Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad galėtumėte naudotis visomis įmanomomis funkcijomis, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Skystoji biopsija (LB) – tai koncepcija, sparčiai populiarėjanti biomedicinos srityje. Ši koncepcija daugiausia pagrįsta cirkuliuojančios tarpląstelinės DNR (ccfDNR) fragmentų, kurie daugiausia išsiskiria kaip maži fragmentai po ląstelių mirties įvairiuose audiniuose, aptikimu. Nedidelė dalis šių fragmentų yra kilę iš svetimų audinių ar organizmų. Šiame darbe šią koncepciją pritaikėme midijoms – sargybinei rūšiai, žinomai dėl didelio jūros vandens filtravimo pajėgumo. Mes naudojame midijų gebėjimą veikti kaip natūralius filtrus, kad surinktume aplinkos DNR fragmentus iš įvairių šaltinių ir gautume informacijos apie jūrų pakrančių ekosistemų biologinę įvairovę. Mūsų rezultatai rodo, kad midijų hemolimfoje yra labai įvairaus dydžio – nuo ​​1 iki 5 kb – DNR fragmentų. Šautuvu atlikta sekvencija parodė, kad daugelis DNR fragmentų yra svetimos mikrobinės kilmės. Tarp jų radome DNR fragmentų iš bakterijų, archėjų ir virusų, įskaitant virusus, kurie, kaip žinoma, užkrečia įvairius šeimininkus, dažniausiai randamus pakrančių jūrų ekosistemose. Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad LB koncepcija, taikoma midijoms, yra turtingas, bet dar neištirtas žinių apie mikrobų įvairovę jūrų pakrančių ekosistemose šaltinis.
Klimato kaitos (KK) poveikis jūrų ekosistemų biologinei įvairovei yra sparčiai auganti tyrimų sritis. Visuotinis atšilimas ne tik sukelia svarbių fiziologinių stresorių, bet ir stumia jūrų organizmų terminio stabilumo evoliucines ribas, paveikdamas daugelio rūšių buveines ir skatindamas jas ieškoti palankesnių sąlygų [1, 2]. Be to, kad KK veikia metazoanų biologinę įvairovę, ji sutrikdo trapią šeimininko ir mikrobų sąveikos pusiausvyrą. Ši mikrobų disbakteriozė kelia rimtą grėsmę jūrų ekosistemoms, nes dėl jos jūrų organizmai tampa jautresni infekciniams patogenams [3, 4]. Manoma, kad SS vaidina svarbų vaidmenį masinėse mirtyse, o tai yra rimta problema pasaulinių jūrų ekosistemų valdymui [5, 6]. Tai svarbus klausimas, atsižvelgiant į daugelio jūrų rūšių ekonominį, ekologinį ir mitybinį poveikį. Tai ypač pasakytina apie dvigeldžius, gyvenančius poliariniuose regionuose, kur KK poveikis yra greitesnis ir sunkesnis [6, 7]. Iš tiesų, dvigeldžiai, tokie kaip Mytilus spp., yra plačiai naudojami KK poveikiui jūrų ekosistemoms stebėti. Nenuostabu, kad jų sveikatai stebėti buvo sukurta gana daug biožymenų, dažnai naudojant dviejų pakopų metodą, apimantį funkcinius biožymenis, pagrįstus fermentiniu aktyvumu arba ląstelių funkcijomis, tokiomis kaip ląstelių gyvybingumas ir fagocitinis aktyvumas [8]. Šie metodai taip pat apima specifinių slėgio indikatorių, kurie kaupiasi minkštuosiuose audiniuose po didelio kiekio jūros vandens absorbcijos, koncentracijos matavimą. Tačiau didelis dvigeldžių filtravimo pajėgumas ir pusiau atvira kraujotakos sistema suteikia galimybę sukurti naujus hemolimfos biožymenis, naudojant skystosios biopsijos (LB) koncepciją – paprastą ir minimaliai invazinį pacientų valdymo metodą. kraujo mėginiai [9, 10]. Nors žmogaus LB galima rasti kelių tipų cirkuliuojančių molekulių, ši koncepcija daugiausia pagrįsta cirkuliuojančių ekstraląstelinių DNR (ccfDNR) fragmentų DNR sekoskaitos analize plazmoje. Tiesą sakant, cirkuliuojančios DNR buvimas žmogaus plazmoje žinomas nuo XX a. vidurio [11], tačiau tik pastaraisiais metais atsiradę didelio našumo sekoskaitos metodai lėmė klinikinę diagnozę, pagrįstą ccfDNR. Šių cirkuliuojančių DNR fragmentų buvimas iš dalies atsiranda dėl pasyvaus genominės DNR (branduolinės ir mitochondrinės) išsiskyrimo po ląstelės mirties. Sveikiems asmenims ccfDNR koncentracija paprastai būna maža (<10 ng/ml), tačiau pacientams, kenčiantiems nuo įvairių patologijų ar patiriantiems stresą, ji gali padidėti 5–10 kartų, dėl ko pažeidžiami audiniai. Sveikiems asmenims ccfDNR koncentracija paprastai būna maža (<10 ng/ml), tačiau pacientams, kenčiantiems nuo įvairių patologijų ar patiriantiems stresą, ji gali padidėti 5–10 kartų, dėl ko pažeidžiami audiniai. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разнрачы патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sveikiems žmonėms cccDNR koncentracija paprastai yra maža (<10 ng/ml), tačiau ji gali padidėti 5–10 kartų pacientams, sergantiems įvairiomis patologijomis arba patiriantiems stresą, dėl kurio pažeidžiami audiniai.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍㼌从而寄致瀍在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml）中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 працинто различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Sveikų asmenų ccfDNR koncentracija paprastai būna maža (<10 ng/ml), tačiau pacientams, sergantiems įvairiomis patologijomis ar patiriantiems stresą, gali padidėti 5–10 kartų, dėl to pažeidžiami audiniai.ccfDNR fragmentų dydis labai skiriasi, tačiau paprastai svyruoja nuo 150 iki 200 bp. [12]. Savarankiškai gautos ccfDNR, t. y. ccfDNR iš normalių arba transformuotų šeimininko ląstelių, analizė gali būti naudojama genetiniams ir epigenetiniams pokyčiams, esantiems branduolio ir (arba) mitochondrijų genome, aptikti, taip padedant klinikų gydytojams parinkti specifines molekulines terapijas [13]. Tačiau ccfDNR galima gauti iš svetimų šaltinių, pavyzdžiui, ccfDNR iš vaisiaus ląstelių nėštumo metu arba iš persodintų organų [14, 15, 16, 17]. ccfDNR taip pat yra svarbus informacijos šaltinis nustatant infekcinio agento (svetimos medžiagos) nukleorūgščių buvimą, o tai leidžia neinvaziškai aptikti plačiai paplitusias infekcijas, kurių nenustato kraujo kultūros, išvengiant invazinės užkrėsto audinio biopsijos [18]. Naujausi tyrimai iš tiesų parodė, kad žmogaus kraujyje yra daug informacijos, kurią galima naudoti virusiniams ir bakteriniams patogenams nustatyti, ir kad apie 1 % žmogaus plazmoje randamos ccfDNR yra svetimos kilmės [19]. Šie tyrimai rodo, kad organizmo cirkuliuojančios mikrobiomos biologinę įvairovę galima įvertinti naudojant ccfDNR analizę. Tačiau iki šiol ši koncepcija buvo taikoma tik žmonėms ir, mažesniu mastu, kitiems stuburiniams gyvūnams [20, 21].
