Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Skysta biopsija (LB) yra koncepcija, kuri sparčiai populiarėja biomedicinos srityje.Koncepcija daugiausia grindžiama cirkuliuojančios tarpląstelinės DNR (ccfDNR) fragmentų aptikimu, kurie daugiausia išsiskiria kaip maži fragmentai po ląstelių mirties įvairiuose audiniuose.Nedidelė dalis šių fragmentų yra kilę iš svetimų (svetimų) audinių ar organizmų.Dabartiniame darbe šią koncepciją pritaikėme midjoms – kontrolinėms rūšims, žinomoms dėl didelio jūros vandens filtravimo pajėgumo.Mes naudojame midijų sugebėjimą veikti kaip natūralius filtrus, kad užfiksuotume aplinkos DNR fragmentus iš įvairių šaltinių, kad pateiktume informacijos apie jūrų pakrančių ekosistemų biologinę įvairovę.Mūsų rezultatai rodo, kad midijų hemolimfoje yra DNR fragmentų, kurių dydis labai skiriasi – nuo ​​1 iki 5 kb.Šautuvo sekos nustatymas parodė, kad daugybė DNR fragmentų yra svetimų mikrobų kilmės.Tarp jų mes nustatėme DNR fragmentus iš bakterijų, archaea ir virusų, įskaitant virusus, kurie, kaip žinoma, užkrečia įvairius šeimininkus, dažniausiai randamus pakrančių jūrų ekosistemose.Apibendrinant, mūsų tyrimas parodo, kad midijoms taikoma LB sąvoka yra turtingas, bet dar neištyrinėtas žinių apie mikrobų įvairovę šaltinis jūrų pakrančių ekosistemose.
Klimato kaitos (CC) poveikis jūrų ekosistemų biologinei įvairovei yra sparčiai auganti tyrimų sritis.Visuotinis atšilimas ne tik sukelia svarbius fiziologinius stresus, bet ir padidina jūrinių organizmų šiluminio stabilumo evoliucines ribas, darydamas įtaką daugelio rūšių buveinei, paskatindami juos ieškoti palankesnių sąlygų [1, 2].CC ne tik daro įtaką metazoanų biologinei įvairovei, bet ir sutrikdo subtilią šeimininko ir mikrobų sąveikos pusiausvyrą.Ši mikrobų disbakteriozė kelia rimtą grėsmę jūrų ekosistemoms, nes ji daro jūrų organizmus jautresnius infekciniams patogenams [3, 4].Manoma, kad SS vaidina svarbų vaidmenį masinėse mirtyse, o tai yra rimta pasaulinių jūrų ekosistemų valdymo problema [5, 6].Tai svarbus klausimas, atsižvelgiant į daugelio jūrų rūšių ekonominį, ekologinį ir mitybos poveikį.Tai ypač pasakytina apie dvigeldžius, gyvenančius poliariniuose regionuose, kur CK poveikis yra greitesnis ir sunkesnis [6, 7].Tiesą sakant, dvigeldžiai, tokie kaip Mytilus spp.yra plačiai naudojami stebint CC poveikį jūrų ekosistemoms.Nenuostabu, kad jų sveikatai stebėti buvo sukurta gana daug biomarkerių, dažnai taikant dviejų pakopų metodą, apimantį funkcinius biomarkerius, pagrįstus fermentiniu aktyvumu arba ląstelių funkcijomis, tokiomis kaip ląstelių gyvybingumas ir fagocitinis aktyvumas [8].Šie metodai taip pat apima specifinių slėgio indikatorių, kurie susikaupia minkštuosiuose audiniuose, absorbuojant didelius jūros vandens kiekius, koncentracijos matavimą.Tačiau didelis filtravimo pajėgumas ir pusiau atvira dvigeldžių kraujotakos sistema suteikia galimybę sukurti naujus hemolimfos biomarkerius, naudojant skystosios biopsijos (LB) koncepciją – paprastą ir minimaliai invazinį pacientų valdymo metodą.kraujo mėginiai [9, 10].Nors žmogaus LB galima rasti kelių tipų cirkuliuojančių molekulių, ši koncepcija visų pirma pagrįsta plazmoje cirkuliuojančių ekstraląstelinės DNR (ccfDNR) fragmentų DNR sekos analize.Tiesą sakant, cirkuliuojančios DNR buvimas žmogaus plazmoje buvo žinomas nuo XX amžiaus vidurio [11], tačiau tik pastaraisiais metais, atsiradus didelio našumo sekos nustatymo metodams, buvo atlikta klinikinė diagnozė, pagrįsta ccfDNR.Šių cirkuliuojančių DNR fragmentų buvimą iš dalies lemia pasyvus genominės DNR (branduolinės ir mitochondrijos) išsiskyrimas po ląstelių mirties. Sveikiems žmonėms ccfDNR koncentracija paprastai yra maža (<10 ng/mL), tačiau pacientams, sergantiems įvairiomis patologijomis arba patiriant stresą, ji gali padidėti 5–10 kartų, todėl pažeidžiami audiniai. Sveikiems žmonėms ccfDNR koncentracija paprastai yra maža (<10 ng/mL), tačiau pacientams, sergantiems įvairiomis patologijomis arba patiriant stresą, ji gali padidėti 5–10 kartų, todėl pažeidžiami audiniai. У зоровых save юю концентeld ( или подвергихся стессс, приводщемемем к к поврежвению тканей. Sveikiems žmonėms cccDNR koncentracija paprastai yra maža (<10 ng/ml), tačiau pacientams, sergantiems įvairiomis patologijomis ar patiriantis stresą, ji gali padidėti 5–10 kartų.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承傗病理或承加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml）可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤 损伤 损伤Коantuką ои ми или стресом, что приводи pasirzinė CCFDNR koncentracija paprastai būna maža (<10 ng/ml) sveikiems asmenims, tačiau pacientams, sergantiems įvairiomis patologijomis ar stresu, jos gali padidėti 5–10 kartų.ccfDNR fragmentų dydis labai įvairus, bet dažniausiai svyruoja nuo 150 iki 200 bp.[12].Savarankiškai gautos ccfDNR, ty ccfDNR iš normalių arba transformuotų šeimininkų ląstelių, analizė gali būti naudojama genetiniams ir epigenetiniams pokyčiams, esantiems branduoliniame ir (arba) mitochondrijų genome, aptikti, taip padedant gydytojams pasirinkti specifines molekulines terapijas [13].Tačiau ccfDNR galima gauti iš užsienio šaltinių, tokių kaip ccfDNR iš vaisiaus ląstelių nėštumo metu arba iš persodintų organų [14,15,16,17].CCFDNR taip pat yra svarbus informacijos šaltinis, skirtas aptikti infekcinio agento (užsienio) nukleorūgščių aptikimą, leidžiančią neinvazinei aptikti plačiai paplitusias infekcijas, nenustatytas kraujo kultūrų, vengiant invazinės užkrėsto audinio biopsijos [18].Naujausi tyrimai iš tiesų parodė, kad žmogaus kraujyje yra gausus informacijos šaltinis, kuris gali būti naudojamas virusų ir bakterijų patogenams nustatyti, ir kad apie 1% žmogaus plazmoje randamos ccfDNR yra svetimos kilmės [19].Šie tyrimai rodo, kad organizmo cirkuliuojančio mikrobiomo biologinė įvairovė gali būti įvertinta naudojant ccfDNR analizę.Tačiau iki šiol ši sąvoka buvo naudojama tik žmonėms ir, kiek mažesniu mastu, kitiems stuburiniams gyvūnams [20, 21].
