Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojama naršyklės versija palaiko ribotą CSS. Kad gautumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Žmogaus žarnų morfogenezė nustato kriptovaliutų 3D epitelio mikroarchitektūros ir erdvinės struktūros bruožus. Ši unikali struktūra reikalinga žarnyno homeostazei palaikyti, nes apsaugo bazinėje kriptoje esančią kamieninių ląstelių nišą nuo egzogeninių mikrobų antigenų ir jų metabolitų. .Todėl 3D epitelio struktūrų atkūrimas yra labai svarbus kuriant in vitro žarnyno modelius.Pažymėtina, kad organinės mimetinės žarnos ant lusto gali sukelti spontanišką 3D žarnyno epitelio morfogenezę su patobulintomis fiziologinėmis funkcijomis ir biomechanika. t mikroskysčių mikroschemoje, taip pat Transwell įterptoje hibridinėje mikroschemoje. Aprašome išsamius prietaiso gamybos, Caco-2 arba žarnyno organoidinių epitelio ląstelių kultivavimo įprastomis sąlygomis, taip pat mikroskysčių platformoje, 3D morfogenezės indukciją ir nustatytų funkcinių 3D epitelio bazinių prototelių apibūdinimo metodus. skysčių srautas 5 d.Mūsų in vitro morfogenezės metodu naudojamas fiziologiškai svarbus šlyties įtempis ir mechaninis judesys, todėl nereikia sudėtingos ląstelių inžinerijos ar manipuliavimo, o tai gali pranokti kitus esamus metodus. Manome, kad mūsų siūlomas protokolas gali turėti platų poveikį biomedicininių tyrimų bendruomenei, suteikiant 3D žarnyno epitelio regeneravimo metodą, skirtą klinikiniams, klinikiniams ir biomedicininiams biomedicininiams sluoksniams.
Eksperimentai rodo, kad žarnyno epitelio Caco-2 ląstelės, kultivuotos žarnyne ant lusto 1, 2, 3, 4, 5 arba dvisluoksniuose mikroskysčių įrenginiuose6, 7, gali patirti spontanišką 3D morfogenezę in vitro be aiškaus pagrindinio mechanizmo supratimo. Neseniai atliktame tyrime nustatėme, kad būtina pašalinti bazolateralinius kanalus ir antagonistus, išskiriamus iš morfolio įtaisų. esis in vitro, kurį įrodė Caco-2 ir pacientų gauti žarnyno organoidai.Epitelio ląstelės buvo patvirtintos. Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme stipraus Wnt antagonisto Dickkopf-1 (DKK-1) ląstelių gamybai ir koncentracijos pasiskirstymui žarnyne ant lusto ir modifikuotuose mikrofluidiniuose įrenginiuose, kuriuose yra Transwell intarpų, vadinamų „hibridiniu lustu“. Mes parodome, kad buvo pridėta egzogeninių Wnt susijusių antagonistų (tokių kaip Wnt, S-repressed proteined arba11nt, DKK-1zz). oggy-1) į mikroschemą esantį žarnyną slopina morfogenezę arba suardo iš anksto struktūruotą 3D epitelio sluoksnį, o tai rodo, kad antagonistinis stresas kultivavimo metu yra atsakingas už žarnyno morfogenezę in vitro. Todėl praktinis būdas pasiekti tvirtą morfogenezę epitelio sąsajoje yra pašalinti arba minimaliai palaikyti antagonistinio fluostinio aktyvumo lygius. -on-a-chip arba hibridinės ant lusto platformos) arba difuzijos .Bazolateralinės terpės (pvz., iš Transwell intarpų į didelius bazolaterinius rezervuarus šuliniuose).
Šiame protokole pateikiame išsamų žarnyno mikroįrenginių ir Transwell įterpiamų hibridinių lustų (1–5 žingsniai) gamybos metodą, skirtą žarnyno epitelio ląstelėms kultivuoti ant polidimetilsiloksano (PDMS) pagrindu pagamintų akytų membranų (6A, 7A, 8, 9 žingsniai) arba poliesterio membranų, įdėtų 7, 6 žingsnių, 9 žingsnių, B. 3D morfogenezė in vitro (10 veiksmas). Taip pat nustatėme ląstelių ir molekulines savybes, rodančias specifinę audinių histogenezę ir nuo kilmės priklausomą ląstelių diferenciaciją, taikydami įvairius vaizdavimo būdus (11–24 žingsniai). s, 2D monosluoksnių kūrimas ir žarnyno biocheminis bei biomechaninės mikroaplinkos atkūrimas.in vitro.Siekdami sukelti 3D morfogenezę iš 2D epitelio vienasluoksnių sluoksnių, pašalinome abiejų kultivuojamų formų morfogenų antagonistus, įleidžiant terpę į bazolaterinį epitelio skyrių, kuris gali būti naudojamas kaip kultūros sluoksnio regeneravimas. modeliuoti nuo morfogeno priklausomą epitelio augimą, išilgines šeimininko ir mikrobiomų kokultūras, patogeninę infekciją, uždegiminį sužalojimą, epitelio barjero disfunkciją ir probiotikais pagrįstas terapijas Pavyzdys.įtakas.
