Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.
Vienu metu rodoma trijų skaidrių karuselė.Naudokite mygtukus Ankstesnis ir Kitas, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres, arba naudokite slankiklio mygtukus, esančius pabaigoje, norėdami pereiti per tris skaidres vienu metu.
Hematoencefalinis barjeras ir hematoencefalinis barjeras neleidžia bioterapinėms medžiagoms pasiekti savo taikinių centrinėje nervų sistemoje ir taip trukdo veiksmingai gydyti neurologines ligas.Norėdami atrasti naujus smegenų pernešėjus in vivo, įdiegėme T7 fago peptidų biblioteką ir nuosekliai rinkome kraują ir smegenų skystį (CSF), naudodami kanuliuotą sąmoningą didelį žiurkių baseino modelį.Po keturių atrankos raundų specifiniai fagų klonai buvo labai praturtinti CSF.Atskirų kandidatų peptidų tyrimas atskleidė daugiau nei 1000 kartų sodrinimą CSF.Peptidų sukelto patekimo į smegenis biologinis aktyvumas buvo patvirtintas 40% sumažinus amiloido-β kiekį smegenų skystyje, naudojant BACE1 peptido inhibitorių, susietą su nustatytu nauju tranzito peptidu.Šie rezultatai rodo, kad in vivo fagų atrankos metodais nustatyti peptidai gali būti naudingi nešikliai sisteminiam makromolekulių tiekimui į smegenis su terapiniu poveikiu.
Centrinės nervų sistemos (CNS) tikslinės terapijos tyrimai daugiausia buvo skirti optimizuotų vaistų ir agentų, pasižyminčių CNS nukreipimo savybėmis, nustatymui, o mažiau pastangų atrandant mechanizmus, skatinančius aktyvų vaistų tiekimą į smegenis.Tai pradeda keistis dabar, nes vaistų, ypač didelių molekulių, pristatymas yra neatsiejama šiuolaikinių neurologijos vaistų kūrimo dalis.Centrinės nervų sistemos aplinką gerai saugo smegenų kraujagyslių barjerinė sistema, kurią sudaro kraujo ir smegenų barjeras (BBB) ​​ir hematoencefalinis barjeras (BCBB)1, todėl sunku tiekti vaistus į smegenis1,2.Apskaičiuota, kad beveik visi didelės molekulės vaistai ir daugiau nei 98% mažų molekulių vaistų pašalinami iš smegenų3.Štai kodėl labai svarbu nustatyti naujas smegenų transporto sistemas, kurios užtikrintų efektyvų ir specifinį gydomųjų vaistų tiekimą į CNS 4,5.Tačiau BBB ir BCSFB taip pat suteikia puikią galimybę tiekti vaistus, nes jie prasiskverbia ir patenka į visas smegenų struktūras per platų kraujagyslių sistemą.Taigi dabartinės pastangos naudoti neinvazinius pristatymo į smegenis metodus daugiausia yra pagrįstos receptorių sukelto transportavimo (PMT) mechanizmu, naudojant endogeninį BBB6 receptorių.Nepaisant pastarojo meto svarbiausių pasiekimų naudojant transferino receptorių kelią 7, 8, reikia toliau kurti naujas tiekimo sistemas su patobulintomis savybėmis.Šiuo tikslu mūsų tikslas buvo nustatyti peptidus, galinčius tarpininkauti CSF transportavimui, nes jie iš esmės galėtų būti naudojami makromolekulėms pristatyti į CNS arba atverti naujus receptorių kelius.Konkrečiai, specifiniai smegenų kraujagyslių sistemos receptoriai ir transporteriai (BBB ir BSCFB) gali būti potencialūs aktyvaus ir specifinio bioterapinių vaistų tiekimo taikiniai.Cerebrospinalinis skystis (CSF) yra choroidinio rezginio (CS) sekrecijos produktas ir per subarachnoidinę erdvę ir skilvelių erdvę tiesiogiai liečiasi su smegenų intersticiniu skysčiu4.Neseniai buvo įrodyta, kad subarachnoidinis cerebrospinalinis skystis per daug difunduoja į smegenų intersticumą9.Tikimės pasiekti parenchiminę erdvę naudodami šį subarachnoidinį įtekėjimo traktą arba tiesiai per BBB.Norėdami tai pasiekti, įgyvendinome tvirtą in vivo fagų atrankos strategiją, kuri idealiai identifikuoja peptidus, transportuojamus vienu iš šių dviejų skirtingų būdų.
Dabar aprašome nuoseklų in vivo fagų rodymo atrankos metodą su CSF mėginių ėmimu kartu su didelio pralaidumo sekos nustatymu (HTS), kad būtų galima stebėti pradinius atrankos raundus su didžiausia bibliotekos įvairove.Atranka buvo atlikta sąmoningoms žiurkėms su visam laikui implantuota didelės cisternos (CM) kaniule, kad būtų išvengta kraujo užkrėtimo.Svarbu tai, kad šis metodas parenka ir nukreipimą į smegenis, ir peptidus, turinčius transportavimo aktyvumą per smegenų kraujagyslių barjerą.Mes naudojome T7 fagus dėl jų mažo dydžio (~ 60 nm)10 ir pasiūlėme, kad jie būtų tinkami pūslelių transportavimui, kurie leidžia transląsteliniu būdu kirsti endotelio ir (arba) epitelio-medulla barjerą.Po keturių apžvalgos raundų fagų populiacijos buvo išskirtos, rodančios stiprų CSF sodrinimą in vivo ir smegenų mikrokraujagyslių asociaciją.Svarbu tai, kad mes galėjome patvirtinti savo išvadas parodydami, kad pageidaujami ir chemiškai susintetinti geriausi kandidatai peptidai gali transportuoti baltymų krovinį į smegenų skystį.Pirma, CNS farmakodinaminis poveikis buvo nustatytas sujungiant pagrindinį tranzito peptidą su BACE1 peptido inhibitoriumi.Be to, kad būtų parodyta, kad in vivo funkcinės atrankos strategijos gali nustatyti naujus smegenų transportavimo peptidus kaip veiksmingus baltymų krovinių nešiklius, tikimės, kad panašūs funkcinės atrankos metodai taip pat taps svarbūs nustatant naujus smegenų transportavimo kelius.
Remiantis apnašas formuojančiais vienetais (PFU), po fago pakavimo etapo buvo sukurta ir sukurta atsitiktinių 12-merų linijinių T7 fagų peptidų biblioteka, kurios įvairovė yra maždaug 109 (žr. Medžiagos ir metodai).Svarbu pažymėti, kad mes atidžiai išanalizavome šią biblioteką prieš in vivo panoramavimą.Fagų bibliotekos mėginių PGR amplifikacija naudojant modifikuotus pradmenis sukūrė amplikonus, kurie buvo tiesiogiai taikomi HTS (papildomas 1a pav.).Dėl a) HTS11 sekos nustatymo klaidų, b) įtakos pradmenų (NNK) 1-12 kokybei ir c) laukinio tipo (wt) fagų (skeleto intarpų) buvimo budėjimo bibliotekoje, buvo įdiegta sekos filtravimo procedūra, siekiant išgauti tik patikrintą sekos informaciją (papildomas 1b pav.).Šie filtro veiksmai taikomi visoms HTS sekos bibliotekoms.Standartinėje bibliotekoje iš viso buvo gauti 233 868 skaitymai, iš kurių 39% atitiko filtro kriterijus ir buvo naudojami bibliotekos analizei bei atrankai tolesniems etapams (papildomas 1c – e paveikslas).Skaitymai daugiausia buvo 3 bazinių porų ilgio kartotiniai, kurių smailė buvo ties 36 nukleotidais (papildomas 1c pav.), patvirtinantis bibliotekos dizainą (NNK) 1–12.Pažymėtina, kad maždaug 11% bibliotekos narių turėjo 12 dimensijų laukinio tipo (wt) pagrindo PAGISRELVDKL intarpą, o beveik pusėje sekų (49%) buvo įterpimų arba ištrynimų.Bibliotekos bibliotekos HTS patvirtino didelę bibliotekoje esančių peptidų įvairovę: daugiau nei 81% peptidų sekų buvo rasta tik vieną kartą ir tik 1,5% buvo ≥4 kopijose (papildomas 2a pav.).Aminorūgščių (aa) dažniai visose 12 pozicijų repertuare gerai koreliavo su dažniais, kurių tikimasi pagal išsigimusio NKK repertuaro generuojamų kodonų skaičių (papildomas 2b pav.).Stebėtas šių įdėklų užkoduotų aa likučių dažnis gerai koreliavo su apskaičiuotu dažniu (r = 0,893) (papildomas 2c pav.).Fagų bibliotekų paruošimas injekcijoms apima endotoksino amplifikacijos ir pašalinimo etapus.Anksčiau buvo įrodyta, kad tai gali sumažinti fagų bibliotekų įvairovę 12, 13 .Todėl mes suskirstėme plokštelėmis amplifikuotą fagų biblioteką, iš kurios buvo pašalintas endotoksinas, ir palyginome ją su pradine biblioteka, kad įvertintume AA dažnį.Buvo pastebėta stipri koreliacija (r = 0,995) tarp pradinio telkinio ir amplifikuoto bei išgryninto telkinio (papildomas 2d pav.), rodantis, kad konkurencija tarp klonų, amplifikuotų plokštelėse naudojant T7 fagą, nesukėlė didelio šališkumo.Šis palyginimas pagrįstas tripeptidų motyvų dažnumu kiekvienoje bibliotekoje, nes bibliotekų įvairovė (~ 109) negali būti visiškai užfiksuota net naudojant HTS.Aa dažnio analizė kiekvienoje padėtyje atskleidė nedidelį nuo padėties priklausomą šališkumą paskutinėse trijose įvesto repertuaro pozicijose (papildomas 2e pav.).Apibendrinant padarėme išvadą, kad bibliotekos kokybė ir įvairovė buvo priimtina ir buvo pastebėti tik nedideli įvairovės pokyčiai dėl fagų bibliotekų amplifikacijos ir paruošimo tarp kelių atrankos etapų.