Šiame darbe mes naudojame LB potencialą analizuodami Aulacomya atra, pietinės rūšies, dažniausiai aptinkamos subantarktinėse Kergueleno salose, salų grupėje, esančioje ant didelio plokščiakalnio, susiformavusio prieš 35 milijonus metų, ccfDNR.ugnikalnio išsiveržimas.Naudodami in vitro eksperimentinę sistemą, nustatėme, kad jūros vandenyje esančius DNR fragmentus greitai pasisavina midijos ir jie patenka į hemolimfos skyrių.Šautuvų sekos nustatymas parodė, kad midijų hemolimfoje ccfDNR yra savo ir ne savaiminės kilmės DNR fragmentų, įskaitant simbiotines bakterijas ir DNR fragmentus iš biomų, būdingų šaltoms vulkaninėms jūrų pakrančių ekosistemoms.Hemolimfos ccfDNR taip pat yra virusų sekų, gautų iš virusų, turinčių skirtingus šeimininkų diapazonus.Taip pat radome DNR fragmentų iš daugialąsčių gyvūnų, tokių kaip kaulinės žuvys, jūros anemonai, dumbliai ir vabzdžiai.Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad LB koncepcija gali būti sėkmingai pritaikyta jūrų bestuburiams, siekiant sukurti turtingą genomo repertuarą jūrų ekosistemose.
Suaugę (55-70 mm ilgio) Mytilus platensis (M. platensis) ir Aulacomya atra (A. atra) buvo surinkti iš Port-au-France uolėtų potvynių krantų (049°21.235 P, 070°13.490 E .).Kergelen salos 2018 m. gruodžio mėn. Kitos suaugusios mėlynosios midijos (Mytilus spp.) buvo gautos iš komercinio tiekėjo (PEI Mussel King Inc., Princo Edvardo sala, Kanada) ir patalpintos į kontroliuojamos temperatūros (4°C) aeruojamą baką, kuriame yra 10–20 l 32‰ dirbtinio sūrymo.(dirbtinė jūros druska Reef Crystal, Instant Ocean, Virdžinija, JAV).Kiekvienam eksperimentui buvo matuojamas atskirų kriauklių ilgis ir svoris.
Nemokamą šios programos atvirosios prieigos protokolą galima rasti internete (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Trumpai tariant, LB hemolimfa buvo paimta iš pagrobėjų raumenų, kaip aprašyta [22].Hemolimfa buvo skaidrinta centrifuguojant 1200 x g 3 minutes, supernatantas buvo užšaldytas (-20 ° C) iki naudojimo.CFDNR išskyrimui ir gryninimui mėginiai (1,5–2,0 ml) buvo atšildyti ir apdoroti naudojant nukleosNap cfDNR rinkinį (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) pagal gamintojo instrukcijas.ccfDNR buvo laikoma -80 ° C temperatūroje iki tolesnės analizės.Kai kuriuose eksperimentuose ccfDNA buvo išskirta ir išgryninta naudojant QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Torontas, Ontarijas, Kanada).Išgryninta DNR buvo kiekybiškai įvertinta naudojant standartinį PicoGreen tyrimą.Izoliuotos ccfDNR fragmentų pasiskirstymas buvo išanalizuotas kapiliarų elektroforeze naudojant Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA), naudojant didelio jautrumo DNR rinkinį.Tyrimas buvo atliktas naudojant 1 µl ccfDNR mėginio pagal gamintojo instrukcijas.
Hemolimfos ccfDNR fragmentų sekos nustatymui „Génome Québec“ (Monrealis, Kvebekas, Kanada) paruošė šautuvų bibliotekas, naudodamos „Illumina MiseQ PE75“ rinkinio „Illumina DNR“ rinkinį.Buvo naudojamas standartinis adapteris (BioO).Neapdorotų duomenų failus galima rasti NCBI sekos skaitymo archyve (SRR8924808 ir SRR8924809).Pagrindinė skaitymo kokybė buvo įvertinta naudojant FastQC [23].Trimmomatic [24] buvo naudojamas adapteriams kirpti ir prastos kokybės skaitymui.Kad būtų išvengta neatitikimų, šratų rodmenys su suporuotais galais buvo FLASH sujungti į ilgesnius pavienius rodmenis su mažiausiai 20 bp persidengimu [25]. Sujungti skaitymai buvo anotuoti naudojant BLASTN naudojant dvigeldžių NCBI taksonomijos duomenų bazę (e vertė < 1e-3 ir 90% homologija), o mažo sudėtingumo sekos maskuojamos naudojant DUST [26]. Sujungti skaitymai buvo anotuoti naudojant BLASTN naudojant dvigeldžių NCBI taksonomijos duomenų bazę (e vertė < 1e-3 ir 90% homologija), o mažo sudėtingumo sekos maskuojamos naudojant DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двусты таксономии двусты чение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испольно с использо. Sujungti skaitymai buvo anotuoti naudojant BLASTN naudojant NCBI dvigeldžių taksonomijos duomenų bazę (e vertė < 1e-3 ir 90% homologija), o mažo sudėtingumo sekos maskavimas buvo atliktas naudojant DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数]低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данскотлорхдвуных BI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использо. Sujungti skaitymai buvo anotuoti naudojant BLASTN naudojant NCBI dvigeldžių taksonominę duomenų bazę (e vertė <1e-3 ir 90% homologija), o mažo sudėtingumo sekos maskavimas buvo atliktas naudojant DUST [26].Skaitymai buvo suskirstyti į dvi grupes: susijusius su dvigeldžiais sekomis (čia vadinama savarankišku skaitymu) ir nesusijusius (nesavarankiškai skaitančius).Dvi grupės buvo atskirai surinktos naudojant MEGAHIT kontigams generuoti [27].Tuo tarpu ateivių mikrobiomų skaitymų taksonominis pasiskirstymas buvo klasifikuojamas naudojant Kraken2 [28] ir grafiškai pavaizduotas galaktikos kronos skritulinėje diagramoje [29, 30].Iš mūsų išankstinių eksperimentų buvo nustatyta, kad optimalūs kmers yra kmers-59. Tada savaiminiai kontigai buvo nustatyti suderinus su BLASTN (dvigeldžių NCBI duomenų bazė, e vertė < 1e-10 ir 60% homologija) galutinei anotacijai. Tada savaiminiai kontigai buvo nustatyti suderinus su BLASTN (dvigeldžių NCBI duomenų bazė, e vertė < 1e-10 ir 60% homologija) galutinei anotacijai. „ <1e-10 и гомологškumas 60%) дл оончательной анотации. Tada buvo nustatyti savarankiški kontigai, suderinant juos su BLASTN (NCBI dvigeldžių duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija) galutinei anotacijai.