Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Mikrobinių parazitų evoliucija apima priešpriešą tarp natūralios atrankos, dėl kurios parazitai tobulėja, ir genetinio dreifo, dėl kurio parazitai praranda genus ir kaupia žalingas mutacijas.Siekdami suprasti, kaip ši priešprieša vyksta vienos makromolekulės mastu, aprašome Encephalitozoon cuniculi, eukariotų organizmo, turinčio vieną iš mažiausių genomų gamtoje, ribosomos krio-EM struktūrą.Ekstremalų rRNR sumažėjimą E. cuniculi ribosomose lydi precedento neturintys struktūriniai pokyčiai, tokie kaip anksčiau nežinomų sulietų rRNR jungčių ir rRNR be iškilimų evoliucija.Be to, E. cuniculi ribosoma išgyveno praradus rRNR fragmentus ir baltymus, išvystydama galimybę naudoti mažas molekules kaip suardytų rRNR fragmentų ir baltymų struktūrines imitacijas.Apskritai mes parodome, kad molekulinės struktūros, kurios ilgą laiką buvo laikomos redukuotomis, išsigimusiomis ir susilpninančiomis mutacijomis, turi daugybę kompensacinių mechanizmų, kurie išlaiko jas aktyvias nepaisant ekstremalių molekulinių susitraukimų.
Kadangi dauguma mikrobinių parazitų grupių turi unikalius molekulinius įrankius, kad galėtų išnaudoti savo šeimininkus, dažnai turime sukurti skirtingus gydymo būdus skirtingoms parazitų grupėms1, 2.Tačiau nauji įrodymai rodo, kad kai kurie parazitų evoliucijos aspektai yra susiliejantys ir iš esmės nuspėjami, o tai rodo galimą pagrindą plačioms terapinėms intervencijoms į mikrobinius parazitus 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Ankstesniame darbe buvo nustatyta bendra mikrobinių parazitų evoliucijos tendencija, vadinama genomo mažinimu arba genomo skilimu 10, 11, 12, 13.Dabartiniai tyrimai rodo, kad kai mikroorganizmai atsisako laisvo gyvenimo būdo ir tampa viduląsteliniais parazitais (arba endosimbiontais), jų genomai per milijonus metų patiria lėtas, bet nuostabias metamorfozes9,11.Procese, vadinamame genomo skilimu, mikrobiniai parazitai kaupia žalingas mutacijas, kurios daugelį anksčiau svarbių genų paverčia pseudogenais, todėl laipsniškas genų praradimas ir mutacijų žlugimas14, 15.Šis žlugimas gali sunaikinti iki 95% genų seniausiuose tarpląsteliniuose organizmuose, palyginti su glaudžiai susijusiomis laisvai gyvenančiomis rūšimis.Taigi tarpląstelinių parazitų evoliucija yra dviejų priešingų jėgų – darvino natūralios atrankos, vedančios į parazitų tobulėjimą, ir genomo žlugimo, numetančio parazitus į užmarštį – virvės traukimas.Kaip parazitui pavyko ištrūkti iš šio virvės traukimo ir išlaikyti savo molekulinės struktūros aktyvumą, lieka neaišku.
Nors genomo skilimo mechanizmas nėra visiškai suprantamas, atrodo, kad tai daugiausia dėl dažno genetinio dreifo.Kadangi parazitai gyvena mažose, nelytinėse ir genetiškai ribotose populiacijose, jie negali veiksmingai pašalinti žalingų mutacijų, kurios kartais atsiranda DNR replikacijos metu.Tai veda prie negrįžtamo kenksmingų mutacijų kaupimosi ir parazito genomo sumažėjimo.Dėl to parazitas ne tik praranda genus, kurie nebereikalingi jo išlikimui tarpląstelinėje aplinkoje.Dėl parazitų populiacijų nesugebėjimo veiksmingai pašalinti atsitiktines žalingas mutacijas šios mutacijos kaupiasi visame genome, įskaitant svarbiausius jų genus.
Didžioji dalis mūsų dabartinio genomo mažinimo supratimo yra pagrįsta tik genomo sekų palyginimu, skiriant mažiau dėmesio faktinių molekulių, atliekančių namų tvarkymo funkcijas ir galinčių naudoti narkotikų taikinius, pokyčiams.Lyginamieji tyrimai parodė, kad žalingų tarpląstelinių mikrobų mutacijų našta, atrodo, skatina baltymus ir nukleorūgštis netinkamai susilankstyti ir agreguotis, todėl jie yra labiau priklausomi nuo chaperono ir yra pernelyg jautrūs karščiui19, 20, 21, 22, 23.Be to, įvairūs parazitai – nepriklausoma evoliucija, kartais atskirti net 2,5 milijardo metų – patyrė panašų baltymų sintezės5,6 ir DNR atkūrimo mechanizmų kokybės kontrolės centrų praradimą24.Tačiau mažai žinoma apie viduląstelinio gyvenimo būdo įtaką visoms kitoms ląstelių makromolekulių savybėms, įskaitant molekulinį prisitaikymą prie didėjančios žalingų mutacijų naštos.
Šiame darbe, siekdami geriau suprasti tarpląstelinių mikroorganizmų baltymų ir nukleorūgščių evoliuciją, nustatėme viduląstelinio parazito Encephalitozoon cuniculi ribosomų struktūrą.E. cuniculi yra į grybą panašus organizmas, priklausantis parazitinių mikrosporidijų grupei, turinčiai neįprastai mažus eukariotų genomus ir todėl naudojamas kaip pavyzdinis organizmas tiriant genomo irimą25,26,27,28,29,30.Neseniai krio-EM ribosomų struktūra buvo nustatyta vidutiniškai sumažintiems Microsporidia, Paranosema locustae ir Vairimorpha necatrix31,32 genomams (~3,2 Mb genomas).Šios struktūros rodo, kad tam tikrą rRNR amplifikacijos praradimą kompensuoja naujų kontaktų tarp gretimų ribosomų baltymų atsiradimas arba naujų msL131, 32 ribosomų baltymų įsigijimas.Rūšis Encefalitozonas (genomas ~ 2,5 mln. bp) kartu su artimiausia giminaite Ordospora demonstruoja galutinį eukariotų genomo sumažėjimo laipsnį – jie turi mažiau nei 2000 baltymus koduojančių genų, ir tikimasi, kad jų ribosomose nėra tik rRNR išsiplėtimo fragmentų (rRNR ribosomų fragmentų, kurie skiria keturias ribosomų bakterijas, skiriančias ribobolines bakterijas). mal baltymų, nes jiems trūksta homologų E. cuniculi genome26,27,28.Todėl padarėme išvadą, kad E. cuniculi ribosoma gali atskleisti anksčiau nežinomas molekulinės adaptacijos prie genomo irimo strategijas.
