Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Paukščių vaisingumas priklauso nuo jų gebėjimo ilgą laiką laikyti pakankamai gyvybingų spermatozoidų spermos saugojimo kanalėliuose (SST).Tikslus mechanizmas, kuriuo spermatozoidai patenka, gyvena ir palieka SST, išlieka prieštaringi.Sharkasi vištų spermatozoidai turėjo didelį polinkį į agliutinaciją, sudarydami judrius siūlinius ryšulius, kuriuose yra daug ląstelių.Kadangi buvo sunku stebėti spermatozoidų judrumą ir elgseną nepermatomame kiaušintakyje, spermatozoidų agliutinacijai ir judrumui tirti panaudojome mikrofluidinį prietaisą, kurio mikrokanalo skerspjūvis panašus į spermatozoidų skerspjūvį.Šiame tyrime aptariama, kaip susidaro spermatozoidų ryšuliai, kaip jie juda ir galimas jų vaidmuo pratęsiant spermatozoidų buvimo vietą SST.Mes ištyrėme spermatozoidų greitį ir reologinį elgesį, kai skysčio srautas buvo sukurtas mikrofluidiniame kanale hidrostatiniu slėgiu (tėkmės greitis = 33 µm/s).Spermatozoidai linkę plaukti prieš srovę (teigiama reologija), o spermatozoidų pluošto greitis žymiai sumažėja, palyginti su pavieniais spermatozoidais.Pastebėta, kad spermatozoidų ryšuliai juda spirale ir ilgėja bei storėja, nes prisirenka daugiau pavienių spermatozoidų. Pastebėta, kad spermatozoidų ryšuliai artėja prie mikroskysčių kanalų šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad būtų išvengta jų nuvalymo, kai skysčio srauto greitis > 33 µm/s. Pastebėta, kad spermatozoidų ryšuliai artėja prie mikroskysčių kanalų šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad būtų išvengta jų nuvalymo, kai skysčio srauto greitis > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюикачх, икрофлюикачено сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Pastebėta, kad spermatozoidų ryšuliai artėja prie mikroskysčių kanalų šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad būtų išvengta nušlavimo, kai skysčio srauto greitis >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 流µm/s> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного, тания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Pastebėta, kad spermatozoidų ryšuliai artėja prie mikrofluidinio kanalo šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad būtų išvengta skysčio srauto, kurio greitis >33 µm/s, nuplaunamas.Skenavimo ir perdavimo elektronų mikroskopija atskleidė, kad spermatozoidų ryšulius palaiko gausi tanki medžiaga.Gauti duomenys rodo unikalų Šarkazi vištienos spermatozoidų mobilumą, taip pat spermatozoidų gebėjimą agliutinuotis ir formuoti judrius ryšulius, o tai padeda geriau suprasti ilgalaikį spermatozoidų saugojimą SMT.
Kad žmonės ir dauguma gyvūnų būtų apvaisinti, sperma ir kiaušialąstės turi patekti į apvaisinimo vietą tinkamu laiku.Todėl poravimasis turi įvykti prieš ovuliaciją arba jos metu.Kita vertus, kai kurie žinduoliai, pavyzdžiui, šunys, taip pat ne žinduolių rūšys, pavyzdžiui, vabzdžiai, žuvys, ropliai ir paukščiai, ilgą laiką laiko spermą savo dauginimosi organuose, kol jų kiaušinėliai bus paruošti apvaisinti (asinchroninis apvaisinimas 1 ).Paukščiai gali išlaikyti spermatozoidų, galinčių apvaisinti kiaušinėlius, gyvybingumą 2–10 savaičių2.
Tai unikali savybė, išskirianti paukščius iš kitų gyvūnų, nes užtikrina didelę apvaisinimo tikimybę po vienkartinio apvaisinimo kelias savaites be tuo pačiu metu poravimosi ir ovuliacijos.Pagrindinis spermos saugojimo organas, vadinamas spermos saugojimo kanalėliu (SST), yra vidinėse gleivinės raukšlėse gimdos vaginalinėje jungtyje.Iki šiol mechanizmai, kuriais spermatozoidai patenka į spermos banką, gyvena ir išeina iš jo, nėra visiškai suprantami.Remiantis ankstesniais tyrimais, buvo iškelta daug hipotezių, tačiau nė viena iš jų nepasitvirtino.
Forman4 iškėlė hipotezę, kad spermatozoidai išlaiko savo gyvenamąją vietą SST ertmėje per nuolatinį svyruojantį judėjimą prieš skysčio srauto kryptį baltymų kanalais, esančiais ant SST epitelio ląstelių (reologija).ATP yra išeikvotas dėl nuolatinio žiuželių aktyvumo, reikalingo spermatozoidams išlaikyti SST spindyje, o judrumas ilgainiui mažėja, kol spermatozoidai skysčio srautu išnešami iš spermos banko ir pradeda naują kelionę žemyn kylančiu kiaušintakiu apvaisinti spermą.Kiaušinis (Forman4).Šį spermos saugojimo modelį patvirtina SST epitelio ląstelėse esančių 2, 3 ir 9 akvaporinų aptikimas imunocitochemijos būdu.Iki šiol trūksta viščiukų spermos reologijos ir jos vaidmens SST saugojimo, makšties spermos atrankos ir spermos konkurencijos tyrimų.Viščiukams spermatozoidai patenka į makštį po natūralaus poravimosi, tačiau daugiau nei 80 % spermatozoidų išstumiami iš makšties netrukus po poravimosi.Tai rodo, kad makštis yra pagrindinė paukščių spermos atrankos vieta.Be to, buvo pranešta, kad mažiau nei 1% spermatozoidų, apvaisintų makštyje, patenka į SST2.Dirbtinai apvaisinant jauniklius makštyje, spermatozoidų, pasiekiančių SST, skaičius paprastai didėja praėjus 24 valandoms po apvaisinimo.Kol kas spermos atrankos mechanizmas šio proceso metu yra neaiškus, o spermatozoidų judrumas gali atlikti svarbų vaidmenį SST spermatozoidų įsisavinimui.Dėl storų ir nepermatomų kiaušintakių sienelių sunku tiesiogiai stebėti spermatozoidų judrumą paukščių kiaušintakiuose.Todėl mums trūksta pagrindinių žinių apie tai, kaip spermatozoidai pereina į SST po apvaisinimo.