Mūsų protokolas gali būti naudingas daugeliui pagrindinių (pvz., žarnyno gleivinės biologijos, kamieninių ląstelių biologijos ir vystymosi biologijos) ir taikomųjų tyrimų (pvz., ikiklinikinių vaistų tyrimų, ligų modeliavimo, audinių inžinerijos ir gastroenterologijos) mokslininkų. Dėl mūsų protokolo atkuriamumo ir tvirtumo, kuriuo siekiama paskatinti 3D morfologinį 3D morfologinį regėjimą. skleidžiama auditorijoms, tiriančioms ląstelių signalizacijos dinamiką žarnyno vystymosi, regeneracijos ar homeostazės metu. Be to, mūsų protokolas yra naudingas tiriant infekciją, kurią sukelia įvairūs infekciniai sukėlėjai, pvz., Norovirus 8, Sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusas 2 (SARS-CoV-2), Clostridium Viphimurium, Tybrcholla9 arba Tybrichoraere.Ligos patologijos ir patogenezės auditorijos taip pat naudingos. Naudojant mikrofiziologinę žarnyno mikrofiziologinę sistemą, galima atlikti išilginę kokultūrą 10 ir vėliau įvertinti šeimininko apsaugą, imuninį atsaką ir su patogenais susijusius sužalojimus virškinimo trakte. galimo žarnyno sindromas gali būti imituojamas, kai 3D žarnyno epitelio sluoksniai ruošiami naudojant paciento 3D žarnyno epitelio sluoksnius, šios ligos apima gaurelių atrofiją, kriptų sutrumpėjimą, gleivinės pažeidimą arba sutrikusią epitelio barjerą. Biopsija arba iš kamieninių ląstelių gauta žarnyno liga gali būti geresnė, 13 ligos modelis gali būti sudėtingesnis12. skruzdžių ląstelių tipus, pvz., paciento periferinio kraujo mononuklearines ląsteles (PBMC), modeliams, kuriuose yra 3D žarnyno gaurelių ir kriptų mikroarchitektūros.audinių specifinės imuninės ląstelės, 5.
Kadangi 3D epitelio mikrostruktūrą galima fiksuoti ir vizualizuoti be atskyrimo proceso, žiūrovai, dirbantys su erdvine transkriptomika ir didelės skiriamosios gebos arba ypač didelės skiriamosios gebos vaizdavimu, gali būti suinteresuoti mūsų epitelio nišose esančių genų ir baltymų erdvinės ir laiko dinamikos žemėlapiais.Domina technologija. Atsakas į mikrobų arba imuninius dirgiklius. Be to, išilginis šeimininko ir mikrobiomo skersinis pokalbis 10, 14, koordinuojantis žarnyno homeostazę, gali būti nustatytas 3D žarnyno gleivinės sluoksnyje, kartu kultivuojant įvairias mikrobų rūšis, mikrobų bendruomenes, ypač išmatų mikrobiologijoje.platformoje.Šis metodas ypač patrauklus auditorijai, studijuojančioms gleivinės imunologiją, gastroenterologiją, žmogaus mikrobiomą, kulturomiką ir klinikinę mikrobiologiją, siekiantiems laboratorijoje auginti anksčiau nekultūrintą žarnyno mikrobiotą.Jei mūsų in vitro morfogenezės protokolas gali būti pritaikytas keičiamiems kultūros formatams, pvz. Protokolas taip pat gali būti platinamas tiems, kurie kuria farmacijos, biomedicinos arba didelio našumo patikros ar patvirtinimo platformas maisto pramonei.Kaip principo įrodymas, neseniai pademonstravome daugialypės didelio našumo morfogenezės sistemos, kurią galima keisti iki 24 šulinėlių plokštelės formato, įgyvendinamumą. Be to, buvo parduoti keli organai. Mūsų in vitro morfogenezės metodą galima paspartinti ir galbūt pritaikyti daugelyje mokslinių tyrimų laboratorijų, pramonės ar vyriausybės bei reguliavimo agentūrų, kad suprastų ląstelių perprogramavimą in vitro žarnyno morfogenezei transkriptominiu lygiu, kad būtų galima išbandyti vaistus ar bioterapiją. žarnyno morfogenezės procesas.
Tiriant žarnyno epitelio morfogenezę buvo naudojamas ribotas skaičius žmonėms svarbių eksperimentinių modelių, daugiausia dėl to, kad trūksta įgyvendinamų protokolų 3D morfogenezei in vitro sukelti. Tiesą sakant, didžioji dalis dabartinių žinių apie žarnyno morfogenezę yra pagrįstos tyrimais su gyvūnais (pvz., zebražuvės20, pelės21 ir viščiukai gali būti labai brangūs, 21 ir viščiukai). ir, svarbiausia, tiksliai nenustato žmogaus vystymosi procesų. Šiuos modelius taip pat labai ribota galimybė išbandyti įvairiais būdais keičiamo mastelio būdu. Todėl mūsų 3D audinių struktūrų regeneravimo in vitro protokolas yra geresnis už in vivo gyvūnų modelius, taip pat kitus tradicinius statinius 2D ląstelių kultūros modelius. reaguojant į įvairius gleivinės ar imuninius dirgiklius. 3D epitelio sluoksniai gali suteikti erdvę tirti, kaip mikrobų ląstelės konkuruoja formuojant erdvines nišas ir ekologinę evoliuciją, reaguodamos į šeimininko veiksnius (pvz., vidinis ir išorinis gleivių sluoksniai, IgA ir antimikrobinių peptidų sekrecija). ergistiškai gamina mikrobų metabolitus (pvz., trumpos grandinės riebalų rūgštis), kurie formuoja ląstelių organizaciją ir kamieninių ląstelių nišas bazinėse kriptose. Šios savybės gali būti pademonstruotos tik tada, kai in vitro nustatomi 3D epitelio sluoksniai.
Be mūsų 3D žarnyno epitelio struktūrų kūrimo metodo, yra keletas in vitro metodų. Žarnyno organoidų kultūra yra moderniausias audinių inžinerijos metodas, pagrįstas žarnyno kamieninių ląstelių kultivavimu konkrečiomis morfogeninėmis sąlygomis23, 24, 25. Tačiau 3D organoidinių modelių naudojimas atliekant transportavimo analizę arba kartu su kultūra yra mikromedžio analizė. organoido viduje, todėl luminalinių komponentų, tokių kaip mikrobinės ląstelės arba egzogeniniai antigenai, įvedimas yra ribotas.Prieiga prie organoidinių liumenų gali būti pagerinta naudojant mikroinjektorių, 26, 27, tačiau šis metodas yra invazinis ir daug darbo reikalaujantis, o jo atlikimui reikia specialių žinių. Be to, tradicinės organoidinės kultūros, laikomos hidrogelio pastoliuose statinėmis sąlygomis, tiksliai neatspindi aktyvios in vivo biomechanikos.
