Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad užtikrintumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Žmogaus žarnos morfogenezė nustato kriptų-gaurelių 3D epitelio mikroarchitektūros ir erdvinės organizacijos ypatybes. Ši unikali struktūra reikalinga žarnyno homeostazei palaikyti, apsaugant kamieninių ląstelių nišą bazinėje kriptoje nuo egzogeninių mikrobų antigenų ir jų metabolitų. Be to, žarnyno gaureliai ir išskiriamos gleivės pateikia funkciškai diferencijuotas epitelio ląsteles su apsauginiu barjeru žarnyno gleivinės paviršiuje. Todėl 3D epitelio struktūrų atkūrimas yra labai svarbus kuriant in vitro žarnyno modelius. Pažymėtina, kad organinė mimetinė žarna ant lusto gali sukelti savaiminę žarnyno epitelio 3D morfogenezę su pagerintomis fiziologinėmis funkcijomis ir biomechanika. Čia pateikiame atkartojamą protokolą, skirtą patikimai sukelti žarnyno morfogenezę žarnyne mikrofluidinėje luste, taip pat Transwell įterptoje hibridinėje luste. Aprašome išsamius prietaisų gamybos, Caco-2 arba žarnyno organoidinių epitelio ląstelių kultivavimo įprastoje aplinkoje, taip pat mikrofluidinėje platformoje, 3D morfogenezės indukcijos ir nusistovėjusio 3D epitelio charakterizavimo metodus naudojant įvairius vaizdavimo būdus. Šis protokolas pasiekia funkcinės žarnos regeneraciją. mikroarchitektūra kontroliuojant bazolateralinį skysčio srautą 5 dienas. Mūsų in vitro morfogenezės metodas naudoja fiziologiškai reikšmingą šlyties įtempį ir mechaninį judėjimą ir nereikalauja sudėtingos ląstelių inžinerijos ar manipuliavimo, o tai gali pranokti kitus esamus metodus. Manome, kad mūsų siūlomas protokolas galėtų turėti didelę reikšmę biomedicininių tyrimų bendruomenei, suteikdamas metodą trimačiams žarnyno epitelio sluoksniams regeneruoti in vitro biomedicinos, klinikinės ir farmacijos reikmėms.
Eksperimentai rodo, kad žarnyno epitelio Caco-2 ląstelės, kultivuojamos „gunt-on-a-chip“1,2,3,4,5 arba dvisluoksniuose mikrofluidiniuose įrenginiuose6,7, gali patirti savaiminę 3D morfogenezę in vitro, aiškiai nesuprantant pagrindinio mechanizmo. Neseniai atliktame tyrime nustatėme, kad bazolateraliai išskiriamų morfogenų antagonistų pašalinimas iš kultūros įrenginių yra būtinas ir pakankamas, kad in vitro sukeltų 3D epitelio morfogenezę, ką įrodė Caco-2 ir iš pacientų gauti žarnyno organoidai. Epitelio ląstelės buvo patvirtintos. Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme stipraus Wnt antagonisto Dickkopf-1 (DKK-1) ląstelių gamybai ir koncentracijos pasiskirstymui „gunt-on-a-chip“ ir modifikuotuose mikrofluidiniuose įrenginiuose su Transwell įdėklais, vadinamuose „hibridiniais lustais“. Parodome, kad pridėjus egzogeninių Wnt antagonistų (pvz., DKK-1, Wnt represoriaus 1, sekretuojamo su frizzled susijusio baltymo 1 arba Soggy-1) prie žarnų, kuriose yra žarnos, slopinama morfogenezė arba sutrikdomas iš anksto suformuotas 3D epitelio sluoksnis, o tai rodo, kad antagonistinis stresas kultūros metu yra atsakingas už žarnyno morfogenezę in vitro. Todėl praktinis būdas pasiekti tvirtą morfogenezę epitelio sąsajoje yra pašalinti arba minimalus Wnt antagonistų kiekio palaikymas bazolateralinėje erdvėje aktyviai praplaunant (pvz., „gunt-on-a-chip“ arba „hybrid-on-a-chip“ platformose) arba difuzijos būdu. Bazolateralinė terpė (pvz., iš Transwell įdėklų į didelius bazolateralinius rezervuarus šuliniuose)
Šiame protokole pateikiame išsamų „žarnynas ant lusto“ mikroįrenginių ir Transwell įterpiamų hibridinių lustų (1–5 žingsniai) gamybos metodą, skirtą žarnyno epitelio ląstelėms kultivuoti ant polidimetilsiloksano (PDMS) pagrindu pagamintų porėtų membranų (6A, 7A, 8, 9 žingsniai) arba Transwell įdėklų poliesterio membranų (6B, 7B, 8, 9 žingsniai) ir indukuoti 3D morfogenezę in vitro (10 žingsnis). Taip pat nustatėme ląstelinius ir molekulinius požymius, rodančius audinių specifinę histogenezę ir nuo linijos priklausomą ląstelių diferenciaciją, taikydami kelis vaizdavimo būdus (11–24 žingsniai). Morfogenezę indukuojame naudodami žmogaus žarnyno epitelio ląsteles, tokias kaip Caco-2 arba žarnyno organoidus, dviem kultūros formatais su techninėmis detalėmis, įskaitant porėtų membranų paviršiaus modifikavimą, 2D monosluoksnių kūrimą ir žarnyno biocheminius bei biomechaninės mikroaplinkos atkūrimą in vitro. Norėdami sukelti 3D morfogenezę iš 2D epitelio monosluoksnių, pašalinome morfogenų antagonistus abiejose kultivuojamose formose, tekėdami terpę į... kultūros bazolateralinis skyrius. Galiausiai pateikiame regeneruojamo 3D epitelio sluoksnio, kuris gali būti naudojamas modeliuojant nuo morfogeno priklausomą epitelio augimą, išilgines šeimininko ir mikrobiomo kokultūras, patogeno infekciją, uždegiminį pažeidimą, epitelio barjero disfunkciją ir probiotikais pagrįstą terapiją, naudingumo pavyzdį. Pavyzdys. įtaka.
