Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu. Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Be to, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir „JavaScript“.
Neseniai buvo sukurta dirbtinio vandens nanostruktūrų (EWNS) pagrindu sukurta antimikrobinė platforma be cheminių medžiagų, pagrįsta nanotechnologijomis. EWNS turi didelį paviršiaus krūvį ir yra turtingos reaktyviųjų deguonies formų (ROS), kurios gali sąveikauti su daugeliu mikroorganizmų, įskaitant maiste esančius patogenus, ir juos inaktyvuoti. Čia parodyta, kad jų savybes sintezės metu galima tiksliai sureguliuoti ir optimizuoti, siekiant dar labiau padidinti jų antibakterinį potencialą. EWNS laboratorinė platforma buvo sukurta siekiant tiksliai sureguliuoti EWNS savybes keičiant sintezės parametrus. EWNS savybių (krūvio, dydžio ir ROS kiekio) apibūdinimas buvo atliktas naudojant šiuolaikinius analitinius metodus. Be to, maisto mikroorganizmai, tokie kaip Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum ir Saccharomyces cerevisiae, buvo inokuliuoti ant ekologiškų vynuoginių pomidorų paviršiaus, siekiant įvertinti jų mikrobų inaktyvavimo potencialą. Čia pateikti rezultatai rodo, kad EWNS savybes galima tiksliai sureguliuoti sintezės metu, todėl inaktyvavimo efektyvumas padidėja eksponentiškai. Visų pirma, paviršiaus krūvis padidėjo keturis kartus, o ROS kiekis padidėjo. Mikrobų pašalinimo greitis priklausė nuo mikrobų ir svyravo nuo 1,0 iki 3,8 log po 45 minučių poveikio 40 000 #/cm3 EWNS aerozolio doze.
Mikrobinė tarša yra pagrindinė maistu plintančių ligų, kurias sukelia patogenų ar jų toksinų prarijimas, priežastis. Vien Jungtinėse Valstijose maistu plintančios ligos kasmet sudaro apie 76 milijonus ligų, 325 000 hospitalizacijų ir 5 000 mirčių1. Be to, Jungtinių Valstijų Žemės ūkio departamentas (USDA) apskaičiavo, kad padidėjęs šviežių produktų vartojimas yra 48 procentų visų Jungtinėse Valstijose pranešamų maistu plintančių ligų2 priežastis. Ligų ir mirčių nuo maistu plintančių patogenų kaina Jungtinėse Valstijose yra labai didelė – Ligų kontrolės ir prevencijos centrai (CDC) apskaičiavo, kad ji siekia daugiau nei 15,6 milijardo JAV dolerių per metus3.
Šiuo metu cheminės4, radiacinės5 ir terminės6 antimikrobinės intervencijos, skirtos maisto saugai užtikrinti, daugiausia įgyvendinamos ribotuose kritiniuose kontrolės taškuose (SKT) gamybos grandinėje (paprastai po derliaus nuėmimo ir (arba) pakavimo metu), o ne nuolat įgyvendinamos taip, kad švieži produktai būtų kryžminės taršos objektas7. Antimikrobinės intervencijos reikalingos siekiant geriau kontroliuoti per maistą plintančias ligas ir maisto gedimą, ir turi potencialą taikyti visame procese nuo ūkio iki stalo. Mažesnis poveikis ir išlaidos.