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来自諆别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления сопоставления с Бластнынцированы ворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ir гомология 60%). Tada buvo nustatyti savarankiški kontigtai galutinei anotacijai, suderinant su BLASTN (NCBI dvigeldžių duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija). Lygiagrečiai, nesavarankiškų grupių kontigai buvo pažymėti BLASTN (nt NCBI duomenų bazė, e reikšmė < 1e-10 ir 60% homologija). Lygiagrečiai, nesavarankiškų grupių kontigai buvo pažymėti BLASTN (nt NCBI duomenų bazė, e reikšmė < 1e-10 ir 60% homologija). Паралельно чжеродные груовые контиги ыли анотированы с сомщщюю ю зdin). Lygiagrečiai užsienio grupių kontigai buvo pažymėti BLASTN (NT NCBI duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠用平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠用 Пара paprastai контиги, н о тносщиеся к с сственной груе, ы0 б 10 б аотированы с сомощщщюююююююююююююю дA дз дetas и гомологи 1 60%). Lygiagrečiai ne savarankiškų grupių kontigams buvo priskirtos BLASTN anotacijos (nt NCBI duomenų bazė, e vertė <1e-10 ir 60% homologija). BLASTX taip pat buvo atliktas su nesavarankiškais kontigais, naudojant nr ir RefSeq baltymų NCBI duomenų bazes (e vertė < 1e-10 ir 60% homologija). BLASTX taip pat buvo atliktas su nesavarankiškais kontigais, naudojant nr ir RefSeq baltymų NCBI duomenų bazes (e vertė < 1e-10 ir 60% homologija). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значич01e) %). BLASTX taip pat buvo atliktas ne savaiminiams kontigams, naudojant nr ir RefSeq NCBI baltymų duomenų bazes (e vertė < 1e-10 ir 60% homologija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和源 悌源 倧 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和源 悌源 倧 60% Blastx также ыоолняли на несамостотельных контиг с иолзованием баз даных бека nr и и иolin (значение н бека и и и иolin . BLASTX taip pat buvo atliktas ne savaiminiams kontigams, naudojant nr ir RefSeq NCBI baltymų duomenų bazes (e vertė <1e-10 ir 60% homologija).BLASTN ir BLASTX nesavarankiškų kontigų telkiniai yra galutiniai kontigtai (žr. papildomą failą).
PGR naudojami pradmenys išvardyti S1 lentelėje.Taq DNR polimerazė (Bio Basic Canada, Markham, ON) buvo naudojama ccfDNR tiksliniams genams amplifikuoti.Buvo naudojamos šios reakcijos sąlygos: denatūravimas 95 ° C temperatūroje 3 minutes, 95 ° C 1 minutę, nustatyta atkaitinimo temperatūra 1 minutę, pailginimas 72 ° C temperatūroje 1 minutę, 35 ciklai ir galiausiai 72 ° C per 10 minučių..PGR produktai buvo atskirti elektroforezės būdu agarozės gelyje (1, 5%), turinčiame SYBRTM saugią DNR gelio dėmę (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada), esant 95 V įtampai.
Midijos (Mytilus spp.) buvo aklimatizuotos 500 ml deguonies prisotinto jūros vandens (32 PSU) 24 valandas 4 °C temperatūroje.Plazmidinė DNR su intarpu, koduojančiu žmogaus galektino-7 cDNR seką (NCBI registracijos numeris L07769), buvo įdėta į buteliuką, kai galutinė koncentracija buvo 190 μg/μl.Midijos, inkubuotos tomis pačiomis sąlygomis, nepridedant DNR, buvo kontrolė.Trečiajame kontrolės bake buvo DNR be midijų.Norint stebėti DNR kokybę jūros vandenyje, iš kiekvieno rezervuaro nurodytu laiku buvo paimti jūros vandens mėginiai (20 μl; trys pakartojimai).Plazmidės DNR atsekamumui LB midijos buvo surinktos nurodytu laiku ir analizuojamos naudojant qPCR ir ddPCR.Dėl didelio druskos kiekio jūros vandenyje alikvotinės dalys buvo praskiestos PGR kokybės vandeniu (1:10) prieš visus PGR tyrimus.
Skaitmeninis lašelių PGR (ddPCR) buvo atliktas naudojant BioRad QX200 protokolą (Misisuga, Ontarijas, Kanada).Optimaliai temperatūrai nustatyti naudokite temperatūros profilį (S1 lentelė).Lašai buvo sukurti naudojant QX200 lašų generatorių (BioRad).ddPCR buvo atlikta taip: 95 ° C 5 minutes, 50 ciklų 95 ° C 30 s ir tam tikra atkaitinimo temperatūra 1 min. ir 72 ° C 30 s, 4 ° C 5 minutes ir 90 ° C per 5 minutes.Lašų skaičius ir teigiamos reakcijos (kopijų skaičius/µL) buvo išmatuoti naudojant QX200 lašų skaitytuvą (Biorad).Mėginiai su mažiau nei 10 000 lašelių buvo atmesti.Modelio valdymas nebuvo atliekamas kiekvieną kartą, kai buvo vykdomas DDPCR.
qPCR buvo atlikta naudojant Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidnėjus, Australija) ir specifinius LGALS7 pradmenis.Visi kiekybiniai PGR buvo atlikti 20 µl naudojant QuantiFast SYBR Green PCR rinkinį (QIAGEN).qPCR buvo pradėtas 15 minučių inkubuojant 95 ° C temperatūroje, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 10 sekundžių ir 60 ° C temperatūroje 60 sekundžių su vienu duomenų rinkimu.Lydymosi kreivės buvo sukurtos naudojant nuoseklius matavimus 95 ° C temperatūroje 5 s, 65 ° C temperatūroje 60 s ir 97 ° C qPCR pabaigoje.Kiekvienas qPCR buvo atliktas trimis egzemplioriais, išskyrus kontrolinius mėginius.
