຊີວະນາໆພັນແລະຜົນກະທົບຂອງການປ່ຽນແປງດິນຟ້າອາກາດໃນລະບົບນິເວດນ້ໍາ.ເຖິງແມ່ນວ່າການປະກົດຕົວຂອງຊິ້ນ DNA ທີ່ມາຈາກເຈົ້າພາບສາມາດເຫັນໄດ້ວ່າເປັນຂໍ້ຈໍາກັດຂອງວິທີການທຽບກັບ eDNA, ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການມີ ccfDNA ພື້ນເມືອງດັ່ງກ່າວທຽບກັບ eDNA ແມ່ນມີຄວາມເຂົ້າໃຈພ້ອມໆກັນສໍາລັບຂໍ້ມູນຈໍານວນຫລາຍທີ່ມີສໍາລັບການສຶກສາສຸຂະພາບ.ເຈົ້າພາບຊົດເຊີຍ.ນີ້ປະກອບມີການປະກົດຕົວຂອງລໍາດັບໄວຣັສທີ່ປະສົມປະສານເຂົ້າໄປໃນ genome ຂອງເຈົ້າພາບເຈົ້າພາບ.ນີ້ເປັນສິ່ງສໍາຄັນໂດຍສະເພາະສໍາລັບ mussels, ເນື່ອງຈາກການມີ leukemic retroviruses ຢຽດຕາມທາງຂວາງຢູ່ໃນ bivalves [80, 81].ປະໂຫຍດອີກອັນຫນຶ່ງຂອງ LB ຫຼາຍກວ່າ eDNA ແມ່ນວ່າມັນຂຸດຄົ້ນກິດຈະກໍາ phagocytic ຂອງການໄຫຼວຽນຂອງເມັດເລືອດໃນ hemolymph, ເຊິ່ງ engulfs ຈຸລິນຊີ (ແລະ genomes ຂອງພວກມັນ).Phagocytosis ແມ່ນຫນ້າທີ່ຕົ້ນຕໍຂອງເມັດເລືອດໃນ bivalves [82].ສຸດທ້າຍ, ວິທີການໃຊ້ປະໂຫຍດຈາກຄວາມສາມາດໃນການກັ່ນຕອງສູງຂອງຫອຍ (ໂດຍສະເລ່ຍ 1.5 ລິດ / ຊົ່ວໂມງຂອງນ້ໍາທະເລ) ແລະການໄຫຼວຽນຂອງສອງມື້, ເຊິ່ງເພີ່ມການປະສົມຂອງຊັ້ນຕ່າງໆຂອງນ້ໍາທະເລ, ຊ່ວຍໃຫ້ການຈັບຕົວຂອງ eDNA ທີ່ເປັນມໍລະດົກ.[83, 84].ດັ່ງນັ້ນ, ການວິເຄາະ ccfDNA ຂອງ mussel ແມ່ນເສັ້ນທາງທີ່ຫນ້າສົນໃຈຍ້ອນຜົນກະທົບດ້ານໂພຊະນາການ, ເສດຖະກິດ, ແລະສິ່ງແວດລ້ອມຂອງ mussels.ຄ້າຍຄືກັນກັບການວິເຄາະຂອງ LB ທີ່ເກັບກໍາຈາກມະນຸດ, ວິທີການນີ້ຍັງເປີດຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງການວັດແທກການປ່ຽນແປງທາງພັນທຸກໍາແລະ epigenetic ໃນ DNA ເຈົ້າພາບໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ສານ exogenous.ຕົວຢ່າງ, ເຕັກໂນໂລຢີການຈັດລໍາດັບຮຸ່ນທີສາມສາມາດຖືກຄາດຫມາຍເພື່ອປະຕິບັດການວິເຄາະ methylation ກວ້າງ genome ໃນ ccfDNA ພື້ນເມືອງໂດຍໃຊ້ລໍາດັບ nanopore.ຂະບວນການນີ້ຄວນໄດ້ຮັບການອໍານວຍຄວາມສະດວກໂດຍຄວາມຈິງທີ່ວ່າຊິ້ນສ່ວນຂອງ mussel ccfDNA ແມ່ນເຫມາະສົມທີ່ເຫມາະສົມກັບເວທີການຈັດລໍາດັບທີ່ອ່ານຍາວທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ການວິເຄາະ genome-wide DNA methylation ຈາກການດໍາເນີນການລໍາດັບດຽວໂດຍບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີການຫັນປ່ຽນທາງເຄມີ.ດັ່ງນັ້ນ, ມັນສາມາດສະຫນອງຄວາມເຂົ້າໃຈທີ່ມີຄຸນຄ່າໃນກົນໄກພື້ນຖານທີ່ຄວບຄຸມການຕອບສະຫນອງຫຼັງຈາກການສໍາຜັດກັບການປ່ຽນແປງດິນຟ້າອາກາດຫຼືມົນລະພິດ [87].ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການນໍາໃຊ້ LB ບໍ່ແມ່ນບໍ່ມີຂໍ້ຈໍາກັດ.ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງເວົ້າ, ນີ້ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປະກົດຕົວຂອງຊະນິດຕົວຊີ້ວັດໃນລະບົບນິເວດ.ດັ່ງທີ່ໄດ້ກ່າວມາຂ້າງເທິງ, ການນໍາໃຊ້ LB ເພື່ອປະເມີນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງລະບົບນິເວດທີ່ກໍານົດຍັງຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີທໍ່ bioinformatics ທີ່ເຄັ່ງຄັດທີ່ຄໍານຶງເຖິງການມີຊິ້ນ DNA ຈາກແຫຼ່ງ.ບັນຫາໃຫຍ່ອີກອັນໜຶ່ງແມ່ນການມີ genomes ອ້າງອີງສຳລັບຊະນິດພັນທະເລ.ມັນຫວັງວ່າການລິເລີ່ມເຊັ່ນໂຄງການພັນທຸກໍາຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມທະເລແລະໂຄງການ Fish10k ທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນເມື່ອໄວໆມານີ້ [88] ຈະສ້າງຄວາມສະດວກໃນການວິເຄາະດັ່ງກ່າວໃນອະນາຄົດ.ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຂອງແນວຄວາມຄິດ LB ກັບສິ່ງມີຊີວິດການກັ່ນຕອງນ້ໍາທະເລຍັງເຂົ້າກັນໄດ້ກັບຄວາມກ້າວຫນ້າຫລ້າສຸດຂອງເຕັກໂນໂລຊີລໍາດັບ, ເຮັດໃຫ້ມັນເຫມາະສົມດີສໍາລັບການພັດທະນາຂອງ multi-ohm biomarkers ເພື່ອສະຫນອງຂໍ້ມູນທີ່ສໍາຄັນກ່ຽວກັບສຸຂະພາບຂອງທີ່ຢູ່ອາໄສໃນທະເລເພື່ອຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນດ້ານສິ່ງແວດລ້ອມ.
ຂໍ້ມູນການຈັດລໍາດັບ Genome ໄດ້ຖືກຝາກໄວ້ໃນ NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ພາຍໃຕ້ Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ ຜົນກະທົບຂອງການປ່ຽນແປງດິນຟ້າອາກາດຕໍ່ຊີວິດໃນທະເລແລະລະບົບນິເວດ.ຊີວະວິທະຍາ Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.ພິ​ຈາ​ລະ​ນາ​ຜົນ​ກະ​ທົບ​ລວມ​ຂອງ​ການ​ປ່ຽນ​ແປງ​ຂອງ​ດິນ​ຟ້າ​ອາ​ກາດ​ແລະ​ຄວາມ​ກົດ​ດັນ​ຂອງ​ທ້ອງ​ຖິ່ນ​ອື່ນໆ​ກ່ຽວ​ກັບ​ສະ​ພາບ​ແວດ​ລ້ອມ​ທາງ​ທະ​ເລ​.ສະພາບແວດລ້ອມວິທະຍາສາດທົ່ວໄປ.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).ວິທະຍາສາດທໍາອິດຂອງເດືອນມີນາ.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. ການຫຼຸດຜ່ອນຄວາມທົນທານຕໍ່ຄວາມຮ້ອນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຄວາມກົດດັນຂອງຄວາມຮ້ອນຊ້ໍາຊ້ອນອະທິບາຍເຖິງອັດຕາການຕາຍໃນຊ່ວງລຶະເບິ່ງຮ້ອນສູງຂອງແມງກະເບື້ອສີຟ້າ.ບົດລາຍງານວິທະຍາສາດ 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.ການປ່ຽນແປງທີ່ຜ່ານມາກ່ຽວກັບຄວາມຖີ່, ສາເຫດ ແລະຂອບເຂດຂອງການຕາຍຂອງສັດ.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.ເຊື້ອພະຍາດທີ່ບໍ່ສະເພາະຫຼາຍຊະນິດອາດເຮັດໃຫ້ເກີດການຕາຍຂອງ Pinna nobilis ມະຫາຊົນ.ຊີວິດ.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.ຜົນກະທົບທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງການປ່ຽນແປງດິນຟ້າອາກາດຕໍ່ພະຍາດ zoonotic Arctic.ສຸຂະພາບຂອງ Int J Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.ແມງກະເບື້ອສີຟ້າ (Mytilus edulis spp.) ເປັນສິ່ງມີຊີວິດສັນຍານໃນການຕິດຕາມມົນລະພິດແຄມທະເລ: ການທົບທວນຄືນ.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. ການປະສົມປະສານຂອງ biopsy ແຫຼວໃນການປິ່ນປົວມະເຮັງ.Nat Rev Clean Oncol.ປີ 2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.ການເຕີບໃຫຍ່ຂອງການກວດ biopsy ຂອງແຫຼວ: ອະນຸຍາດໃຫ້ DNA ຂອງ tumor ແຜ່ລາມ.ມະເຮັງ Nat Rev.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. ອາຊິດ Nucleic ໃນ plasma ຂອງມະນຸດ.ບົດບັນທຶກກອງປະຊຸມຂອງບໍລິສັດຍ່ອຍ Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. ບົດບາດໃຫມ່ສໍາລັບ DNA ບໍ່ມີຈຸລັງເປັນເຄື່ອງຫມາຍໂມເລກຸນສໍາລັບການປິ່ນປົວມະເຮັງ.ປະລິມານການວິເຄາະ biomolar.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy ເຂົ້າໄປໃນຄລີນິກ - ບັນຫາການປະຕິບັດແລະສິ່ງທ້າທາຍໃນອະນາຄົດ.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ແລະອື່ນໆ.DNA ຂອງ fetal ມີຢູ່ໃນ plasma ຂອງແມ່ແລະ serum.Lancet.ປີ 1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ການສຶກສາຫຼັກສູດຂອງການຖືພາແລະອາການແຊກຊ້ອນຂອງມັນໂດຍໃຊ້ RNA extracellular circulating ໃນເລືອດຂອງແມ່ຍິງໃນລະຫວ່າງການຖືພາ.Dopediatrics.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.ການກວດຮ່າງກາຍຂອງແຫຼວ: DNA ທີ່ບໍ່ມີຈຸລັງຂອງຜູ້ໃຫ້ບໍລິຈາກແມ່ນໃຊ້ເພື່ອກວດຫາບາດແຜ allogeneic ໃນຕ່ອມຫມາກໄຂ່ຫຼັງ.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM ນະວັດຕະກໍາໃນການວິນິດໄສກ່ອນເກີດ: ການຈັດລໍາດັບ genome plasma ຂອງແມ່.Anna MD.2016; 67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.ການກວດຫາເຊື້ອພະຍາດຢ່າງໄວວາດ້ວຍການຈັດລໍາດັບ metagenomic ລຸ້ນຕໍ່ໄປຂອງນໍ້າໃນຮ່າງກາຍທີ່ຕິດເຊື້ອ.ແພດສາດ Nat.2021; 27:115-24.