Neseniai buvo sukurta nanotechnologijomis pagrįsta chemikalų neturinti antimikrobinė platforma, skirta inaktyvuoti bakterijas ant paviršių ir ore, naudojant dirbtines vandens nanostruktūras (EWNS). EVNS sintezei buvo naudojami du lygiagretūs procesai: elektropurškimas ir vandens jonizacija (1a pav.). Anksčiau buvo įrodyta, kad EWNS pasižymi unikaliomis fizikinėmis ir biologinėmis savybėmis8,9,10. EWNS vidutiniškai turi 10 elektronų vienoje struktūroje, o vidutinis nanometro dydis yra 25 nm (1b, c pav.)8,9,10. Be to, elektronų sukinio rezonanso (ESR) tyrimai parodė, kad EWNS turi daug reaktyviųjų deguonies formų (ROS), daugiausia hidroksilo (OH•) ir superoksido (O2-) radikalų (1c pav.)8. EWNS ilgą laiką išliko ore ir galėjo susidurti su ore ir ant paviršių esančiais mikrobais, pernešdamos savo ROS naudingąją medžiagą ir sukeldamos mikrobų inaktyvaciją (1d pav.). Šie ankstesni tyrimai taip pat parodė, kad EWNS gali sąveikauti su įvairiomis visuomenės sveikatai svarbiomis gramneigiamomis ir gramteigiamomis bakterijomis, įskaitant mikobakterijas, ant paviršių ir ore8,9, ir jas inaktyvuoti. Transmisinė elektroninė mikroskopija parodė, kad inaktyvaciją sukėlė ląstelės membranos pažeidimas. Be to, ūmaus įkvėpimo tyrimai parodė, kad didelės EWNS dozės nesukelia plaučių pažeidimo ar uždegimo8.
a) Elektros purškimas įvyksta, kai tarp kapiliarinio indo su skysčiu ir priešelektrodo prijungiama aukšta įtampa. b) Dėl aukštos įtampos taikymo atsiranda du skirtingi reiškiniai: i) vandens elektro purškimas ir ii) reaktyviųjų deguonies formų (jonų), įstrigusių EWNS, susidarymas. c) Unikali EWNS struktūra. d) EWNS yra labai judrios dėl savo nanoskalės prigimties ir gali sąveikauti su ore esančiais patogenais.
Neseniai taip pat buvo įrodytas EWNS antimikrobinės platformos gebėjimas inaktyvuoti maiste esančius mikroorganizmus ant šviežio maisto paviršiaus. Taip pat buvo įrodyta, kad EWNS paviršiaus krūvis gali būti naudojamas kartu su elektriniu lauku tiksliniam perdavimui. Dar svarbiau, kad per 90 minučių po maždaug 50 000#/cm311 EWNS poveikio buvo pastebėtas daug žadantis pradinis rezultatas – maždaug 1,4 log organinių pomidorų aktyvumo sumažėjimas prieš įvairius maisto mikroorganizmus, tokius kaip E. coli ir Listeria. Be to, preliminarūs organoleptiniai vertinimo testai neparodė jokio organoleptinio poveikio, palyginti su kontroliniu pomidoru. Nors šie pradiniai inaktyvavimo rezultatai žada maisto saugą net ir esant labai mažoms 50 000#/cc EWNS dozėms, akivaizdu, kad didesnis inaktyvavimo potencialas būtų naudingesnis siekiant dar labiau sumažinti infekcijos ir gedimo riziką.
Čia savo tyrimus sutelksime į EWNS generavimo platformos kūrimą, siekdami tiksliai suderinti sintezės parametrus ir optimizuoti EWNS fizikines ir chemines savybes, siekiant padidinti jų antibakterinį potencialą. Optimizavimas ypač sutelktas į jų paviršiaus krūvio (siekiant pagerinti tikslinį perdavimą) ir ROS kiekio (siekiant pagerinti inaktyvavimo efektyvumą) didinimą. Optimizuotų fizikinių ir cheminių savybių (dydžio, krūvio ir ROS kiekio) apibūdinimas naudojant šiuolaikinius analitinius metodus ir įprastus maisto mikroorganizmus, tokius kaip E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae ir M. parafortuitum.
EVNS buvo susintetintas vienu metu elektropurškiant ir jonizuojant labai gryną vandenį (18 MΩ cm–1). Elektrinis purkštuvas 12 paprastai naudojamas skysčiams, kontroliuojamo dydžio sintetinių polimerų ir keraminių dalelių 13 bei pluoštų 14 purškimui.