Kadangi midijos yra žinomos dėl didelio filtravimo greičio, pirmiausia ištyrėme, ar jos gali filtruoti ir išlaikyti jūros vandenyje esančius DNR fragmentus.Taip pat domėjomės, ar šie fragmentai kaupiasi pusiau atviroje limfinėje sistemoje.Mes išsprendėme šią problemą eksperimentiškai, atsekdami tirpių DNR fragmentų, pridėtų prie mėlynųjų midijų rezervuarų, likimą.Norėdami palengvinti DNR fragmentų sekimą, mes panaudojome svetimą (ne savęs) plazmidę DNR, kurioje yra žmogaus galektino-7 genas.ddPCR atskleidžia plazmidės DNR fragmentus jūros vandenyje ir midijose.Mūsų rezultatai rodo, kad jei DNR fragmentų kiekis jūros vandenyje išliko santykinai pastovus laikui bėgant (iki 7 dienų), nesant midijų, tai esant midijų šis lygis beveik visiškai išnyko per 8 valandas (1a,b pav.).Egzogeninės DNR fragmentai buvo lengvai aptikti per 15 minučių intravalvuliniame skystyje ir hemolimfoje (1 pav. C).Šiuos fragmentus vis tiek buvo galima aptikti iki 4 valandų po ekspozicijos.Šis filtravimo aktyvumas DNR fragmentų atžvilgiu yra panašus į bakterijų ir dumblių filtravimo aktyvumą [31].Šie rezultatai rodo, kad midijos gali filtruoti ir kauptis svetimoje DNR skysčio skyriuose.
Santykinė plazmidės DNR koncentracija jūros vandenyje, kai yra (A) arba nėra (B) midijų, išmatuota ddPCR.A dalyje rezultatai išreiškiami procentais, o langelių kraštinės reiškia 75 ir 25 procentilius.Pritaikyta logaritminė kreivė rodoma raudonai, o pilka spalva nuspalvinta sritis reiškia 95 % pasikliautinąjį intervalą.B raudona linija reiškia vidurkį, o mėlyna linija – 95 % koncentracijos pasikliautinąjį intervalą.C Plazmidės DNR kaupimasis midijų hemolimfoje ir vožtuvų skystyje skirtingu metu, pridėjus plazmidės DNR.Rezultatai pateikiami kaip aptiktos absoliučios kopijos/ml (±SE).
Toliau ištyrėme ccfDNR kilmę midijose, surinktose iš midijų lovų Kerguelen salose, atokioje salų grupėje, turinčioje ribotą antropogeninę įtaką.Šiuo tikslu cccDNR iš midijų hemolimfų buvo išskirta ir išgryninta metodais, paprastai naudojamais žmogaus cccDNR valymui [32, 33].Mes nustatėme, kad vidutinė hemolimfos ccfDNR koncentracija midijų yra žemose mikrogramuose viename ml hemolimfos diapazone (žr. S2 lentelę, papildomą informaciją).Šis koncentracijų diapazonas yra daug didesnis nei sveikų žmonių (mažas nanogramų mililitre), tačiau retais atvejais vėžiu sergantiems pacientams ccfDNR lygis gali siekti kelis mikrogramus mililitre [34, 35].Hemolimfos ccfDNR dydžio pasiskirstymo analizė parodė, kad šių fragmentų dydis labai skiriasi – nuo ​​1000 bp iki 1000 bp.Iki 5000 bp (2 pav.).Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant silicio dioksido pagrindu pagamintą QIAamp Investigator Kit – metodą, dažniausiai naudojamą teismo medicinoje, siekiant greitai išskirti ir išgryninti genominę DNR iš mažos koncentracijos DNR mėginių, įskaitant ccfDNR [36].
Tipinė midijų hemolimfos ccfDNA elektroforegrama.Išskirta naudojant NucleoSnap Plasma Kit (viršuje) ir QIAamp DNA Investigator Kit.B Smuiko grafikas, rodantis hemolimfos ccfDNR koncentracijų (±SE) pasiskirstymą midijose.Juodos ir raudonos linijos žymi atitinkamai medianą ir pirmąjį bei trečiąjį kvartilius.
Maždaug 1% žmonių ir primatų ccfDNR turi pašalinių šaltinių [21, 37].Atsižvelgdami į pusiau atvirą dvigeldžių kraujotakos sistemą, daug mikrobų turintį jūros vandenį ir midijų ccfDNR pasiskirstymą pagal dydį, iškėlėme hipotezę, kad midijų hemolimfoje ccfDNR gali būti gausus ir įvairus mikrobų DNR telkinys.Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes sekvenavome hemolimfos ccfDNR iš Aulacomya atra mėginių, surinktų iš Kerguelen salų, ir gauta daugiau nei 10 milijonų skaitymų, iš kurių 97, 6% praėjo kokybės kontrolę.Tada rodmenys buvo klasifikuojami pagal savarankiškus ir ne savarankiškus šaltinius, naudojant BLASTN ir NCBI dvigeldžių duomenų bazes (S1 pav., Papildoma informacija).
Žmonėms tiek branduolinė, tiek mitochondrijų DNR galima išleisti į kraują [38].Tačiau šiame tyrime nebuvo įmanoma išsamiai aprašyti midijų branduolinės genominės DNR, nes A. atra genomas nebuvo sekvenuotas ar aprašytas.Tačiau mums pavyko nustatyti daugybę savo kilmės ccfDNR fragmentų, naudodamiesi dvigeldžios biblioteka (S2 pav., Papildoma informacija).Taip pat patvirtinome savo kilmės DNR fragmentų buvimą tų A. atra genų, kurie buvo sekvenuoti, nukreipta PGR amplifikacija (3 pav.).Panašiai, atsižvelgiant į tai, kad A. atra mitochondrijų genomas yra prieinamas viešose duomenų bazėse, galima rasti įrodymų, kad A. atra hemolimfoje yra mitochondrijų ccfDNR fragmentų.Mitochondrijų DNR fragmentų buvimas patvirtintas PGR amplifikacija (3 pav.).
A. ATRA hemolimfoje (raudoni taškai - atsargų numeris: SRX5705969) ir M. platensis (mėlyni taškai - atsargų numeris: SRX5705968) amplifikuoti PGR.Paveikslas pritaikytas iš Breton ir kt., 2011 B A. atra hemolimfos supernatanto amplifikacija Saugoma ant FTA popieriaus.Naudokite 3 mm perforatorių, kad pridėtumėte tiesiai į PGR mėgintuvėlį, kuriame yra PGR mišinys.