Šiame straipsnyje mes naudojame LB potencialą Aulacomya atra, pietinės rūšies, dažniausiai aptinkamos subantarktinėse Kergeleno salose, salų grupėje, esančioje didelėje plynaukštėje, susidariusioje prieš 35 milijonus metų. Naudodami in vitro eksperimentinę sistemą, nustatėme, kad jūros vandenyje esančius DNR fragmentus greitai pasisavina midijos ir jie patenka į hemolimfos skyrių. Šautuvu atliktas sekvenavimas parodė, kad midijų hemolimfos ccfDNR yra nuosavos ir nesavos kilmės DNR fragmentų, įskaitant simbiotines bakterijas ir DNR fragmentus iš biomų, būdingų šaltoms vulkaninėms jūrų pakrančių ekosistemoms. Hemolimfos ccfDNR taip pat yra virusų sekų, gautų iš virusų, turinčių skirtingą šeimininkų diapazoną. Taip pat radome DNR fragmentų iš daugialąsčių gyvūnų, tokių kaip kaulinės žuvys, jūros anemonai, dumbliai ir vabzdžiai. Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad LB koncepcija gali būti sėkmingai taikoma jūrų bestuburiams, siekiant sukurti turtingą genominį repertuarą jūrų ekosistemose.
Suaugusios (55–70 mm ilgio) Mytilus platensis (M. platensis) ir Aulacomya atra (A. atra) midijos buvo surinktos 2018 m. gruodžio mėn. iš potvynio ir atoslūgio zonos uolėtų Port o Franso (049°21,235 pietų platumos, 070°13,490 rytų ilgumos) krantų Kergeleno salose. Kitos suaugusios mėlynosios midijos (Mytilus spp.) buvo įsigytos iš komercinio tiekėjo (PEI Mussel King Inc., Princo Edvardo sala, Kanada) ir patalpintos į temperatūros kontroliuojamos (4 °C) aeruojamą baką, kuriame buvo 10–20 l 32 ‰ dirbtinio sūrymo (dirbtinė jūros druska „Reef Crystal“, Instant Ocean, Virdžinija, JAV). Kiekvienam eksperimentui buvo matuojamas atskirų kriauklių ilgis ir svoris.
Šios programos nemokamą atviros prieigos protokolą galima rasti internete (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Trumpai tariant, LB hemolimfa buvo surinkta iš atitraukiamųjų raumenų, kaip aprašyta [22]. Hemolimfa buvo skaidrinama centrifuguojant 1200 × g greičiu 3 minutes, supernatantas buvo užšaldytas (-20 °C) iki naudojimo. cfDNR išskyrimui ir išgryninimui mėginiai (1,5–2,0 ml) buvo atšildyti ir apdoroti naudojant „NucleoSnap cfDNA“ rinkinį („Macherey-Nagel“, Bethlehen, PA) pagal gamintojo instrukcijas. ccfDNR buvo laikoma -80 °C temperatūroje iki tolesnės analizės. Kai kuriuose eksperimentuose ccfDNR buvo išskirta ir išgryninta naudojant „QIAamp DNA Investigator Kit“ (QIAGEN, Torontas, Ontarijas, Kanada). Išgryninta DNR buvo kiekybiškai įvertinta naudojant standartinį „PicoGreen“ tyrimą. Izoliuotos ccfDNR fragmentų pasiskirstymas buvo analizuojamas kapiliarine elektroforeze naudojant „Agilent 2100“ bioanalizatorių („Agilent Technologies Inc.“, Santa Klara, Kalifornija) ir didelio jautrumo DNR rinkinį. Tyrimas buvo atliktas naudojant 1 µl ccfDNR mėginio pagal gamintojo instrukcijas.
Hemolimfos ccfDNR fragmentų sekvenavimui „Génome Québec“ (Monrealis, Kvebekas, Kanada) parengė „shotgun“ tipo bibliotekas, naudodama „Illumina DNA Mix“ rinkinį iš „Illumina MiSeq PE75“ rinkinio. Buvo naudojamas standartinis adapteris („BioO“). Neapdorotų duomenų failus galima gauti iš NCBI sekos skaitymo archyvo (SRR8924808 ir SRR8924809). Pagrindinė skaitymo kokybė buvo įvertinta naudojant „FastQC“ [23]. Adapteriams apkarpyti ir prastos kokybės skaitymams buvo naudota „Trimmomatic“ [24]. „Shotgun“ tipo skaitymai su suporuotais galais buvo FLASH būdu sujungti į ilgesnius atskirus skaitymus, kurių minimali persidengimo suma buvo 20 bp, siekiant išvengti neatitikimų [25]. Sujungti rodmenys buvo anotuoti BLASTN naudojant dvigeldžių NCBI taksonomijos duomenų bazę (e reikšmė < 1e−3 ir 90 % homologija), o mažo sudėtingumo sekų maskavimas buvo atliktas naudojant DUST [26]. Sujungti rodmenys buvo anotuoti BLASTN naudojant dvigeldžių NCBI taksonomijos duomenų bazę (e reikšmė < 1e−3 ir 90 % homologija), o mažo sudėtingumo sekų maskavimas buvo atliktas naudojant DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуство NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с иваспольнено с DULKĖS [26]. Apibendrinti rodmenys buvo anotuoti BLASTN naudojant NCBI dvigeldžių taksonomijos duomenų bazę (e reikšmė < 1e-3 ir 90 % homologija), o mažo sudėtingumo sekos maskavimas buvo atliktas naudojant DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数 [使类吼并的读数]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6 ]（进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы даннутворчств даннытво моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ir 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выспологии использованием DULKĖS [26]. Apibendrinti rodmenys buvo anotuoti BLASTN naudojant NCBI dvigeldžių taksonominę duomenų bazę (e reikšmė <1e-3 ir 90 % homologija), o mažo sudėtingumo sekos maskavimas buvo atliktas naudojant DUST [26].Skaitymai buvo suskirstyti į dvi grupes: susiję su dvigeldžių sekomis (čia vadinami savarankiškais skaitymais) ir nesusiję (nesavarankiškais skaitymais). Dvi grupės buvo atskirai surinktos naudojant MEGAHIT, kad būtų sugeneruoti kontigai [27]. Tuo tarpu svetimų mikrobiomų skaitymų taksonominis pasiskirstymas buvo klasifikuojamas naudojant Kraken2 [28] ir grafiškai pavaizduotas Kronos skritulinėje diagramoje „Galaxy“ [29, 30]. Remiantis mūsų preliminariais eksperimentais, optimalūs kmeriai buvo nustatyti kaip kmeriai-59. Tada savęs kontigai buvo identifikuoti suderinant su BLASTN (dvigeldžių NCBI duomenų bazė, e vertė <1e−10 ir 60% homologija), kad būtų gauta galutinė anotacija. Tada savęs kontigai buvo identifikuoti suderinant su BLASTN (dvigeldžių NCBI duomenų bazė, e vertė <1e−10 ir 60% homologija), kad būtų gauta galutinė anotacija. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных, двустворюсмолчатыNC значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Tada savęs kontigai buvo identifikuoti palyginant juos su BLASTN (NCBI dvigeldžių duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija) galutinei anotacijai.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Tada savikontrolės buvo identifikuotos galutinei anotacijai, palyginant jas su BLASTN (NCBI dvigeldžių duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija). Lygiagrečiai, nesavarankiškų grupių kontigai buvo anotuoti naudojant BLASTN (nt NCBI duomenų bazė, e vertė <1e−10 ir 60% homologija). Lygiagrečiai, nesavarankiškų grupių kontigai buvo anotuoti naudojant BLASTN (nt NCBI duomenų bazė, e vertė <1e−10 ir 60% homologija). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt лигмо0 NCBI, значение-10 60 proc.). Lygiagrečiai, užsienio grupių kontigai buvo anotuoti naudojant BLASTN (NT NCBI duomenų bazė, e reikšmė <1e-10 ir 60% homologija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннчхе <1e-10 ir гомология 60%). Lygiagrečiai, nesavarankiškos grupės kontigai buvo anotuoti naudojant BLASTN (nt NCBI duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija). BLASTX taip pat buvo atliktas su nesavanaudiškais kontigais, naudojant nr ir RefSeq baltymų NCBI duomenų bazes (e vertė <1e−10 ir 60% homologija). BLASTX taip pat buvo atliktas su nesavanaudiškais kontigais, naudojant nr ir RefSeq baltymų NCBI duomenų bazes (e vertė <1e−10 ir 60% homologija). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr ir RefSeq NCBI (знач1e) гомология 60%). BLASTX taip pat buvo atliktas su nesavanaudiškais kontigais, naudojant nr ir RefSeq NCBI baltymų duomenų bazes (e vertė < 1e-10 ir 60% homologija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧源 傌源 倧 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧源 傌源 倧 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значени-10 игимо0 60 proc.). BLASTX taip pat buvo atliktas su nesavanaudiškais kontigais, naudojant nr ir RefSeq NCBI baltymų duomenų bazes (e vertė <1e-10 ir 60% homologija).BLASTN ir BLASTX nesavarankiškų kontigenų telkiniai atspindi galutinius kontigenus (žr. papildomą failą).
PGR naudoti pradmenys išvardyti S1 lentelėje. ccfDNR tiksliniams genams amplifikuoti buvo naudojama Taq DNR polimerazė („Bio Basic Canada“, Markhamas, Ontarijas). Buvo naudojamos šios reakcijos sąlygos: denatūravimas 95 °C temperatūroje 3 minutes, 95 °C temperatūroje 1 minutę, nustatyta atkaitinimo temperatūra 1 minutę, elongacija 72 °C temperatūroje 1 minutę, 35 ciklai ir galiausiai 72 °C per 10 minučių. PGR produktai buvo atskirti elektroforezės būdu agarozės geliuose (1,5 %), kuriuose buvo SYBRTM saugaus DNR gelio dažų („Invitrogen“, Burlingtonas, Ontarijas, Kanada), esant 95 V įtampai.
Midijos (Mytilus spp.) buvo aklimatizuojamos 500 ml deguonimi prisotinto jūros vandens (32 PSU) 24 valandas 4 °C temperatūroje. Į buteliuką buvo įdėta plazmidės DNR, turinti įdėklą, koduojantį žmogaus galektino-7 kDNR seką (NCBI registracijos numeris L07769), kurio galutinė koncentracija buvo 190 μg/μl. Kontrolinė grupė buvo midijos, inkubuotos tomis pačiomis sąlygomis be DNR pridėjimo. Trečiajame kontroliniame bake buvo DNR be midijų. Siekiant stebėti DNR kokybę jūros vandenyje, nurodytu laiku iš kiekvieno bako buvo paimti jūros vandens mėginiai (20 μl; trys pakartojimai). Plazmidžių DNR atsekamumui LB midijos buvo surinktos nurodytu laiku ir analizuojamos kPGR ir ddPGR metodais. Dėl didelio druskos kiekio jūros vandenyje prieš visus PGR tyrimus alikvotinės dalys buvo praskiestos PGR kokybės vandeniu (1:10).
Skaitmeninė lašelinė PGR (ddPCR) buvo atlikta naudojant „BioRad QX200“ protokolą (Misisauga, Ontarijas, Kanada). Optimaliai temperatūrai nustatyti naudokite temperatūros profilį (S1 lentelė). Lašai buvo generuojami naudojant QX200 lašų generatorių („BioRad“). ddPCR buvo atlikta taip: 95 °C 5 min., 50 ciklų po 95 °C 30 s ir tam tikroje atkaitinimo temperatūroje 1 min., 72 °C 30 s, 4 °C 5 min. ir 90 °C per 5 minutes. Lašų skaičius ir teigiamos reakcijos (kopijų skaičius/µl) buvo matuojamos naudojant QX200 lašų skaitytuvą („BioRad“). Mėginiai, kuriuose buvo mažiau nei 10 000 lašelių, buvo atmesti. Modelio kontrolė nebuvo atliekama kiekvieną kartą, kai buvo vykdoma ddPCR.
KPGR buvo atlikta naudojant „Rotor-Gene® 3000“ („Corbett Research“, Sidnėjus, Australija) ir specifinius LGALS7 pradmenis. Visos kiekybinės PGR buvo atliktos 20 µl tirpale, naudojant „QuantiFast SYBR Green PCR Kit“ (QIAGEN). KPGR buvo pradėta 15 min. inkubacija 95 °C temperatūroje, po to sekė 40 ciklų 95 °C temperatūroje 10 sekundžių ir 60 °C temperatūroje 60 sekundžių, renkant duomenis vieną kartą. Lydymosi kreivės buvo generuojamos naudojant nuoseklius matavimus 95 °C temperatūroje 5 s, 65 °C temperatūroje 60 s ir 97 °C temperatūroje KPGR pabaigoje. Kiekviena KPGR buvo atlikta trimis egzemplioriais, išskyrus kontrolinius mėginius.