Kaip išsamiai aprašyta ankstesnėse publikacijose 8, 9, 10, 11, tipiškame eksperimente tarp metalinio kapiliaro ir įžeminto priešpriešinio elektrodo prijungiama aukšta įtampa. Šio proceso metu vyksta du skirtingi reiškiniai: 1) elektros purškimas ir 2) vandens jonizacija. Stiprus elektrinis laukas tarp dviejų elektrodų sukelia neigiamų krūvių kaupimąsi kondensuoto vandens paviršiuje, dėl ko susidaro Teiloro kūgiai. Dėl to susidaro labai įkrauti vandens lašeliai, kurie, remiantis Rayleigh teorija16, toliau skyla į mažesnes daleles. Tuo pačiu metu stiprus elektrinis laukas sukelia kai kurių vandens molekulių skylimą ir elektronų atitraukimą (jonizacija), taip susidarant dideliam kiekiui reaktyviųjų deguonies formų (ROS)17. Tuo pačiu metu generuojami ROS18 paketai buvo įkapsuliuoti EWNS (1c pav.).
2a paveiksle parodyta šiame tyrime sukurta ir EWNS sintezėje panaudota EWNS generavimo sistema. Uždarytame butelyje laikomas išgrynintas vanduo per tefloninį vamzdelį (vidinis skersmuo 2 mm) buvo tiekiamas į 30G nerūdijančio plieno adatą (metalinį kapiliarą). Kaip parodyta 2b paveiksle, vandens srautą kontroliuoja oro slėgis butelyje. Adata pritvirtinta prie tefloninio pulto, kurį galima rankiniu būdu reguliuoti tam tikru atstumu nuo priešpriešinio elektrodo. Priešpriešinis elektrodas yra poliruotas aliuminio diskas su skylute viduryje mėginių ėmimui. Po priešpriešiniu elektrodu yra aliuminio mėginių ėmimo piltuvėlis, kuris per mėginių ėmimo angą (2b pav.) sujungtas su likusia eksperimentine sistema. Visi mėginių ėmimo komponentai yra elektriškai įžeminti, kad būtų išvengta krūvio kaupimosi, kuris galėtų pakenkti dalelių mėginių ėmimui.
(a) Inžinerinė vandens nanostruktūrų generavimo sistema (EWNS). (b) Mėginių ėmiklio ir elektros purškimo įrenginio skerspjūvis, kuriame parodyti svarbiausi parametrai. (c) Eksperimentinė bakterijų inaktyvavimo įranga.
Aukščiau aprašyta EWNS generavimo sistema gali keisti pagrindinius veikimo parametrus, kad būtų lengviau tiksliai sureguliuoti EWNS savybes. Reguliuokite tiekiamą įtampą (V), atstumą tarp adatos ir priešpriešinio elektrodo (L) ir vandens srautą (φ) per kapiliarą, kad tiksliai sureguliuotumėte EWNS charakteristikas. Simboliai [V (kV), L (cm)] naudojami skirtingiems deriniams žymėti. Reguliuokite vandens srautą, kad gautumėte stabilų tam tikro rinkinio [V, L] Tayloro kūgį. Šio tyrimo tikslais priešpriešinio elektrodo (D) anga buvo nustatyta ties 0,5 colio (1,29 cm).
Dėl ribotos geometrijos ir asimetrijos elektrinio lauko stiprumo negalima apskaičiuoti remiantis pirmaisiais principais. Vietoj to, elektriniam laukui apskaičiuoti buvo naudojama „QuickField™“ programinė įranga (Svendborgas, Danija)19. Elektrinis laukas nėra vienodas, todėl įvairioms konfigūracijoms kaip atskaitos vertė buvo naudojama elektrinio lauko vertė kapiliarų gale.
Tyrimo metu buvo įvertinti keli įtampos ir atstumo tarp adatos ir priešelektrodo deriniai, atsižvelgiant į Tayloro kūgio formavimąsi, Tayloro kūgio stabilumą, EWNS susidarymo stabilumą ir atkuriamumą. Įvairūs deriniai pateikti papildomoje S1 lentelėje.