Atsižvelgiant į gausų mikrobų kiekį jūros vandenyje, iš pradžių mes sutelkėme dėmesį į mikrobų DNR sekų apibūdinimą hemolimfoje.Norėdami tai padaryti, naudojame dvi skirtingas strategijas.Pirmoji strategija naudojo Kraken2, algoritmu pagrįstą sekų klasifikavimo programą, kuri gali identifikuoti mikrobų sekas tokiu tikslumu, kaip BLAST ir kiti įrankiai [28].Nustatyta, kad daugiau nei 6719 nuskaitymų buvo bakterinės kilmės, o atitinkamai 124 ir 64 – iš archajų ir virusų (4 pav.).Gausiausi bakterijų DNR fragmentai buvo Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) ir Bacteroidetes (17 %) (4a pav.).Šis pasiskirstymas atitinka ankstesnius jūrų mėlynųjų midijų mikrobiomo tyrimus [39, 40].Gamaproteobakterijos buvo pagrindinė proteobakterijų klasė (44 %), įskaitant daug vibrionalų (4b pav.).ddPCR metodas patvirtino Vibrio DNR fragmentų buvimą A. atra hemolimfos ccfDNR (4c pav.) [41].Norėdami gauti daugiau informacijos apie ccfDNR bakterinę kilmę, buvo imtasi papildomo požiūrio (S2 pav., Papildoma informacija). Šiuo atveju perskaityta, kad sutapta buvo surinkta kaip suporuotų galūnių skaitymai ir buvo klasifikuojami kaip savęs (dvigubas) arba neuždengtos kilmės, naudojant BLASTN, o E vertė-1e-3 ir yra> 90% homologija. Šiuo atveju perskaityta, kad sutapta buvo surinkta kaip suporuotų galūnių skaitymai ir buvo klasifikuojami kaip savęs (dvigubas) arba neuždengtos kilmės, naudojant BLASTN, o E vertė-1e-3 ir yra> 90% homologija. В эом слае перекрыающиеся чтения ыыи собраны как чтения с парныи концами ыыли кицирирunk ба боmin иеmin кparteris - ывmin створчатые молюски) или чжие по происхожжению с иоолзованием blastn и значения e 1e-3 и и иечения с сeto. Tokiu atveju sutapimo skaitymai buvo surinkti kaip suporuoti skaitymai ir buvo klasifikuojami kaip vietiniai (dvignialūs) arba neoriginaliniai, naudojant 1E-3 ir E vertę, o ribos-90% homologija. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицивстустуныны тые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гом>9 гомолога гом>9%. Šiuo atveju sutampantys rodmenys buvo renkami kaip suporuoti rodmenys ir klasifikuojami kaip nuosavi (dvigeldžiai) arba neoriginalūs, naudojant e BLASTN ir 1e-3 reikšmes ir homologijos slenkstį > 90%.Kadangi A. atra genomas dar nebuvo sekvenuotas, mes panaudojome MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) surinkėjo de novo surinkimo strategiją.Iš viso 147 188 kontigai buvo nustatyti kaip priklausomi (dvigeldžiai) kilmės.Tada šie jungtys buvo susprogdinti su 1e-10 vertėmis, naudojant BLASTN ir BLASTX.Ši strategija leido mums nustatyti 482 ne dvigeldžius fragmentus, esančius A. atra ccfDNR.Daugiau nei pusė (57%) šių DNR fragmentų buvo gauti iš bakterijų, daugiausia iš žiauninių simbiontų, įskaitant sulfotrofinius simbiontus, ir iš žiauninių simbiontų Solemya velum (5 pav.).
Santykinė gausa tipo lygyje.B Dviejų pagrindinių bakterijų (Firmicutes ir Proteobacteria) mikrobų įvairovė.Reprezentatyvi ddPCR C Vibrio spp.A. 16S rRNR geno fragmentai (mėlyna) trijose atra hemolimfose.
Iš viso buvo išanalizuoti 482 surinkti kontigai.Bendras metagenominių kontiginių anotacijų (prokariotų ir eukariotų) taksonominio pasiskirstymo profilis.B Išsamus BLASTN ir BLASTX nustatytų bakterijų DNR fragmentų pasiskirstymas.
KRAKEN2 analizė taip pat parodė, kad mide ccfDNR buvo archealinių DNR fragmentų, įskaitant Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ir Thaurmarcheota (11%) (65%) DNR fragmentus (11%) (6A pav.).DNR fragmentų, gautų iš Euryarchaeota ir Crenarchaeota, anksčiau aptiktų Kalifornijos midijų mikrobų bendruomenėje, buvimas neturėtų stebinti [42].Nors Euryarchaeota dažnai siejama su ekstremaliomis sąlygomis, dabar pripažįstama, kad tiek Euryarchaeota, tiek Crenarcheota yra vieni iš labiausiai paplitusių prokariotų jūros kriogeninėje aplinkoje [43, 44].Metanogeninių mikroorganizmų buvimas midijose nestebina, atsižvelgiant į naujausius pranešimus apie didelius metano nuotėkius iš dugno nuotėkio Kergeleno plynaukštėje [45] ir galimą mikrobų metano gamybą, pastebėtą Kergeleno salų pakrantėse [46].
Tada mūsų dėmesys nukrypo į DNR virusų rodmenis.Mūsų žiniomis, tai pirmasis netikslinis viruso kiekio midijose tyrimas.Kaip ir tikėtasi, radome bakteriofagų (Caudovirales) DNR fragmentų (6b pav.).Tačiau dažniausiai virusinė DNR gaunama iš nukleocitovirusų grupės, taip pat žinomo kaip branduolinis citoplazminis didelės DNR virusas (NCLDV), kurio genomas yra didžiausias iš visų virusų.Šiame prieglobstyje dauguma DNR sekų priklauso Mimimidoviridae (58%) ir Poxviridae (21%) šeimoms, kurių natūralūs šeimininkai yra stuburiniai ir nariuotakojai, o nedidelė šių DNR sekų dalis priklauso žinomiems virusologiniams dumbliams.Užkrečia jūrų eukariotinius dumblius.Sekos taip pat buvo gautos iš Pandora viruso, milžiniško viruso, turinčio didžiausią genomo dydį iš visų žinomų virusų genčių.Įdomu tai, kad šeimininkų diapazonas, žinomas, užkrėsti virusu, kaip nustatyta hemolimfos ccfDNR seka, buvo palyginti didelis (S3 pav., Papildoma informacija).Tai apima virusus, užkrečiančius vabzdžius, tokius kaip Baculoviridae ir Iridoviridae, taip pat virusus, kurie užkrečia amebas, dumblius ir stuburinius gyvūnus.Taip pat radome sekas, atitinkančias Pithovirus sibericum genomą.Pitovirusai (taip pat žinomi kaip „zombių virusai“) pirmą kartą buvo išskirti iš 30 000 metų amžinojo įšalo Sibire [47].Taigi mūsų rezultatai atitinka ankstesnes ataskaitas, rodančias, kad ne visos šiuolaikinės šių virusų rūšys yra išnykusios [48] ir kad šių virusų gali būti atokiose subarktinėse jūrų ekosistemose.