Kadangi midijos žinomos dėl savo didelio filtravimo greičio, pirmiausia ištyrėme, ar jos gali filtruoti ir išlaikyti jūros vandenyje esančius DNR fragmentus. Taip pat domėjomės, ar šie fragmentai kaupiasi jų pusiau atviroje limfinėje sistemoje. Šią problemą išsprendėme eksperimentiškai, atsekdami tirpių DNR fragmentų, įdėtų į mėlynųjų midijų rezervuarus, likimą. Siekdami palengvinti DNR fragmentų sekimą, naudojome svetimą (ne savąją) plazmidinę DNR, kurioje yra žmogaus galektino-7 genas. ddPCR atseka plazmidinės DNR fragmentus jūros vandenyje ir midijose. Mūsų rezultatai rodo, kad jei DNR fragmentų kiekis jūros vandenyje laikui bėgant (iki 7 dienų) išliko santykinai pastovus, tai esant midijoms šis lygis beveik visiškai išnyko per 8 valandas (1a, b pav.). Egzogeninės DNR fragmentai buvo lengvai aptinkami per 15 min. intravožtuviniame skystyje ir hemolimfoje (1c pav.). Šie fragmentai vis dar galėjo būti aptinkami iki 4 valandų po ekspozicijos. Šis DNR fragmentų filtravimo aktyvumas yra panašus į bakterijų ir dumblių filtravimo aktyvumą [31]. Šie rezultatai rodo, kad midijos gali filtruoti ir kaupti svetimą DNR savo skysčių skyriuose.
Santykinės plazmidinės DNR koncentracijos jūros vandenyje, esant (A) arba nesant (B) midijų, išmatuotos ddPCR metodu. A paveikslėlyje rezultatai išreikšti procentais, o langelių kraštinės žymi 75 ir 25 procentiles. Pritaikyta logaritminė kreivė pavaizduota raudonai, o pilkai užtamsinta sritis žymi 95 % patikimumo intervalą. B paveikslėlyje raudona linija žymi koncentracijos vidurkį, o mėlyna linija – 95 % patikimumo intervalą. C Plazmidės DNR kaupimasis midijų hemolimfoje ir vožtuvų skystyje skirtingu laiku po plazmidinės DNR pridėjimo. Rezultatai pateikiami kaip absoliutus aptiktų kopijų skaičius/ml (±SE).
Toliau tyrėme ccfDNR kilmę midijose, surinktose iš midijų telkinių Kergeleno salose – atokioje salų grupėje, kuriai antropogeninė įtaka ribota. Šiuo tikslu ccfDNR iš midijų hemolimfų buvo išskirta ir išgryninta metodais, įprastais žmogaus cccDNR gryninimui [32, 33]. Nustatėme, kad vidutinė hemolimfos ccfDNR koncentracija midijose yra maža – mikrogramai mililitre (žr. S2 lentelę, papildomą informaciją). Šis koncentracijų diapazonas yra daug didesnis nei sveikų žmonių (mažas nanogramų mililitre), tačiau retais atvejais, vėžiu sergantiems pacientams, ccfDNR lygis gali siekti kelis mikrogramus mililitre [34, 35]. Hemolimfos ccfDNR dydžio pasiskirstymo analizė parodė, kad šių fragmentų dydis labai skiriasi – nuo ​​1000 bp iki 5000 bp (2 pav.). Panašūs rezultatai gauti naudojant silicio dioksido pagrindu pagamintą „QIAamp Investigator Kit“ – metodą, dažnai naudojamą teismo medicinoje, skirtą greitai išskirti ir išgryninti genominę DNR iš mažos koncentracijos DNR mėginių, įskaitant ccfDNR [36].
Reprezentatyvi midijų hemolimfos ccfDNR elektroforegrama. Išskirta naudojant „NucleoSnap Plasma Kit“ (viršuje) ir „QIAamp DNA Investigator Kit“. B Violin diagrama, rodanti hemolimfos ccfDNR koncentracijų pasiskirstymą (±SE) midijose. Juoda ir raudona linijos atitinkamai žymi medianą, pirmąjį ir trečiąjį kvartilius.
Maždaug 1 % žmonių ir primatų ccfDNR turi svetimą šaltinį [21, 37]. Atsižvelgdami į dvigeldžių pusiau atvirą kraujotakos sistemą, mikrobų gausų jūros vandenį ir midijų ccfDNR dydžio pasiskirstymą, iškėlėme hipotezę, kad midijų hemolimfos ccfDNR gali turėti gausų ir įvairų mikrobų DNR telkinį. Norėdami patikrinti šią hipotezę, sekvenavome hemolimfos ccfDNR iš Aulacomya atra mėginių, surinktų Kergeleno salose, ir gavome daugiau nei 10 milijonų nuskaitymų, iš kurių 97,6 % praėjo kokybės kontrolę. Tada rodmenys buvo klasifikuojami pagal savarankiškus ir svetimus šaltinius, naudojant BLASTN ir NCBI dvigeldžių duomenų bazes (S1 pav., papildoma informacija).
Žmonių organizme į kraują gali patekti ir branduolio, ir mitochondrijų DNR [38]. Tačiau šiame tyrime nebuvo įmanoma išsamiai aprašyti midijų branduolio genominės DNR, atsižvelgiant į tai, kad A. atra genomas nebuvo sekvenuotas ar aprašytas. Tačiau, naudodami dvigeldžių biblioteką, mums pavyko identifikuoti keletą mūsų pačių kilmės ccfDNR fragmentų (S2 pav., papildoma informacija). Mes taip pat patvirtinome savo kilmės DNR fragmentų buvimą, atlikdami nukreiptą PGR amplifikaciją tų A. atra genų, kurie buvo sekvenuoti (3 pav.). Panašiai, atsižvelgiant į tai, kad A. atra mitochondrijų genomas yra prieinamas viešose duomenų bazėse, galima rasti įrodymų apie mitochondrijų ccfDNR fragmentų buvimą A. atra hemolimfoje. Mitochondrijų DNR fragmentų buvimas buvo patvirtintas PGR amplifikacija (3 pav.).
PGR metodu amplifikuotose A. atra (raudoni taškai – atsargų numeris: SRX5705969) ir M. platensis (mėlyni taškai – atsargų numeris: SRX5705968) hemolimfoje buvo aptikta įvairių mitochondrijų genų. Paveikslėlis adaptuotas iš Breton ir kt., 2011 m. B A. atra hemolimfos supernatanto amplifikacija. Laikyta ant FTA popieriaus. 3 mm skylmušu įpilkite tiesiai į PGR mėgintuvėlį, kuriame yra PGR mišinys.