EWNS generavimo sistemos išvestis buvo tiesiogiai prijungta prie skenuojančio mobilumo dalelių dydžio matuoklio (SMPS, modelis 3936, TSI, Shoreview, Minesota), kad būtų galima išmatuoti dalelių skaičiaus koncentraciją, ir buvo naudojama kartu su Faradėjaus aerozolio elektrometru (TSI, modelis 3068B, Shoreview, JAV). MN) aerozolių srautams matuoti, kaip aprašyta ankstesniame mūsų leidinyje9. Tiek SMPS, tiek aerozolio elektrometras ėmė mėginius 0,5 l/min srauto greičiu (bendras mėginio srautas 1 l/min). Dalelių koncentracijos ir aerozolio srautai buvo matuojami 120 s. Matavimas kartojamas 30 kartų. Bendras aerozolio krūvis apskaičiuojamas pagal srovės matavimus, o vidutinis EWNS krūvis įvertinamas pagal bendrą paimtų EWNS dalelių skaičių. Vidutinę EWNS kainą galima apskaičiuoti pagal (1) lygtį:
kur IEl yra išmatuota srovė, NSMPS yra SMPS išmatuota skaitinė koncentracija, o φEl yra srautas į elektrometrą.
Kadangi santykinė drėgmė (RH) veikia paviršiaus krūvį, eksperimento metu temperatūra ir (RH) buvo palaikomos pastovios – atitinkamai 21 °C ir 45 %.
EWNS dydžiui ir gyvavimo trukmei matuoti buvo naudojama atominės jėgos mikroskopija (AFM), „Asylum MFP-3D“ („Asylum Research“, Santa Barbara, Kalifornija) ir AC260T zondas („Olympus“, Tokijas, Japonija). AFM skenavimo dažnis yra 1 Hz, o skenavimo plotas – 5 µm × 5 µm su 256 skenavimo linijomis. Visiems vaizdams buvo atliktas pirmos eilės vaizdų lygiavimas naudojant „Asylum“ programinę įrangą (kaukė su 100 nm diapazonu ir 100 pm slenksčiu).
Išimkite mėginių ėmimo piltuvą ir padėkite žėručio paviršių 2,0 cm atstumu nuo priešelektrodo vidutiniškai 120 s, kad būtų išvengta dalelių koalescencijos ir netaisyklingų lašelių susidarymo žėručio paviršiuje. EWNS buvo užteptas tiesiai ant šviežiai pjaustytų žėručio paviršių (Ted Pella, Redding, CA). Iškart po purškimo žėručio paviršius buvo vizualizuotas naudojant AFM. Šviežiai pjaustyto nemodifikuoto žėručio paviršiaus sąlyčio kampas yra artimas 0°, todėl EWNS sklinda žėručio paviršiumi kupolo pavidalu20. Difuzuojančių lašelių skersmuo (a) ir aukštis (h) buvo išmatuoti tiesiai iš AFM topografijos ir panaudoti kupolo formos difuzijos tūriui EWNS apskaičiuoti naudojant mūsų anksčiau patvirtintą metodą8. Darant prielaidą, kad įmontuoto EVNS tūris yra toks pat, ekvivalentinį skersmenį galima apskaičiuoti pagal (2) lygtį:
Pagal mūsų anksčiau sukurtą metodą, elektronų sukinio rezonanso (ESR) sukinio gaudyklė buvo naudojama trumpaamžių radikalų tarpinių produktų buvimui EWNS aptikti. Aerozoliai buvo praleisti per tirpalą, kuriame buvo 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksido) („Oxis International Inc.“, Portlandas, Oregonas). Visi EPR matavimai buvo atlikti naudojant „Bruker EMX“ spektrometrą („Bruker Instruments Inc.“, Billerica, MA, JAV) ir plokščiųjų ląstelių matricas. Duomenims rinkti ir analizuoti buvo naudojama „Acquisit“ programinė įranga („Bruker Instruments Inc.“, Billerica, MA, JAV). ROS charakterizavimas buvo atliktas tik esant tam tikroms darbo sąlygoms [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS koncentracijos buvo matuojamos naudojant SMPS, atsižvelgiant į EWNS praradimą impactoryje.
Ozono lygis buvo stebimas naudojant „205 Dual Beam Ozone Monitor™“ („2B Technologies“, Boulderis, Koloradas)8,9,10.
Visoms EWNS savybėms matavimo vertė yra matavimų vidurkis, o matavimo paklaida – standartinis nuokrypis. Optimizuoto EWNS atributo vertei palyginti su atitinkama bazinio EWNS verte buvo atliktas t-testas.