Serijinis smegenų skysčio mėginių ėmimas gali būti atliekamas chirurginiu būdu implantuojant kaniulę į sąmoningų žiurkių CM, kad būtų lengviau identifikuoti T7 fagą, suleistą į veną (iv) per BBB ir (arba) BCSFB (1a-b pav.).Pirmuosiuose trijuose in vivo atrankos etapuose naudojome dvi nepriklausomas atrankos grupes (rankas A ir B) (1c pav.).Palaipsniui padidinome atrankos griežtumą, sumažindami bendrą fagų kiekį, įvestą per pirmuosius tris atrankos turus.Ketvirtajam slinkimo etapui sujungėme A ir B šakų pavyzdžius ir atlikome tris papildomas nepriklausomas atrankas.Norint ištirti šio modelio T7 fago dalelių savybes in vivo, žiurkėms per uodegos veną buvo sušvirkštas laukinio tipo fagas (PAGISRELVDKL pagrindinis įdėklas).Fagų atsigavimas iš smegenų skysčio ir kraujo skirtingais laiko momentais parodė, kad santykinai maži T7 ikosaedriniai fagai turėjo greitą pradinę klirenso fazę iš kraujo skyriaus (papildomas 3 pav.).Remdamiesi titrais ir žiurkių kraujo tūriu, apskaičiavome, kad tik maždaug 1 % masės.Fagas nuo suleistos dozės kraujyje buvo aptiktas praėjus 10 minučių po injekcijos į veną.Po šio pradinio spartaus sumažėjimo buvo matuojamas lėtesnis pirminis klirensas, kurio pusinės eliminacijos laikas buvo 27,7 minutės.Svarbu tai, kad iš CSF skyriaus buvo paimti tik labai nedaug fagų, o tai rodo žemą laukinio tipo fagų migracijos į CSF skyrių foną (papildomas 3 pav.).Smegenų skystyje per visą mėginių ėmimo laikotarpį (0-250 min.) vidutiniškai buvo aptikta tik apie 1 x 10-3 % T7 fago titrų kraujyje ir 4 x 10-8 % iš pradžių infuzuotų fagų.Pažymėtina, kad laukinio tipo fago pusinės eliminacijos laikas (25,7 min.) smegenų skystyje buvo panašus į stebimą kraujyje.Šie duomenys rodo, kad barjeras, skiriantis CSF skyrių nuo kraujo, yra nepažeistas žiurkėms su CM kaniuliu, todėl in vivo galima atrinkti fagų bibliotekas, kad būtų galima identifikuoti klonus, kurie lengvai transportuojami iš kraujo į CSF skyrių.
a) Smegenų skysčio (CSF) pakartotinio mėginių ėmimo iš didelio telkinio metodo nustatymas.(b) Diagrama, rodanti centrinės nervų sistemos (CNS) barjero vietą ląstelėse ir atrankos strategiją, naudojamą peptidams, kurie kerta kraujo ir smegenų barjerą (BBB) ​​ir kraujo ir smegenų barjerą, nustatyti.c) In vivo fagų ekrano atrankos schema.Kiekviename atrankos etape fagai (gyvūnų identifikatoriai rodyklėse) buvo švirkščiami į veną.Dvi nepriklausomos alternatyvios šakos (A, B) laikomos atskirai iki 4 atrankos turo.3 ir 4 atrankos etapuose kiekvienas fago klonas, ekstrahuotas iš CSF, buvo sekvenuotas rankiniu būdu.(d) Fago, išskirto iš kraujo (raudoni apskritimai) ir smegenų skysčio (žali trikampiai), kinetika per pirmąjį atrankos etapą dviejose žiurkėse su kaniuliuotais po T7 peptidų bibliotekos intraveninės injekcijos (2 x 1012 fagų vienam gyvūnui).Mėlyni kvadratai rodo vidutinę pradinę fago koncentraciją kraujyje, skaičiuojamą pagal suleisto fago kiekį, atsižvelgiant į bendrą kraujo tūrį.Juodi kvadratai rodo y linijos susikirtimo tašką, ekstrapoliuotą iš kraujo fagų koncentracijos.(e, f) Pateikite santykinį visų galimų persidengiančių tripeptido motyvų, rastų peptide, dažnį ir pasiskirstymą.Rodomas 1000 skaitymų rastų motyvų skaičius.Ženkliai (p < 0,001) praturtinti motyvai pažymėti raudonais taškais.(e) Koreliacijos sklaidos diagrama, lyginant sušvirkštos bibliotekos tripeptido motyvo santykinį dažnį su fagu, gautu iš kraujo iš gyvūnų Nr. 1.1 ir Nr. 1.2.(f) Koreliacinė sklaidos diagrama, lyginanti gyvūnų fago tripeptido motyvų #1.1 ir #1.2, išskirtų kraujyje ir smegenų skystyje, santykinius dažnius.(g, h) Fago, praturtinto krauju (g), sekos ID atvaizdavimas, palyginti su sušvirkštomis bibliotekomis ir fagais, praturtintais CSF (h), palyginti su krauju po abiejų gyvūnų atrankos in vivo.Vienos raidės kodo dydis rodo, kaip dažnai ta aminorūgštis atsiranda toje padėtyje.Žalia = polinė, violetinė = neutrali, mėlyna = bazinė, raudona = rūgštinė ir juoda = hidrofobinės aminorūgštys.1a, b paveikslus sukūrė ir pagamino Eduardas Urichas.