Galiausiai išbandėme, ar galime rasti DNR fragmentų iš kitų daugialąsčių gyvūnų.Iš viso BLASTN ir BLASTX nustatė 482 užsienio kontigus su nt, nr ir RefSeq bibliotekomis (genominėmis ir baltyminėmis).Mūsų rezultatai rodo, kad tarp svetimkūnių daugialąsčių gyvūnų ccfDNR fragmentų vyrauja kaulinių kaulų DNR (5 pav.).Taip pat rasta vabzdžių ir kitų rūšių DNR fragmentų.Santykinai didelė dalis DNR fragmentų nebuvo identifikuoti, galbūt dėl ​​to, kad genominėse duomenų bazėse nėra daug jūrų rūšių, palyginti su sausumos rūšimis [49].
Šiame darbe mes taikome LB koncepciją midjoms, teigdami, kad hemolimfos ccfDNA šūvio sekos nustatymas gali suteikti informacijos apie jūrų pakrančių ekosistemų sudėtį.Visų pirma, mes nustatėme, kad 1) midijų hemolimfoje yra palyginti didelės koncentracijos (mikrogramų lygiai) santykinai didelių (~1-5 kb) cirkuliuojančių DNR fragmentų;2) šie DNR fragmentai yra ir nepriklausomi, ir nepriklausomi 3) Tarp svetimų šių DNR fragmentų šaltinių aptikome bakterijų, archeologinę ir virusinę DNR, taip pat kitų daugialąsčių gyvūnų DNR;4) Šių svetimų ccfDNR fragmentų kaupimasis hemolimfoje vyksta greitai ir prisideda prie vidinio midijų filtravimo aktyvumo.Apibendrinant, mūsų tyrimas parodo, kad LB, kuri iki šiol buvo taikoma daugiausia biomedicinos srityje, sąvoka koduoja turtingą, bet neištyrintą žinių šaltinį, kuris gali būti naudojamas geriau suprasti Sentinelio rūšių ir jų aplinkos sąveiką.
Be primatų, buvo pranešta apie ccfDNR išskyrimą žinduoliams, įskaitant peles, šunis, kates ir arklius [50, 51, 52].Tačiau, mūsų žiniomis, mūsų tyrimas yra pirmasis, kuriame pranešama apie ccfDNR aptikimą ir sekos nustatymą jūrų rūšyse su atviros cirkuliacijos sistema.Ši anatominė midijų savybė ir filtravimo gebėjimas bent iš dalies gali paaiškinti skirtingas cirkuliuojančių DNR fragmentų dydžio charakteristikas, palyginti su kitomis rūšimis.Žmonėms dauguma kraujyje cirkuliuojančių DNR fragmentų yra maži fragmentai, kurių dydis svyruoja nuo 150 iki 200 bp.Maksimali smailė 167 bp [34, 53].Nedidelė, bet reikšminga dalis DNR fragmentų yra nuo 300 iki 500 bp dydžio, o apie 5 % yra ilgesni nei 900 bp.[54].Šio dydžio pasiskirstymo priežastis yra ta, kad pagrindinis ccfDNR šaltinis plazmoje atsiranda dėl ląstelių mirties, dėl ląstelių mirties arba dėl cirkuliuojančių kraujodaros ląstelių nekrozės sveikiems asmenims arba dėl naviko ląstelių apoptozės vėžiu sergantiems pacientams (vadinamas cirkuliuojančio naviko DNR)., ctDNR).Hemolimfos ccfDNR dydžio pasiskirstymas, kurį radome midijose, svyravo nuo 1000 iki 5000 bp, o tai rodo, kad midijų ccfDNR kilmė yra kitokia.Tai logiška hipotezė, nes midijos turi pusiau atvirą kraujagyslių sistemą ir gyvena jūros vandens aplinkoje, kurioje yra didelė mikrobų genominės DNR koncentracija.Tiesą sakant, mūsų laboratoriniai eksperimentai, naudojant egzogeninę DNR, parodė, kad midijos kaupia DNR fragmentus jūros vandenyje, bent po kelių valandų jie suyra po ląstelių įsisavinimo ir (arba) išleidžiami ir (arba) saugomi įvairiose organizacijose.Atsižvelgiant į ląstelių (tiek prokariotinių, tiek eukariotinių) retumą, intravalvulinių skyrių naudojimas sumažins ccfDNR kiekį iš savo šaltinių ir iš užsienio šaltinių.Atsižvelgdami į dvigeldžių įgimto imuniteto svarbą ir didelį cirkuliuojančių fagocitų skaičių, toliau iškėlėme hipotezę, kad net svetima ccfDNR yra praturtinta cirkuliuojančiais fagocitais, kurie kaupia svetimą DNR prarijus mikroorganizmus ir (arba) ląstelių šiukšles.Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad dvigeldžių hemolimfos ccfDNA yra unikali molekulinės informacijos saugykla ir sustiprina jų, kaip kontrolinės rūšies, statusą.
Mūsų duomenys rodo, kad iš bakterijų gautų hemolimfos ccfDNR fragmentų seka ir analizė gali suteikti pagrindinės informacijos apie šeimininko bakterinę florą ir aplinkinėje jūrų ekosistemoje esančias bakterijas.Šūvio sekos nustatymo metodai atskleidė komensalinių bakterijų A. atra gill sekas, kurios būtų praleistos, jei būtų buvę naudojami įprasti 16S rRNR identifikavimo metodai, iš dalies dėl etaloninės bibliotekos paklaidos.Tiesą sakant, mūsų naudojimas LB duomenų, surinktų iš M. platensis tame pačiame midijų sluoksnyje Kerguelen, parodė, kad su žiaunomis susijusių bakterijų simbiontų sudėtis buvo vienoda abiejų midijų rūšims (S4 pav., Papildoma informacija).Šis dviejų genetiškai skirtingų midijų panašumas gali atspindėti bakterijų bendruomenių sudėtį šaltose, sieros ir vulkaninėse Kergueleno telkiniuose [55, 56, 57, 58].Aukštesnis sieros mažinančių mikroorganizmų kiekis buvo gerai aprašytas, kai surinktos midijos iš bioturbuotų pakrančių teritorijų [59], pavyzdžiui, Port-au-France pakrantė.Kita galimybė yra ta, kad midijų florą gali paveikti horizontalus perdavimas [60, 61].Reikia daugiau tyrimų, kad būtų galima nustatyti ryšį tarp jūros aplinkos, jūros dugno paviršiaus ir midijų simbiotinių bakterijų sudėties.Šie tyrimai šiuo metu vyksta.