2c paveiksle parodyta anksčiau sukurta ir apibūdinta elektrostatinė kritulių praleidimo sistema (EPES), kuri gali būti naudojama EWNS11 nukreipimui į paviršius. EPES naudoja EWNS krūvį kartu su stipriu elektriniu lauku, kad „nukreiptų“ tiesiai į taikinio paviršių. Išsami informacija apie EPES sistemą pateikta neseniai Pyrgiotakis ir kt. publikacijoje. Taigi, EPES sudaro 3D spausdinta PVC kamera su kūginiais galais, kurių viduryje yra dvi lygiagrečios nerūdijančio plieno (304 nerūdijančio plieno, veidrodinio poliravimo) metalinės plokštės, esančios 15,24 cm atstumu viena nuo kitos. Plokštės buvo prijungtos prie išorinio aukštos įtampos šaltinio („Bertran 205B-10R“, „Spellman“, Hauppauge, Niujorkas), apatinė plokštė visada buvo teigiama, o viršutinė plokštė visada buvo įžeminta (plaukiojanti). Kameros sienelės padengtos aliuminio folija, kuri yra elektriškai įžeminta, kad būtų išvengta dalelių praradimo. Kamera turi sandarias priekines pakrovimo dureles, leidžiančias bandymo paviršius dėti ant plastikinių stovų, pakeliant juos nuo apatinės metalinės plokštės, kad būtų išvengta aukštos įtampos trukdžių.
EWNS nusodinimo efektyvumas EPES buvo apskaičiuotas pagal anksčiau sukurtą protokolą, išsamiai aprašytą papildomame S111 paveiksle.
Kaip valdymo kamera, antrasis srautas per cilindrinę kamerą yra nuosekliai sujungtas su EPES sistema, naudojant tarpinį HEPA filtrą, kad būtų pašalinti EWNS. Kaip parodyta 2c paveiksle, EWNS aerozolis buvo pumpuojamas per dvi nuosekliai sujungtas kameras. Filtras tarp valdymo patalpos ir EPES pašalina visus likusius EWNS, todėl temperatūra (T), santykinė drėgmė (RH) ir ozono lygis išlieka tokie patys.
Nustatyta, kad svarbūs maiste plintantys mikroorganizmai užteršia šviežius produktus, tokius kaip Escherichia coli (ATCC #27325) – išmatų indikatorius, Salmonella enterica (ATCC #53647) – maiste plintantis patogenas, Listeria innocua (ATCC #33090) – alternatyva patogeninei Listeria monocytogenes. Iš ATCC (Manasas, Virdžinija) įsigytos gyvos bakterijos Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) – kaip alternatyva gedimo mielėms, ir Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) – atsparesnės.
Atsitiktine tvarka iš vietinio turgaus pirkite dėžutes ekologiškų vynuoginių pomidorų ir laikykite šaldytuve 4 °C temperatūroje iki naudojimo (iki 3 dienų). Eksperimentui rinkitės vieno dydžio pomidorus, maždaug 1,25 cm skersmens.
Inkubacijos, inokuliacijos, ekspozicijos ir kolonijų skaičiavimo protokolai buvo išsamiai aprašyti ankstesniuose mūsų leidiniuose ir išsamiai paaiškinti 11 papildomuose duomenyse. EWNS veikimas buvo įvertintas inokuliuotus pomidorus 45 minutes veikiant 40 000 #/cm3. Trumpai tariant, t = 0 min. metu trys pomidorai buvo panaudoti išgyvenusiems mikroorganizmams įvertinti. Trys pomidorai buvo įdėti į EPES ir paveikti EWNS 40 000 #/cc greičiu (EWNS paveikti pomidorai), o kiti trys buvo įdėti į kontrolinę kamerą (kontroliniai pomidorai). Nė viena iš pomidorų grupių nebuvo papildomai apdorota. EWNS paveikti pomidorai ir kontrolinė grupė buvo pašalinti po 45 minučių, kad būtų galima įvertinti EWNS poveikį.
Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais. Duomenų analizė atlikta pagal papildomuose duomenyse aprašytą protokolą.