Mūsų protokolas gali būti naudingas plačiam mokslininkų ratui, atliekantiems fundamentinius (pvz., žarnyno gleivinės biologijos, kamieninių ląstelių biologijos ir vystymosi biologijos) ir taikomuosius tyrimus (pvz., ikiklinikinių vaistų testavimo, ligų modeliavimo, audinių inžinerijos ir gastroenterologijos). Dėl mūsų protokolo atkuriamumo ir patikimumo indukuojant žarnyno epitelio 3D morfogenezę in vitro, manome, kad mūsų techninė strategija gali būti skleidžiama auditorijoms, tiriančioms ląstelių signalizacijos dinamiką žarnyno vystymosi, regeneracijos ar homeostazės metu. Be to, mūsų protokolas yra naudingas tiriant infekciją, kurią sukelia įvairūs infekciniai agentai, tokie kaip norovirusas 8, sunkus ūminis respiracinis sindromas, koronavirusas 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 arba Vibrio cholerae. Taip pat naudingos ligos patologijos ir patogenezės auditorijos. Naudojant žarnų mikrofiziologijos sistemą, galima atlikti išilginę bendrą kultūrą 10 ir vėliau įvertinti šeimininko apsaugą, imuninius atsakus ir patogenų sukeltų pažeidimų atstatymą virškinimo trakte (VT) 11. Kiti VT sutrikimai, susiję su pralaidaus žarnos sindromu, celiakija, Krono liga, opiniu kolitu, poodiniu mazginiu uždegimu arba dirgliosios žarnos sindromu, gali būti imituojami, kai 3D žarnyno epitelio sluoksniai paruošiami naudojant paciento 3D žarnyno epitelio sluoksnius. Šios ligos apima gaurelių atrofiją, kriptų sutrumpėjimą, gleivinės pažeidimą arba sutrikusį epitelio barjerą. Biopsija arba kamieninių ląstelių gauti žarnyno organoidai 12,13. Siekdami geriau modeliuoti didesnį ligos aplinkos sudėtingumą, skaitytojai gali apsvarstyti galimybę į modelius, kuriuose yra 3D žarnyno gaurelių ir kriptų mikroarchitektūros, įtraukti su liga susijusius ląstelių tipus, tokius kaip paciento periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PKMKL), audinių specifinės imuninės ląstelės 5.
Kadangi 3D epitelio mikrostruktūrą galima fiksuoti ir vizualizuoti neatliekant pjūvių proceso, žiūrovai, dirbantys su erdvine transkriptomika ir didelės skiriamosios gebos arba itin didelės skiriamosios gebos vaizdavimu, gali būti suinteresuoti mūsų atliekamu genų ir baltymų epitelio nišose esančios erdvėlaikio dinamikos žemėlapiu. Domisi technologijomis. Atsakas į mikrobinius ar imuninius dirgiklius. Be to, išilginis šeimininko ir mikrobiomo sąryšis 10, 14, koordinuojantis žarnyno homeostazę, gali būti nustatytas 3D žarnyno gleivinės sluoksnyje, kartu kultivuojant įvairias mikrobų rūšis, mikrobų bendrijas arba išmatų mikrobiotą, ypač žarnyne ant lusto. platformoje. Šis metodas ypač patrauklus auditorijoms, studijuojančioms gleivinės imunologiją, gastroenterologiją, žmogaus mikrobiomą, kulturomiką ir klinikinę mikrobiologiją, siekiančioms laboratorijoje kultivuoti anksčiau nekultivuotą žarnyno mikrobiotą. Jei mūsų in vitro morfogenezės protokolą galima pritaikyti keičiamo dydžio kultūros formatams, pavyzdžiui, daugiašuliniams įdėklams 24, 96 arba 384 šulinėlių plokštelėse, kurios nuolat papildo bazolateralinius skyrius, protokolą taip pat galima platinti tiems, kurie kuria farmacijos, biomedicinos ar didelio našumo atrankos ar patvirtinimo platformas maisto pramonei. Kaip principo įrodymą neseniai pademonstravome daugiasluoksnės didelio našumo morfogenezės sistemos, kurią galima pritaikyti 24 šulinėlių plokštelės formatui, įgyvendinamumą. Be to, buvo komercializuoti keli „organas ant lusto“ produktai16,17,18. Todėl mūsų in vitro morfogenezės metodo patvirtinimą galima paspartinti ir potencialiai pritaikyti daugelyje tyrimų laboratorijų, pramonės ar vyriausybinių ir reguliavimo agentūrų, siekiant suprasti ląstelių perprogramavimą in vitro žarnyno morfogenezėje transkriptominiu lygmeniu, siekiant išbandyti vaistus ar bioterapinius preparatus. Vaistų kandidatų absorbcija ir pernaša buvo įvertinta naudojant 3D žarnyno surogatiniai modeliai arba individualiai pritaikyti arba komerciniai organų ant lusto modeliai, siekiant įvertinti žarnyno morfogenezės proceso atkuriamumą.
Žarnyno epitelio morfogenezei tirti buvo panaudotas ribotas skaičius su žmonėmis susijusių eksperimentinių modelių, daugiausia dėl to, kad trūksta įgyvendinamų protokolų, skirtų 3D morfogenezei in vitro sukelti. Iš tiesų, dauguma dabartinių žinių apie žarnyno morfogenezę yra pagrįstos tyrimais su gyvūnais (pvz., su zebrinėmis žuvimis20, pelėmis21 arba vištomis22). Tačiau jie yra daug darbo reikalaujantys ir brangūs, gali būti etiškai abejotini ir, svarbiausia, tiksliai nenustato žmogaus vystymosi procesų. Šie modeliai taip pat yra labai riboti, nes juos galima išbandyti daugiaplaniu mastelio keitimo būdu. Todėl mūsų protokolas, skirtas 3D audinių struktūrų regeneravimui in vitro, pranoksta in vivo gyvūnų modelius, taip pat kitus tradicinius statinius 2D ląstelių kultūros modelius. Kaip aprašyta anksčiau, 3D epitelio struktūrų panaudojimas leido mums ištirti diferencijuotų ląstelių erdvinę lokalizaciją kriptos-gaurelių ašyje, reaguojant į įvairius gleivinės ar imuninius stimulus. 3D epitelio sluoksniai gali suteikti erdvę tirti, kaip mikrobų ląstelės konkuruoja dėl erdvinių nišų formavimo ir ekologinės evoliucijos, reaguodamos į šeimininko veiksnius (pvz., vidinius ir išorinius gleivių sluoksnius, IgA ir antimikrobinių peptidų sekreciją). Be to, Trimatė epitelio morfologija gali padėti suprasti, kaip žarnyno mikrobiota struktūrizuoja savo bendrijas ir sinergiškai gamina mikrobų metabolitus (pvz., trumpos grandinės riebalų rūgštis), kurie formuoja ląstelių organizaciją ir kamieninių ląstelių nišas bazinėse kriptose. Šias savybes galima įrodyti tik tada, kai in vitro sukuriami trimačiai epitelio sluoksniai.
Be mūsų metodo, skirto 3D žarnyno epitelio struktūroms kurti, yra keletas in vitro metodų. Žarnyno organoidų kultūra yra pažangiausia audinių inžinerijos technika, pagrįsta žarnyno kamieninių ląstelių kultivavimu specifinėmis morfogeninėmis sąlygomis23,24,25. Tačiau 3D organoidų modelių naudojimas transportavimo analizei arba šeimininko ir mikrobiomo kokultūroms dažnai yra sudėtingas, nes žarnyno spindis yra uždarytas organoide, todėl spindžio komponentų, tokių kaip mikrobinės ląstelės ar egzogeniniai antigenai, įvedimas yra ribotas. Prieigą prie organoidų spindžių galima pagerinti naudojant mikroinjektorių26,27, tačiau šis metodas yra invazinis ir reikalauja daug darbo, todėl jam atlikti reikia specializuotų žinių. Be to, tradicinės organoidų kultūros, laikomos hidrogelio karkasuose statinėmis sąlygomis, tiksliai neatspindi aktyvios in vivo biomechanikos.