Atsižvelgdami į gausų mikrobų kiekį jūros vandenyje, iš pradžių sutelkėme dėmesį į mikrobų DNR sekų apibūdinimą hemolimfoje. Tam naudojome dvi skirtingas strategijas. Pirmoji strategija naudojo „Kraken2“ – algoritmais pagrįstą sekų klasifikavimo programą, kuri gali identifikuoti mikrobų sekas tokiu tikslumu, kaip ir BLAST bei kitos priemonės [28]. Nustatyta, kad daugiau nei 6719 nuskaitymų yra bakterinės kilmės, o 124 ir 64 – atitinkamai iš archėjų ir virusų (4 pav.). Gausiausi bakterijų DNR fragmentai buvo iš Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) ir Bacteroidetes (17 %) (4a pav.). Šis pasiskirstymas atitinka ankstesnius jūrinių mėlynųjų midijų mikrobiomo tyrimus [39, 40]. Gamaproteobakterijos buvo pagrindinė proteobakterijų klasė (44 %), įskaitant daugelį Vibrionales (4b pav.). ddPCR metodas patvirtino Vibrio DNR fragmentų buvimą A. atra hemolimfos ccfDNR (4c pav.) [41]. Norint gauti daugiau informacijos apie ccfDNR bakterinę kilmę, buvo pasirinktas papildomas metodas (S2 pav., papildoma informacija). Šiuo atveju persidengiantys skaitymai buvo surinkti kaip suporuoti skaitymai ir, naudojant BLASTN ir e reikšmę 1e − 3, bei ribą, kurios homologija > 90 %, buvo klasifikuojami kaip savarankiškos (dvigeldžių) arba nesavarankiškos kilmės. Šiuo atveju persidengiantys skaitymai buvo surinkti kaip suporuoti skaitymai ir, naudojant BLASTN ir e reikšmę 1e − 3, bei ribą, kurios homologija > 90 %, buvo klasifikuojami kaip savarankiškos (dvigeldžių) arba nesavarankiškos kilmės. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиронсоныц (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсеч homologija > 90%. Šiuo atveju persidengiantys skaitymai buvo surinkti kaip suporuoti skaitymai ir, naudojant BLASTN ir e reikšmę 1e-3 bei ribą su >90% homologija, buvo klasifikuojami kaip natūralūs (dvigeldžiai) arba neoriginalūs.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的 和> 90% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 皁 blast1ne 用 使用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицавсткныныны (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 порога и homologija > 90%. Šiuo atveju persidengiantys skaitymai buvo surinkti kaip suporuoti skaitymai ir klasifikuojami kaip nuosavi (dvigeldžiai) arba neoriginalūs, naudojant e BLASTN ir 1e-3 reikšmes bei homologijos slenkstį >90%.Kadangi A. atra genomas dar nebuvo sekvenuotas, naudojome MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) surinkimo strategijos „de novo“ metodą. Iš viso 147 188 kontigai buvo identifikuoti kaip kilmės priklausomi (dvigeldžiai). Šie kontigai buvo suskaidyti į e reikšmes 1e-10 naudojant BLASTN ir BLASTX. Ši strategija leido mums identifikuoti 482 ne dvigeldžių fragmentus, esančius A. atra ccfDNR. Daugiau nei pusė (57 %) šių DNR fragmentų buvo gauti iš bakterijų, daugiausia iš žiaunų simbiontų, įskaitant sulfotrofinius simbiontus, ir iš žiaunų simbiontų Solemya velum (5 pav.).
Santykinis gausumas tipo lygmeniu. B Dviejų pagrindinių filų (Firmicutes ir Proteobacteria) mikrobų įvairovė. Tipinė ddPCR amplifikacija C Vibrio spp. A. 16S rRNR geno fragmentai (mėlyni) trijose atra hemolimfose.
Iš viso buvo išanalizuoti 482 surinkti kontigai. Bendras metagenominių kontigų anotacijų taksonominio pasiskirstymo profilis (prokariotai ir eukariotai). B. Detalus bakterijų DNR fragmentų, identifikuotų BLASTN ir BLASTX metodais, pasiskirstymas.
„Kraken2“ analizė taip pat parodė, kad midijų ccfDNR buvo rasta archajinių DNR fragmentų, įskaitant Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) ir Thaurmarcheota (11 %) DNR fragmentus (6a pav.). DNR fragmentų, gautų iš Euryarchaeota ir Crenarchaeota, anksčiau rastų Kalifornijos midijų mikrobų bendruomenėje, buvimas neturėtų stebinti [42]. Nors Euryarchaeota dažnai siejama su ekstremaliomis sąlygomis, dabar pripažįstama, kad tiek Euryarchaeota, tiek Crenarcheota yra vieni iš labiausiai paplitusių prokariotų jūrinėje kriogeninėje aplinkoje [43, 44]. Metanogeninių mikroorganizmų buvimas midijose nestebina, atsižvelgiant į naujausius pranešimus apie didelius metano nuotėkius iš dugno nuotėkių Kergeleno plynaukštėje [45] ir galimą mikrobų metano gamybą, pastebėtą prie Kergeleno salų krantų [46].
Tada mūsų dėmesys nukrypo į DNR virusų rodmenis. Kiek mums žinoma, tai pirmasis netikslinis midijų viruso kiekio tyrimas. Kaip ir tikėtasi, radome bakteriofagų (Caudovirales) DNR fragmentų (6b pav.). Tačiau dažniausiai virusinė DNR yra kilusi iš nukleocitovirusų tipo, dar žinomo kaip branduolinio citoplazminio didelio DNR virusas (NCLDV), kuris turi didžiausią genomą iš visų virusų. Šiame tipe dauguma DNR sekų priklauso Mimimidoviridae (58 %) ir Poxviridae (21 %) šeimoms, kurių natūralūs šeimininkai yra stuburiniai ir nariuotakojai, o nedidelė šių DNR sekų dalis priklauso žinomiems virusologiniams dumbliams. Užkrečia jūrinius eukariotinius dumblius. Sekos taip pat buvo gautos iš Pandora viruso – milžiniško viruso, turinčio didžiausią genomo dydį iš visų žinomų virusų genčių. Įdomu tai, kad virusu užsikrėtusių šeimininkų diapazonas, nustatytas hemolimfos ccfDNR sekoskaita, buvo gana didelis (S3 pav., papildoma informacija). Tai apima virusus, kurie užkrečia vabzdžius, tokius kaip Baculoviridae ir Iridoviridae, taip pat virusus, kurie užkrečia amebas, dumblius ir stuburinius gyvūnus. Taip pat radome sekas, atitinkančias Pithovirus sibericum genomą. Pitovirusai (dar vadinami „zombių virusais“) pirmą kartą buvo išskirti iš 30 000 metų senumo amžinojo įšalo Sibire [47]. Taigi, mūsų rezultatai atitinka ankstesnes ataskaitas, rodančias, kad ne visos šiuolaikinės šių virusų rūšys yra išnykusios [48] ir kad šie virusai gali būti atokiose subarktinėse jūrų ekosistemose.