Neseniai reologija buvo pripažinta svarbiu veiksniu, kontroliuojančiu spermos transportavimą žinduolių lytiniuose organuose.Remdamiesi judrių spermatozoidų gebėjimu migruoti priešinga srove, Zaferani ir kt.8 naudojo corra mikrofluidinę sistemą, kad pasyviai izoliuotų judrius spermatozoidus iš užpiltų spermos mėginių.Šio tipo spermos rūšiavimas yra būtinas medicininiam nevaisingumo gydymui ir klinikiniams tyrimams, ir yra teikiama pirmenybė tradiciniams metodams, kurie reikalauja daug laiko ir darbo bei gali pakenkti spermos morfologijai ir struktūriniam vientisumui.Tačiau iki šiol nebuvo atlikta jokių tyrimų, kaip išskyros iš viščiukų lytinių organų veikia spermatozoidų judrumą.
Nepriklausomai nuo mechanizmo, kuriuo SST saugomi spermatozoidai, daugelis tyrėjų pastebėjo, kad viščiukų 9, 10, putpelių 2 ir kalakutų 11 SST reziduojantys spermatozoidai agliutinuojasi viena nuo kitos, sudarydami agliutinuotus spermatozoidų pluoštus.Autoriai teigia, kad yra ryšys tarp šios agliutinacijos ir ilgalaikio spermatozoidų saugojimo SST.
Tingari ir Lake12 pranešė apie tvirtą ryšį tarp spermatozoidų viščiuko liaukoje, priimančioje spermą, ir suabejojo, ar paukščių spermatozoidai agliutinuojasi taip pat, kaip žinduolių spermatozoidai.Jie mano, kad gilūs ryšiai tarp spermatozoidų kraujagyslėse gali atsirasti dėl streso, kurį sukelia didelis spermatozoidų skaičius mažoje erdvėje.
Vertinant spermatozoidų elgesį ant šviežių kabančių stiklelių, galima pastebėti laikinus agliutinacijos požymius, ypač spermos lašelių kraštuose.Tačiau agliutinaciją dažnai sutrikdė sukimosi veiksmas, susijęs su nuolatiniu judėjimu, o tai paaiškina trumpalaikį šio reiškinio pobūdį.Tyrėjai taip pat pastebėjo, kad į spermą įpylus skiediklio, atsirado pailgos „į siūlą panašios“ ląstelių sankaupos.
Ankstyvieji bandymai imituoti spermatozoidus buvo atlikti nuo kabančio lašo nuėmus ploną vielą, dėl kurios iš spermos lašo išsikišo pailgos į spermą panaši pūslelė.Spermatozoidai iškart išsidėstė lygiagrečiai pūslelės viduje, tačiau visas vienetas greitai išnyko dėl 3D apribojimo.Todėl norint ištirti spermatozoidų agliutinaciją, būtina stebėti spermatozoidų judrumą ir elgesį tiesiogiai izoliuotuose spermos kaupimo kanalėliuose, o tai sunkiai pasiekiama.Todėl būtina sukurti instrumentą, kuris imituotų spermatozoidus, kad būtų paremti spermatozoidų judrumo ir agliutinacijos elgesio tyrimai.Brillard ir kt.13 pranešė, kad vidutinis suaugusių viščiukų spermos laikymo kanalėlių ilgis yra 400–600 µm, tačiau kai kurie SST gali siekti 2000 µm.Mero ir Ogasawara14 padalijo sėklines liaukas į padidintus ir nepadidėjusius spermos saugojimo kanalėlius, kurių abiejų ilgis (~ 500 µm) ir kaklo plotis (~ 38 µm), tačiau vidutinis kanalėlių liumenų skersmuo buvo 56, 6 ir 56, 6 µm.., atitinkamai 11,2 μm.Šiame tyrime naudojome mikrofluidinį įrenginį, kurio kanalo dydis yra 200 µm × 20 µm (W × H), kurio skerspjūvis yra šiek tiek artimas sustiprinto SST skerspjūviui.Be to, ištyrėme spermatozoidų judrumą ir agliutinacijos elgesį tekančiame skystyje, o tai atitinka Foremano hipotezę, kad SST epitelio ląstelių gaminamas skystis išlaiko spermą spindyje priešinga (reologine) kryptimi.
Šio tyrimo tikslas – įveikti spermatozoidų judrumo kiaušintakyje stebėjimo problemas ir išvengti sunkumų tiriant spermatozoidų reologiją ir elgseną dinamiškoje aplinkoje.Naudotas mikrofluidinis prietaisas, sukuriantis hidrostatinį slėgį, kad imituotų spermatozoidų judrumą vištos genitalijose.
Kai į mikrokanalinį įrenginį buvo įlašinamas lašelis praskiesto spermos mėginio (1:40), buvo galima nustatyti dviejų tipų spermatozoidų judrumą (izoliuotą spermą ir surištą spermą).Be to, spermatozoidai buvo linkę plaukti prieš srovę (teigiama reologija; 1, 2 vaizdo įrašai). Nors spermatozoidų ryšulių greitis buvo mažesnis nei vienišų spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino spermatozoidų, kurių reotaksė buvo teigiama, procentą (p < 0,001; 2 lentelė). Nors spermatozoidų ryšulių greitis buvo mažesnis nei vienišų spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino spermatozoidų, kurių reotaksė buvo teigiama, procentą (p < 0,001; 2 lentelė). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001 валончевидов), рматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Nors spermatozoidų pluoštų greitis buvo mažesnis nei pavienių spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino spermatozoidų, kuriems nustatyta teigiama reotaksė, procentą (p < 0,001; 2 lentelė).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们筐筞加了昁昧羵逳加了显羵分比 (p < 0,001；表2）).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001）分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они уверматозоидов они уверматозоидов в с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Nors spermatozoidų pluoštų greitis buvo mažesnis nei pavienių spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino teigiamos reologijos spermatozoidų procentą (p < 0,001; 2 lentelė).Apskaičiuota, kad pavienių spermatozoidų ir kuokštelių teigiama reologija yra atitinkamai maždaug 53 % ir 85 %.