Kiti kelių tyrimų grupių taikomi metodai naudoja iš anksto struktūrizuotus 3D hidrogelio karkasus, kad imituotų žarnyno epitelio struktūrą, kultivuojant izoliuotas žmogaus žarnyno ląsteles ant gelio paviršiaus. Hidrogelio karkasai gaminami naudojant 3D spausdintas, mikrofrezuotas arba litografiškai pagamintas formas. Šis metodas parodo savaime organizuotą izoliuotų epitelio ląstelių išsidėstymą in vitro su fiziologiškai reikšmingais morfogenų gradientais, sukuriant didelį epitelio struktūros santykį ir stromos bei epitelio sąveiką, įtraukiant stromos ląsteles į karkasą. Tačiau iš anksto struktūrizuotų karkasų pobūdis gali neleisti parodyti paties savaiminio morfogenezės proceso. Šie modeliai taip pat neužtikrina dinaminio luminalinio ar intersticinio srauto, nes trūksta skysčio šlyties įtempio, kurio žarnyno ląstelėms reikia morfogenezei atlikti ir fiziologinei funkcijai įgyti. Kitame neseniai atliktame tyrime hidrogelio karkasai buvo naudojami mikrofluidinėje platformoje ir modeliuojamos žarnyno epitelio struktūros, naudojant lazerinio ėsdinimo metodus. Pelių žarnyno organoidai seka išgraviruotus modelius, kad suformuotų žarnyno vamzdines struktūras, o vidinio skysčio srautą galima atkurti naudojant mikrofluidikos modulį. Tačiau šis modelis neparodo savaiminių morfogenezės procesų ir neapima... žarnyno mechanobiologiniai judesiai. Tos pačios grupės 3D spausdinimo metodai leido sukurti miniatiūrinius žarnyno vamzdelius su savaiminiais morfogenezės procesais. Nepaisant sudėtingo skirtingų žarnyno segmentų pagaminimo vamzdelyje, šiam modeliui taip pat trūksta spindžio skysčio tekėjimo ir mechaninės deformacijos. Be to, modelio veikimas gali būti ribotas, ypač po to, kai biospausdinimo procesas yra baigtas, sutrikdydamas eksperimentines sąlygas arba ląstelių sąveiką. Vietoj to, mūsų siūlomas protokolas užtikrina savaiminę žarnyno morfogenezę, fiziologiškai reikšmingą šlyties įtempį, biomechaniką, kuri imituoja žarnyno motoriką, nepriklausomų apikalinių ir bazolateralinių skyrių prieinamumą ir sudėtingų biologinių modulinių mikroaplinkų atkūrimą. Todėl mūsų in vitro 3D morfogenezės protokolas gali suteikti papildomą požiūrį į esamų metodų iššūkius.
Mūsų protokolas yra visiškai orientuotas į 3D epitelio morfogenezę, kultūroje naudojant tik epitelio ląsteles ir jokių kitų aplinkinių ląstelių tipų, tokių kaip mezenchiminės ląstelės, endotelio ląstelės ir imuninės ląstelės. Kaip aprašyta anksčiau, mūsų protokolo esmė yra epitelio morfogenezės indukcija pašalinant morfogenų inhibitorius, išskiriamus įvestos terpės bazolateralinėje pusėje. Nors tvirtas mūsų „žarnos ant lusto“ ir „hibrido ant lusto“ moduliškumas leidžia mums atkurti banguojantį 3D epitelio sluoksnį, dar reikia toliau nagrinėti papildomus biologinius sudėtingumus, tokius kaip epitelio ir mezenchimos sąveika33,34, tarpląstelinės matricos (ECM) nusėdimas35 ir, mūsų modelyje, kriptų gaurelių ypatybės, perteikiančios kamieninių ląstelių nišas bazinėse kriptose. Stromos ląstelės (pvz., fibroblastai) mezenchime atlieka pagrindinį vaidmenį ECM baltymų gamyboje ir žarnyno morfogenezės reguliavime in vivo35,37,38. Mezenchiminių ląstelių įtraukimas į mūsų modelį sustiprino morfogenezės procesą ir ląstelių prisitvirtinimo efektyvumą. Endotelio sluoksnis (t. y. kapiliarai arba limfagyslės) atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant molekulinis pernašos39 ir imuninių ląstelių pritraukimas40 žarnyno mikroaplinkoje. Be to, kraujagyslių komponentai, kuriuos galima sujungti tarp audinių modelių, yra būtina sąlyga, kai audinių modeliai yra sukurti siekiant parodyti daugelio organų sąveiką. Todėl, norint modeliuoti tikslesnes fiziologines savybes su organų lygio skiriamąja geba, gali tekti įtraukti endotelio ląsteles. Iš pacientų gautos imuninės ląstelės taip pat yra būtinos norint parodyti įgimtą imuninį atsaką, antigenų pateikimą, įgimtą adaptyvų imuninį perdavimą ir audinių specifinį imunitetą, imituojant žarnyno ligas.
Hibridinių lustų naudojimas yra paprastesnis nei „žarna ant lusto“ tipo, nes įrenginio sąranka yra paprastesnė, o „Transwell“ įdėklų naudojimas leidžia keisti žarnyno epitelio kultūrą. Tačiau komerciškai prieinami „Transwell“ įdėklai su poliesterio membranomis nėra elastingi ir negali imituoti peristaltinių judesių. Be to, į hibridinį lustą įdėto „Transwell“ įdėklo apikalinis skyrius išliko nejudantis be šlyties įtempio apikalinėje pusėje. Akivaizdu, kad statinės savybės apikaliniame skyriuje retai leidžia ilgai kultivuoti bakterijas kartu su hibridiniais lustais. Nors naudodami hibridinius lustus galime patikimai sukelti 3D morfogenezę „Transwell“ įdėkluose, fiziologiškai reikšmingos biomechanikos ir apikalinio skysčio tekėjimo trūkumas gali apriboti hibridinių lustų platformų tinkamumą potencialiems taikymams.
Pilno masto žmogaus kriptų ir gaurelių ašies rekonstrukcijos „žarnos ant lusto“ ir hibridinėse „ant lusto“ kultūrose dar nebuvo iki galo ištirtos. Kadangi morfogenezė prasideda nuo epitelio monosluoksnio, 3D mikroarchitektūros nebūtinai užtikrina morfologinį panašumą į kriptas in vivo. Nors apibūdinome proliferuojančių ląstelių populiaciją šalia bazinio kriptų domeno mikroinžinerijos būdu sukurtame 3D epitelyje, kriptų ir gaurelių regionai nebuvo aiškiai atskirti. Nors aukštesni viršutiniai kanalai ant lusto padidina mikroinžinerijos būdu sukurto epitelio aukštį, maksimalus aukštis vis tiek ribojamas iki ~300–400 µm. Tikrasis žmogaus žarnyno kriptų gylis plonojoje ir storojoje žarnose yra atitinkamai ~135 µm ir ~400 µm, o plonosios žarnos gaurelių aukštis yra ~600 µm41.