Galiausiai, mes patikrinome, ar galime rasti DNR fragmentų iš kitų daugialąsčių gyvūnų. Iš viso BLASTN ir BLASTX, naudojant nt, nr ir RefSeq bibliotekas (genomo ir baltymų), identifikavome 482 svetimus kontigus. Mūsų rezultatai rodo, kad tarp daugialąsčių gyvūnų ccfDNR svetimų fragmentų vyrauja kaulinių kaulų DNR (5 pav.). Taip pat rasta vabzdžių ir kitų rūšių DNR fragmentų. Santykinai didelė dalis DNR fragmentų nebuvo identifikuota, galbūt dėl ​​to, kad genominėse duomenų bazėse, palyginti su sausumos rūšimis, nepakankamai atstovaujama daugeliui jūrinių rūšių [49].
Šiame straipsnyje taikome LB koncepciją midijoms, teigdami, kad hemolimfos ccfDNR sekoskaita gali suteikti įžvalgų apie jūrų pakrančių ekosistemų sudėtį. Visų pirma, nustatėme, kad 1) midijų hemolimfoje yra santykinai didelė (mikrogramų lygmens) santykinai didelių (~1–5 kb) cirkuliuojančių DNR fragmentų koncentracija; 2) šie DNR fragmentai yra ir nepriklausomi, ir nepriklausomi; 3) Tarp šių DNR fragmentų svetimų šaltinių radome bakterijų, archajų ir virusų DNR, taip pat kitų daugialąsčių gyvūnų DNR; 4) Šių svetimų ccfDNR fragmentų kaupimasis hemolimfoje vyksta greitai ir prisideda prie midijų vidinio filtravimo aktyvumo. Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad LB koncepcija, kuri iki šiol daugiausia buvo taikoma biomedicinos srityje, koduoja turtingą, bet neištirtą žinių šaltinį, kurį galima panaudoti siekiant geriau suprasti sarginių rūšių ir jų aplinkos sąveiką.
Be primatų, ccfDNR išskyrimas buvo aptiktas žinduoliams, įskaitant peles, šunis, kates ir arklius [50, 51, 52]. Tačiau, kiek mums žinoma, mūsų tyrimas yra pirmasis, kuriame aprašytas ccfDNR aptikimas ir sekvenavimas jūrų gyvūnų rūšyse, turinčiose atvirą kraujotakos sistemą. Ši anatominė midijų savybė ir filtravimo gebėjimas gali bent iš dalies paaiškinti skirtingas cirkuliuojančių DNR fragmentų dydžio charakteristikas, palyginti su kitomis rūšimis. Žmonių kraujyje dauguma DNR fragmentų yra maži, kurių dydis svyruoja nuo 150 iki 200 bp, o didžiausias pikas yra 167 bp [34, 53]. Maža, bet reikšminga DNR fragmentų dalis yra nuo 300 iki 500 bp dydžio, o apie 5 % yra ilgesni nei 900 bp [54]. Šio dydžio pasiskirstymo priežastis yra ta, kad pagrindinis ccfDNR šaltinis plazmoje atsiranda dėl ląstelių mirties – dėl ląstelių mirties arba dėl cirkuliuojančių kraujodaros ląstelių nekrozės sveikiems asmenims arba dėl naviko ląstelių apoptozės vėžiu sergantiems pacientams (žinoma kaip cirkuliuojanti naviko DNR). , ctDNR). Hemolimfos ccfDNR, kurią radome midijose, dydžio pasiskirstymas svyravo nuo 1000 iki 5000 bp, o tai rodo, kad midijų ccfDNR kilmė kitokia. Tai logiška hipotezė, nes midijos turi pusiau atvirą kraujagyslių sistemą ir gyvena jūros vandens aplinkoje, kurioje yra didelė mikrobų genominės DNR koncentracija. Iš tiesų, mūsų laboratoriniai eksperimentai, naudojant egzogeninę DNR, parodė, kad midijos kaupia DNR fragmentus jūros vandenyje, bent po kelių valandų jie suskaidomi po ląstelių įsisavinimo ir (arba) išleidžiami ir (arba) saugomi įvairiose organizacijose. Atsižvelgiant į ląstelių (tiek prokariotinių, tiek eukariotinių) retumą, intravožtuvinių skyrių naudojimas sumažins ccfDNR kiekį tiek iš savų šaltinių, tiek iš svetimų šaltinių. Atsižvelgdami į dvigeldžių įgimto imuniteto svarbą ir didelį cirkuliuojančių fagocitų skaičių, mes taip pat iškėlėme hipotezę, kad net svetima ccfDNR yra praturtinta cirkuliuojančiuose fagocituose, kurie kaupia svetimą DNR, patekę į mikroorganizmus ir (arba) ląstelių liekanas. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad dvigeldžių hemolimfos ccfDNR yra unikali molekulinės informacijos saugykla ir sustiprina jų, kaip sarginės rūšies, statusą.
Mūsų duomenys rodo, kad bakterijų kilmės hemolimfos ccfDNR fragmentų sekoskaita ir analizė gali suteikti svarbios informacijos apie šeimininko bakterijų florą ir bakterijas, esančias aplinkinėje jūrų ekosistemoje. Šūvio sekoskaitos metodai atskleidė komensalinės bakterijos A. atra žiaunų sekas, kurios būtų praleistos, jei būtų buvę naudojami įprasti 16S rRNR identifikavimo metodai, iš dalies dėl etaloninės bibliotekos šališkumo. Tiesą sakant, mūsų panaudotų LB duomenų, surinktų iš M. platensis tame pačiame midijų sluoksnyje Kerguelene, panaudojimas parodė, kad su žiaunomis susijusių bakterijų simbionų sudėtis abiejų midijų rūšių atveju buvo tokia pati (S4 pav., papildoma informacija). Šis dviejų genetiškai skirtingų midijų panašumas gali atspindėti bakterijų bendrijų sudėtį šaltuose, sieringuose ir vulkaniniuose Kergueleno nuogulose [55, 56, 57, 58]. Didesnis sierą redukuojančių mikroorganizmų kiekis buvo gerai aprašytas renkant midijas iš bioturbuotų pakrančių zonų [59], tokių kaip Port o Franso pakrantė. Kita galimybė yra ta, kad komensalinę midijų florą gali paveikti horizontalus perdavimas [60, 61]. Reikia daugiau tyrimų, siekiant nustatyti jūros aplinkos, jūros dugno paviršiaus ir simbiotinių bakterijų sudėties midijose koreliaciją. Šie tyrimai šiuo metu vyksta.