E. coli, Enterobacter ir L. innocua bakterijų mėginiai, paveikti EWNS (45 min., EWNS aerozolio koncentracija 40 000 #/cm3) ir neapdoroti, buvo susmulkinti, siekiant įvertinti inaktyvacijos mechanizmus. Nuosėdos 2 valandas kambario temperatūroje buvo fiksuotos 0,1 M natrio kakodilato tirpale (pH 7,4) su fiksatoriumi, sudarytu iš 2,5 % glutaraldehido, 1,25 % paraformaldehido ir 0,03 % pikrino rūgšties. Po plovimo jos buvo fiksuotos 1 % osmio tetroksidu (OsO4) / 1,5 % kalio ferocianidu (KFeCN6) 2 valandas, 3 kartus plautos vandeniu ir inkubuotos 1 % uranilo acetate 1 valandą, po to du kartus plautos vandeniu. Vėliau dehidratuotos po 10 minučių 50 %, 70 %, 90 % ir 100 % alkoholio tirpale. Tada mėginiai 1 valandai buvo dedami į propileno oksidą ir impregnuoti 1:1 propileno oksido ir TAAP Epon mišiniu („Marivac Canada Inc.“, St. Laurent, Kalifornija). Mėginiai buvo įterpti į TAAB Epon ir polimerizuoti 60 °C temperatūroje 48 valandas. Sukietėjusi granuliuota derva buvo supjaustyta ir vizualizuota TEM metodu, naudojant JEOL 1200EX („JEOL“, Tokijas, Japonija) – įprastą transmisinį elektroninį mikroskopą su AMT 2k CCD kamera („Advanced Microscopy Techniques“, Korp., Voburnas, Masačusetsas, JAV).
Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Kiekvienam laiko taškui bakterijų plovimo mišiniai buvo dedami trimis egzemplioriais, gaunant iš viso devynis duomenų taškus kiekvienam taškui, kurių vidurkis buvo naudojamas kaip bakterijų koncentracija tam konkrečiam organizmui. Standartinis nuokrypis buvo naudojamas kaip matavimo paklaida. Visi taškai įskaičiuoti.
Bakterijų koncentracijos sumažėjimo logaritmas, palyginti su t = 0 min, buvo apskaičiuotas pagal šią formulę:
kur C0 yra bakterijų koncentracija kontroliniame mėginyje 0 laiko momentu (t. y. po to, kai paviršius išdžiūvo, bet prieš įdedant jį į kamerą), o Cn yra bakterijų koncentracija ant paviršiaus po n minučių veikimo.
Siekiant atsižvelgti į natūralų bakterijų skaidymąsi per 45 minučių ekspozicijos laikotarpį, logaritminis sumažėjimas, palyginti su kontroline grupe po 45 minučių, taip pat buvo apskaičiuotas taip:
Kur Cn yra bakterijų koncentracija kontroliniame mėginyje n laiko momentu, o Cn-Control yra kontrolinių bakterijų koncentracija n laiko momentu. Duomenys pateikiami kaip logaritminis sumažėjimas, palyginti su kontroline grupe (be EWNS poveikio).
Tyrimo metu buvo įvertinti keli įtampos ir atstumo tarp adatos ir priešpriešinio elektrodo deriniai, atsižvelgiant į Teiloro kūgio formavimąsi, Teiloro kūgio stabilumą, EWNS susidarymo stabilumą ir atkuriamumą. Įvairūs deriniai pateikti papildomoje S1 lentelėje. Išsamiam tyrimui buvo pasirinkti du atvejai, parodantys stabilias ir atkuriamas savybes (Teiloro kūgis, EWNS susidarymas ir stabilumas laikui bėgant). 3 paveiksle pateikti dviejų atvejų ROS krūvio, dydžio ir kiekio rezultatai. Rezultatai taip pat apibendrinti 1 lentelėje. Informacijai, 3 paveiksle ir 1 lentelėje pateikiamos anksčiau susintetintų neoptimizuotų EWNS8, 9, 10, 11 (bazinis EWNS) savybės. Statistinio reikšmingumo skaičiavimai, naudojant dvipusį t testą, yra pakartotinai paskelbti papildomoje S2 lentelėje. Be to, papildomi duomenys apima priešpriešinio elektrodo mėginių ėmimo angos skersmens (D) ir atstumo tarp įžeminimo elektrodo ir adatos galiuko (L) įtakos tyrimus (papildomi S2 ir S3 paveikslai).