Pastebėta, kad sharkasi viščiukų spermatozoidai iškart po ejakuliacijos sudaro linijinius ryšulius, susidedančius iš dešimčių individų.Laikui bėgant šie kuokšteliai ilgėja ir storėja ir gali išlikti in vitro kelias valandas, kol išsisklaidys (3 vaizdo įrašas).Šie siūliniai ryšuliai yra echidnos spermatozoidų formos, susidarančios prielipo gale.Nustatyta, kad Sharkashi vištų sperma turi didelį polinkį agliutinuotis ir suformuoti tinklinį pluoštą greičiau nei per minutę po surinkimo.Šios sijos yra dinamiškos ir gali prilipti prie bet kokių netoliese esančių sienų ar statinių objektų.Nors spermatozoidų ryšuliai mažina spermatozoidų greitį, akivaizdu, kad makroskopiškai jie padidina jų tiesiškumą.Ryšulių ilgis skiriasi priklausomai nuo į ryšulius surinktų spermatozoidų skaičiaus.Išskirtos dvi ryšulio dalys: pradinė dalis, įskaitant laisvą agliutinuoto spermatozoidų galvutę, ir galinė dalis, įskaitant uodegą ir visą distalinį spermos galą.Naudojant didelės spartos kamerą (950 kadrų per sekundę), pradinėje pluošto dalyje buvo stebimos laisvos agliutinuotų spermatozoidų galvutės, atsakingos už ryšulio judėjimą dėl savo svyruojančio judesio, likusias spiraliniu judesiu tempiant į ryšulį (4 vaizdo įrašas).Tačiau buvo pastebėta, kad ilguose kuokšteliuose kai kurios laisvos spermatozoidų galvutės, prilipusios prie kūno, o galinė kuokšto dalis veikia kaip mentelės, padedančios kuokštelį varyti.
Lėtai tekant skysčiui spermatozoidų ryšuliai juda lygiagrečiai vienas kitam, tačiau pradeda persidengti ir prilimpa prie visko, kas stovi, kad, didėjant srauto greičiui, nenuplautų srovės srautas.Ryšuliai susidaro, kai sauja spermatozoidų artėja viena prie kitos, jos pradeda sinchroniškai judėti ir apsivynioti viena aplink kitą, o tada prilimpa prie lipnios medžiagos.1 ir 2 paveiksluose parodyta, kaip spermatozoidai artėja vienas prie kito, sudarydami sandūrą, kai uodegos apsivynioja viena aplink kitą.
Tyrėjai taikė hidrostatinį slėgį, kad sukurtų skysčio srautą mikrokanaluose, kad ištirtų spermos reologiją.Buvo naudojamas 200 µm × 20 µm (W × H) ir 3, 6 µm ilgio mikrokanalas.Tarp talpyklų naudokite mikrokanalus, kurių galuose sumontuoti švirkštai.Kad kanalai būtų geriau matomi, buvo naudojami maistiniai dažai.
Pritvirtinkite jungiamuosius laidus ir priedus prie sienos.Vaizdo įrašas darytas fazinio kontrasto mikroskopu.Su kiekvienu vaizdu pateikiami fazinio kontrasto mikroskopijos ir kartografavimo vaizdai.(A) Jungtis tarp dviejų srautų priešinasi srautui dėl spiralinio judėjimo (raudona rodyklė).(B) Jungtis tarp vamzdžio pluošto ir kanalo sienelės (raudonos rodyklės), tuo pačiu metu jie yra prijungti prie dviejų kitų ryšulių (geltonos rodyklės).(C) Spermos ryšuliai mikrofluidiniame kanale pradeda jungtis vienas su kitu (raudonos rodyklės), sudarydami spermatozoidų ryšulių tinklelį.(D) Spermos ryšulių tinklo susidarymas.
Kai į mikrofluidinį prietaisą buvo įlašinamas lašelis praskiestos spermos ir sukuriamas srautas, buvo pastebėta, kad spermos spindulys juda prieš srauto kryptį.Ryšuliai tvirtai priglunda prie mikrokanalų sienelių, o laisvos galvutės pradinėje ryšulių dalyje tvirtai priglunda prie jų (5 vaizdo įrašas).Jie taip pat prilimpa prie bet kokių nejudančių dalelių savo kelyje, pavyzdžiui, šiukšlių, kad neatsispirtų srovės nunešimui.Laikui bėgant šie kuokšteliai tampa ilgais siūlais, sulaikončiais kitus pavienius spermatozoidus ir trumpesnius kuokštelius (6 vaizdo įrašas).Kai srautas pradeda lėtėti, ilgos spermatozoidų linijos pradeda formuoti spermos linijų tinklą (7 vaizdo įrašas; 2 pav.).
Esant dideliam srauto greičiui (V > 33 µm/s), gijų spiraliniai judesiai padidėja, siekiant sugauti daug atskirų spermatozoidų formuojančių ryšulių, kurie geriau atsispirtų dreifuojančiai srauto jėgai. Esant dideliam srauto greičiui (V > 33 µm/s), gijų spiraliniai judesiai padidėja, siekiant sugauti daug atskirų spermatozoidų formuojančių ryšulių, kurie geriau atsispirtų dreifuojančiai srauto jėgai. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытепныйтся х сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Esant dideliam srauto greičiui (V > 33 µm/s), sruogų spiraliniai judesiai didėja, nes jos bando sugauti daug atskirų spermatozoidų, formuojančių ryšulius, kurie geriau atsispiria dreifuojančiai srauto jėgai.在高流速(V > 33 μm/s)好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 训 弚 形成 束 束更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватеть попытке захватить зоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Esant dideliam srauto greičiui (V > 33 µm/s), gijų spiralinis judėjimas didėja, bandant užfiksuoti daug atskirų spermatozoidų, formuojančių ryšulius, kad geriau atsispirtų srauto dreifo jėgoms.Jie taip pat bandė pritvirtinti mikrokanalus prie šoninių sienelių.
Naudojant šviesos mikroskopiją (LM), spermatozoidų ryšuliai buvo identifikuoti kaip spermatozoidų galvų ir susisukusių uodegų sankaupos.Spermos ryšuliai su įvairiais agregatais taip pat buvo identifikuoti kaip susuktos galvutės ir žvynelių agregatai, kelios susiliejusios spermatozoidų uodegos, spermatozoidų galvutės, pritvirtintos prie uodegos, ir spermatozoidų galvutės su sulenktais branduoliais kaip keli susilieję branduoliai.perdavimo elektronų mikroskopija (TEM).Skenuojanti elektroninė mikroskopija (SEM) parodė, kad spermatozoidų ryšuliai buvo padengti spermatozoidų galvučių agregatais, o spermatozoidų agregatai parodė pritvirtintą apvyniotų uodegų tinklą.
Spermatozoidų morfologija ir ultrastruktūra, spermatozoidų ryšulių susidarymas buvo tiriamas naudojant šviesos mikroskopiją (puspjūvis), skenuojančią elektroninę mikroskopiją (SEM) ir transmisijos elektronų mikroskopiją (TEM), spermatozoidų tepinėliai nudažyti akridino oranžine spalva ir ištirti naudojant epifluorescencinę mikroskopiją.