Hemolimfos ccfDNR ilgis ir koncentracija, jos lengvas gryninimas ir aukšta kokybė, leidžianti greitai atlikti sekvenavimą „šautuvo metodu“, yra vieni iš daugelio midijų ccfDNR naudojimo privalumų vertinant biologinę įvairovę jūrų pakrančių ekosistemose. Šis metodas ypač veiksmingas apibūdinant virusų bendrijas (viromas) tam tikroje ekosistemoje [62, 63]. Skirtingai nuo bakterijų, archėjų ir eukariotų, virusų genomuose nėra filogenetiškai konservuotų genų, tokių kaip 16S sekos. Mūsų rezultatai rodo, kad skystos biopsijos iš indikatorinių rūšių, tokių kaip midijos, gali būti naudojamos norint nustatyti santykinai didelį skaičių ccfDNR viruso fragmentų, kurie, kaip žinoma, užkrečia šeimininkus, paprastai gyvenančius pakrančių jūrų ekosistemose. Tai apima virusus, kurie, kaip žinoma, užkrečia pirmuonis, nariuotakojus, vabzdžius, augalus ir bakterinius virusus (pvz., bakteriofagus). Panašus pasiskirstymas buvo nustatytas, kai ištyrėme mėlynųjų midijų (M. platensis) hemolimfos ccfDNR viromą, surinktą tame pačiame midijų sluoksnyje Kerguelene (S2 lentelė, papildoma informacija). ccfDNR sekoskaita šautuvo metodu iš tiesų yra naujas metodas, įgaunantis pagreitį tiriant žmonių ar kitų rūšių viromą [21, 37, 64]. Šis metodas ypač naudingas tiriant dvigrandžius DNR virusus, nes tarp visų dvigrandžių DNR virusų, atstovaujančių pačiai įvairiausiai ir plačiausiai virusų klasei Baltimorėje, nėra išsaugotas nė vienas genas. Nors dauguma šių virusų lieka neklasifikuoti ir gali apimti virusus iš visiškai nežinomos virusinio pasaulio dalies [66], nustatėme, kad midijų A. atra ir M. platensis viromai ir šeimininkų diapazonai panašiai patenka į šių dviejų rūšių vidurį (žr. S3 paveikslą, papildomą informaciją). Šis panašumas nestebina, nes jis gali atspindėti selektyvumo stoką pasisavinant aplinkoje esančią DNR. Šiuo metu reikalingi būsimi tyrimai naudojant išgrynintą RNR, kad būtų galima apibūdinti RNR viromą.
Savo tyrime naudojome labai griežtą Kowarski ir kolegų [37] darbo adaptuotą kanalą, kuriame buvo atliktas dviejų pakopų sujungtų nuskaitymų ir kontigų ištrynimas prieš ir po natūralios ccfDNR surinkimo, todėl didelė dalis nuskaitymų buvo nesugrupuoti. Todėl negalime atmesti galimybės, kad kai kurie iš šių nesugrupuotų nuskaitymų vis dar gali turėti savo kilmę, daugiausia dėl to, kad neturime šios midijų rūšies etaloninio genomo. Šį kanalą taip pat naudojome, nes nerimavome dėl chimerų tarp savarankiškų ir nesavarankiškų nuskaitymų bei „Illumina MiSeq PE75“ sugeneruotų nuskaitymų ilgių. Kita daugelio nesugrupuotų nuskaitymų priežastis yra ta, kad dauguma jūrinių mikrobų, ypač atokiose vietovėse, tokiose kaip Kergelenas, nebuvo anotuoti. Naudojome „Illumina MiSeq PE75“, darydami prielaidą, kad ccfDNR fragmentų ilgis yra panašus į žmogaus ccfDNR. Būsimiems tyrimams, atsižvelgiant į mūsų rezultatus, rodančius, kad hemolimfos ccfDNR nuskaitymai yra ilgesni nei žmonių ir (arba) žinduolių, rekomenduojame naudoti sekvenavimo platformą, tinkamesnę ilgesniems ccfDNR fragmentams. Ši praktika leis daug lengviau nustatyti daugiau indikacijų gilesnei analizei. Šiuo metu neprieinamos pilnos A. atra branduolio genomo sekos gavimas taip pat labai palengvintų ccfDNR atskyrimą nuo savų ir svetimų šaltinių. Atsižvelgiant į tai, kad mūsų tyrimai buvo sutelkti į skystosios biopsijos koncepcijos taikymo midijoms galimybę, tikimės, kad naudojant šią koncepciją būsimuose tyrimuose bus sukurtos naujos priemonės ir procesai, kurie padidins šio metodo potencialą tiriant midijų mikrobų įvairovę jūrų ekosistemoje.
Kaip neinvazinis klinikinis biožymuo, padidėjęs ccfDNR kiekis žmogaus plazmoje yra susijęs su įvairiomis ligomis, audinių pažeidimais ir stresinėmis sąlygomis [67, 68, 69]. Šis padidėjimas yra susijęs su pačios DNR fragmentų išsiskyrimu po audinių pažeidimo. Šią problemą sprendėme naudodami ūminį karščio stresą, kurio metu midijos buvo trumpai veikiamos 30 °C temperatūros. Šią analizę atlikome su trijų skirtingų rūšių midijomis trijuose nepriklausomuose eksperimentuose. Tačiau po ūminio karščio streso jokių ccfDNR kiekio pokyčių neradome (žr. S5 paveikslą, papildomą informaciją). Šis atradimas gali bent iš dalies paaiškinti faktą, kad midijos turi pusiau atvirą kraujotakos sistemą ir dėl didelio filtravimo aktyvumo jose kaupiasi dideli kiekiai svetimos DNR. Kita vertus, midijos, kaip ir daugelis bestuburių, gali būti atsparesnės streso sukeltiems audinių pažeidimams, todėl ribojamas ccfDNR išsiskyrimas į jų hemolimfą [70, 71].