Vaizdavimo požiūriu, 3D mikroarchitektūrų itin didelės skiriamosios gebos vaizdavimas in situ gali apsiriboti žarna ant lusto, nes reikalingas darbinis atstumas nuo objektyvo lęšio iki epitelio sluoksnio yra maždaug keli milimetrai. Norint išspręsti šią problemą, gali prireikti tolimojo objektyvo. Be to, plonų pjūvių gamyba vaizdavimo mėginių paruošimui yra sudėtinga dėl didelio PDMS elastingumo. Be to, kadangi sluoksnis po sluoksnio mikrofabrikacija ant lusto apima nuolatinį sukibimą tarp kiekvieno sluoksnio, labai sunku atidaryti arba pašalinti viršutinį sluoksnį, kad būtų galima ištirti epitelio sluoksnio paviršiaus struktūrą. Pavyzdžiui, naudojant skenuojantį elektroninį mikroskopą (SEM).
PDMS hidrofobiškumas buvo ribojantis veiksnys mikrofluidiniais tyrimais, susijusiais su mažomis hidrofobinėmis molekulėmis, nes PDMS gali nespecifiškai adsorbuoti tokias hidrofobines molekules. Galima apsvarstyti PDMS alternatyvas su kitomis polimerinėmis medžiagomis. Arba galima apsvarstyti PDMS paviršiaus modifikavimą (pvz., padengimą lipofilinėmis medžiagomis 42 arba poli(etilenglikoliu) 43), siekiant sumažinti hidrofobinių molekulių adsorbciją.
Galiausiai, mūsų metodas nebuvo gerai apibūdintas kaip didelio našumo atrankos arba „vienodo dydžio visiems“ patogios eksperimentinės platformos užtikrinimo būdas. Dabartiniam protokolui reikalingas švirkštinis siurblys kiekvienam mikroįrenginiui, kuris užima vietą CO2 inkubatoriuje ir neleidžia atlikti didelio masto eksperimentų. Šį apribojimą galima gerokai sumažinti pritaikant novatoriškus kultūros formatus (pvz., 24, 96 arba 384 šulinėlių porėtus įdėklus, kurie leidžia nuolat papildyti ir pašalinti bazolateralinę terpę).
Norėdami in vitro sukelti žmogaus žarnyno epitelio 3D morfogenezę, panaudojome mikrofluidinį žarnyno įrenginį, turintį du lygiagrečius mikrokanalus ir tarp jų esančią elastingą porėtą membraną, kad sukurtume spindžio ir kapiliarų sąsają. Taip pat demonstruojame vieno kanalo mikrofluidinio įrenginio (hibridinio lusto), užtikrinančio nuolatinį bazolateralinį srautą po poliarizuotais epitelio sluoksniais, auginamais ant Transwell įdėklų, naudojimą. Abiejose platformose įvairių žmogaus žarnyno epitelio ląstelių morfogenezę galima parodyti taikant kryptingą srauto manipuliavimą, siekiant pašalinti morfogenų antagonistus iš bazolateralinio skyriaus. Visa eksperimentinė procedūra (1 pav.) susideda iš penkių dalių: (i) žarnos lusto arba Transwell įterpiamo hibridinio lusto mikrogamyba (1–5 žingsniai; 1 langelis), (ii) žarnyno epitelio ląstelių (Caco-2 ląstelių) arba žmogaus žarnyno organoidų paruošimas; 2–5 langeliai), (iii) žarnyno epitelio ląstelių kultivavimas ant žarnyno lustų arba hibridinių lustų (6–9 žingsniai), (iv) 3D morfogenezės indukcija in vitro (10 žingsnis) ir (v) ), siekiant apibūdinti 3D epitelio mikrostruktūrą (11–24 žingsniai). Galiausiai buvo sukurta tinkama kontrolinė grupė (aptariama toliau), siekiant patvirtinti in vitro morfogenezės veiksmingumą, lyginant epitelio morfogenezę su erdvine, laiko, sąlygine ar procedūrine kontrole.
Naudojome dvi skirtingas kultivavimo platformas: „žarnynas ant lusto“ su tiesiais kanalais arba netiesiniais vingiuotais kanalais arba hibridinius lustus su Transwell (TW) įdėklais mikrofluidiniame įrenginyje, pagamintu, kaip aprašyta 1 langelyje, ir 1–5 veiksme „Įrenginio gamyba“ parodyti pagrindiniai vieno lusto arba hibridinio lusto gamybos etapai. „Žmogaus žarnyno epitelio ląstelių kultūra“ paaiškina ląstelių šaltinį (Caco-2 arba žmogaus žarnyno organoidus) ir šiame protokole naudojamą kultivavimo procedūrą. „In vitro morfogenezė“ rodo bendrus etapus, kuriuose Caco-2 arba iš organoidų gautos epitelio ląstelės kultivuojamos žarnyno luste arba hibridinio lusto Transwell įdėkluose, po to indukuojama 3D morfogenezė ir formuojama charakterizuota epitelio struktūra. Programos veiksmo numeris arba langelio numeris rodomas po kiekviena rodykle. Programoje pateikiami pavyzdžiai, kaip nustatyti žarnyno epitelio sluoksniai gali būti naudojami, pavyzdžiui, ląstelių diferenciacijos apibūdinimui, žarnyno fiziologijos tyrimams, šeimininko ir mikrobiomo ekosistemų kūrimui ir ligų modeliavimui. Imunofluorescenciniai vaizdai „Ląstelių diferenciacija“ rodo branduolius, F-aktiną ir MUC2 ekspresuojamas 3D Caco-2 epitelio sluoksnyje, sukurtame ant žarnyno mikroschemos. MUC2 signalizacija yra taurinėse ląstelėse ir gleivėse, išskiriamose iš gleivinės paviršių. Fluorescenciniai vaizdai žurnale „Gut Physiology“ rodo gleives, gautas dažant sialo rūgštimi ir N-acetilgliukozamino likučiais naudojant fluorescencinį kviečių gemalų agliutininą. Dviejuose persidengiančiuose vaizduose žurnale „Šeimininko ir mikrobo kokultūros“ rodomos reprezentatyvios šeimininko ir mikrobiomo kokultūros žarnyne ant mikroschemos. Kairiajame skydelyje parodyta žaliai fluorescencinį baltymą (GFP) ekspresuojančios E. coli kokultūra su mikroinžinerijos būdu sukurtomis 3D Caco-2 epitelio ląstelėmis. Dešiniajame skydelyje parodyta GFP E. coli, kokultivuotos su 3D Caco-2 epitelio ląstelėmis, lokalizacija, po kurios atliktas imunofluorescencinis dažymas F-aktinu (raudona) ir branduoliais (mėlyna). Ligos modeliavimas iliustruoja sveikos ir nesandarios žarnos skirtumus žarnyno uždegimo mikroschemose, fiziologiškai paveiktose bakterijų antigenais (pvz., lipopolisacharidu, LPS) ir imuninėmis ląstelėmis (pvz., PBMC; žalia). Caco-2 ląstelės buvo kultivuojamos siekiant sukurti 3D epitelio sluoksnį. Mastelis juosta, 50 µm. Paveikslėliai apatinėje eilutėje: „Ląstelių diferenciacija“, adaptuota gavus 2 nuorodos leidimą. Oksfordo universiteto leidykla; atgaminta gavus 5 nuorodos leidimą. NAS; „Šeimininko ir mikrobo bendra kultūra“, adaptuota gavus 3 nuorodos leidimą. NAS; „Ligų modeliavimas“, adaptuotas gavus 5 nuorodos leidimą. NAS.