Hemolimfos ccfDNR ilgis ir koncentracija, paprastas jos gryninimas ir aukšta kokybė, leidžianti greitai nustatyti šūvių seką, yra vieni iš daugelio privalumų, kuriuos naudojant midijų ccfDNA biologinei įvairovei įvertinti jūros pakrančių ekosistemose.Šis metodas yra ypač veiksmingas apibūdinti virusų bendruomenes (viromas) tam tikroje ekosistemoje [62, 63].Skirtingai nuo bakterijų, archajų ir eukariotų, virusų genomuose nėra filogenetiškai konservuotų genų, tokių kaip 16S sekos.Mūsų rezultatai rodo, kad skystos biopsijos iš indikatorinių rūšių, tokių kaip midijos, gali būti naudojamos santykinai daugybei ccfDNR viruso fragmentų, kurie, kaip žinoma, užkrečia šeimininkus, kurie paprastai gyvena pakrančių jūrų ekosistemose, nustatyti.Tai apima virusus, užkrečiančius pirmuonius, nariuotakojus, vabzdžius, augalus ir bakterinius virusus (pvz., bakteriofagus).Panašus pasiskirstymas buvo nustatytas, kai ištyrėme mėlynųjų midijų (M. platensis) hemolimfos ccfDNR viromą, surinktą tame pačiame midijų sluoksnyje Kerguelene (S2 lentelė, papildoma informacija).ccfDNR sekos nustatymas šautuvu iš tiesų yra naujas požiūris, įgaunantis pagreitį tiriant žmonių ar kitų rūšių virusą [21, 37, 64].Šis metodas yra ypač naudingas tiriant dvigrandžius DNR virusus, nes nė vienas genas nėra išsaugotas tarp visų dvigrandžių DNR virusų, atstovaujančių pačiai įvairiausiai ir plačiausiai Baltimorės virusų klasei [65].Nors dauguma šių virusų lieka neklasifikuoti ir gali apimti virusus iš visiškai nežinomos virusų pasaulio dalies [66], mes nustatėme, kad midijų A. atra ir M. platensis virusai ir šeimininkų diapazonai patenka tarp šių dviejų rūšių.panašiai (žr. S3 pav., papildoma informacija).Šis panašumas nestebina, nes jis gali atspindėti selektyvumo trūkumą aplinkoje esančios DNR įsisavinimui.Šiuo metu reikia atlikti būsimus tyrimus naudojant išgrynintą RNR, kad būtų galima apibūdinti RNR viromą.
Savo tyrime naudojome labai griežtą dujotiekį, pritaikytą iš Kowarskio ir kolegų darbo [37], kurie naudojo dviejų etapų sujungtų skaitymų ir kontigų ištrynimą prieš ir po gimtosios ccfDNR surinkimo, todėl buvo daug nesusijusių skaitymų.Todėl negalime atmesti galimybės, kad kai kurie iš šių nenurodytų skaitymų vis dar gali turėti savo kilmę, visų pirma todėl, kad neturime šios midijų rūšies etaloninio genomo.Mes taip pat naudojome šį dujotiekį, nes nerimavome dėl chimerų tarp savaiminio ir nesavarankiško skaitymo ir skaitymo ilgių, kuriuos sukuria Illumina MiSeq PE75.Kita daugumos neatrastų rodmenų priežastis yra ta, kad daugelis jūros mikrobų, ypač atokiose vietovėse, tokiose kaip Kerguelenas, nebuvo komentuoti.Mes naudojome Illumina MiSeq PE75, darydami prielaidą, kad ccfDNR fragmentų ilgiai yra panašūs į žmogaus ccfDNR.Būsimiems tyrimams, atsižvelgiant į mūsų rezultatus, rodančius, kad hemolimfos ccfDNR skaitymas yra ilgesnis nei žmonių ir (arba) žinduolių, rekomenduojame naudoti sekos nustatymo platformą, labiau tinkančią ilgesniems ccfDNR fragmentams.Ši praktika leis daug lengviau nustatyti daugiau gilesnės analizės požymių.Gauti šiuo metu neprieinamą A. atRA branduolinio genomo seką taip pat labai palengvintų CCFDNR diskriminaciją nuo savęs ir ne savęs šaltinių.Atsižvelgiant į tai, kad mūsų tyrimas sutelkė dėmesį į galimybę pritaikyti skystos biopsijos koncepciją midijoms, tikimės, kad kadangi ši koncepcija bus naudojama būsimuose tyrimuose, bus sukurtos naujos priemonės ir vamzdynai, siekiant padidinti šio metodo potencialą tiriant midijų mikrobų įvairovę.jūrų ekosistema.
Kaip neinvazinis klinikinis biomarkeris, padidėjęs ccfDNR kiekis žmogaus plazmoje yra susijęs su įvairiomis ligomis, audinių pažeidimais ir stresinėmis sąlygomis [67, 68, 69].Šis padidėjimas yra susijęs su savos kilmės DNR fragmentų išsiskyrimu po audinių pažeidimo.Šią problemą išsprendėme naudodami ūmų karščio stresą, kai midijos buvo trumpam veikiamos 30 °C temperatūros.Šią analizę atlikome su trimis skirtingų tipų midijomis trijuose nepriklausomuose eksperimentuose.Tačiau mes neradome jokių ccfDNR lygio pokyčių po ūminio karščio streso (žr. S5 paveikslą, papildoma informacija).Šis atradimas bent iš dalies gali paaiškinti faktą, kad midijos turi pusiau atvirą kraujotakos sistemą ir dėl didelio filtravimo aktyvumo kaupia daug svetimos DNR.Kita vertus, midijos, kaip ir daugelis bestuburių, gali būti atsparesnės streso sukeltam audinių pažeidimui, taip apribodamos ccfDNR išsiskyrimą jų hemolimfoje [70, 71].