Spermos tepinėlio dažymas akridino apelsinu (3B pav.) parodė, kad spermatozoidų galvutės buvo sulipusios ir padengtos sekrecine medžiaga, todėl susidarė dideli kuokšteliai (3D pav.).Spermos ryšulius sudarė spermatozoidų agregatai su prijungtų uodegų tinklu (4A-C pav.).Spermos ryšuliai sudaryti iš daugelio kartu sulipusių spermatozoidų uodegų (4D pav.).Paslaptys (4E,F pav.) apėmė spermatozoidų ryšulių galvas.
Spermatozoidų pluošto susidarymas Naudojant fazinio kontrasto mikroskopiją ir akridino apelsinu nudažytus spermatozoidų tepinėlius, nustatyta, kad spermatozoidų galvutės sulimpa.(A) Ankstyvas spermatozoidų kuokštelio formavimasis prasideda nuo spermos (balto apskritimo) ir trijų spermatozoidų (geltono apskritimo), o spiralė prasideda nuo uodegos ir baigiasi galvoje.(B) Akridino oranžine spalva nudažyto spermos tepinėlio mikrofotografija, kurioje matyti prilipusios spermos galvutės (rodyklės).Išskyros apima galvą (-es).Didinimas × 1000. (C) Didelio pluošto, perduodamo srautu mikroskysčių kanale, išvystymas (naudojant didelės spartos kamerą 950 kadrų per sekundę greičiu).(D) Akridino oranžine spalva nudažyto spermos tepinėlio mikrografija, kurioje matyti dideli kuokšteliai (rodyklės).Padidinimas: × 200.
Spermatozoidų pluošto ir spermos tepinėlio, nudažyto akridino oranžine spalva, skenuojanti elektroninė mikrografija.(A, B, D, E) yra spermatozoidų skaitmeninės spalvotos nuskaitymo elektroninės mikrografijos, o C ir F yra akridino oranžine spalva dažytų spermatozoidų tepinėlių mikrografijos, kuriose matyti, kad daug spermatozoidų, apvyniojančių uodegą, yra pritvirtinti.(AC) Spermos agregatai rodomi kaip pritvirtintų uodegų (rodyklių) tinklas.(D) Kelių spermatozoidų (su lipnia medžiaga, rausvu kontūru, rodykle) sukibimas, apsivyniojęs aplink uodegą.(E ir F) Spermos galvučių agregatai (rodikliai), padengti lipnia medžiaga (rodikliais).Spermatozoidai sudarė ryšulius su keliomis į sūkurį panašiomis struktūromis (F).(C) × 400 ir (F) × 200 padidinimai.
Naudodami perdavimo elektronų mikroskopiją nustatėme, kad spermatozoidų ryšuliai buvo pritvirtinti prie uodegų (6A, C pav.), prie uodegų pritvirtintos galvutės (6B pav.) arba prie uodegų pritvirtintos galvutės (6D pav.).Spermatozoidų galvutės ryšulyje yra išlenktos, jų pjūvyje yra dvi branduolio sritys (6D pav.).Pjūvio pluošte spermatozoidai turėjo susisukusią galvą su dviem branduolio sritimis ir daugybe žvynelių (5A pav.).
Skaitmeninė spalvota elektroninė mikrografija, kurioje matyti spermatozoidų pluošte esančios jungiamosios uodegėlės ir spermatozoidų galvutes jungianti agliutinuojanti medžiaga.(A) Pritvirtinta daugybės spermatozoidų uodega.Atkreipkite dėmesį, kaip uodega atrodo vertikalioje (rodyklės) ir kraštovaizdžio (rodyklės) projekcijoje.(B) Spermos galva (rodyklė) yra sujungta su uodega (rodyklė).(C) Pritvirtintos kelios spermatozoidų uodegos (rodyklės).(D) Agliutinacijos medžiaga (AS, mėlyna) jungia keturias spermatozoidų galvas (violetinė).
Nuskaitymo elektronų mikroskopija buvo naudojama spermatozoidų galvoms aptikti spermatozoidų pluoštuose, padengtuose išskyromis arba membranomis (6B pav.), o tai rodo, kad spermatozoidų pluoštai buvo pritvirtinti prie tarpląstelinės medžiagos.Agliutinuota medžiaga buvo sukoncentruota spermatozoidų galvutėje (medūzos galvutės pavidalo mazgas; 5B pav.) ir išsiplėtė distaliai, todėl fluorescencinės mikroskopijos metu, nudažyta akridino oranžine spalva, ji buvo ryškiai geltona (6C pav.).Ši medžiaga aiškiai matoma skenuojančiu mikroskopu ir laikoma rišikliu.Pusiau ploni pjūviai (5C pav.) ir spermos tepinėliai, nudažyti akridino oranžine spalva, parodė spermatozoidų ryšulius su tankiai supakuotomis galvutėmis ir riestomis uodegomis (5D pav.).
Įvairios mikrofotografijos, kuriose įvairiais metodais matyti spermatozoidų galvų ir sulenktų uodegų agregacija.(A) Spermatozoidų pluošto skerspjūvio skaitmeninė spalvų perdavimo elektroninė mikrografija, kurioje matyti susukta spermatozoidų galvutė su dviejų dalių branduoliu (mėlyna) ir keliomis žvynelių dalimis (žalia).(B) Skaitmeninis spalvotas nuskaitomas elektronų mikrografas, kuriame matyti į medūzą panašių spermatozoidų galvų (rodyklės), kurios atrodo uždengtos, sankaupa.(C) Pusiau plona pjūvis, kuriame pavaizduotos suvestos spermatozoidų galvutės (rodyklės) ir riestos uodegos (rodyklės).(D) Akridino oranžine spalva nudažyto spermatozoidų tepinėlio mikrografija, kurioje matyti spermatozoidų galvučių agregatai (rodyklės) ir riestos prilipusios uodegos (rodyklės).Atkreipkite dėmesį, kad spermatozoido galvutę dengia lipni medžiaga (S).(D) × 1000 padidinimas.
Taikant transmisijos elektronų mikroskopiją (7A pav.), taip pat buvo pastebėta, kad spermatozoidų galvutės buvo susisukusios, o branduoliai buvo spiralės formos, ką patvirtina spermatozoidų tepinėliai, nudažyti akridino oranžine spalva ir ištirti naudojant fluorescencinę mikroskopiją (7B pav.).
(A) Skaitmeninė spalvų perdavimo elektroninė mikrografija ir (B) Akridinu oranžine spalva nudažytas spermatozoidų tepinėlis, kuriame matyti susisukusios galvutės ir spermatozoidų galvučių bei uodegų pritvirtinimas (rodyklės).(B) × 1000 padidinimas.