Tiek „žarnos ant lusto“, tiek hibridiniai lustai buvo pagaminti naudojant PDMS kopijas, kurios buvo išimtos iš silicio formų minkštosios litografijos būdu1,44 ir suformuotos SU-8. Kiekvieno lusto mikrokanalų konstrukcija nustatoma atsižvelgiant į hidrodinamiką, tokią kaip šlyties įtempis ir hidrodinaminis slėgis1,4,12. Originalus „žarnos ant lusto“ dizainas (išplėstiniai duomenys, 1a pav.), kurį sudarė du greta esantys lygiagretūs tiesūs mikrokanalai, išsivystė į sudėtingą „žarnos ant lusto“ (išplėstiniai duomenys, 1b pav.), apimantį porą išlenktų mikrokanalų, kad būtų padidintas skysčio buvimo laikas, netiesiniai srauto modeliai ir kultivuojamų ląstelių daugiaašė deformacija (2a–f pav.)12. Kai reikia atkurti sudėtingesnę žarnyno biomechaniką, galima pasirinkti sudėtingą „žarnos ant lusto“. Parodėme, kad vingiuotas „Gut-Chip“ taip pat stipriai sukelia 3D morfogenezę per panašų laiką su panašiu epitelio augimo laipsniu, palyginti su originaliu „Gut-Chip“, neatsižvelgiant į... kultivuotų ląstelių tipas. Todėl, norint sukelti 3D morfogenezę, linijiniai ir sudėtingi žarnų dizainai ant lusto yra keičiami. Ant silicio formų su SU-8 raštais sukietintos PDMS kopijos po išėmimo iš formų suteikė neigiamų savybių (2a pav.). Norint pagaminti žarną ant lusto, paruoštas viršutinis PDMS sluoksnis buvo nuosekliai sujungtas su porėta PDMS plėvele, o po to sulygiuotas su apatiniu PDMS sluoksniu negrįžtamu sujungimu naudojant vainikinį apdorojimą (2b–f pav.). Norint pagaminti hibridinius lustus, sukietintos PDMS kopijos buvo sujungtos su stiklinėmis plokštelėmis, kad būtų sukurti vieno kanalo mikrofluidiniai įrenginiai, kuriuose būtų galima įdėti Transwell įdėklus (2h pav. ir išplėstiniai duomenys 2 pav.). Sujungimo procesas atliekamas apdorojant PDMS kopijos ir stiklo paviršius deguonies plazma arba vainikiniu apdorojimu. Sterilizavus prie silikoninio vamzdelio pritvirtintą mikrogamintą įrenginį, įrenginio sąranka buvo paruošta žarnyno epitelio 3D morfogenezei atlikti (2g pav.).
a, PDMS dalių paruošimo iš SU-8 raštuotų silicio formų schema. Neapdorotas PDMS tirpalas buvo supiltas ant silicio formos (kairėje), apdorotas 60 °C temperatūroje (viduryje) ir išimtas iš formos (dešinėje). Išimtas PDMS buvo supjaustytas į gabalus ir išvalytas tolesniam naudojimui. b, Silicio formos, naudojamos PDMS viršutiniam sluoksniui paruošti, nuotrauka. c, Silicio formos, naudojamos PDMS porėtai membranai pagaminti, nuotrauka. d, Viršutinių ir apatinių PDMS komponentų bei surinkto ant lusto esančio žarnyno įtaiso nuotraukų serija. e, Viršutinių, membraninių ir apatinių PDMS komponentų sulyginimo schema. Kiekvienas sluoksnis yra negrįžtamai sujungtas plazmos arba korona apdorojimu. f, Pagaminto žarnos ant lusto įtaiso su uždėtais vingiuotais mikrokanalais ir vakuuminėmis kameromis schema. g, Žarnos ant lusto mikrofluidinei ląstelių kultūrai paruošimas. Pagaminta žarna ant lusto, surinkta su silikoniniu vamzdeliu ir švirkštu, buvo uždėta ant dengiamojo stiklelio. Lusto įtaisas buvo uždėtas ant 150 mm Petri lėkštelės dangtelio. apdorojimas. Rišiklis naudojamas silikoniniam vamzdeliui uždaryti.h, Hibridinio lusto gamybos ir 3D morfogenezės naudojant hibridinius lustus vaizdinės nuotraukos. Transvelo įdėklai, paruošti atskirai žarnyno epitelio ląstelių 2D monosluoksniams kultivuoti, buvo įterpti į hibridinį lustą, siekiant sukelti žarnyno 3D morfogenezę. Terpė perfuzuojama per mikrokanalus po ląstelių sluoksniu, suformuotu ant Transvelo įdėklo. Mastelio juosta, 1 cm.h Perspausdinta gavus nuorodos leidimą.4. Elsevier.
Šiame protokole Caco-2 ląstelių linija ir žarnyno organoidai buvo naudojami kaip epitelio šaltiniai (3a pav.). Abu ląstelių tipai buvo kultivuojami atskirai (2 langelis ir 5 langelis) ir naudojami ECM padengtų mikrokanalų, esančių ant lusto, sėjimui. Kai ląstelės susilieja (>95 % padengimas kolbose), įprastai kultivuojamos Caco-2 ląstelės (tarp 10 ir 50 pasažų) T kolbose surenkamos, kad būtų paruoštos disocijuotos ląstelių suspensijos tripsinizacijos skysčiu (2 langelis). Žmogaus žarnyno organoidai iš žarnyno biopsijų arba chirurginių rezekcijų buvo kultivuojami Matrigelio karkaso kupoluose 24 šulinėlių plokštelėse, siekiant palaikyti struktūrinę mikroaplinką. Terpė, kurioje buvo būtinų morfogenų (pvz., Wnt, R-spondinas ir Nogginas) ir augimo faktorių, paruoštų, kaip aprašyta 3 langelyje, buvo papildoma kas antrą dieną, kol organoidai užaugo iki ~500 µm skersmens. Visiškai užaugę organoidai surenkami ir suskaidomi į atskiras ląsteles, skirtas sėjimui ant žarnos arba Transwell įdėklų ant lusto (2 langelis). 5). Kaip jau anksčiau pranešėme, jį galima diferencijuoti pagal ligos tipą12,13 (pvz., opinis kolitas, Krono liga, kolorektalinis vėžys arba normalus donoras), pažeidimo vietą (pvz., pažeidimo ar nepažeistos srities) ir virškinimo trakto vietą (pvz., dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, gaubtinė žarna arba tiesioji žarna). 5 langelyje pateikiame optimizuotą protokolą, skirtą gaubtinės žarnos organoidų (koloidų), kuriems paprastai reikia didesnės morfogenų koncentracijos nei plonosios žarnos organoidams, kultivavimui.