Kituose metoduose, kuriuos taiko kelios tyrimų grupės, naudojami iš anksto struktūrizuoti 3D hidrogelio karkasai, siekiant imituoti žarnyno epitelio struktūrą, kultivuojant izoliuotas žmogaus žarnyno ląsteles ant gelio paviršiaus. Gaminame hidrogelio pastolius naudojant 3D atspausdintas, mikromaltas arba litografiškai pagamintas formas. Šis metodas parodo morfologiškai izoliuotų epitelio organizuotų ląstelių išdėstymą savarankiškai. s, sukuriant aukšto formato santykio epitelio struktūrą ir stromos ir epitelio skerspjūvį, įtraukiant stromos ląsteles į pastolius. Tačiau iš anksto sukonstruotų pastolių pobūdis gali neleisti pasireikšti pačiam spontaniškam morfogenetiniam procesui. Šie modeliai taip pat neužtikrina dinaminio luminalinio ar intersticinio tėkmės, nes trūksta skysčių ir fiziologinio krūvio, kuriam trūksta testo, fiziologinio krūvio. nė viename neseniai atliktame tyrime nebuvo naudojami hidrogelio karkasai mikrofluidinėje platformoje ir raštuotos žarnyno epitelio struktūros, naudojant lazerinio ėsdinimo metodus. Pelės žarnyno organoidai seka išgraviruotus modelius, sudarydami žarnyno kanalėlių struktūras, o intraluminalinio skysčio srautą galima apibendrinti naudojant mikrofluidikos modulį. Taikant tos pačios grupės 3D spausdinimo metodus buvo galima sukurti miniatiūrinius žarnų vamzdelius su spontaniškais morfogenetiniais procesais.Nepaisant sudėtingo skirtingų žarnų segmentų gamybos vamzdyje, šiame modelyje taip pat trūksta šviesos skysčio srauto ir mechaninės deformacijos. Be to, modelio veikimas gali būti apribotas, ypač pasibaigus biospausdinimo procesui, arba trikdančios ląstelės-protokologeninės eksperimentinės sąlygos. ess, fiziologiškai svarbus šlyties įtempis, biomechanika, imituojanti žarnyno judrumą, nepriklausomų viršūninių ir bazolaterinių skyrių prieinamumas ir sudėtingos biologinės modulinės mikroaplinkos atkūrimas. Todėl mūsų in vitro 3D morfogenezės protokolas gali būti papildomas būdas įveikti esamų metodų iššūkius.
Mūsų protokolas yra visiškai orientuotas į 3D epitelio morfogenezę, o kultūroje yra tik epitelio ląstelės ir nėra kitų tipų aplinkinių ląstelių, tokių kaip mezenchiminės ląstelės, endotelio ląstelės ir imuninės ląstelės. Kaip aprašyta anksčiau, mūsų protokolo esmė yra epitelio morfogenezės indukcija, pašalinant morfogeno inhibitorius, išskiriamus iš bazinės terpės pusės. lustas ir hibridas ant lusto leidžia atkurti banguotą 3D epitelio sluoksnį, papildomus biologinius sudėtingumus, tokius kaip epitelio ir mezenchiminės sąveikos 33, 34, ekstraląstelinės matricos (ECM) nusodinimas 35 ir, mūsų modelyje, kripto-villio bruožai, perkeliantys fibroblastines kamienines ląsteles į bazines ląsteles. aš vaidinu pagrindinį vaidmenį gaminant ECM baltymus ir reguliuojant žarnyno morfogenezę in vivo35,37,38.Mezenchiminių ląstelių pridėjimas prie mūsų modelio pagerino morfogenetinį procesą ir ląstelių prisitvirtinimo efektyvumą. Endotelio sluoksnis (ty kapiliarai ar limfagyslės) vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant molekulinių ląstelių transportavimą, imuninės sistemos atsigavimą ir mikrokraujagysles. Kultūros komponentai, kuriuos galima sujungti tarp audinių modelių, yra būtina sąlyga, kai audinių modeliai yra sukurti siekiant parodyti kelių organų sąveiką. Todėl gali reikėti įtraukti endotelio ląsteles, kad būtų galima modeliuoti tikslesnes fiziologines ypatybes naudojant organų lygio skiriamąją gebą. Iš paciento gautos imuninės ląstelės taip pat yra būtinos norint parodyti įgimtą imuninį atsaką, antigenų pateikimą, įgimtą adaptacinę ligą, imuninę ligą ir imuninės kryžminės ligos tyrimo kontekste.
Hibridinių lustų naudojimas yra paprastesnis nei žarnos ant lusto, nes įrenginio sąranka yra paprastesnė, o naudojant Transwell įdėklus galima keisti žarnyno epitelio kultūrą. Tačiau parduodami Transwell įdėklai su poliesterio membranomis nėra elastingi ir negali imituoti peristaltiką primenančių judesių. Be to, apicalinė lusto dalis liko įtempta ant šoninio lusto. .Akivaizdu, kad statinės savybės viršūniniame skyriuje retai įgalina ilgalaikę bendrą bakterijų kultūrą hibridiniuose lustuose. Nors naudojant hibridinius lustus galime tvirtai sukelti 3D morfogenezę Transwell intarpuose, fiziologiškai svarbios biomechanikos ir viršūninio skysčio srauto trūkumas gali apriboti hibridinių lustų platformų panaudojimo galimybes.
Viso masto žmogaus kripto-viluso ašies rekonstrukcijos žarnyno epitelio ir hibrido ant lusto kultūrose nebuvo visiškai nustatytos. Kadangi morfogenezė prasideda nuo epitelio vienasluoksnio sluoksnio, 3D mikroarchitektūros nebūtinai suteikia morfologinį panašumą į kriptas in vivo. Nors mes apibūdinome proliferacinę ląstelę3, kuri yra netoli bazinės ląstelės. kriptos ir gaurelių sritys nebuvo aiškiai atskirtos. Nors aukštesni viršutiniai lusto kanalai padidina mikroinžinerijos epitelio aukštį, maksimalus aukštis vis tiek ribojamas iki ~300–400 µm. Faktinis žmogaus žarnyno kriptų gylis plonojoje ir storojoje žarnoje yra ~135 µm ir ~400 µm storio plonajame žarnyne m41.