Įdomus atradimas yra tas, kad Sharkazi sperma agreguojasi ir sudaro judrius siūlinius ryšulius.Šių ryšulių savybės leidžia suprasti galimą jų vaidmenį absorbuojant ir saugant spermatozoidus SST.
Po poravimosi spermatozoidai patenka į makštį ir intensyviai atrenkami, todėl į SST15,16 patenka tik ribotas spermatozoidų skaičius.Iki šiol mechanizmai, kuriais spermatozoidai patenka ir išeina iš SST, yra neaiškūs.Naminių paukščių spermatozoidai SST laikomi ilgą laiką nuo 2 iki 10 savaičių, priklausomai nuo rūšies6.Ginčai išlieka dėl spermos būklės saugojimo SST metu.Ar jie juda ar ilsisi?Kitaip tariant, kaip spermos ląstelės taip ilgai išlaiko savo poziciją SST?
Forman4 teigė, kad SST buvimo vietą ir išstūmimą galima paaiškinti spermatozoidų judrumu.Autoriai iškelia hipotezę, kad spermatozoidai išlaiko savo padėtį plaukdami prieš SST epitelio sukurtą skysčio srautą ir kad spermatozoidai iš SST išmetami, kai jų greitis nukrenta žemiau taško, kuriame jie pradeda judėti atgal dėl energijos trūkumo.Zaniboni5 patvirtino, kad SST epitelio ląstelių viršūninėje dalyje yra 2, 3 ir 9 akvaporinų, kurie gali netiesiogiai palaikyti Foremano spermos saugojimo modelį.Dabartiniame tyrime nustatėme, kad beveik pusės Sharkashi spermatozoidų tekančiame skystyje yra teigiama reologija ir kad agliutinuoti spermatozoidų pluoštai padidina spermatozoidų, turinčių teigiamą reologiją, skaičių, nors agliutinacija juos sulėtina.Kaip spermos ląstelės keliauja paukščio kiaušintakiu į apvaisinimo vietą, nėra visiškai suprantama.Žinduolių folikulų skystis chemoattraukia spermatozoidus.Tačiau manoma, kad chemoatraktantai nukreipia spermatozoidus į didelius atstumus7.Todėl už spermos transportavimą atsakingi kiti mechanizmai.Pranešama, kad spermatozoidų gebėjimas orientuotis ir tekėti prieš kiaušintakio skystį, išsiskiriantį po poravimosi, yra pagrindinis veiksnys, nukreipiantis į pelių spermą.Parkeris 17 pasiūlė, kad spermatozoidai kirstų kiaušintakius plaukdami prieš paukščių ir roplių ciliarinę srovę.Nors tai nebuvo eksperimentiškai įrodyta su paukščiais, Adolphi18 buvo pirmasis, kuris nustatė, kad paukščių sperma duoda teigiamų rezultatų, kai filtravimo popieriaus juostele sukuriamas plonas skysčio sluoksnis tarp dengiamojo stiklelio ir stiklelio.Reologija.Hino ir Yanagimachi [19] įdėjo pelės kiaušidžių, kiaušintakių ir gimdos kompleksą į perfuzijos žiedą ir įšvirkštė 1 µl rašalo į sąsmauka, kad būtų galima vizualizuoti skysčio tekėjimą kiaušintakiuose.Jie pastebėjo labai aktyvų susitraukimo ir atsipalaidavimo judėjimą kiaušintakyje, kuriame visi rašalo rutuliukai tolygiai judėjo link kiaušintakio ampulės.Autoriai pabrėžia kiaušintakių skysčio tekėjimo iš apatinių į viršutinius kiaušintakių svarbą spermatozoidų pakilimui ir apvaisinimui.Brillard20 pranešė, kad viščiukuose ir kalakutuose spermatozoidai migruoja aktyviai judėdami nuo makšties įėjimo, kur jie yra laikomi, iki gimdos ir makšties jungties, kur jie yra saugomi.Tačiau šis judėjimas nėra būtinas tarp gimdos vaginalinės jungties ir infundibulumo, nes spermatozoidai pernešami pasyviu poslinkiu.Žinant šias ankstesnes rekomendacijas ir dabartinio tyrimo metu gautus rezultatus, galima daryti prielaidą, kad spermatozoidų gebėjimas judėti prieš srovę (reologija) yra viena iš savybių, kuriomis grindžiamas atrankos procesas.Tai lemia spermatozoidų patekimą per makštį ir jų patekimą į CCT saugojimui.Kaip pasiūlė Forman4, tai taip pat gali palengvinti spermatozoidų patekimą į SST ir jos buveinę tam tikrą laiką, o paskui išeinant, kai jų greitis pradeda lėtėti.
Kita vertus, Matsuzaki ir Sasanami 21 teigė, kad paukščių spermatozoidų judrumas pasikeičia iš ramybės būsenos į judrumą vyrų ir moterų dauginimosi traktuose.Siekiant paaiškinti ilgą spermatozoidų laikymo laiką, o vėliau - atjauninimą palikus SST, buvo pasiūlytas SST nuolatinio spermatozoidų judrumo slopinimas.Hipoksinėmis sąlygomis Matsuzaki ir kt.1 pranešė apie didelę laktato gamybą ir išsiskyrimą SST, o tai gali slopinti spermatozoidų judrumą.Šiuo atveju spermatozoidų reologijos svarbą atspindi spermatozoidų atranka ir įsisavinimas, o ne jų saugojimas.
Spermos agliutinacijos modelis laikomas patikimu ilgo spermos laikymo SST laikotarpio paaiškinimu, nes tai yra įprastas naminių paukščių spermos susilaikymo modelis 2, 22, 23.Bakst ir kt.2 pastebėta, kad dauguma spermatozoidų prilipo vienas prie kito, sudarydami fascikulinius agregatus, o pavieniai spermatozoidai retai aptinkami putpelių CCM.Kita vertus, Wen ir kt.24 viščiukų SST spindyje pastebėjo daugiau išsibarsčiusių spermatozoidų ir mažiau spermatozoidų kuokštelių.Remiantis šiais stebėjimais, galima daryti prielaidą, kad polinkis į spermatozoidų agliutinaciją skiriasi tarp paukščių ir tarp spermatozoidų tame pačiame ejakuliate.Be to, Van Krey ir kt.9 rodo, kad atsitiktinė agliutinuotų spermatozoidų disociacija yra atsakinga už laipsnišką spermatozoidų įsiskverbimą į kiaušintakio spindį.Remiantis šia hipoteze, pirmiausia iš SST turėtų būti pašalinti spermatozoidai, turintys mažesnį agliutinacijos pajėgumą.Šiame kontekste spermatozoidų gebėjimas agliutinuotis gali būti veiksnys, turintis įtakos nešvarių paukščių spermos konkurencijos rezultatams.Be to, kuo ilgiau agliutinuotas spermatozoidas disocijuoja, tuo ilgiau išlaikomas vaisingumas.