Fago peptidų biblioteką suleidome į dvi CM instrumentų žiurkes (A ir B kladus) ir išskyrėme fagą iš smegenų skysčio ir kraujo (1d pav.).Pradinis greitas bibliotekos klirensas buvo mažiau ryškus, palyginti su laukinio tipo fagu.Sušvirkštos bibliotekos vidutinis pusinės eliminacijos laikas abiem gyvūnams buvo 24,8 minutės kraujyje, panašiai kaip laukinio tipo fago, ir 38,5 minutės likvore.Kiekvieno gyvūno kraujo ir smegenų skysčio fagų mėginiai buvo tiriami HTS ir visi nustatyti peptidai buvo išanalizuoti, ar nėra trumpo tripeptido motyvo.Tripeptidiniai motyvai buvo pasirinkti, nes jie suteikia minimalų pagrindą struktūros formavimui ir peptidų ir baltymų sąveikai 14, 15.Mes nustatėme gerą koreliaciją tarp suleistos fagų bibliotekos ir klonų, išskirtų iš abiejų gyvūnų kraujo, motyvų pasiskirstymo (1e pav.).Duomenys rodo, kad bibliotekos sudėtis tik šiek tiek praturtinta kraujo skyriuje.Aminorūgščių dažniai ir konsensuso sekos buvo toliau analizuojami kiekvienoje padėtyje, naudojant Weblogo16 programinės įrangos pritaikymą.Įdomu tai, kad mes nustatėme stiprų glicino likučių praturtėjimą kraujyje (1g pav.).Kai kraujas buvo lyginamas su klonais, atrinktais iš CSF, buvo pastebėta stipri atranka ir tam tikras motyvų atrankos panaikinimas (1f pav.), o tam tikros aminorūgštys pirmiausia buvo iš anksto nustatytose 12 narių vietose (1h pav.).Pažymėtina, kad atskiri gyvūnai labai skyrėsi smegenų skystyje, o abiejų gyvūnų kraujyje buvo pastebėtas glicino praturtėjimas (papildomas 4a–j pav.).Griežtai filtravus sekos duomenis gyvūnų #1.1 ir #1.2 smegenų skystyje, iš viso buvo gauti 964 ir 420 unikalių 12-merų peptidų (papildomas 1d – e pav.).Išskirti fagų klonai buvo amplifikuoti ir atlikti antrąjį in vivo atrankos ratą.Fagai, išgauti iš antrojo atrankos etapo, buvo paveikti HTS kiekviename gyvūne ir visi nustatyti peptidai buvo naudojami kaip motyvų atpažinimo programos įvestis, siekiant analizuoti tripeptidų motyvų atsiradimą (2a, b, ef pav.).Palyginti su pirmuoju fago, išgauto iš CSF, ciklu, A ir B šakose stebėjome tolesnę daugelio CSF ​​motyvų atranką ir atranką (2 pav.).Buvo pritaikytas tinklo identifikavimo algoritmas, siekiant nustatyti, ar jie atspindi skirtingus nuoseklios sekos modelius.Buvo pastebėtas aiškus panašumas tarp 12 dimensijų sekų, kurias CSF atgavo alternatyviame A klade (2c, d pav.) ir B klade (2g pav., h).Bendra kiekvienos šakos analizė atskleidė skirtingus 12-merų peptidų atrankos profilius (papildomas 5c, d pav.) ir CSF/kraujo titro santykio padidėjimą laikui bėgant sujungtiems klonams po antrojo atrankos etapo, palyginti su pirmuoju atrankos ratu (papildomas 5e pav.).).
Smegenų skysčio motyvų ir peptidų praturtinimas dviem nuosekliais funkcinio fago rodymo atrankos etapais in vivo.
Visi cerebrospinalinio skysčio fagai, gauti iš kiekvieno gyvūno pirmojo etapo (gyvūnai Nr. 1.1 ir Nr. 1.2), buvo sujungti, amplifikuoti, HT sekvenuoti ir pakartotinai sušvirkšti kartu (2 x 1010 fagų vienam gyvūnui) 2 SM kaniuliuotoms žiurkėms (#1.1 → #).2.1 ir 2.2, 1.2 → 2.3 ir 2.4).(a, b, e, f) Koreliacinės sklaidos diagramos, lyginančios santykinį visų iš CSF gautų fagų tripeptidinių motyvų dažnį pirmame ir antrame atrankos ture.Santykinis motyvų, reprezentuojančių visus galimus persidengiančius tripeptidus, randamus peptiduose abiejose orientacijose, dažnis ir pasiskirstymas.Rodomas 1000 skaitymų rastų motyvų skaičius.Motyvai, kurie buvo reikšmingai (p < 0,001) pasirinkti arba neįtraukti vienoje iš lyginamų bibliotekų, pažymėti raudonais taškais.(c, d, g, h) Visų CSF turtingų 12 aminorūgščių ilgų sekų sekos logotipas, pagrįstas 2 ir 1 in vivo atrankos raundais.Vienos raidės kodo dydis rodo, kaip dažnai ta aminorūgštis atsiranda toje padėtyje.Kad būtų pavaizduotas logotipas, palyginamas CSF sekų, išskirtų iš atskirų gyvūnų tarp dviejų atrankos etapų, dažnis ir rodomos praturtintos antrojo turo sekos: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ir (h) #1.2–#2.4.Labiausiai praturtintos aminorūgštys tam tikroje (c, d) gyvūnų padėtyje Nr.2.1 ir Nr.2.2 arba (g, h) gyvūnams Nr.2.3 ir Nr.2.4 rodomi spalvotai.Žalia = polinė, violetinė = neutrali, mėlyna = bazinė, raudona = rūgštinė ir juoda = hidrofobinės aminorūgštys.
Po trečiojo atrankos etapo mes nustatėme 124 unikalias peptidų sekas (#3.1 ir #3.2) iš 332 CSF atkurtų fagų klonų, išskirtų iš dviejų gyvūnų (papildomas 6a pav.).Didžiausia santykinė dalis buvo LGSVS seka (18,7 %), po to seka laukinio tipo intarpai PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) ir SARGSWREIVSLS (2,2 %).Paskutiniame ketvirtajame ture sujungėme dvi nepriklausomai atrinktas šakas iš trijų atskirų gyvūnų (1c pav.).Iš 925 sekvenuotų fagų klonų, išgautų iš CSF, ketvirtajame ture radome 64 unikalias peptidų sekas (papildomas 6b pav.), tarp kurių santykinė laukinio tipo fagų dalis sumažėjo iki 0,8%.Dažniausi CSF klonai ketvirtajame ture buvo LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) ir RLSSVDSDLSGC (3, 6%).%)).Pasirinktų peptidų ilgio diapazonas atsiranda dėl nukleotidų įterpimų / ištrynimų arba priešlaikinių stop kodonų bibliotekos pradmenyse, kai NNK bibliotekos projektavimui naudojami išsigimę kodonai.Priešlaikiniai stop kodonai generuoja trumpesnius peptidus ir yra atrenkami, nes juose yra palankus aa motyvas.Ilgesni peptidai gali atsirasti dėl įterpimų / ištrynimų sintetinių bibliotekų pradmenyse.Taip sukurtas stop kodonas yra už kadro ir skaitomas tol, kol pasroviui atsiranda naujas stop kodonas.Apskritai, mes apskaičiavome praturtinimo koeficientus visiems keturiems atrankos etapams, lygindami įvesties duomenis su imties išvesties duomenimis.Pirmajame atrankos etape kaip nespecifinę fono nuorodą naudojome laukinio tipo fagų titrus.Įdomu tai, kad neigiama fagų atranka buvo labai stipri per pirmąjį CSF ciklą, bet ne kraujyje (3a pav.), o tai gali būti dėl mažos daugumos peptidų bibliotekos narių pasyvios difuzijos į CSF skyrių tikimybės arba santykiniai fagai yra veiksmingiau išlaikomi arba pašalinami iš kraujotakos nei bakteriofagai.Tačiau antrajame apžvalgos etape abiejuose kladuose buvo pastebėta stipri fagų atranka CSF, o tai rodo, kad ankstesnis etapas buvo praturtintas fagais, kuriuose buvo peptidų, skatinančių CSF įsisavinimą (3a pav.).Vėlgi, be reikšmingo kraujo sodrinimo.Taip pat trečiajame ir ketvirtajame raunde fagų klonai buvo žymiai praturtinti CSF.Palyginus santykinį kiekvienos unikalios peptidų sekos dažnį tarp paskutinių dviejų atrankos etapų, mes nustatėme, kad ketvirtajame atrankos etape sekos buvo dar labiau praturtintos (3b pav.).Iš visų 64 unikalių peptidų sekų, naudojant abi peptidų orientacijas, iš viso buvo išskirtas 931 tripeptido motyvas.Labiausiai praturtinti motyvai ketvirtajame ture buvo atidžiau ištirti dėl jų sodrinimo profilių visuose etapuose, palyginti su įšvirkšta biblioteka (riba: 10% sodrinimas) (papildomas 6c pav.).Bendrieji atrankos modeliai parodė, kad dauguma tirtų motyvų buvo praturtinti visuose ankstesniuose abiejų atrankos šakų etapuose.Tačiau kai kurie motyvai (pvz., SGL, VSG, LGS GSV) daugiausia buvo iš alternatyvaus klado A, o kiti (pvz., FGW, RTN, WGF, NTR) buvo praturtinti alternatyviame B klade.