Iki šiol vandens ekosistemų biologinės įvairovės DNR analizė daugiausia buvo sutelkta į aplinkos DNR (eDNR) metabarkodavimą. Tačiau šis metodas biologinės įvairovės analizėje paprastai yra ribotas, kai naudojami pradmenys. Naudojant „shotgun“ sekvenavimą, apeinami PGR apribojimai ir šališkas pradmenų rinkinių parinkimas. Taigi, tam tikra prasme mūsų metodas yra artimesnis neseniai naudojamam didelio našumo eDNR „Shotgun“ sekvenavimo metodui, kuris gali tiesiogiai sekvenuoti fragmentuotą DNR ir analizuoti beveik visus organizmus [72, 73]. Tačiau yra keletas esminių problemų, skiriančių LB nuo standartinių eDNR metodų. Žinoma, pagrindinis skirtumas tarp eDNR ir LB yra natūralių filtrų šeimininkų naudojimas. Buvo pranešta apie jūrinių rūšių, tokių kaip kempinės ir dvigeldžiai moliuskai (Dresseina spp.), naudojimą kaip natūralų filtrą eDNR tyrimui [74, 75]. Tačiau Dreissena tyrime buvo naudojamos audinių biopsijos, iš kurių buvo išskirta DNR. ccfDNR analizei iš LB nereikia audinių biopsijos, specializuotos ir kartais brangios įrangos bei logistikos, susijusios su eDNR ar audinių biopsija. Tiesą sakant, neseniai pranešėme, kad ccfDNR iš LB gali būti saugoma ir analizuojama naudojant FTA palaikymą, nepažeidžiant šaldymo grandinės, o tai yra didelis iššūkis tyrimams atokiose vietovėse [76]. ccfDNR išskyrimas iš skystų biopsijų taip pat yra paprastas ir suteikia aukštos kokybės DNR, skirtą sekvenavimui su šautuvais ir PGR analizei. Tai didelis privalumas, atsižvelgiant į kai kuriuos techninius apribojimus, susijusius su eDNR analize [77]. Mėginių ėmimo metodo paprastumas ir maža kaina taip pat ypač tinka ilgalaikėms stebėsenos programoms. Be didelio filtravimo gebėjimo, kita gerai žinoma dvigeldžių savybė yra cheminė mukopolisacharidų sudėtis jų gleivėse, kuri skatina virusų absorbciją [78, 79]. Dėl to dvigeldžiai yra idealus natūralus filtras biologinei įvairovei ir klimato kaitos poveikiui tam tikroje vandens ekosistemoje apibūdinti. Nors iš šeimininko gautų DNR fragmentų buvimas gali būti laikomas metodo apribojimu, palyginti su eDNR, tokios natūralios ccfDNR kaina, palyginti su eDNR, yra suprantama, atsižvelgiant į didžiulį informacijos kiekį, prieinamą sveikatos tyrimams. Tai apima virusinių sekų, integruotų į šeimininko genomą, buvimą. Tai ypač svarbu midijoms, atsižvelgiant į horizontaliai perduodamų leukeminių retrovirusų buvimą dvigeldžiuose [80, 81]. Kitas LB pranašumas, palyginti su eDNR, yra tas, kad jis išnaudoja cirkuliuojančių kraujo ląstelių fagocitinį aktyvumą hemolimfoje, kuri praryja mikroorganizmus (ir jų genomus). Fagocitozė yra pagrindinė kraujo ląstelių funkcija dvigeldžiuose [82]. Galiausiai, šis metodas pasinaudoja dideliu midijų filtravimo pajėgumu (vidutiniškai 1,5 l/h jūros vandens) ir dviejų dienų cirkuliacija, o tai padidina skirtingų jūros vandens sluoksnių maišymąsi ir leidžia užfiksuoti heterologinę eDNR. [83, 84]. Taigi, midijų ccfDNR analizė yra įdomi sritis, atsižvelgiant į midijų poveikį mitybai, ekonominiam ir aplinkosauginiam poveikiui. Panašiai kaip ir iš žmonių surinkto LB analizė, šis metodas taip pat atveria galimybę matuoti genetinius ir epigenetinius šeimininko DNR pokyčius, reaguojant į egzogenines medžiagas. Pavyzdžiui, galima numatyti trečios kartos sekvenavimo technologijas, skirtas atlikti viso genomo metilinimo analizę natūralioje ccfDNR, naudojant nanoporų sekvenavimą. Šį procesą turėtų palengvinti tai, kad midijų ccfDNR fragmentų ilgis idealiai suderinamas su ilgo skaitymo sekvenavimo platformomis, kurios leidžia atlikti viso genomo DNR metilinimo analizę iš vieno sekvenavimo ciklo, nereikalaujant cheminių transformacijų.85,86] Tai įdomi galimybė, nes įrodyta, kad DNR metilinimo modeliai atspindi atsaką į aplinkos stresą ir išlieka daugelį kartų. Todėl tai gali suteikti vertingų įžvalgų apie pagrindinius mechanizmus, reguliuojančius atsaką po klimato kaitos ar teršalų poveikio [87]. Tačiau LB naudojimas nėra be apribojimų. Savaime suprantama, kad tam reikia indikatorinių rūšių buvimo ekosistemoje. Kaip minėta pirmiau, LB naudojimas tam tikros ekosistemos biologinei įvairovei įvertinti taip pat reikalauja griežto bioinformatikos proceso, kuriame būtų atsižvelgiama į DNR fragmentų buvimą iš šaltinio. Kita didelė problema yra etaloninių genomų prieinamumas jūrų rūšims. Tikimasi, kad tokios iniciatyvos kaip Jūrų žinduolių genomų projektas ir neseniai įkurtas „Fish10k“ projektas [88] ateityje palengvins tokią analizę. LB koncepcijos taikymas jūriniams filtruojantiems organizmams taip pat suderinamas su naujausiais sekoskaitos technologijos pasiekimais, todėl jis puikiai tinka kuriant daugiaomus biožymenis, kurie teikia svarbią informaciją apie jūrų buveinių sveikatą reaguojant į aplinkos stresą.
Genomo sekoskaitos duomenys buvo pateikti NCBI sekos skaitymo archyve https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808, skiltyje „Bioprojects SRR8924808“.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimato kaitos poveikis jūrų gyvūnijai ir ekosistemoms. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E., Manea E., Mazaris AD., Fraschetti S., Almpanidou V., Bevilacqua S. ir kt. Apsvarstykite bendrą klimato kaitos ir kitų vietinių stresorių poveikį jūros aplinkai. Bendroji mokslinė aplinka. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P ir kt. ). Kovo pirmosios mokslas. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Sumažėjęs atsparumas karščiui esant pasikartojančiam karščio stresui paaiškina didelį mėlynųjų midijų mirtingumą vasarą. Mokslinė ataskaita 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER ir kt. Naujausi gyvūnų mirčių dažnumo, priežasčių ir masto pokyčiai. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S ir kt. Masinį Pinna nobilis mirtį galėjo sukelti keli nespecifiniai patogenai. Gyvenimas. 2020; 10:238.
Bradley M., Coutts SJ., Jenkins E., O'Hara TM. Galimas klimato kaitos poveikis Arkties zoonozėms. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ir kt. Mėlynosios midijos (Mytilus edulis spp.) kaip signaliniai organizmai pakrančių taršos monitoringe: apžvalga. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Skystosios biopsijos integravimas į vėžio gydymą. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C ir kt. Skystos biopsijos brandinimas: leidžia cirkuliuoti naviko DNR. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleino rūgštys žmogaus plazmoje. „Soc Biol“ dukterinių įmonių posėdžių protokolai. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Naujas laisvos DNR vaidmuo kaip molekulinis žymuo vėžio gydymui. Biomolinės analizės kiekybinis įvertinimas. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. Skystoji biopsija patenka į kliniką – įgyvendinimo problemos ir būsimi iššūkiai. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ir kiti. Vaisiaus DNR yra motinos plazmoje ir serume. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Nėštumo eigos ir jo komplikacijų tyrimas naudojant cirkuliuojančią tarpląstelinę RNR moterų kraujyje nėštumo metu. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J ir kt. Skystoji biopsija: donoro ląstelių neturinti DNR naudojama alogeniniams pažeidimams inkstų transplantate aptikti. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM. Prenatalinės diagnostikos naujovės: motinos plazmos genomo sekvenavimas. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D ir kt. Greitas patogenų aptikimas naudojant naujos kartos metagenomą užkrėstų kūno skysčių sekvenavimą. Nat Medicine. 2021;27:115-24.