Iki šiol vandens ekosistemų biologinės įvairovės DNR analizė daugiausia buvo skirta aplinkos DNR (eDNA) metabarkodavimui.Tačiau šis metodas paprastai yra ribotas atliekant biologinės įvairovės analizę, kai naudojami pradmenys.Šratų sekos naudojimas apeina PGR apribojimus ir šališką pradmenų rinkinių pasirinkimą.Taigi tam tikra prasme mūsų metodas yra artimesnis neseniai naudotam didelio našumo eDNA Shotgun sekos nustatymo metodui, kuris gali tiesiogiai sekti fragmentuotą DNR ir analizuoti beveik visus organizmus [72, 73].Tačiau yra keletas esminių problemų, kurios skiria LB nuo standartinių eDNA metodų.Žinoma, pagrindinis skirtumas tarp eDNA ir LB yra natūralių filtrų šeimininkų naudojimas.Buvo pranešta apie jūrinių rūšių, tokių kaip kempinės ir dvigeldžiai (Dresseina spp.), naudojimas kaip natūralus filtras tiriant eDNR [74, 75].Tačiau Dreisenos tyrime buvo naudojamos audinių biopsijos, iš kurių buvo išskirta DNR.CCFDNR analizei iš LB nereikia audinių biopsijos, specializuotos ir kartais brangios įrangos ir logistikos, susijusios su EDNA ar audinių biopsija.Tiesą sakant, neseniai pranešėme, kad CCFDNR iš LB gali būti saugoma ir išanalizuota naudojant FPS palaikymą, neišlaikant šaltos grandinės, o tai yra pagrindinis iššūkis atliekant tyrimus atokiose vietose [76].ccfDNR ekstrahavimas iš skystų biopsijų taip pat yra paprastas ir suteikia aukštos kokybės DNR šautuvų sekos nustatymui ir PGR analizei.Tai yra didelis pranašumas, atsižvelgiant į kai kuriuos techninius apribojimus, susijusius su eDNR analize [77].Mėginių ėmimo metodo paprastumas ir maža kaina taip pat ypač tinka ilgalaikėms stebėsenos programoms.Be jų didelio filtravimo gebėjimo, dar viena gerai žinoma dvigeldžių bruožas yra jų gleivių cheminė gleivinės kompozicija, skatinanti virusų absorbciją [78, 79].Dėl to dvigeldžiai yra idealus natūralus filtras, apibūdinantis biologinę įvairovę ir klimato kaitos poveikį tam tikroje vandens ekosistemoje.Nors iš šeimininko išvestų DNR fragmentų gali būti vertinamas kaip metodo apribojimas, palyginti su EDNA, išlaidos, susijusios su tokiu natūralia ccfDNR, palyginti su EDNA, yra vienu metu suprantama dėl didžiulės informacijos apie sveikatos tyrimams.kompensuoti šeimininką.Tai apima virusų sekų, integruotų į šeimininko genomą, buvimą.Tai ypač svarbu midijose, atsižvelgiant į horizontaliai plintančių leukeminių retrovirusų buvimą dvigeldžiuose gyvūnuose [80, 81].Kitas LB pranašumas, palyginti su EDNA, yra tas, kad jis išnaudoja hemolimfos cirkuliuojančių kraujo ląstelių fagocitinį aktyvumą, apimantį mikroorganizmus (ir jų genomus).Fagocitozė yra pagrindinė dvigeldžių kraujo ląstelių funkcija [82].Galiausiai, taikant metodą išnaudojamas didelis midijų filtravimo pajėgumas (vidutiniškai 1,5 l/h jūros vandens) ir dviejų dienų cirkuliacija, dėl kurių padidėja skirtingų jūros vandens sluoksnių maišymasis, leidžiantis užfiksuoti heterologinę eDNR.[83, 84].Taigi, midijų ccfDNA analizė yra įdomus būdas, atsižvelgiant į midijų poveikį mitybai, ekonominiam ir aplinkai.Panašiai kaip iš žmonių surinktų LB analizės, šis metodas taip pat atveria galimybę išmatuoti genetinius ir epigenetinius šeimininko DNR pokyčius reaguojant į išorines medžiagas.Pvz., Trečiosios kartos sekos nustatymo technologijos gali būti numatytos atliekant visos genomo metilinimo analizę natūralioje ccfDNR, naudojant nanoporų seką.Šį procesą turėtų palengvinti faktas, kad midijų ccfDNR fragmentų ilgis yra idealiai suderinamas su ilgai skaitomos sekos platformomis, leidžiančiomis genomo visos DNR metilinimo analizę atlikti iš vieno sekos nustatymo, nereikia cheminių transformacijų.Todėl tai gali suteikti vertingos įžvalgos apie pagrindinius mechanizmus, reglamentuojančius reagavimą po klimato pokyčių ar teršalų [87].Tačiau LB naudojimas nėra be apribojimų.Nereikia nė sakyti, kad tam reikia, kad ekosistemoje būtų indikatorinių rūšių.Kaip minėta aukščiau, naudojant LB tam tikros ekosistemos biologinei įvairovei įvertinti, taip pat reikia griežto bioinformatikos vamzdyno, kuriame atsižvelgiama į DNR fragmentų buvimą iš šaltinio.Kita didelė problema yra etaloninių jūrų rūšių genomų prieinamumas.Tikimasi, kad tokios iniciatyvos kaip Jūrų žinduolių genomų projektas ir neseniai įsteigtas Fish10k projektas [88] palengvins tokią analizę ateityje.LB koncepcijos taikymas jūriniams filtrais maitinamiems organizmams taip pat suderinamas su naujausiais sekos nustatymo technologijos pasiekimais, todėl jis puikiai tinka kelių omų biomarkerių kūrimui, siekiant teikti svarbią informaciją apie jūros buveinių sveikatą reaguojant į aplinkos stresą.
Genomo sekos nustatymo duomenys buvo saugomi NCBI sekos skaitymo archyve https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pagal Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimato kaitos poveikis jūrų gyvybei ir ekosistemoms.Cole'o biologija.2009 m.;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S ir kt.Apsvarstykite bendrą klimato kaitos ir kitų vietinių stresinių veiksnių poveikį jūrų aplinkai.bendra mokslinė aplinka.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P ir kt.).Kovo pirmosios mokslas.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Sumažėjęs karščio toleravimas pasikartojančio karščio streso sąlygomis paaiškina didelį mėlynųjų midijų mirtingumą vasarą.2019 m. Mokslinė ataskaita;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER ir kt.Naujausi gyvūnų žūties dažnio, priežasčių ir masto pokyčiai.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S ir kt.Masinį Pinna nobilis mirtį galėjo sukelti keli nespecifiniai patogenai.Gyvenimas.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Galimas klimato kaitos poveikis Arkties zoonozinėms ligoms.Int J Circumpolar Health.2005 m.;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ir kt.Mėlynosios midijos (Mytilus edulis spp.) kaip signaliniai organizmai pakrančių taršos monitoringe: apžvalga.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Skystos biopsijos integravimas gydant vėžį.Nat Rev Clean Oncol.2017 m.;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C ir kt.Skystos biopsijos brandinimas: leidžia cirkuliuoti naviko DNR.Nat Rev vėžys.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleino rūgštys žmogaus plazmoje.SOC BIOL dukterinių įmonių susitikimo protokolas.1948 m.;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Naujas DNR be ląstelių vaidmuo kaip molekulinis vėžio gydymo žymeklis.Biomolinės analizės kiekybinis įvertinimas.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Skystoji biopsija patenka į kliniką – įgyvendinimo problemos ir ateities iššūkiai.Nat Rev Clin Oncol.2021 m.;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ir kt.Vaisiaus DNR yra motinos plazmoje ir serume.Lancetas.1997 m.;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Nėštumo eigos ir jo komplikacijų tyrimas naudojant cirkuliuojančią tarpląstelinę RNR moterų kraujyje nėštumo metu.Dopediatrija.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J ir kt.Skysta biopsija: donoro ląstelių neturinti DNR naudojama alogeniniams inkstų transplantato pažeidimams aptikti.Nat Rev Nephrol.2021 m.;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Prenatalinės diagnostikos naujovės: motinos plazmos genomo sekos nustatymas.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D ir kt.Greitas patogenų aptikimas naudojant naujos kartos metagenominę užkrėstų kūno skysčių seką.Nat Medicina.2021;27:115-24.