a, Žarnyno morfogenezės indukcijos žarnos luste darbo eiga. Šiame protokole naudojamas Caco-2 žmogaus žarnyno epitelis ir žarnyno organoidai, siekiant parodyti 3D morfogenezę. Izoliuotos epitelio ląstelės buvo pasėtos paruoštame žarnos ant lusto įrenginyje (lusto paruošimas). Kai ląstelės pasėjamos ir pritvirtinamos prie PDMS porėtos membranos 0 dieną (D0), pradedamas ir pirmąsias 2 dienas palaikomas apikalinis (AP) srautas (srautas, AP, D0-D2). Taip pat pradedamas bazolateralinis (BL) srautas kartu su cikliniais tempimo judesiais (tempimas, srautas, AP ir BL), kai susidaro visas 2D monosluoksnis. Žarnyno 3D morfogenezė įvyko savaime po 5 dienų mikrofluidinės kultūros (morfogenezė, D5). Fazinio kontrasto vaizdai rodo tipišką Caco-2 ląstelių morfologiją kiekviename eksperimentiniame etape arba laiko taške (juostinė diagrama, 100 µm). Keturios schemos, iliustruojančios atitinkamas žarnyno morfogenezės kaskadas (viršuje dešinėje). Schemoje punktyrinės rodyklės rodo kryptį skysčio srautas.b, SEM vaizdas, rodantis nusistovėjusio 3D Caco-2 epitelio paviršiaus topologiją (kairėje). Įdėklas, paryškinantis padidintą sritį (baltas punktyrinis langelis), rodo regeneruotus mikroplaukelius ant 3D Caco-2 sluoksnio (dešinėje).c, Horizontalus priekinis nusistovėjusio 3D Caco-2 vaizdas, klaudinas (ZO-1, raudonas) ir ištisinės šepetėlio kraštinės membranos, pažymėtos F-aktinu (žalia) ir branduoliais (mėlyna). Imunofluorescencinė konfokalinė epitelio ląstelių vizualizacija žarnyno lustuose. Rodyklės, nukreiptos į vidurinę schemą, nurodo židinio plokštumos vietą kiekvienam konfokaliniam vaizdui.d, Organoidų, kultivuojamų ant lusto, gautų fazinio kontrasto mikroskopu 3, 7, 9, 11 ir 13 dienomis, morfologinių pokyčių laiko eiga. Įdėklas (viršuje dešinėje) rodo didelį pateikto vaizdo padidinimą.e, DIC fotomikrografija, kurioje pavaizduotas žarnyne nusistovėjęs organoidinis 3D epitelis, paimtas 7 dieną.f, Perdengti imunofluorescenciniai vaizdai, rodantys kamieninių ląstelių (LGR5; rausvai raudona), taurinių ląstelių (MUC2; žalia) žymenis. F-aktinas (pilkas) ir branduoliai (žydri), atitinkamai 3 dienas auginami ant žarnyno lustų (kairėje), ir 13 dienų (viduryje) organoidai ant epitelio sluoksnio. Taip pat žr. išplėstinių duomenų 3 paveikslą, kuriame paryškintas LGR5 signalizacija be MUC2 signalizacijos. Fluorescenciniai vaizdai, rodantys 3D organoidinio epitelio epitelio mikrostruktūrą (dešinėje), sukurtą žarnyne ant lusto, dažant plazminę membraną CellMask dažais (dešinėje) 13 kultūros dieną. Mastelio juosta yra 50 μm, jei nenurodyta kitaip. b Perspausdinta gavus nuorodos leidimą. 2. Oxford University Press; c Adaptuota gavus nuorodos leidimą. 2. Oxford University Press; e ir f adaptuoti gavus nuorodos leidimą. 12 Pagal „Creative Commons“ licenciją CC BY 4.0.
Žarnyne ant lusto būtina modifikuoti PDMS porėtos membranos hidrofobinį paviršių, kad būtų sėkmingai padengta ECM. Šiame protokole taikome du skirtingus PDMS membranų hidrofobiškumo modifikavimo metodus. Caco-2 ląstelių kultivavimui pakako vien paviršiaus aktyvinimo UV/ozono apdorojimu, kad sumažėtų PDMS paviršiaus hidrofobiškumas, būtų padengta ECM ir Caco-2 ląstelės pritvirtintos prie PDMS membranos. Tačiau organoidinio epitelio mikrofluidinei kultūrai reikalingas cheminis paviršiaus funkcionalizavimas, kad būtų pasiektas efektyvus ECM baltymų nusodinimas, nuosekliai taikant polietileniminą (PEI) ir glutaraldehidą ant PDMS mikrokanalų. Po paviršiaus modifikavimo ECM baltymai buvo nusodinami, kad padengtų funkcionalizuotą PDMS paviršių, o po to įvedami į izoliuotą organoidinį epitelį. Pritvirtinus ląsteles, mikrofluidinė ląstelių kultūra pradedama perfuzuojant tik terpę į viršutinį mikrokanalą, kol ląstelės suformuoja visą monosluoksnį, o apatinis mikrokanalas palaiko statines sąlygas. Šis optimizuotas paviršiaus aktyvavimo ir ECM padengimo metodas leidžia pritvirtinti organoidinį epitelį, kad būtų indukuota 3D morfogenezė PDMS paviršiuje.
Transvelo kultūroms prieš ląstelių sėjimą taip pat reikalingas ECM padengimas; tačiau Transvelo kultūroms nereikia sudėtingų išankstinio apdorojimo etapų, kad būtų aktyvuotas porėtų įdėklų paviršius. Auginant Caco-2 ląsteles ant Transvelo įdėklų, ECM padengimas ant porėtų įdėklų pagreitina disocijuotų Caco-2 ląstelių prisitvirtinimą (<1 val.) ir glaudaus jungimosi barjero formavimąsi (<1–2 dienos). Norint kultivuoti organoidus ant Transvelo įdėklų, izoliuoti organoidai pasėjami ant ECM padengtų įdėklų, pritvirtinami prie membranos paviršiaus (<3 val.) ir palaikomi tol, kol organoidai suformuoja pilną monosluoksnį su barjero vientisumu. Transvelo kultūros atliekamos 24 šulinėlių plokštelėse nenaudojant hibridinių lustų.