CSF praturtintų fagais rodomų peptidų ir biotiniluotų lyderių peptidų, konjuguotų su streptavidino naudingosiomis apkrovomis, CSF pernešimo patvirtinimas.
a) Sodrinimo koeficientai, apskaičiuoti per visus keturis etapus (R1-R4), remiantis įšvirkštais (įvestis = I) fago (PFU) titrais ir nustatytais CSF fagų titrais (išvestis = O).Paskutinių trijų raundų sodrinimo koeficientai (R2-R4) buvo apskaičiuoti lyginant su ankstesniu raundu ir pirmuoju turu (R1) su svorio duomenimis.Atviros juostos yra smegenų skystis, užtamsintos juostos yra plazma.(***p<0,001, remiantis Stjudento t-testu).(b) Gausiausių fagų peptidų sąrašas, suskirstytas pagal jų santykinį santykį su visais fagais, surinktais CSF po 4 atrankos turo.Šeši dažniausiai pasitaikantys fagų klonai yra paryškinti spalva, sunumeruoti ir jų praturtinimo faktoriai tarp 3 ir 4 atrankos turų (įdėklai).( c, d ) Šeši labiausiai praturtinti fagų klonai, tuščios fagų ir tėvų fagų peptidų bibliotekos iš 4 turo buvo analizuojami atskirai CSF mėginių ėmimo modelyje.CSF ir kraujo mėginiai buvo paimti nurodytais laiko momentais.(c) Lygiai 6 fagų klonų kandidatų (2 x 1010 fagų/gyvūnų), tuščių fagų (nr. 1779) (2 x 1010 fagų/gyvūnų) ir pradinių fagų peptidų bibliotekų (2 x 1012 fagų/gyvūnų) kiekiai. Sušvirkškite bent 3 CM į atskirą gyvūno veną.Parodyta kiekvieno suleisto fago klono ir fago peptidų bibliotekos CSF farmakokinetika laikui bėgant.(d) rodo vidutinį visų išgautų fagų/ml CSF/kraujo santykį per mėginių ėmimo laiką.(e) Keturi sintetiniai lyderio peptidai ir viena sumaišyta kontrolė buvo susieti su biotinu su streptavidinu per jų N-galą (tetramero ekranas), po to buvo sušvirkšta (uodegos vena į veną, 10 mg streptavidino / kg).Mažiausiai trys intubuotos žiurkės (N = 3).).CSF mėginiai buvo paimti nurodytais laiko momentais, o streptavidino koncentracija buvo išmatuota CSF anti-streptavidino ELISA metodu (nd = neaptikta).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, remiantis ANOVA testu).(f) Labiausiai praturtinto fago peptido klono #2002 (violetinė) aminorūgščių sekos palyginimas su kitais atrinktais fago peptidų klonais iš 4-ojo atrankos etapo.Identiški ir panašūs aminorūgščių fragmentai žymimi spalvomis.
Iš visų praturtintų fagų ketvirtajame ture (3b pav.) buvo atrinkti šeši klonai kandidatai tolesnei individualiai analizei CSF mėginių ėmimo modelyje.Vienodai kiekiai šešių fagų kandidatų, tuščių fagų (be intarpo) ir profago peptidų bibliotekų buvo sušvirkšti į tris CM gyvūnus su kaniuliuotais CM gyvūnais, o farmakokinetika buvo nustatyta atliekant CSF (3c pav.) ir kraujo (papildomas 7 pav.) tyrimus.Visi tirti fagų klonai buvo nukreipti į CSF skyrių 10–1000 kartų aukštesniu nei tuščio kontrolinio fago (#1779) lygiu.Pavyzdžiui, klonų #2020 ir #2077 CSF titrai buvo maždaug 1000 kartų didesni nei kontrolinio fago.Kiekvieno pasirinkto peptido farmakokinetinis profilis yra skirtingas, tačiau visi jie turi didelį CSF gebėjimą.Stebėjome nuolatinį klonų #1903 ir #2011 sumažėjimą, o klonų #2077, #2002 ir #2009 padidėjimas per pirmąsias 10 minučių gali reikšti aktyvų transportavimą, tačiau jį reikia patikrinti.Klonai #2020, #2002 ir #2077 stabilizavosi esant dideliam lygiui, o klono #2009 CSF koncentracija lėtai mažėjo po pradinio padidėjimo.Tada palyginome santykinį kiekvieno CSF ​​kandidato dažnį su jo koncentracija kraujyje (3d pav.).Kiekvieno CSF ​​kandidato vidutinio titro koreliacija su jo kraujo titru visais mėginių ėmimo laikais parodė, kad trys iš šešių kandidatų buvo žymiai praturtinti kraujo CSF.Įdomu tai, kad klonas # 2077 parodė didesnį kraujo stabilumą (papildomas 7 paveikslas).Norėdami patvirtinti, kad patys peptidai gali aktyviai gabenti krovinius, išskyrus fago daleles, į CSF skyrių, mes susintetinome keturis pagrindinius peptidus, darytus su biotinu N-gale, kur peptidai prisijungia prie fago dalelės.Biotinilinti peptidai (nr. 2002, 2009, 2020 ir 2077) buvo konjuguoti su streptavidinu (SA), kad gautų multimerines formas, šiek tiek imituojančias fago geometriją.Šis formatas taip pat leido išmatuoti SA ekspoziciją kraujyje ir smegenų skystyje kaip krovinius gabenančius baltymų peptidus.Svarbu tai, kad fagų duomenys dažnai gali būti atkuriami, kai sintetiniai peptidai buvo įvedami šiuo SA konjuguotu formatu (3e pav.).Sumaišyti peptidai turėjo mažesnę pradinę ekspoziciją ir greitesnį CSF klirensą, o jų kiekis buvo nenustatomas per 48 valandas.Norėdami sužinoti apie šių peptidinių fagų klonų pristatymo kelius į CSF erdvę, išanalizavome atskirų fagų peptidų lokalizaciją naudodami imunohistochemiją (IHC), kad tiesiogiai aptiktume fago daleles praėjus 1 valandai po intraveninės injekcijos in vivo.Pažymėtina, kad klonus #2002, #2077 ir #2009 buvo galima aptikti stipriai dažant smegenų kapiliarus, o kontrolinis fagas (#1779) ir klonas #2020 nebuvo aptikti (papildomas 8 paveikslas).Tai rodo, kad šie peptidai prisideda prie poveikio smegenims būtent kirsdami BBB.Norint patikrinti šią hipotezę, reikalinga tolesnė išsami analizė, nes gali būti įtrauktas ir BSCFB maršrutas.Lyginant labiausiai praturtinto klono (#2002) aminorūgščių seką su kitais pasirinktais peptidais, pastebėta, kad kai kurie iš jų turi panašius aminorūgščių išplėtimus, o tai gali rodyti panašų transportavimo mechanizmą (3f pav.).
Dėl savo unikalaus profilio plazmoje ir reikšmingo CSF ​​padidėjimo laikui bėgant, fago ekrano klonas #2077 buvo toliau tiriamas per ilgesnį 48 valandų laikotarpį ir galėjo atkurti greitą CSF padidėjimą, pastebėtą kartu su nuolatiniu SA lygiu (4a pav.).Kalbant apie kitus identifikuotus fagų klonus, #2077 stipriai nusidažė smegenų kapiliarais ir parodė reikšmingą kolokalizaciją su kapiliarų žymekliu lektinu, kai žiūrima didesne skiriamąja geba, ir galbūt šiek tiek nusidažė parenchiminėje erdvėje (4b pav.).Norėdami ištirti, ar CNS galima gauti peptidų sukeltą farmakologinį poveikį, atlikome eksperimentą, kurio metu biotinilintos i) #2077 tranzitinio peptido ir ii) BACE1 inhibitoriaus peptido versijos buvo sumaišytos su SA dviem skirtingais santykiais.Vienam deriniui naudojome tik BACE1 peptido inhibitorių, o kitam naudojome 1:3 BACE1 peptido inhibitoriaus ir #2077 peptido santykį.Abu mėginiai buvo suleisti į veną ir laikui bėgant buvo matuojamas beta amiloido peptido 40 (Abeta40) kiekis kraujyje ir smegenų skystyje.Abeta40 buvo matuojamas CSF, nes jis atspindi BACE1 slopinimą smegenų parenchimoje.Kaip ir tikėtasi, abu kompleksai žymiai sumažino Abeta40 koncentraciją kraujyje (4c, d pav.).Tačiau tik mėginiai, kuriuose yra peptido Nr.2077 ir BACE1 peptido inhibitorius, konjuguotas su SA, sukėlė reikšmingą Abeta40 sumažėjimą smegenų skystyje (4c pav.).Duomenys rodo, kad peptidas Nr.2077 gali transportuoti 60 kDa SA baltymą į CNS ir taip pat sukelia farmakologinį poveikį su SA konjuguotais BACE1 peptido inhibitoriais.