Vaizdo gavimo požiūriu didelės skiriamosios gebos 3D mikroarchitektūrų vaizdavimas in situ gali būti apribotas lusto žarnyne, nes reikalingas darbinis atstumas nuo objektyvo lęšio iki epitelio sluoksnio yra maždaug keli milimetrai. Norint išspręsti šią problemą, gali prireikti nutolusio objektyvo. Be to, plonų pjūvių paruošimas, kad būtų galima atlikti didesnį vaizdų gavimo elastingumą. Žarnyno mikrogamybos sluoksnis po sluoksnio ant lusto apima nuolatinį sukibimą tarp kiekvieno sluoksnio, todėl labai sunku atidaryti arba pašalinti viršutinį sluoksnį, kad būtų galima ištirti epitelio sluoksnio paviršiaus struktūrą. Pavyzdžiui, naudojant skenuojantį elektroninį mikroskopą (SEM).
PDMS hidrofobiškumas buvo ribojantis veiksnys atliekant mikrofluidinius tyrimus, susijusius su hidrofobinėmis mažomis molekulėmis, nes PDMS gali nespecifiškai adsorbuoti tokias hidrofobines molekules. Galima apsvarstyti PDMS alternatyvas naudojant kitas polimerines medžiagas. Arba galima apsvarstyti PDMS paviršiaus modifikavimą (pvz., padengimą lipofilinėmis medžiagomis3 arba polietileno medžiagas4) hidrofobinių molekulių buvimas.
Galiausiai, mūsų metodas nebuvo gerai apibūdintas kaip didelio našumo atranka arba „vienas dydis tinka visiems“ patogi eksperimentinė platforma. Pagal dabartinį protokolą kiekvienam mikroįrenginiui reikalingas švirkšto siurblys, kuris užima vietą CO2 inkubatoriuje ir neleidžia atlikti didelio masto eksperimentų. Šį apribojimą gali žymiai pagerinti naujoviškų kultūros formatų mastelio keitimas, 934 gerai, kurios leidžia nuolat papildyti ir pašalinti bazolaterinę terpę).
Siekdami sukelti 3D žmogaus žarnyno epitelio morfogenezę in vitro, panaudojome mikroskysčių lustą žarnyno įtaisą, kuriame yra du lygiagrečiai mikrokanalai ir elastinga porėta membrana tarp jų, kad sukurtume liumenų ir kapiliarų sąsają. Taip pat demonstruojame, kaip naudojamas vieno kanalo mikroskysčių įtaisas (hibridinis lustas), kuris užtikrina nenutrūkstamą bazolaterinį epitelio sluoksnį, esantį po abiejų šulinių. yra įvairių žmogaus žarnyno epitelio ląstelių, gali būti parodyta taikant kryptingą srauto manipuliavimą, kad būtų pašalinti morfogeno antagonistai iš bazolaterinio skyriaus. Visą eksperimentinę procedūrą (1 pav.) sudaro penkios dalys: (i) žarnyno mikroschemos arba Transwell įterpiamos hibridinės mikroschemos mikrogamyba (1-5 žingsniai; 1 langelis žmogaus epitelio ląstelių paruošimas). organoidai;2–5 langeliai), iii) žarnyno epitelio ląstelių kultūra ant žarnyno lustų arba hibridinių lustų (6–9 žingsniai), iv) 3D morfogenezės indukcija in vitro (10 ir v) ), siekiant apibūdinti 3D epitelio mikrostruktūrą in vitro (11–24 žingsniai). epitelio morfogenezę lyginant su erdvine, laiko, sąlygine ar procedūrine kontrole.
Naudojome dvi skirtingas kultivavimo platformas: žarnų ant lusto su tiesiais kanalais arba netiesiniais vingiuotais kanalais arba hibridines lustas su Transwell (TW) įdėklais mikrofluidiniame įrenginyje, pagamintame, kaip aprašyta 1 langelyje, ir 1-5 veiksmą. sėklidžių organoidai) ir kultivavimo procedūra, naudojama šiame protokole."In vitro morfogenezė" rodo bendrus etapus, kurių metu Caco-2 arba iš organoidų gautos epitelio ląstelės kultivuojamos žarnyno mikroschemoje arba hibridinio lusto Transwell intarpuose, po to indukuojama 3D morfogenezė ir formuojama apibūdinta epitelio struktūra. Toliau pateikiamas kiekvieno testo eilučių skaičiaus nustatymo programos veiksmo pavyzdys. al sluoksniai gali būti naudojami, pavyzdžiui, ląstelių diferenciacijos apibūdinimui, žarnyno fiziologijos tyrimams, šeimininko ir mikrobiomų ekosistemų kūrimui ir ligų modeliavimui. „Ląstelių diferenciacijos“ imunofluorescenciniai vaizdai, kuriuose rodomi branduoliai, F-aktinas ir MUC2, išreikšti 3D Caco-2 epitelio sluoksnyje, generuojančiame goC2 slaptą epitelio lustą. s. Fluorescuojantys vaizdai žarnų fiziologijoje rodo gleives, susidarančias dažant sialo rūgštimi ir N-acetilgliukozamino likučiais naudojant fluorescencinį kviečių gemalų agliutininą. Dviejuose persidengiančiuose vaizduose „Šeimininko ir mikrobų bendros kultūros“ skydelyje matyti reprezentatyvios fluorescencinės baltymų lustų kolikultūros. (GFP) su mikroinžinerijos būdu sukurtomis 3D Caco-2 epitelio ląstelėmis. Dešiniajame skydelyje rodoma GFP E. coli, kultivuotų kartu su 3D Caco-2 epitelio ląstelėmis, lokalizacija, po to atliekamas imunofluorescencinis dažymas F-aktinu (raudona) ir branduoliais (mėlyna). Ligos modeliavimas iliustruoja sveiką, palyginti su nesandariomis lipgenų uždegimu bakterijomis. acharidas, LPS) ir imuninės ląstelės (pvz., PBMC;žalia).Caco-2 ląstelės buvo kultivuojamos siekiant sukurti 3D epitelio sluoksnį.Mastelio juosta, 50 µm.Vaizdai apatinėje eilutėje: „Ląstelių diferenciacija“ pritaikyta su leidimu iš nuorodos.2.Oksfordo universiteto leidykla;Atkurta gavus 5 nuorodos leidimą.NAS;„Host-Microbe Co-Culture“ pritaikyta su leidimu iš ref.3.NAS;„Ligos modeliavimas“ pritaikytas su leidimu iš nuorodos.5.NAS.
Tiek žarnos ant lusto, tiek hibridinės lustos buvo pagamintos naudojant PDMS kopijas, kurios buvo išardytos iš silicio formų minkštos litografijos būdu1,44 ir margintos SU-8. Kiekvieno lusto mikrokanalų konstrukcija nustatoma atsižvelgiant į hidrodinamiką, pvz., šlyties įtempį ir hidrodinaminį slėgį1,4,12. ed lygiagrečius tiesius mikrokanalus, išsivystė į sudėtingą žarną ant lusto (Išplėstiniai duomenys 1b pav.), kurią sudaro lenktų mikrokanalų pora, skatinanti padidinti skysčio buvimo laiką, netiesinius srauto modelius ir daugiaašę kultivuojamų ląstelių deformaciją (2a–f pav.). Mes parodėme, kad vingiuotas Gut-Chip taip pat stipriai indukuoja 3D morfogenezę per panašų laikotarpį su panašiu epitelio augimo laipsniu, palyginti su originaliu Gut-Chip, nepriklausomai nuo kultivuojamos ląstelės tipo.Todėl, norint sukelti 3D morfogenezę, linijinis ir sudėtingas moduliuojamo dizaino lustas yra keičiamas su lustais. -8 modeliai suteikė neigiamų savybių po išardymo (1 pav.).2a). Norint pagaminti žarnyną ant lusto, paruoštas viršutinis PDMS sluoksnis buvo nuosekliai sujungtas su akyta PDMS plėvele, o po to sulygiuotas su apatiniu PDMS sluoksniu negrįžtamu sujungimu naudojant koronos apdorojimo priemonę (2b–f pav.). Norint pagaminti hibridines lustas, sukietintos PDMS kopijos buvo sujungtos su mikrofluumuotiniais įtaisais, kurie galėtų gerai sujungti stiklines skaidres. 2h ir išplėstiniai duomenys 2 pav.. Sujungimo procesas atliekamas apdorojant PDMS replikos ir stiklo paviršius deguonies plazma arba korono apdorojimu.Sterilizavus prie silikoninio vamzdelio pritvirtintą mikromedžiaginį prietaisą, prietaiso sąranka buvo paruošta atlikti žarnyno epitelio 3D morfogenezę2g (paveikslas).
a, Scheminė PDMS dalių paruošimo iš SU-8 raštuotų silicio formų iliustracija.Nesukietėjęs PDMS tirpalas buvo pilamas ant silicio formos (kairėje), sukietintas 60 °C temperatūroje (viduryje) ir išardytas (dešinėje). Išardytas PDMS buvo supjaustytas į gabalus ir išvalytas tolesniam naudojimui.b, Silicio sluoksnio paruošimui naudota PDMS nuotrauka. d, naudojama PDMS akytai membranai gaminti.d, Viršutinių ir apatinių PDMS komponentų ir surinkto ant lusto žarnyno įrenginio nuotraukų serija.e, Viršutinių, membranų ir apatinių PDMS komponentų išlyginimo schema. Kiekvienas sluoksnis yra negrįžtamai sujungtas apdorojant plazmą arba vainiką. um chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture.Pagaminta žarna ant lusto, surinkto su silikoniniu vamzdeliu ir švirkštu, buvo uždėta ant dengiamojo stiklelio. Lustų įtaisas buvo uždėtas ant 150 mm Petri lėkštelės dangtelio apdorojimui. Rišiklis naudojamas uždaryti silikoninį lustą, lustą ir silikoninį vamzdelį. .Transwell intarpai, paruošti nepriklausomai, norint kultivuoti 2D žarnyno epitelio ląstelių monosluoksnius, buvo įterpti į hibridinį lustą, kad sukeltų žarnyno 3D morfogenezę. Terpė perfuzuojama per mikrokanalus, esančius po ląstelės sluoksniu, nustatytu Transwell intarpe.Mastelio juosta, 1 cm.h Perspausdinta gavus 4 nuorodos leidimą.Elsevier.
Šiame protokole Caco-2 ląstelių linija ir žarnyno organoidai buvo naudojami kaip epitelio šaltiniai (3a pav.). Abiejų tipų ląstelės buvo kultivuojamos atskirai (2 langelis ir 5 langelis) ir buvo naudojami mikrokanalams, padengtiems ant lusto žarnų arba Transwell ląstelių, sėti. lt 10 ir 50 pasažai) surenkami T formos kolbose, kad būtų paruoštos disocijuotos ląstelių suspensijos tripsinizacijos skysčiu (2 langelis). Žmogaus žarnyno organoidai, gauti iš žarnyno biopsijų arba chirurginių rezekcijų, buvo kultivuojami Matrigel pastolių kupoluose 24 šulinėlių plokštelėse (mordino ir esminių R-megenų, nospondino mikroelementų ir struktūrinių mikroelementų palaikymui. ggin) ir augimo faktoriai, paruošti, kaip aprašyta 3 langelyje, buvo papildomi kas antrą dieną, kol organoidai išaugo iki ~500 µm skersmens. Visiškai išaugę organoidai surenkami ir suskaidomi į atskiras ląsteles, kad būtų sėjamos į žarnas arba Transwell intarpus ant lusto (5 langelis). arba normalus donoras), pažeidimo vieta (pvz., pažeidimas, palyginti su nepažeista sritimi) ir virškinimo trakto vieta trakte (pvz., dvylikapirštės žarnos, tuščiosios žarnos, klubinės žarnos, aklosios žarnos, gaubtinės žarnos arba tiesiosios žarnos). 5 langelyje pateikiame optimizuotą gaubtinės žarnos organoidų (koloidų) kultivavimo protokolą, kuriam paprastai reikia didesnės koncentracijos morofogeno mažuose organuose.