In vitro 3D morfogenezę galima inicijuoti skysčio srautu į nusistovėjusio epitelio sluoksnio bazolateralinę pusę. Lusto žarnyne epitelio morfogenezė prasidėjo, kai terpė buvo perfuzuojama į viršutinį ir apatinį mikrokanalus (3a pav.). Kaip aprašyta anksčiau, labai svarbu įvesti skysčio srautą į apatinį (bazolateralinį) skyrių, kad būtų nuolat šalinami kryptingai išskiriami morfogenų inhibitoriai. Kad ląstelės, surištos prie porėtų membranų, gautų pakankamai maistinių medžiagų ir serumo ir būtų sukurtas spindžio šlyties įtempis, luste žarnyne paprastai taikome dvigubą srautą. Hibridiniuose lustuose į hibridinius lustus buvo įterpiami Transwell įdėklai su epitelio monosluoksniais. Tada terpė buvo uždėta po porėto Transwell įdėklo bazolateraline puse per mikrokanalą. Žarnyno morfogenezė įvyko praėjus 3–5 dienoms po bazolateralinio srauto pradžios abiejose kultūros platformose.
Mikroinžinerijos būdu sukurtų 3D epitelio sluoksnių morfologines ypatybes galima analizuoti taikant įvairius vaizdavimo metodus, įskaitant fazinio kontrasto mikroskopiją, diferencinio interferencinio kontrasto (DIC) mikroskopiją, SEM arba imunofluorescencinę konfokalinę mikroskopiją (3 ir 4 pav.). Fazinio kontrasto arba DIC vaizdavimą galima lengvai atlikti bet kuriuo kultūros metu, siekiant stebėti 3D epitelio sluoksnių formą ir išsikišimą. Dėl PDMS ir poliesterio plėvelių optinio skaidrumo tiek „gunt-on-a-chip“, tiek hibridinės lustų platformos gali užtikrinti realaus laiko in situ vaizdavimą, nereikalaujant įrenginio sekcijų ar išardymo. Atliekant imunofluorescencinį vaizdavimą (1, 3c, f ir 4b, c pav.), ląstelės paprastai fiksuojamos 4 % (svorio/tūrio) paraformaldehidu (PFA), po to Triton X-100 ir 2 % (svorio/tūrio) galvijų serumo albuminu (BSA), tokia tvarka. Priklausomai nuo ląstelių tipo, galima naudoti skirtingus fiksatorius, pralaidumą didinančias ir blokuojančias medžiagas. Pirminiai antikūnai, nukreipti į nuo linijos priklausančius ląstelių ar regionų žymenis, naudojami imobilizuotoms ląstelėms paryškinti. in situ ant lusto, po to antriniai antikūnai kartu su kontrastiniu dažikliu, nukreiptu į branduolį (pvz., 4′,6-diamidino-2-fenilen)indolą, DAPI) arba F-aktiną (pvz., fluorescenciniu būdu žymėtą faloidiną). Fluorescencija pagrįstas tiesioginis vaizdavimas taip pat gali būti atliekamas in situ, siekiant aptikti gleivių gamybą (1 pav. „Ląstelių diferenciacija“ ir „Žarnyno fiziologija“), atsitiktinę mikrobų ląstelių kolonizaciją (1 pav. „Šeimininko ir mikrobo bendra kultūra“), imuninių ląstelių pritraukimą (1 pav. „Ligos modeliavimas“) arba 3D epitelio morfologijos kontūrus (3c, f ir 4b, c pav.). Modifikuojant žarną ant lusto, siekiant atskirti viršutinį sluoksnį nuo apatinio mikrokanalo sluoksnio, kaip aprašyta nuorodoje. Kaip parodyta 2 pav., 3D epitelio morfologiją, taip pat mikroplaukelius ant viršūninio šepetėlio krašto, galima vizualizuoti SEM (3b pav.). Diferenciacijos žymenų raišką galima įvertinti atliekant kiekybinę PGR5 arba vienos ląstelės RNR sekvenavimą. Šiuo atveju žarnyno lustuose arba hibridiniuose lustuose išaugintų epitelio ląstelių 3D sluoksniai surenkami tripsinu ir naudojami molekulinei arba genetinei analizei.
a, Žarnyno morfogenezės indukcijos hibridiniame luste darbo eiga. Šiame protokole Caco-2 ir žarnyno organoidai naudojami trimačiai morfogenezei hibridinio lusto platformoje pademonstruoti. Disocijuotos epitelio ląstelės buvo pasėtos paruoštuose Transwell įdėkluose (TW paruošimas; žr. paveikslėlį žemiau). Kai ląstelės buvo pasėtos ir pritvirtintos prie poliesterio membranų Transwell įdėkluose, visos ląstelės buvo kultivuojamos statinėmis sąlygomis (TW kultūra). Po 7 dienų vienas Transwell įdėklas, kuriame buvo 2D epitelio ląstelių monosluoksnis, buvo integruotas į hibridinį lustą, kad būtų įvestas bazolateralinis srautas (Flow, BL), kuris galiausiai lėmė 3D epitelio sluoksnio susidarymą (morfogenezė). Fazinio kontrasto mikrografijos, rodančios žmogaus organų epitelio ląstelių, gautų iš normalaus donoro (C103 linija) kylančiosios gaubtinės žarnos, morfologines ypatybes kiekviename eksperimentiniame etape arba laiko momente. Viršutinių sluoksnių schemos iliustruoja kiekvieno etapo eksperimentinę konfigūraciją. b, Hibridiniai lustai (schema kairėje) gali sukelti organoidinių epitelio ląstelių trimatę morfogenezę, atliekant konfokalinės mikroskopijos vaizdus iš viršaus į apačią skirtingose ​​Z pozicijose (viršutinėje, vidurinėje ir apatinėje; žr. schemą dešinėje ir atitinkamas punktyrines linijas). parodė akivaizdžias morfologines charakteristikas. F-aktinas (žydras), branduolys (pilkas). c, Organoidinės kilmės epitelio ląstelių, kultivuotų statinėje Transwell (TW; įdėklas baltame punktyriniame langelyje), palyginti su hibridiniu lustu (didžiausias pilnas kadras), fluorescencinės konfokalinės mikrografijos (3D kampinis vaizdas), lyginant atitinkamai 2D ir 3D morfologiją. Pora 2D vertikalių skersinių vaizdų (įdėklas viršutiniame dešiniajame kampe; „XZ“) taip pat rodo 2D ir 3D ypatybes. Mastelio juosta, 100 µm. c Perspausdinta gavus nuorodos leidimą. 4. Elsevier.
Kontrolinius mėginius galima paruošti kultivuojant tas pačias ląsteles (Caco-2 arba žarnyno organoidines epitelio ląsteles) į dvimatį monosluoksnį įprastomis statinės kultūros sąlygomis. Pažymėtina, kad dėl riboto mikrokanalų tūrio (t. y. ~4 µL viršutiniame kanale originaliame žarnyno mikroschemos dizaine) gali sumažėti maistinių medžiagų. Todėl taip pat galima palyginti epitelio morfologiją prieš ir po bazolateralinio srauto taikymo.
Minkštosios litografijos procesas turėtų būti atliekamas švarioje patalpoje. Kiekvienam lusto sluoksniui (viršutiniam ir apatiniam sluoksniams bei membranoms) ir hibridiniams lustams buvo naudojamos skirtingos fotokaukės, pagamintos ant atskirų silicio plokštelių, nes mikrokanalų aukščiai buvo skirtingi. Lusto žarnos viršutinio ir apatinio mikrokanalų taikinio aukščiai yra atitinkamai 500 µm ir 200 µm. Hibridinio lusto kanalo taikinio aukštis yra 200 µm.
Įdėkite 3 colių silicio plokštelę į indą su acetonu. Švelniai pasukiokite plokštelę 30 sekundžių, tada išdžiovinkite plokštelę ore. Perkelkite plokštelę ant plokštelės su IPA, tada 30 sekundžių sukite plokštelę, kad ji nusivalytų.
Piranijos tirpalas (vandenilio peroksido ir koncentruotos sieros rūgšties mišinys, 1:3 (tūris/tūris)) gali būti naudojamas siekiant maksimaliai padidinti organinių likučių pašalinimą iš silicio plokštelės paviršiaus.
Piranijų tirpalas yra itin ėsdinantis ir generuoja šilumą. Būtinos papildomos saugos priemonės. Šalinant atliekas, leiskite tirpalui atvėsti ir supilkite į švarų, sausą atliekų konteinerį. Naudokite antrinius konteinerius ir tinkamai paženklinkite atliekų konteinerius. Išsamesnės procedūros pateikiamos įmonės saugos gairėse.
Dehidratuokite plokšteles, padėdami jas ant 200 °C karštos plokštės 10 min. Po dehidratacijos plokštelė penkis kartus buvo pakratyta ore, kad atvėstų.
Ant nuvalytos silicio plokštelės centro užpilkite ~10 g fotorezisto SU-8 2100. Pincetu tolygiai paskirstykite fotorezistą ant plokštelės. Retkarčiais padėkite plokštelę ant 65 °C įkaitintos plokštės, kad fotorezistas būtų mažiau lipnus ir lengviau tepamas. Nedėkite plokštelės tiesiai ant įkaitintos plokštės.
SU-8 buvo tolygiai paskirstytas ant plokštelės naudojant sukamąjį dengimą. Užprogramuokite SU-8 įeinantį sukimąsi 5–10 s, kad jis sklistų 500 aps./min. greičiu ir 100 aps./min. pagreičiu. Nustatykite pagrindinį sukimąsi 200 µm storio modeliavimui esant 1500 aps./min. greičiui arba pasiekite 250 µm storį (sukuriant 500 µm aukštį viršutiniam lusto vidurio sluoksniui; žr. „Kritiniai žingsniai“ toliau), nustatydami 300 aps./min. pagreitį 30 sekundžių ir 1200 aps./min. greičiu.
Pagrindinį sukimosi greitį galima reguliuoti pagal tikslinį SU-8 rašto storį ant silicio plokštelės.
Norint pagaminti 500 µm aukščio SU-8 raštus viršutiniam lusto žarnos sluoksniui, šios dėžutės sukimosi dengimo ir minkšto kepimo etapai (7 ir 8 etapai) buvo nuosekliai pakartoti (žr. 9 etapą), kad būtų gauti du 250 µm storio SU-8 sluoksniai, kuriuos galima sluoksniuoti ir sujungti UV spinduliuote šios dėžutės 12 etape, gaunant 500 µm aukščio sluoksnį.
Švelniai kepkite SU-8 padengtas plokšteles, atsargiai padėdami jas ant karštos plokštės 65 °C temperatūroje 5 minutes, tada perjunkite nustatymą į 95 °C ir inkubuokite dar 40 minučių.
Norint pasiekti 500 μm aukščio SU-8 modelį viršutiniame mikrokanale, pakartokite 7 ir 8 veiksmus, kad sukurtumėte du 250 μm storio SU-8 sluoksnius.
Naudodami UV kaukės lygiavimo įrenginį, atlikite lempos bandymą pagal gamintojo instrukcijas, kad apskaičiuotumėte plokštelės ekspozicijos laiką (ekspozicijos laikas, ms) = (ekspozicijos dozė, mJ/cm2) / (lempos galia, mW/cm2).
Nustačius ekspozicijos laiką, uždėkite fotokaukę ant UV kaukės lygiavimo įrenginio kaukės laikiklio ir uždėkite fotokaukę ant SU-8 padengtos plokštelės.
Kad sumažintumėte UV spindulių sklaidą, atspausdintą fotokaukės paviršių uždėkite tiesiai ant silicio plokštelės SU-8 padengtos pusės.
SU-8 padengtą plokštelę ir fotokaukę vertikaliai apšvieskite 260 mJ/cm2 UV šviesa iš anksto nustatytą ekspozicijos laiką (žr. šio langelio 10 veiksmą).
Po UV spindulių poveikio SU-8 padengtos silicio plokštelės buvo kepamos 65 °C temperatūroje 5 minutes ir 95 °C temperatūroje 15 minučių ant kiekvienos karštos plokštės, kad būtų gauti 200 μm aukščio raštai. Kepimo laikas po kepimo 95 °C temperatūroje pailgintas iki 30 minučių, kad būtų gauti 500 µm aukščio raštai.
Ryškalas supilamas į stiklinį indą, o iškeptas vaflis įdedamas į indą. SU-8 ryškalo tūris gali skirtis priklausomai nuo stiklinės plokštelės dydžio. Įsitikinkite, kad naudojate pakankamai SU-8 ryškalo, kad visiškai pašalintumėte neapšviestą SU-8. Pavyzdžiui, jei naudojate 150 mm skersmens stiklinį indą, kurio talpa 1 l, naudokite ~300 ml SU-8 ryškalo. Ryškinkite formelę 25 minutes, retkarčiais švelniai pasukdami.
Išryškintą formą nuplaukite ~10 ml šviežio ryškalo, o po to pipete purkškite tirpalą IPA.
Įdėkite plokštelę į plazmos valytuvą ir 1,5 min. paveikite deguonies plazma (atmosferos dujos, tikslinis slėgis 1 × 10−5 Torr, galia 125 W).
Įdėkite plokštelę į vakuuminį eksikatorių su stikliniu stikleliu viduje. Plokšteles ir stiklelius galima dėti greta. Jei vakuuminis eksikatorius lėkšte padalintas į kelis sluoksnius, stiklelius įdėkite į apatinę kamerą, o plokšteles – į viršutinę. Ant stiklinio stiklelio įlašinkite 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktil)silano tirpalo ir silanizavimui naudokite vakuumą.
Atšildykite užšaldytų Caco-2 ląstelių buteliuką 37 °C vandens vonelėje, tada atšildytas ląsteles perkelkite į T75 kolbą, kurioje yra 15 ml 37 °C pašildytos Caco-2 terpės.
Norint persodinti Caco-2 ląsteles, kurių susiliejimas buvo ~90 %, pirmiausia pašildykite Caco-2 terpę, PBS ir 0,25 % tripsino / 1 mM EDTA 37 °C vandens vonelėje.
Išsiurbkite terpę vakuuminiu būdu. Ląsteles du kartus nuplaukite 5 ml šilto PBS, kartodami vakuuminį išsiurbimą ir įpildami šviežio PBS.