a ) T7 fago, turinčio ilgalaikius CSF peptido # 2077 (RLSSVDSDLSGC) ir nesušvirkšto kontrolinio fago (# 1779) farmakokinetinius profilius, kloninė injekcija (2 × 10 fagų vienam gyvūnui) mažiausiai trims CM intubuotoms žiurkėms.(b) Konfokalinis mikroskopinis reprezentatyvių žievės mikrokraujagyslių vaizdas žiurkėse, kurioms buvo sušvirkštas fagas (2 × 1010 fagų vienam gyvūnui), rodantis peptido #2077 ir kraujagyslių (lektino) priešingą dažymą.Šie fagų klonai buvo skirti 3 žiurkėms ir leista cirkuliuoti 1 valandą prieš perfuziją.Smegenys buvo supjaustytos ir nudažytos polikloniniais FITC pažymėtais antikūnais prieš T7 fago kapsidą.Likus dešimčiai minučių iki perfuzijos ir vėlesnės fiksacijos, DyLight594 pažymėtas lektinas buvo švirkščiamas į veną.Fluorescenciniai vaizdai, rodantys lektino dažymą (raudoną) mikrokraujagyslių ir fagų (žalia) luminalinėje pusėje kapiliarų ir perivaskulinio smegenų audinio spindyje.Mastelio juosta atitinka 10 µm.( c, d ) Biotinilintas BACE1 slopinantis peptidas vienas arba kartu su biotiniluotu tranzitiniu peptidu # 2077 buvo sujungtas su streptavidinu, po to į veną buvo sušvirkšta mažiausiai trys CM žiurkės su kaniuliuotais (10 mg streptavidino / kg).BACE1 peptido inhibitorių sukeltas Aβ40 sumažėjimas buvo matuojamas Aβ1-40 ELISA kraujyje (raudona) ir smegenų skystyje (oranžinė) nurodytais laiko momentais.Siekiant didesnio aiškumo, diagramoje brėžiama punktyrinė linija 100% skalėje.c) Aβ40 procentinis sumažėjimas kraujyje (raudonieji trikampiai) ir smegenų skystyje (oranžiniai trikampiai) žiurkėms, gydomoms streptavidinu, konjuguotu su tranzitiniu peptidu #2077 ir BACE1 slopinančiu peptidu santykiu 3:1.d) Procentinis kraujo Aβ40 (raudoni apskritimai) ir smegenų skysčio (oranžiniai apskritimai) sumažėjimas žiurkėms, gydomoms streptavidinu, susietu tik su BACE1 slopinančiu peptidu.Aβ koncentracija kontrolėje buvo 420 pg/ml (standartinis nuokrypis = 101 pg/ml).
Fagų ekranas buvo sėkmingai pritaikytas keliose biomedicinos tyrimų srityse17.Šis metodas buvo naudojamas in vivo kraujagyslių įvairovės tyrimams 18, 19, taip pat tyrimams, skirtiems smegenų kraujagyslėms 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26.Šiame tyrime mes išplėtėme šio atrankos metodo taikymą ne tik tiesioginiam peptidų, nukreiptų į smegenų kraujagysles, identifikavimui, bet ir kandidatų, turinčių aktyvių transportavimo savybių, kad galėtų kirsti kraujo ir smegenų barjerą, atradimui.Dabar aprašome in vivo atrankos procedūros kūrimą CM intubuotoms žiurkėms ir parodome jos potencialą identifikuoti peptidus, turinčius CSF nukreipimo savybių.Naudodami T7 fagą, kuriame yra 12-merų atsitiktinių peptidų biblioteka, galėjome parodyti, kad T7 fagas yra pakankamai mažas (maždaug 60 nm skersmens)10, kad būtų pritaikytas kraujo ir smegenų barjerui, taip tiesiogiai kertant kraujo ir smegenų barjerą arba gyslainės rezginį.Pastebėjome, kad CSF surinkimas iš kaniuliuotų CM žiurkių buvo gerai kontroliuojamas in vivo funkcinės atrankos metodas ir kad ekstrahuotas fagas ne tik prisijungė prie kraujagyslių, bet ir veikė kaip pernešėjas per kraujo ir smegenų barjerą.Be to, tuo pačiu metu rinkdami kraują ir taikydami HTS į CSF ir iš kraujo gaunamus fagus, patvirtinome, kad mūsų CSF pasirinkimui įtakos neturėjo kraujo sodrinimas ar tinkamumas plėsti tarp atrankos etapų.Tačiau kraujo skyrius yra atrankos procedūros dalis, nes fagai, galintys pasiekti CSF skyrių, turi išgyventi ir cirkuliuoti kraujyje pakankamai ilgai, kad praturtėtų smegenyse.Siekdami gauti patikimą sekos informaciją iš neapdorotų HTS duomenų, analizės darbo eigoje įdiegėme filtrus, pritaikytus konkrečios platformos sekos klaidoms.Į atrankos metodą įtraukę kinetinius parametrus, patvirtinome greitą laukinio tipo T7 fagų farmakokinetiką (t½ ~ 28 min.) kraujyje24, 27, 28, taip pat nustatėme jų pusinės eliminacijos laiką smegenų skystyje (t½ ~ 26 min.) per minutę).Nepaisant panašių farmakokinetinių profilių kraujyje ir likvore, tik 0,001% fago koncentracijos kraujyje buvo galima aptikti likvore, o tai rodo žemą laukinio tipo T7 fago mobilumą per kraujo ir smegenų barjerą.Šiame darbe pabrėžiama pirmojo atrankos etapo svarba naudojant in vivo panoramavimo strategijas, ypač fagų sistemoms, kurios greitai pašalinamos iš kraujotakos, nes nedaug klonų gali pasiekti CNS skyrių.Taigi pirmajame etape bibliotekų įvairovės sumažėjimas buvo labai didelis, nes pagal šį labai griežtą CSF modelį galiausiai buvo surinktas tik ribotas klonų skaičius.Ši in vivo panardinimo strategija apėmė keletą atrankos etapų, tokių kaip aktyvus kaupimasis CSF skyriuje, klonų išgyvenimas kraujo skyriuje ir greitas T7 fago klonų pašalinimas iš kraujo per pirmąsias 10 minučių (1d pav. ir papildomas 4M pav.).).Taigi po pirmojo turo CSF ​​buvo nustatyti skirtingi fagų klonai, nors atskiriems gyvūnams buvo naudojamas tas pats pradinis telkinys.Tai rodo, kad keli griežti šaltinių bibliotekų, kuriose yra daug bibliotekos narių, atrankos žingsnių, žymiai sumažina įvairovę.Todėl atsitiktiniai įvykiai taps neatsiejama pirminės atrankos proceso dalimi, darysianti didelę įtaką rezultatui.Tikėtina, kad daugelis pradinės bibliotekos klonų turėjo labai panašų CSF sodrinimo polinkį.Tačiau net ir tomis pačiomis eksperimentinėmis sąlygomis atrankos rezultatai gali skirtis dėl nedidelio kiekvieno konkretaus klono skaičiaus pradiniame telkinyje.
CSF praturtinti motyvai skiriasi nuo kraujo.Įdomu tai, kad pastebėjome pirmąjį poslinkį link glicino turtingų peptidų atskirų gyvūnų kraujyje.(1g pav., papildomi 4e, 4f pav.).Fagas, kuriame yra glicino peptidų, gali būti stabilesnis ir mažiau tikėtina, kad bus pašalintas iš apyvartos.Tačiau šie glicino turintys peptidai nebuvo aptikti smegenų skysčio mėginiuose, o tai rodo, kad kuruojamos bibliotekos perėjo du skirtingus atrankos etapus: vieną kraujyje, o kitą leido kauptis smegenų skystyje.CSF praturtinti klonai, gauti po ketvirtojo atrankos etapo, buvo plačiai išbandyti.Buvo patvirtinta, kad beveik visi atskirai išbandyti klonai yra praturtinti CSF, palyginti su tuščiuoju kontroliniu fagu.Vienas peptido smūgis (#2077) buvo ištirtas išsamiau.Jis parodė ilgesnį pusinės eliminacijos periodą plazmoje, palyginti su kitais smūgiais (3d pav. ir 7 papildomas paveikslas), ir įdomu tai, kad šiame peptide C-gale buvo cisteino liekanos.Neseniai buvo įrodyta, kad cisteino pridėjimas prie peptidų gali pagerinti jų farmakokinetines savybes, prisijungdamas prie albumino 29.Šiuo metu tai nežinoma dėl peptido #2077 ir reikalauja tolesnio tyrimo.Kai kurie peptidai parodė CSF sodrinimo priklausomybę nuo valentingumo (duomenys nerodomi), o tai gali būti susiję su rodoma T7 kapsidės paviršiaus geometrija.Mūsų naudojama T7 sistema parodė 5–15 kiekvieno peptido kopijų fago dalelėje.IHC buvo atliktas su kandidatų švino fagų klonais, kurie buvo suleisti į veną į žiurkių smegenų žievę (papildomas 8 pav.).Duomenys parodė, kad mažiausiai trys klonai (Nr. 2002, Nr. 2009 ir Nr. 2077) sąveikavo su BBB.Dar reikia nustatyti, ar ši BBB sąveika lemia CSF kaupimąsi, ar šių klonų judėjimą tiesiai į BCSFB.Svarbu tai, kad parodome, kad pasirinkti peptidai išlaiko savo CSF ​​transportavimo pajėgumus, kai yra susintetinti ir prijungti prie baltymų krovinio.N-galo biotiniluotų peptidų prisijungimas prie SA iš esmės pakartoja rezultatus, gautus su atitinkamais fagų klonais kraujyje ir smegenų skystyje (3e pav.).Galiausiai parodome, kad švino peptidas #2077 gali skatinti biotinilinto BACE1 peptido inhibitoriaus, konjuguoto su SA, smegenų veikimą, sukeldamas ryškų farmakodinaminį poveikį CNS, žymiai sumažindamas Abeta40 koncentraciją likvore (4 pav.).Nepavyko nustatyti jokių duomenų bazėje esančių homologų, atlikdami visų atitikčių peptidų sekos homologijos paiešką.Svarbu pažymėti, kad T7 bibliotekos dydis yra apytiksliai 109, o teorinis 12-merų bibliotekos dydis yra 4 x 1015. Todėl pasirinkome tik nedidelę 12-merų peptidų bibliotekos įvairovės erdvės dalį, o tai gali reikšti, kad labiau optimizuotus peptidus galima nustatyti įvertinus šių gretimų identifikuotų sekų erdvę.Hipotetiškai viena iš priežasčių, kodėl neradome jokių natūralių šių peptidų homologų, gali būti atranka evoliucijos metu, siekiant užkirsti kelią nekontroliuojamam tam tikrų peptidų motyvų patekimui į smegenis.
Apibendrinant, mūsų rezultatai yra pagrindas būsimam darbui, siekiant išsamiau nustatyti ir apibūdinti smegenų kraujagyslių barjero transportavimo sistemas in vivo.Pagrindinė šio metodo sąranka yra pagrįsta funkcine atrankos strategija, kuri ne tik identifikuoja klonus, turinčius smegenų kraujagyslių surišimo savybių, bet ir apima svarbų žingsnį, kurio metu sėkmingi klonai turi vidinį aktyvumą, kad peržengtų biologinius barjerus in vivo į CNS skyrių.yra išsiaiškinti šių peptidų transportavimo mechanizmą ir jų pirmenybę jungtis prie smegenų regionui būdingų mikrokraujagyslių.Tai gali paskatinti atrasti naujus BBB ir receptorių transportavimo būdus.Tikimės, kad nustatyti peptidai gali tiesiogiai prisijungti prie smegenų kraujagyslių receptorių arba prie cirkuliuojančių ligandų, transportuojamų per BBB arba BCSFB.Šiame darbe aptikti peptidiniai vektoriai, turintys CSF transportavimo aktyvumą, bus toliau tiriami.Šiuo metu tiriame šių peptidų smegenų specifiškumą dėl jų gebėjimo kirsti BBB ir (arba) BCSFB.Šie nauji peptidai bus itin vertingos priemonės potencialiems naujų receptorių ar kelių atradimams ir naujų labai efektyvių platformų, skirtų makromolekulėms, pavyzdžiui, biologinėms medžiagoms, pristatymui į smegenis, kūrimui.
Įdėkite kaniulę į didelę cisterną (CM) naudodami anksčiau aprašyto metodo modifikaciją.Anestezuotos Wistar žiurkės (200–350 g) buvo pritvirtintos prie stereotaksinio aparato, o nuskustoje ir aseptiškai paruoštoje galvos odoje buvo padaryta vidutinė pjūvis, kad būtų atskleista kaukolė.Viršutinės varčios srityje išgręžkite dvi skylutes ir pritvirtinkite tvirtinimo varžtus skylėse.Šoninėje pakaušio dalyje buvo išgręžta papildoma skylė, kad nerūdijančio plieno kaniulė būtų stereotaktiškai nukreipta į CM.Aplink kaniulę užtepkite dantų cemento ir pritvirtinkite varžtais.Po kietėjimo foto ir cemento sukietėjimo, odos žaizda buvo uždaryta 4/0 supramid siūlu.Tinkamą kaniulės įdėjimą patvirtina spontaniškas smegenų skysčio (CSF) nutekėjimas.Išimkite žiurkę iš stereotaksinio aparato, jai atlikite tinkamą pooperacinę priežiūrą ir skausmo malšinimą ir leiskite jai atsigauti bent vieną savaitę, kol smegenų skystyje bus pastebėti kraujo požymiai.Wistar žiurkės (Crl: WI/Han) buvo gautos iš Charles River (Prancūzija).Visos žiurkės buvo laikomos tam tikromis sąlygomis, kuriose nėra patogenų.Visi eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtinti Bazelio miesto veterinarijos tarnybos (Šveicarija) ir buvo atlikti pagal gyvūnų licenciją Nr. 2474 (Assessment of Active Brain Transport, Meassment of Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Švelniai laikykite žiurkę sąmoningą, laikydami rankoje CM kaniulę.Išimkite Datura iš kaniulės ir surinkite 10 µl spontaniškai tekančio smegenų skysčio.Kadangi galiausiai buvo pažeistas kaniulės pralaidumas, į šį tyrimą buvo įtraukti tik skaidrūs smegenų skysčio mėginiai be kraujo užteršimo ar spalvos pakitimo požymių.Lygiagrečiai iš mažo pjūvio uodegos gale į mėgintuvėlius su heparinu (Sigma-Aldrich) buvo paimta maždaug 10–20 μl kraujo.CSF ir kraujas buvo paimti įvairiais laiko momentais po T7 fago injekcijos į veną.Prieš paimant kiekvieną CSF mėginį, buvo išmesta maždaug 5–10 μl skysčio, o tai atitinka negyvą kateterio tūrį.
Bibliotekos buvo sukurtos naudojant T7Select 10-3b vektorių, kaip aprašyta T7Select sistemos vadove (Novagen, Rosenberg ir kt., InNovations 6, 1-6, 1996).Trumpai tariant, atsitiktinis 12-merų DNR intarpas buvo susintetintas tokiu formatu:
NNK kodonas buvo naudojamas siekiant išvengti dvigubų stop kodonų ir aminorūgščių per didelės ekspresijos intarpe.N yra rankiniu būdu sumaišytas kiekvieno nukleotido ekvimolinis santykis, o K yra rankiniu būdu sumaišytas adenino ir citozino nukleotidų ekvimolinis santykis.Vienos grandinės sritys buvo paverstos dvigrandžiais DNR, toliau inkubuojant su dNTP (Novagen) ir Klenow fermentu (New England Biolabs) Klenow buferyje (New England Biolabs) 3 valandas 37 ° C temperatūroje.Po reakcijos dvigrandė DNR buvo išgauta nusodinant EtOH.Gauta DNR buvo suardyta restrikcijos fermentais EcoRI ir HindIII (abu iš Roche).Tada suskaidytas ir išgrynintas (QIAquick, Qiagen) intarpas (T4 ligazė, New England Biolabs) buvo sujungtas kadre į iš anksto suskaidytą T7 vektorių po 10B kapsidės geno 348 aminorūgšties.Ligacijos reakcijos buvo inkubuojamos 16 °C temperatūroje 18 valandų prieš supakuojant in vitro.Fagų pakavimas in vitro buvo atliktas pagal instrukcijas, pateiktas kartu su T7Select 10-3b klonavimo rinkiniu (Novagen), o pakavimo tirpalas buvo amplifikuotas vieną kartą, kad būtų lizuojamas naudojant Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizatai buvo centrifuguojami, titruojami ir užšaldomi -80 °C temperatūroje kaip pradinis glicerolio tirpalas.
Fago kintamų sričių, amplifikuotų sultinyje arba lėkštelėje, tiesioginis PGR amplifikavimas, naudojant patentuotus 454/Roche amplikono suliejimo pradmenis.Priekiniame suliejimo pradmenyje yra sekos, besiribojančios su kintamuoju regionu (NNK) 12 (specifinis šablonas), GS FLX titano adapterį A ir keturių bazių bibliotekos raktų seką (TCAG) (papildomas 1a paveikslas):
Atvirkštinio suliejimo pradmenyje taip pat yra biotino, pritvirtinto prie gaudymo granulių, ir GS FLX titano adapterio B, reikalingo klonų amplifikacijai emulsijos PGR metu:
Po to amplikonams buvo atlikta 454/Roche pirosevencija pagal 454 GS-FLX Titanium protokolą.Rankiniam Sanger sekos nustatymui (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 fago DNR buvo amplifikuota PGR ir sekvenuota naudojant šias pradmenų poras:
Intarpai iš atskirų plokštelių buvo amplifikuoti PGR naudojant Roche Fast Start DNA polimerazės rinkinį (pagal gamintojo instrukcijas).Atlikite karštąjį paleidimą (10 min. esant 95 °C) ir 35 padidinimo ciklus (50 s esant 95 °C, 1 min. esant 50 °C ir 1 min. esant 72 °C).
Fagas iš bibliotekų, laukinio tipo fagas, fagas, išgelbėtas iš CSF ir kraujo, arba atskiri klonai buvo amplifikuojami Escherichia coli BL5615 TB sultinyje (Sigma Aldrich) arba 500 cm2 lėkštelėse (Thermo Scientific) 4 valandas 37 °C temperatūroje.Fagai buvo išgauti iš plokštelių, plaunant plokšteles Tris-EDTA buferiu (Fluka Analytical) arba surenkant plokšteles steriliais pipetės antgaliais.Fagai buvo išskirti iš kultūros supernatanto arba ekstrahavimo buferio su vienu polietilenglikolio (PEG 8000) nusodinimo ratu (Promega) ir pakartotinai suspenduoti Tris-EDTA buferyje.
Prieš suleidžiant į veną (IV) (500 μl vienam gyvūnui), amplifikuotas fagas buvo 2–3 kartus pašalintas endotoksinu, naudojant endotoksinų šalinimo granules (Miltenyi Biotec).Pirmajame ture įvesti 2×1012 fagų;antrajame – 2×1010 fagų;trečiame ir ketvirtame atrankos turuose po 2×109 fagus vienam gyvūnui.Fagų kiekis CSF ir nurodytais laiko momentais paimtuose kraujo mėginiuose buvo nustatytas skaičiuojant apnašas pagal gamintojo instrukcijas (T7Select sistemos vadovas).Fagų atranka buvo atlikta į veną sušvirkščiant išgrynintas bibliotekas į uodegos veną arba pakartotinai sušvirkščiant fagą, išskirtą iš CSF iš ankstesnio atrankos etapo, o vėlesni derliai buvo atlikti atitinkamai 10 min., 30 min., 60 min., 90 min., 120 min., 180 min. ir 240 min., imant CSF ir kraujo mėginius.Iš viso buvo atlikti keturi in vivo panoramavimo raundai, kurių metu dvi pasirinktos šakos buvo atskirai saugomos ir analizuojamos per pirmuosius tris atrankos turus.Visiems fagų intarpams, išgautiems iš CSF per pirmuosius du atrankos etapus, buvo atlikta 454/Roche pirosevencija, o visi klonai, išgauti iš CSF iš paskutinių dviejų atrankos etapų, buvo sekvenuoti rankiniu būdu.Visiems kraujo fagams iš pirmojo atrankos etapo taip pat buvo atliktas 454/Roche pirosekvenavimas.Fagų klonų injekcijai atrinkti fagai buvo amplifikuoti E. coli (BL5615) 500 cm2 plokštelėse 37°C temperatūroje 4 valandas.Atskirai atrinkti ir rankiniu būdu sekvenuoti klonai buvo dauginami TB terpėje.Po fagų ekstrahavimo, išgryninimo ir endotoksino pašalinimo (kaip aprašyta aukščiau), 2 × 1010 fagų vienam gyvūnui 300 μl buvo švirkščiama į veną į vieną uodegos veną.
Sekos duomenų išankstinis apdorojimas ir kokybinis filtravimas.Neapdoroti 454/Roche duomenys buvo konvertuoti iš dvejetainio standartinio srauto žemėlapio formato (sff) į Pearson žmogui skaitomą formatą (fasta), naudojant tiekėjo programinę įrangą.Tolesnis nukleotidų sekos apdorojimas buvo atliktas naudojant patentuotas C programas ir scenarijus (neišleistas programinės įrangos paketas), kaip aprašyta toliau.Pirminių duomenų analizė apima griežtas kelių etapų filtravimo procedūras.Norint išfiltruoti rodmenis, kuriuose nėra galiojančios 12-merų intarpo DNR sekos, rodmenys buvo nuosekliai sulygiuoti su pradžios etikete (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stabdymo etikete (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ir fono intarpu (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC), naudojant pasaulinį testą Wunsch Need.lygiavimas, leidžiantis iki 2 neatitikimų viename išlygiavime31.Todėl skaitymai be pradžios ir pabaigos žymų bei skaitymai su foniniais įterpimais, ty lygiavimais, viršijančiais leistiną neatitikimų skaičių, buvo pašalinti iš bibliotekos.Kalbant apie likusius nuskaitymus, N-mer DNR seka, besitęsianti nuo pradžios žymos ir besibaigianti prieš stabdymo ženklą, buvo išskirta iš pradinės skaitymo sekos ir toliau apdorojama (toliau vadinama „įterpti“).Po intarpo vertimo dalis po pirmojo stopkodono pradmens 5′ gale pašalinama iš intarpo.Be to, taip pat buvo pašalinti nukleotidai, vedantys į nepilnus kodonus 3′ pradmens gale.Norint neįtraukti intarpų, kuriuose yra tik fono sekos, taip pat buvo pašalinti išversti intarpai, prasidedantys aminorūgščių modeliu „PAG“.Peptidai, kurių po transliacijos buvo mažesnis nei 3 aminorūgštys, buvo pašalinti iš bibliotekos.Galiausiai pašalinkite perteklinį įdėklų telkinį ir nustatykite kiekvieno unikalaus įdėklo dažnį.Šios analizės rezultatai apėmė nukleotidų sekų (intarpų) ir jų (skaitymo) dažnių sąrašą (papildomi 1c ir 2 paveikslai).
Grupuokite N-mer DNR intarpus pagal sekos panašumą: Siekiant pašalinti 454/Roche specifines sekos nustatymo klaidas (pvz., homopolimero plėtinių sekos nustatymo problemas) ir pašalinti mažiau svarbius perteklius, anksčiau filtruoti N-mer DNR sekos intarpai (intarpai) rūšiuojami pagal panašumą.įterpimai (leidžiami iki 2 nesutampančių bazių), naudojant iteracinį algoritmą, apibrėžtą taip: įterpimai pirmiausia rūšiuojami pagal dažnį (nuo didžiausio iki mažiausio), o jei jie yra vienodi, pagal antrinį rūšiavimą pagal ilgį (nuo ilgiausio iki trumpiausio) ).Taigi dažniausiai ir ilgiausi įterpimai apibrėžia pirmąją „grupę“.Grupės dažnis nustatomas į pagrindinį dažnį.Tada kiekvieną surūšiuotame sąraše likusį įterpimą buvo bandoma įtraukti į grupę poromis Needleman-Wunsch lygiavimu.Jei lygiavimo neatitikimų, įterpimų ar ištrynimų skaičius neviršija 2 slenksčio, įterpimas pridedamas prie grupės, o bendras grupės dažnis padidinamas pagal įterpimo dažnumą.Į grupę įtraukti intarpai yra pažymėti kaip naudojami ir toliau neapdorojami.Jei įterpimo sekos negalima pridėti prie jau esamos grupės, įterpimo seka naudojama kuriant naują grupę su atitinkamu įterpimo dažniu ir pažymima kaip naudojama.Iteracija baigiasi, kai kiekviena įterpimo seka buvo panaudota kuriant naują grupę arba gali būti įtraukta į jau esamą grupę.Galų gale, sugrupuoti intarpai, susidedantys iš nukleotidų, galiausiai paverčiami peptidų sekomis (peptidų bibliotekomis).Šios analizės rezultatas yra įterpimų rinkinys ir atitinkami jų dažniai, kurie sudaro nuoseklių skaitymų skaičių (papildomas 2 pav.).
Motyvų generavimas: remiantis unikalių peptidų sąrašu, buvo sukurta biblioteka, kurioje yra visi galimi aminorūgščių modeliai (aa), kaip parodyta žemiau.Kiekvienas galimas 3 ilgio modelis buvo išgautas iš peptido ir pridėtas jo atvirkštinis modelis kartu su bendra motyvų biblioteka, kurioje yra visi modeliai (tripeptidai).Labai pasikartojančių motyvų bibliotekos buvo suskirstytos į seką ir pašalintas perteklius.Tada kiekvienam tripeptidui motyvų bibliotekoje patikrinome jo buvimą bibliotekoje naudodami skaičiavimo įrankius.Tokiu atveju pridedamas peptido, kuriame yra rasto motyvo tripeptido, dažnis ir priskiriamas motyvui motyvų bibliotekoje („motyvų skaičius“).Motyvų generavimo rezultatas yra dvimatis masyvas, kuriame yra visi tripeptidų (motyvų) pasireiškimai ir atitinkamos jų reikšmės, kurios yra sekos skaitymų skaičius, dėl kurio gaunamas atitinkamas motyvas, kai skaitymai yra filtruojami, grupuojami ir verčiami.Metrika, kaip išsamiai aprašyta aukščiau.