Nors keliuose tyrimuose 2, 22, 24 buvo pastebėtas spermatozoidų agregacija ir agregacija į ryšulius, jie nebuvo išsamiai aprašyti dėl jų kinematinių stebėjimų sudėtingumo SST.Buvo atlikta keletas bandymų tirti spermos agliutinaciją in vitro.Pašalinus ploną vielą nuo kabančio sėklų lašo, buvo pastebėtas platus, bet laikinas susikaupimas.Tai lemia tai, kad iš lašo išsikiša pailgas burbulas, imituojantis sėklinę liauką.Dėl 3D apribojimų ir trumpo lašelinio džiovinimo laiko visas blokas greitai sunyko9.Dabartiniame tyrime, naudojant Sharkashi viščiukus ir mikrofluidinius lustus, galėjome apibūdinti, kaip šie kuokšteliai susidaro ir kaip jie juda.Spermos ryšuliai susidarė iškart po spermos surinkimo ir, kaip nustatyta, juda spirale, rodo teigiamą reologiją, kai yra sraute.Be to, žiūrint makroskopiškai, spermatozoidų ryšuliai padidina judrumo tiesiškumą, palyginti su izoliuotais spermatozoidais.Tai rodo, kad prieš SST prasiskverbimą gali įvykti spermatozoidų agliutinacija ir kad spermos gamyba neapsiriboja nedideliu plotu dėl streso, kaip buvo pasiūlyta anksčiau (Tingari ir Lake12).Susiformuojant kuokštams, spermatozoidai sinchroniškai plaukia, kol susidaro jungtis, tada jų uodegos apsivynioja viena aplink kitą ir spermatozoidų galva lieka laisva, tačiau uodega ir distalinė spermatozoidų dalis sulimpa lipnia medžiaga.Todėl laisva raiščio galva yra atsakinga už judėjimą, vilkdama likusį raištį.Spermatozoidų pluoštų nuskaitymo elektroninė mikroskopija parodė, kad pritvirtintos spermatozoidų galvutės buvo padengtos daug lipnios medžiagos, o tai rodo, kad spermatozoidų galvutės buvo pritvirtintos ramybės ryšuliuose, o tai galėjo atsirasti pasiekus saugojimo vietą (SST).
Kai spermos tepinėlis yra nudažytas akridino apelsinu, fluorescenciniu mikroskopu galima pamatyti tarpląstelinę lipnią medžiagą aplink spermos ląsteles.Ši medžiaga leidžia spermatozoidų ryšuliams prilipti prie bet kokių aplinkinių paviršių ar dalelių, kad jie nejudėtų su aplinkiniu srautu.Taigi, mūsų stebėjimai rodo spermatozoidų adhezijos vaidmenį mobilių ryšulių pavidalu.Jų gebėjimas plaukti prieš srovę ir prilipti prie netoliese esančių paviršių leidžia spermai ilgiau išlikti SST.
Rothschild25 naudojo hemocitometrijos kamerą, kad ištirtų plūduriuojantį galvijų spermos pasiskirstymą suspensijos laše, fotografuodamas per kamerą su vertikalia ir horizontalia optine mikroskopo ašimi.Rezultatai parodė, kad spermatozoidai buvo pritraukti prie kameros paviršiaus.Autoriai teigia, kad tarp spermos ir paviršiaus gali būti hidrodinaminės sąveikos.Atsižvelgiant į tai, kartu su Sharkashi viščiukų spermos gebėjimu formuoti lipnius kuokštelius, gali padidėti tikimybė, kad sperma prilips prie SST sienelės ir bus saugoma ilgą laiką.
Bccetti ir Afzeliu26 pranešė, kad spermos glikokaliksas reikalingas gametų atpažinimui ir agliutinacijai.Forman10 pastebėjo, kad glikoproteino-glikolipidų dangų α-glikozidinių jungčių hidrolizė, apdorojant paukščių spermą neuraminidaze, sumažino vaisingumą, nepažeidžiant spermatozoidų judrumo.Autoriai teigia, kad neuraminidazės poveikis glikokaliksui sutrikdo spermatozoidų sekvestraciją gimdos ir makšties jungtyje ir taip sumažina vaisingumą.Jų stebėjimai negali ignoruoti galimybės, kad gydymas neuraminidaze gali sumažinti spermatozoidų ir oocitų atpažinimą.Forman ir Engel10 nustatė, kad vaisingumas sumažėjo, kai vištos buvo sėklinamos intravaginaliai sperma, apdorota neuraminidaze.Tačiau IVF su neuraminidaze apdorota sperma neturėjo įtakos vaisingumui, palyginti su kontroliniais viščiukais.Autoriai padarė išvadą, kad glikoproteino-glikolipidinės dangos pokyčiai aplink spermos membraną sumažino spermatozoidų gebėjimą apvaisinti, nes pablogėjo spermatozoidų sekvestracija gimdos ir makšties jungtyje, o tai savo ruožtu padidino spermatozoidų praradimą dėl gimdos ir makšties jungties greičio, bet neturi įtakos spermatozoidų ir kiaušinių atpažinimui.
Kalakutuose Bakstas ir Bauchanas 11 rado mažas pūsleles ir membranos fragmentus SST spindyje ir pastebėjo, kad kai kurios iš šių granulių susiliejo su spermos membrana.Autoriai teigia, kad šie santykiai gali prisidėti prie ilgalaikio spermatozoidų saugojimo SST.Tačiau mokslininkai nenurodė šių dalelių šaltinio – ar jas išskiria CCT epitelio ląstelės, gamina ir išskiria vyrų reprodukcinė sistema, ar jas gamina pati sperma.Be to, šios dalelės yra atsakingos už agliutinaciją.Grützner ir kt.27 pranešė, kad epididiminės epitelio ląstelės gamina ir išskiria specifinį baltymą, reikalingą vienos poros sėklinių takų susidarymui.Autoriai taip pat praneša, kad šių ryšulių sklaida priklauso nuo epididiminių baltymų sąveikos.Nixonas ir kt.28 nustatė, kad adnexa išskiria baltymą – rūgštinį cisteino turintį osteonektiną;SPARC dalyvauja formuojant trumpasnapių echidnų ir plekšnių spermatozoidų kuokštelius.Šių spindulių išsibarstymas yra susijęs su šio baltymo praradimu.