(a–c) AFM dydžio pasiskirstymas. (d–f) Paviršiaus krūvio charakteristika. (g) ROS ir ESR charakteristika.
Taip pat svarbu atkreipti dėmesį, kad visomis minėtomis sąlygomis išmatuotos jonizacijos srovės buvo 2–6 µA diapazone, o įtampos – nuo ​​-3,8 iki -6,5 kV, todėl šio vieno terminalo EWNS energijos suvartojimas buvo mažesnis nei 50 mW. Nors EWNS buvo susintetintas esant aukštam slėgiui, ozono lygis buvo labai žemas ir niekada neviršijo 60 ppb.
Papildomame S4 ​​paveiksle parodyti atitinkamai [-6,5 kV, 4,0 cm] ir [-3,8 kV, 0,5 cm] scenarijuose sumodeliuoti elektriniai laukai. Scenarijų [-6,5 kV, 4,0 cm] ir [-3,8 kV, 0,5 cm] laukai apskaičiuoti atitinkamai kaip 2 × 10⁶ V/m ir 4,7 × 10⁶ V/m. To ir reikėjo tikėtis, nes antruoju atveju įtampos ir atstumo santykis yra daug didesnis.
3a ir 3b paveiksluose parodytas EWNS skersmuo, išmatuotas naudojant AFM8. Vidutiniai EWNS skersmenys [-6,5 kV, 4,0 cm] ir [-3,8 kV, 0,5 cm] scenarijuose buvo apskaičiuoti atitinkamai kaip 27 nm ir 19 nm. Geometriniai standartiniai pasiskirstymo nuokrypiai atvejais [-6,5 kV, 4,0 cm] ir [-3,8 kV, 0,5 cm] yra atitinkamai 1,41 ir 1,45, o tai rodo siaurą dydžių pasiskirstymą. Tiek vidutinis dydis, tiek geometrinis standartinis nuokrypis yra labai artimi baziniam EWNS, atitinkamai 25 nm ir 1,41. 3c paveiksle parodytas bazinio EWNS dydžio pasiskirstymas, išmatuotas tuo pačiu metodu tomis pačiomis sąlygomis.
3d, e paveiksluose pateikti krūvio charakteristikų nustatymo rezultatai. Duomenys yra 30 vienu metu atliktų koncentracijos (#/cm3) ir srovės (I) matavimų vidurkiai. Analizė rodo, kad vidutinis EWNS krūvis yra 22 ± 6 e- ir 44 ± 6 e- atitinkamai esant [-6,5 kV, 4,0 cm] ir [-3,8 kV, 0,5 cm]. Palyginti su baziniais EWNS (10 ± 2 e-), jų paviršiaus krūvis yra žymiai didesnis – dvigubai didesnis nei [-6,5 kV, 4,0 cm] scenarijuje ir keturis kartus didesnis nei [-3,8 kV, 0,5 cm]. 3f paveiksle pateikti pagrindiniai EWNS mokėjimo duomenys.
Iš EWNS skaičiaus koncentracijos žemėlapių (papildomi S5 ir S6 paveikslai) matyti, kad [-6,5 kV, 4,0 cm] scenoje dalelių skaičius yra žymiai didesnis nei [-3,8 kV, 0,5 cm] scenoje. Taip pat reikėtų atkreipti dėmesį, kad EWNS skaičiaus koncentracijos buvo stebimos iki 4 valandų (papildomi S5 ir S6 paveikslai), kur EWNS generavimo stabilumas abiem atvejais parodė tą patį dalelių skaičiaus koncentracijos lygį.
3g paveiksle parodytas optimizuoto EWNS EPR spektras po kontrolinės (foninės) atėmimo esant [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektras taip pat lyginamas su anksčiau publikuotame straipsnyje aprašyta EWNS bazine linija. Apskaičiuotas su sukinių gaudykle reaguojančių EWNS skaičius yra 7,5 × 104 EWNS/s, o tai panašu į anksčiau publikuotą bazinės linijos EWNS8 spektrą. EPR spektrai aiškiai parodė dviejų tipų ROS buvimą, kur vyravo O2-, o OH• buvo mažesnis kiekis. Be to, tiesioginis smailių intensyvumų palyginimas parodė, kad optimizuotame EWNS ROS kiekis buvo žymiai didesnis, palyginti su bazine EWNS.
4 paveiksle parodytas EWNS nusodinimo efektyvumas EPES sistemoje. Duomenys taip pat apibendrinti I lentelėje ir palyginti su pradiniais EWNS duomenimis. Abiem EUNS atvejais nusodinimas buvo artimas 100 % net esant žemai 3,0 kV įtampai. Paprastai 3,0 kV pakanka 100 % nusodinimui pasiekti, nepaisant paviršiaus krūvio pokyčio. Tokiomis pačiomis sąlygomis bazinio EWNS nusodinimo efektyvumas buvo tik 56 % dėl mažesnio krūvio (vidutiniškai 10 elektronų vienam EWNS).
5 paveiksle ir 2 lentelėje apibendrintas mikroorganizmų, inokuliuotų pomidorų paviršiuje po maždaug 40 000 #/cm3 EWNS 45 minučių trukmės poveikio optimaliu scenarijumi [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokuliuotos E. coli ir L. innocua parodė reikšmingą 3,8 log sumažėjimą po 45 minučių poveikio. Tokiomis pačiomis sąlygomis S. enterica parodė mažesnį log sumažėjimą – 2,2 log, o S. cerevisiae ir M. parafortuitum – 1,0 log sumažėjimą.
Elektroninės mikrografijos (6 pav.), vaizduojančios EWNS sukeltus fizinius pokyčius E. coli, Salmonella enterica ir L. innocua ląstelėse, dėl kurių jos inaktyvuojamos. Kontrolinės bakterijos turėjo nepažeistas ląstelių membranas, o paveiktos bakterijos turėjo pažeistas išorines membranas.
Kontrolinių ir paveiktų bakterijų elektroninis mikroskopinis vaizdavimas atskleidė membranų pažeidimus.
Optimizuotų EWNS fizikocheminių savybių duomenys rodo, kad EWNS savybės (paviršiaus krūvis ir ROS kiekis) buvo žymiai pagerintos, palyginti su anksčiau paskelbtais EWNS baziniais duomenimis8,9,10,11. Kita vertus, jų dydis išliko nanometrų diapazone, o tai labai panašu į anksčiau paskelbtus rezultatus, todėl jie ilgą laiką gali išlikti ore. Stebimą polidispersiškumą galima paaiškinti paviršiaus krūvio pokyčiais, kurie lemia Rayleigh efekto dydį, atsitiktinumą ir galimą EWNS susiliejimą. Tačiau, kaip išsamiai aprašė Nielsen ir kt.22, didelis paviršiaus krūvis sumažina garavimą, efektyviai padidindamas vandens lašo paviršiaus energiją / įtempimą. Ši teorija buvo eksperimentiškai patvirtinta mikrolašeliams22 ir EWNS ankstesnėje mūsų publikacijoje8. Laiko praradimas taip pat gali turėti įtakos dydžiui ir prisidėti prie stebimo dydžio pasiskirstymo.
Be to, vienos struktūros krūvis yra apie 22–44 e⁻, priklausomai nuo aplinkybių, o tai yra žymiai daugiau, palyginti su bazine EWNS, kurios vidutinis krūvis yra 10 ± 2 elektronai vienoje struktūroje. Tačiau reikėtų pažymėti, kad tai yra vidutinis EWNS krūvis. Seto ir kt. Įrodyta, kad krūvis nėra tolygus ir atitinka logaritminį normalųjį skirstinį21. Palyginti su ankstesniu mūsų darbu, paviršiaus krūvio padvigubinimas padvigubina nusodinimo efektyvumą EPES sistemoje iki beveik 100 %11.