Motyvų skaičiaus ir atitinkamų sklaidos schemų normalizavimas: kiekvieno mėginio motyvų skaičius buvo normalizuotas naudojant
kur ni yra skaitymų, kuriuose yra tema i, skaičius.Taigi vi reiškia skaitymo (arba peptidų), turinčių motyvą i, procentinį dažnį mėginyje.Nenormalizuoto motyvų skaičiaus P vertės buvo apskaičiuotos naudojant tikslų Fišerio testą.Kalbant apie motyvų skaičiaus korelogramas, Spearmano koreliacijos buvo apskaičiuotos naudojant normalizuotą motyvų skaičių su R.
Norint vizualizuoti aminorūgščių turinį kiekvienoje peptidų bibliotekos vietoje, buvo sukurtos 32, 33 interneto logogramos (//weblogo.threeplusone.com).Pirma, aminorūgščių kiekis kiekvienoje 12-merų peptido padėtyje yra saugomas 20 × 12 matricoje.Tada 1000 peptidų, turinčių tą patį santykinį aminorūgščių kiekį kiekvienoje padėtyje, rinkinys sugeneruojamas „fasta“ sekos formatu ir pateikiamas kaip įvestis į 3 žiniatinklio logotipą, kuris sukuria grafinį santykinio aminorūgščių kiekio kiekvienoje padėtyje vaizdą.tam tikrai peptidų bibliotekai.Norint vizualizuoti daugiamačius duomenų rinkinius, šilumos žemėlapiai buvo sukurti naudojant viduje sukurtą įrankį R (biosHeatmap, dar neišleistas R paketas).Šilumos žemėlapiuose pateiktos dendrogramos buvo apskaičiuotos naudojant Ward hierarchinį klasterizacijos metodą su Euklido atstumo metrika.Motyvų vertinimo duomenų statistinei analizei nenormalizuoto balo P vertės buvo apskaičiuotos naudojant Fišerio tikslų testą.Kitų duomenų rinkinių P vertės buvo apskaičiuotos R naudojant Stjudento t testą arba ANOVA.
Atrinkti fagų klonai ir fagai be intarpų buvo švirkščiami į veną per uodegos veną (2 × 1010 fagų vienam gyvūnui 300 μl PBS).Likus dešimčiai minučių iki perfuzijos ir vėlesnės fiksacijos, tiems patiems gyvūnams į veną buvo sušvirkšta 100 μl DyLight594 pažymėto lektino (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Praėjus 60 minučių po fago injekcijos, žiurkėms per širdį buvo perfuzuojama 50 ml PBS, po to 50 ml 4% PFA / PBS.Smegenų mėginiai buvo papildomai fiksuoti per naktį 4% PFA / PBS ir mirkyti 30% sacharozėje per naktį 4 ° C temperatūroje.Mėginiai greitai užšaldomi UŠT mišinyje.Imunohistocheminė šaldytų mėginių analizė buvo atlikta kambario temperatūroje 30 µm kriosekcijose, užblokuotose 1% BSA ir inkubuotose su polikloniniais FITC pažymėtais antikūnais prieš T7 fagą (Novus NB 600-376A) 4 °C temperatūroje.Inkubuokite per naktį.Galiausiai sekcijos buvo 3 kartus plaunamos PBS ir tiriamos konfokaliniu lazeriniu mikroskopu (Leica TCS SP5).
Visi peptidai, kurių grynumas ne mažesnis kaip 98%, buvo susintetinti GenScript USA, biotinilinti ir liofilizuoti.Biotinas jungiasi per papildomą trigubą glicino tarpiklį N gale.Patikrinkite visus peptidus naudodami masės spektrometriją.
Streptavidinas (Sigma S0677) buvo sumaišytas su 5 kartus ekvimoliniu biotinilinto peptido, biotinilinto BACE1 slopinančio peptido arba biotinilinto BACE1 slopinančio peptido ir BACE1 slopinančio peptido deriniu (santykiu 3:1) 5–10% DMSO/inkubuotame PBS.1 valandą kambario temperatūroje prieš injekciją.Streptavidinu konjuguoti peptidai buvo švirkščiami į veną 10 mg/kg doze į vieną iš žiurkių, turinčių smegenų ertmę, uodegos venų.
Streptavidino-peptido kompleksų koncentracija buvo įvertinta ELISA metodu.Nunc Maxisorp mikrotitravimo plokštelės (Sigma) per naktį 4 °C temperatūroje buvo padengtos 1,5 μg/ml pelės anti-streptavidino antikūnu (Thermo, MA1-20011).Po blokavimo (blokavimo buferis: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatina, 1% BSA) kambario temperatūroje 2 valandas, 3 valandas plaukite plokštelę 0,05% Tween-20/PBS (plovimo buferiu) (plovimo buferis), 3 sekundes 000, CSF 1:115).Tada plokštelė buvo inkubuojama per naktį 4 ° C temperatūroje su aptikimo antikūnu (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Po trijų plovimo etapų streptavidinas buvo aptiktas inkubuojant TMB substrato tirpale (Roche) iki 20 min.Sustabdę spalvos vystymąsi 1M H2SO4, išmatuokite absorbciją esant 450 nm.
Streptavidino-peptido-BACE1 inhibitorių komplekso funkcija buvo įvertinta Aβ(1-40) ELISA metodu pagal gamintojo protokolą (Wako, 294-64701).Trumpai tariant, CSF mėginiai buvo praskiesti standartiniu skiedikliu (1:23) ir inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje 96 šulinėlių plokštelėse, padengtose BNT77 gaudymo antikūnu.Po penkių plovimo etapų buvo pridėtas HRP konjuguotas BA27 antikūnas ir inkubuojamas 2 valandas 4 ° C temperatūroje, po to buvo atlikti penki plovimo etapai.Aβ (1–40) buvo aptiktas inkubuojant TMB tirpale 30 minučių kambario temperatūroje.Sustabdžius spalvos vystymąsi stabdymo tirpalu, išmatuokite absorbciją esant 450 nm.Plazmos mėginiai buvo ekstrahuoti kietosios fazės metu prieš Aβ (1–40) ELISA.Plazma buvo pridėta prie 0, 2% DEA (Sigma) 96 šulinėlių plokštelėse ir 30 minučių inkubuojama kambario temperatūroje.SPE plokšteles (Oasis, 186000679) iš eilės nuplovus vandeniu ir 100% metanoliu, į SPE plokšteles buvo sudėti plazmos mėginiai ir visas skystis pašalintas.Mėginiai buvo plaunami (iš pradžių 5 % metanoliu, po to 30 % metanoliu) ir eliuuojami 2 % NH4OH/90 % metanoliu.Išdžiovinus eliuatą 55 °C temperatūroje 99 minutes esant pastoviai N2 srovei, mėginiai buvo sumažinti standartiniuose skiedikliuose ir Aβ (1–40) buvo išmatuotas, kaip aprašyta aukščiau.
Kaip cituoti šį straipsnį: Urich, E. ir kt.Krovinių pristatymas į smegenis naudojant tranzito peptidus, nustatytus in vivo.Mokslas.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ir Moos T. Makromolekulinių vaistų pristatymas į smegenis taikant tikslinę terapiją.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ir Martinez-Martinez, P. Peptidinių ir baltymų vaistų pristatymas per kraujo ir smegenų barjerą.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hematoencefalinis barjeras: smegenų vaistų kūrimo kliūtis.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johansonas, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ir Byrdas, A. Geresnio vaistų tiekimo ir nukreipimo į smegenis perspektyvos gyslainės rezginio-CSF keliu.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmacijos modernizavimas naudojant molekulinius Trojos arklius smegenų pristatymui.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorių sukeltas peptidų pernešimas per kraujo ir smegenų barjerą.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ir kt.Padidinkite terapinių antikūnų įsiskverbimą į smegenis ir veiksmingumą, naudodami monovalentinius molekulinius šautuvus.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ir kt.Transferino receptorių (TfR) transportavimas lemia TfR antikūnų afinitetų variantų įsisavinimą smegenyse.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).