Mūsų krio-EM struktūra yra mažiausia eukariotinė citoplazminė ribosoma, kuri turi būti apibūdinta, ir suteikia supratimo apie tai, kaip galutinis genomo sumažinimo laipsnis veikia molekulinės įrangos, kuri yra neatsiejama nuo ląstelės, struktūrą, surinkimą ir evoliuciją.Mes nustatėme, kad E. cuniculi ribosoma pažeidžia daugelį plačiai konservuotų RNR lankstymo ir ribosomų surinkimo principų, ir atradome naują, anksčiau nežinomą ribosomų baltymą.Gana netikėtai parodome, kad mikrosporidijų ribosomos išvystė gebėjimą surišti mažas molekules, ir iškeliame hipotezę, kad rRNR ir baltymų sutrumpinimas sukelia evoliucines naujoves, kurios galiausiai gali suteikti naudingų savybių ribosomai.
Siekdami pagerinti mūsų supratimą apie baltymų ir nukleorūgščių evoliuciją viduląsteliniuose organizmuose, nusprendėme išskirti E. cuniculi sporas iš užkrėstų žinduolių ląstelių kultūrų, kad išvalytume jų ribosomas ir nustatytų šių ribosomų struktūrą.Sunku gauti daug parazitinių mikrosporidijų, nes mikrosporidijos negali būti auginamos maistinėje terpėje.Vietoj to, jie auga ir dauginasi tik šeimininko ląstelės viduje.Todėl, norėdami gauti E. cuniculi biomasę ribosomų valymui, mes užkrėtėme žinduolių inkstų ląstelių liniją RK13 E. cuniculi sporomis ir keletą savaičių kultivavome šias užkrėstas ląsteles, kad E. cuniculi galėtų augti ir daugintis.Naudodami maždaug pusės kvadratinio metro užkrėstų ląstelių monosluoksnį, sugebėjome išvalyti apie 300 mg Microsporidia sporų ir panaudoti jas ribosomų išskyrimui.Tada išgrynintas sporas suardėme stiklo karoliukais ir išskyrėme neapdorotas ribosomas, naudodami laipsnišką lizatų frakcionavimą polietilenglikoliu.Tai leido mums gauti maždaug 300 µg neapdorotų E. cuniculi ribosomų struktūrinei analizei.
Tada mes surinkome krio-EM vaizdus naudodami gautus ribosomų mėginius ir apdorojome šiuos vaizdus naudodami kaukes, atitinkančias didelį ribosomų subvienetą, mažą subvieneto galvutę ir mažą subvienetą.Šio proceso metu surinkome apie 108 000 ribosomų dalelių vaizdus ir apskaičiavome krio-EM vaizdus, ​​kurių skiriamoji geba yra 2, 7 Å (papildomi 1–3 paveikslai).Tada naudojome krioEM vaizdus, ​​kad modeliuotume rRNR, ribosomų baltymus ir žiemos miego faktorių Mdf1, susijusį su E. cuniculi ribosomomis (1a, b pav.).
E. cuniculi ribosomos struktūra komplekse su žiemos miego faktoriumi Mdf1 (pdb id 7QEP).b Hibernacijos faktoriaus Mdf1, susieto su E. cuniculi ribosoma, žemėlapis.c Antrinės struktūros žemėlapis, kuriame lyginama atgauta rRNR mikrosporidų rūšyse su žinomomis ribosomų struktūromis.Plokštelės rodo amplifikuotų rRNR fragmentų (ES) ir ribosomų aktyviųjų vietų, įskaitant dekodavimo vietą (DC), sarcicino kilpą (SRL) ir peptidiltransferazės centrą (PTC), vietą.d Elektronų tankis, atitinkantis E. cuniculi ribosomos peptidiltransferazės centrą, rodo, kad ši katalizinė vieta turi tokią pačią struktūrą E. cuniculi parazite ir jo šeimininkuose, įskaitant H. sapiens.e, f Atitinkamas dekodavimo centro elektronų tankis (e) ir dekodavimo centro schema (f) rodo, kad E. cuniculi daugelyje kitų eukariotų turi U1491 liekanas, o ne A1491 (E. coli numeracija).Šis pokytis rodo, kad E. cuniculi gali būti jautrus antibiotikams, nukreiptiems į šią aktyvią vietą.
Priešingai nei anksčiau nustatytos V. necatrix ir P. locustae ribosomų struktūros (abi struktūros atstovauja tai pačiai mikrosporidijų šeimai Nosematidae ir yra labai panašios viena į kitą), 31,32 E. cuniculi ribosomose vyksta daugybė rRNR ir baltymų fragmentacijos procesų.Tolesnė denatūracija (papildomi 4-6 paveikslai).Ryškiausi rRNR pokyčiai buvo visiškas amplifikuoto 25S rRNR fragmento ES12L praradimas ir dalinis h39, h41 ir H18 spiralių degeneracija (1c pav., papildomas 4 pav.).Tarp ribosomų baltymų ryškiausi pokyčiai buvo visiškas eS30 baltymo praradimas ir eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 ir eS7 baltymų sutrumpėjimas (4, eS7 5 papildomi paveikslai).
Taigi, ekstremalus Encephalotozoon/Ordospora rūšių genomų sumažėjimas atsispindi jų ribosomų struktūroje: E. cuniculi ribosomos patiria didžiausią baltymų kiekio sumažėjimą eukariotinėse citoplazminėse ribosomose, kurioms taikomas struktūrinis apibūdinimas, ir jose net nėra tų rRNR ir baltymų fragmentų, kurie yra plačiai išsaugoti ne tik trijų domenų gyvybėje.E. cuniculi ribosomos struktūra yra pirmasis šių pokyčių molekulinis modelis ir atskleidžia evoliucinius įvykius, kurių nepastebėjo tiek lyginamoji genomika, tiek tarpląstelinės biomolekulinės struktūros tyrimai (papildomas 7 pav.).Žemiau aprašome kiekvieną iš šių įvykių kartu su tikėtina jų evoliucine kilme ir galimu poveikiu ribosomų funkcijai.
Tada mes nustatėme, kad, be didelių rRNR sutrumpėjimų, E. cuniculi ribosomos turi rRNR variacijų vienoje iš savo aktyvių vietų.Nors E. cuniculi ribosomos peptidiltransferazės centras turi tokią pat struktūrą kaip ir kitų eukariotų ribosomų (1d pav.), dekodavimo centras skiriasi dėl sekos variacijos ties 1491 nukleotidu (E. coli numeracija, 1e, f pav.).Šis stebėjimas yra svarbus, nes eukariotinių ribosomų dekodavimo vietoje paprastai yra liekanų G1408 ir A1491, palyginti su bakterijų tipo liekanomis A1408 ir G1491.Šis skirtumas lemia skirtingą bakterijų ir eukariotų ribosomų jautrumą ribosominių antibiotikų aminoglikozidų šeimai ir kitoms mažoms molekulėms, nukreiptoms į dekodavimo vietą.E. cuniculi ribosomos dekodavimo vietoje liekana A1491 buvo pakeista U1491, potencialiai sukuriant unikalią surišimo sąsają mažoms molekulėms, nukreiptoms į šią aktyvią vietą.Tas pats A14901 variantas yra ir kitose mikrosporidijose, tokiose kaip P. locustae ir V. necatrix, o tai rodo, kad jis plačiai paplitęs tarp mikrosporidijų rūšių (1f pav.).
Kadangi mūsų E. cuniculi ribosomų mėginiai buvo išskirti iš metaboliškai neaktyvių sporų, mes išbandėme E. cuniculi krio-EM žemėlapį, kad būtų galima nustatyti anksčiau aprašytą ribosomų surišimą streso ar bado sąlygomis.Hibernacijos faktoriai 31,32,36,37,38. Suderinome anksčiau nustatytą žiemojančios ribosomos struktūrą su E. cuniculi ribosomos krio-EM žemėlapiu.Prijungimui buvo naudojamos S. cerevisiae ribosomos komplekse su žiemos miego faktoriumi Stm138, skėrių ribosomos komplekse su Lso232 faktoriumi ir V. necatrix ribosomos komplekse su Mdf1 ir Mdf231 faktoriais.Tuo pačiu metu mes nustatėme krio-EM tankį, atitinkantį poilsio koeficientą Mdf1.Panašiai kaip Mdf1 jungiasi prie V. necatrix ribosomos, Mdf1 taip pat jungiasi prie E. cuniculi ribosomos, kur blokuoja ribosomos E vietą, galbūt padėdamas padaryti ribosomas prieinamas, kai parazitų sporos tampa metaboliškai neaktyvios, kai organizmą inaktyvuoja (2 pav.).).
Mdf1 blokuoja ribosomos E vietą, kuri, atrodo, padeda inaktyvuoti ribosomą, kai parazitų sporos tampa metaboliškai neaktyvios.E. cuniculi ribosomos struktūroje nustatėme, kad Mdf1 suformuoja anksčiau nežinomą kontaktą su L1 ribosomos kamienu – ta ribosomos dalimi, kuri baltymų sintezės metu palengvina deacilintos tRNR išsiskyrimą iš ribosomos.Šie kontaktai rodo, kad Mdf1 atsiskiria nuo ribosomos, naudodamas tą patį mechanizmą, kaip ir deacetilinta tRNR, todėl galima paaiškinti, kaip ribosoma pašalina Mdf1, kad vėl suaktyvintų baltymų sintezę.
Tačiau mūsų struktūra atskleidė nežinomą kontaktą tarp Mdf1 ir L1 ribosomos kojos (ribosomos dalies, kuri baltymų sintezės metu padeda iš ribosomos išlaisvinti deacilintą tRNR).Visų pirma, Mdf1 naudoja tuos pačius kontaktus kaip ir deacilintos tRNR molekulės alkūnės segmentas (2 pav.).Šis anksčiau nežinomas molekulinis modeliavimas parodė, kad Mdf1 atsiskiria nuo ribosomos, naudodamas tą patį mechanizmą kaip deacetilinta tRNR, o tai paaiškina, kaip ribosoma pašalina šį žiemos miego faktorių, kad vėl suaktyvintų baltymų sintezę.
Kurdami rRNR modelį nustatėme, kad E. cuniculi ribosoma turi neįprastai susilanksčiusius rRNR fragmentus, kuriuos pavadinome sulietąja rRNR (3 pav.).Ribosomose, apimančiose tris gyvenimo sritis, rRNR susilanksto į struktūras, kuriose dauguma rRNR bazių arba bazių poros, ir susilanksto viena su kita, arba sąveikauja su ribosomų baltymais38, 39, 40.Tačiau atrodo, kad E. cuniculi ribosomose rRNR pažeidžia šį lankstymo principą, kai kurias jų sraigtas paversdamos į išsiskleidusias rRNR sritis.
S. cerevisiae, V. necatrix ir E. cuniculi H18 25S rRNR spiralės struktūra.Paprastai ribosomose, apimančiose tris gyvybės sritis, šis linkeris susisuka į RNR spiralę, kurioje yra 24–34 liekanos.Priešingai, Microsporidia, šis rRNR jungiklis palaipsniui sumažinamas iki dviejų vienos grandinės uridino turtingų jungčių, turinčių tik 12 liekanų.Dauguma šių likučių yra veikiami tirpiklių.Paveikslėlyje parodyta, kad parazitinės mikrosporidijos pažeidžia bendruosius rRNR lankstymo principus, kai rRNR bazės paprastai yra susietos su kitomis bazėmis arba dalyvauja rRNR ir baltymų sąveikoje.Mikrosporidijose kai kurie rRNR fragmentai įgauna nepalankią raukšlę, kurioje buvusi rRNR spiralė tampa viengrandžiu fragmentu, pailgu beveik tiesia linija.Šių neįprastų sričių buvimas leidžia mikrosporidijų rRNR surišti tolimus rRNR fragmentus naudojant minimalų RNR bazių skaičių.
Ryškiausias šio evoliucinio perėjimo pavyzdys yra H18 25S rRNR spiralė (3 pav.).Rūšyse nuo E. coli iki žmogaus šios rRNR spiralės bazėse yra 24-32 nukleotidai, sudarantys šiek tiek netaisyklingą spiralę.Anksčiau nustatytose ribosominėse struktūrose iš V. necatrix ir P. locustae31,32 H18 spiralės bazės yra iš dalies nesusivyniojusios, tačiau nukleotidų bazių pora yra išsaugota.Tačiau E. cuniculi šis rRNR fragmentas tampa trumpiausiais jungikliais 228UUUGU232 ir 301UUUUUUUUUU307.Skirtingai nuo įprastų rRNR fragmentų, šie uridino turintys jungikliai nesusisuka ir nesusiliečia su ribosomų baltymais.Vietoj to, jie naudoja tirpikliu atviras ir visiškai išskleistas struktūras, kuriose rRNR grandinės yra išplėstos beveik tiesiai.Ši ištempta konformacija paaiškina, kaip E. cuniculi naudoja tik 12 RNR bazių, kad užpildytų 33 Å tarpą tarp H16 ir H18 rRNR spiralių, o kitoms rūšims reikia bent dvigubai daugiau rRNR bazių, kad užpildytų tarpą.
Taigi galime parodyti, kad dėl energetiškai nepalankaus lankstymo parazitinės mikrosporidijos sukūrė strategiją, kaip sutraukti net tuos rRNR segmentus, kurie išlieka iš esmės konservuoti visose rūšyse trijose gyvenimo srityse.Matyt, kaupdamas mutacijas, kurios paverčia rRNR sraigtas į trumpus poli-U linkerius, E. cuniculi gali suformuoti neįprastus rRNR fragmentus, turinčius kuo mažiau nukleotidų, skirtų distalinių rRNR fragmentų ligavimui.Tai padeda paaiškinti, kaip mikrosporidijos smarkiai sumažino savo pagrindinę molekulinę struktūrą, neprarandant struktūrinio ir funkcinio vientisumo.
Kitas neįprastas E. cuniculi rRNR bruožas yra rRNR atsiradimas be sustorėjimų (4 pav.).Išsipūtimai yra nukleotidai be bazių porų, kurie išsisuka iš RNR spiralės, užuot joje pasislėpę.Dauguma rRNR išsikišimų veikia kaip molekuliniai klijai, padedantys surišti gretimus ribosomų baltymus ar kitus rRNR fragmentus.Kai kurie iškilimai veikia kaip vyriai, leidžiantys rRNR spiralei optimaliai lankstytis ir susilankstyti produktyviai baltymų sintezei41.
a rRNR išsikišimo (S. cerevisiae numeracijos) nėra E. cuniculi ribosomų struktūroje, tačiau jis yra daugumoje kitų eukariotų b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens ir E. cuniculi vidinėse ribosomose.parazitams trūksta daugelio senovinių, labai konservuotų rRNR iškilimų.Šie sustorėjimai stabilizuoja ribosomų struktūrą;todėl jų nebuvimas mikrosporidijose rodo sumažėjusį rRNR susilankstymo stabilumą mikrosporidijų parazituose.Palyginimas su P stiebeliais (bakterijų L7/L12 stiebais) rodo, kad rRNR kauburėlių praradimas kartais sutampa su naujų iškilimų atsiradimu šalia prarastų iškilimų.23S/28S rRNR H42 spiralė turi senovinį išsipūtimą (U1206 Saccharomyces cerevisiae), kurio amžius yra mažiausiai 3,5 milijardo metų, nes jis apsaugotas trijose gyvenimo srityse.Sergant mikrosporidijomis, šis iškilimas pašalinamas.Tačiau šalia pamesto iškilumo atsirado naujas iškilimas (E. cuniculi A1306).
Stebėtina, kad E. cuniculi ribosomose trūksta daugumos rRNR iškilimų, esančių kitose rūšyse, įskaitant daugiau nei 30 išsipūtimų, išsaugotų kituose eukariotuose (4a pav.).Šis praradimas pašalina daug kontaktų tarp ribosomų subvienetų ir gretimų rRNR spiralių, kartais ribosomoje susidaro didelės tuščiavidurės tuštumos, todėl E. cuniculi ribosoma tampa poringesnė, palyginti su tradicinėmis ribosomomis (4b pav.).Pažymėtina, kad mes nustatėme, kad dauguma šių iškilimų taip pat buvo prarasti anksčiau nustatytose V. necatrix ir P. locustae ribosomų struktūrose, kurios buvo nepastebėtos ankstesnėse struktūrinėse analizėse31, 32.
Kartais rRNR iškilimų praradimą lydi naujų iškilimų atsiradimas šalia prarasto išsipūtimo.Pavyzdžiui, ribosominiame P kamiene yra U1208 iškilimas (Saccharomyces cerevisiae), kuris išliko nuo E. coli iki žmonių, todėl manoma, kad jo amžius yra 3,5 mlrd.Baltymų sintezės metu šis išsipūtimas padeda P stiebui judėti tarp atviros ir uždaros konformacijos, kad ribosoma galėtų įdarbinti transliacijos faktorius ir pristatyti juos į aktyviąją vietą.E. cuniculi ribosomose šio sustorėjimo nėra;tačiau naujas sustorėjimas (G883), esantis tik trijose bazių porose, gali prisidėti prie optimalaus P stiebo lankstumo atkūrimo (4c pav.).
Mūsų duomenys apie rRNR be iškilimų rodo, kad rRNR sumažinimas neapsiriboja rRNR elementų praradimu ribosomos paviršiuje, bet gali apimti ir ribosomos branduolį, sukuriant parazitui būdingą molekulinį defektą, kuris nebuvo aprašytas laisvai gyvenančiose ląstelėse.stebimos gyvos rūšys.
Sumodeliavę kanoninius ribosomų baltymus ir rRNR, nustatėme, kad įprasti ribosominiai komponentai negali paaiškinti trijų krio-EM vaizdo dalių.Du iš šių fragmentų yra mažų molekulių dydžio (5 pav., papildomas 8 pav.).Pirmasis segmentas yra tarp ribosomų baltymų uL15 ir eL18 tokioje padėtyje, kurią paprastai užima eL18 C galas, kuris E. cuniculi yra sutrumpintas.Nors negalime nustatyti šios molekulės tapatybės, šios tankio salos dydis ir forma gerai paaiškinami spermidino molekulių buvimu.Jo prisijungimą prie ribosomos stabilizuoja mikrosporidijų specifinės mutacijos uL15 baltymuose (Asp51 ir Arg56), kurios, atrodo, padidina ribosomos afinitetą šiai mažai molekulei, nes leidžia uL15 apvynioti mažą molekulę į ribosominę struktūrą.2 papildomas paveikslas).8, papildomi duomenys 1, 2).
Krio-EM vaizdas, rodantis nukleotidų buvimą už ribozės, susietos su E. cuniculi ribosoma.E. cuniculi ribosomoje šis nukleotidas užima tą pačią vietą kaip ir 25S rRNR A3186 nukleotidas (Saccharomyces cerevisiae numeracija) daugumoje kitų eukariotų ribosomų.b E. cuniculi ribosominėje struktūroje šis nukleotidas yra tarp ribosomų baltymų uL9 ir eL20, taip stabilizuodamas kontaktą tarp dviejų baltymų.cd eL20 sekos išsaugojimo analizė tarp mikrosporidijų rūšių.Filogenetinis Microsporidia rūšių medis (c) ir eL20 baltymo (d) kelių sekų išlyginimas rodo, kad nukleotidus surišančios F170 ir K172 liekanos yra konservuotos daugumoje tipiškų mikrosporidijų, išskyrus S. lophii, išskyrus ankstyvą šakojančią Microsporidia, kuri išlaikė ES39L pratęsimą.e Šis paveikslas rodo, kad nukleotidus surišančios F170 ir K172 liekanos yra tik labai sumažinto mikrosporidijų genomo eL20, bet ne kituose eukariotuose.Apskritai šie duomenys rodo, kad Microsporidian ribosomos sukūrė nukleotidų surišimo vietą, kuri, atrodo, jungiasi su AMP molekulėmis ir naudoja jas baltymų ir baltymų sąveikai ribosomų struktūroje stabilizuoti.Didelis šios surišimo vietos išsaugojimas Microsporidia ir jos nebuvimas kituose eukariotuose rodo, kad ši vieta gali suteikti selektyvų Microsporidia išgyvenimo pranašumą.Taigi, nukleotidus surišanti kišenė mikrosporidijų ribosomoje nėra išsigimusi rRNR degradacijos ypatybė ar galutinė forma, kaip aprašyta anksčiau, o veikiau naudinga evoliucinė naujovė, leidžianti mikrosporidijų ribosomai tiesiogiai surišti mažas molekules, naudojant jas kaip molekulinius statybinius blokus.ribosomų statybiniai blokai.Dėl šio atradimo mikrosporidijų ribosoma yra vienintelė ribosoma, kuri kaip struktūrinis blokas naudoja vieną nukleotidą.f Hipotetinis evoliucijos kelias, kilęs iš nukleotidų surišimo.
Antrasis mažos molekulinės masės tankis yra ribosomų baltymų uL9 ir eL30 sąsajoje (5a pav.).Ši sąsaja anksčiau buvo aprašyta Saccharomyces cerevisiae ribosomos struktūroje kaip rRNR A3186 25S nukleotido surišimo vieta (ES39L rRNR plėtinio dalis)38.Buvo parodyta, kad išsigimusiose P. locustae ES39L ribosomose ši sąsaja suriša nežinomą vieną 31 nukleotidą ir daroma prielaida, kad šis nukleotidas yra redukuota galutinė rRNR forma, kurioje rRNR ilgis ~130-230 bazių.ES39L redukuojamas iki vieno nukleotido 32.43.Mūsų krio-EM vaizdai patvirtina idėją, kad tankis gali būti paaiškintas nukleotidais.Tačiau didesnė mūsų struktūros skiriamoji geba parodė, kad šis nukleotidas yra ekstraribosominė molekulė, galbūt AMP (5a, b pav.).
Tada paklausėme, ar nukleotidų surišimo vieta atsirado E. cuniculi ribosomoje, ar ji egzistavo anksčiau.Kadangi nukleotidų surišimą daugiausia skatina Phe170 ir Lys172 liekanos eL30 ribosomų baltymuose, įvertinome šių liekanų išsaugojimą 4396 tipiniuose eukariotuose.Kaip ir aukščiau uL15 atveju, mes nustatėme, kad Phe170 ir Lys172 liekanos yra labai konservuotos tik tipiškuose Microsporidia, tačiau jų nėra kituose eukariotuose, įskaitant netipinius Microsporidia Mitosporidium ir Amphiamblys, kuriuose ES39L rRNR fragmentas nėra sumažintas (4F5,454c).-e).
Apibendrinant, šie duomenys patvirtina idėją, kad E. cuniculi ir galbūt kitos kanoninės mikrosporidijos išvystė gebėjimą efektyviai užfiksuoti daug mažų metabolitų ribosomų struktūroje, kad kompensuotų rRNR ir baltymų kiekio sumažėjimą.Tai darydami jie sukūrė unikalų gebėjimą surišti nukleotidus už ribosomos ribų, parodydami, kad parazitinės molekulinės struktūros kompensuoja gaudamos gausius mažus metabolitus ir naudodamos juos kaip suardytų RNR ir baltymų fragmentų struktūrines imitacijas..
Trečioji nesumodeliuota mūsų krio-EM žemėlapio dalis, randama dideliame ribosomų subvienete.Santykinai didelė mūsų žemėlapio skiriamoji geba (2,6 Å) rodo, kad šis tankis priklauso baltymams su unikaliais didelių šoninių grandinių liekanų deriniais, o tai leido mums nustatyti šį tankį kaip anksčiau nežinomą ribosomų baltymą, kurį identifikavome kaip Jis buvo pavadintas msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metodai, 6 pav.).Mūsų homologijos paieška parodė, kad msL2 yra išsaugotas Encephaliter ir Orosporidium genties Microsporidia klade, bet nėra kitose rūšyse, įskaitant kitas Microsporidia.Ribosomų struktūroje msL2 užima tarpą, susidarantį praradus išplėstą ES31L rRNR.Šioje tuštumoje msL2 padeda stabilizuoti rRNR sulankstymą ir gali kompensuoti ES31L praradimą (6 pav.).
a E. cuniculi ribosomose aptikto Microsporidia specifinio ribosominio baltymo msL2 elektronų tankis ir modelis.b Daugumoje eukariotinių ribosomų, įskaitant Saccharomyces cerevisiae 80S ribosomą, ES19L rRNR amplifikacija prarandama daugumoje Microsporidian rūšių.Anksčiau nustatyta V. necatrix microsporidia ribosomos struktūra rodo, kad ES19L praradimą šiuose parazituose kompensuoja naujo msL1 ribosominio baltymo evoliucija.Šiame tyrime mes nustatėme, kad E. cuniculi ribosoma taip pat sukūrė papildomą ribosomų RNR imitacinį baltymą, kaip akivaizdžią kompensaciją už ES19L praradimą.Tačiau msL2 (šiuo metu anotuojamas kaip hipotetinis ECU06_1135 baltymas) ir msL1 turi skirtingą struktūrinę ir evoliucinę kilmę.c Šis evoliuciškai nesusijusių msL1 ir msL2 ribosomų baltymų generavimo atradimas rodo, kad jei ribosomos sukaupia žalingų mutacijų savo rRNR, jos gali pasiekti precedento neturintį kompozicinės įvairovės lygį net mažame glaudžiai susijusių rūšių pogrupyje.Šis atradimas galėtų padėti išsiaiškinti mitochondrijų ribosomos kilmę ir evoliuciją, kuri yra žinoma dėl labai sumažėjusio rRNR ir nenormalaus baltymų sudėties kintamumo įvairiose rūšyse.
Tada palyginome msL2 baltymą su anksčiau aprašytu msL1 baltymu, vieninteliu žinomu mikrosporidijų specifiniu ribosomų baltymu, randamu V. necatrix ribosomoje.Norėjome patikrinti, ar msL1 ir msL2 yra evoliuciškai susiję.Mūsų analizė parodė, kad msL1 ir msL2 ribosomų struktūroje užima tą pačią ertmę, tačiau turi skirtingas pirmines ir tretines struktūras, o tai rodo jų nepriklausomą evoliucinę kilmę (6 pav.).Taigi, mūsų atradimas msL2 suteikia įrodymų, kad kompaktiškų eukariotų rūšių grupės gali savarankiškai išsivystyti struktūriškai skirtingus ribosomų baltymus, kad kompensuotų rRNR fragmentų praradimą.Šis atradimas pastebimas tuo, kad daugumoje citoplazminių eukariotų ribosomų yra nekintamas baltymas, įskaitant tą pačią 81 ribosominio baltymo šeimą.MsL1 ir msL2 atsiradimas įvairiuose mikrosporidijų kladuose, reaguojant į išplėstų rRNR segmentų praradimą, rodo, kad parazito molekulinės architektūros degradacija verčia parazitus ieškoti kompensuojamųjų mutacijų, kurios galiausiai gali lemti jų įgijimą skirtingose ​​parazitų populiacijose.struktūros.
Galiausiai, kai mūsų modelis buvo baigtas, palyginome E. cuniculi ribosomos sudėtį su ta, kuri buvo prognozuojama pagal genomo seką.Anksčiau buvo manoma, kad kelių ribosomų baltymų, įskaitant eL14, eL38, eL41 ir eS30, trūksta E. cuniculi genome, nes akivaizdžiai nėra jų homologų E. cuniculi genome.Daugelio ribosomų baltymų praradimas taip pat numatomas daugumoje kitų labai sumažintų tarpląstelinių parazitų ir endosimbiontų.Pavyzdžiui, nors daugumoje laisvai gyvenančių bakterijų yra ta pati 54 ribosomų baltymų šeima, tik 11 iš šių baltymų šeimų turi aptinkamus homologus kiekviename analizuojamame šeimininko apribotų bakterijų genome.Siekiant paremti šią mintį, eksperimentiškai buvo pastebėtas ribosomų baltymų praradimas V. necatrix ir P. locustae microsporidia, kuriems trūksta eL38 ir eL4131,32 baltymų.
Tačiau mūsų struktūros rodo, kad tik eL38, eL41 ir eS30 iš tikrųjų yra prarasti E. cuniculi ribosomoje.eL14 baltymas buvo konservuotas ir mūsų struktūra parodė, kodėl šio baltymo nepavyko rasti homologijos paieškoje (7 pav.).E. cuniculi ribosomose didžioji dalis eL14 surišimo vietos prarandama dėl rRNR amplifikuoto ES39L degradacijos.Nesant ES39L, eL14 prarado didžiąją dalį antrinės struktūros ir tik 18 % eL14 sekos buvo identiška E. cuniculi ir S. cerevisiae.Šis prastas sekos išsaugojimas yra nuostabus, nes net Saccharomyces cerevisiae ir Homo sapiens - organizmai, kurie išsivystė 1,5 milijardo metų atstumu - turi daugiau nei 51% tų pačių likučių eL14.Šis nenormalus išsaugojimo praradimas paaiškina, kodėl E. cuniculi eL14 šiuo metu yra anotuojamas kaip galimas M970_061160 baltymas, o ne kaip eL1427 ribosominis baltymas.
ir Microsporidia ribosoma prarado ES39L rRNR plėtinį, kuris iš dalies pašalino eL14 ribosomų baltymų surišimo vietą.Nesant ES39L, eL14 mikrosporos baltymas praranda antrinę struktūrą, kurioje buvusi rRNR surišanti α-spiralė išsigimsta į minimalaus ilgio kilpą.b Kelių sekų derinimas rodo, kad eL14 baltymas yra labai konservuotas eukariotinėse rūšyse (57% mielių ir žmogaus homologų sekos tapatumas), bet prastai konservuotas ir skiriasi mikrosporidijose (kuriame ne daugiau kaip 24% liekanų yra identiškos eL14 homologui).iš S. cerevisiae arba H. sapiens).Šis prastas sekos išsaugojimas ir antrinės struktūros kintamumas paaiškina, kodėl eL14 homologas niekada nebuvo rastas E. cuniculi ir kodėl manoma, kad šis baltymas buvo prarastas E. cuniculi.Priešingai, E. cuniculi eL14 anksčiau buvo anotuotas kaip galimas M970_061160 baltymas.Šis stebėjimas rodo, kad šiuo metu mikrosporidijų genomo įvairovė yra pervertinta: kai kurie genai, šiuo metu manoma, kad jie yra prarasti mikrosporidijose, iš tikrųjų yra išsaugoti, nors ir labai diferencijuotomis formomis;Vietoj to, manoma, kad kai kurie koduoja kirmėlių specifinių baltymų mikrosporidijų genus (pvz., hipotetinis baltymas M970_061160) iš tikrųjų koduoja labai įvairius baltymus, esančius kituose eukariotuose.
Šis atradimas rodo, kad rRNR denatūracija gali sukelti dramatišką gretimų ribosomų baltymų sekos išsaugojimo praradimą, todėl šie baltymai gali būti neaptinkami homologijos paieškoms.Taigi galime pervertinti tikrąjį molekulinio skilimo laipsnį mažuose genomo organizmuose, nes kai kurie baltymai, kurie, kaip manoma, buvo prarasti, iš tikrųjų išlieka, nors ir labai pakitusiomis formomis.
Kaip parazitai gali išlaikyti savo molekulinių mašinų funkciją ekstremalaus genomo mažinimo sąlygomis?Mūsų tyrimas atsako į šį klausimą aprašydamas sudėtingą E. cuniculi – organizmo, turinčio vieną iš mažiausių eukariotų genomų – ​​molekulinę struktūrą (ribosomą).
Jau beveik du dešimtmečius žinoma, kad mikroorganizmų parazitų baltymų ir RNR molekulės dažnai skiriasi nuo savo homologinių molekulių laisvai gyvenančiose rūšyse, nes joms trūksta kokybės kontrolės centrų, laisvai gyvenančiuose mikrobuose yra sumažintos iki 50% savo dydžio ir kt.daug sekinančių mutacijų, kurios pažeidžia lankstymą ir funkciją.Pavyzdžiui, mažų genomo organizmų ribosomose, įskaitant daugybę viduląstelinių parazitų ir endosimbiontų, trūks kelių ribosomų baltymų ir iki trečdalio rRNR nukleotidų, palyginti su laisvai gyvenančiomis 27, 29, 30, 49 rūšimis. Tačiau šių molekulių veikimo būdas daugiausia ištirtas per parazitus.
Mūsų tyrimas rodo, kad makromolekulių struktūra gali atskleisti daugybę evoliucijos aspektų, kuriuos sunku išskirti iš tradicinių lyginamųjų viduląstelinių parazitų ir kitų organizmų, kurių šeimininkas yra apribotas, genominių tyrimų (papildomas 7 pav.).Pavyzdžiui, eL14 baltymo pavyzdys rodo, kad galime pervertinti tikrąjį parazitinių rūšių molekulinio aparato degradacijos laipsnį.Dabar manoma, kad encefalitiniai parazitai turi šimtus mikrosporidijų specifinių genų.Tačiau mūsų rezultatai rodo, kad kai kurie iš šių iš pažiūros specifinių genų iš tikrųjų yra tik labai skirtingi genų variantai, paplitę kituose eukariotuose.Be to, msL2 baltymo pavyzdys rodo, kaip mes nepastebime naujų ribosomų baltymų ir nepakankamai įvertiname parazitinių molekulinių mašinų kiekį.Mažų molekulių pavyzdys rodo, kaip galime nepastebėti genialiausių parazitinių molekulinių struktūrų naujovių, kurios gali suteikti joms naują biologinį aktyvumą.
Apibendrinant, šie rezultatai pagerina mūsų supratimą apie šeimininkų apribotų organizmų ir jų atitikmenų laisvai gyvuose organizmuose molekulinių struktūrų skirtumus.Mes parodome, kad molekulinės mašinos, ilgai manytos, kad jos yra sumažintos, išsigimusios ir patiriamos įvairios silpninančios mutacijos, turi sistemingai nepastebėtų neįprastų struktūrinių ypatybių.
Kita vertus, netūriniai rRNR fragmentai ir susilieti fragmentai, kuriuos radome E. cuniculi ribosomose, rodo, kad genomo redukcija gali pakeisti net tas pagrindinio molekulinio mechanizmo dalis, kurios yra išsaugotos trijose gyvybės srityse – po beveik 3,5 mlrd.nepriklausoma rūšių evoliucija.
Atsižvelgiant į ankstesnius endosimbiotinių bakterijų RNR molekulių tyrimus, E. cuniculi ribosomose esantys rRNR fragmentai be iškilimų yra ypač svarbūs.Pavyzdžiui, įrodyta, kad amarų endosimbionte Buchnera aphidicola rRNR ir tRNR molekulės turi temperatūrai jautrias struktūras dėl A + T sudėties paklaidos ir didelės nekanoninių bazių porų dalies 20, 50.Manoma, kad šie RNR pokyčiai, kaip ir baltymų molekulių pokyčiai, dabar yra atsakingi už per didelę endosimbiontų priklausomybę nuo partnerių ir endosimbiontų nesugebėjimą perduoti šilumos 21, 23 .Nors parazitinės mikrosporidijos rRNR turi struktūriškai skirtingus pokyčius, šių pokyčių pobūdis rodo, kad sumažėjęs terminis stabilumas ir didesnė priklausomybė nuo chaperono baltymų gali būti bendri RNR molekulių bruožai organizmuose, kurių genomai yra sumažėję.
Kita vertus, mūsų struktūros rodo, kad parazitinės mikrosporidijos išvystė unikalų gebėjimą atsispirti plačiai konservuotiems rRNR ir baltymų fragmentams, išvystydamos galimybę naudoti gausius ir lengvai prieinamus mažus metabolitus kaip degeneruotų rRNR ir baltymų fragmentų struktūrines imitacijas.Molekulinės struktūros degradacija..Šią nuomonę patvirtina faktas, kad mažos molekulės, kompensuojančios baltymų fragmentų praradimą rRNR ir E. cuniculi ribosomose, jungiasi prie mikrosporidijų specifinių liekanų uL15 ir eL30 baltymuose.Tai rodo, kad mažų molekulių prisijungimas prie ribosomų gali būti teigiamos atrankos produktas, kai Microsporidia specifinės ribosomų baltymų mutacijos buvo atrinktos dėl jų gebėjimo padidinti ribosomų afinitetą mažoms molekulėms, o tai gali paskatinti efektyvesnius ribosominius organizmus.Šis atradimas atskleidžia protingą mikrobinių parazitų molekulinės struktūros naujovę ir leidžia geriau suprasti, kaip parazitų molekulinės struktūros išlaiko savo funkciją nepaisant redukcinės evoliucijos.
Šiuo metu šių mažų molekulių identifikavimas lieka neaiškus.Neaišku, kodėl skiriasi šių mažų molekulių išvaizda ribosomų struktūroje tarp mikrosporidijų rūšių.Visų pirma, neaišku, kodėl nukleotidų surišimas stebimas E. cuniculi ir P. locustae ribosomose, o ne V. necatrix ribosomose, nepaisant F170 liekanos V. necatrix eL20 ir K172 baltymuose.Šią deleciją gali sukelti 43 uL6 liekana (esanti šalia nukleotidų surišimo kišenės), kuri yra tirozinas V. necatrix, o ne treoninas E. cuniculi ir P. locustae.Didelė Tyr43 aromatinė šoninė grandinė gali trukdyti nukleotidų surišimui dėl sterinio sutapimo.Arba akivaizdi nukleotidų delecija gali būti dėl mažos krio-EM vaizdavimo skiriamosios gebos, kuri trukdo modeliuoti V. necatrix ribosomų fragmentus.
Kita vertus, mūsų darbas rodo, kad genomo skilimo procesas gali būti išradimo jėga.Visų pirma, E. cuniculi ribosomos struktūra rodo, kad rRNR ir baltymų fragmentų praradimas mikrosporidijų ribosomoje sukuria evoliucinį slėgį, kuris skatina ribosomų struktūros pokyčius.Šie variantai atsiranda toli nuo aktyviosios ribosomos vietos ir, atrodo, padeda palaikyti (arba atkurti) optimalų ribosomų rinkinį, kuris kitu atveju būtų sutrikdytas sumažinus rRNR.Tai rodo, kad pagrindinė mikrosporidijų ribosomos naujovė tapo poreikiu apsaugoti nuo genų dreifo.
Galbūt tai geriausiai iliustruoja nukleotidų surišimas, kuris iki šiol nebuvo pastebėtas kituose organizmuose.Faktas, kad nukleotidus surišančios liekanos yra tipiškose mikrosporidijose, bet ne kituose eukariotuose, rodo, kad nukleotidų surišimo vietos nėra tik reliktai, laukiantys išnykimo, arba galutinė rRNR vieta, kuri turi būti atkurta į atskirų nukleotidų formą.Vietoj to, ši svetainė atrodo kaip naudinga funkcija, kuri galėjo išsivystyti per kelis teigiamos atrankos etapus.Nukleotidų surišimo vietos gali būti natūralios atrankos šalutinis produktas: kai ES39L yra suskaidytas, mikrosporidijos yra priverstos ieškoti kompensacijos, kad atkurtų optimalią ribosomų biogenezę, jei ES39L nėra.Kadangi šis nukleotidas gali imituoti ES39L esančio A3186 nukleotido molekulinius kontaktus, nukleotido molekulė tampa ribosomos statybiniu bloku, kurio surišimas dar labiau pagerinamas mutavus eL30 sekai.
Kalbant apie tarpląstelinių parazitų molekulinę evoliuciją, mūsų tyrimas rodo, kad Darvino natūralios atrankos ir genetinio genomo irimo dreifo jėgos neveikia lygiagrečiai, o svyruoja.Pirma, genetinis dreifas pašalina svarbias biomolekulių savybes, todėl labai reikalinga kompensacija.Tik tada, kai parazitai patenkins šį poreikį per Darvino natūralią atranką, jų makromolekulės turės galimybę išsiugdyti įspūdingiausius ir novatoriškiausius bruožus.Svarbu tai, kad nukleotidų surišimo vietų evoliucija E. cuniculi ribosomoje rodo, kad šis molekulinės evoliucijos praradimo modelis ne tik amortizuoja žalingas mutacijas, bet kartais suteikia ir visiškai naujų funkcijų parazitinėms makromolekulėms.
Ši idėja atitinka Sewello Wrighto judančios pusiausvyros teoriją, teigiančią, kad griežta natūralios atrankos sistema riboja organizmų gebėjimą diegti naujoves51,52,53.Tačiau, jei genetinis dreifas sutrikdo natūralią atranką, šie dreifai gali sukelti pokyčius, kurie patys savaime nėra prisitaikantys (ar net žalingi), bet lems tolesnius pokyčius, kurie suteikia didesnį tinkamumą arba naują biologinį aktyvumą.Mūsų sistema palaiko šią idėją, parodydama, kad tos pačios rūšies mutacija, kuri sumažina biomolekulės raukšlę ir funkciją, yra pagrindinis jos tobulinimo veiksnys.Remiantis abipusiai naudingu evoliucijos modeliu, mūsų tyrimas rodo, kad genomo irimas, tradiciškai laikomas degeneraciniu procesu, taip pat yra pagrindinis inovacijų variklis, kartais ir galbūt net dažnai leidžiantis makromolekulėms įgyti naujų parazitinių veiklų.gali juos naudoti.