Dabartiniame tyrime ultrastruktūrinė analizė naudojant elektroninę mikroskopiją parodė, kad spermatozoidai prilipo prie didelio tankios medžiagos kiekio.Manoma, kad šios medžiagos yra atsakingos už agliutinaciją, kuri kondensuojasi tarp prilipusių galvų ir aplink jas, tačiau mažesnė koncentracija uodegos srityje.Darome prielaidą, kad ši agliutinuojanti medžiaga kartu su sperma išsiskiria iš vyrų reprodukcinės sistemos (sėklidžių prielipo arba kraujagyslių sienelių), nes ejakuliacijos metu dažnai stebime, kaip sperma atsiskiria nuo limfos ir sėklinės plazmos.Buvo pranešta, kad kai paukščių spermatozoidai praeina pro prielipą ir kraujagysles, jie patiria su brendimu susijusių pokyčių, kurie palaiko jų gebėjimą surišti baltymus ir įgyti su plazmos lema susijusių glikoproteinų.Šių baltymų išlikimas ant nuolatinių spermos membranų SST rodo, kad šie baltymai gali turėti įtakos spermos membranos stabilumui 30 ir jų vaisingumui 31 .Ahammad ir kt.32 pranešė, kad spermatozoidai, gauti iš įvairių vyriškos lyties reprodukcinės sistemos dalių (nuo sėklidžių iki distalinių kraujagyslių kraujagyslių), laipsniškai didina gyvybingumą skysčių laikymo sąlygomis, nepriklausomai nuo laikymo temperatūros, o viščiukų gyvybingumas taip pat didėja kiaušintakiuose po dirbtinio apvaisinimo.
Sharkashi viščiukų spermatozoidų kuokšteliai pasižymi kitokiomis savybėmis ir funkcijomis nei kitų rūšių, tokių kaip echidnos, plekšnės, medžio pelės, elninės žiurkės ir jūrų kiaulytės.Šarkasių viščiukams spermatozoidų ryšulių susidarymas sumažino jų plaukimo greitį, palyginti su pavieniais spermatozoidais.Tačiau šie ryšuliai padidino reologiškai teigiamų spermatozoidų procentą ir padidino spermatozoidų gebėjimą stabilizuotis dinamiškoje aplinkoje.Taigi mūsų rezultatai patvirtina ankstesnį teiginį, kad spermos agliutinacija SST yra susijusi su ilgalaikiu spermos saugojimu.Taip pat manome, kad spermatozoidų polinkis formuotis kuokšteliams gali kontroliuoti spermatozoidų praradimo greitį SST, o tai gali pakeisti spermos konkurencijos rezultatus.Remiantis šia prielaida, spermatozoidai, turintys mažą agliutinacijos pajėgumą, pirmiausia išskiria SST, o spermatozoidai su dideliu agliutinacijos pajėgumu sukuria didžiąją dalį palikuonių.Vienos poros spermatozoidų pluoštų susidarymas yra naudingas ir turi įtakos tėvų ir vaikų santykiui, tačiau naudojamas kitoks mechanizmas.Echidnose ir plekšnėse spermatozoidai išsidėstę lygiagrečiai vienas kitam, kad padidėtų spindulio judėjimo į priekį greitis.Echidnų ryšuliai juda maždaug tris kartus greičiau nei pavieniai spermatozoidai.Manoma, kad tokių spermatozoidų kuokštelių susidarymas echidnose yra evoliucinis prisitaikymas, siekiant išlaikyti dominavimą, nes patelės yra palaidos ir dažniausiai poruojasi su keliais patinais.Todėl skirtingų ejakuliatų spermatozoidai įnirtingai konkuruoja dėl kiaušinėlio apvaisinimo.
Agliutinuotus sharkasi viščiukų spermatozoidus lengva vizualizuoti naudojant fazinio kontrasto mikroskopiją, kuri laikoma naudinga, nes leidžia lengvai ištirti spermatozoidų elgesį in vitro.Mechanizmas, kuriuo spermatozoidų kuokštelių susidarymas skatina sharkasi viščiukų dauginimąsi, taip pat skiriasi nuo kai kurių placentos žinduolių, atstovaujančių kooperatyvų spermatozoidų elgesį, pavyzdžiui, miškinių pelių, kai kai kurie spermatozoidai pasiekia kiaušinius, padėdami kitiems giminingiems asmenims pasiekti ir sugadinti savo kiaušinėlius.įrodyti save.altruistinis elgesys.Savaiminis apvaisinimas 34. Kitas kooperatyvo elgsenos spermatozoiduose pavyzdys buvo rastas elnių pelėms, kur spermatozoidai sugebėjo atpažinti ir sujungti su labiausiai genetiškai giminingais spermatozoidais ir sudaryti kooperatyvines grupes, kad padidintų savo greitį, palyginti su nesusijusiais spermatozoidais35.
Šio tyrimo metu gauti rezultatai neprieštarauja Fomano teorijai apie ilgalaikį spermatozoidų saugojimą SWS.Tyrėjai praneša, kad spermatozoidai ilgą laiką juda SST išklojančių epitelio ląstelių sraute, o po tam tikro laiko išsenka spermatozoidų ląstelių energijos atsargos, todėl sumažėja greitis, o tai leidžia išstumti mažos molekulinės masės medžiagas.spermatozoidų energija su skysčio srautu iš SST spindžio Kiaušintakio ertmė.Dabartiniame tyrime pastebėjome, kad pusė pavienių spermatozoidų sugebėjo plaukti prieš tekančius skysčius, o jų sukibimas ryšulyje padidino jų gebėjimą parodyti teigiamą reologiją.Be to, mūsų duomenys atitinka Matsuzaki ir kt.1, kuris pranešė, kad padidėjusi laktato sekrecija SST gali slopinti spermatozoidų judrumą.Tačiau mūsų rezultatai apibūdina spermatozoidų judriųjų raiščių susidarymą ir jų reologinį elgesį esant dinaminei aplinkai mikrokanale, siekiant išsiaiškinti jų elgesį SST.Būsimi tyrimai gali būti sutelkti į agliutinuojančio agento cheminės sudėties ir kilmės nustatymą, o tai neabejotinai padės mokslininkams sukurti naujus būdus laikyti skystą spermą ir padidinti vaisingumo trukmę.
