Kai kurios LC trikčių šalinimo temos niekada nėra pasenusios, nes LC praktikoje kyla problemų, net jei prietaisų technologija laikui bėgant tobulėja. Yra daug būdų, kaip LC sistemoje gali kilti problemų ir baigtis bloga piko forma. Kai iškyla problemų, susijusių su smailės forma, trumpas galimų šių rezultatų priežasčių sąrašas padeda supaprastinti trikčių šalinimo patirtį.
Buvo smagu rašyti šią rubriką „LC trikčių šalinimas“ ir kiekvieną mėnesį galvoti apie temas, nes kai kurios temos niekada neišeina iš mados. Nors chromatografijos tyrimų srityje tam tikros temos ar idėjos tampa nebeaktualios, nes jas pakeičia naujesnės ir geresnės idėjos, trikčių šalinimo srityje nuo to laiko, kai šiame žurnale pasirodė pirmasis trikčių šalinimo straipsnis (nuo LC žurnalo kai kurių temų 19 tuo metu vis dar yra keletas)3. Aš sutelkiau dėmesį į keletą LC trikčių šalinimo skyrių apie šiuolaikines tendencijas, turinčias įtakos skysčių chromatografijai (LC) (pavyzdžiui, santykinis mūsų supratimo apie slėgio poveikį sulaikymui palyginimas [2] Nauji pasiekimai) Mūsų LC rezultatų interpretacija ir tai, kaip pašalinti triktis naudojant šiuolaikinius LC prietaisus. Šio mėnesio dalyje aš tęsiu kai kurias savo 21 serijas (3) pradėjau 21. LC trikčių šalinimas – elementai, kurie puikiai tinka bet kokiam trikčių šalinimo įrankiui, yra būtini, neatsižvelgiant į mūsų naudojamos sistemos amžių.Pagrindinė šios serijos tema yra labai svarbi LCGC garsiajai „LC trikčių šalinimo vadovo“ sieninei diagramai (4), kabančiai daugelyje laboratorijų. Trečiojoje šios serijos dalyje nusprendžiau sutelkti dėmesį į problemas, susijusias su galimų smailių formų smailės formos arba viršūnės ypatybių sąrašu4. Negalime išsamiai aptarti visų šių klausimų viename straipsnyje, todėl šioje pirmoje šios temos dalyje daugiausia dėmesio skirsiu kai kuriems dažniausiai matomiems dalykams.Tikiuosi, kad jauni ir seni LC vartotojai ras naudingų patarimų ir priminimų šia svarbia tema.
Vis dažniau į trikčių šalinimo klausimus atsakau žodžiais „viskas įmanoma“. Šis atsakymas gali atrodyti lengvas, kai svarstome sunkiai interpretuojamus pastebėjimus, bet dažnai manau, kad tai tinkama. Kadangi yra daug galimų prastos smailės formos priežasčių, svarbu išlikti atviram sprendžiant, kokia gali būti problema, ir mokėti nustatyti galimas priežastis, kad galėtume pradėti trikčių šalinimo pastangas, sutelkiant dėmesį į dažniausiai pasitaikančias galimybes.
Pagrindinis bet kokio trikčių šalinimo veiksmas – bet, mano manymu, jis yra nepakankamai įvertintas – yra pripažinimas, kad yra problema, kurią reikia išspręsti. Pripažinti, kad problema yra, dažnai reikia pripažinti, kad tai, kas atsitiks su įrankiu, skiriasi nuo mūsų lūkesčių, kuriuos formuoja teorija, empirinės žinios ir patirtis (5). kraštą, uodegą ir kt.), bet ir į plotį. Mūsų lūkesčiai dėl tikrosios smailės formos yra paprasti. Teorija (6) gerai patvirtina vadovėlio lūkesčius, kad daugeliu atvejų chromatografinės smailės turi būti simetriškos ir atitikti Gauso skirstinio formą, kaip parodyta 1a paveiksle. Ko mes tikimės iš stebimų smailių pločių, yra sudėtingesnė problema. Kitoje skiltyje galime aptarti šią temą1 ateityje. – kitaip tariant, kai kurie būdai, kaip viskas gali suklysti. Likusioje šios dalies dalyje praleisime laiko aptardami keletą konkrečių situacijų, galinčių sukelti šių formų tipų, pavyzdžius.
Kartais smailės visai nepastebimos chromatogramoje, kur tikimasi, kad jos bus išplautos. Aukščiau pateikta sieninė diagrama rodo, kad smailės nebuvimas (darant prielaidą, kad mėginyje iš tikrųjų yra tokios koncentracijos tikslinės analitės, kad detektoriaus atsakas turėtų būti pakankamas, kad jis būtų matomas virš triukšmo) paprastai yra susijęs su kokia nors prietaiso problema arba netinkamomis judriosios fazės sąlygomis (jei iš viso pastebėta).smailės, dažniausiai per „silpnos“).Trumpą galimų šios kategorijos problemų ir sprendimų sąrašą galima rasti I lentelėje.
Kaip minėta pirmiau, klausimas, kiek smailės išplėtimas turėtų būti toleruojamas prieš atkreipiant dėmesį ir bandant jį išspręsti, yra sudėtinga tema, kurią aptarsiu būsimame straipsnyje. Mano patirtis rodo, kad reikšmingą smailės išplėtimą dažnai lydi reikšmingas smailės formos pasikeitimas, o smailės uodegos pasiskirstymas yra dažnesnis nei prieš piką arba skilimas. Tačiau nominaliai smailės gali būti padidintos dėl simetriškų priežasčių, kurios taip pat gali būti skirtingos.
Kiekviena iš šių problemų buvo išsamiai aptarta ankstesniuose LC trikčių šalinimo numeriuose, o šiomis temomis besidomintys skaitytojai gali peržiūrėti šiuos ankstesnius straipsnius, kad gautų informacijos apie pagrindines šių problemų priežastis ir galimus sprendimus.Daugiau informacijos.
Smailių uodegą, smailės frontą ir skilimą gali sukelti cheminiai ar fiziniai reiškiniai, o galimų šių problemų sprendimų sąrašas labai skiriasi, atsižvelgiant į tai, ar susiduriame su chemine ar fizine problema. Dažnai palyginę skirtingas chromatogramos smailes galite rasti svarbių užuominų apie tai, kuri yra kaltininkė. smailės yra paveiktos, bet likusi dalis atrodo gerai, priežastis greičiausiai cheminė.
Cheminės smailės uodegos susidarymo priežastys yra per sudėtingos, kad jas būtų galima trumpai aptarti čia. Suinteresuotas skaitytojas yra nukreipiamas į neseniai išleistą „LC Triubleshooting“ numerį, kad būtų galima išsamiau aptarti (10). Tačiau lengva pabandyti sumažinti įšvirkštos analitės masę ir pažiūrėti, ar smailės forma pagerėja. Jei taip, tai yra geras požymis, kad „šiuo atveju problemos perkrovimas yra nedidelis. es, arba turi būti pakeistos chromatografinės sąlygos, kad būtų galima gauti gerą smailių formą net ir įpurškus didesnę masę.
Taip pat yra daug galimų fizinių priežasčių, dėl kurių gali susidaryti smailės uodegos. Skaitytojai, norintys išsamiai aptarti galimybes, kreipiasi į kitą neseniai išleistą „LC trikčių šalinimo“ (11) numerį. Viena iš dažnesnių fizinių piko uodegos susidarymo priežasčių yra prastas ryšys tarp purkštuko ir detektoriaus (12). Ekstremalus pavyzdys parodytas 1d paveiksle, gautas mano laboratorijoje, prieš kelias savaites sumontavome nedidelį įpurškimo sistemą. p su antgaliu, kuris buvo suformuotas ant nerūdijančio plieno kapiliaro. Atlikę kai kuriuos pradinius trikčių šalinimo eksperimentus, supratome, kad įpurškimo vožtuvo statoriaus angos gylis buvo daug gilesnis nei buvome įpratę, todėl angos apačioje yra didelis negyvas tūris. Šią problemą nesunku išspręsti pakeitus įpurškimo kilpą kitu vamzdeliu, galime reguliuoti tinkamą angos tūrį.
Smailių frontai, kaip parodyta 1e paveiksle, taip pat gali atsirasti dėl fizinių ar cheminių problemų. Dažna fizinė priekinio krašto priežastis yra ta, kad kolonėlės dalelių sluoksnis nėra gerai supakuotas arba dalelės laikui bėgant persitvarkė. Kaip ir dėl šio fizinio reiškinio sukeltą piko uodegą, geriausias būdas tai išspręsti yra pakeisti kolonėlę ir tęsti. (linijinėmis) sąlygomis nejudančios fazės sulaikomas analitės kiekis (taigi sulaikymo koeficientas) yra tiesiškai susijęs su analitės koncentracija kolonėlėje. Chromatografiškai tai reiškia, kad didėjant į kolonėlę įšvirkštos analitės masei, smailė tampa aukštesnė, bet ne platesnė. Šis ryšys nutrūksta, kai sulaikymo, smailės elgsena tampa ne tik platesnė, bet ir ne platesnė. be to, netiesinės formos nustato chromatografinių smailių formą, dėl kurios susidaro priekiniai arba galiniai kraštai.Kaip ir esant masės perkrovai, dėl kurios susidaro smailės uodegos (10), netiesinio sulaikymo sukelta smailės priekinė dalis taip pat gali būti diagnozuojama sumažinus įpurkštos analitės masę.Jei smailės forma pagerėja, metodas turi būti pakeistas, kad nebūtų viršyta įpurškimo kokybė, chromatografijos sąlygos turi būti pakeistos iki minimumo.
Kartais stebime, kas atrodo kaip „suskaldyta“ smailė, kaip parodyta 1f paveiksle. Pirmas žingsnis sprendžiant šią problemą yra nustatyti, ar smailės forma atsirado dėl dalinės bendro eliuavimo (ty dėl dviejų skirtingų, bet glaudžiai eliuuojančių junginių). Jei iš tikrųjų yra dvi skirtingos analitės, eliuuojamos arti viena kitos, reikia pagerinti jų skiriamąją gebą, apšvietimą ir atranką, susijusią plokštelę (pvz. forma neturi nieko bendra su pačia kolona. Dažnai svarbiausias šio sprendimo požymis yra tai, ar visos chromatogramos smailės yra suskaidytos, ar tik viena ar dvi. Jei tai tik viena ar dvi, tai tikriausiai yra bendro eliuavimo problema;jei visos smailės yra padalintos, tai tikriausiai yra fizinė problema, greičiausiai susijusi su pačia kolona.
Suskilusios smailės, susijusios su pačios kolonėlės fizinėmis savybėmis, dažniausiai atsiranda dėl iš dalies užsikimšusių įleidimo ar išleidimo fritų arba dalelių pertvarkymo kolonėlėje, leidžiančiai judriajai fazei tekėti greičiau nei judrioji fazė tam tikrose kolonėlės kanalo formavimosi vietose .kituose regionuose (11).Iš dalies užsikimšusį fritą kartais galima išvalyti apverčiant srautą per kolonėlę;tačiau mano patirtis rodo, kad tai dažniausiai yra trumpalaikis, o ne ilgalaikis sprendimas. Šiuolaikinėse kolonėlėse tai dažnai būna mirtina, jei dalelės kolonoje rekombinuojasi. Šiuo metu geriausia pakeisti kolonėlę ir tęsti.
1g paveikslo smailė, taip pat neseniai mano laboratorijoje, paprastai rodo, kad signalas yra toks didelis, kad pasiekė aukščiausią atsako diapazono galą. Optinių absorbcijos detektorių (šiuo atveju UV spindulių) atveju, kai analitės koncentracija yra labai didelė, analitė sugeria didžiąją dalį šviesos, praeinančios per detektoriaus srauto elementą, paliekant labai mažai šviesos, kurią galima aptikti iš šių elektrinio signalo. , pvz., išsklaidyta šviesa ir „tamsi srovė“, todėl signalas yra labai „neryškus“ ir nepriklauso nuo analitės koncentracijos.Kai taip nutinka, problemą dažnai galima lengvai išspręsti sumažinus analitės įpurškimo tūrį – sumažinant įpurškimo tūrį, skiedžiant mėginį arba abu.
Chromatografijos mokykloje mes naudojame detektoriaus signalą (ty y ašį chromatogramoje) kaip analitės koncentracijos mėginyje indikatorių. Taigi atrodo keista matyti chromatogramą su signalu, mažesniu už nulį, nes paprastas aiškinimas yra toks, kad tai rodo neigiamą analitės koncentraciją – o tai, žinoma, fiziškai neįmanoma.
Šiuo atveju neigiama smailė paprasčiausiai reiškia, kad molekulės, eliuuojamos iš kolonėlės, sugeria mažiau šviesos nei pati judrioji fazė prieš pat smailę ir po jos. Taip gali nutikti, pavyzdžiui, naudojant santykinai mažus aptikimo bangos ilgius (<230 nm) ir judriosios fazės priedus, kurie iš tikrųjų sugeria didžiąją dalį šviesos šiais bangos ilgiais. Tokie priedai gali būti tokie judriosios fazės komponentai, kaip tirpiklis arba kananacetatas. neigiamas smailes, kad būtų galima parengti kalibravimo kreivę ir gauti tikslią kiekybinę informaciją, todėl nėra jokios esminės priežasties jų vengti per se (šis metodas kartais vadinamas „netiesioginiu UV aptikimu“) (13). Tačiau, jei tikrai norime visiškai išvengti neigiamų smailių, sugerties aptikimo atveju geriausias sprendimas yra naudoti kitokį aptikimo bangos ilgį, o judriosios fazės sugertį, kad judrioji fazė sugertų mažiau, kad mažiau sugertų fazę. lytes.
Neigiamos smailės taip pat gali atsirasti naudojant lūžio rodiklio (RI) aptikimą, kai kitų komponentų, o ne analitės mėginyje, pvz., tirpiklio matricos, lūžio rodiklis skiriasi nuo judriosios fazės lūžio rodiklio. Taip atsitinka ir naudojant UV spindulių aptikimą, tačiau šis efektas yra susilpnėjęs, palyginti su RI aptikimu. Abiem atvejais neigiamos matricos smailės gali būti labiau suderintos su matricos smailėmis.
Trečioje dalyje apie pagrindinę LC trikčių šalinimo temą aptariau situacijas, kai stebima smailės forma skiriasi nuo laukiamos ar normalios smailės formos. Veiksmingas tokių problemų šalinimas prasideda žinant numatomas smailių formas (remiantis teorija arba ankstesne esamų metodų patirtimi), todėl nukrypimai nuo šių lūkesčių yra akivaizdūs. Piktinės formos problemos turi daug skirtingų galimų priežasčių (dažnai aptariu šį diegimą per platus, ir tt). .Žinodami šias detales, galite pradėti trikčių diagnostiką, bet neapsaugosite visų galimybių. Skaitytojai, besidomintys išsamesniu priežasčių ir sprendimų sąrašu, gali peržiūrėti LCGC „LC trikčių šalinimo vadovo“ sieninę lentelę.
(4) LCGC „LC Troubleshooting Guide“ sieninė diagrama.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Duomenų analizė ir signalų apdorojimas chromatografijoje (Elsevier, Niujorkas, NY, 1998), p. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ir Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.