a, Darbo eiga žarnų morfogenezės indukcijai žarnų mikroschemoje.Caco-2 žmogaus žarnyno epitelis ir žarnyno organoidai yra naudojami šiame protokole 3D morfogenezei parodyti. Izoliuotos epitelio ląstelės buvo pasėtos į paruoštą žarnų ant lusto prietaisą (lusto preparatą). (D0), viršūninis (AP) srautas inicijuojamas ir palaikomas pirmąsias 2 dienas (tėkmė, AP, D0-D2).Bazolateralinis (BL) srautas taip pat pradedamas kartu su cikliniais tempimo judesiais (tempimas, tekėjimas, AP ir BL), kai susidaro pilnas 2D vienasluoksnis sluoksnis. Žarnyno 3D morfogenezė mikrofluogenezė įvyko po 5 dienų. vaizduose parodyta reprezentatyvi Caco-2 ląstelių morfologija kiekviename eksperimento etape arba laiko taške (juostinė diagrama, 100 µm). Keturios scheminės diagramos, iliustruojančios atitinkamas žarnyno morfogenezės kaskadas (viršuje dešinėje). Brūkšninės rodyklės schemoje rodo skysčio tekėjimo kryptį.b, SEM vaizdas, rodantis nustatytos 3D epiliuotos srities paviršiaus topologiją (paryškintas 3D epitelio dydis). ) rodomi regeneruoti mikrovilliai 3D Caco-2 sluoksnyje (dešinėje).c, Horizontalus priekinis nustatytos Caco-2 3D vaizdas, claudin (ZO-1, raudona) ir ištisinės šepetėlio kraštinės membranos, pažymėtos F-aktinu (žalia) ir branduoliais (mėlyna). židinio vaizdas.d, Organoidų, kultivuotų mikroschemoje, morfologinių pokyčių laiko eiga, gauta atliekant fazinio kontrasto mikroskopiją 3, 7, 9, 11 ir 13 dienomis. Įdėklas (viršuje dešinėje) rodo didelį pateikto vaizdo padidinimą. E, organoidinio 3D epitelio mikrofotografija, nustatyta žarnyne, GR žymekliai, paimti per dieną. 5;rausvai raudonos spalvos), taurės ląstelės (MUC2; žalia), F-aktinas (pilkas) ir branduoliai (žydrai), atitinkamai 3 dienas (kairėje) ir 13 dienų (viduryje) auginami ant žarnyno lustų epitelio sluoksnyje. epitelis, nustatytas žarnyne ant lusto, plazmos membraną dažant dažais CellMask (dešinėje) 13 auginimo dieną.Masto juosta yra 50 μm, jei nenurodyta kitaip.b Perspausdinta su leidimu iš nuorodos.2.Oksfordo universiteto leidykla;c Pritaikyta gavus leidimą iš nuorodos.2.Oksfordo universiteto leidykla;e ir f pritaikyti su leidimu pagal nuorodą.12 Pagal Creative Commons licenciją CC BY 4.0.
Žarnyne ant lusto būtina modifikuoti hidrofobinį PDMS porėtos membranos paviršių, kad būtų sėkmingai dengta ECM. Šiame protokole taikome du skirtingus metodus PDMS membranų hidrofobiškumui modifikuoti. Kultivuojant Caco-2 ląsteles, pakako paviršiaus aktyvinimo UV/ozonu apdorojant vien tik PDMS, o membrana, kad ECM paviršius būtų prijungtas, o CaH ir PDCM paviršius prisitvirtintų. Mikrofluidinei organoidinio epitelio kultūrai reikalingas cheminis paviršiaus funkcionalizavimas, kad būtų galima efektyviai nusodinti ECM baltymus, nuosekliai naudojant polietilenimino (PEI) ir glutaraldehido PDMS mikrokanalus. Po paviršiaus modifikavimo ECM baltymai buvo nusodinti, kad padengtų funkcionalizuotą PDMS paviršių, o tada įvedami į izoliuotą organoidinę ląsteles, tik perfuusio epitelio terpę. viršutiniame mikrokanale, kol ląstelės suformuoja vientisą vienasluoksnį sluoksnį, o apatiniame mikrokanale palaikomos statinės sąlygos. Šis optimizuotas paviršiaus aktyvinimo ir ECM dengimo metodas leidžia pritvirtinti organoidinį epitelį, kad sukeltų 3D morfogenezę PDMS paviršiuje.
Transwell kultūras taip pat reikia padengti ECM prieš sėjant ląsteles;Tačiau Transwell kultūroms nereikia sudėtingų išankstinio apdorojimo etapų, kad būtų suaktyvintas akytų intarpų paviršius.Kai Caco-2 ląsteles auginti ant Transwell intarpų, ECM danga ant poringų įdėklų pagreitina disocijuotų Caco-2 ląstelių prisitvirtinimą (<1 val.) ir sandaraus jungties barjero susidarymą (<1-2 dienos).Norėdami kultivuoti organoidus ant Transwello paviršiaus, žr. palaikoma tol, kol organoidai suformuoja vientisą monosluoksnį su barjero vientisumu .Transwell kultūros atliekamos 24 šulinėlių plokštelėse nenaudojant hibridinių lustų.
In vitro 3D morfogenezę galima inicijuoti pritaikius skysčio srautą į bazolateralinį nusistovėjusio epitelio sluoksnio aspektą. Žarnyne ant lusto epitelio morfogenezė prasidėjo, kai terpė buvo perfuzuojama į viršutinį ir apatinį mikrokanalus (3a pav.).Kaip aprašyta anksčiau, labai svarbu užtikrinti pakankamą skysčių srautą sekreciniam morfogeno pašalinimui iš apatinės dalies. maistinės medžiagos ir serumas prie ląstelių, surištų ant poringų membranų ir generuoja luminalinį šlyties įtempį, paprastai žarnyne taikome dvigubą srovę ant lusto.Hibridiniuose lustuose į hibridines lustas buvo įterpiami Transwell intarpai, kuriuose yra epitelio vienasluoksniai sluoksniai. Tada terpė buvo dedama po akyto Transwell kultūros intarpo bazolateraline puse per mikrokanalą. Po to, kai žarnyno morfogenezė 5 dienomis pasireiškė morfogenezė.
Mikroinžinerijos 3D epitelio sluoksnių morfologines ypatybes galima analizuoti taikant įvairius vaizdo gavimo būdus, įskaitant fazinio kontrasto mikroskopiją, diferencinio interferencinio kontrasto (DIC) mikroskopiją, SEM arba imunofluorescencinę konfokalinę mikroskopiją (3 ir 4 pav.). Fazinio kontrasto arba DIC vaizdavimą galima nesunkiai atlikti bet kuriuo epitelio sluoksnio3 formos stebėjimu. Dėl PDMS ir poliesterio plėvelių optinio skaidrumo, tiek „gut-on-a-chip“, tiek hibridinių lustų platformos gali užtikrinti realiojo laiko in situ vaizdavimą, nereikia dalyti ar išardyti prietaiso. Atliekant imunofluorescencinį vaizdą (1, 3c, f ir 4b, c paveikslai), ląstelės paprastai yra fiksuojamos (XFA) % (su/vol) 100 ir 2 % (masės/tūrio) ) galvijų serumo albumino (BSA), eilės tvarka. Priklausomai nuo ląstelės tipo, gali būti naudojami įvairūs fiksatoriai, pralaidumą skatinančios medžiagos ir blokatoriai. -diamidino-2-fenilenas) indolas, DAPI) arba F-aktinas (pvz., fluorescenciniu būdu pažymėtas faloidinas).1, „Ląstelių diferenciacija“ ir „Žarnyno fiziologija“), atsitiktinė mikrobų ląstelių kolonizacija (1 pav., „Šeimininko ir mikrobų bendra kultūra“), imuninių ląstelių įdarbinimas (1 pav. „Ligos modeliavimas“) arba 3D epitelio morfologijos kontūrai, atskiriantys, modifikuojantys ir modifikuojantys 4 pav. Viršutinis sluoksnis nuo apatinio mikrokanalų sluoksnio, kaip aprašyta nuorodoje. Kaip parodyta 2 pav., 3D epitelio morfologija, taip pat mikrovileliai ant viršūninio šepetėlio krašto gali būti vizualizuojami naudojant SEM (3b pav.). Diferenciacijos žymenų raiška gali būti įvertinta atliekant kiekybinį PCR5 arba vienos ląstelės lusto sluoksnių RNR auginimo ląstelių seką arba auginimo ląsteles3. hibridiniai lustai surenkami tripsinizuojant ir naudojami molekulinei arba genetinei analizei.
a, Darbo eiga žarnyno morfogenezės indukcijai hibridiniame luste. Šiame protokole Caco-2 ir žarnyno organoidai naudojami 3D morfogenezei pademonstruoti hibridinėje lusto platformoje. Išsiskyrusios epitelio ląstelės buvo pasėtos į paruoštus Transwell intarpus (TW paruošimas; žr. paveikslą toliau). Kai ląstelės buvo pasėtos statinės intarpų membranos sąlygomis (visos ląstelės buvo sėjamos į poliesterio membraną, buvo pasėtos T. W kultūra). Po 7 dienų vienas Transwell intarpas, kuriame yra 2D vienasluoksnis epitelio ląstelių sluoksnis, buvo integruotas į hibridinį lustą, kad būtų įvestas bazolaterinis srautas (Flow, BL), kuris galiausiai paskatino 3D epitelio sluoksnio susidarymą (morfogenezę). Fazinio kontrasto mikrografijos, rodančios žmogaus organų epitelio ląstelių morfologines ypatybes kiekviename donoro etape (Ccenlonal3) Viršutiniuose sluoksniuose esantys s iliustruoja kiekvieno žingsnio eksperimentinę konfigūraciją.b Hibridiniai lustai (schema kairėje) gali sukelti organoidinių epitelio ląstelių 3D morfogenezę su konfokalinės mikroskopijos vaizdais iš viršaus į apačią, paimtą skirtingose ​​Z padėtyse (viršutinėje, vidurinėje ir apatinėje);žr. dešiniąją schemą ir atitinkamas punktyrines linijas).parodė akivaizdžias morfologines charakteristikas.F-aktinas (žydra), branduolys (pilkas).c, Fluorescencinės konfokalinės mikrografijos (3D kampinis vaizdas) organoidinių epitelio ląstelių, kultivuotų statiniame Transwell (TW; įdėklas baltai brūkšniniame langelyje), palyginti su hibridine mikroschema (didžiausias pilnas kadras), lyginant 2D morfologiją (atitinkamą 2D kryžminį vaizdą su 3D morfologija, viršutiniame dešiniajame kampe; „XZ“) taip pat rodomos 2D ir 3D funkcijos.Mastelio juosta, 100 µm.c Perspausdinta su leidimu iš nuorodos.4.Elsevier.
Kontroles galima paruošti auginant tas pačias ląsteles (Caco-2 arba žarnyno organoidų epitelio ląsteles) į dvimatį monosluoksnius, esant įprastoms statinės kultūros sąlygoms. Nemokamai maistinių medžiagų išeikvojimas gali atsirasti dėl riboto mikrokanalų tūrio talpos (ty ~ 4 µl viršutiniame kanale, esančiame originaliame žarnyno konstrukcijoje).
Minkštoji litografija turi būti atliekama švarioje patalpoje. Kiekvienam lusto sluoksniui (viršutiniam ir apatiniam sluoksniams bei membranoms) ir hibridiniams lustams buvo naudojamos skirtingos fotokaukės, pagamintos ant atskirų silicio plokštelių, nes mikrokanalų aukščiai buvo skirtingi. Mikrokanalų viršutinio ir apatinio mikrokanalų tikslinis aukštis yra 500 µm. µm.
Įdėkite 3 colių silicio plokštelę į indą su acetonu. Švelniai pasukite plokštelę 30 sekundžių, tada išdžiovinkite plokštelę oru. Perkelkite plokštelę į lėkštę su IPA, tada sukite plokštelę 30 s, kad išvalytumėte.
Pasirinktinai gali būti naudojamas piranijos tirpalas (vandenilio peroksido ir koncentruotos sieros rūgšties mišinys, 1:3 (tūris/tūris)), siekiant maksimaliai pašalinti organines liekanas nuo silicio plokštelės paviršiaus.
Piranha tirpalas yra labai ėsdinantis ir skleidžia šilumą.Būtina imtis papildomų saugos priemonių.Norėdami išmesti atliekas, leiskite tirpalui atvėsti ir supilkite į švarų, sausą atliekų konteinerį.Naudokite antrinius konteinerius ir tinkamai paženklinkite atliekų konteinerius.Išsamesnių procedūrų vykdykite įrenginio saugos gaires.
Dehidratuokite vaflius 10 min. padėdami ant 200 °C kaitvietės. Po dehidratacijos vafliai penkis kartus purtyti ore, kad atvėstų.
Ant išvalytos silicio plokštelės vidurio supilkite ~10 g fotorezisto SU-8 2100.Pincetu tolygiai paskirstykite fotorezistą ant plokštelės.Retkarčiais vaflę padėkite ant 65°C kaitvietės, kad fotorezistas būtų mažiau lipnus ir lengviau teptųsi.Nedėkite plokštelės tiesiai ant karštos plokštės.
SU-8 buvo tolygiai paskirstytas ant plokštelės naudojant sukimosi dangą. Užprogramuokite įeinantį SU-8 sukimąsi 5–10 s, kad jis sklistų 500 aps./min. greičiu, 100 aps./s. pagreičiu. Nustatykite pagrindinį sukimąsi 200 µm storio modeliu, esant 1 500 µm, 50 mm storio, 50 µm storio. viršutinį žarnyno sluoksnį ant lusto; žr. toliau esantį skyrių „Kritiniai žingsniai“) nustatytas 300 aps./min. pagreičiu 30 sekundžių esant 1 200 aps./min.
Pagrindinis gręžimo greitis gali būti reguliuojamas pagal tikslinį SU-8 rašto storį ant silicio plokštelės.
Norint pagaminti 500 µm aukščio SU-8 raštus viršutiniam žarnos sluoksniui ant lusto, šio dėžutės gręžimo dangos ir minkšto kepimo etapai (7 ir 8 žingsniai) buvo paeiliui kartojami (žr. 9 veiksmą), kad būtų pagaminti du 250 µm sluoksniai. .
SU-8 dengtus vaflius kepkite minkštai, atsargiai padėdami vaflius ant 65 °C kaitvietės 5 min., tada nustatykite 95 °C ir inkubuokite dar 40 min.
Norėdami pasiekti 500 μm SU-8 modelio aukštį viršutiniame mikrokanale, pakartokite 7 ir 8 veiksmus, kad sukurtumėte du 250 μm storio SU-8 sluoksnius.
Naudodami UV Mask Aligner, atlikite lempos testą pagal gamintojo instrukcijas, kad apskaičiuotumėte plokštelės ekspozicijos laiką. (ekspozicijos laikas, ms) = (ekspozicijos dozė, mJ/cm2)/(lempos galia, mW/cm2).
Nustačius ekspozicijos laiką, uždėkite fotokaukę ant UV kaukės lygintuvo kaukės laikiklio ir uždėkite fotokaukę ant SU-8 padengtos plokštelės.
Padėkite spausdintą fotokaukės paviršių tiesiai ant SU-8 padengtos silicio plokštelės pusės, kad sumažintumėte UV dispersiją.
Iš anksto nustatytą ekspozicijos laiką SU-8 padengtą plokštelę ir fotokaukę vertikaliai išlaikykite 260 mJ/cm2 UV spinduliu (žr. šio langelio 10 veiksmą).
Po UV poveikio SU-8 padengtos silicio plokštelės buvo kepamos 65 °C temperatūroje 5 min. ir 95 °C temperatūroje 15 min. ant kiekvienos kaitvietės, kad būtų pagaminti 200 μm aukščio raštai. Pailginkite kepimo laiką 95 °C temperatūroje iki 30 min., kad gautumėte 500 µm aukščio raštus.
Ryškiklis supilamas į stiklinį indą, o iškeptas vaflis dedamas į indą. SU-8 ryškalo tūris gali skirtis priklausomai nuo stiklo plokštės dydžio. Įsitikinkite, kad naudokite pakankamai ryškalo SU-8, kad visiškai pašalintumėte neeksponuotą SU-8. Pavyzdžiui, jei naudojate 150 mm skersmens stiklinį indą, kurio talpa 1 l, naudokite ~30-50 ml. sukimasis.
Išskalaukite išvystytą formą ~10 ml šviežio ryškalo, po to IPA, purškiant tirpalą pipete.
Įdėkite plokštelę į plazminį valiklį ir 1,5 min palaikykite deguonies plazmoje (atmosferos dujos, tikslinis slėgis 1 × 10–5 Torr, galia 125 W).
Įdėkite plokštelę į vakuuminį eksikatorių, kurio viduje yra stiklinis stiklelis.Vafliai ir stikleliai gali būti dedami vienas šalia kito.Jei vakuuminis eksikatorius yra padalintas į kelis sluoksnius plokšte, stiklelius įdėkite į apatinę kamerą, o plokšteles - į viršutinę kamerą.Užlašinkite 100 μL trichloro (1H, 2H,1H) tirpalo (1H, fluoro) ir fluoro taikykite vakuumą silanizavimui.
Atšildykite šaldytų Caco-2 ląstelių buteliuką 37 °C vandens vonioje, tada perkelkite atšildytas ląsteles į T75 kolbą, kurioje yra 15 ml 37 °C pašildytos Caco-2 terpės.
Norėdami perduoti Caco-2 ląsteles esant ~90% santakai, pirmiausia pašildykite Caco-2 terpę, PBS ir 0,25% tripsino/1 mM EDTA 37 °C vandens vonioje.
Išsiurbkite terpę vakuuminiu išsiurbimu. Du kartus nuplaukite ląsteles 5 ml šilto PBS, pakartodami vakuuminį išsiurbimą ir pridedant šviežio PBS.