Tyrimo metu spermos donorais buvo atrinkta 15 30 savaičių amžiaus sharkasi (homozigotinis dominuojantis; Na Na) plikas kaklu.Paukščiai buvo auginami Ashito universiteto Žemės ūkio fakulteto moksliniame paukštyno ūkyje, Ašito gubernijoje, Egipte.Paukščiai buvo laikomi atskiruose narvuose (30 x 40 x 40 cm), jiems buvo taikoma šviesos programa (16 valandų šviesos ir 8 valandos tamsos) ir šeriami ėdalu, kuriame buvo 160 g žalių baltymų, 2800 kcal metabolizuojamos energijos ir 35 g kalcio.5 gramai turimo fosforo vienam kilogramui dietos.
36, 37 duomenimis, sperma buvo paimta iš vyrų pilvo masažo būdu.Iš viso per 3 dienas iš 15 vyrų buvo paimti 45 spermos mėginiai.Sperma (n = 15 per dieną) buvo nedelsiant atskiesta santykiu 1:1 (v:v) Belsville paukštienos spermos skiedikliu, kuriame yra kalio difosfato (1,27 g), mononatrio glutamato monohidrato (0,867 g), fruktozės (0,5 d) bevandenio natrio.acetatas (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometanas (0,195 g), kalio citrato monohidratas (0,064 g), kalio monofosfatas (0,065 g), magnio chloridas (0,034 g) ir H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarizacija 3 3 kg/m33.Praskiesti spermos mėginiai pirmiausia buvo tiriami šviesos mikroskopu, siekiant užtikrinti gerą spermos kokybę (drėgmę), o po to laikomi vandens vonioje 37 °C temperatūroje iki panaudojimo per pusvalandį po surinkimo.
Spermatozoidų kinematika ir reologija aprašyta naudojant mikrofluidinių prietaisų sistemą.Spermos mėginiai buvo toliau skiedžiami iki 1:40 Beltsville paukščių spermos skiedikliu, įkeliami į mikrofluidinį prietaisą (žr. toliau), o kinetikos parametrai buvo nustatyti naudojant kompiuterizuotą spermos analizės (CASA) sistemą, anksčiau sukurtą mikrofluidikai apibūdinti.apie spermatozoidų mobilumą skystoje terpėje (Assiuto universiteto Inžinerijos fakulteto Mechanikos inžinerijos katedra, Egiptas).Papildinį galima atsisiųsti adresu: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Išmatuotas kreivės greitis (VCL, μm/s), tiesinis greitis (VSL, μm/s) ir vidutinis trajektorijos greitis (VAP, μm/s).Spermatozoidų vaizdo įrašai buvo nufotografuoti naudojant apverstą Optika XDS-3 fazės kontrastinį mikroskopą (su 40x objektyvu), prijungtu prie Tucson ISH1000 fotoaparato 30 kadrų per sekundę greičiu 3 s.Naudokite CASA programinę įrangą, kad ištirtumėte bent tris sritis ir 500 spermatozoidų trajektorijų viename mėginyje.Įrašytas vaizdo įrašas buvo apdorotas naudojant savadarbį CASA.CASA papildinio judrumo apibrėžimas pagrįstas spermatozoidų plaukimo greičiu, palyginti su srauto greičiu, ir neapima kitų parametrų, tokių kaip judėjimas iš vienos pusės į kitą, nes buvo nustatyta, kad tai yra patikimesnė skysčio sraute.Reologinis judėjimas apibūdinamas kaip spermatozoidų judėjimas prieš skysčio tekėjimo kryptį.Reologinių savybių turintys spermatozoidai padalinti iš judrių spermatozoidų skaičiaus;Į skaičiavimą neįtraukti spermatozoidai, kurie buvo ramybės būsenoje ir konvektyviai judantys spermatozoidai.
Visos naudojamos cheminės medžiagos buvo gautos iš Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairas, Egiptas), jei nenurodyta kitaip.Prietaisas buvo pagamintas taip, kaip aprašyta El-sherry ir kt.40 su kai kuriais pakeitimais.Mikrokanaliams gaminti buvo naudojamos stiklo plokštės (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 neigiamas atsparumas (MicroChem, Newton, CA), diacetono alkoholis (Sigma Aldrich, Steinheim, Vokietija) ir poliacetonas.-184, Dow Corning, Midlandas, Mičiganas).Mikrokanalai gaminami naudojant minkštąją litografiją.Pirmiausia didelės raiškos spausdintuvu (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) buvo atspausdinta skaidri apsauginė veido kaukė su norimu mikrokanalų dizainu.Meistrai buvo pagaminti naudojant stiklo plokštes kaip pagrindą.Plokštelės buvo išvalytos acetone, izopropanolyje ir dejonizuotame vandenyje, o po to padengtos 20 µm SU8-25 sluoksniu, naudojant sukimosi dangą (3000 aps./min., 1 min.).Po to SU-8 sluoksniai buvo švelniai išdžiovinti (65 °C, 2 min. ir 95 °C, 10 min.) ir 50 sekundžių veikiami UV spinduliuote.Po ekspozicijos kepkite 65 °C ir 95 °C temperatūroje 1 min. ir 4 min., kad susijungtų atviri SU-8 sluoksniai, po to 6,5 min.Kietai kepkite vaflius (200°C 15 min.), kad dar labiau sutvirtėtų SU-8 sluoksnis.
PDMS buvo paruoštas sumaišant monomerą ir kietiklį 10:1 svorio santykiu, po to degazuojamas vakuuminiame eksikatoriuje ir pilamas ant SU-8 pagrindinio rėmo.PDMS buvo kietinamas orkaitėje (120 ° C, 30 min.), tada kanalai buvo iškirpti, atskirti nuo pagrindinio ir perforuoti, kad būtų galima pritvirtinti vamzdelius prie mikrokanalo įėjimo ir išleidimo angos.Galiausiai, PDMS mikrokanalai buvo visam laikui pritvirtinti prie mikroskopo stiklelių, naudojant nešiojamąjį koronos procesorių („Electro-Technic Products“, Čikaga, IL), kaip aprašyta kitur.Šiame tyrime naudojamas mikrokanalas yra 200 µm × 20 µm (W × H) ir yra 3, 6 cm ilgio.
Hidrostatinio slėgio sukeltas skysčio srautas mikrokanalo viduje pasiekiamas išlaikant skysčio lygį įleidimo rezervuare virš aukščio skirtumo Δh39 išleidimo rezervuare (1 pav.).
čia f – trinties koeficientas, apibrėžiamas kaip f = C/Re laminariniam srautui stačiakampiame kanale, kur C – konstanta, priklausanti nuo kanalo kraštinių santykio, L – mikrokanalo ilgis, Vav – vidutinis greitis mikrokanalo viduje, Dh – kanalo hidraulinis skersmuo, g – gravitacijos pagreitis.Naudojant šią lygtį, vidutinį kanalo greitį galima apskaičiuoti naudojant šią lygtį: